CN105758700B - 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶冻干全血质控品及其制备方法,该质控品是以CPD全血基质和G6PD制成的冻干品。其制备方法是用离心分离CPD全血基质的红细胞与血浆;用物理方法制备红细胞溶血液,按不同比例与溶血液混合,得CPD全血基质;将不同量G6PD加入全血基质中,制备成G6PD为正常及缺乏两个不同水平的质控品,分装,冷冻干燥,真空压盖,即得G6PD冻干全血质控品。本发明的质控品,产品均一性、样品储存长期稳定性及复溶后稳定性良好,不受运输、温度等因素影响,适用范围广,可适用于不用品牌的定量检测试剂盒,G6PD质控品能满足临床对G6PD检测的质量控制要求,可以更准确地检测临床样本检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域,具体是一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品及其制备方法。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,以下简称G6PD)是存在于所有细胞和组织中的一种看家酶,是磷酸戊糖旁路代谢的起始酶,它提供戊糖用于核酸合成,用以保持还原型谷胱甘肽生成还原型辅酶II(NADPH),维持红细胞的还原能力,防止过氧化氢等物质对红细胞的损伤。G6PD缺乏症是人类最常见的遗传性酶缺陷病,为X染色体连锁不完全显性方式遗传,其临床变化较大,从无症状到药物或感染造成的急性溶血、蚕豆病、慢性非球形细胞溶血性贫血、新生儿黄疸甚至核黄疸。检测G6PD是否缺乏,可告知患者避免使用可能引起溶血的药物,告知医务人员及时处理由检测G6PD酶缺乏引起的新生儿高胆红素血症。因此,检测G6PD是否缺乏,成为婚前检查及产前检查的检测项目之一,同时也是新生儿筛查的检测项目。
目前,对G6PD缺乏的检测方法主要是用生物化学方法,其包括高铁血红蛋白还原法、荧光斑点法、NBT定量比值法、紫外速率法等,当前临床上常用的G6PD检测方法主要为紫外速率法。由于紫外速率法具有标本前处理简单、操作简便、快速、重复性好、特异性好、准确度较高、便于上机全自动化等优点,因此成为WHO推荐的方法。紫外速率法是以检测G6PD活性及血红蛋白含量作为指标,但由于G6PD检测受温度及标本处理等因素影响大,因此该项目的样本保存是制约各实验室间比对及做好室内质控一个重要因素。目前普通样本通过EDTA-K2抗凝放置2-8℃可稳定一周;放置20℃可稳定48小时,72小时明显偏低;高于此温度,G6PD活性呈明显下降趋势。当检测该项目时,制备好的溶血液超出半小时检测,酶活性也随之下降,溶血样本更难以保存。
目前国际和国内组织实施评价G6PD项目的方法是通过发放干纸片血斑到各实验室用户对该项目进行筛查实验。对于G6PD定量检测项目评价还没有很好的质控样本。商品化的试剂厂商提供的质控品不能适用G6PD定量项目检测。质控品是实现体外诊断试剂临床检测及监督检验结果一致的主要工具,因此,亟待开发出安全、稳定、有效、准确性高、的能适用G6PD定量检测的质控品。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题,提供一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品及其制备方法。该质控品稳定性好,不受运输、温度等因素影响,制备成溶血液后检测过程稳定时间较长,具备检测重复性、准确性高,可适用于不同仪器型号、不同试剂定量检测,不同地域、不同实验室操作人员检测。
为实现以上目的,本发明采用的技术方案如下:
一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品,所述质控品是以CPD全血基质和G6PD制成的冻干品。
进一步地,以上所述CPD全血基质和G6PD的体积比为1:50和1:500。
进一步地,以上所述CPD全血基质是由体积比为7:1的血液和CPD保存液组成。
进一步地,以上所述CPD保存液的配方为枸缘酸三钠2.6g、枸缘酸0.32g、葡萄糖2.5g、磷酸二氢钠0.2g和蒸馏水100mL。
以上所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品的制备方法,包括以下步骤:
1.选择合格供血者,抽取静脉血液,将血液放入含CPD保存液的血袋中,血液与CPD保存液的体积比为7:1,混匀,在23±2℃、转速为2500rpm下离心30min,分离出红细胞和血浆;
2.将上述分离好的红细胞用盐水洗涤三次,离心,弃掉上清液,然后放置-80℃冰箱冷冻过夜,将冷冻完全的红细胞从冰箱取出,放置室温,直至完全融解;
3.重复步骤(2)中的操作“放置-80℃冰箱冷冻过夜,将冷冻完全的红细胞从冰箱取出,放置室温,直至完全融解”五次,红细胞完全溶解后,将溶解好的红细胞与步骤(1)分离的血浆混合均匀,再用尼龙网过滤,即得CPD全血基质;
4.将浓度为1000U/L的G6PD加入CPD全血基质中,其中G6PD与CPD全血基质的体积比为1:50和1:500,混合均匀,得G6PD全血质控品,取质控品在全自动生化分析仪上进行检测,然后以紫外速率法检测定值,选择G6PD检测值为正常和缺乏(即最高值和最低值)的G6PD全血质控品,然后将两种不同的质控品分别装至安培瓶;
5.将上述安培瓶放入已预冷至-50℃的真空冷冻干燥机,维持32h后,抽真空,压盖取出并封口,最后将安培瓶放置2-8℃冰箱保存,得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品。
进一步地,以上所述红细胞和血浆的体积比为3:2或2:3。
进一步地,以上所述盐水的质量浓度为9%。
进一步地,以上所述尼龙网丝为300目。
进一步地,所述合格供血者是指血液中生物源性病原体如HBsAg、抗HCV、抗特异性TP、抗HIV等感染性标志物指标均为阴性的健康供血者。
本发明制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品,可应用在G6PD试剂盒的定量检测。所述定量检测方法具体为紫外速率法。
所述紫外速率法定量检测G6PD的原理如下:
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)在NADP存在条件下催化葡萄糖-6-磷酸生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,在340nm处测定NADPH的生成速率,即可测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力。
结合血红蛋白含量或者溶血指数的测定,可以计算出每克血红蛋白中G6PD活力。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
1、本发明质控品的均一性和稳定性好,不受运输、温度等因素影响,可适用于不同仪器型号、不同试剂定量检测,不同地域、不同实验室操作人员检测。制备成溶血液后检测过程稳定时间较长,具备检测重复性、准确性高,能满足临床对G6PD检测的质量控制要求,可以更准确地检测临床样本检测结果的准确性。
2、本发明的质控品为冻干品,可使血液中G6PD活性稳定,2~8℃环境效期可达12个月,质量可靠,准确度高。
3、本发明提供的冻干质控品粘稠度低,容易复溶与混匀,开瓶后2-8℃保存可稳定3天,开瓶后分装放置-20℃保存可稳定一个月。
4、本发明提供的质控品,制备成溶血液后,可稳定两小时,为复查提供充足时间。
5、本发明所提供的质控品来源广泛,制作简单,且不含稳定剂、固定剂、防腐剂,成本低廉。
6、本发明质控品为真空压盖冻干品,稳定性好,运输存储方便,可大大降低存储费用。
7、本发明制备的G6PD冻干质控品性能稳定、使用简便、准确度高,可用于室间质量评价组织者对不同检测系统定量测定G6PD和血红蛋白等项目评价,使各实验室间具备可比性。同时可作为室内质控品,监测G6PD定量分析的检测系统的稳定性。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明详细说明,但不限本发明的保护范围。
实施例1
本实施例的G6PD冻干全血质控品,以G6PD正常和缺乏质控品为例。正常和缺乏质控品均由CPD全血基质和G6PD制成的冻干品。冻干后呈红色饼状固体,两者颜色一致。所述CPD全血基质是由血液和CPD保存液组成。
CPD保存液的制备方法:称取枸缘酸三钠2.6g、枸缘酸0.32g、葡萄糖2.5g、磷酸二氢钠0.2g,然后加入蒸馏水1000mL,充分溶解,即得CPD保存液。
一、G6PD冻干全血质控品的制备
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品的制备方法,包括以下步骤:
1.选择血液中生物源性病原体如HBsAg、抗HCV、抗特异性TP、抗HIV等感染性标志物指标均为阴性的健康成人作合格供血者,采用200mL含28mLCDP保存液的血袋收集静脉血(血液和CPD保存液体积比为7:1),混匀,得抗凝血,然后取200mL抗凝血分装至4个50ml的离心管,在23±2℃、转速为2500rpm下离心30min,分离出红细胞和血浆;
2.将上述分离好的红细胞用质量浓度为9%的盐水洗涤三次,离心,弃掉上清液,留取红细胞,将4个离心管中洗涤好的红细胞转移至1个较大的无菌离心管,然后放置-80℃冰箱冷冻过夜,将冷冻完全的红细胞从冰箱取出,放置室温,直至完全融解;
3.重复步骤(2)中的操作“放置-80℃冰箱冷冻过夜,将冷冻完全的红细胞从冰箱取出,放置室温,直至完全融解”五次,红细胞完全溶解后,将溶解好的红细胞与步骤(1)分离的血浆按照3:2或2:3比例混合均匀,再用300目尼龙网过滤,两种不同浓度CPD全血基质;
4.将浓度为1000U/L的G6PD加入CPD全血基质中,其中G6PD与CPD全血基质的体积分别比为1:50和1:500,混合均匀,得G6PD全血质控品,取1mL质控品在Beckman AU5800全自动生化分析仪上检测,然后用紫外速率法检测,分别获得G6PD检测值为正常和缺乏(即为最高值和最低值)的G6PD全血质控品,然后将两种不同的质控品以每瓶0.25mL的量分别装至安培瓶;
5.将上述安培瓶放入已预冷至-50℃的真空冷冻干燥机,维持32h后,抽真空,压盖取出并封口,最后将安培瓶放置2-8℃冰箱保存,得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品。
上述操作均在无菌环境下进行。
二、G6PD冻干全血质控品的均匀性评价
参照CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,随机抽取放置2-8℃保存的正常和缺乏两批号G6PD冻干全血质控品各10瓶,每支用0.25mL蒸馏水复溶。用BeckmanAU5800全自动生化分析仪及长春汇力试剂盒检测每瓶质控品中每克血红蛋白G6PD含量。每个样本重复检测两次,计算F值,P>0.05,说明各样品组内、组间间均匀性良好。均匀性检验显示,正常质控品F值为1.265,P值为0.358,P>0.05;缺乏质控品F值为1.034,P值为0.475,P>0.05。检测结果见表1。
表1:G6PD冻干全血质控品复溶后的均匀性检测结果
从上表可知:正常值及缺乏值的G6PD冻干全血质控品的样品分装均匀。
三、G6PD冻干全血质控品的稳定性评价
稳定性评价:包括开瓶稳定性和长期稳定性。
1、开瓶稳定性检测:将上述均匀性检测数据作为初始检测结果值(即第0天检测值),每个批号(正常和缺乏两个批号)随机抽取已做均匀性检测的一瓶样品,开瓶后于2-8℃保存,于第1,2,3,4天检测。参照CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,稳定性用t检验统计分析,t值临界值为2.015,小于2.015,则P>0.05,说明稳定性好。结果显示开瓶第1,2,3天,均为P>0.05,第4天P<0.05。检测结果见表2。
表2:G6PD全血冻干质控品复溶后开瓶稳定性结果
注:*为P<0.05
从表中可知G6PD冻干全血质控品开瓶后于2-8℃保存可稳定3天,说明该产品稳定性好。
2、长期稳定性检测:稳定性检验用t检验统计分析。将G6PD正常和缺乏两个批号的冻干全血质控品放置于2-8℃保存,每个批号每月随机抽取3瓶检测,共监测12个月。每月检测结果与第0天总均值比较做百分偏差表,检测结果见表3。
3、表3:G6PD全血冻干质控品每月检测结果与第0天总均值偏差
上述结果显示G6PD全血冻干质控品于2~8℃环境保存,稳定性好,有效期可达12个月,质量可靠,准确度高。同时G6PD缺乏的质控品偏差较大,在0.5%~15%之间,G6PD正常的质控品偏差小,在0.18%~6.06%。
四、G6PD冻干全血质控品在不同定量试剂盒上的适用性评价
G6PD冻干全血质控品在不同定量试剂盒上的适用性评价:G6PD正常和缺乏的质控品每批号随机抽取10瓶,将复溶后的质控品分别在长春汇力、北京北检、北京利德曼、广州科方、宁波美康、深圳迈瑞等国内主要不同品牌的G6PD定量试剂盒检测,计算各试剂检测结果均值、标准差及变异系数(CV)。(见表4)
表4:各定量试剂盒检测G6PD全血冻干质控品结果
适用性结果表明不同试剂盒定量结果具有可比性。在定性判定中正常、缺乏质控品的检测结果均符合以上品牌试剂盒的要求。(其中汇力、北检试剂盒中G6PD的成人参考范围是大于4.2U/gHb;其余试剂盒参考范围是大于1300U/L)。
以上内容仅是本发明方案的优选实施方式,在不脱离本发明构思的前提下,做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (4)
1.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品的制备方法,其特征在于:所述全血质控品是以CPD全血基质和G6PD制成的冻干品;所述CPD全血基质和G6PD的体积比为1:50或1:500;所述CPD全血基质是由体积比为7:1的血液和CPD保存液组成;所述CPD保存液的配方为枸缘酸三钠2.6g、枸缘酸0.32g、无水葡萄糖2.5g、磷酸二氢钠0.2g和蒸馏水100mL;
所述全血质控品的制备方法,包括以下步骤:
(1)选择合格供血者,抽取静脉血液,将血液放入含CPD保存液的血袋中,混匀,在23±2℃、转速为2500rpm下离心30min,分离出红细胞和血浆;
(2)将上述分离好的红细胞用盐水洗涤三次,离心,弃掉上清液,然后放置-80℃冰箱冷冻过夜,将冷冻完全的红细胞从冰箱取出,放置室温,直至完全融解;
(3)重复步骤(2)中的操作“放置-80℃冰箱冷冻过夜,将冷冻完全的红细胞从冰箱取出,放置室温,直至完全融解”五次,红细胞完全溶解后,将溶解好的红细胞与步骤(1)分离的血浆混合均匀,再用尼龙网过滤,即得CPD全血基质;
(4)将浓度为1000U/L的G6PD加入CPD全血基质中,其中G6PD与CPD全血基质的体积比为1:50或1:500,混合均匀,得G6PD全血质控品,取全血质控品在全自动生化分析仪上进行检测,然后以紫外速率法检测定值,选择G6PD检测值为正常和缺乏的G6PD全血质控品,然后将两种不同的全血质控品分别装至安培瓶;
(5)将上述安培瓶放入已预冷至-50℃的真空冷冻干燥机,维持32h后,抽真空,压盖取出并封口,最后将安培瓶放置2-8℃冰箱保存,得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品的制备方法,其特征在于:所述红细胞和血浆的体积比为3:2或2:3。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品的制备方法,其特征在于:所述盐水的质量浓度为9%。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶冻干全血质控品的制备方法,其特征在于:所述尼龙网为300目。
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