CN102419373A - 一种胰岛素和c肽双标记测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种胰岛素和C肽双标记试剂盒，特别是涉及一种以滤纸干血片为样本使用双标记时间分辨免疫荧光法进行胰岛素和C肽测定的试剂盒，并提供了铕标记抗C肽抗体和钐标记胰岛素抗体的制备方法，利用本试剂盒一次测试可以同时定量检测胰岛素和C肽两种标志物，以滤纸干血片为样本解决了血清样本中胰岛素和C肽不稳定的问题。本发明的试剂盒可广泛用于糖尿病的辅助诊断和病情检测，指导临床用药以及预后等多个研究领域。

Description

一种胰岛素和C肽双标记测定试剂盒

技术领域

本发明涉及一种胰岛素和C肽双标记试剂盒，特别是涉及一种以滤纸干血片为样本使用双标记时间分辨免疫荧光法进行胰岛素和C肽测定的试剂盒，利用本试剂盒一次测试可以同时定量检测胰岛素和C肽两种标志物。本发明试剂盒的应用解决了血清样本中胰岛素和C肽不稳定的问题，可广泛用于糖尿病的辅助诊断和病情检测，指导临床用药以及预后等多个研究领域。

背景技术

糖尿病(DM)是一种常见多发病，也是世界卫生组织所列三大疑难病之一，如何防治DM是现代医学界的一大难题.DM分为I型(胰岛素依赖型)和II型(非胰岛素依赖型)，其实验室分型依据主要依赖胰岛素及C肽释放试验。

胰岛素及C肽释放试验即在做口服葡萄糖耐量试验的同时，利用口服葡萄使血糖升高而刺激胰岛B细胞分泌胰岛素，通过测定空腹及服糖后1小时、2小时、3小时血中胰岛素和C肽动态变化，来反映胰岛B细胞的功能状况。

胰岛素是从胰岛B细胞分泌的一种能降低血糖的物质。胰岛B细胞合成胰岛素原后，分裂为胰岛素及C肽，二者以同等的数目释放入血循环中。测定血中胰岛素及C肽浓度，可以了解胰岛B细胞贮备功能，对指导治疗具有非常重要的意义。对于那些已经使用外源性胰岛素治疗的糖尿病人，体内可产生胰岛素抗体，干扰胰岛素测定，而测定血中C肽水平不仅可以准确地反映B细胞功能，而且可以弥补胰岛素测定的不足。临床上，常常将葡萄糖耐量试验，胰岛素及C肽释放试验同时检测。

常规的血清胰岛素和C肽检测大多采用酶联免疫法(ELISA)、化学发光法和时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA)。

酶联免疫法试剂盒均为半定量试剂，不能为临床医生提供精确的定量值，很难有效指导临床的治疗。同时，由于该方法本身在灵敏度上的局限性，对于血清胰岛素和C肽含量的变化还无法有效检测，影响了临床医生的判断。

时间分辨免疫荧光分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。TRFIA以稀土离子作为标记物，具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。因此，本发明选用TRFIA技术研制胰岛素和C肽检测试剂盒。

胰岛素分子量5700道尔顿，由两条氨基酸肽链组成，C肽是由21个氨基酸组成的直链，分子量3020道尔顿，均可以采用双抗体夹心法进行检测。

铕和钐是TRFIA技术中常用于双标记分析中的一对稀土元素。他们的激发波长均为340nm，均能利用β-萘甲酰三氟丙酮(β-NTA)螯合剂增强荧光强度。铕和钐最大发射波长分别为613nm和643nm，虽然相差不大，但由于是窄峰发射，能够充分分辨；另外铕和钐荧光寿命相差显著，分别为820μs和88μs，检测时彼此干扰比较小。本发明采用铕标记C肽抗体、钐标记胰岛素抗体，利用TRFIA技术在一份样本中同时定量测定胰岛素和C肽，除了拥有TRFIA技术的固有特点外，还具有省时、经济和高效等突出优点。

常规实验方法以血清作为检测样本。而胰岛素和C肽在血清中稳定性较差，特别是C肽。血清样本(2-8)℃放置3天，胰岛素和C肽浓度将下降10％以上。本发明采用滤纸干血片为载体，采集病人手指或足跟血，滴制血片，晾干。胰岛素和C肽在滤纸干血片中(2-8)℃保存7天，活性无明显下降。本发明采用滤纸干血片作为样本，大大提高胰岛素和C肽的检测结果的稳定性，更适合于临床应用。

本发明的试剂盒选用滤纸干血片为检测样本，并整合双标记时间分辨荧光分析技术，具有灵敏度高、稳定性好、省时、高效等显著优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用双标记时间分辨免疫荧光分析技术同时进行胰岛素和C肽定量测定的试剂盒。

为了实现本发明，需要对试剂盒所使用的原料进行筛选，从而确定最佳的原料，这一筛选过程包括包被和标记抗体的活性、标记物和抗体的比例、包被抗体的浓度、标记物的稀释度、包被板的吸附性能和变异大小等。由于铕和钐的标记和纯化方法与酶联免疫分析完全不同，通过反复探索和试验比对，最终找到了简便、效率高、成本低、质量可靠的方法。

同时本发明通过研究确定了试剂盒的组分及配方，包括：洗液配方、分析缓冲液配方、增强液配方、校准品基质的配方等，并公开了铕和钐标记抗体的制备过程。

基于本发明目的，其中所述的试剂盒包括：

1)校准品干血片；

2)包被反应板；

3)标记物；

4)分析缓冲液；

5)洗液(25x)；

6)增强液。

根据本发明一个优选的实施方案，校准品干血片由胰岛素和C肽两种物质溶解在校准品基质中，并滴制在市售滤纸上。校准品干血片根据胰岛素和C肽浓度不同分别编号A-E，其中胰岛素和C肽可使用市售产品，市售滤纸优选Whatman903^#滤纸。编号A-E的校准品干血片加入胰岛素和C肽浓度如下表所示：

根据本发明所述的校准品干血片，其中校准品基质由脱纤维绵羊全血，使用生理盐水洗涤6次后，并采用生理盐水调整红细胞压积至0.55，轻轻混匀制备而成，其中脱纤维绵羊全血选用市售产品。

根据本发明一个优选的实施方案，包被反应板为由0.6μg C肽抗体、0.6μg胰岛素抗体、200μl包被缓冲液加入96孔透明微孔板制备而成。

根据本发明一个优选的实施方案，标记物含铕标记抗C肽抗体和钐标记胰岛素抗体两种标记物，其中铕标记抗C肽抗体和钐标记胰岛素抗体浓度分别为25μg/mL和50μg/mL，溶解基质组分为Tris-HCl(50mmol/L，pH7.8)、BSA(3％)、Proclin300(0.1％)、海藻糖(3％)和NaCl(0.84％)。

根据本发明一个优选的实施方案，分析缓冲液组分为Tris-HCl(50mmol/L，pH7.8)、PEG6000(1.5％)、BSA(0.2％)、Proclin300(0.1％)、牛IgG(0.02％)、Tween 20(0.1％)和NaCl(0.84％)。

根据本发明一个优选的实施方案，洗液(25x)组分为Tris-HCl(1.25mmol/L，pH7.8)、Tween 20(2.5％)和NaCl(21％)。

根据本发明一个优选的实施方案，增强液可采用市售产品，推荐使用PerkinElmer公司产品，货号为B118-100。

根据本发明所述的铕标记抗C肽抗体和钐标记胰岛素抗体，其制备步骤分别为：

1)抗体纯化和浓缩：选择市售的抗C肽单克隆抗体和抗胰岛素单克隆抗体，将1mg抗C肽单克隆抗体或1mg抗胰岛素单克隆抗体加入0.5ml标记缓冲液(50mmol/L，Na₂CO₃，pH 9.0)，混匀后，用市售的带有滤膜的G-50离心管10000rpm离心5min，再用0.5ml标记缓冲液重复洗涤6次，倒转G-50离心管，1500rpm离心2min收集抗体。

2)抗体标记：将纯化的C肽抗体加入0.2mg Eu³⁺标记试剂，纯化的胰岛素抗体加入0.5mg Sm³⁺标记试剂，充分混匀，25℃振荡过夜。

3)上样与洗脱：用Sephadex G-50层析柱(1×30cm)分离纯化，洗脱液(含0.9％NaCl的50mmol/l Tris-HCl)洗脱，同时收集流出液(1ml/管)，逐管测量吸光度(A280nm)，合并峰管，测蛋白含量。

4)确定稀释度：并管后的铕和钐标记物，进行稀释度摸索，选择线性较好，灵敏度较低的稀释度，优选稀释度为1∶100，以此为基准稀释并管后的标记物。

5)分装标记物：分装体积为1.0ml/瓶，真空冷冻干燥。

6)保存：冻干后在2℃-8℃条件下保存。

本发明的试剂盒优选的样本类型为滤纸干血片。

利用本发明的试剂盒进行检测，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测范围宽、无放射性污染的特点、一次测试同时检出两个项目，使用滤纸干血片样本成功解决了血清样本在28℃放置不稳定的问题，非常适合于临床检测，可广泛用于糖尿病的辅助诊断和病情检测，指导临床用药以及预后等多个研究领域。

附图说明

图1为试剂盒的胰岛素剂量-反应曲线图(双对数拟合)。

图2为试剂盒的C肽剂量-反应曲线图(双对数拟合)。

图3为本发明的试剂盒同国外胰岛素测定试剂盒(PerkinElmer公司)临床样本胰岛素测值比对的回归曲线。

图4为本发明的试剂盒同国外C肽测定试剂盒(PerkinElmer公司)临床样本C肽测值比对的回归曲线。

具体实施方式

实施例1试剂盒的组成

1)校准品干血片，1套，分别编号A-E

2)标记物，1瓶，为冻干品

3)25×洗液，1瓶，150mL

4)增强液，1瓶，150mL

5)分析缓冲液，1瓶，150mL

6)包被反应板，1块，96孔/块

7)封片，3片

8)说明书，1份

实施例2试剂盒的使用方法

一、样本收集

对被采血者指尖进行局部消毒后，采血针穿刺，让血自然流出，用棉签或棉球拭去第一滴血，将采血滤纸靠近出血处采血，让血自然渗透至滤纸背面；样品收集后，滤纸应平放室内自然晾干，2-8℃保存。

二、试剂的准备

(1)洗涤液：将50mL 25×洗液和1200mL去离子水混合，作为工作洗涤液。

(2)标记物工作液：使用前一小时将每瓶标记物用1mL去离子水溶解，用分析缓冲液以1∶25倍稀释作为工作液。

三、操作步骤

首先将包被反应板按标本数量取用相应数量的反应条置室温平衡(23-28℃，30分钟)，然后用专用打孔器在校准品干血片或待测样品干血片上轧下小血片(每片直径3mm左右)，按顺序加入微孔反应条小孔中。每孔加入150μl标记物工作液并加贴封条，室温快速振动4小时后，弃去血片，用洗涤液冲洗6次，拍干，而后每孔加增强液200μl，振动孵育5分钟。最后使用时间分辨荧光检测仪测定荧光值(CPS)，在激发波长340nm，发射波长613nm时测定铕的荧光值，在激发波长340nm，发射波长642nm时测定钐的荧光值。分别以校准品中C肽浓度的Log值为横坐标，铕的CPS扣除本底后的Log值为纵坐标，以及胰岛素浓度的Log值为横坐标，钐的CPS扣除本底后的Log值为纵坐标分别绘制胰岛素和C肽的剂量-反应曲线(双对数曲线)，参见附图1和附图2。根据各待测血清CPS值在相应剂量-反应曲线上可以查出该血清胰岛素和C肽的浓度。

实施例3比较分析缓冲液对滤纸干血片溶出率的影响

一、试剂盒准备

1)实施例1的胰岛素和C肽双标记测定试剂盒，称为试剂盒1。

2)PerkinElmer公司的胰岛素AutoDELFIA试剂盒(货号：B080-101)和C肽AutoDELFIA试剂盒(货号：B081-101)，称为试剂盒2和试剂盒3。

二、检测样本来源

从医院收集滤纸干血片样本24例，编号为201001-201024，胰岛素浓度在(10-150)μIU/ml之间，C肽浓度在(3.0-18.6)ng/ml之间。

三、检测方法

分别采用上述三种试剂盒中的分析缓冲液，使用试剂盒1对12份血片进行平行检测，测定程序和结果判断严格按照实施例2进行。

四、检测结果

表1两种分析缓冲液对滤纸干血片中胰岛素溶出率比较

表2两种分析缓冲液滤纸干血片C肽溶出率比较

结论：相比市售酶联免疫检测试剂盒中的分析缓冲液，使用本发明本试剂盒的分析缓冲液，可将血片中胰岛素和C肽的溶出率分别可以提高9.31％和14.04％。

实施例4样本类型对胰岛素和C肽活性的影响

一、试剂盒准备

使用实施例3中的试剂盒1。

二、检测样本来源

从医院收集胰岛素和C肽样本各24例，其中滤纸干血片样本和血清样本分别为12例，编号：201001-201048，每份样本分装成9份；样本中胰岛素浓度在(9.5-167)μIU/ml之间，C肽浓度在(2.5-17.6)ng/ml之间。

三、检测方法

将每份样本(滤纸干血片及血清)室温(20-25℃)保存0天、1天、3天、7天和14天；将每份样本(滤纸干血片及血清)冰箱(2-8℃)保存0天、1天、2天和3天；使用试剂盒1按照实施例2的方法对滤纸干血片进行测定，使用试剂盒2和试剂盒3按照试剂盒说明书对血清样本进行测定。。

四、检测结果

计算同一条件下保存的12份样本的均值及浓度降低的百分率，检测结果见表3和表4。

表3样本储存温度和时间对胰岛素活性的影响

表4样本储存温度和时间对C肽活性的影响

结论：相比血清样本，滤纸干血片样本中的胰岛素和C肽稳定性明显提高，特别是C肽；使用滤纸干血片样本，在室温(20-25℃)下可保存两天，2-8℃冰箱可以保存7天。

实施例5试剂盒的实验室性能

对实施例1的试剂盒进行实验室性能分析，结果如下：

1)最低检测量

胰岛素：0.31μIU/ml；C肽：0.12ng/ml。

2)准确性

试剂盒校准品与国家标准品同时进行平行双孔分析测定，以国家标准品为对照品，试剂盒校准品胰岛素和C肽的实测浓度与其标示浓度的比值均在0.957～1.05范围内。

3)剂量-反应曲线的线性

用双对数数学模型拟合，胰岛素在校准品干血片B(3.6μIU/ml)与校准品干血片E(180μIU/ml)之间的浓度范围内，C肽在校准品B(0.5ng/ml)与校准品E(22ng/ml)之间的浓度范围内，剂量-反应曲线相关系数(r)分别为0.9998和0.9997。

4)精密度(CV％)

批内精密度为4.2％(n＝10)；批间精密度为6.3％(n＝10)。

5)特异性

浓度为10ng/mL胰岛素原使用本试剂盒进行检测，胰岛素测值为0.65μIU/ml，C肽测值为0.12ng/ml。

实施例6试剂盒同国外试剂盒临床样本测值比较

收集241例样本，其中确诊为I型糖尿病患者51例，确诊为II型糖尿病患者78例，正常人112例，每例样本采集滤纸干血片和血清各一份。

利用实施例3中的试剂盒1、试剂盒2和试剂盒3对上述样本进行检测，其中试剂盒1检测滤纸干血片样本，试剂盒2和试剂盒3检测血清样本。

以试剂盒1测定样本的胰岛素浓度结果为纵坐标，以试剂盒2测定的胰岛素浓度结果为横坐标进行相关性分析，回归方程为：Y＝0.8937X+2.9389，相关系数r＝0.9533；以试剂盒1测定样本的C肽浓度结果为纵坐标，以试剂盒3测定的C肽浓度结果为横坐标进行相关性分析，回归方程为：Y＝1.0598X+0.7607，相关系数r＝0.9540，参见附图3和附图4。结果表明，本发明试剂盒与国外同类试剂盒测值具有显著相关性。

Claims (5)

1.一种利用双标记时间分辨免疫荧光分析技术同时进行胰岛素和C肽定量测定的试剂盒，包括：校准品干血片、包被反应板、标记物、分析缓冲液、25x洗液和增强液，其中标记物含铕标记抗C肽抗体和钐标记胰岛素抗体两种标记物，其特征在于铕标记抗C肽抗体和钐标记胰岛素抗体浓度分别为25μg/mL和50μg/mL，溶解基质组分为pH7.8的50mmol/lTris-HCl、3％BSA、0.1％Proclin300、3％海藻糖和0.84％NaCl。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于铕标记抗C肽抗体和钐标记胰岛素抗体的制备步骤分别为：

1)抗体纯化和浓缩：选择市售的抗C肽单克隆抗体和抗胰岛素单克隆抗体，将1mg抗C肽单克隆抗体和1mg抗胰岛素单克隆抗体加入pH 9.0的50mmol/L Na₂CO₃ 0.5ml，混匀后，用市售的带有滤膜的G-50离心管10000rpm离心5min，再用pH 9.0的50mmol/LNa₂CO₃0.5ml重复洗涤6次，倒转G-50离心管，1500rpm离心2min收集抗体，体积控制在150μl-250μl；

2)抗体标记：将纯化的C肽抗体加入0.2mg Eu³⁺标记试剂，纯化的胰岛素抗体加入0.5mgSm³⁺标记试剂，充分混匀，25℃振荡过夜；

3)上样与洗脱：用规格为1×30cm的Sephadex G-50层析柱分离纯化，含0.9％NaCl的50mmol/l Tris-HCl洗脱，按1ml/管收集流出液，逐管测量A280nm，合并峰管，测蛋白含量；

4)稀释标记物：并管后的铕和钐标记物，按1∶100的比例进行稀释；

5)分装标记物：分装体积为1.0ml/瓶，真空冷冻干燥；

6)保存：冻干后在2℃-8℃条件下保存。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于分析缓冲液组分为pH7.8的50mmol/LTris-HCl、1.5％PEG6000、0.2％BSA、0.1％Proclin300、0.02％牛IgG、0.1％Tween 20和0.84％NaCl。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于校准品干血片由胰岛素和C肽溶解在校准品基质中，并滴制在Whatman903^#滤纸上，其中校准品干血片根据胰岛素和C肽浓度不同分别编号A-E，编号为A-E的校准品干血片加入胰岛素和C肽的浓度分别为：

校准品基质由脱纤维绵羊全血，使用生理盐水洗涤6次后，并采用生理盐水调整红细胞压积至0.55，轻轻混匀制备而成。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒使用的标本类型为滤纸干血片。

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