CN1963505A - 人血清中胰岛素含量及c－肽含量的化学发光检测方法 - Google Patents

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张学东
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Abstract

本发明属于临床血液免疫检测方法技术领域，涉及一种人血清中胰岛素含量及C－肽含量的化学发光检测方法，该方法是利用人血清胰岛素定量检测试剂盒测定人血清中的胰岛素含量和人血清C－肽定量检测试剂盒测定人血清中C－肽的含量。本发明检测范围宽、操作简便快捷、无放射性污染，能够更好地满足临床的需要。

Description

人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法
技术领域
本发明属于临床血液免疫检测方法技术领域，涉及一种临床用于人血清中胰岛素和C-肽的定量检测判断糖尿病的方法。
背景技术
随着当前人们生活水平的提高，生活方式的改变，胰岛素功能障碍性疾病的发病率日益增加，导致糖尿病的发病率和发病人数急剧增加，由于糖尿病及其病变的特殊性，严重影响了患者的健康和生活质量，已成为了严重的社会问题，当前对胰岛素功能的体外检测多采用放射免疫分析法，但由于放免法必须使用放射性标记物，检测设备复杂，必需用专门的放射性探测器对检测结果进行测定，对操作人员也存在有放射性污染与伤害，同时常用的碘-125、碘-131和磷-32等半衰期短的核素，其保存时期不长，也给临床使用带来了不便，严重限制了该项目在临床诊断重的应用。在胰岛素(INS)、C-肽(C-P)测定方面，主要表现是特异性差，难以排除胰岛素原及其他胰岛素类似物的干扰。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确灵敏、稳定性强、特异性好、快速的糖尿病化学发光定量检测方法。
本发明采用以下技术方案来实现上述目的：一种人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，是利用人血清胰岛素定量检测试剂盒测定人血清中的胰岛素含量和人血清C-肽定量检测试剂盒测定人血清中C-肽的含量。
人血清胰岛素定量检测试剂盒由包被有胰岛素抗体的免疫反应滴定微孔板，人胰岛素系列标准品，酶标记针对另一抗原位点的胰岛素抗体，发光底物构成。
免疫反应滴定微孔板上包被抗胰岛素单克隆抗体。
系列标准品由分析缓冲液为基质，加入人胰岛素纯品配制而成。
人血清C-肽定量检测试剂盒由包被有C-肽抗体的免疫反应滴定微孔板，C肽系列标准品，酶标记针对另一抗原位点的C-肽抗体，发光底物构成。
免疫反应滴定微孔板包被有抗C-肽单克隆抗体。
所说的系列标准品由分析缓冲液为基质，加入C-肽纯品配制而成。
用辣根过氧化物酶标记INS单克隆抗体和C-P单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记INS抗体和C-P抗体的工作浓度不低于1∶3000。
发光底物为HRP-鲁米诺发光体系。
包被板制作：在包被缓冲液中加入单抗制成工作液，滴入免疫反应滴定微孔板的孔中包被，然后甩去液体，用洗液洗涤，用封闭液封闭。
其中包被缓冲液由Tris6.06g，NaCl8.2g，蒸馏水1000ml组成，PH7.4
封闭液由Na2HPO42.9g、KH2PO40.2g、NaCl8.0g、KCl0.2g、蔗糖25.0g、BSA10.0g组成，PH7.4
抗体标记：取辣根过氧化物酶溶于去离子水，加入过碘酸钠溶液活化，加入乙二醇反应，将反应混合物装入透析袋，用醋酸缓冲液透析，加入待标记物混匀，碳酸缓冲液调PH至碱性，加入NaHB4溶液反应后，装入透析袋，用磷酸盐缓冲液透析，分装后加入蛋白保护剂，-20℃保存。
标准品的配制：用分析缓冲液将高值阳性血清(基因合成抗原)做倍比稀释，以国家标准品(购自中国生物制品检定所)为标准进行标定。分装2-8℃保存备用，标准品设置5-10个。
分析缓冲液由0.05M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01M氯化钠的3％牛血清白蛋白(BSA)组成，PH7.2。
发光底物系统为HRP-鲁米诺发光体系：
A液为：0.15mM高效发光剂；0.59mM羟基香豆素；0.35mM没食子酸；pH7.4，0.2MTris-Hcl缓冲液。
B液：0.85mM氨基酸氧化酶；0.8％吐温-20(V/V)；0.5mM金属离子络合剂(DTPA)；0.12mM维生素C；pH6.5，0.2M乙酸-乙酸盐缓冲液。
本发明是针对临床实验室，为其提供一种既可手工操作，又可适用于某些标准全自动检测仪器的检测手段，本发明采用的化学发光免疫分析法，是利用辣根过氧化物酶催化发光底物，则发光底物发生化学反应并释放大量的能量，产生激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子，利用发光信号检测仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由于可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量，本发明灵敏度高，其中胰岛素的最小检出量为1μIU/ml，C-肽的最小检出量为0.2ng/ml；本发明精密度高，变异＜10％达到国家标准，在检测实验中具有很好的重复性；本发明准确性好，可以准确回算国家标准品。检测范围宽、操作简便、无放射性污染等特点，并且选用位点特异而且配对良好的单抗，采用双抗体夹心法，避免了放射免疫法的缺点，并且在灵敏度，特异性等方面也比放射免疫有了进一步的提高。本发明进行测定所用时间较短，测定一般仅需一个多小时即可完成，方便快捷。实际应用本发明对人血清中的胰岛素和C-肽进行测定，只需取少量样品即可进行，对被检测者没有任何伤害。
附图说明
图1是实施例胰岛素的标准曲线；
图2是实施例C-肽的标准曲线。
具体实施方式
实施例，(一)、人血清胰岛素定量检测试剂盒的制备：
1、包被板制作：采用PH7.4 Tris-HCl缓冲液作为包被缓冲液，加入单抗4ug/ml，按照100ul/孔进行包被，37度3小时后4℃过夜，然后甩去液体，用洗液洗涤，采用1％牛血清白蛋白(BSA-PBS)-2.5％蔗糖(0.01M，PH＝7.4)作为封闭液，4℃封闭过夜方式进行封闭。
2、抗体标记：
1)取辣根过氧化物酶12mg溶于3ml新鲜配制的去离子水中。
2)按51ul/1mg酶加入0.1mol/L的过碘酸钠溶液，混匀，4℃60分钟活化。
3)按26ul/1mg酶加入乙二醇，充分混匀，4℃反应30分钟，终止反应。
4)按上述反应混合物装入透析袋，对1mmol/L醋酸缓冲液透析，4℃过夜，换透析液2-3次。
5)按1.5mg待标记物/1mg酶加入待标记的INS单克隆抗体，充分混匀，用PH9.6的0.2mol/L碳酸缓冲液调PH至9.3±0.1。
6)按47ul/lmg酶加入0.106M(4mg/nl)NaHB4溶液，混匀，4℃反应2小时。
7)装入透析袋，用0.067mol/L PH7.0磷酸盐缓冲液中4℃条件下透析过夜，其间换液3-4次。
8)取出测体积，暂存4℃，质检后分装，加入蛋白保护剂(BB2#)，-20℃保存。
3、标准品的配制：
选用3％分析缓冲液，将高值阳性血清做倍比稀释，以国家标准品(购自中国生物制品检定所)为标准进行标定。分装成0.5ml/瓶，2-8℃保存备用。
胰岛素标准品设置为2μlU/ml、15μlU/ml、60μlU/ml、100μlU/ml、200μlU/ml
分析缓冲液由0.05M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、0.01M的氯化钠的3％牛血清白蛋白(BSA)组成，PH7.4。
(二)、人血清C肽定量检测试剂盒的制备：
制备方法同人血清C肽定量检测试剂盒。
标准品设置为0.4ng/ml、0.8ng/ml、1.6ng/ml、3.2ng/ml、6.4ng/ml。
(三)、本发明检测试剂盒的使用操作程序如下：
实验前准备
1、选择低、中、高3个血清标本(已经定值)。将所有检测试剂及血清标本恢复至室温18-25℃(约需30分钟)。
2、将恒温箱或水浴锅调至反应温度。
3、将发光底物A、B液等比例混合至本次实验所需体积(每孔需100μl，可按照每条包被板8孔需混合后的发光底物1ml混合，依次推类)。
实验操作步骤
1、将所需用量的包被板条放置在支架上；
2、在包被孔中分别加入50μl标准品、血清样品。
3、每孔再分别加入酶标记抗体溶液50μl。微量震荡器上振荡1分钟使其混合均匀。
4、置37℃温浴60分钟。
5、用洗板机以洗液洗6次，然后在吸水纸上拍干。
6、每孔加入混合后的发光底物50μl，室温(18-25℃)反应5分钟。
7、化学发光检测仪器测发光强度值。
选用标准品，以胰岛素标准品浓度值的对数值为横坐标(X轴)，以标准品发光强度值的对数值为纵坐标(Y轴)，将下表数据建立如图1的标准曲线，进行计算。
    胰岛素标准品设置(μIU/ml)   相对发光值(RLU)
    2     4.384
    15     110.856
    60     996.254
    100     2362.25
    200     9162.52
选用标准品，以胰岛素标准品浓度值的对数值为横坐标(X轴)，以标准品发光强度值的对数值为纵坐标(Y轴)，将下表数据建立如图2的标准曲线，进行计算。
    C-肽标准品设置(ng/ml)     相对发光值(RLU)
    0.4     492.4396
    0.8     1136.907
    1.6     2234.768
    3.2     5634.903
    6.4     11977.24
标准品按照每孔50μl加入包被板，每孔加入样本50μl，然后每孔加入酶标记抗体溶液50μl，震荡1分钟，贴封膜，放入温箱温育。底物在温育开始后混合，等体积混合A、B，按每孔需要100μl。温育1小时后洗板5次，每孔加入混合后的底物100μl，上机检测。检测结果如下表：
  INS定值血清浓度μIU/ml     测定浓度μIU/ml
    1     0.95
    50     51
    150     153
    C-P定值血清浓度ng/ml     测定浓度ng/ml
    0.2     0.21
    2.8     2.8
    5.6     5.5
由此可以分析，灵敏度高(其中胰岛素的最小检出量为1μIU/ml，C-肽的最小检出量为0.2ng/ml)、准确性高。
临床结果对比：选择304名病人的血清样本，采用本发明的方法与放射免疫法结果做对照。
临床结果如下表：
胰岛素   C-肽  百分比％
  I   I   28.3
  II   II   65.5
  正常   正常   6.2
胰岛素测定结果分析
                     本发明结果
   I    II   正常 小计
放免结果小计 III正常 840286 41941199 001919 8819422304
C-肽测定结果分析
                      本发明结果
  I   II   正常   小计
放免结果小计   III正常   850186   21961199   011819   8719720304
经过与临床结果对照本发明的临床病情的符合率为100％，完全能满足临床的需要。
而放射免疫法测定的胰岛素，I符合率97.7％，II符合率97.5％，正常符合率。放射免疫法测定的C-肽，I符合率98.8％，II符合率98.5％，正常符合率94.7％。
很明显，本发明的方法测定结果准确率远远高于放免，而且还没有放射性污染，本方法在临床有很广阔的使用前景。

Claims (10)

1、一种人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，利用人血清胰岛素定量检测试剂盒测定人血清中的胰岛素含量，利用人血清C肽定量检测试剂盒测定人血清中C-肽的含量。
2、如权利要求1所述的人血清中胰岛素含量及C肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，人血清胰岛素定量检测试剂盒由包被有胰岛素抗体的免疫反应滴定微孔板、人胰岛素系列标准品、酶标记针对另一抗原位点的胰岛素抗体、发光底物构成。
3、如权利要求2所述的人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，免疫反应滴定微孔板上包被抗胰岛素单克隆抗体。
4、如权利要求2所述的人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，系列标准品由分析缓冲液为基质，加入人胰岛素纯品配制而成。
5、如权利要求2所述的人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，用辣根过氧化物酶标记胰岛素单克隆抗体，其工作浓度不低于1∶3000。
6、如权利要求1所述的人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，人血清C-肽定量检测试剂盒由包被有C-肽抗体的免疫反应滴定微孔板、C-肽系列标准品、酶标记针对另一抗原位点的C-肽抗体、发光底物构成。
7、如权利要求6所述的人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，免疫反应滴定微孔板包被有抗C-肽单克隆抗体。
8、如权利要求6所述的人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，所说的系列标准品由分析缓冲液为基质，加入C-肽纯品配制而成。
9、如权利要求6所述的人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，用辣根过氧化物酶标记C-肽抗体，其工作浓度不低于1∶3000。
10、如权利要求2或6所述的人血清中胰岛素含量及C-肽含量的化学发光检测方法，其特征在于，发光底物为HRP-鲁米诺发光体系。
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