CN104880423A - 一种人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂,该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成,其中,所述试剂I含有Tris-双甘肽缓冲液、底物稳定剂;所述试剂II含有甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸、底物稳定剂。本发明采用的试剂盒及检测方法只需十几微升血清,无需离心或电泳等分离处理,操作简便,可满足全自动化分析的要求,适用于大规模样品的及时准确检测。
Description
技术领域
本申请涉及一种人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒。
背景技术
早在1966年,Hopsu-Havu和Glenner等在鼠的肝、肾组织中发现了一种新的二肽氨基肽酶。这种酶能水解甘氨酰-脯氨酰-B-萘胺,释放二肽甘氨酰脯氨酸,而被称为甘氨酰脯氨酸-B-萘胺酸。由于甘氨酰脯氨酰-B-萘胺有致癌作用,Nagatsu等合成了新底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺,并为大家广泛接受,这种酶也一度被称为甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺酶,现已通称为甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶(Glycylproline dipeptidyl aminopeptidase,GPDA)。
临床上,血清GPDA明显降低可作为胃癌的诊断指标,一般在正常人的1/2左右,其他良性胃肠道病变GPDA也可略有下降,胃癌切除后,病人血清GPDA有回升趋势。各类肝病血清GPDA也有不同程度的增高,升高幅度不及肝癌患者。尿液GPDA增高是肾小管早期损伤的诊断指标。
GPDA测定试剂中的主原料-甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸(GPN),配制成液体试剂后极不稳定,易水解变质,只能当天使用,否则必须在零摄氏度下冰冻保存,临用前复融混匀,一次使用,不能反复冻融,给实际应用带来很大不便,也易影响测定结果的准确性。
发明内容
本申请的目的是提供一种人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒。
本申请采用了以下技术方案:
本申请的一方面公开了一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂,该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成,其中,所述试剂I含有Tris-双甘肽缓冲液、底物稳定剂;所述试剂II含有甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸、底物稳定剂。
进一步的,所述试剂I中Tris-双甘肽缓冲液为100-300mmol/L,底物稳定剂的浓度为0.01-0.15g/mL。
进一步的,所述试剂I中Tris-双甘肽缓冲液为150mmol/L,底物稳定剂的浓度为0.06g/mL。
进一步的,所述试剂II中甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸含量为100-300mmol/L,底物稳定剂含量为0.01-0.15g/mL。
进一步的,所述试剂II中甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸含量为150mmol/L,底物稳定剂含量为0.06g/mL。
进一步的,所述Tris-双甘肽缓冲液PH为8.6。
进一步的,所述底物稳定剂为NaN3。
本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂盒,其中装有上述定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂,该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。
本申请的另一方面提供一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的方法,该方法包括向血清样品中加入所述试剂I,37℃孵育5分钟,然后向样品中加入试剂II,37℃延迟1分钟,在405nm或410nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化,计算样本每分钟平均吸光度变化值△A样本/min;用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A空白/min;再通过下式(1)计算得到血清样品的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性:
GPDA活性(U/L)=(△A样本/min-△A空白/min)×K (1)
主波长405nm:K=1955
主波长410nm:K=2259
本方法的原理为:在碱性条件下,GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解,生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺,后者可引起在特定波长下吸光度的升高,吸光度升高速率与GPDA活性成正比。
本发明直接定量测定人血清样品中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂盒,是将分别放置的上述试剂I和试剂II以不同的规格装入试剂盒包装中。该试剂盒具有多种不同的规格,可以分别适用于目前在临床实验室普遍使用的各种国内外品牌的自动生化分析仪器。
本发明采用的试剂盒及检测方法只需十几微升血清,无需离心或电泳等分离处理,操作简便,可满足全自动化分析的要求,适用于大规模样品的及时准确检测。
具体实施方式
实施例一
按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II:
试剂I:
Tris-双甘肽缓冲液 100mmol/L
底物稳定剂 0.01g/mL
试剂II:
甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸 100mmol/L
底物稳定剂 0.01g/mL
在样品管中将234μl试剂I和15μl血清样品混合,在37℃孵育5分钟,使用日立7060型全自动生化分析仪,空白管调零,然后向样品中加入26μL试剂II,37℃延迟1分钟,在405nm或410nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化,计算样本每分钟平均吸光度变化值△A样本/min;用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A空白/min;再通过下式(1)计算得到血清样品的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性:
GPDA活性(U/L)=(△A样本/min-△A空白/min)×K (1)
主波长405nm:K=1955
主波长410nm:K=2259
R1:R2:样本/空白=234:26:15
实施例二
按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II:
试剂I:
Tris-双甘肽缓冲液 300mmol/L
底物稳定剂 0.15g/mL
试剂II:
甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸 300mmol/L
底物稳定剂 0.15g/mL
在样品管中将234μl试剂I和15μl血清样品混合,在37℃孵育5分钟,使用日立7060型全自动生化分析仪,空白管调零,然后向样品中加入26μL试剂II,37℃延迟1分钟,在405nm或410nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化,计算样本每分钟平均吸光度变化值△A样本/min;用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A空白/min;再通过下式(1)计算得到血清样品的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性:
GPDA活性(U/L)=(△A样本/min-△A空白/min)×K (1)
主波长405nm:K=1955
主波长410nm:K=2259
R1:R2:样本/空白=234:26:15
实施例三
按照下述成分和比例配置下述本发明试剂I及试剂II:
试剂I:
Tris-双甘肽缓冲液 150mmol/L
底物稳定剂 0.06g/mL
试剂II:
甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸 150mmol/L
底物稳定剂 0.06g/mL
在样品管中将234μl试剂I和15μl血清样品混合,在37℃孵育5分钟,使用日立7060型全自动生化分析仪,空白管调零,然后向样品中加入26μL试剂II,37℃延迟1分钟,在405nm或410nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化,计算样本每分钟平均吸光度变化值△A样本/min;用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A空白/min;再通过下式(1)计算得到血清样品的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性:
GPDA活性(U/L)=(△A样本/min-△A空白/min)×K (1)
主波长405nm:K=1955
主波长410nm:K=2259
R1:R2:样本/空白=234:26:15
实施例四
使用本实施例1中所列的试剂,按照实施例1所述的方法和条件对120例血清样品的血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性进行测定,每份血清样品同时以市售甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶检测试剂盒(宁波美康生物科技股份有限公司)为对照试剂盒,通过计算本发明试剂盒与对照试剂盒(美康试剂盒)的正常值符合率、异常值符合率、总符合率来证明本发明试剂盒与已批准上市的美康试剂盒等效。
方法:在临床试验单位按对照试剂盒的测定参考范围选取120例临床剩余血清,测定结果70例在参考范围内,50例超出参考范围。然后再用临床研究试剂盒对选取好的120例血清进行测定,通过交叉列表分析计算本发明试剂盒与对照试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率。
研究结果:本发明试剂盒与已批准上市的宁波美康生物科技股份有限公司生产的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶检测试剂盒对120例样本进行测定,以美康试剂盒为对照试剂盒,具体结果如下:
1、交叉列表分析
以美康试剂盒为对照试剂盒,计算本发明试剂盒与美康试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率:
异常值符合率=[50/(50+0)]×100%=100%
正常值符合率=[70/(70+0)]×100%=100%
总符合率=[(70+50)/120]×100%=100%
2、本发明试剂盒与对照试剂盒的相关系数
数据组 | 相关系数(r) |
两组异常值测定结果的相关系数 | 0.997994 |
两组正常值测定结果的相关系数 | 0.925417 |
两组数据总的相关系数 | 0.998702 |
3、本发明试剂盒与对照试剂盒测定结果不符合和的确认情况
在本实施例中,本发明试剂盒与对照试剂盒的测定结果完全符合。
讨论和结论:本实施例收集了120例血清标本,以美康试剂盒的测定结果为标准选取测定结果在参考范围内的标本70例、测定结果高于参考范围上限的标本50例,将本发明试剂盒与对照试剂盒的测定结果进行统计,计算本发明试剂盒与对照试剂盒的正常值符合率、异常值符合率及总符合率。临床试验结果显示:
1)本试剂盒用于体外定量测定人血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的活性。甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶为肝功能检测项目,药物性肝损害或原发性肝汁性肝硬变引起肝内胆汁郁积的病人,其血清GPDA明显升高。与其他肝功能项目联合检测,有助于肝脏疾病的诊断与鉴别诊断。
2)本发明试剂盒与对照产品的异常值符合率、正常值符合率、总符合率及相关系数均能达到方案中规定的标准。
因此,本发明试剂盒能够满足临床性能要求,与已批准上市的宁波美康生物科技股份有限公司生产的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶检测试剂盒等效。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明,不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本申请的保护范围。
Claims (7)
1.一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂,该试剂由分别放置的试剂I和试剂II组成,其中,所述试剂I含有Tris-双甘肽缓冲液、底物稳定剂;所述试剂II含有甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸、底物稳定剂。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂I中Tris-双甘肽缓冲液为100-300mmol/L,底物稳定剂的浓度为0.01-0.15g/mL。
3.根据权利要求2所述的试剂,其特征在于,所述试剂I中Tris-双甘肽缓冲液为150mmol/L,底物稳定剂的浓度为0.06g/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂II中甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸含量为100-300mmol/L,底物稳定剂含量为0.01-0.15g/mL。
5.根据权利要求4所述的试剂,其特征在于,所述试剂II中甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺对甲苯磺酸含量为150mmol/L,底物稳定剂含量为0.06g/mL。
6.一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂盒,其特征在于,其中装有权利要求1至5中任一所述的定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的试剂,该试剂由分别放置的试剂I及试剂II组成。
7.一种定量测定人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性的方法,该方法包括向血清样品中加入所述试剂I,37℃孵育5分钟,然后向样品中加入试剂II,37℃延迟1分钟,在405nm或410nm波长下连续监测1-2分钟样本吸光度变化,计算样本每分钟平均吸光度变化值△A样本/min;用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A空白/min;再通过下式(1)计算得到血清样品的甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性:
GPDA活性(U/L)=(△A样本/min-△A空白/min)×K (1)
主波长405nm:K=1955
主波长410nm:K=2259。
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