背景技术
碱性磷酸酶几乎存在于人体的各个组织中,其中以肝脏为最多其次为肾脏,骨骼、肠、和胎盘等组织。正常人血清中碱性磷酸酶主要来自骨骼,由成骨骼产生,故骨骼病患,特别是当有新骨骼生成时或正在生长的儿童期,血液内的碱性磷酸酶活性增高。当肝脏受到损伤或者障碍时碱性磷酸酶经淋巴道和肝窦进入血液,故肝胆疾病,特别是胆道阻塞时,血清中碱性磷酸酶活性增高。
因此碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因,生理性原因即儿童骨骼发育期、孕妇和骨折愈合期骨组织中的碱性磷酸酶很活跃,检测值偏高;病理性原因即当人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等时,肝细胞过度制造ALP,经淋巴道和肝窦进入血液,同时由于胆汁排泄障碍,反流入血,引起血清中的碱性磷酸酶偏高。因此碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查以及孕妇、骨折愈合期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松等鉴别。
目前,血清(浆)碱性磷酸酶的测定方法有很多,主要有以β-甘油磷酸钠为基质的Bodansky氏测定法、以磷酸苯二钠为基质的King氏测定法和以4-硝基苯磷酸钠为基质的动力学法,但Bodansky氏测定法和King氏测定法不适用于全自动生化分析仪,使用起来不方便。而以4-硝基苯磷酸钠为基质的动力学法适合于各种半、全自动生化分析仪,它的反应原理为碱性磷酸酶在碱性条件下水解对硝基苯磷酸钠生成黄色的对硝基苯酚,对硝基苯酚的生成速率与血清中碱性磷酸酶活性成正比,通过在405nm下测定对硝基苯酚的生成速率来测定血清中碱性磷酸酶的含量。基于此方法的检测试剂盒是国际临床化学协会推荐的碱性磷酸酶检测试剂盒,被广泛应用。
然而上述试剂盒中4-硝基苯磷酸钠稳定性不好,自身易发生水解,致使检测结果偏高,检测准确性降低。
发明内容
有鉴于此,本发明目的是针对现有检测碱性磷酸酶的试剂盒中对硝基苯磷酸钠稳定性不好、检测结果偏高、准确性低的问题,提供了一种检测碱性磷酸酶的试剂盒。
为实现本发明的目的,本发明采用如下技术方案:
一种检测碱性磷酸酶的试剂盒,包括对硝基苯磷酸钠和海藻糖、pH10.0~10.5的缓冲液和激活剂。
优选的,本发明所述试剂盒中,所述海藻糖浓度为0.25~2g/L,更优选为1g/L。
优选的,本发明所述试剂盒的缓冲液为2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液。
优选的,本发明所述试剂盒中所述激活剂包括MgCl2·6H2O、硫酸锌和N-羟乙基乙二胺三乙酸。
优选的,本发明所述试剂盒包括5~20mmol/L对硝基苯磷酸钠、0.25~2g/L海藻糖、100~140mmol/L pH10.0~10.5 2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、0.4~1.5mmol/L MgCl2·6H2O、0.2~0.6mmol/L硫酸锌和0.5~2mmol/L N-羟乙基乙二胺三乙酸。
更优选的,本发明所述试剂盒包括10mmol/L对硝基苯磷酸钠、1g/L海藻糖、120mmol/L pH10.0~10.52-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、0.5mmol/LMgCl2·6H2O、0.5mmol/L硫酸锌和1mmol/L N-羟乙基乙二胺三乙酸。
从上述的技术方案可以看出,本发明提供的检测碱性磷酸酶的试剂盒,包括对硝基苯磷酸钠和海藻糖、pH10~10.5的缓冲液和激活剂。海藻糖存在可以稳定对硝基苯磷酸钠,避免对硝基苯磷酸钠自身水解,提高对硝基苯磷酸钠的稳定性。试验表明,本发明所述试剂盒稳定性好,保存期长,应用本发明所述试剂盒检测检测结果准确性高、精密度好,线性范围宽。本发明所述试剂盒适用范围广,便于推广使用,可应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中碱性磷酸酶含量。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种检测碱性磷酸酶的试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的,本发明采用如下技术方案:
一种检测碱性磷酸酶的试剂盒,包括对硝基苯磷酸钠和海藻糖、pH10.0~10.5的缓冲液和激活剂。
对硝基苯磷酸钠,又名对硝基苯磷酸二钠、4-硝基苯磷酸二钠,英文名为PNPP-Na2、4-NPP,分子式为C6H4O6PNNa2,分子量为263.05。然而对硝基苯磷酸钠稳定性不好,自身易发生水解。海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷键构成的非还原性糖,自身性质非常稳定。本发明人意外发现海藻糖存在可以稳定对硝基苯磷酸钠,避免对硝基苯磷酸钠自身水解,提高对硝基苯磷酸钠的稳定性,保证碱性磷酸酶检测结果的准确性。
优选的,本发明所述试剂盒中,所述海藻糖浓度为0.25~2g/L,更优选为1g/L。
为了酶与底物很好的结合,酶和底物都需要缓冲液提供适宜的解离环境。因此本发明所述试剂盒还包括pH10.0~10.5缓冲液。缓冲液的离子强度也影响着酶的活性,离子强度过高,电解质干扰酶和底物结合,酶活性将逐步下降,但离子强度过低也可能无法激活酶活性。一般选择与生理环境的体液比较接近的离子强度。作为优选,本发明所述试剂盒中的缓冲液为2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液。2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液不仅起缓冲作用,还可作为磷酸的受体参与反应,增进酶促反应的速率。
根据酶催化反应最适条件的要求,在酶测定体系中还需要加入一定量的激活剂。激活剂可以是酶的活性中心,也可以通过其他机制激活酶的活性。激活剂最常见的是二价金属离子如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。优选的,本发明所述试剂盒中所述激活剂包括MgCl2·6H2O、硫酸锌和N-羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)。MgCl2·6H2O和硫酸锌可以提供Mg2+、Zn2+。
在一个具体实施方案中,所述试剂盒包括5~20mmol/L对硝基苯磷酸钠、0.25~2g/L海藻糖、100~140mmol/L pH10.0~10.52-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、0.4~1.5mmol/L MgCl2·6H2O、0.2~0.6mmol/L硫酸锌和0.5~2mmol/L N-羟乙基乙二胺三乙酸。
本发明提供的检测碱性磷酸酶的试剂盒可以为单一试剂,也可以为双试剂。例如,将对硝基苯磷酸钠和海藻糖与缓冲液、金属离子激活剂制成单一试剂;或者,将对硝基苯磷酸钠和海藻糖制成第一试剂,将缓冲液和金属离子激活剂制成第二试剂,在利用该试剂盒检测碱性磷酸酶时,将第一试剂与第二试剂混合,从而检测待测样品中的碱性磷酸酶。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1:本发明所述检测碱性磷酸酶的试剂盒。
本发明所述检测碱性磷酸酶的试剂盒为液体单一试剂,包括:10mmol/L对硝基苯磷酸钠、1g/L海藻糖、120mmol/L pH10.0~10.5HCl-AMP缓冲液、0.5mmol/L MgCl2·6H2O、0.5mmol/L硫酸锌和1mmol/L HEDTA。
实施例2:本发明所述检测碱性磷酸酶的试剂盒。
本发明所述检测碱性磷酸酶的试剂盒为双试剂,第一试剂包括2g/L海藻糖和5mmol/L对硝基苯磷酸钠,第二试剂包括140mmol/L pH10.0~10.5HCl-AMP缓冲液、1.5mmol/L MgCl·6H2O、0.2mmol/L硫酸锌和0.5mmol/LHEDTA。
实施例3:本发明所述检测碱性磷酸酶的试剂盒。
本发明所述检测碱性磷酸酶的试剂盒为液体单一试剂,包括:2g/L海藻糖、20mmol/L对硝基苯磷酸钠、100mmol/L pH10.0~10.5HCl-AMP缓冲液、0.4mmol/L MgCl·6H2O、0.6mmol/L硫酸锌和2mmol/L HEDTA。
实施例4:检测碱性磷酸酶的方法。
设定全自动生化分析仪反应温度37℃,反应方法为速率法,测定主波长405nm,反应方向为正反应,延迟时间60s,测量时间为60s,理论因数为2757。然后取待测样品与试剂盒中的试剂混合均匀后,置于全自动生化分析仪,检测并记录405nm波长下的吸光度变化值。根据计算公式C样=ΔA样/min×K,计算待测样品中碱性磷酸酶的浓度,其中,C样为待测样本浓度;ΔA样/min为样品每分钟吸光度变化率;K为理论因数,已设定为2757。
实施例5:海藻糖加入量的比较试验
取10mmol/L对硝基苯磷酸钠、120mmol/L pH10.0~10.5HCl-AMP缓冲液、0.5mmol/L MgCl2·6H2O、0.5mmol/L硫酸锌和1mmol/L HEDTA分别与不同浓度的海藻糖混合,在37℃条件下进行加速热破坏试验考察,加速试验考察7天,检测加入不同浓度海藻糖后空白吸光度的变化,结果见表1。
表137℃加速实验
由表1的结果可见,在37℃加速条件下考察7天,加入海藻糖后空白吸光度的变化减小,表明海藻糖存在可以稳定对硝基苯磷酸钠,避免对硝基苯磷酸钠自身水解,提高试剂盒的稳定性。
实施例6:本发明所述试剂盒稳定性试验
利用日立7080全自动生化分析仪,检测在2~8℃环境下保存不同时间的实施例1所述试剂盒的空白吸光度,结果见表2。
表2稳定性试验
由表2的结果可见,与市售不含海藻糖的碱性磷酸酶试剂(YZB/国213-40)按比例混合成的工作试剂相比,本发明所述试剂盒半年内的空白吸光度的变化明显小于现有的碱性磷酸酶试剂的空白吸光度,表明本发明所述试剂盒稳定性优于现有的碱性磷酸酶试剂。
实施例7:本发明所述试剂盒准确性检测
以朗道质控中值和朗道质控高值血清作为待测样品,与本发明实施例1所述试剂盒和市售碱性磷酸酶试剂混合,按照实施例4所述方法,利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的碱性磷酸酶含量,设三个重复,结果见表3。
表3朗道质控样品碱性磷酸酶含量检测结果
注:朗道质控中值样品靶值181U/L,
朗道质控高值样品靶值325U/L,
由表3结果可见,与现有碱性磷酸酶试剂相比,本发明所述试剂盒在质控品的
范围内,符合《体外诊断试剂通用要求》,表明本发明所述检测方法准确性好。
实施例8:本发明所述试剂盒重复性检测
以常规血清样本作为待测样品,分别与实施例1所述试剂盒和市售碱性磷酸酶试剂混合,按照实施例4所述方法,利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的碱性磷酸酶含量,结果见表4。
表4样品重复性检测结果
实施例1试剂盒 |
市售碱性磷酸酶试剂 |
74.8 |
73.8 |
76.1 |
74.9 |
75.1 |
73.3 |
74.4 |
73.4 |
76.1 |
75.1 |
76.1 |
78.1 |
75.3 |
76.1 |
74.1 |
74.6 |
77.4 |
75.1 |
74.6 |
75.6 |
CV%=1.34% |
CV%=1.89% |
由表4的结果可见,采用本发明所述试剂盒检测碱性磷酸酶的变异系数CV为1.34%,小于5%,符合《体外诊断试剂通用要求》,并且小于现有的碱性磷酸酶试剂的变异系数,表明本发明所述试剂盒重复性好。
实施例9:本发明所述试剂盒线性的检测
取碱性磷酸酶浓度接近800U/L的高值血清,稀释成5个不同的浓度梯度,理论浓度值依次为50、100、200、400、800U/L,与实施例1所述试剂盒混合,按照实施例4所述方法,利用日立7080全自动生化分析仪检测待测样品中的碱性磷酸酶,每个浓度测定2次,取平均值,根据公式计算相关系数r值,结果见表5。
表5样品线性检测结果
由表7的结果可见,本发明所述检测方法线性范围可达800U/L,表明本发明所述试剂盒线性范围宽、适用范围广。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。