CN111721756A - 一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种碱性磷酸酶活性检测用试剂盒及快速检测方法，所述试剂盒包括显色试剂和标准比色卡，所述显色试剂为酚酞磷酸钠显色试剂或磷酸苯二钠显色试剂。所述试剂盒可以应用于乳品碱性磷酸酶活性检测。本发明还提供快速半定量检测碱性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：(1)配制显色试剂溶液；(2)在显色溶液中加入待测样品，水浴加热；(3)常温静置后将显色结果与标准比色卡对比，快速判断样品中ALP的浓度活性范围以及是否存在渗入生乳，并由此判断致病微生物的灭活程度或加工过程中生乳的渗入污染情况。本发明的检测试剂盒成分简单，便于携带，使用方便，可以快速筛查检测乳品的灭菌情况。

Description

一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于食品质量快速检测技术领域，具体涉及一种用于检测牛奶中碱性磷酸酶活性的试剂盒及检测方法。
背景技术
生乳中微生物及致病菌作为评价牛奶质量安全的一个重要指标，其含量直接影响乳制品的质量安全。微生物含量越高，越容易引起牛奶腐败变质，甚至会造成巴氏杀菌失败，使产品乳中细菌超标。
根据各国国情及自身乳品安全的需要，关于生乳中微生物检测限量以及项目的规定各不相同。我国现行的生乳卫生标准是2010年修改并颁布的《食品安全国家标准-生乳》，其中将生乳中菌落总数指标从旧版4×106CFU/g(mL)调整为2×106CFU/g(mL)，提高了生乳的收购门槛。
美国食品药品管理局(FDA)对生乳菌落总数的限量要求设置为5×105CFU/mL。欧盟EC No.1662/2006关于食品微生物法规规定了生鲜牛乳中和其他动物生乳的菌落总数应分别小于1×105和1.5×106CFU/mL，欧盟EC No.1441/2007关于食品微生物法规又规定生乳和即食生乳中菌落总数分别小于1.5×106和5×105CFU/mL。澳大利亚和新西兰《食物中的微生物限量》中规定，生乳中SPC应低于2.5×104CFU/mL，沙门氏菌、空肠弯曲菌不得检出，大肠菌群低于103CFU/mL，大肠杆菌低于9CFU/mL，李斯特氏菌在即食食品中不得检出。中国台湾地区现行的《生奶CNS 3055-2015》标准规定，生乳中菌落总数的限量为1×105CFU/mL。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP，EC 3.1.3.1)是自然界中普遍存在的一种酶，在牛乳中主要缔合在乳脂肪球膜上(MFGM)。ALP是一种热稳定性较好的酶，其热稳定性要略高生乳中其他致病微生物。因此，当牛乳热处理后，其活性的大幅降低，也标志着牛乳中其他致病微生物的灭活。这一特性可以使ALP作为巴氏杀菌乳热处理效果的标志物，即当ALP检测结果呈阳性时，可认为乳品巴氏杀菌不彻底，或者有生乳渗入污染。为了保证乳及乳制品的卫生安全，不同国家、地区和组织分别制定了关于ALP的限量标准。目前，本领域常用的ALP检测方法有比色法、荧光法和发光法。上述方法作为精准检测技术手段，具有较高的灵敏度，但都需要相应的专用仪器设备、相对复杂的操作步骤、较长的测定时间等，难以适用乳品生产过程中快速、简便的需求。
同时，碱性磷酸酶存在复活现象，即牛乳在加热处理后即可检测为ALP阴性，但是经过一段时间后又变成阳性。研究发现，将乳加热到84℃或将稀奶油加热到74℃会发生ALP的复活。复活的最适储存温度是30℃，在此温度下储存6小时即可检测到ALP复活。在一定条件下发生的ALP复活使检测结果的解读变得复杂，容易造成假阳性。
乳品是否合格，碱性磷酸酶只是其中的一个指标，还要综合菌落总数等指标才能确定其是否杀菌合格，但是为了达到快速筛查的目的，即快速锁定不合格乳品或确定生产线是否存在生乳渗漏污染，可以单独使用ALP作为指标进行快速判断。这时，ALP的检测不要求高精度，但要求阳性时定性准确。
因此，需要一种简单有效的快速检测技术来判定乳品的杀菌程度，以及是否被生乳渗漏污染，并提高大批量样品同时检测的效率和降低检测成本。
发明内容
为了改善上述缺陷，本发明提供一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒以及快速检测方法。
本发明的第一方面，提供一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒，包括标准比色卡和显色试剂。
根据本发明，所述显色试剂包含酚酞磷酸钠或者磷酸苯二钠中的一种，例如选自包含酚酞磷酸钠或磷酸苯二钠的显色试剂。
根据本发明，所述标准比色卡包含至少两个颜色深浅不同的色块，例如包含5-10个色块，优选7个、8个或9个色块。
根据本发明，所述标准比色卡各个色块对应于不同的ALP标准活性浓度或生乳比例。
根据本发明，所述标准比色卡采用如下方法制作：采用不含ALP或ALP已完全失活的液态乳(例如UHT乳)，加入不同活性浓度的ALP标准品或者不同比例的生乳，形成含有不同活性浓度的ALP或生乳比例标准品乳样，向该系列乳样中加入显色试剂，进行显色反应，得到不同浓度ALP或生乳比例显示的色彩，将其显示的色彩定为比色卡的标准色，标注对应颜色下的ALP活性浓度或生乳比例即得标准比色卡。
进一步地，所述ALP标准品的浓度或加入生乳的比例以梯度递增。例如，所述梯度递增是以倍数递增，例如以1倍、2倍、3倍的浓度倍数递增。
根据本发明，所述包含酚酞磷酸钠的显色试剂包括氨水、氯化铵、酚酞二磷酸四钠和水。
根据本发明，所述包含酚酞磷酸钠的显色试剂为所述酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液的酚酞磷酸钠溶液，其中所述NH3-NH4Cl缓冲溶液由所述氨水、氯化铵和水配制而成。
根据本发明，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂包括2,6-二溴苯醌氯亚胺、Na2CO3、磷酸苯二钠、乙醇、硼酸盐缓冲液和水。
根据本发明，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂中，由所述磷酸苯二钠、硼酸盐缓冲液配制磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质，所述2,6-二溴苯醌氯亚胺和乙醇配制成Gibb酚试剂，所述Na2CO3和水配制为Na2CO3溶液。
根据本发明，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂进一步包括正丁醇。
根据本发明，所述试剂盒包括至少一个棕色试剂瓶。
根据本发明，所述试剂盒包括标准比色卡使用方法，优选地，所述试剂盒包括说明书。
本发明的第二方面，提供如第一方面所述试剂盒在乳品碱性磷酸酶活性检测中的应用，所述检测为半定量检测。
本发明的第三方面，提供一种快速半定量检测碱性磷酸酶活性的方法，包括以下步骤：将显色试剂与待测样品接触，进行显色反应，将显色结果与指示ALP活性浓度或生乳比例的标准比色卡对比，确定样品中ALP活性浓度或生乳比例的范围。
根据本发明的方法，所述显色试剂为包括酚酞磷酸钠的显色试剂或者包括磷酸苯二钠的显色试剂。
根据本发明的方法，所述显色反应在水浴中进行；优选地，所述水浴温度为36-44℃，例如38-42℃，再例如为40℃。
根据本发明的方法，所述包括酚酞磷酸钠的显色试剂为酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液形成的酚酞磷酸钠溶液。
根据本发明，所述酚酞磷酸钠溶液的浓度为0.5-1.5g/L，更优选0.8-1.2g/L。在本发明的一个具体实施方式中，所述酚酞磷酸钠溶液的浓度为1g/L。
根据本发明的方法，所述NH3-NH4Cl缓冲溶液的pH为9.0-10.0，优选9.8。
根据本发明的方法，所述加入待测样品的酚酞磷酸钠溶液的体积比为0.5-4:1，优选1-2:1；在本发明的一个具体实施方式中，二者体积比为1:1。
根据本发明的方法，所述酚酞磷酸钠溶液在0-6℃下避光保存。优选地，所述试剂盒于制备后180天内使用。
根据本发明的方法，所述包括磷酸苯二钠的显色试剂包括磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质、Na2CO3、Gibb酚试剂。
根据本发明的方法，所述Gibb酚试剂的浓度为4-16g/L，优选8-12g/L。在本发明的一个具体实施方式中，所述Gibb酚试剂的浓度为10g/L。
根据本发明的方法，使用时所述磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质的浓度为0.4-1.2g/L，优选0.6-1.0g/L。在本发明的一个具体实施方式中，所述磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质的浓度为0.8g/L。
根据本发明的方法，所述硼酸盐缓冲液的pH为9.0-11.0，优选9.8。
根据本发明的方法，所述Na2CO3溶液的质量浓度为12-16％，优选14％。
根据本发明的方法，所述缓冲基质与待测样品的体积比为3-12:1，优选5-10:1，在本发明的一个实施方式中，二者体积比为5:1。
根据本发明的方法，所述Na2CO3溶液与待测样品的体积比为0.5-5:1，优选1-2:1，在本发明的一个具体实施方式中，二者体积比为1:1。
根据本发明的方法，加入的Gibb酚试剂与待测样品的体积比为0.1-0.5:1，优选0.2-0.4:1，在本发明的一个实施方式中，二者体积比为0.3:1。
根据本发明的方法，加入的正丁醇与待测样品的体积比为1-3:1，在本发明的一个实施方式中，二者体积比为2:1。
根据本发明的方法，所述方法还包括配制显色试剂的步骤。作为本发明的一个实施方式，所述配制显色试剂的步骤为：用氨水和氯化铵配制NH3-NH4Cl缓冲溶液，称取酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液中得到酚酞磷酸钠溶液。作为本发明的另一个实施方式，所述配制显色试剂的步骤为：磷酸苯二钠溶于硼酸盐溶液，用水稀释制成缓冲基质；称取2,6-二溴苯醌氯亚胺溶于95％乙醇中制成Gibb酚试剂，Na2CO3溶于水制成Na2CO3溶液。
根据本发明的方法，采用磷酸苯二钠溶液作为显色试剂时，可以包括以下步骤：
(1)磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质的制备：准备测定样品时，称取磷酸苯二钠溶于硼酸盐缓冲液，用水稀释10倍制成缓冲基质，现用现配；
(2)Na2CO3溶液的配制；
(3)Gibb酚试剂(显色试剂)的配制：称取2,6-二溴苯醌氯亚胺溶于95％乙醇中；
(4)取磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质加入待测样品，震荡摇匀后置于36-44℃水浴中；
(5)取出后加入Na2CO3溶液、Gibb酚试剂震荡，加入正丁醇静置，观察正丁醇层的颜色，将显色结果与标准比色卡对比，确定样品中ALP活性浓度或生乳比例的范围。
根据本发明的方法，所述标准比色卡具有如第一方面所述的含义。
根据本发明的方法，采用如第一方面所述的试剂盒进行检测。
在本发明中，使用显色试剂进行样品检测时，所用显色试剂种类、浓度和用量与相应标准比色卡制作时所用显色试剂种类、浓度和用量相同。
术语与定义
“半定量检测”：通过对照显色反应显现的色彩与标准比色卡对比得出ALP浓度或生乳比例的范围。所述标准比色卡提供的是一定范围内的对照结果，不是精确定量，因此是半定量检测。
“液态乳”或“乳品”：指人或哺乳动物分泌的乳汁，包括但不限于牛乳、羊乳、马乳、驴乳、骆驼乳、人乳等以及利用上述乳汁制备的制品。
“生乳”：指从符合国家有关要求的健康奶畜乳房中，挤出的无任何成分改变的，未添加外源物质，未经过加工的常乳。
“UHT乳”：指超高温瞬时灭菌的乳品。
在本发明中溶液的浓度未做特殊说明的情况下，均为质量体积比浓度。
有益效果
1.本发明的碱性磷酸酶的快速检测试剂盒，基于酶促反应原理利用乳中的ALP在显色试剂中发生显色反应的特点，进行检测分析)，检测时无需繁复的前处理步骤，简便快捷高效。
2.检测不需要大型仪器设备，结果简单直观，检测人员不需要进行专门培训，设备成本及人力成本低。
3.通过ALP标准品或掺入生乳比例标准样，从而建立标准比色卡，将待测乳品显示的颜色与标准比色卡对比，可以得出乳品中ALP活性的区间范围，或乳品中可能掺入生乳的比例。通过比色卡大致反映出乳品的杀菌程度，实现快速半定量检测，满足乳品生产线现场检验、加工处理工艺控制、乳品验收和检测中快速检测的需求，有助于生产线的泄露污染排查，避免生乳或杀菌不彻底的乳品进入流通环节，提高乳品加工全过程中ALP的检测效率。
4.试剂盒携带方便，操作简单，可适用于乳品生产线的密闭性检验、产品乳的质量抽检和快速筛查，为乳品的质量控制提供了有利途径。
附图说明
图1：添加不同浓度的ALP标准品的UHT乳样品酚酞磷酸钠试剂显色反应结果
图2：添加不同浓度的ALP标准品的UHT乳样品磷酸苯二钠试剂显色反应结果
图3：基于ALP标准品的酚酞磷酸钠试剂显色反应标准比色卡
图4：基于ALP标准品的磷酸苯二钠试剂显色反应标准比色卡
图5：添加不同比例生乳的UHT乳样品酚酞磷酸钠试剂显色反应结果
图6：添加不同比例生乳的UHT乳样品磷酸苯二钠试剂显色反应结果
图7：基于生乳添加量的酚酞磷酸钠试剂显色反应标准比色卡
图8：基于生乳添加量的磷酸苯二钠试剂显色反应标准比色卡
图9：不同热处理条件乳样的显色反应结果
图10：酚酞磷酸钠显色试剂的有效期测试结果
图11：磷酸苯二钠显色试剂的有效期测试结果
图12：市售乳样1-9号的检测结果(上图：酚酞磷酸钠显色试剂显色结果；下图：磷酸苯二钠显色试剂显色结果)
图13：市售乳样10-17号的检测结果(上图：酚酞磷酸钠显色试剂显色结果；下图：磷酸苯二钠显色试剂显色结果)
具体实施方式
下面结合实施例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的具体实施方式及实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明所用试剂均可商业购买。
【实施例1】标准比色卡的建立
1.显示ALP浓度活性的标准比色卡
采用不含ALP或ALP已完全失活的液态乳(例如UHT乳)，加入不同浓度活性的ALP标准品，形成含有不同浓度活性的ALP标准品乳样。
(1)向该系列乳样中加入1g/L酚酞磷酸钠溶液，待测样品与酚酞磷酸钠溶液的体积比为1:1，40℃水浴加热10分钟，取出后常温放置1小时，得到不同浓度ALP显色的色彩，将其显示的颜色定为显色卡的标准色，标注对应颜色下的ALP浓度活性即得酚酞磷酸钠显色标准比色卡。
(2)向该系列乳样中加入0.8g/L磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质，缓冲基质与待测样品的体积比为5:1，40℃水浴加热10分钟，取出后加入14％Na2CO3溶液和10g/L Gibb酚显色试剂，与待测样品的体积比分别为1:1和0.3:1，震荡摇匀，加入正丁醇，与待测样品的体积比为2:1，静置2min，正丁醇层显示的颜色定为显色卡的标准色，标注对应颜色下的ALP浓度活性即得磷酸苯二钠显色标准比色卡。
在实际检测中，可以将待测乳样显示的颜色与标准比色卡进行对比，通过相同或相近的颜色，快速判断待测乳样中ALP的浓度活性范围。
以乳样中含有350mU/L的ALP标准品浓度活性为浓度梯度的起点，以梯度递增，例如形成的浓度梯度为350、1050、3500、10500、35000、105000、350000mU/L。所述标准显色卡由指示乳品中的7个显色颜色块组成。显色结果如图1、图2所示，根据潘通标准色卡(C版)，识别对应色号如表1所示，据此建立标准比色卡如图3、图4。通过标准比色卡，以检测人员目视分析ALP活性1050mU/L以上的样品。其中，在ALP活性高于10500mU/L时，分辨率和准确度更高可以快速筛查高污染程度的样品。
表1
Figure BDA0001998811020000071
2.显示生乳含量的标准比色卡
采用不含ALP或ALP已完全失活的液态乳(例如UHT乳)，加入不同比例的生乳，形成含有不同生乳比例的乳样。
(1)向该系列乳样中加入1g/L酚酞磷酸钠溶液，待测样品的酚酞磷酸钠溶液的体积比为1:1，40℃水浴加热10分钟，取出后常温放置1小时，得到不同比例生乳显色的色彩，将其显示的颜色定为显色卡的色彩，标注对应颜色下的生乳比例即得酚酞磷酸钠显色标准比色卡。
(2)向该系列乳样中加入0.8g/L磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质，与待测样品的体积比为5:1，40℃水浴加热10分钟，取出后加入14％Na2CO3溶液和10g/L Gibb酚显色试剂，与待测样品的体积比分别为1:1和0.3:1，震荡摇匀，加入正丁醇，与待测样品的体积比为2:1，静置2min，正丁醇层显示的颜色定为显色卡的标准色，标注对应颜色下的ALP浓度活性即得磷酸苯二钠显色标准比色卡。
在实际检测中，可以将待测乳样显示的颜色与标准比色卡进行对比，通过相同或相近的颜色，快速判断待测样品中是否存在生乳渗入污染。以生乳为0％为起点，形成的浓度梯度为0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、100％。所述标准显色卡由指示乳品中的9个显色颜色块组成。显色结果如图5、图6所示，根据潘通标准色卡(C版)，识别对应色号如表2所示，据此建立标准比色卡如图7、图8。通过标准比色卡，以检测人员目视分析生乳比例0.25％以上的样品。其中，在生乳比例高于1％时，分辨率和准确度更高，可以快速筛查高污染程度的样品。
表2
Figure BDA0001998811020000081
具体地，在实际测量时，所述标准比色卡指示了待测乳样在显色体系中水浴加热后，乳样或指示层显示的颜色与ALP活性之间的关系，或者指示了待测乳样在显色体系中水浴加热后，乳样或指示层显示的颜色与掺入生乳比例之间的关系。
【实施例2】试剂盒制备及显色试剂配制
(1)试剂盒组成：氨水、氯化铵、酚酞二磷酸四钠、去离子水，棕色试剂瓶一只。
酚酞磷酸钠显色试剂配制：
取适量氨水和氯化铵溶液混合配制NH3-NH4Cl缓冲溶液。可根据本领域常规操作方法，选用本领域常规浓度的氨水和氯化铵溶液配制所需pH范围的NH3-NH4Cl缓冲溶液。可以加入80mL1mol/L氨水和20mL1mol/L氯化铵溶液混合配制NH3-NH4Cl缓冲溶液(pH＝9.8，磷酸酶活性最适pH值)。
称取酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液中，冷藏避光保存，作为显色试剂。将配制好的试剂装于棕色瓶中，于冰箱内2-6℃下冷藏保存。酚酞磷酸钠溶液的浓度为1g/L。
(2)试剂盒组成：2,6-二溴苯醌氯亚胺、Na2CO3、磷酸苯二钠、硼酸盐缓冲液(pH为9.8)、95％乙醇、去离子水，棕色试剂瓶两只。
磷酸苯二钠显色试剂配制：
准备测定样品时，称取磷酸苯二钠溶于硼酸盐缓冲液，用水稀释10倍制成缓冲基质，现用现配。硼酸盐缓冲液的pH为9.8，所述-硼酸盐磷酸苯二钠-硼酸盐溶液中磷酸苯二钠的浓度在稀释前为8g/L，稀释后的缓冲基质浓度为0.8g/L。
将配制好的试剂装于棕色瓶中，于冰箱内2-6℃冷藏保存，于7天内使用。
称取2,6-二溴苯醌氯亚胺溶于95％乙醇中，置棕色瓶中于冰箱内保存，于7天内使用。所述Gibb酚试剂的浓度为10g/L。
称取碳酸钠溶于水中，现用现配，Na2CO3溶液的质量浓度为14％。
【实施例3】不同热处理乳样的测定
准备不同热处理的巴氏杀菌乳(由现代牧业提供)，其杀菌温度分别为72℃、75℃、80℃、85℃、90℃、100℃、105℃、110℃和120℃，杀菌时间均为15s，以及巴氏杀菌乳杀菌前、UHT乳灭菌前的生乳各一份。
取1g/L酚酞磷酸钠显色溶液1mL于离心管，加入待测样品1mL，震荡摇匀后置于40℃水浴中加热10分钟。取出后常温放置1小时，观察其颜色变化。
取0.8g/L磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质5mL于另一离心管，加入待测样品1mL，震荡摇匀后置于40℃水浴中加热10分钟。取出后加入14％Na2CO3溶液1mL、10g/L Gibb酚试剂0.3mL，震荡摇匀，加入正丁醇2mL静置2分钟，观察正丁醇层显示的颜色。
结果如图9所示。在酚酞磷酸钠显色体系下，生乳的质控样品显示为玫瑰红色，与比色卡205C一致，72℃至120℃的乳样显示颜色均为白色(不变色)。在磷酸苯二钠显色体系下，生乳的质控样品显示为深海蓝色，与比色卡303C一致，72℃至120℃的乳样显示颜色均为棕黄色，与比色卡456C一致。因此，72℃至120℃的乳样ALP活性均低于10500mU/L，生乳渗入不超过1％，基本可以判定为杀菌充分，不存在生乳渗漏污染。
【实施例4】显色试剂的有效期测试
于不同时间分别配制NH3-NH4Cl缓冲溶液及酚酞磷酸钠溶液装棕色瓶于冰箱内0-6℃保存。量取ALP标准品(活性为35U/mgP，8.5mgP/mL)，置于15mL离心管中，加入ALP活性为0的UHT乳，配成ALP活性为350000mU/mL的标准品乳样。逐级稀释配制成ALP活性为350000、105000、35000、10500、3500、1050、350mU/mL的系列标准品乳样。
取1g/L酚酞磷酸钠显色溶液1mL于离心管，加入待测样品1mL，震荡摇匀后置于40℃水浴中加热10分钟。取出后常温放置1小时，观察其颜色变化。
于不同时间分别配制磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质及Gibb酚试剂装棕色瓶于冰箱内0-6℃保存。量取不同体积的生鲜牛乳，置于15mL离心管中，加入ALP活性为0的UHT乳，配成生乳比例为0％、0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、100％的系列乳样。
取0.8g/L磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质5mL于另一离心管，加入待测样品1mL，震荡摇匀后置于40℃水浴中加热10分钟。取出后加入14％Na2CO3溶液1mL、10g/L Gibb酚试剂0.3mL，震荡摇匀，加入正丁醇2mL静置2分钟，观察正丁醇层显示的颜色。
结果如图10、11所示，在酚酞磷酸钠显色体系下，系列标准品的显色状况完全一致。在磷酸苯二钠显色体系下，7天时的显色已经改变，但仍存在梯度变化，30天时显色无差异。
通过比较各组乳样的显色情况，可以确定酚酞磷酸钠显色试剂的有效期至少应为180天、磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质与Gibb酚试剂的有效期应不超过7天、最好现用现配。
【实施例5】市售液态乳样品检测
购买市售液液态乳样品(奶业创新团队样品库中随机抽取))共9份，为第一组，样品编号1-9；取样某乳品加工企业液态乳样品(上海)共8份，为第二组，样品编号10-17；并准备生乳一份(阳性质控)。
取1mL实施例2配制的酚酞磷酸钠显色溶液于离心管，加入待测样品1mL，震荡摇匀后置于40℃水浴中加热10分钟。取出后常温放置1小时，观察其颜色变化，并与标准比色卡进行对比。
取5mL实施例2配制的磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质于另一离心管，加入待测样品1mL，震荡摇匀后置于40℃水浴中加热10分钟。取出后加入Na2CO3溶液1mL、Gibb酚试剂0.3mL震荡摇匀，加入正丁醇2mL静置2分钟，记录正丁醇层显示的颜色，并与标准比色卡进行对比。
结果如图12、13所示。在酚酞磷酸钠显色体系下，质控样品显示为玫瑰红色，样品1-9均为白色(不变色)。在磷酸苯二钠显色体系下，生乳的质控样品显示为深海蓝色，样品1-9均为棕黄色。因此，样品ALP活性均低于10500mU/L，生乳渗入不超过1％，基本可以判定为杀菌充分，不存在生乳渗漏污染。
在酚酞磷酸钠显色体系下，样品10和14为淡玫瑰红色，接近比色板7401C和489C，样品11、12、13、15、16、17均为白色(不变色)。在磷酸苯二钠显色体系下，生乳的质控样品显示为深海蓝色，样品10和14为军车绿色，接近比色板385C和384C，样品11、12、13、15、16、17均为棕黄色，与比色卡456C一致。因此，样品11、12、13、15、16、17的ALP活性均低于10500mU/L，生乳渗入不超过1％，基本可以判定为杀菌充分，不存在生乳渗漏污染；样品/10和14的ALP活性约为10500mU/L左右，生乳渗入约为2％左右，基本判定为杀菌不充分，或存在少量生乳渗漏污染。
实验表明，当ALP浓度分辨为10500时mU/L，或生乳渗入不超过1％，目视检测可以分辨出酚酞磷酸钠显色反应和磷酸苯二钠显色反应。
以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种碱性磷酸酶活性检测试剂盒，其特征在于，包括标准比色卡和显色试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色试剂包含酚酞磷酸钠或者磷酸苯二钠中的一种，例如选自包含酚酞磷酸钠或磷酸苯二钠的显色试剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述标准比色卡包含至少两个颜色深浅不同的色块，例如包含5-10个色块；
优选地，所述标准比色卡各个色块对应于不同的碱性磷酸酶标准活性浓度或生乳比例。
优选地，所述标准比色卡采用如下方法制作：采用不含ALP或ALP已完全失活的液态乳，加入不同活性浓度的ALP标准品或者不同比例的生乳，形成含有不同活性浓度的ALP或生乳比例标准品乳样，向该系列乳样中加入显色试剂，进行显色反应，得到不同浓度ALP或生乳比例显示的色彩，将其显示的色彩定为比色卡的标准色，标注对应颜色下的ALP活性浓度或生乳比例即得标准比色卡；
优选地，所述ALP标准品的浓度或加入生乳的比例以梯度递增；例如，所述梯度递增是以倍数递增。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述包含酚酞磷酸钠的显色试剂包括氨水、氯化铵、酚酞二磷酸四钠和水；
优选地，所述包含酚酞磷酸钠的显色试剂为所述酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液的酚酞磷酸钠溶液，其中所述NH3-NH4Cl缓冲溶液由所述氨水、氯化铵和水配制而成；
优选地，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂包括2,6-二溴苯醌氯亚胺、Na2CO3、磷酸苯二钠、乙醇、硼酸盐缓冲液和水；
优选地，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂中，由所述磷酸苯二钠、硼酸盐缓冲液配制磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质，所述2,6-二溴苯醌氯亚胺和乙醇配制成Gibb酚试剂，所述Na2CO3和水配制为Na2CO3溶液；
优选地，所述包含磷酸苯二钠的显色试剂进一步包括正丁醇；
优选地，所述试剂盒包括至少一个棕色试剂瓶。
5.如权利要求1-4任一项所述试剂盒在乳品碱性磷酸酶活性检测中的应用，所述检测为半定量检测。
6.一种快速半定量检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤将显色试剂与待测样品接触，进行显色反应，将显色结果与指示ALP活性浓度或生乳比例的标准比色卡对比，确定样品中ALP活性浓度或生乳比例的范围。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述显色试剂为包括酚酞磷酸钠的显色试剂或者包括磷酸苯二钠的显色试剂；
优选地，所述包括酚酞磷酸钠的显色试剂为酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液形成的酚酞磷酸钠溶液；
优选地，所述酚酞磷酸钠溶液的浓度为0.5-1.5g/L；
优选地，所述NH3-NH4Cl缓冲溶液的pH为9.0-10.0；
优选地，所述加入待测样品的酚酞磷酸钠溶液的体积比为0.5-41:1；
优选地，所述酚酞磷酸钠溶液在0-6℃下避光保存，优选地，所述试剂盒于制备后180天内使用；
优选地，所述包括磷酸苯二钠的显色试剂包括磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质、Na2CO3、Gibb酚试剂；
优选地，所述Gibb酚试剂的浓度为4-16g/L；
优选地，使用时所述磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质的浓度为0.4-1.2g/L；
优选地，所述硼酸盐缓冲液的pH为9.0-11.0，优选9.8；
优选地，所述Na2CO3溶液的质量浓度为14％。
优选地，所述缓冲基质与待测样品的体积比为3-12:1。
优选地，所述Na2CO3溶液与待测样品的体积比为0.5-5:1；加入的Gibb酚试剂与待测样品的体积比为0.1-0.5:1；
优选地，所述正丁醇与待测样品的体积比为1-3:1。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括配制显色试剂的步骤
优选地，所述配制显色试剂的步骤为：用氨水和氯化铵配制NH3-NH4Cl缓冲溶液，称取酚酞二磷酸四钠溶于NH3-NH4Cl缓冲溶液中得到酚酞磷酸钠溶液；
优选地，所述配制显色试剂的步骤为：磷酸苯二钠溶于硼酸盐溶液，用水稀释制成缓冲基质；称取2,6-二溴苯醌氯亚胺溶于95％乙醇中制成Gibb酚试剂，Na2CO3溶于水制成Na2CO3溶液。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质的制备：准备测定样品时，称取磷酸苯二钠磷酸苯二钠溶于硼酸盐缓冲液，用水稀释制成缓冲基质，现用现配；
(2)Na2CO3溶液的配制；
(3)Gibb酚试剂(显色试剂)的配制：称取2,6-二溴苯醌氯亚胺溶于95％乙醇中；
(4)取磷酸苯二钠-硼酸盐缓冲基质加入待测样品，震荡摇匀后置于36-44℃水浴中；
(5)取出后加入Na2CO3溶液、Gibb酚试剂震荡，加入正丁醇静置，观察正丁醇层的颜色，将显色结果与标准比色卡对比，确定样品中ALP活性浓度或生乳比例的范围。
10.根据权利要求6-9任一项所述的方法，其特征在于，所述标准比色卡为权利要求1-4任一项所述的标准比色卡。
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