CN104619857A - 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法 - Google Patents
用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104619857A CN104619857A CN201280074120.5A CN201280074120A CN104619857A CN 104619857 A CN104619857 A CN 104619857A CN 201280074120 A CN201280074120 A CN 201280074120A CN 104619857 A CN104619857 A CN 104619857A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- def
- euglobulin
- plasminogen
- concentration
- biological activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/127—DNAzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
Abstract
公开了用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的方法,其包括以下步骤:a)使哺乳动物的优球蛋白及对血纤维蛋白溶酶具特异性的底物接触去纤维蛋白多核苷酸,该底物通过与该血纤维蛋白溶酶作用而提供可测量的产物;以及b)测量于连续时间中所产生的产物的量,从而测定该去纤维蛋白多核苷酸的生物活性。亦公开了液体去纤维蛋白多核苷酸制剂,其优选为水溶液,具有定义的生物活性,且特别地具有去纤维蛋白多核苷酸的活性为25至35IU/mg,优选27.5至32.5IU/mg,以及更优选28至32IU/mg。
Description
本发明是关于一种用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的方法,以及更特别地是关于一种间接酶促方法,用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性。
发明的技术领域
去纤维蛋白多核苷酸(Merck Index,1996,no.2915)是天然起源的物质,其是从动物器官提取而得,且其是由低分子量的聚脱氧核糖核苷酸钠盐组成。去纤维蛋白多核苷酸已成为许多医药研究的主题,所述研究已推测其可作为抗凝血剂用于治疗(美国专利号3,829,567)。
此外,去纤维蛋白多核苷酸亦已被成功用于治疗外周动脉血管疾病、急性肾功能不全(美国专利号4,694,134)或急性心肌缺血(美国专利号第4,693,995)。
目前,去纤维蛋白多核苷酸正用于进行静脉阻塞疾病(VOD)的治疗与预防的临床试验。
如同其他提取而得的生物物质,去纤维蛋白多核苷酸也受制于组成的有限变化性,这对于天然生物聚合物是典型的。此状况的经典例子是肝素,已知其在链长、分子量、组成、硫酸盐化的程度等方面随批次的变化性。此结果是相同重量的去纤维蛋白多核苷酸可能实际上从比生物活性的观点而言是非等同的。
由于其固有的生物聚合物本质,提取、分离与纯化的过程无法本身确保产物的绝对的再现性。
然而,如果控制良好,可能降低此变化性。为达此目的,已有研究得到用于通过从器官提取分离去纤维蛋白多核苷酸的标准化的工业过程,例如美国专利号4,985,552所描述的。
上述过程所得到的产物通过测定一些特定的物理化学参数而表征,例如,电泳移动率、消光系数、旋光力以及质量平均相对分子质量。然而,这些参数基本上取决于去纤维蛋白多核苷酸的结构,并且无法提供其生物活性的信息。
目前如我们所知,已报导用于评估去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的方法仅有纤维蛋白平板测试法与优球蛋白水解时间凝血弹性图式记录(thromboelastographic recording)(Prino G.、Mantovani M.、Niada R.、Coccheri S.、Butti A.、Indagini preliminari sull′attivitàfibrinolitica、nell′animale e nell′uomo与di una nuova sostanza发表的diversi organianimali,Simposio Internazionale:La ricerca scientifica nell’industriafarmaceutica,意大利,罗马,1975年10月2-4日—Il Farmaco,Ed.Prat.)(1969),24,552-561),以及美国专利号7,338,777公开的以血纤维蛋白溶酶为基础的方法,上述皆通过引用并入本案。
然而,在上述方法中,优球蛋白水解时间凝血弹性图式记录的特征是相当大的实验复杂性、不令人满意的再现性与精准性,以及,在凝血弹性图式记录的一些特定例子中,反应线性受限于非常严格的浓度范围。
关于血纤维蛋白溶酶为基础的方法,通常通过体外测试中的多种标准而测定血纤维蛋白溶酶的酶促活性。最常使用的方法之一是由分光光度法或荧光测定法测定发色或发荧光化合物,所述化合物是通过血纤维蛋白溶酶作用于合适的底物上而释放(Haemostasis,(1978),7,138-145)。通常使用具有式A1-A2-A3-X的肽底物,其中A1与A2是主要为非极性的氨基酸,A3是赖氨酸或精氨酸,以及X代表可测量的游离的化合物,例如对硝基苯胺(pNa)或2-萘胺(NA)(Haemostasis,(1978),7,146-149)。除了上述肽底物之外,已成功使用其他的、较简单的化合物,例如p-硝基苄基对甲苯磺酰-L-精氨酸(Haemostasis,(1978),7,105-108)。
该化合物X释放至孵育基质中的速率是与样品中存在的血纤维蛋白溶酶活性(单位/毫克)成比例。美国专利号7,338,777公开的方法因此是基于上述血纤维蛋白溶酶评估测试法中的发现,去纤维蛋白多核苷酸增加化合物X的释放速率与其浓度成比例。
然而,此方法是在TRIS缓冲液进行,不需要任何其他的血浆/血清活化物/抑制物。因此,该程序不会反应出生理条件或是恰当模拟去纤维蛋白多核苷酸在体内的作用机制。
因此,至今未有真正有效地、精确地且可再现的方法被描述并且验证用于测量去纤维蛋白多核苷酸的生物活性,而精确地反映出产物在复杂生物系统(体内)中的作用机制。。
我们已经建立简单与可靠的方法用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性,使得通过提取得到的样品受到控制,且因而使得以去纤维蛋白多核苷酸为基础的药物制备能够被标准化。
本发明的方法可测定去纤维蛋白多核苷酸的比生物活性,与参考标准比较,具有高度的精准性与正确性。
附图简述
图1是通过以去纤维蛋白多核苷酸(浓度为0-50μg/ml,0-100分钟)活化或非活化的哺乳动物的优球蛋白级分,显示pNA自底物S-2251的释放动力学的曲线图。
图2是说明关于去纤维蛋白多核苷酸的标准品与测试样品的上升的S形曲线图。
图3是显示标准制剂(例如:S1_Ca,S1_Cb,S1_Cc)的“吸光度与时间的对应图”,其鉴定合适的线性范围(例如:从30至35分钟)。
发明内容
本发明因此涉及用于测定去纤维蛋白多核苷酸样品的比生物活性的方法,该方法包含以下步骤:
a)使优球蛋白及血纤维蛋白溶酶特异性的底物接触去纤维蛋白多核苷酸,该底物通过与该血纤维蛋白溶酶反应而提供可测量的产物;以及
b)测量在连续时间所形成的产物的量。
本发明是一种间接的体外方法,用于测定去纤维蛋白多核苷酸的活性,其以去纤维蛋白多核苷酸与优球蛋白之间的功能性相互作用为基础。
优球蛋白是血清球蛋白的级分,其无法溶于蒸馏水中,但可溶于盐溶液中。
优球蛋白包含纤维蛋白原、PAI-1、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶原、以及少量的α2-抗血纤维蛋白溶酶和因子VIII。
本发明人惊讶地发现去纤维蛋白多核苷酸催化血纤维蛋白溶酶原水解为血纤维蛋白溶酶。因此,当去纤维蛋白多核苷酸与优球蛋白及血纤维蛋白溶酶特异性的底物(例如式A1-A2-A3-X的肽,如Haemostasis,(1978),7,138-149公开的,通过引用并入本文)孵育时,该化合物X释放至孵育基质的速率增加与去纤维蛋白多核苷酸本身的浓度成比例。
换言之,去纤维蛋白多核苷酸催化优球蛋白中所含的血纤维蛋白溶酶原水解为血纤维蛋白溶酶;所述血纤维蛋白溶酶与血纤维蛋白溶酶特异性的底物,优选发色底物酶促反应,以提供可测量的产物。
本发明的方法因此还包括步骤:c)在去纤维蛋白多核苷酸的标准样品与测试样品二者的酶促反应过程中,测定该可测量的产物的释放速率;d)数学上地及/或图形上地关联该释放速率与所对应的去纤维蛋白多核苷酸浓度,以得到该去纤维蛋白多核苷酸的测试样品的生物活性。
本发明中用于测定的去纤维蛋白多核苷酸样品通常依照已知方法由从器官提取而制备,所述方法例如在美国专利号4,985,552中描述,其于前已述,且亦通过引用并入本文。
根据本发明的方法,选择正常工业制造的批次的去纤维蛋白多核苷酸作为参考样本(标准品),并将其用于制备校正曲线。
一般而言,本发明的方法甚至在污染物存在下提供去纤维蛋白多核苷酸的精准与正确测量,所述污染物为例如RNA、肝素、降解的去纤维蛋白多核苷酸(从中已移除嘌呤与嘧啶的去纤维蛋白多核苷酸)或是乙醇,前提是它们的浓度以重量计通常小于10%,从而不会损害系统。
除了允许测定去纤维蛋白多核苷酸之外,本发明的方法亦可测定衍生自去纤维蛋白多核苷酸的其他生物学上相当的物质,例如去氨基的去纤维蛋白多核苷酸,或更简单地,受到物理化学条件结合而变性/降解的去纤维蛋白多核苷酸。
本方法的灵敏度足以检测浓度(测定系统中的最终浓度)小于或等于2.5μg/ml的去纤维蛋白多核苷酸,并且通常表现良好的关联性,高达大于或等于1000μg/ml的最大浓度值。
所使用的优球蛋白通常是任何的哺乳动物优球蛋白级分,例如牛、猪、兔或人类的优球蛋白,优选人类与牛的优球蛋白。
然而,虽然优球蛋白级分是选择的酶促系统,使用其他等同酶促系统,例如稀释的血浆与血清(使用缓冲液高达1:10)、人工制成或是分离的血纤维蛋白溶酶原的组合、tPA、uPA、PAI-1&2与α2-抗血纤维蛋白溶酶以及化学与生物相关且具有相似功能的酶促系统等,皆落入本发明的范围内。
在本发明的方法中,血纤维蛋白溶酶的底物可被理解为任何对于血纤维蛋白溶酶有特异性的底物,其在此方法条件下,释放出可检测的水解产物X。
取决于可检测的基团X的本质,亦可采用本领域技术人员所周知的备选检测系统。分光光度或荧光测定的检测系统特别有利,特别是分光光度系统。
通常使用的底物是血纤维蛋白溶酶原-血纤维蛋白溶酶测定法特异性的底物。优选使用式A1-A2-A3-X的肽,其中A1与A2为主要是非极性的氨基酸,A3是赖氨酸或精氨酸,以及X代表可测量的基团。这些底物的实例是Val-Leu-Lys-pNa、Val-Phe-Lys-pNa或pyroGlu-Phe-Lys-pNa,其中分光光度法可检测的基团X是对硝基苯胺(pNA)。其他合适的底物,例如Val-Gly-Arg-2NA,包含2-萘胺,其可由荧光测定法测量。特别优选的底物是化合物H-D-缬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酸-p-硝基苯胺(H-D-Val-Leu-Lys-pNA)。
用于测定优球蛋白级分中的去纤维蛋白多核苷酸活性的具体底物通常是为商业上可取得的。
本发明的测定方法是通过将去纤维蛋白多核苷酸样品置放于特定pH与摩尔浓度的优球蛋白溶液中实施的。
特别地,得自哺乳动物血浆的优球蛋白级分是以盐缓冲液将优球蛋白溶解并稀释为产生血浆的原始体积而重构的(例如:得自10毫升血浆的优球蛋白级分以盐缓冲溶液溶解并重构为10毫升,其pH在7与8之间)。
然而,在发色底物的情况下,通常使用的底物浓度为从0.3至4mM,优选为从2.5至3.5mM,以及有利地为3mM,而在发荧光底物的情况下,使用浓度为从0.05至0.15mM。
如同其他酶促方法,本发明的测定方法对基质的pH敏感。
事实上,它通常不能用于极端的pH值,在所述pH值酶促系统会被失活。
优选在进行测量期间的任何时间,基质的pH值都不会发生变化,因此,以选自通常用于生物测试的那些的缓冲系统重构优球蛋白级分。合适的缓冲系统,例如可为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或是三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐与氯化钠(TRIS-NaCl)缓冲液。优选以TRIS-NaCl进行优球蛋白级分的重构。
在本发明的方法中,通常优选是将孵育基质的pH维持在约7至8的范围,更优选为约7.4至7.6。
此外,优选地保持缓冲系统的浓度在10至200mM的范围,优选为约50mM。更具体而言,TRIS-NaCl的浓度应为50mM的TRIS与150mM的氯化钠。
在用于测定去纤维蛋白多核苷酸生物活性的本发明的方法中,去纤维蛋白多核苷酸样品溶液直接稀释于优球蛋白级分中,而后加入发色或发荧光底物。特别地,为了能够测量,优选地将去纤维蛋白多核苷酸预稀释/溶解于TRIS-NaCl缓冲液中,以得到样品与标准品二者的母储液溶液。通过连续稀释,从母储液溶液稀释该样品与该标准品成为定义体积的优球蛋白级分,直到约1至1000μg/mL的去纤维蛋白多核苷酸的分析浓度范围。
本发明的测定方法的重要参数为温度。关于建立参考曲线以及在测量阶段,优选地在整个测量过程中,以及对于所有测量的样品维持相同温度。为了达到此目的,优选使用温控装置,视需要可进行数组测量,适当改变样品的位置,以确保系统具有最大的热均质。
一般而言,此测定方法使用的温度范围,例如25至40℃,优选为35至39℃,甚至更优选为37℃。
根据本发明,当已经加入所有的反应试剂时,开始测量通过去纤维蛋白多核苷酸的作用释放在基质中的化合物X的浓度,并且以预定的频率,持续测量一段预定的时间,作为X与检测系统的化学本质的函数。
类似于其他生物测定方法,本发明的方法亦提供校正阶段与测量阶段,所述校正阶段与测量阶段在相同的微量板上进行,以尽可能减少实验变量的发生。
该校正阶段包括在已知增加的去纤维蛋白多核苷酸(标准品)浓度,获得与样品相关的吸光度数据,那些数据的统计再处理以及校正曲线的外推,其表示本发明的酶促反应速率的增加与优球蛋白级分中存在的去纤维蛋白多核苷酸的浓度之间的关联性。在测量阶段中,由于在校正阶段得到的该关联性,可在相同条件下所测量和处理的吸光度基础上,决定去纤维蛋白多核苷酸样品的未知生物活性。
详言之,实验规程通常提供用于制备数个样品,在多种已知浓度的去纤维蛋白多核苷酸的标准品与未知。根据预定的稀释因子,通过连续稀释母溶液制备去纤维蛋白多核苷酸样品
在本发明的方法中,优选制备至少5个浓度的标准品与5个浓度的待测样品,对于标准品的每一个浓度以及类似地对于测试样品的每一个浓度,通常是对母溶液连续1:2稀释,制备至少4个重复。
去纤维蛋白多核苷酸的标准品与测试样品浓度通常是0.1至1000μg/ml。
该测试样品的浓度优选与标准品浓度的数量级相同。
根据上述说明,每一个浓度的测量优选是在一个微量板上进行,其中每个样品,分别是对应浓度的标准品与测试样品的位置优选是交替的。根据此样品放置的方案(所述方案以细节说明于实验部分),对于每一浓度的去纤维蛋白多核苷酸标准品与测试样品,每一次至少测量4个吸光度值。
在预定的时间进行上述测量的组,亦即,首先在时间t0,即已经加入所有的成分且在本发明的酶促反应开始之前,而后以准确的间隔,进行足够长的时间以获取所需要的数据。
优选地,持续进行吸光度测量至最多90分钟,每1-10分钟进行读取。更有利的是每分钟进行读取。在这样的波长进行分光吸光值读取,所述波长取决于在酶促水解反应过程中所释放的可检测的基团X的本质。在X为p-NA的具体例子中,测量405nm处的吸光度。
称为原始数据的标准品与未知的去纤维蛋白多核苷酸样品的吸光度读数通常是直接源自于提供读取操作的相同装置,其以表示每一时间点与孔的吸光值的方式被制表。
而后,使用例如Spread Sheet—Microsoft处理该原始数据。此第一处理操作导致计算在每一时间点以及对于每组读数的平均吸光度与相关标准偏差,各组包括标准品与测试样品去纤维蛋白多核苷酸二者的每一浓度至少4个重复。
以用于生物测定法测定的商业上可获取的软件进行另外的数据的统计处理,如Finney D J,Statistical Method in Biological Assay,第2版Ch.Griffin,London和相关药典中所述。
更确切而言,根据本发明,可使用如相关European PharmacopoeiaGeneral text 5.3,Statistical Analysis中所定义的平行线模式、斜率比例模式与四参数逻辑曲线模式,进行去纤维蛋白多核苷酸的生物测定法测定。
如第1图所示,通过将时间放在横坐标以及吸光度放在纵坐标,得到直线,其斜率“b”与酶促反应的速率成比例:通过增加去纤维蛋白多核苷酸的浓度,水解的速率与“b”值会成比例地增加。最后,如上所述标准品去纤维蛋白多核苷酸与测试样品去纤维蛋白多核苷酸的每组重复计算的斜率值与其相关的去纤维蛋白多核苷酸的浓度的相关。可使用横坐标的合适的数学转型(亦即去纤维蛋白多核苷酸浓度的对数)以替代真实值。
图形上,该关联性造成该标准品为S形以及测试样品为S形(图2);S形的中央部分具有两条直线,其通常为平行,且其间距离是该测试样品与该标准品之间生物活性差的函数。此间隔使用如Finney D J,StatisticalMethod in Biological Assay,第2版Ch.Griffin,London中所述的平行线模式用于效能测定。
为了更具体的测定,使用四参数逻辑曲线模式,并且在此情况中,样品与标准品二者的整个S形曲线用于计算样品的相对生物效能。
在本发明优选的实施方式中,去纤维蛋白多核苷酸的标准溶液与待测的样品溶液被置入微量板的各个孔中。优球蛋白级分在要使用时制备,且其是去纤维蛋白多核苷酸储液的稀释基质。最后,加入含有发色底物的溶液。而后,将微量板置于恒温读取器,并在快速搅动后,以预定的间隔与预定的时间期间,进行系统的吸光度的读取。而后,处理得到的原始数据,因而测定去纤维蛋白多核苷酸样品的未知活性。
由以下实施例可理解,根据本发明的方法可得到液体去纤维蛋白多核苷酸制剂,优选为水溶液,其具有定义的生物活性,以及特别地具有25至35IU/mg,优选27.5至32.5IU/mg,以及更优选28至32IU/mg的去纤维蛋白多核苷酸活性。
液体去纤维蛋白多核苷酸制剂优选以容器,更优选以小瓶的形式销售,包含于2.5ml的缓冲水溶液中的200mg的去纤维蛋白多核苷酸(优选为pH6.5至8.5,更优选为7至8),在使用前稀释;结果,当以本发明的方法评估生物活性时,每一个容器呈现5000至7000IU,优选5500至6500IU,更优选5600至6400IU的去纤维蛋白多核苷酸活性。
本发明的上述与其他方面如以下实施例所述,然而以下实施例并不被视为限制本发明。
实施例
以下材料用于本案的实施例中:
装置
程序与软件
oMicrosoft(微软公司,Redmond,Wash.,USA)物质
o去纤维蛋白多核苷酸(Gentium)
o发色底物S-2251(Chromogenix InstrumentationLaboratory S.p.A.,意大利米兰)
o三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(TRIS)-氯化钠(TRIS-NaCl),(Sigma-Aldrich,意大利米兰)
o1N HCl(Carlo Erba reagenti,意大利米兰)
o1N NaOH(Carlo Erba reagenti,意大利米兰)
o牛血浆(Tebu Bio Italia,Magenta(MI),意大利)
o冰醋酸(Carlo Erba reagenti,意大利米兰)溶液
oTRIS-NaCl(制备1L):将6.06克的TRIS-HCl与2.2g的NaCl定量转入1L烧杯中。溶解于500mL的经纯化的水中,并且以约40mL的1N HCl将pH调整至7.4。将溶液定量转入1L容量瓶中,并且以纯水稀释溶液至容量。将该溶液储存于冰箱(2-8℃)。
o发色底物S2251(CAS 63589-93-5)3mM(制备15.2mL):以15.2mL经纯化的水溶解约25mg的发色底物。将该溶液储存于冰箱(2-8℃)。
o牛的优球蛋白(制备10mL)。在最小容量为300mL的容器中,加入240mL的冰冷的经纯化的水,并且在搅拌下加入10mL牛血浆。以1%醋酸调整pH至5.3±0.1。在2-8℃允许静置1至16小时。通过虹吸移除上清溶液,并且在4℃于2.800rpm离心5分钟以收集沉淀物。机械式分散(例如:使用实验用玻璃棒)悬浮该沉淀于5mL的冰纯水,震荡约5分钟,并且在4℃于2.800rpm离心5分钟以收集沉淀。将该沉淀机械式分散于约10mL的TRIS-NaCl;为促使该沉淀溶解,以合适的仪器(例如:实验用玻璃棒)破坏沉淀颗粒。将所得到的悬浮液储存在2-8℃在使用前不少于1小时且不超过6小时。
标准品与样品去纤维蛋白多核苷酸溶液
参考储液
将准确测量的约100mg的去纤维蛋白多核苷酸参考标准品定量转入20mL的容量瓶中。以约10mL的TRIS-NaCl溶解粉末,并以相同溶剂补足体积。将所得到的溶液以TRIS-NaCl稀释1:4,以得到约1.25mg/mL的去纤维蛋白多核苷酸RS溶液。
样品储液
将准确测量的约100mg的去纤维蛋白多核苷酸样品定量转入20mL的容量瓶中。以约10mL的TRIS-NaCl溶解粉末,并以相同溶剂补足体积。将所得到的溶液以TRIS-NaCl稀释1:4,以得到约1.25mg/mL的去纤维蛋白多核苷酸样品溶液。
参考品与样品溶液的制备
a)125ug/mL的去纤维蛋白多核苷酸:用TRIS NaCl(对应于板孔中为50ug/mL)以1:10稀释去纤维蛋白多核苷酸储液(参考品与样品)。定量转入500uL的制备的溶液于eppendorf管中,并与500uL的优球蛋白混合。封闭该离心管,并且将其储存于冰冷的水中。
b)62.5ug/mL的去纤维蛋白多核苷酸:用TRIS NaCl(对应于板孔中为25ug/mL)以1:2稀释溶液(a)。定量转入500uL的制备的溶液于eppendorf管中,并与500uL的优球蛋白混合。封闭该离心管,并且将其储存于冰冷的水中。
c)31.25ug/mL的去纤维蛋白多核苷酸:用TRIS NaCl(对应于板孔中为12.5ug/mL)以1:2稀释溶液(b)。定量转入500uL的制备的溶液于eppendorf管中,并与500uL的优球蛋白混合。封闭该离心管,并且将其储存于冰冷的水中。
d)12.5ug/mL的去纤维蛋白多核苷酸:用TRIS NaCl(对应于板孔中为5ug/mL)以1:2.5稀释溶液(d)。定量转入500uL的制备的溶液于eppendorf管中,并与500uL的优球蛋白混合。封闭该离心管,并且将其储存于冰冷的水中。
空白溶液
混合1体积的优球蛋白与1体积的TRIS NaCl溶液(例如:500uL+500uL)。
板储存
根据所提出的储存方案(请见以下表1),在微量板的每一孔中,加入200uL的标准品或样品或空白溶液。注意到可根据自动移液管的可用性与配置,而使用不同的储存方案。然而,对于每个参考品与样品溶液,必须使用不少于四个储存以用于测定法。
在紧接将板在微量板读取器中孵育前,加入50uL的发色底物于每一孔中。
表1
S1,S2,S3,S4:参考品溶液储存1、储存2、储存3、储存4
U1,U2,U2,U5:样品溶液储存1、储存2、储存3、储存4
Ca,Cb,Cc等:去纤维蛋白多核苷酸参考品与样品浓度a、b、c等
BLK:空白溶液
计算与结果
从动力图可知,标准品制剂的“吸光值与时间”(例如:S1_Ca、S1_Cb、S1_Cc)鉴定合适的线性范围(例如:30至35分钟,请见图3)。
线性动力范围的鉴定(A405nm与时间)
如下计算标准品与样品的每一制剂在预定时间范围内的测定法的反应(斜率)。
其中:
Aa是在时间Ta的吸光值(自上述图的30分)
Ab是在时间Tb的吸光值(自上述图的35分)
以列表的形式报告获得的值,如表2中所报告。
表2
将待测物质的反应及标准品的反应与浓度的对数作图,并且使用Ph.Eur目前版本的相关的第5.3.2章定义的平行线模式计算待检测物质的活性。
应该使用不少于3个连序系列稀释的参考品与样品(例如去纤维蛋白多核苷酸浓度5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL或5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、或12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL)。
变异的分析
根据Ph.Eur.目前版本的5.3.2.3部分以及Finney DJ(1964年)Statistical Method in Biological Assay第2版,进行变异的分析。
有效性的测试
1)线性回归条件是显著的,亦即计算的概率小于0.05。如果未符合标准,不可能计算95%C.I。
2)非平行的条件不是显著的,亦即计算的概率小于0.05。
3)非线性的条件不是显著的,亦即计算的概率小于0.05。
接受条件
4)估计效能不小于90%,且不大于所称效能的111%。
5)估计效能的置信限制(P=0.95)不小于80%,且不大于所称效能的125%。
计算
其中:
R:平行线模式分析所得的样品结果
Std效能:标准品的所称效能(干物质的UI/mg)
标准品浓度:标准品的浓度(干物质的mg/mL)
样品浓度:样品的浓度(干物质的mg/mL)
用于去纤维蛋白多核苷酸制剂的测定法
以上公开的测定法已用于测定液体制剂的生物活性,所述液体制剂在2.5ml中含有200mg的去纤维蛋白多核苷酸(每毫升有80毫克)且具有表3中所报告的定性定量组成。
表3
结果如表4所报告。
表4
*用作参考标准
Claims (20)
1.用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的方法,所述方法包括以下步骤:
a)使哺乳动物的优球蛋白及血纤维蛋白溶酶特异性的底物接触去纤维蛋白多核苷酸,所述底物通过与血纤维蛋白溶酶反应提供可测量的产物;以及
b)测量在连续时间中所形成的产物的量,从而以测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性。
2.根据权利要求1的方法,其中优球蛋白是哺乳动物优球蛋白。
3.根据权利要求2的方法,其中优球蛋白是人、兔或牛优球蛋白。
4.根据权利要求1的方法,其中与血纤维蛋白溶酶特异性的底物反应的血纤维蛋白溶酶由包含于优球蛋白中的血纤维蛋白溶酶原所释放。
5.根据权利要求1的方法,其中血纤维蛋白溶酶特异性的底物是发色底物。
6.根据权利要求1的方法,其中血纤维蛋白溶酶特异性的底物为式A1-A2-A3-X的化合物,其中A1与A2为非极性氨基酸,A3是赖氨酸或精氨酸,以及X是可测量的产物。
7.根据权利要求6的方法,其中可测量的产物X选自对硝基苯胺与2-萘胺所组成的组。
8.根据权利要求4的方法,其中血纤维蛋白溶酶特异性的底物是H-D-缬氨酰-L-亮氨酰-L-赖氨酸-p-硝基苯胺。
9.根据权利要求6的方法,其中通过分光光度法或荧光测定法测量可测量的产物X。
10.根据权利要求2的方法,其中用合适的缓冲液将哺乳动物优球蛋白重构为与来源血浆相同的体积,或高至1:10稀释,且发色/发荧光底物具有从2.5至3.5mM,优选3mM的浓度。
11.根据权利要求1的方法,其中所述方法在反应基质中进行,所述反应基质是缓冲至pH 7至8,优选至pH 7.4的水溶液。
12.根据权利要求1的方法,其中温度维持在从35至39℃,优选为37℃。
13.根据权利要求1的方法,其中血纤维蛋白溶酶特异性的底物的浓度为从0.3至4mM,优选从2.5至3.5mM,更优选为3mM。
14.根据权利要求1的方法,所述方法包括步骤:c)在标准样品与测试样品二者的酶促反应过程中,测定可测量的产物的释放速率;d)数学上地及/或图形上地关联释放速率与所对应的去纤维蛋白多核苷酸浓度,以得到去纤维蛋白多核苷酸的测试样品的生物活性。
15.液体去纤维蛋白多核苷酸制剂,其具有的去纤维蛋白多核苷酸的生物活性为25至35IU/mg,优选从27.5至32.5IU/mg,更优选从28至32IU/mg。
16.根据权利要求15的液体去纤维蛋白多核苷酸制剂,其特征在于其是水溶液。
17.根据权利要求16的液体去纤维蛋白多核苷酸制剂,其特征在于被缓冲,优选pH从6.5至8.5,优选从7至8。
18.根据权利要求15至17的液体去纤维蛋白多核苷酸制剂,其用于VOD的治疗与预防。
19.容器,其含有液体去纤维蛋白多核苷酸制剂且具有5000至7000IU,优选5500至6500IU,更优选5600至6400的生物活性。
20.根据权利要求19的容器,其中所述液体去纤维蛋白多核苷酸制剂是水溶液。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910228570.9A CN110079580B (zh) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/IT2012/000193 WO2013190582A1 (en) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | Euglobulin-based method for determining the biological activity of defibrotide |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910228570.9A Division CN110079580B (zh) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104619857A true CN104619857A (zh) | 2015-05-13 |
Family
ID=46829846
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910228570.9A Active CN110079580B (zh) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法 |
CN201280074120.5A Pending CN104619857A (zh) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910228570.9A Active CN110079580B (zh) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法 |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US9902952B2 (zh) |
EP (1) | EP2864496B2 (zh) |
JP (1) | JP6198821B2 (zh) |
KR (4) | KR20190112197A (zh) |
CN (2) | CN110079580B (zh) |
AU (1) | AU2012383169B2 (zh) |
BR (1) | BR112014031934B1 (zh) |
CA (1) | CA2874960C (zh) |
DK (1) | DK2864496T4 (zh) |
ES (1) | ES2660969T5 (zh) |
HK (1) | HK1208503A1 (zh) |
IL (1) | IL236132B (zh) |
IN (1) | IN2014DN10584A (zh) |
MX (1) | MX352085B (zh) |
RU (1) | RU2627177C2 (zh) |
SG (1) | SG11201408481UA (zh) |
WO (1) | WO2013190582A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107109458A (zh) * | 2014-11-27 | 2017-08-29 | 真蒂奥姆责任有限公司 | 基于细胞的去纤维蛋白多核苷酸效力测定方法 |
CN111132663A (zh) * | 2017-08-03 | 2020-05-08 | 爵士制药爱尔兰有限公司 | 包含高浓度核酸的制剂 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6069209B2 (ja) | 2010-11-12 | 2017-02-01 | ジェンティウム ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | 移植片対宿主病(gvhd)の予防および/または治療に使用するためのデフィブロタイド |
RU2627177C2 (ru) | 2012-06-22 | 2017-08-03 | Джентиум С.Р.Л. | Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина |
JP7150733B2 (ja) * | 2017-01-25 | 2022-10-11 | ケメット エレクトロニクス コーポレーション | 自己減衰型mlccアレイ |
WO2019200251A1 (en) | 2018-04-12 | 2019-10-17 | Jazz Pharmaceuticals, Inc. | Defibrotide for the prevention and treatment of cytokine release syndrome and neurotoxicity associated with immunodepletion |
US20220023533A1 (en) | 2018-12-07 | 2022-01-27 | Jazz Phrmaceticals Ireland Limited | Subcutaneous delivery of high concentration formulations |
US20230190783A1 (en) | 2020-02-28 | 2023-06-22 | Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited | Delivery of low viscosity formulations |
WO2022234101A1 (en) | 2021-05-06 | 2022-11-10 | Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited | Defibrotide for the treatment and prevention of acute respiratory distress syndrome |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN87103688A (zh) * | 1986-04-17 | 1988-01-20 | 克利诺斯农场生物工业联合股票公司 | 聚脱氧核苷酸的制备工艺 |
CN1612938A (zh) * | 2001-12-17 | 2005-05-04 | 金蒂姆股份公司 | 去纤肽生物学活性的测定方法 |
CN101688235A (zh) * | 2007-06-07 | 2010-03-31 | 国家健康医学研究所 | 用于测量存在于生物学流体样品中的微颗粒的纤溶酶活性的方法及用途 |
Family Cites Families (65)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1043823B (it) | 1970-11-03 | 1980-02-29 | Prephar | Procedimento per l estrazione di acidi nucleici da organi animali |
US3899481A (en) | 1970-11-03 | 1975-08-12 | Crinos Industria Farmaco | Process for the controlled partial degradation of deoxyribonucleic acid extracted from animal organs |
DE2154279A1 (de) | 1970-11-03 | 1972-05-25 | Crinos Industria Farmaco | Medikamente für das fibrinolytische System |
DE2812943C3 (de) | 1978-03-23 | 1981-05-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma |
US4853221A (en) | 1980-11-13 | 1989-08-01 | Warner-Lambert Company | Method for treating non-small cell lung cancer, head and neck cancers and breast cancer |
IT1170215B (it) | 1983-09-12 | 1987-06-03 | Crinos Industria Farmaco | Composizione farmaceutica per il trattamento di stati di insufficienza renale acuta |
IT1170214B (it) | 1983-09-12 | 1987-06-03 | Crinos Industria Farmaco | Composizione farmaceutica per la cura delle arteriopatie periferiche |
IT1206341B (it) * | 1984-02-16 | 1989-04-14 | Crinos Industria Farmaco | Composizione farmaceutica per il trattamento dell'ischemia acuta del miocardio. |
US4694134A (en) | 1985-05-28 | 1987-09-15 | Ajax Magnethermic Corporation | Apparatus for overheating edges of skelp for the production of compression welded pipe |
US5223609A (en) | 1986-04-17 | 1993-06-29 | Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. | Process for obtaining chemically defined and reproducible polydeoxyribonucleotides |
US5231006A (en) | 1986-10-16 | 1993-07-27 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Method for the determination of plasminogen |
US4753221A (en) | 1986-10-22 | 1988-06-28 | Intravascular Surgical Instruments, Inc. | Blood pumping catheter and method of use |
JP2907447B2 (ja) | 1988-08-24 | 1999-06-21 | 中外製薬株式会社 | 抗血栓剤 |
IT1231509B (it) | 1989-09-07 | 1991-12-07 | Crinos Industria Farmaco | Composizione farmceutica ad uso topico per la terapia della fragilita' capillare. |
JPH0539280A (ja) * | 1990-07-20 | 1993-02-19 | Takeda Chem Ind Ltd | サツカロアスコルビン酸誘導体および血栓症予防治療剤 |
US5199942A (en) | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
US5624912A (en) | 1991-08-21 | 1997-04-29 | Burcoglu; Arsinur | Method of treating HIV infection and related secondary infections with defibrotide |
US6699985B2 (en) | 1991-08-21 | 2004-03-02 | Arsinur Burcoglu | Method of treating HIV infection and related secondary infections thereof |
US5977083A (en) | 1991-08-21 | 1999-11-02 | Burcoglu; Arsinur | Method for using polynucleotides, oligonucleotides and derivatives thereof to treat various disease states |
IT1252174B (it) | 1991-12-09 | 1995-06-05 | Crinos Industria Farmaco | Oligodesossimibonucleotidi ad attivita' antiischemica e procedimenti per il loro ottenimento |
US5578716A (en) | 1993-12-01 | 1996-11-26 | Mcgill University | DNA methyltransferase antisense oligonucleotides |
JPH08127539A (ja) | 1994-10-31 | 1996-05-21 | Ajinomoto Co Inc | ヒトil−11を含有する末梢血幹細胞増加剤 |
EP0801076A4 (en) | 1994-11-30 | 1999-12-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | THROMBOCYTOTIC FACTOR |
WO1998001151A1 (fr) | 1996-07-10 | 1998-01-15 | Meiji Milk Products Co., Ltd. | Nouvelle utilisation de la famille mk comme facteur hematopoietique |
CA2259041A1 (en) | 1997-04-28 | 1998-11-05 | Arsinur Burcoglu | Method of treating hiv infection and related secondary infections thereof |
EP0985035A2 (en) | 1997-05-30 | 2000-03-15 | McGILL UNIVERSITY | Dna methyltransferase genomic sequences and antisense oligonucleotides |
US6177545B1 (en) | 1997-09-02 | 2001-01-23 | Insight Strategy & Marketing Ltd. | Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications |
DE19740384A1 (de) | 1997-09-08 | 1999-03-11 | Max Delbrueck Centrum | Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN) gegen Proteinkinase C (PKC)-Isoformen, ihre Verwendung und pharmazeutische Zubereitungen dieser ODN |
GB9719161D0 (en) * | 1997-09-09 | 1997-11-12 | Glaxo Group Ltd | New therapeutic method |
US6573372B2 (en) | 1999-01-07 | 2003-06-03 | Heska Corporation | Feline immunoglobulin E molecules and compositions there of |
JP2003503313A (ja) | 1999-06-03 | 2003-01-28 | ジェシー エル エス オウ | 細胞増殖及び細胞死を変調する方法及び組成物 |
DE69928778T2 (de) | 1999-06-08 | 2006-07-06 | Gentium S.P.A., Villa Guardia | Anwendung von Komplexen von kationischen Liposomen und Polydeoxyribonukleotiden wie Arzneimitteln |
US8771663B2 (en) | 2000-04-18 | 2014-07-08 | Gentium Spa | Formulation having mobilising activity |
EP1147777A1 (en) | 2000-04-18 | 2001-10-24 | Crinos Industria Farmacobiologica S.p.A. | Combination of defibrotide and G-CSF and its use to activate haematopoietic progenitors |
EP1334113A4 (en) | 2000-10-20 | 2007-08-08 | Expression Diagnostics Inc | EVALUATION OF LEUCOCYTAIRE EXPRESSION LEVEL |
CA2430341A1 (en) | 2000-11-28 | 2002-06-06 | The University Of Chicago | Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease |
EP1406930A4 (en) | 2000-12-29 | 2007-01-10 | Savient Pharmaceuticals Inc | "ISOLATED MOLECULES WITH SULFATED GROUPING CONTAINING EPITOPES, ANTIBODIES AGAINST SUCH EPITOPES AND USES THEREOF" |
US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
US6770753B2 (en) | 2001-07-05 | 2004-08-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Phosphorothioate antisense heparanase oligonucleotides |
US7514414B2 (en) | 2001-09-24 | 2009-04-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Suppressors of CpG oligonucleotides and methods of use |
US6965025B2 (en) | 2001-12-10 | 2005-11-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of connective tissue growth factor expression |
US20050215498A1 (en) | 2002-05-31 | 2005-09-29 | Guenther Eissner | Method for the protection of endothelial and epithclial cells during chemotherapy |
NZ536864A (en) | 2002-05-31 | 2008-08-29 | Univ Regensburg Klinikum | Use of oligodeoxyribonucleotides for the protection of endothelial and epithelial cells during chemotherapy |
MXPA05000272A (es) | 2002-07-01 | 2005-09-20 | Savient Pharmaceuticals Inc | Anticuerpos y usos de ellos. |
ES2378987T3 (es) | 2002-08-06 | 2012-04-19 | Toray Industries, Inc. | Remedio o agente preventivo para una enfermedad renal y procedimiento para diagnosticar una enfermedad renal |
US20050196382A1 (en) | 2002-09-13 | 2005-09-08 | Replicor, Inc. | Antiviral oligonucleotides targeting viral families |
DE10244453A1 (de) | 2002-09-24 | 2004-04-01 | Phenomiques Gmbh | Hemmung der Proteinkinase C-alpha zur Behandlung von Krankheiten |
US7803781B2 (en) | 2003-02-28 | 2010-09-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression |
ITMI20031714A1 (it) | 2003-09-05 | 2005-03-06 | Gentium Spa | Formazioni ad azione antitumorale. |
WO2005089503A2 (en) | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Cd4-igg2 formulations |
CA2623142C (en) * | 2004-09-22 | 2016-01-19 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods for a global assay of coagulation and fibrinolysis |
US7723127B2 (en) | 2005-03-03 | 2010-05-25 | Novx Systems Inc. | Immunoassay with extended dynamic range |
JP5714203B2 (ja) | 2005-03-03 | 2015-05-07 | ゲンチウム エスピーエー | 血管新生依存性腫瘍を治療するためのデフィブロチドおよび/またはオリゴデオキシリボヌクレオチド |
WO2006119619A1 (en) | 2005-05-06 | 2006-11-16 | Replicor Inc. | Oligonucleotides inhibiting cell proliferation |
EP1872787A1 (en) | 2006-06-27 | 2008-01-02 | Gentium S.p.A. | Use of defibrotide for the inhibition of heparanase |
EP1982722A1 (en) | 2007-04-16 | 2008-10-22 | Gentium S.p.A. | Use of oligotide for the treatment of renal diseases |
EP2183598A1 (en) | 2007-07-13 | 2010-05-12 | Elan Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for identifying substrate specificity of inhibitors of gamma secretase |
EP2103689A1 (en) | 2008-03-19 | 2009-09-23 | Gentium S.p.A. | Synthetic phosphodiester oligonucleotides and therapeutical uses thereof |
WO2009126310A2 (en) | 2008-04-10 | 2009-10-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for identification and use of agents targeting cancer stem cells |
NZ624963A (en) * | 2009-04-29 | 2016-07-29 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Pharmaceutical compositions comprising epa and a cardiovascular agent and methods of using the same |
WO2011057143A1 (en) * | 2009-11-06 | 2011-05-12 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for simultaneous assay of thrombin and plasmin generation |
JP6069209B2 (ja) | 2010-11-12 | 2017-02-01 | ジェンティウム ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | 移植片対宿主病(gvhd)の予防および/または治療に使用するためのデフィブロタイド |
RU2627177C2 (ru) | 2012-06-22 | 2017-08-03 | Джентиум С.Р.Л. | Способ определения биологической активности дефибротида, основанный на применении эуглобулина |
EP3026122A1 (en) | 2014-11-27 | 2016-06-01 | Gentium S.p.A. | Cellular-based method for determining the potency of defibrotide |
JP2020530004A (ja) | 2017-08-03 | 2020-10-15 | ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド | 核酸を高濃度で含む製剤 |
-
2012
- 2012-06-22 RU RU2014149089A patent/RU2627177C2/ru active
- 2012-06-22 WO PCT/IT2012/000193 patent/WO2013190582A1/en active Application Filing
- 2012-06-22 CA CA2874960A patent/CA2874960C/en active Active
- 2012-06-22 MX MX2014016114A patent/MX352085B/es active IP Right Grant
- 2012-06-22 SG SG11201408481UA patent/SG11201408481UA/en unknown
- 2012-06-22 KR KR1020197028118A patent/KR20190112197A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-06-22 JP JP2015517926A patent/JP6198821B2/ja active Active
- 2012-06-22 KR KR20157001763A patent/KR20150044877A/ko active Search and Examination
- 2012-06-22 US US14/408,272 patent/US9902952B2/en active Active
- 2012-06-22 AU AU2012383169A patent/AU2012383169B2/en active Active
- 2012-06-22 ES ES12756826T patent/ES2660969T5/es active Active
- 2012-06-22 KR KR1020187024264A patent/KR101948243B1/ko active IP Right Grant
- 2012-06-22 KR KR1020197003854A patent/KR102038357B1/ko active IP Right Grant
- 2012-06-22 CN CN201910228570.9A patent/CN110079580B/zh active Active
- 2012-06-22 CN CN201280074120.5A patent/CN104619857A/zh active Pending
- 2012-06-22 EP EP12756826.9A patent/EP2864496B2/en active Active
- 2012-06-22 BR BR112014031934-0A patent/BR112014031934B1/pt active IP Right Grant
- 2012-06-22 IN IN10584DEN2014 patent/IN2014DN10584A/en unknown
- 2012-06-22 DK DK12756826.9T patent/DK2864496T4/da active
-
2014
- 2014-12-08 IL IL236132A patent/IL236132B/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-09-17 HK HK15109110.9A patent/HK1208503A1/zh active IP Right Maintenance
-
2017
- 2017-12-18 US US15/844,801 patent/US20180334672A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-03-12 US US16/816,741 patent/US11085043B2/en active Active
-
2021
- 2021-08-06 US US17/396,028 patent/US11746348B2/en active Active
- 2021-08-27 US US17/459,169 patent/US11236328B2/en active Active
-
2023
- 2023-07-12 US US18/351,241 patent/US20230357762A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN87103688A (zh) * | 1986-04-17 | 1988-01-20 | 克利诺斯农场生物工业联合股票公司 | 聚脱氧核苷酸的制备工艺 |
CN1612938A (zh) * | 2001-12-17 | 2005-05-04 | 金蒂姆股份公司 | 去纤肽生物学活性的测定方法 |
CN101688235A (zh) * | 2007-06-07 | 2010-03-31 | 国家健康医学研究所 | 用于测量存在于生物学流体样品中的微颗粒的纤溶酶活性的方法及用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PAUL G. RICHARDSON ET AL: "Defibrotide for the Treatment of Severe Hepatic Veno-Occlusive Disease and Multiorgan Failure after Stem Cell Transplantation: A Multicenter, Randomized, Dose-Finding Trial", 《NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107109458A (zh) * | 2014-11-27 | 2017-08-29 | 真蒂奥姆责任有限公司 | 基于细胞的去纤维蛋白多核苷酸效力测定方法 |
CN107109458B (zh) * | 2014-11-27 | 2021-10-26 | 真蒂奥姆责任有限公司 | 基于细胞的去纤维蛋白多核苷酸效力测定方法 |
CN111132663A (zh) * | 2017-08-03 | 2020-05-08 | 爵士制药爱尔兰有限公司 | 包含高浓度核酸的制剂 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104619857A (zh) | 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法 | |
US4234682A (en) | Method and reagent for determining biologically active heparin in plasma | |
CN1650170A (zh) | 用于测定复合生物介质中瞬时蛋白水解活性浓度的诊断测试 | |
CN104880423A (zh) | 一种人体血清中甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶活性定量测定方法、试剂及试剂盒 | |
KR100912424B1 (ko) | 디파이브로타이드의 생물학적 활성 측정 방법 | |
CN103743911A (zh) | 一种纤维连接蛋白测定试剂盒及其使用方法 | |
CN105510572A (zh) | 一种甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶检测试剂盒 | |
RU2766143C2 (ru) | Жидкая композиция дефибротида для лечения и профилактики веноокклюзионной болезни | |
TWI615473B (zh) | 用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之基於優球蛋白的方法 | |
CN105980859B (zh) | 针对溶酶体酶的底物清除测定 | |
EP3047033A1 (en) | Method for assaying a protease | |
Edwards et al. | A bio-sensor for human neutrophil elastase employs peptide-p-nitroanilide cellulose conjugates | |
SA113350049B1 (ar) | طريقة تعتمد على جلوبولين حقيقي لتحديد النشاط الحيوي لديفيبروتيد | |
Leytus | Design and Use of Fluorescent Assays to Study Plasminogen Activator and Other Serine Proteases Involved in Biological Control | |
CN104099401A (zh) | 磷脂酶a2水解反应试剂 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: Italy gualdi town Applicant after: It Diaomu Limited Liability Company Address before: Italy gualdi town Applicant before: Gentium S.P.A. |
|
COR | Change of bibliographic data | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150513 |