CN1650170A

CN1650170A - 用于测定复合生物介质中瞬时蛋白水解活性浓度的诊断测试

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Publication number: CN1650170A
Application number: CNA038099381A
Authority: CN
Inventors: 彼得·吉森; 亨德里克·C·赫姆克尔; 雷德·奥·迪耶里; 叙泽特·L·贝甘; 罗伯特·瓦根伍尔德
Original assignee: Synapse BV
Current assignee: Synapse BV
Priority date: 2002-05-01
Filing date: 2003-05-01
Publication date: 2005-08-03
Anticipated expiration: 2023-05-01
Also published as: ES2291661T3; DE60315151T2; DE60315151D1; EP1504269A1; AU2003232720B9; ATE368229T1; AU2003232720A1; JP4718833B2; AU2003232720B2; CN100350252C; EP1504269B1; CA2484554A1; US8802386B2; US20060051828A1; WO2003093831A1; JP2005528097A; CA2484554C; DK1504269T3

Abstract

本发明提供了一种实时测定在血液或血浆样品中凝血酶活性从样品中出现和消失的进程的方法，该方法包括向样品中加入可在每个单位时间发出一定量可检测信号的凝血酶底物，信号的量与存在的凝血酶量相关。同时，在凝血酶的产生未被触发的相同血液或血浆的对照样品中，测定具有恒定凝血酶活性的标准制剂的活性。通过将在凝血中测得的活性与同时测得的校准物进行比较，获得在任意时刻存在的凝血酶的精确摩尔量。该方法尤其适用于诊断人和动物天生的、获得的或药物引起的高凝血状态和低凝血状态。本发明还提供了一种用于该方法的试剂盒。

Description

用于测定复合生物介质中瞬时蛋白水解活性浓度的诊断测试

发明领域

本发明属于诊断领域，更具体而言，涉及一种实时测定在血液或其它体液中瞬时存在的生物活性酶的浓度进程的方法，还涉及一种实施该方法的测试试剂盒。

发明背景

a.引言

在诸如消化、发炎、血凝和血栓形成的许多过程中，蛋白水解酶在体液中的产生和分解是一个关键因素。给出一个例子：凝血酶是一种瞬时存在于凝血中的酶，是止血和形成血栓的关键酶。在半数以上的致残和致命的疾病中，止血血栓形成系统(HTS)紊乱是关键的。从数量上较不重要的那些病，血友病和肺栓塞，易于引起注意。未被广泛地认识到的是，动脉血栓引起冠状动脉梗塞或十分之一的老年人可能由于阻塞脑动脉的凝块(基于心房纤颤和颈动脉栓塞的栓塞)而丧失脑功能，或病情严重的病人可能会由于凝血系统的紊乱而出血死亡(事故的受害者和具有致命的血管内凝血的患有脓毒病的病人)。还未被充分认识到如下事实，更多人死于动脉血栓而非恶意行为，更多人死于静脉血栓而非事故。考虑到这种医学上的重要性，令人吃惊的是目前临床医生竟然对HTS没有有效的功能检测。

在体液中存在着若干在生理学上更为重要的生化系统，其通过蛋白水解酶的激活及随后的失活而起作用，例如，血液中的凝固系统、溶血纤系统和补体系统和肠胃液中的消化酶。为了评估这些系统的生物功能，重要的是能够及时跟踪该蛋白水解活性在体外的体液样品中被触发后发展的过程。这种功能评估具有极其重要的诊断重要性，因为这些系统的失调可导致致命疾病如冠状动脉梗塞、中风或致命的出血(血凝固和纤维蛋白溶解)、全身感染和自体免疫性疾病(补体系统)或扰乱食物吸收(肠胃液)。

在止血和形成血栓中，凝固时间是目前可利用的最好评估方法，它们对轻微止血障碍(例如，血友病携带者、轻度肝病)、或对导致血栓症风险提高的升高的凝固力不敏感。凝固试验常常需要适应于特定的用途。例如，可将促凝血酶原激酶时间(＝凝血酶原时间(PT)，＝快速时间)用于诊断严重的肝病、或使用抗凝血剂但没有血友病延迟的治疗、或肝素治疗。临床凝固实验室的许多科学技术停留于知道如何解释由不同类型的凝固时间、血小板凝聚、出血时间等获得的分散信息。

综合检测的不足可通过对凝固系统的单组分的许多复杂检测得到部分补偿，检测之多使得在每种特定情况下都应进行明智的选择，这是临床止血实验室特定知识的另一半。

b.凝血酶产生的机理

在血浆中凝血酶产生的机理可以示例如下。组织因子(TF)丰富地，但不是唯一地存在于管壁上。当血管损伤时，血液进入组织，血浆蛋白因子VIIa(VIIa)可与TF互相作用。这在血浆蛋白和血小板之间触发了一套极其复杂的交互作用，其导致了在时间和空间上留存有限的凝血酶的瞬时暴发，结果伤口停止流血而凝固不会扩展到身体的其它部分。

该机理看起来可能是如此复杂，充满了正负反馈的反应，使得其作用不能通过各部分的知识进行预测(不能分解的复杂性)。因而，如果一个人想评估止血系统的功能，就必须像在体内、或身体的隔离部分，即血液或富含血小板的血浆那样探查凝血酶的产生。血小板和血浆因子之间的相互作用具有特殊的重要性，由贫血小板的血浆获得的信息本质上是有缺陷的。参见，例如Béguin S.，R.Kumar，I.Keularts，U.Seligsohn，B.C.Coller and H.C.Hemker，Fibrin-Dependent PlateletProcoagulant Activity Requires GPIb Receptors and Von WillebrandFactor，Blood(1999)93：564-570；Béguin，S.and R.Kumar，supra(1997)]。

凝固血浆中形成的所有凝血酶的一个重要部分(≈30％)附着于血纤维蛋白凝块上。附着于凝块中的凝血酶仍保留其血栓形成性能，它可以使纤维蛋白原、激活因子V，VIII和XI、及血小板凝固[Béguin，S.and R.Kumar，Thromb.Haemost.(1997)78：590-594；Kumar，R.，S.Béguin，and H.C.Hemker，Thromb.Haemost.(1994)72：713-721，and(1995)74：962-968]。它只是部分地被抗凝血酶抑制。因此，重要的是当探查凝固系统的功能时，纤维蛋白是存在的。

为了评估这种系统的功能以用于诊断目的和抗血栓药物的安全使用，已经开发出了对该凝固系统中的单个组分进行检测的许多方法，以下将对其作进一步的说明。

如前面所述，在损伤部位产生的凝血酶活性对于继而发生的止血-血栓形成反应的程度是一个重要的决定因素。大部分凝血酶(＞95％)是在凝固后产生的，因此凝固时间并不是自然而然的有效指标。凝血中的凝血酶活性是一种瞬时现象，因此应该在凝固过程中进行测定。

在凝血或血浆中凝血酶形成的典型进程，也叫作凝血酶产生曲线，示于表1中。在没有可观察到的凝血酶形成的时期之后，其浓度陡然上升，达到顶峰然后再下降。参数是滞后时间、曲线下的面积(AUC)，也叫作内生凝血酶势(ETP，参见下面)、峰高、和达到峰值所需的时间。

c.相关的现有技术

图1所示的凝血酶产生曲线是典型地通过对从凝固血液或血浆中短时间内取出的少量次级样品中的凝血酶含量进行测定获得的。参见，例如R.Biggs and R.G.Macfarlane，Human Blood Coagulation and itsDisorders，Blackwell Scientific Publications，Oxford 1953；W.Seegers，Prothombin，Harvard University Press，Cambridge Mass.1962。该方法通常需要对次级样品的独立分析，使得仅3-5个曲线的同时测定就要连续地占用一个熟练的实验工。它是如此地劳动密集，以至于使之不能应用于临床或药学的常规程序。

EP-A-0 420 332(等同于US 5,192,689)披露了一种通过测定由人造底物在凝固期间生成的产物的量，来测定已存在于凝固血液或血浆样品中的凝血酶量的方法。该量与凝血酶产生曲线下的面积，也叫作内生凝血酶势ETP成正比。该方法包括将凝血酶形成激活物同凝血酶底物一起加入到凝固血液或血浆样品中，其中对凝血酶底物的用量和动力学特性进行选择，使得样品中产生的凝血酶量不能把所述凝血酶底物消耗完，从而生成一种转化产物，测定所生成的所述转化产物的量，并由此确定样品中的内生凝血酶势。可用以下反应说明这种ETP-法：

3)凝血酶+抗血栓药→非活性复合物

所有反应均不可逆，因此凝血酶只是暂时地存在于反应混合物中。当凝血酶存在时，其参与反应4，结果，底物的转化度指示了凝血酶催化该反应所经过的时间和达到的时间。

重要的是底物量不能在凝血酶消失前耗尽。为了将底物的量转化为所产生的凝血酶活性总量的精确代表，在任意时刻反应速率应与凝血酶浓度成正比。这种ETP法的本质是作为终点法来测定凝血酶势，而没有同样地测定凝血酶/时间曲线。如果短促地测定底物，终点就只是所形成产物的最大量，这种数据是没有任何意义的。

另外，在实际操作中该ETP-法的实施采用了可通过光密度测定检测出的发色性底物，即带有发色性离去基团的底物。纤维蛋白原，和相应的血小板必须从血浆中除去，因为凝血酶导致的纤维蛋白原-纤维蛋白转化所引起的混乱使得进一步的测定成为不可能。但是，纤维蛋白原和血小板是凝固系统的重要组分，对凝血酶的形成进程有影响。这对应用光密度作为检测方式形成了严重的限制。因此，评估含血小板和/或纤维蛋白原的血浆的ETP是不可能的。

已经尝试了通过以下方法对凝血酶浓度进行连续监测：在凝固样品中加入适当的凝血酶底物，然后监测酰胺水解分裂产物。例如，采用发色性底物并检测光密度，以监测对硝基苯胺的发展(Hemker HC，S.Wielders，H.Kessels，S.Béguin：Thromb Haemost.(1993)70(4)：617-24；Hemker HC，and S.Béguin：Thromb Haemost.(1995)74(1)：134-8)。如果该测试中的反应速率仅取决于凝血酶浓度，且信号与产物的量成正比，那么产物曲线的斜率就正比于存在的凝血酶量，结果，若比例常数(Kc)是已知的，就可以从产物曲线的一阶导数获得凝血酶产生曲线。

但是，实际上反应速率并不仅仅取决于凝血酶浓度，信号并不一定与产物量成正比，且Kc是未知的。原因如下：

A：底物消耗：信号不但取决于样品中凝血酶的活性，还取决于底物的量，该量恰由于酶活性本身而及时降低。这种效应通过加入过量的底物而削弱，但仅削弱到一定限度。底物可逆地结合到凝血酶的活性中心上，从而使凝血酶不被天然的抗凝血酶钝化。消除底物消耗效应至可接受的程度，其代价是延长实验，使之持续约两小时。(所加底物越多，被占用而不能用于天然钝化过程的酶分子就越多。这延长了实验的持续时间。在1×Km时反应在30min后结束，在5Km时获得了对底物消耗的实际独立性，但反应持续90min)。另外，在这种底物浓度下，凝血酶抑制会干扰反馈反应，不再能保证天然过程的测定。这也是下述情况的原因：在打算从底物的转化总量评估曲线下面积的方法中，必须加入过量的底物，这使得需要加入额外的抗凝血酶以使实验可行(参见以上讨论过的EP-A-0 420 332)。

B：血浆样品凝固时光密度的改变。使用发色性底物意味着除去纤维蛋白原，结果即除去了血小板，这导致在凝固时光散射出现欺骗性的OD升高。但是，纤维蛋白原和血小板是对凝血酶的形成过程产生影响的凝固系统的重要成分(参见以上内容)。这对于将光密度法作为检测方法形成了严重的限制。可通过使用产生荧光产物的底物绕过这个问题[H.C.Hemker et al.The thrombogram：monitoring thrombingeneration in platelet rich plasma.Thromb Haemost.83：589-91(2000)]。但是，这又引起了下一个问题：

C：在荧光测量中，信号并不与产物的量线性相关。特别是荧光信号并不线性地取决于荧光产物的浓度，因为荧光分子吸收其它产物分子的光，即所谓的“内滤波效应”。对于荧光产物，为了限制底物消耗效应，而根据需要将底物的浓度提高到数倍于Km时，也自然地提高了内滤波效应。

问题A对所有连续方法是普遍的。问题B可通过采用荧光底物绕过，但它引起了C问题。

D：即使不存在A、B和C问题，还有将反应速率关联到凝血酶浓度的难题，即，确定校准常数Kc。这种关系随实验设置的不同而变化(例如对于不同的荧光计是不同的)、随样品的不同(例如，由于血浆颜色的变化)而变化。在样品中添加已知的标准量的凝血酶是不可能的，因为所添加的酶会干扰生理反应。也不可能在非凝固的平行样品中加入凝血酶，因为它会在血浆中钝化。

本发明的目的是通过提供一种涉及测定血液或血浆样品中凝血酶的方法来消除这些缺点，该方法与上述的ETP-法有本质的不同，因为它不是对产物的量进行终点测定，而是实时地测定凝血酶浓度曲线的进程并提供连续的信号，从而给出诸如滞后时间和峰高的有关参数的更有价值和更精确的信息。后者对于测定凝固机构活性(将在下面说明)的微妙差异更为重要。换句话说，这种新方法并不像ETP-法那样提供样品中已存在的凝血酶量的单一值，而是实时提供瞬时存在于样品中的凝血酶浓度的进程。

发明概述

现在已令人吃惊地发现，上述缺点可通过测定带有或不带有血小板的凝固血浆中的凝血酶浓度来方便地消除，所述测定通过如下方法进行：监测适当的信号底物的分裂，并将其与平行样品中恒定已知的凝血酶活性进行比较。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种实时测定在第一生物样品中蛋白水解活性从样品中出现和消失的进程的方法，该方法包括下列步骤：

a)向所述第一样品中加入蛋白酶激活物以产生蛋白水解活性；

b)向步骤a)中加入信号底物，所述信号底物引起与产生的蛋白水解活性导致的反应所形成的转化产物量相关的可检测信号；

c)加入一种工具(means)，该工具对于步骤b)中定义的信号底物具有恒定已知的稳定蛋白水解活性，而对于其中蛋白水解活性未被触发的第二平行样品是惰性的；

d)向步骤c)中加入与步骤b)中定义相同的信号底物，所述信号底物通过具有已知的稳定蛋白水解活性的工具导致的反应引起可检测信号；

e)测定在所述第一样品和所述第二平行样品中信号发展的时间进程，以提供它们各自的曲线；

f)比较所述曲线以及时导出在第一样品中蛋白水解活性的进程。

在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种在第一血液或血浆样品中实时测定蛋白水解活性从样品中出现和消失的进程的方法，所述蛋白水解活性主要是溶解血栓活性，所述方法包括下列步骤：

a)向所述第一样品中加入凝血酶形成激活物以形成凝血酶；

b)向步骤a)中加入信号底物，所述信号底物引起与形成的凝血酶导致的反应所形成的转化产物量相关的可检测信号；

c)加入一种工具，该工具对于步骤b)中定义的信号底物具有恒定已知的稳定凝血酶活性，而对于其中凝血酶活性未被触发的第二平行样品是惰性的；

d)向步骤c)中加入与步骤b)中定义相同的信号底物，所述信号底物通过具有已知的稳定凝血酶活性的工具导致的反应引起可检测信号；

f)比较所述曲线以及时导出在第一样品中凝血酶活性的进程。

第一生物样品通常选自血液，包括富血小板血浆、贫血小板血浆、或无血小板血浆在内的血浆，唾液，血清，尿，脑脊髓液，精液，和粪便。

当在血液样品上实施本发明的方法时，血液通常是收集在装有柠檬酸钠或EDTA等的管中，使得血液中的游离钙离子被束缚，阻止了凝血酶的形成和凝固。因此，为了启动凝血酶的产生，应该在测定开始之前立刻加入钙。但是，如果血液不是收集在柠檬酸钠等中，就不需要这样添加钙。例如在以如下方式使用该方法时：使得可以在取得血液后的几分钟内开始实验。

所要测定的蛋白水解活性通常选自激活的凝固因子活性，包括凝血酶、激活的溶血纤因子活性、和补体系统活性的激活组分。按照本发明的方法从血液或血浆样品中实时测定凝血酶活性的进程是优选的

实施方案。

本发明方法中所用的信号底物优选选自含有离去基团的化合物，所述离去基团通过形成的蛋白水解酶导致的反应产生可检测的转化产物。该转化产物通常通过光谱学测定，特别是通过荧光(优选)、光密度和NMR等测定。因此，所述离去基团通常为荧光基团、发色基团、释放氢离子的基团等。用于实施本发明方法的一种适宜和优选的信号底物是Z-Gly-Gly-Arg-AMC。另外，适宜的可检测转化产物包括对硝基苯胺和7-氨基-4-甲基-香豆素。

如上定义的、用于实施本发明方法的具有恒定已知的稳定蛋白水解活性的合适工具包括：α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物(优选)、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原复合物、和γ凝血酶。另外，可以使用在次级识别部位进行改性的任何蛋白水解酶，因为其活性中心保持完整，而其与反应混合物中的蛋白质的功能性相互作用已被消除。

用于实施本发明方法的有用蛋白酶激活物包括钙离子、磷脂、组织因子、可溶性组织因子、促凝血酶原激酶、高岭土和鞣花酸(elagicacid)。

根据本发明的另一方面，所述第一生物样品还包括一种药剂，该药剂将被测试其对正在研究的蛋白水解系统，如止血-血栓形成系统的影响。可在本发明的方法中测试的适宜药剂是抗血栓剂，如抗血小板剂和抗凝血剂，例如肝素、硫酸皮肤素、直接凝血酶抑制剂，例如水蛭素、阿加曲班(argatroban)或美加拉群(melagatran)、和Xa因子抑制剂，例如稠抗凝血蛋白。

根据本发明的又一方面，提供了一种试剂盒来实施本发明方法，用于如上所定义的实时测定蛋白水解活性，尤其是溶解血栓活性的进程。该试剂盒方便地包括在合适的容器或其它常规包装装置中的一种或多种下列组分：

-一种已知浓度的α₂M-凝血酶复合物；

-一种用于富血小板血浆以启动凝固反应的PRP试剂；

-一种用于贫血小板血浆或无血小板血浆以启动凝固反应的PPP试剂；

-一种添加剂，该添加剂有助于诊断溶解血栓活性进程，特别是在遇到或预期有止血-血栓形成系统的特定的反常情况下。适宜的添加剂为例如凝血调节蛋白或激活的蛋白质C，其在诊断V Leiden因子或特定的抗血栓药或抗血小板药上特别有用。

-一种含有信号底物的试剂；

-一种有助于计算凝血酶活性曲线的软件程序；

-一份使用手册。

该试剂盒可适当地包括冻干试剂。

下面将对本发明的这些及其它目的进行更详细的说明。

附图简述

图1为凝血酶产生曲线，显示了在凝固血液或血浆中凝血酶形成的典型进程，通过二次采样测定。

图2显示了在加热的含有荧光底物的血浆或缓冲剂(上部符号线)中添加凝血酶(下部符号线)和α₂-巨球蛋白-凝血酶(粗线)后荧光信号的产生。

图3显示了在两份加入了相同浓度的荧光底物的相同血浆样品中的原始荧光信号。在一个样品中加入了凝血酶产生激活物，导致凝血酶的产生。在另一个样品中加入了导致稳定的酰胺水解活性的已知浓度的α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物。

粗线：凝血酶产生已被激活的样品中产生的信号

细线：已加入了α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物的样品中产生的信号

图4显示了图1中信号的一阶导数。

粗线：出现凝血酶产生的样品的dFU/dt

细线：已加入了已知浓度的α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物的样品的dFU/dt

图5显示了两个在血浆中的凝血酶产生曲线。粗线：未对底物消耗或内滤波效应进行校正的实时凝血酶浓度；细线：对底物消耗或内滤波效应进行校正后的实时凝血酶浓度。在这两种情况下，凝血酶浓度都是通过血浆中α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物的已知活性，从荧光底物的初始转化速率进行测定的。

图6显示了同时测定的来自24个凝血酶产生的平均值和置信界限。曲线A描述了正常血浆，曲线B描述了除去纤维蛋白原的正常血浆。

图7显示了对由各重复四次的三个个体进行同时测定得到的凝血酶曲线。

图8显示了在不同的六天内、从重复四次的一个个体的PRP得到的曲线。

图9分别显示了健康供体的富血小板血浆和用血小板激活抑制剂处理的相同血浆中凝血酶的产生曲线。

定义

本文使用的与血液或血浆样品中产生的蛋白水解酶有关的术语“瞬时活性”是指一旦生理进程通过本领域熟知的方法启动，酶活性首先升高，然后再降低到最终的(接近)零活性。

本文使用的术语“复合生物介质”是指血浆、带有血细胞或整个血液或任何其它源自身体的流体或其它成分的血浆，其中会发生酶活化和酶失活的生理过程。

本文使用的术语“实时”是指在样品于反应容器中活化和失活的同时，显示介质中酶浓度的进程。

本文使用的术语“滞后时间”是指在凝血酶的形成真正开始之前所经过的时间。

本文使用的术语“峰高”是指所达到的最大凝血酶活性。

本文使用的术语“上升坡的陡度”是指凝血酶浓度达到峰值前的升高速率。

本文使用的术语“达到峰值的时间”是指从反应开始至达到峰值的时间。

本文使用的术语“ETP”是指直到凝血酶活性达到(接近)零时的曲线的时间积分。

本文使用的术语“信号底物”指可被介质中的蛋白水解酶分裂的底物，从其上分裂出可通过光学、NMR或其它方法检测出的离去基团。可光学检测出的离去基团为例如对硝基苯胺和7-酰氨基-4-甲基-香豆素。对硝基苯胺在405nm产生吸收，7-酰氨基-4-甲基-香豆素是荧光性的(在390nm处激发，在460nm处发射)。NMR-活性离去基团的例子是那些含有³¹P、¹³C、或任何其它可被NMR或相似技术检测出的原子的基团。另外，H⁺离子可以用作离去基团，它可以通过测定pH值的变化检测出来。

发明详述

为了实施本发明，下面将给出对止血和血栓形成系统(HTS)的典型描述，重点在于其最重要的酶，凝血酶。但应该注意的是，本发明也涉及其它酶和其它生理系统，如血液和血浆中凝固系统的其它激活的蛋白水解酶(因子)、在血液和血浆中溶血纤系统的胞浆素和其它激活的成分、在血液和血浆中激活的补体因子、胃液中的胃蛋白酶、十二指肠液中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等。

如上所述，通常瞬时酶活性可通过添加一种在转变时产生信号的底物来测定。采用本领域中的荧光底物时，该方法典型地包括将荧光底物添加到凝血酶的产生已经被触发(使用本领域熟知的方法)的血液(或另一种生物样品)中。底物分裂后，就形成了可在适当的激发和发射波长上可测定的荧光产物。

通常，在相似的情况下，可通过以下方法达到该目的：向第二个可完全比较的样品中添加固定量的具有已知活性的相同底物酶，也叫“校准物”，然后将所探测样品的活性与该已知活性进行实时比较。但是，在现在的情况下，因为其不稳定且继而会从血浆中消失，就不可能将凝血酶本身用作校准物。另外，在添加凝血酶后的即刻，凝块随之形成，这保证可阻止试剂的适当混合并导致不规律的结果。

但是，除了上述问题，在Y轴上的单位会是不定的，随实验的进展而变化，因为由于所谓的内滤波效应及伴随的可用底物的减少，转化产物浓度的提高会改变凝血酶浓度与信号产生速率之间的关系。并且，实验的实施是在血液或血浆中，具有供体依赖性，会通过光吸收和荧光淬灭对信号产生影响。

因此应该采取某种方法对每一供体的每一样品进行测定，使得Y轴上的任意单位可实时地归因于凝血酶活性的有效量，表示为摩尔单位的凝血酶浓度。

本发明基于以下令人吃惊的发现：某种底物表现出恒定的类似凝血酶的活性，这可被适当地用于将绝对值(nM)分配到由分子所获得的信号的一阶导数上，凝血酶在凝固血浆中出现和消失时将所述分子分裂。一种适宜的特别优选的物质是α₂-巨球蛋白(本文也称为α₂-M或α₂M)与凝血酶的不可逆复合物、或可替代地为葡萄球菌凝固酶-凝血酶原复合物。

如果凝血酶在样品中的活性是通过例如其产生荧光性分子的酰胺水解行为进行监测，由于多种原因所获得的信号不能与凝血酶活性直接相关。每单位时间里所形成的荧光产物量与荧光信号的升高之间的关系取决于仪器、样品的光吸收性能和样品中已有的产物量(所谓的内滤波效应)。凝血酶量与荧光产物量之间的关系取决于已经消耗的底物量。即使在某一时间内产物的形成(dP/dt)与凝血酶活性之间存在有直接关系，它也具有仪器和样品依赖性，且在实验过程中发生改变。

凝血酶在系统触发后的出现和消失正是凝固系统的特性。出现和消失速率的病理学变化导致严重的疾病。因此，凝血酶在样品中的消失速率是一个重要的生物学变量，必须在待测的样品中保持原样。该相同特性使得不可能得到一种在血浆中具有恒定活性的凝血酶制剂，该制剂可用作校准物而给凝血酶活性分配绝对值。

本发明的重要因素是，通过将凝固血浆中的信号与具有恒定的类似凝血酶活性的工具相比较，消除仪器、样品和时间信赖性。已经发现，α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物具有所期望的特性，可作为这种提供恒定的类似凝血酶活性的极好工具，这种活性可由本领域的技术人员方便地测定。将凝血酶附着在α₂-巨球蛋白上使其能够对存在于血浆中的天然灭活剂免疫，但又保留其分裂小底物的能力，该小底物在分裂后可释放出具有光吸收性、荧光性或其它信号性的分子。由于α₂-巨球蛋白能够结合很多种蛋白水解酶，可以将其用于制备其它蛋白水解酶(例如，激活的凝固因子X、血纤蛋白溶酶、胰蛋白酶(trypsis)、胃蛋白酶、补体因子3)的校准物。如上所述，发现葡萄球菌凝固酶和凝血酶原的复合物具有相似的特性，因为它也可以提供恒定的类似凝血酶的活性，该活性对血浆抑制剂不敏感，从而可以作为替代的校准系统用于其它的蛋白水解酶。

本发明的方法包括将血液或血浆样品分成两份，或仅仅使用两份基本相同的样品，向这两份样品中均加入一种在单位时间内产生一定量的可检测信号的底物，信号的量与存在的凝血酶的活性相关。在一份样品中，凝血酶的产生(即凝血)通过本领域熟知的方法触发。向另一份样品中加入一种具有独立测定的恒定的凝血酶活性的制剂，优选加入上述的α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物。优选同时在这两份样品中测量产物形成。在凝固样品中任意时刻存在的凝血酶的精确摩尔量是通过如下方法得到的：将该样品中产生的信号与同时测得的来自已加入具有已知的恒定凝血酶活性的制剂但凝血酶的形成未被触发的样品的信号进行比较。

除了α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物之外，具有酰胺水解性但没有凝血酶生物活性的替代性酶是葡萄球菌凝固酶，其由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生。这种酶能够结合到血浆中存在的凝血酶原上。葡萄球菌凝固酶-凝血酶原复合物能够不被AT抑制地转化少量凝血酶底物。例如，葡萄球菌凝固酶、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原或α₂M-凝血酶复合物以一定量加入到测试样品中，用量通常为5至1000毫微摩/升、优选约100毫微摩/升。

由本发明的方法得到的曲线的特征在于诸如滞后时间、曲线下的面积、峰高、上升斜率的陡度、达到峰值的时间的参数及其它的类似于数学函数T＝a.t^b.exp-ct(在滞后时间后开始)的曲线的所有参数。凝血酶的浓度通常开始于零，升高到通常为50-500毫微摩值的峰高，然后再回到零。滞后时间通常为0-20分钟，在凝血酶浓度约高于10毫微摩时马上结束。此时，也出现凝固的形成，而峰值发生在几分钟后。在此描述的凝血酶产生曲线的参数(也称Thrombogram，是Synapse B.V.的注册商标)为复合参数，其受到一大组浓度及相互作用的凝固因子的反应常数的影响。它们反映了这些变量的所有变化，所述变量就像在临床、治疗学或其它设置中那样影响止血血栓形成系统的功能。因此与测量的止血血栓形成系统有关的所有抗血栓药和所有疾病会影响这些参数。在任何类型的抗血栓形成处理或止血凝固紊乱期间，滞后时间及达到峰值的时间通常会升高，峰高及曲线下的面积通常会降低。另一方面，在高凝血状态下，这些参数向相反的方向移动。Thrombogram以这种方式真实地反映了血液的凝固性，并给出血栓形成或止血风险的指示。

本发明还涉及如本文所述用于实施本发明方法的试剂盒，以及涉及用于常规地实施本发明方法的测定的设备、和涉及批量的测试元件源，以利于操作可处理大量测试样品的自动化设备。

在一个优选的实施方案中，测试试剂盒适当地包括：

1.一种由已知浓度的α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物组成的凝血酶“校准物”，所述复合物任选地为冻干形式。

2.一种PRP-试剂，用于富血小板血浆，且含有触发剂以启动凝固反应，通常为促凝血酶原激酶或重组再脂质化(relipidated)组织因子或可溶性组织因子，任选地为冻干形式。可替代地，它可含有激活固有系统如鞣花酸或高岭土的触发剂。

3.一种PPP-试剂，用于贫血小板血浆或无血小板血浆，含有与促凝血酶原激酶或重组再脂质化组织因子或可溶性组织因子组合的磷脂囊，任选地为冻干形式。可替代地，它可含有激活固有系统如鞣花酸或高岭土的触发剂。

4.含有来自PPP或PRP试剂的化合物加上特定化合物的试剂，使Thrombogram对凝固系统的特定异常更为敏感。例如，没有磷脂的PPP-试剂会使Thrombogram对血浆中存在的微粒敏感。添加了凝血调节蛋白或激活的蛋白质C(APC)的PPP或PRP试剂使得Thrombogram对天然抗凝固系统即已知的蛋白质C系统的所有紊乱更为敏感。添加了激活的蛋白质C(APC)的PPP或PRP试剂使得Thrombogram对V Leiden因子及V因子和/或VIII因子的所谓APC抗性的其它的先天或获得形式很敏感。没有组织因子的PRP-或PPP-试剂使Thrombogram对样品中内源性组织因子活性的存在敏感(参见Giesen et al.，Proc NatlAcad Sci USA 1999 96(5)：2311-5.)。

5.含有信号底物如Z-Gly-Gly-Arg-AMC并通常还含有钙离子的试剂。

6.一种有利于本方法中包括的校准计算，以及时获得凝血酶浓度的软件程序。专门设计用来实施本发明方法、且注册商标为Thrombinoscope的适宜软件程序可从申请人Synapse B.V.获得，可通过其网址www.thrombin.com或通过电子邮件：info@thrombin.com与其联系。

7.一份指导如何使用试剂盒的手册也可以成为测试试剂盒的一部分。

PPP和PRP试剂的不同在于磷脂的含量，为了能够测定凝血酶形成中血小板的贡献，在PRP情况下该含量应该是低的。

测试试剂盒方便地以下面的方式使用：向80微升PPP中加入20BL的PPP试剂，并向另外80μL相同血浆的样品中加入20μL凝血酶校准剂。然后向两种样品中加入荧光底物和钙的混合物20μL，反应开始在荧光计中进行。通常在每种条件下要再测定80μL样品，可通过专用的软件程序计算每种条件下的平均值和标准偏差。

对于本领域的熟练技术人员可以理解的是，本发明的方法和试剂盒并不局限于使用荧光底物，而可以潜在地用于发色性、NMR、化学发光及其它类似的检验方法。但是，目前的荧光底物是优选的选择，因为相对于任何其它可利用的方法，其可以在纤维蛋白的存在下进行评估，因而也可以测定纤维蛋白上的凝血酶。并且，可以避免通常很麻烦的脱纤维蛋白，成为在临床上易于操作的更简单和更可靠的方法。另外，本方法中使用荧光底物，这允许在血小板的存在的情况下评估凝血酶(正如本领域所熟知的，血小板的激活需要纤维蛋白)，因而可以测定抗血小板药物，可以测定血小板病理学，从而可进行更适当的治疗。

图9是一个实验实施例，其中对健康供体的富血小板血浆及用已知血小板激活抑制剂(ReoPro)处理过的相同血浆进行测定。两条曲线形状不同，差异在于更长的TTP和更低的峰高，但这两条曲线下的面积在3％以内是相同的。这种对峰高和TTP有影响、对ETP没有明显影响的情况也见于许多轻微的凝固因子缺陷中，如von Willebrand病、VII因子或V因子缺陷、及VIII或IX因子缺陷(血友病)。在许多情况下，峰高和TTP已被证明是凝血酶产生曲线上比ETP自身敏感得多的参数。

本发明的方法可以适当地被用于诊断人和动物天生的、获得的或药物引起的高凝血或低凝血状态，从而监测预防性治疗或治疗性治疗，其中采用了抗血栓药，和通常可影响凝固系统功能和以该系统障碍为特征的所有疾病状态的所有药物。

现在将通过下列实施例对本发明作进一步地说明，这些实施例绝不能被当作是对本发明范围的限定。

实验

1、凝血酶校准物的制备

α₂-巨球蛋白的分离

按照Barrett，A.J.，Alpha 2-macroglobulin，Methods Enzvmol，(1981)80(PtC)p.737-54.制备粗α₂-巨球蛋白(α₂M)。将该材料从柠檬酸化的牛血浆中分离。进行该过程，直到α₂M在12％(w/v)的PEG-20000中沉淀出。将小丸溶解在100mM NaCl、20mM HEPES(pH7.9)中，用来制备α₂M-凝血酶复合物(α₂M-T)。

α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物的制备

向α₂M中加入12μM牛凝血酶原、6mM CaCl2、50μM磷脂囊(20％的脑磷脂酰丝氨酸，80％的蛋黄磷脂酰胆碱)、5nM牛Xa因子和0.78nM牛Va因子。室温下搅拌该混合物30min，然后在4℃下保存过夜。除去形成的凝块，并将制剂分成适当的量以通过凝胶过滤(尺寸排阻色谱法)进行净化；即，在这种情况下中按40ml的量使用。现在可将制剂在-80℃下冷冻，直到进行进一步处理。

将40ml的α₂M-T加到用100mM柠檬酸钠、20mM HEPES(pH7.4)、0.02％NaN₃平衡的Sephacryl柱(20cm²×90cm)中。在该柱的运行中，平衡缓冲剂以0.7ml/min的速率添加700ml，然后以3ml/min的速率添加。保留体积为774-846ml的部分含有α₂M-T。材料的洗提形成尖峰。

α₂M-T的浓度可通过其水解发色性底物82238的能力进行测定。水解发色性底物的能力被称为酰胺水解活性。将制剂的酰胺水解活性调整到与600nM人凝血酶相同的活性，然后加入100nM的牛抗凝血酶和2U/ml肝素(LEO)。现在该材料已准备好用作凝血酶校准物。如需要，可将该材料按适当的量冻干。

2、向血浆中添加凝血酶或α₂M-凝血酶

当凝血酶加入到血浆中时，由于血浆中存在的凝血酶的天然抑制剂，其活性会立即降低。另一方面，相同活性的α₂M-凝血酶导致直线弯曲，这仅仅是由于底物消耗和内滤波效应。图1显示了在96-井板的井中测定的荧光信号，向井中加入了凝血酶(100nM)或α2M-凝血酶复合物，以及荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC(0.417μM，可从BACHEM获得，商品目录号#1-1140)。可以看到相对于α₂M-凝血酶复合物(粗线)，凝血酶曲线(符号)的活性下降很快。在缓冲剂(20mMHepes，140mM NaCl，5g/l牛血清白蛋白(BSA)，pH7.35)中，这两种制剂具有相同的活性(细线和符号)，并且也可观察到缓冲剂中的荧光产量比血浆中的高。这是由于血浆的颜色与缓冲剂有显著的差异。甚至由于在血浆颜色中供体对供体的不同也能产生信号量的显著不同。这就强调了始终需要将特定供体血浆中的凝血酶活性与相同供体的血浆中已知校准物的活性进行比较。

3、α₂M-凝血酶复合物活性的评价

校准物的酰胺分解活性是通过将其活性与已知量的人凝血酶进行比较而测定的。该人凝血酶浓度通过活性部位滴定来测定，使凝血酶与在催化反应的第一部分反应非常迅速的底物进行相互作用，以释放发色性产物，例如，酶迅速酰化而释放出可测定的产物(如，对硝基苯胺)，然后由一种慢得多的反应结束该转换反应。因此，产物的释放正比与活性部位的数目。通过该凝血酶，可以精确地得知以单位时间内单位酶分子的转化分子数目计的活性。比较是在以下条件下和在一种介质中进行的：温度、pH和底物浓度与实际实验中的相同，在所述介质中凝血酶在实验的时间界限(＜30min)内稳定的。这可以是缓冲剂(见上述内容和图2)或加热的血浆，即其中的凝血酶天然抑制剂已被加热灭活(70℃下10分钟)的血浆。

4、凝血酶产生的自动荧光测定

首先说明一个实验，在该实验中对富血小板血浆样品中的凝血酶产生进行测定。所用溶液：富血小板的人血浆，根据Beguin，S.，T.Lindhout，and H.C.Hemker，The effect of trace amounts of tissue factoron thrombin generation in platelet rich plasma，its inhibition by heparin.Thromb Haemost，1989.61(1)：p.25-9.获得。缓冲剂A：20mM Hepes，140mM NaCl，5g/l牛血清白蛋白(BSA)，pH7.35；缓冲剂C：20mMHepes，140mM NaCl，BSA 60mg/mL，pH7.35，以0.02％的叠氮化钠作为防腐剂。

FluCa溶液：向1750μL缓冲剂C中加入200μL的1M CaCl₂。将混合物加热到37℃。然后喷入50μL的100mmol/l底物的DMSO溶液，并立即旋转试管，获得极清澈的溶液，其中底物为2.5mM，CaCl₂为100mM，DMSO为2.5％。

将微量滴定板荧光计(Fluoroscan Ascent，Thermolab Systems，Helsinki，Finland)恒温至37℃。在96-井圆底板中，向一个井加入20μL预热的由浓度为30皮摩的重组组织因子的缓冲剂A溶液组成的触发溶液，向另一个井中加入20μL预热的由浓度为600毫微摩的α₂M-凝血酶复合物组成的校准物；向这些井中的每一个加入80μL血浆。向荧光计的分配器中充入FluCa溶液，开始实验。图3显示了产生的荧光信号。所获得的荧光信号的一阶导数示于图4。

图3所示的一阶导数并未真实地代表凝血酶-时间曲线，原因有三个：a)产物-荧光关系不是线性的，因为荧光分子在测量波长下也吸收光(内滤波效应)，b)底物有消耗，c)α₂-巨球蛋白-凝血酶由实验中产生的凝血酶而形成，α-巨球蛋白一般存在于任何血浆中。

实验中α₂M-凝血酶的形成效应是所有凝血酶产生测定的共有特征，其中通过其对少量信号底物的酰胺水解活性评价凝血酶，二次采样和连续方法相似。校准该效应的方法已经被公布，是所属领域人员已知的[Hemker，H.C.and S.Beguin，Thrombin generation in plasma：itsassessment via the endogenous thrombin potential.Thromb Haemost，1995.74(1)：p.134-8]。

干扰效应a和b的校准可通过以下方式进行：在线地连续由该样品中产生的凝血酶所得信号的一阶导数(O＝f(t))与另一样品中校准物所产生信号的一阶导数(S＝f(t))进行比较。后者很接近于与公式S＝B-A*t吻合的直线。A和B是在实验中通过S＝f(t)由最吻合的直线连续算出的。校准值(R)通过下式得到：

R(t)＝B*SQRT(((B^2-4*A)*O(t))/(2*A))-(B^2/(2*A))

实验期间，在实施这些实验的计算机的屏幕上连续地显示所得到的曲线R＝f(t)(图5A和B)。

5、同时实验

序号4所描述的实验需要96井板中的两个井。也可以在任何数量的可用井中同时进行重复实验或不同的实验。唯一的要求是给定血浆中的实验总是伴有来自相同血浆的另一样品中校准物信号的记录。图6显示了24个同时实验的信号的平均值和置信界限。可看出，存在纤维蛋白(原)时产生的凝血酶量更高，这表明该方法确实得到了凝块束缚的凝血酶的活性。

图7显示了对三个不同个体进行各重复四次的同时测定得到的曲线。图8显示了由在不同的6天中测定的重复四次的一个个体的PRP得到的曲线。

本发明提供了一种实时地测定生物样品中蛋白水解活性、特别是血液或血浆中凝血酶活性的进程的简便试验方法，该方法将其作为连续的信号提供出来，从而，与属于本领域技术的方法如ETP-法相比，本方法给出了有关诸如滞后时间和峰高的参数的更有价值和更为精确的信息，像ETP-法这样的方法只能对产物量进行终点测定。

无论从哪方面来看，本发明的公开内容都应被认为是说明性的而非限定性的，通过权利要求指定的本发明的范围、及任何落在等同物的主旨和范围内的改变都包含在内。

Claims

1.一种实时测定在第一生物样品中蛋白水解活性从样品中出现和消失的进程的方法，该方法包括下列步骤：

c)加入一种工具，该工具对于步骤b)中定义的信号底物具有恒定已知的稳定蛋白水解活性，而对于其中蛋白水解活性未被触发的第二平行样品是惰性的；

2.如权利要求1所述的方法，用于实时测定蛋白水解活性在第一血液或血浆样品中从样品中出现和消失的进程，所述蛋白水解活性主要是凝血酶活性，该方法包括下列步骤：

a)向所述第一样品中加入凝血酶形成激活物以形成凝血酶；

c)加入一种工具，该工具对于步骤b)中定义的信号底物具有恒定已知的稳定蛋白水解活性，而对于其中凝血酶活性未被触发的第二平行样品是惰性的；

3.如权利要求1或2所述的方法，其中第一生物样品选自血液，包括富血小板血浆、贫血小板血浆或无血小板血浆在内的血浆，唾液，血清，尿，脑脊髓液，精液，和粪便。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中蛋白水解活性选自激活的凝固因子活性，包括凝血酶、激活的溶血纤因子活性、和补体系统活性的激活组分。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中信号底物选自含有离去基团的化合物，所述离去基团通过形成的蛋白水解酶导致的反应产生可检测的转化产物。

6.如权利要求5所述的方法，其中信号底物为Z-Gly-Gly-Arg-AMC。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中可检测的转化产物通过光谱学，特别是荧光、光密度和NMR测定。

8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，其中离去基团为荧光基团、发色基团或释放氢离子的基团。

9.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中可检测的转化产物是对硝基苯胺或7-氨基-4-甲基-香豆素。

10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中具有恒定已知的稳定蛋白水解活性的工具选自α₂-巨球蛋白-凝血酶复合物、葡萄球菌凝固酶-凝血酶原复合物和γ凝血酶。

11.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中蛋白酶激活物选自钙离子、磷脂、组织因子、可溶性组织因子、促凝血酶原激酶、高岭土和鞣花酸。

12.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一生物样品还包括一种药剂，该药剂将被测试其对正在研究的蛋白水解系统的影响。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述蛋白水解系统是止血-血栓形成系统。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中药剂是抗血栓剂，如抗血小板剂或抗凝血剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中抗血栓剂选自肝素、硫酸皮肤素、直接凝血酶抑制剂，例如水蛭素、阿加曲班或美加拉群、和Xa因子抑制剂，例如稠抗凝血蛋白。

16.用于实施权利要求1至15中任一项所述的方法的试剂盒，该试剂盒包括以下组件中的一种或多种：

-一种已知浓度的α₂M-凝血酶复合物；

-一种用于富血小板血浆以启动凝固反应的PRP试剂；

-一种有助于诊断溶解血栓活性进程的添加剂；

-一种含有信号底物的试剂；

-一种有助于计算凝血酶活性曲线的软件程序；

-一份使用手册。

17.如权利要求16所述的试剂盒，该试剂盒含有冻干试剂。