JPH11504718A

JPH11504718A - 血栓症リスクのテスト

Info

Publication number: JPH11504718A
Application number: JP9503149A
Authority: JP
Inventors: プレダ，ルイジ
Original assignee: インスツルメンテーションラボラトリー，エス．ピー．エー．
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1999-04-27
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: WO1996042018A1; DE69610558T2; DE69610558D1; CA2224465A1; ES2152531T3; EP0830608A1; ATE196804T1; DK0830608T3; EP0830608B1; JP3248621B2; MX9709961A; US5780255A

Abstract

(57)【要約】本発明は個体の血栓リスクを判定する方法を提供する。本方法は血栓リスクが考えられる個体の血漿中の蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓの活性を、個体から得られた血漿サンプルに、(i)血漿の凝固を誘発または活性化するのに十分な量の第１の試薬と、(ii)血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬、および(iii)カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第３の試薬を加えることにより判定するものである。同じ患者からの第２の血漿サンプルに、凝固を誘発または活性化させる試薬と、蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液または他の物質、ならびに上記のような第３の試薬を加える。第１および第２のサンプル両方において内因性フィブリノーゲンをフィブリンに転化させるのに必要な時間、速度または両者を測定する。この差または比が患者の血栓リスクの指標となる。本法を実施するように考案されたキットもまた本発明の主題事項である。本発明の方法およびキットの別の実施態様においては、合成基質を含む第１の試薬と、患者からの第１のサンプル中で蛋白質Ｃを活性化させる第２の試薬、ならびに第２のサンプル中では蛋白質Ｃを活性化させない第２の試薬を含む。これらの実施態様においては、合成基質の加水分解の速度を測定・比較する。

Description

【発明の詳細な説明】血栓症リスクのテスト発明の背景本発明は個体の血栓症リスクを、その患者の蛋白質Ｃ／蛋白質Ｓの機能性分析をすることによって判定する分析的な血球テストに関する。凝固性疾患のためのスクリーニングテストは、出血の危険性のある患者を探し出すために用いられることが多い。そうしたテストとしては例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT: Activated Partial Thromboplastin Time)およびプロトロンビン時間（PT: Prothrombin Time)テストがある。凝固性疾患または出血の危険性に対するスクリーニングテストは、１つまたはそれ以上の血塊形成因子における顕著な異常性を検出し、またこの異常性を凝固経路の種々の段階のどこにあるかを突き止めるように設計されている。周知のように凝血は内因系経路および外因系経路の２つの系統で起きる。前者は通常、表在するリン脂質とカルシウムの存在が引き金となり、多くの段階を通して最終的に安定化したフィブリン血塊の形成を刺激する。APTTテストは典型的には、ほとんどの凝固性不全が起こる内因経路の凝固因子を測定し、またPTテストは外因経路の凝固因子を測定する。 APTTテストは典型的には、血漿にカオリン、シリカ、エラグ酸などのアクチベーターをリン脂質をベースとした試薬とともに加えることによって行われる。これらの添加が第XII 因子と第XI因子を活性化させる。APTTテストで使用されるリン脂質は従来は大豆などを原料としたものが使用されていたが、現在はウシまたはウサギの脳から抽出されるものとなっている。第IX因子、第VIII因子および第V 因子による第X 因子の活性化に、血小板により生体内(in vivo)で供給されるリン脂質にかわって、外因性リン脂質のAPTT試薬が使用されるようになっている。この凝血テストでは血液の凝固はカルシウムを添加することにより制限される。第VII 因子は部分トロンボプラスチン時間によって影響されない唯一の因子である。したがって、APTTは第VII 因子欠乏の患者では正常（ノーマル）となる。 PTテストは典型的には、組織トロンボプラスチンをカルシウムとともに血漿に加えることによって行われる。これによって第VII 因子を活性化させて凝血を開始させ、これが次に第X 因子を活性化させ、第V 因子の存在下でプロトロンビンのトロンビンへの転化をもたらす。このようにして産生されたトロンビンが、フィブリノーゲンをフィブリンに転化する。したがってPTテストは内因性凝固経路をバイパスして、第XII 因子、第XI因子、第IX因子および第VII 因子の欠損患者ではノーマルとなる。PTは、第VII 因子、第X 因子、第V 因子、プロトロンビンまたはフィブリノーゲンが欠損している患者ではアブノーマルとなる。組織トロンボプラスチンはリン脂質抽出物−たとえば、ウサギの脳または肺あるいはヒトの脳または胎盤からの−であり、これにカルシウムが加えられたものである。蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓ（それぞれ、PCおよびPSと略記する）もまた、凝血プロセスに関与する。蛋白質Ｃは血漿中にある二重鎖の、ビタミンＫ依存性の糖蛋白質であり、肝臓で合成される。これによって先ず生理学的に未分化の凝固プレカーサー（デカルボキシ蛋白質Ｃ）が形成される。蛋白質中のγ- グルタミン酸残基のビタミンＫ依存性カルボン酸塩によるカルボキシル化によって蛋白質Ｃが形成される。蛋白質Ｃ自体はプロ酵素であり、トロンビンによって活性化蛋白質Ｃ(aPC)に転化される。後者は活性化された凝固第V 因子および第VIII因子の蛋白分解不活化によって抗凝固因子として働く。活性蛋白質Ｃの抑制作用は補因子である蛋白質Ｓによって増強される。蛋白質Ｓは血漿中にある単鎖の糖蛋白質であり、これもまたビタミンＫ依存性である。活性蛋白質Ｃおよび蛋白質Ｓは等モル複合体を形成する。蛋白質Ｃのレベルならびに蛋白質Ｓのレベルの低下が、肝臓疾患、汎発性血管内凝固症候群(DIC)および口腔凝固治療後の患者で認められている。蛋白質Ｃまたは蛋白質Ｓの凝固性欠陥が静脈血栓塞栓のリスクを増加させる。したがって、蛋白質Ｃならびに蛋白質Ｓは、単に生理学的止血の場合だけでなく、多くの疾患、特に血栓のケースにおいて重要な役割を果たす。商業的に採用可能なテスト方法においては、血漿中の蛋白質Ｃの量は酵素標識抗体によって測定される。しかしながらこの方法は、測定に使用される抗体がまた前述の脱カルボキシ蛋白質Ｃと反応するという欠点がある。脱カルボキシ蛋白質Ｃの血漿濃度は抗凝固剤治療中に著しく増加し、この方法には多くのエラーが含まれることになり、ある条件下においては間違ったまたは不十分な治療をすることになる。たとえば、ある光学的方法においては蛋白質Ｃは、Agkistrodon contortrix c ontortrix ヘビの毒液から得られるProtac^TM （スイスのペンタファーム社[Pentapharm]から入手可能）を、色素形成蛋白質Ｃ基質とともに使用することにより活性化される。このプロセスにおいてはサンプルの調製を省略することができるが、カルボキシ化された蛋白質Ｃと非カルボキシ化蛋白質Ｃを区別することは不可能である。カルボキシ化蛋白質Ｃだけがin v ivo で有効であることは周知のことである。したがって、この方法では蛋白質Ｃ分子の生物活性に関する情報は得ることができない。血漿中の蛋白質Ｓの量は、たとえばベルチナ[Bertina]ら(Thromb．Haemostas ．、52（2）268-272(1985))の記述による免疫ラジオメトリック試験法により測定することができる。しかしながらこの方法は、測定に使用される抗体が同じく非機能性蛋白質Ｓと反応してしまう。たとえば、脱カルボキシ蛋白質ＳまたはＣ₄ 結合蛋白質と複合化した蛋白質Ｓと反応する。ある条件下においては、これは間違った蛋白質Ｓの値をもたらす。この著者らはまた、活性化蛋白質Ｃをヒト血漿と混合して血漿中の蛋白質Ｓを測定する方法、ならびに部分トロンボプラスチン時間(PTT)を測定する可能性のある方法についても記述している。PTTの時間の長さは機能性蛋白質Ｓの濃度の指標となる。この反応はトロンビンによるフィブリノーゲンの切断ならびにフィブリン血塊の形成によって確認することができる。しかしながらこの検出方法には限界があり、蛋白質Ｃと蛋白質Ｓを同時に測定することはできず、また精製活性化蛋白質Ｃを使用しなければならない。したがって、凝固の生化学的メカニズムに基づいて、既知または未知のものを含め患者のすべての因子の活性を調べることにより、患者の血栓リスクを判定するための迅速な血球テストが切望されている。発明の要旨本発明は、蛋白質Ｃ／蛋白質Ｓの機能性を探索することによって、検体の血栓リスクを判定するための分析的血球テストを指向するものである。本発明のその他の特徴および利点については以下の説明で記述するが、その一部は説明文から明らかとなるか、あるいは本発明を実施することによって理解されるであろう。本発明の目的およびその他の利点は、本明細書の説明および付帯の請求項で具体的に指摘した方法およびキットにより具現され、また達成される。これらおよびその他の利点を本発明の目的に基づいて達成するために、本発明は本明細書に具体化しかつ広範に説明するように、検体から得た血漿サンプルに、（i）血漿の凝固を誘発または活性化するのに十分な量の第１の試薬と、(ii) 血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬、ならびに(iii)カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第３の試薬を添加することにより、検体の血栓のリスクを判定する方法を提供する。次に同じ患者からの第２の血漿サンプルに、（i）凝固を誘発または活性化させる試薬と、(ii)蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液またはその他の物質、ならびに(iii)カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第３の試薬を加える。第１および第２のサンプルの両方における内因性フィブリノーゲンからフィブリンへの転化に必要な時間、速度、またはその両方を測定する。同じステップを正常な対照血漿についても行ない、上記で得た時間、速度、またはその両方との差または比を求める。別の実施態様においては、本発明の方法は検体から得た血漿サンプルに、合成基質、および血漿中の蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬を加え、また同じ患者からの第２のサンプルに合成基質、および血漿中の蛋白質Ｃを活性化させない第２の試薬を加えることを含む。そして各サンプル中の合成基質の加水分解速度を測定し、上記のように比較する。正常な対照血漿についても同じステップを行ない、加水分解速度を測定する。ある実施態様においては、第１の試薬は、以下に限定はされないが、第IXa 因子と、生体外(in vitro)で第IXa 因子を発生させる試薬、ならびにAPTT試薬で構成されるグループから選択される。別の実施態様においては、第１の試薬は、第 Xa因子、in vitroで第Xa因子を発生させる試薬、PT試薬、ならびに外因性凝固経路のアクチベーターで構成されるグループから選択される。好ましい第２試薬は、蛛形類または爬虫類などの毒液産生生物から得られる毒、すなわちヘビまたはクモ毒の精製画分である。現在好ましいとされている実施態様においては、第２試薬は Agkistrodon contortix contortrix から得られるヘビの毒液画分である。別の実施態様においては、第２試薬はリコンビナント毒蛋白質またはポリペプチドとすることもできる。検体の血栓リスクを判定するキットもまた本発明の主題事項である。１つの実施態様において、このキットは(i)血漿の凝固を誘発または活性化するのに十分な量の第１の試薬と、(ii) 血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬、および(iii)カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第３の試薬を含む第１の容器を含む。本発明のキットはさらに、同じ検体からの第２の血漿サンプルに、凝固を活性化または誘発させる第１の試薬を加え；蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液またはその他の物質；ならびにカルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、あるいはそれらの組み合わせ物を加えるための第２の容器を含む。ある実施態様においては、このキットは合成基質を含む第１の試薬と、蛋白質Ｃを活性化させる第２の試薬を入れる少なくとも１つの容器と；合成基質を含む第１の試薬と、蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液またはその他の物質を入れる少なくとも１つの第２の容器を含む。第１および第２試薬は単一の容器（たとえば、小瓶）に混ぜ入れたり、あるいは別々の容器で提供してもよいのは言うまでもない。このキットは、第IXa因子と、in vitroで第IXa因子を発生させる試薬、ならびにAPTT試薬で構成されるグループから選択される第１の試薬を含むものとすることができる。かわりに、第１の試薬を、第Xa因子、in vitroで第Xa因子を発生させる試薬と、PT試薬、ならびに外因性凝固経路のアクチベーターで構成されるグループから選択してもよい。好ましい実施態様においては、第２の試薬はクモ類またはヘビなどの毒液産生生体から得られる毒液の精製画分を含む。現在好ましいとされている実施態様においては、この第２試薬は精製ヘビ毒の画分である。第２試薬はまたリコンビナント毒蛋白質またはポリペプチドとしてもよい。以上の一般的な説明および以下の詳細な説明は例示と説明のためのものであって、請求の範囲に記載の発明を詳細に説明するものである。付帯の図面は本発明の理解を深めるために、本明細書に組み入れてその一部を構成し、本発明の１つの実施態様を説明するものであり、明細書とともに本発明の原理を説明するためのものである。図面の簡単な説明図は、正常な血漿が 100％のEUC 活性を有し、蛋白質Ｃ欠損の血漿が 0％の E UC活性を有するものとして、蛋白質Ｃの相当単位(EUC)で測定した凝固活性を計算するための較正曲線である。本発明を実施する最良の態様本発明は蛋白質Ｃ蛋白質Ｓの機能性を探索するのに有用な分析的血球テストに関する。血球テストは、造血系の遺伝的および非遺伝的栓友病（すなわち血栓を発生させる傾向のある造血系の疾患）をわずらっている患者、あるいは外部プロゲスチンなどの特別な薬理学治療を受けている患者の血栓リスクを評価するための診断補助とすることができる。さらに、手術を受けている患者についても血栓リスクを判断するための評価を行うことができる。ここに請求する発明は、PC欠損、PS欠損または第Va因子の分子異常の存在、あるいは抗 aPC抗体の存在のいずれかによる抑制系に関わる凝血異常を診断するのに使用することができるin vitroの分析テストである。一般的に、本発明の方法は患者の血漿を、凝血活性を活性化または誘発することができる外因性試薬と；内因性PCを aPCに転化する外因性試薬、ならびに凝血反応を完結させるために必要なカルシウム塩、リン脂質、または組織トロンボプラスチンなどのその他の成分とともにインキュベートする。同じ患者からの第２の血漿サンプルに、第１の試薬、第３の試薬、また第２試薬の代わりに PCを活性化させない物質を加え、それにより患者の血球凝固活性を表す。同じステップを正常血漿の対照サンプルを使用して繰り返す。両方のサンプルについて、フィブリノーゲンをフィブリンに転化するのに必要な時間または速度を測定し、非活性化サンプルと活性化サンプルの間の比または差異を求める。この比または差異は血栓リスクの可能性の存在を示すことになる。一例として、患者血漿の時間の差が正常対照サンプルの時間より短い場合、血栓性事象の高いリスクがあることになる。本発明の方法およびキットについて以下さらに詳細に議論する。この分析テストは血漿サンプル中の蛋白質Ｃ／蛋白質Ｓ系の凝血活性と抑制活性の比率を求める方法を提供する。１つの実施態様において、このテストは患者からの血漿サンプルに、血漿中で凝固を誘発または活性化させるのに十分な第１の試薬を加える。凝固を誘発または活性化させる能力を有する試薬はいかなるものもすべて使用することができる。好ましい第１試薬は、下記には限定されないが第IXa因子、第IXa因子をin vitroで発生させる試薬、APTT試薬、第Xa因子、第 Xa因子をin vitroで発生させる試薬、PT試薬および外因性凝固経路のアクチベーターを含む。外因性凝固経路のアクチベーターは、望ましい活性を有するものであればいかなるアクチベーターでもよい。具体的には、本発明に有用なアクチベーターとしては、たとえば、ウシ・トロンボプラスチン、ヒト・トロンボプラスチン、ウサギ・トロンボプラスチンおよびブタ・トロンボプラスチンなどを含む天然またはリコンビナント組織トロンボプラスチンがある。ウシ・トロンボプラスチンが現在好まれている。それらアクチベーターの一部分もまた、望ましい活性を有する。望ましい活性を有するリコンビナントまたは合成突然変異または修飾トロンボプラスチンもまた、この目的に使用することができる。突然変異または修飾トロンボプラスチンは、蛋白質またはアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一部分が欠失または変化しているものの、トロンボプラスチン活性を維持しているリコンビナントまたは合成蛋白質である。当分野の熟練者であれば本発明の請求事項に有用な外因性凝固経路のその他のアクチベーターを容易に求めることができるであろう。第２試薬もまた、検体から得た血漿サンプルに加える。この第２試薬は血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する。第２試薬は望ましい活性を有するものであればいかなる物質でもよい。たとえば、クモ類または爬虫類などの毒液産生生体の毒から第２試薬を得ることができる。たとえば、望ましい画分を精製して得ることができるヘビ毒は、Agkistrodon contorix contortrix 、A.C.mokasen 、A.C.pi ctigaster 、A.piscivours、A.ieucostoma、A.bilineatus、B.throps moojeni、 B.pradoi、Cerastes cerastes 、Vipera lebetrinaまたはV.russelliから得ることができる。好ましくは第２試薬はヘビ毒であり、最も好ましいのは Agkistr odon contortrix contortrixから得られた画分である。それら試薬は商品名Prot ac^TMとして市販品を入手できる。第２試薬はある場合には、毒の誘導物または修飾物とすることができ、あるいはその他の実施態様においては望ましい活性を有するリコンビナント毒蛋白質またはポリペプチドの少なくとも一部分とすることもできる。血漿サンプルに添加する第３の試薬は、カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、あるいはそれらの組み合わせ物を含むものとすることができる。同じ検体から得られた第２のサンプルを、凝固を活性化する第１の試薬、蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液またはその他の物質、ならびにカルシウム塩、リン脂質、あるいは組織トロンボプラスチンまたはそれらの組み合わせ物の第３試薬と混合する。次に第１サンプルと第２サンプル両方の内因性フィブリノーゲンからフィブリンへの転化を測定する。この測定は、たとえば転化の速度、転化の時間、あるいはその両方を測定する。当分野の熟練者であればどの測定がそれぞれの用途において最も適するかを選択することができる。もし第３試薬が合成基質の場合は、フィブリノーゲンからフィブリンへの転化の代わりに、基質の加水分解を測定する。フィブリノーゲンからフィブリンへの転化の速度または時間は、当分野で公知の方法により測定することができ、たとえばサンプルの光学密度の変化を測定することなどにより凝固時間または速度を求めることができる。上記で得られた速度または時間（あるいは両方）の測定値間の差または比を計算し、同じステップを正常な対照血漿についても実施する。次に、1)正常な対照で得られた時間、速度（または両方）と；2)第１と第２のサンプルの差または比を求める。この差は検体の血栓リスクの指標となる。もし試験血漿で計算した時間、速度または両方が正常な対照血漿で計算した時間、速度またはその両方より短い場合、その患者は血栓リスクが高いことになる。具体的には、短い転化時間または比は蛋白質Ｃ、蛋白質Ｓまたは両者の欠乏の指標となる。蛋白質Ｃまたは蛋白質Ｓのレベルが低下または減少している場合は、凝血形成のリスクが高くなる。逆に、高レベルのPCまたはPSは正常な凝血パターンを示し、したがって血栓のリスクは低いことになる。別の実施態様においては、本発明の方法は検体からの第１のサンプルに合成基質、および蛋白質Ｃを活性化させる第２の試薬を加える。検体からの第２のサンプルには合成基質、および蛋白質Ｃを活性化させない第２の試薬を混合する。これらの実施態様においては、第１および第２のサンプル中の合成基質の加水分解の速度を測定・比較する。合成基質は、たとえば反応をモニタするのに有用なトロンビン基質とすることができる。トロンビン基質としては、合成フィブリノーゲンまたはその一部、あるいはトロンビンによって検出可能な物質に転化することができる他の蛋白質またはポリペプチドを含むものとすることができる。合成基質は、基質の加水分解の速度を測定できるように標識またはタグを包含させるものとする。標識またはタグは、脂質に対して内因性のもの、または基質に検出可能な成分を付加したものとするよう考案されている。本発明の方法は手動、または自動で行なうことができる。本法は好ましくはイタリー・ミラノのインスツルメンテーション・ラボラトリー社［Instrumentatio n Laboratory，S.p.A.］から入手できるものなど、特別に設計された計測装置を使用して自動的に行なうのが好ましい。サンプルを計測装置に充填し、試薬を加え、製造者の指示に従って転化時間または速度を求める。請求の本発明はまた検体の血栓リスクを判定するキットについても考案している。当該キットは、（i）検体から得た血漿の凝固を誘発または活性化するのに十分な量の第１の試薬と、(ii)血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬、ならびに(iii)カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第３の試薬、を収める第１の容器を含む。「容器」と言う用語は本明細書で使用しているように、上に掲げた試薬を収めることができるすべての容器を意味する。さまざまな実施態様において、第１の容器は各試薬ごとに別々の小瓶か、３つの試薬すべてを入れる単一の小瓶、あるいは３つの試薬の組み合わせ物を含む２つの小瓶とすることができる。当分野の熟練者であれば、特定の用途および使用の便利さに基づいて、第１の容器の形状を選定することができる。この容器は任意には、使い捨て型の１回使用容器、あるいは別の実施態様においては、滅菌して再使用可能な容器とすることができる。本発明のキットはまた、同一検体からの第２の血漿サンプルに、（i）第１の試薬と、(ii)蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液またはその他の物質、ならびに(iii)カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、あるいはそれらの組み合わせ物を加えるための第２の容器も有する。このキットで使用される試薬は、本発明の方法に関連して上で議論したものと同じ試薬とすることができる。ある実施態様においては、本発明のキットは合成基質と、蛋白質Ｃを活性化させる第２の試薬を含む第１の容器を有する。第２の容器は合成基質と、蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液または物質を含む。別の実施態様においては、本発明のキットはただ１つの容器、すなわち第１または第２の容器のいずれか、だけを含むものとすることができる。かくして上記のように、請求の本発明は検体のPCおよびPSの機能性の迅速な評価を可能とする。本発明のテストは、高い血栓リスクの患者、すなわち遺伝的な PC欠損、F.V.ライデン突然変異などのヘテロ接合またはホモ接合突然変異、ならびに手術治療中の患者を認識するために、患者のサンプルをスクリーニングするための有効な診断補助とすることができる。本発明の方法は、PCおよびPSに加えて、既知または未知のその他の因子の影響を、生理学的基質（すなわち、第Va因子および第VIIIa因子）上での効果的な活性PC抑制作用を行なわせる生化学的なメカニズムに基づいて検出できることから、血球によるテストを考案したものである。システムの血球活性は、正常な患者血漿のプールに 100％の活性値を、またPC 欠損血漿に 0％の値を与えて、蛋白質Ｃの相当単位で測定する。PC/PS 系の相対的活性を得るためには他の測定手段を利用することもできるが、これは熟練当業者であれば容易に求めることができる。実施例実施例１下記の分析テストは手動または自動のいずれかで実施することができる。以下に報告されている容量はACL 3000/pシステムのリサーチ・プログラム（イタリー・ミラノのインスツルメンテーション・ラボラトリー社[Instrumentation Labor atory,S.p.A.]から入手可能）を使用して得たものである。未稀釈の50μＬの患者血漿を、50μＬのH₂O(または同様の緩衝液)を入れたローターに別々に充填し、遠心分離した。150秒後、50μＬのカルシウム・ウシトロンボプラスチンを加えた。凝固反応を 240秒間進行させ、凝固時間をACL の原理を利用して計算した。測定された凝固時間、または速度(To)は、血漿サンプルの凝固活性を表わす。第２のローター中で同じ検体からの別のサンプルを、H₂O をPROTAC^TM溶液（精留したA.gkistrondon contortrix contortrix 毒、0.125 U/mL濃縮液）と置き換えた以外は上記と同じように処理した。そして、凝縮時間または速度(Ta)を測定した。その比(Ta/To)または差(Ta-To)は、PC-PS インヒビター系の総合的機能の指数を表わす。一例として、下に示した値は上記実施例で説明した方法で得たもので、PC、PS 欠損または aPC抵抗性の大きい患者のTo、Ta、および％E.U.C.を表わす。正常血漿の％E.U.C.は57から153 の間である。実施例２材料と方法液サンプルの収集血液サンプル(20ml)を、21ゲージ・バタフライ注射器セットを使用した静脈穿刺により、3.8 ％（重量／容量）のクエン酸ナトリウムを含むプラスチック・シリンジ中に、抗凝血剤と血液の比率0.1:0.9（容量／容量）の比率で採集した。血小板の少ない血漿を2000 x gで20分間の遠心分離により得て、分析するまで-8 0℃で保存した。ルーチンの凝固検定前述のように、活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)およびプロトロンビン時間(PT)、抗トロンビンIII およびプラスミノーゲン検定、PC抗原活性、合計および遊離PS抗原およびPS活性などの試験室検査を行なった。ジロラーミ[Girol ami]ら、Br.J.Haematol. 85：521-526(1993)；ジロラーミら、Thromb.Haemost. 、61：144-147(1989);プレダ[Preda]ら、 Thomb.Res.、60：19-32(1990)。これらすべての検定用の参照用正常血漿は、20歳から60歳の40人の両性の健常者から得た。それぞれのテストの正常値は20歳から70歳の80人の健常者から求めた。 AT III、PCおよびPS欠損の分類のために使用した基準は、最近の文献で報告されているものに基づいた。ダールバック [Dahlback]、Thromb．Haemost.74：139- 148(1995);アラック[Alach]ら、Thromb．Haemost.74：81-89(1995)。血漿中のAPC に対する応答の評価(APC抵抗性テスト）：本テストはベルチナら（ Nature、369 ：64-67(1994)；Thromb．Haemost.、72：880-886(1994)）の提唱する方法の修正法を用いて、ACL 3000プラス/R（イタリー・ミラノのインスツルメンテーション・ラボラトリー社）で実施した。要約すれば、50マイクロリットルの稀釈していない血漿を、50 ul のaPTT−凍結乾燥シリカ（イタリー・ミラノのインスツルメンテーション・ラボラトリー社）とともに、37℃で300 秒間インキュベートした。凝血の形成は50 ul の25 mM 塩化カルシウム、25mMのトリス-HCl (pH7.5)、50mMのNaClおよび0.05％オバルブミン(aPTT-APC)、または1.0 ug/ml( 最終濃度)のヒトAPC(米国インディアナ州サウスベンドのエンザイム・リサーチ・ラボラトリー社[Enzyme Research Laboratory])を含む50ulの同じ試薬を添加することにより開始させた。 APC感度比(APC-SR)を、aPTT＋APC（秒）をaPTT-AP C（秒）で除して算出した。このAPC-SRを次に参照血漿で得られたものの比として標準化(n-APC-SR)した。APC に対する抵抗性は、n-APC-SR 0.80 以下で規定される。n-APC-SR が0.45から0.70の範囲のものはヘテロ接合F.V.ライデン突然変異の存在と一致するのに対し、n-APC-SRが＜0.45の場合はホモ接合欠損の診断が下される。F.V. ライデン突然変異のDNA分析：高分子量DNAを、結合マトリックス(米国カリフォルニア州ハーキュレスのバイオラッド・ラボ社[Biorad Lab.])を使用して５ μL の末梢血液から抽出した。前述のようにDNA分析を行なった。ベルチナら、N ature 369：64-67(1994)；シモニ[Simoni]ら、Stroke、28：885-890(1995)。PC-PS 系球テスト：このテストは、活性化前の血漿サンプルのPT(PTo)と、ペンタファーム社[Pentapharm]（スイス・ベーゼル）から得た Agkistrodon contort rix contortrix由来のヘビ毒であるPROTAC^TMにより活性化させた後のサンプル中に存在する天然PC(PTa)を測定することよりなる。天然PCの活性化後の凝固時間(PTa-PTo)の長期化は、PC-PS系の血球活性を反映する。PC-PS 系の血球活性は、PC相当単位(Equivalent Unit of PC：EUC ％)で表わされる。したがってプールされた標準血漿で得られたPTa-PTo が100EUCに対応し、PC欠損血漿から得られた値は0 EUC となる。プールした正常血漿(PNP)をP C欠損血漿中に稀釈することにより較正曲線を得た。このテストはACL 3000プラス/R凝血計を用いて、下記の分析条件で２段階のサイクルで行った。サンプル 50μｌ試薬１ 50μｌ試薬２ 50μｌ活性化時間 150秒ランプ間時間 3秒遅延時間 10秒データ取得時間 240秒速度 1200rpm 凝血時間は下記の算出方式を利用して計算した：モード S/R x 100 データ ml = 15，Sm2 = 11 第１誘導値 Calc = 3，Sml = 11 基準第１誘導値前述のように、PC-PS 系血球テストはダブルPTで構成されている。試薬１はそれぞれ、基底PTの測定においてはH₂O 、天然PCの活性化後に行われるPTの測定においては最終濃度0.125U/mlのPROTAC^TMを使用した。試薬２は、ヘパリンインヒビターとして20mMのカルシウムイオンとポリブレン(polybrane)を含むウシ・トロンボプラスチン（イタリー・ミラノのインスツルメンテーション・ラボラトリー社）を使用した。 EUC ％は以下のようにして計算した：正常血漿として乾燥血漿（較正用血漿、ロット＃N0743187、イタリー・ミラノのインスツルメンテーション・ラボラトリー社）を使用したが、すべての凝固因子の活性は＞90％であり、PCおよびPS機能活性はそれぞれ90％と98％であった。統計的分析：グループ間の差異はノンパラメトリック検定（無対のウイルコクソン検定）で評価し、ｐ値＞0.05は有意ではない(NS)と見なした。結果 PC/PS 系活性の評価を231 の血漿サンプルで実施した。112 が正常個体（対照群）、36がPC欠損の患者、22がPS欠損、35がF.V.ライデン突然変異による aPC抵抗性、ならびに26がその他の凝固疾患による栓友病(ATIII欠損が２、HCII欠損が１、プラスミノーゲン欠損が１、高ホモシスチン血症が12)であった。表１はこのテストの用量応答性を示したものである。凝血時間(Ta-To)の長期化をEUC ％に対してプロットした場合、直線関係が得られた。表２は血球テストに関し較正用血漿(NO＃NO743187)、40％PSを含む対照血漿、および20％PCを含む対照血漿に対応する３つのEUC ％レベルで求めた検定内の変動係数（CV％）および検定間の変動係数のデータを示す。検定の精度は満足のいく結果であった。表３は対照群並びに４つの患者群のデータを示す。示されているのは患者の欠損状態に応じたサンプル数、平均EUC ％値、中央EUC ％値、EUC ％レベルが欠損状態と一致したサンプル数である。本テストは２つの基本的インヒビターの欠損に対して高い感度を示した。すなわちPC(33/36、91.7％)およびPS(20/22、90.9％)ならびにF.V.ライデン突然変異 (34/35、97.1％)であった。対照群の112 の検体のうち103(92％)は血球活性テストにより正常と判定された。PC/PS 系とは異なる欠損のその他すべての患者は正常な血球テスト結果(26/26、100 ％)となった。 PC/PS 血球テストにおいては、分画されていないヘパリンは0.4U/mlの濃度まで許容された。 PC、PS、ATの遺伝的欠陥を合わせて見ると、僅かに5-10％の患者だけが家系的な毒栓友病を呈することが判明した。このケースの約90％において、APC抵抗性はArg506のGIn置換と考えられるF.V.遺伝子の点変異により引き起こされている。ベルチナら、Nature、369 ：64-67(1994)。患者の選定の状況を考慮に入れた場合、F.V.ライデンは栓友病のケースの約20-50 ％で認められた。PC/PS 系の欠損は今日では遺伝的栓友病の最も多い原因とされている。いくつかのケースでは、抗リン脂質抗体の存在によるPC/PS 系の阻害が血栓の病理学的メカニズムであるとされている。上記の結果で示されているように、PCおよびPS欠損の検出における本発明のテストの感度は高かった。PC欠損の36人の患者のうち僅か３人だけ、またPS欠損の患者22人のうち２人およびF.V.ライデン突然変異の35人の患者のうち１人だけが検出されなかった。対照群に属する９人の検体が、PC/PS血球テストに対して異常な応答を示した。これらの検体ではPCまたはPS欠損あるいはAPC 抵抗性は認められなかった。抗リン脂質抗体の存在もまた除外した。その他の遺伝的不全による栓友病のその他 26人の患者は誰も異常なPC/PS血球活性を示さなかった。PC/PS血球活性における天然PCはPROTACにより活性化されるため、トロンビン−トロンボモジュリン複合体によるPCの生理学的活性化の阻害は本検定では検出することができないようである。本法は、PC-PS 系の血球活性の減退に関連する血栓リスクの高い患者の日常の選別用のスクリーニングテストとして有用に使用できるであろう。当分野の熟練者には、本発明の精神または範囲から逸脱することなく本発明のキットおよび方法にさまざまな修正や変形を加えることができることは自明のことであろう。したがって、本発明は、それらが付帯の請求項およびそれらの均等範囲にある限り、それら修正や変形も含むものとする。

Claims

【特許請求の範囲】１．a.検体から得た血漿サンプルに、（ｉ）血漿の凝固を誘発または活性化するのに十分な量の第１の試薬と、（ii）血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬、および（iii）カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第３の試薬を添加し、 b.前記同じ検体から得た第２の血漿サンプルに、（i）凝固を誘発または活性化させる試薬と、(ii)蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液またはその他の物質、および（iii）カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第３の試薬を加え、 c.ステップ(a)のサンプル中の内因性フィブリノーゲンをフィブリンに転化するのに必要な時間、速度、または両方を測定し、 d.ステップ(b)のサンプル中の内因性フィブリノーゲンをフィブリンに転化するのに必要な時間、速度、または両方を測定し、 e.ステップ(c)または(d)で得た時間、速度または両方の間の差または比を計算し、 f.正常対照血漿のサンプルに対してステップ(a)(b)(c)および(d)を行ない、そして g.ステップ(e)および(f)で得た時間、速度、または両方の差または比を求め、その差が前記患者の血栓リスクの指標であることを特徴とする検体の血栓リスクを判定する方法。２．a.検体から得た血漿サンプルに、（i）合成基質を含む第１の試薬、および（ii）血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬を添加し、 b.前記同じ検体から得た第２の血漿サンプルに、（i）合成基質を含む第１の試薬、および（ii）血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化させない第２の試薬を添加し、 c.ステップ(a)のサンプル中の合成基質の加水分解の速度を測定し、 d.ステップ(b)のサンプル中の合成基質の加水分解の速度を測定し、 e.ステップ(c)または(d)で得た速度の差または比を計算し、 f.正常対照血漿のサンプルに対してステップ(a)(b)(c)および(d)を行ない、そして g.ステップ(e)および(f)で得た速度の差または比を求め、その差が前記患者の血栓リスクの指標であることを特徴とする検体の血栓リスクを判定する方法。３．上記第１の試薬が、第IXa 因子、第IXa 因子を生体外（invitro）で発生させる試薬およびAPTT試薬で構成されるグループから選択される請求項１に記載の方法。４．上記第１の試薬が、第Xa因子、第Xa因子をin vitroで発生させる試薬、PT試薬、ならびに外因性凝固経路のアクチベーターで構成されるグループから選択される請求項１に記載の方法。５．上記第２の試薬が、毒液産生生体から得た毒の精製画分を含むものである請求項１または２に記載の方法。６．上記毒液が Agkistrodon conntortrix contortrix から得たヘビ毒である請求項５に記載の方法。７．第２の試薬がリコンビナント毒蛋白質の少なくとも一部分を含むものである請求項１または２に記載の方法。８．a．（ｉ）検体からの血漿の凝固を誘発または活性化するのに十分な量の第１の試薬と、（ii）血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬、および（ iii）カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第１の容器と、 b．上記同じ検体から得た第２の血漿サンプルに、（ｉ）前記第１の試薬と、（ii）蛋白質Ｃを活性化させない緩衝液またはその他の物質、および（iii）カルシウム塩、リン脂質または組織トロンボプラスチン、またはそれらの組み合わせ物を含む第３の試薬を添加するための第２の容器を含む、検体の血友病リスクを判定するためのキット。９．a）（ｉ）合成基質を含む第１の試薬、および（ii）血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化する第２の試薬を含む第１の容器と、 b）上記同じ検体から得た第２の血漿サンプルに、（ｉ）合成基質を含む第１の試薬、および（ii）血漿中の内因性蛋白質Ｃを活性化させない第２の試薬を添加するための第２の容器を含むことを特徴とする検体の血友病リスクを判定するためのキット。１０．上記第１の試薬が、第IXa因子、第IXa因子をin vitroで発生させる試薬およびAPTT試薬で構成されるグループから選択される請求項８に記載のキット。１１．上記第１の試薬が、第Xa因子、第Xa因子をin vitroで発生させる試薬、PT 試薬、ならびに外因性凝固経路のアクチベーターで構成されるグループから選択される請求項８に記載のキット。１２．上記第２の試薬が、毒液産生生体から得た毒の精製画分を含むものであることを特徴とする請求項８または９に記載のキット。１３．上記毒液が Agkistrodon conntortrix contortrix から得たヘビ毒であることを特徴とする請求項１２に記載のキット。１４．上記第２の試薬がリコンビナント毒蛋白質の少なくとも一部分を含むものである請求項８または９に記載のキット。