ES2154703T5

ES2154703T5 - Procedimiento para la deteccion especifica de un factor de coagulacion v activado con una estabilidad elevada frente a proteina c activada.

Info

Publication number: ES2154703T5
Application number: ES95116175T
Authority: ES
Inventors: Michael Dr. Kraus
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-10-13
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2015-10-13
Also published as: ES2154703T3; JP3687864B2; AU705596B2; JPH08220091A; CA2162531C; EP0711838B1; ATE198772T1; US6090570A; EP0711838A1; CA2162531A1; EP0711838B2; AU3772495A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA COMPROBACION ESPECIFICA DE UN FACTOR V DE COAGULACION CON UNA ESTABILIDAD ELEVADA CONTRA PROTEINA C ELEVADA EN ESTADO ACTIVADO.

Description

Procedimiento para la detección específica de un factor de coagulación V activado con una estabilidad elevada frente a proteína C activada.

La invención se refiere a un procedimiento para la detección específica de un factor de coagulación V con una estabilidad elevada frente a la proteína C activada, en estado activado.

El sistema de coagulación en la sangre se ocupa, por una parte, del mantenimiento de la corriente sanguínea hacia los tejidos a abastecer, por otra parte reacciona frente a las lesiones con un cierre de las heridas y se ocupa, por tanto, del mantenimiento de la integridad del organismo. Al activarse la coagulación se forma, a través de un sistema semejante a una cascada de proteasas que se activan gradualmente, finalmente la proteasa activa trombina. La formación, al principio sólo muy lenta, de trombina se acelera por la propia trombina, al activar los cofactores factor V y factor VIII por escisión proteolítica. Estos cofactores activados forman, con las proteasas factor Xa o IXa complejos activos de enzima/cofactor sobre las superficies de los fosfolípidos, cuya actividad es un factor de aproximadamente 1000 veces superior a la de las proteasas singulares. Por medio de este retroacoplamiento positivo se produce, de forma casi explosiva, la formación de grandes cantidades de trombina. La trombina hace reaccionar el fibrinógeno para dar fibrina, lo que conduce, en el caso normal, al cierre y a la curación de las heridas. Para evitar una extensión de la coagulación que amenazaría la vida, que conduciría a un cierre del sistema vascular en el cuerpo, es decir a trombosis, deben contrarrestarse tanto la proteasa activa como el suministro suplementario de la proteasa. Las proteasas activas se neutralizan en el cuerpo por medio de inhibidores de proteasa a través de la formación de complejos covalentes. La interrupción del aprovisionamiento se inicia por la propi trombina. La trombina se une para ello a la proteína de la membrana trombomodulina y hace reaccionar la proenzima proteína C para dar la proteasa activa proteína Ca (APC). Por su parte, la APC forma con el cofactor proteína S un complejo que escinde proteolíticamente los cofactores activos factor VIIIa y factor Va y, con ello, los inactiva. La APC interrumpe por tanto la fuerte estimulación por estos cofactores.

Este sistema de proteína C/proteína S antes descrito representa un importante mecanismo anticoagulatorio. Esto se confirma porque personas con carencias o defectos en proteína C o proteína S, hereditarios o adquiridos, padecen con elevada probabilidad trombosis, en especial trombosis venosas recidivas (Esmon, C. T. TCM 2: 214-219, 1992).

Junto a la proteína C y la proteína S, otros factores pueden modificar la actividad del sistema, así el factor von Willebrand y el factor IXa (Rick, M. E. et al., J. Lab. Clin. Med. 115: 415-421, 1990), que pueden proteger el factor VIIIa de la degradación proteolítica. Los trastornos adquiridos pueden también atribuirse a la formación de lupus anticoagulante. Estos son anticuerpos dirigidos contra fosfolípidos que perturban la unión, necesaria para la función, de los complejos de proteasa/cofactor a superficies de los fosfolípidos (Amer, L. et al., Thromb. Res. 57: 247-258, 1990).

Muy recientemente se describió una variante del factor V que en estado activado (factor Va) ya no puede inactivarse mediante la APC, o al menos lo hace sólo muy difícilmente (Bertina, R. M. et al., Nature 369: 64-67, 1994). Este defecto se designa también como "padecimiento F. V" y se basa en un intercambio de Arg 506 por Gln en la región de escisión de la APC. La importancia de esta mutación como causa de un riesgo incrementado de trombosis se confirmó muy recientemente en varios estudios.

Hasta ahora están a disposición dos métodos para la detección de este factor V modificado. Está en primer lugar el análisis del genoma por medio de la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chaim reaction", PCR). Esta metodología es, según se conoce, muy laboriosa, realizable sólo en laboratorios especializados y relativamente cara. Además, sólo abarca la mutación hasta ahora conocida. Sin embargo, es imaginable que mutaciones también en otros puntos estabilicen el factor Va contra la escisión por la APC. Por ello, es absolutamente necesario, además de la muy especial metodología de la PCR, un ensayo funcional.

Un ensayo funcional de este tipo, que se basa en una conocida modificación (Amer, et al., 1990) de un procedimiento de rastreo habitual en la coagulación, el tiempo activado parcial de la tromboplastina (APTT), ya se ha descrito. Para la determinación del APTT se pone en contacto, en este caso, una muestra de plasma con una porción de igual volumen de un reactivo que contiene un activador de superficie, por ejemplo sílice, caolín o vidrio y fosfolípidos. Esta mezcla se incuba durante unos pocos minutos a +37ºC. Durante este tiempo se activan los factores del sistema de coagulación que no dependen del calcio (factor XII, factor XI y factor IX). Después de la adición de iones calcio se activa la cascada residual de coagulación y se forma trombina. La cantidad formada de trombina se determina entonces bien por la reacción del sustrato natural fibrinógeno para dar un coágulo, o bien por la liberación de un cromóforo a partir de un sustrato cromógeno. En la modificación de este APTT según Amer, L. et al., (1990), con los iones calcio se añade, al mismo tiempo, proteína C activada. Puesto que, como antes se ha descrito, la APC destruye los cofactores VIIIa y Va, se produce una disminución de la formación de trombina, que depende de la funcionalidad del sistema proteína C/proteína S. Esta modificación se designa en lo sucesivo como tiempo de APC (APCT).

El APCT en su forma utilizada hasta ahora no es apropiado para detectar específicamente la elevada estabilidad del factor V frente a la APC (véase el Ejemplo 1). En el resultado de la medición entran, además de la proteína C, que ciertamente se añade exógenamente en forma activada, todos los factores antes descritos de la muestra que influyen sobre la funcionalidad del sistema proteína C/proteína S. Así pues, no puede distinguirse una mutación en el factor V, especialmente si el paciente a este respecto es heterozigótico, de un defecto o carencia de proteína S. Igualmente, pueden simular este efecto autoanticuerpos contra la proteína S o la proteína C.

Era por tanto misión de la invención encontrar un procedimiento con el que pudiera detectarse el factor V, que presente una elevada estabilidad frente a la degradación por la APC.

La solución del problema se logra mediante la puesta a disposición de las formas de realización descritas en las reivindicaciones.

Se ha encontrado que en la dilución de plasmas con un reactivo pobre en factor V, que contiene proteína S y los factores de coagulación X y protrombina, puede eliminarse la influencia de la proteína S, mientras que la estabilidad modificada del factor V frente a la APC sigue siendo decisiva para el resultado de la medición. Además, pueden emplearse en este procedimiento muestras heparinizadas y también muestras de pacientes bajo terapia de Marcumar, lo que no es posible en los ensayos funcionales hasta ahora existentes.

En el caso más sencillo se trata, respecto del reactivo con el que se diluye la muestra, de plasma humano deficitario en factor V. Después de la activación del factor V de la muestra, éste se destruye mediante proteína C activada o una proteasa de comportamiento en igual sentido y se determina la actividad residual del factor Va.

La activación del factor V de la muestra, su destrucción y la reacción de detección se basan en el caso más sencillo en el desencadenamiento de la coagulación en la muestra bajo adición de proteína C activada (APC). La proporción de plasma deficitario en factor V (F.V-MP) en el volumen de la muestra debe optimarse para el respectivo procedimiento de ensayo (véanse los Ejemplos) y queda entre 50-95%, pero preferentemente en el intervalo de 60-80%. Para la tanda completa de ensayos esto significa que la proporción de la muestra de plasma asciende, como máximo, al 20%, pero preferentemente es inferior o igual al 10%.

El procedimiento de acuerdo con la invención puede, por tanto, basarse en una modificación del APTT, en el que en principio se activan los factores de coagulación XII, XI y IX. Por adición de una mezcla de APC y cloruro cálcico se inicia la formación de trombina, que activa el factor V. Mediante la presencia simultánea de la APC se inactiva el factor Va, con lo que se hace más lenta la velocidad de la formación del coágulo. Al elevar la proporción de plasma deficitario en factor V en el volumen de la muestra, se prolonga por una parte el tiempo de coagulación por el plasma deficitario en factor V, pero por otra parte se reduce la influencia de una carencia en proteína S. Así, se demuestra en el Ejemplo 2 que a partir de aproximadamente el 70% de proporción de plasma deficitario en factor V en el volumen de la muestra, los tiempos de coagulación de un plasma normal y de un plasma deficitario en proteína S son iguales, mientras que en un plasma homozigótico o heterozigótico, que presenta un factor V modificado con una elevada estabilidad frente a la APC, las diferencias de los tiempos de coagulación respecto del plasma normal más bien aumentan. Por lo tanto, se mejora considerablemente la capacidad de diferenciación de los dos efectos frente al estado actual de la técnica.

En lugar del APTT puede aplicarse también el tiempo de tromboplastina (PT) (Ejemplo 3). Los reactivos para el PT contienen una mezcla de tromboplastina, un cofactor unido a la membrana, fosfolípidos y cloruro cálcico. Después de su adición a la muestra, se escinde en principio autocatalíticamente el factor VII para dar factor VIIa. El factor VIIa, junto con la tromboplastina como cofactor, se ocupa entonces de la activación del factor X y éste de la formación de trombina, que de nuevo activa el factor V. Si se añade al mismo tiempo con el reactivo de tromboplastina proteína C activada, entonces se prolonga también aquí el tiempo de coagulación. Sin embargo, si el factor Va es atacable proteolíticamente con mayor dificultad, esta prolongación es menos pronunciada. Ya que los tiempos de coagulación por esta breve vía de activación son muy cortos, se diluyó en el Ejemplo 3 el contenido en tromboplastina. La prolongación del tiempo de coagulación resultante de ello conduce a una prolongación todavía más clara del tiempo de coagulación en presencia de la APC. Por ello, se mejora la capacidad de diferenciación (relación señal/fondo) entre el factor V normal y el modificado. El Ejemplo 3 demuestra también que por una dilución elevada de la muestra con plasma deficitario en factor V, se neutraliza la influencia de una carencia de proteína S. Sin embargo, en contraposición al APTT modificado se hace necesaria una dilución más elevada de la muestra.

El procedimiento de acuerdo con la invención también puede aplicarse en una modificación del RVVT ("tiempo de veneno de víbora de Russell"). El RVVT se basa en el empleo de enzimas procedentes del veneno de la serpiente Vipera russellii. Este contiene proteasas que activan los factores de coagulación X y V humanos a través de escisión proteolítica. Este procedimiento en sí conocido obvia, por tanto, las vías extrínseca e intrínseca de la coagulación y se emplea para calcular la carencia del factor X, factor V y protrombina, pero también en el diagnóstico del lupus (Thiagarajan, P. et al., 1986). Recientemente se emplea el procedimiento en unión con la APC en el mismo sentido que el ensayo basado en el APTT para la determinación de trastornos del sistema proteína C/proteína S. Sin embargo, también se cumple para este procedimiento que junto al efecto de factor V se comportan también en el mismo sentido otros trastornos, por ejemplo una carencia en proteína S y, por lo tanto, no pueden diferenciarse entre sí con este ensayo. El Ejemplo 4 demuestra que la aplicación del procedimiento de acuerdo con la invención, por el contrario, permite una diferenciación específica, ascendiendo preferentemente la proporción del F.V-MP en el volumen de la muestra a 75%.

Adicionalmente a la diferenciación específica, el Ejemplo 5 muestra que por adición de sustancias neutralizadoras de heparina al F.V-MP puede neutralizarse la heparina en la muestra. Esta es otra ventaja esencial del método frente al procedimiento convencional (APCT). Pues precisamente en pacientes con una trombosis existe un gran interés en averiguar la causa del suceso. Sin embargo, estos pacientes están la mayoría de las veces bajo los efectos de anticoagulantes, tales como la heparina, precisamente.

Después de la heparina muchos pacientes se someten, después de una trombosis, a una terapia con Marcumar. Marcumar es un antagonista de la vitamina K y conduce a la síntesis incompleta de factores de coagulación. Las investigaciones en el Ejemplo 6 insinúan la conjetura de que con el procedimiento de acuerdo con la invención también en pacientes bajo terapia con Marcumar se puede ahora detectar un defecto de F.V. Como alternativa a la adición de proteína C activada, también puede añadirse proteína C en estado no activado o utilizarse y activarse la proteína C del plasma deficitario en factor V. Esto sucede, por ejemplo, por adición de activadores de la proteína C procedentes de venenos de serpiente del género Agkistrodon, tal como se recoge también en la solicitud de patente alemana P 44 27 785.7 (véase el Ejemplo 7).

Al aplicar procedimientos tradicionales de coagulación, tales como el APTT, el PT y el RVTT, la determinación de la actividad de coagulación se efectúa por detección mecánica, mecano-óptica u óptica de la formación de coágulos. El procedimiento de acuerdo con la invención puede combinarse también con procedimientos cromógenos más modernos, por ejemplo por determinación de la conversión de un sustrato de trombina cromógeno.

En lugar de plasma deficitario en F.V puede emplearse un sistema de reactivos a base de factores de coagulación purificados. El principio del método se basa, análogamente a la primera variante, en que el factor Va es el factor limitador de la velocidad de activación de protrombina. Por la simultánea presencia de APC se destruye el factor V activado y, con ello, se prolonga el tiempo de coagulación. La muestra, por tanto, se pone en contacto con un activador de protrombina dependiente del factor V, así como con un activador de factor V, por ejemplo a base del veneno de serpiente de Vipera russellii, y se determina la activación de la protrombina añadida, para cuya medición se emplean procedimientos conocidos en el diagnóstico de la coagulación tales como, por ejemplo, la reacción de fibrinógeno o, en el caso de procedimientos cromógenos, la reacción de un sustrato cromógeno de trombina.

Es conveniente añadir a la tanda de ensayos de las enzimas de coagulación importantes cofactores tales como cloruro cálcico y fosfolípidos. Para la separación de lupus anticoagulante del plasma es conveniente, además, añadir fosfolípidos en una elevada concentración, preferentemente entre 0,3 y 0,001%, de modo especialmente preferido entre 0,001 y 0,01%. Para desplegar la actividad de la proteína Ca debía estar contenida, además, fosfatidiletanolamina proporcionalmente en los fosfolípidos (Horie, S, et. al., 1994). Para evitar alteraciones de los resultados de la medición en virtud de la carencia y/o defecto de proteína S en la muestra, además, convenientemente, un sistema de reactivos contendrá proteína S en el intervalo de concentraciones de 0,1 a 5 U/ml (referido a la tanda de ensayos), de modo especialmente preferido en el intervalo de 1-2 U/ml. Finalmente debe añadirse proteína C activada, a través de cuya concentración se controla finalmente la señal de medición. Habitualmente, la concentración de APC en la tanda de ensayos estará en el intervalo de 0,01-1 U/ml.

Este sistema de reactivos comprende, por tanto, al menos los componentes factor X, proteína S, protrombina, los fosfolípidos necesarios para la coagulación, cloruro cálcico, proteína C activada o alternativamente, proteína C no activada y, separado de esto, un activador de la proteína C. El sistema de reactivos puede pasar a emplearse bien combinado como monorreactivo o bien, para elevar la estabilidad, en forma separada tal como, por ejemplo, como reactivo 1, que contiene factor X, proteína S, protrombina, fosfolípidos, y como reactivo 2, que contiene proteína C activada y cloruro cálcico. La muestra se mezcla con el sistema de reactivos. La coagulación se desencadena a través de la activación de la fase de contacto según la clase del APTT, por activación directa del factor X y/o factor V por medio del RVV o por activación a modo de trazas de la trombina por adición de enzimas que escinden la protrombina tales como, por ejemplo, factor X activo o ecarina procedente del veneno de serpiente de Echis carinatus. En el caso de la activación por medio de RVV o ecarina estas enzimas se emplean preferentemente junto con la APC y cloruro cálcico en el reactivo 2 como reactivo de iniciación. La detección se realiza entonces preferentemente a través de la determinación de la formación de trombina por conversión de un sustrato cromógeno, específico para la trombina.

Además, en vez de proteína C activada se puede emplear proteína C no activada, que una vez en la tanda de ensayos se activa por activadores apropiados, por ejemplo a partir del veneno de serpientes del género Agkistrodon, que puede obtenerse bajo el nombre comercial de Protac®. Un sistema de reactivos de este tipo comprende, pues, por ejemplo el reactivo 1 (que contiene proteína S, factor X, proteína C, protrombina y fosfolípidos) así como el reactivo 2 (que contiene Protac®, RVV, cloruro cálcico y un sustrato de trombina). El reactivo 1 puede ser también sólo un plasma deficitario en factor V, pero aportándose entonces los fosfolípidos al reactivo 2. Para reforzar el efecto de la proteína C endógena, puede dividirse también el reactivo 2 y, después de una incubación previa de la mezcla a base de muestra y reactivo 1 con un reactivo 2a a base de Protac® y fosfolípidos para la activación de la proteína C, puede desencadenarse la reacción de coagulación y la reacción de detección de la estabilidad del factor V por adición del reactivo 2b, que contiene RVV y cloruro cálcico. La adición de los fosfolípidos en este caso es arbitraria y la ulterior adición de un sustrato cromógeno es sólo función de la técnica de valoración deseada.

Además, en un sistema de reactivos a base de factores purificados, puede sustituirse el factor X por activadores de la protrombina dependientes del factor Va no humanos, por ejemplo de venenos de serpientes (para la reseña véase: Rosing, J. y Tans, G., 1991). Esto es igualmente apropiado, en combinación con proteína C activada o con proteína C activada en la tanda de ensayos, para detectar específicamente un factor V en muestras de plasma, que posee una elevada estabilidad frente a la degradación proteolítica por parte de proteína C activada. Así, un sistema de reactivos podría constar de los siguientes componentes: reactivo 1 a base de proteína S, proteína C, protrombina y fosfolípidos, así como reactivo 2 a base de Protac®, RVV o RVV-V (la proteasa de RVV que sólo activa el factor V), activador de protrombina dependiente del factor V, cloruro cálcico y un sustrato de trombina, o el sustrato de trombina como reactivo 3.

Los sistemas de reactivos que se basan en un APTT son función de la concentración del factor VIII en la muestra, tal como está indicado en el Ejemplo 8. Se ha encontrado, de modo sorprendente, que un plasma deficitario en factor V, que contiene factor VIII en concentraciones fisiológicas (0,7-1,4 unidades/ml), frente a un plasma deficitario que no contiene factor VIII, es menos dependiente de la concentración en factor VIII de la muestra. Con ello se mejora la diferenciación entre plasmas normales con elevado contenido en factor VIII, y plasma con contenido normal en factor VIII pero con padecimiento de factor V. En sistemas de reactivos que se basan en un APTT, se emplean por tanto preferentemente plasma deficitario en factor V y/o reactivos que contienen factor VIII en concentraciones entre 0 y 4 U/ml, de modo especialmente preferido en el intervalo de concentraciones entre 0,7 y 1,3 U/ml, o se sustituyen por adición.

Abreviaturas empleadas

APCT: Tiempo de proteína C activada

APCV: Tiempo de proteína C activada bajo mezcladura de la muestra con plasma deficitario en factor V

APTT: Tiempo de tromboplastina parcial, activada

Arg: Arginina

F.V-MP: Plasma humano deficitario en factor V

F.V-padecimiento: Intercambio de aminoácido Arg \rightarrow Gln en la posición 506 en el factor V

Gln: Glutamina

PC-MP: Plasma humano deficitario en proteína C

PS-MP: Plasma humano deficitario en proteína S

RVVT: Tiempo de veneno de víbora de Russell

SHP: Plasma humano normalizado (una agrupación de plasma humano normal)

Tris: Tris-(hidroximetil)-aminometano

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Ejemplo 1 Limitación del estado de la técnica para la detección funcional de un padecimiento de F.V o defecto del mismo sentido

La determinación del tiempo de coagulación se efectuó en un coagulómetro automático (Behring Fibrintimer A, Firma Behringwerke; Firma Behringwerke AG, Marburg). Todos los reactivos eran de la Firma Behringwerke AG. Como agrupación de plasma de donantes normales de sangre se empleó SHP.

La determinación del APTT se efectúa según la prescripción: 1 envase de Pathromtin® para 5 ml, una mezcla de fosfolípidos de placenta humana, se disolvió en 5 ml de una suspensión de caolín como activador de superficies. La solución de cloruro cálcico (25 mM) se calentó antes de su uso a +37ºC.

En un tubito de medición se pipetearon sucesivamente

: 100 \mul de Pathromtin®

: 100 \mul de muestra de plasma.

A continuación se incubó a +37ºC durante 2 minutos y se inició el tiempo de coagulación por adición de 100 \mul de solución de cloruro cálcico. El tiempo de coagulación se determinó a 405 nm.

La determinación del APCT se efectuó con los reactivos de sensibilidad de la APC de la Firma Behringwerke. Tal como en el caso del APTT, se preparó el reactivo activador. El reactivo iniciador de base de cloruro cálcico y proteína C activada se disolvió en 5 ml de agua destilada y se calentó antes de su uso a +37ºC.

En un tubito de medición se pipetearon sucesivamente

: 100 \mul de Pathromtin®

: 100 \mul de muestra de plasma.

A continuación, se incubó a +37ºC durante 2 minutos y se inició el tiempo de coagulación por adición de 100 \mul de reactivo iniciador. El tiempo de coagulación se determinó a 405 nm.

Los APTT y APCT se determinaron en los siguientes plasmas humanos al citrato: en un conjunto de donantes normales de sangre (SHP), en plasmas con una carencia de proteína C (PC-MP) o de proteína S (PS-MP), así como en un plasma con un defecto de padecimiento de F.V homozigótico. Para la simulación de un defecto heterozigótico, en el que aproximadamente el 50% del factor V plasmático está presente intacto o en forma de padecimiento de F.V, se mezcló el plasma con padecimiento de F.V homozigótico con SHP en la relación 1:1.

En la Tabla 1 están representados los tiempos de coagulación obtenidos, así como las diferencias del APCT respecto del SHP. Para el APTT, los valores estaban todos dentro del intervalo de la norma (\leq 40 s), una condición previa para la realización del APCT. En el APCT son patológicos los tiempos de coagulación que, frente al plasma normal, son más cortos. Esto no afecta a la carencia de proteína C. Puesto que en el APTC la proteína C activada se añade exógenamente, la proteína C de la muestra no puede influir en el ensayo. Por el contrario, la carencia de proteína S conduce a un acortamiento del tiempo de coagulación que, en este caso, incluso está algo más fuertemente acentuado que en el caso de un defecto de padecimiento de F.V heterozigótico. En el caso de un defecto de padecimiento de F.V homozigótico, el acortamiento en el APCT está acentuado al máximo. Las diferencias entre carencia de proteína S y un defecto de padecimiento de F.V homozigótico están acentuadas sólo débilmente. Estas diferencias todavía se siguen diluyendo en la práctica al desnaturalizarse continuamente los factores V y VIII en función de la duración del intervalo existente desde la extracción de la sangre hasta la determinación. Esto conduce a una prolongación del tiempo de coagulación que contrarresta el acortamiento observado del tiempo de coagulación.

El procedimiento que hasta ahora está a disposición, es decir el APCT, no es apropiado, por consiguiente, para detectar específicamente un defecto de padecimiento de F.V o un defecto semejante en el factor V que conduzca a una estabilidad incrementada frente a la proteína C activada.

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TABLA 1 APTT y APCT de diferentes plasmas con carencias o defectos que influyen sobre la funcionalidad del sistema proteína C/proteína S

Indicación de los tiempos de coagulación (absolutos) o la diferencia del APCT con respecto a SHP en segundos.

SHP = plasma normal; PC-MP = plasma deficitario en proteína C; PS-MP = plasma deficitario en proteína S; F.V-L 1/1 = plasma con defecto de padecimiento de F.V homozigótico; F.V-L 1/2 = plasma con defecto de padecimiento de F.V heterozigótico.

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Ejemplo 2 Optimación del procedimiento a base de un APTT modificado

Para la determinación del tiempo de coagulación se disolvió 1 envase de Pathromtin® para 5 ml en 5 ml de suspensión de caolín. El reactivo iniciador de los reactivos de sensibilidad de APC (que contienen cloruro cálcico y proteína C activada) se disolvió en 5 ml de agua destilada y se calentó antes de su uso a +37ºC. El plasma deficitario en factor V se disolvió en 1 ml de agua destilada.

En un tubito de medición se pipetearon sucesivamente

: x \mul de muestra de plasma

: y \mul de F.V-MP

: 100 \mul de Pathromtin®.

A continuación se incubó a +37ºC durante 2 minutos y se inició el tiempo de coagulación por adición de 100 \mul de reactivo iniciador. El tiempo de coagulación se determinó a 405 nm.

Los volúmenes x e y se eligieron de modo que el volumen total (x + y) ascendía exactamente a 100 \mul. Los tiempos de coagulación se determinaron en los siguientes plasmas humanos al citrato: en una agrupación de donantes normales de sangre (SHP), en plasmas con una carencia de proteína C (PC-MP) o de proteína S (PS-MP), así como en un plasma con un defecto de padecimiento de F.V homozigótico. Para la simulación de un defecto heterozigótico, en el que aproximadamente el 50% del factor V plasmático está presente intacto o en forma de padecimiento de F.V, el plasma con padecimiento de F.V homozigótico se mezcló con SHP en la relación 1:1.

En la Tabla 2 están recogidos los tiempos de coagulación obtenidos, así como las diferencias de los tiempos de coagulación respecto del SHP. Con proporción creciente de F.V-MP en el volumen de la muestra se hacen más largos los tiempos de coagulación en virtud de la creciente carencia de factor V. Sin embargo, mientras que la diferencia entre SHP y PC-MP permanece casi invariable, la separación entre SHP y PS-MP se hace cada vez más corta y a partir de una proporción aproximada del 70% de F.V-MP en la tanda de ensayos ya no se observa diferencia alguna. La carencia de proteína S de la muestra, por tanto, se neutraliza suficientemente por la proteína S en el F.V-MP. Los plasmas con defecto de padecimiento de F.V homozigótico o (simulado) heterozigótico se comportan, sin embargo, de forma absolutamente opuesta. Aquí aumenta la diferencia de los tiempos de coagulación respecto del SHP.

El procedimiento permite, por tanto, no sólo diafragmar la carencia de proteína S, incluso refuerza el efecto originado por el padecimiento de F.V. Con ello, tampoco los trastornos debidos a prolongados tiempos de almacenamiento de los plasmas conducirán tan fácilmente como en el procedimiento actual (Ejemplo 1) a un borrado de las diferencias entre carencia de PS y defecto de F.V. Además, es de esperar que en este procedimiento se neutralicen autoanticuerpos contra la PS, puesto que ciertamente se elimina el efecto PS. Sin embargo, también autoanticuerpos contra la PC o complejos PC/PS-fosfolípido apenas habrán de observarse con elevada dilución de la muestra con el F.V-MP solo en virtud de la dilución.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2 Tiempos de coagulación de diferentes plasmas con carencia o defectos que influyen sobre la funcionalidad del sistema proteína C/proteína S en el procedimiento a base de un APTT modificado en función de la proporción de F.V-MP en el volumen de la muestra

Indicación de los tiempos de coagulación obtenidos (A) o sus diferencias (B) respecto del SHP en segundos.

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Ejemplo 3 Optimación del procedimiento a base de un tiempo de tromboplastina modificado

Para la determinación del tiempo de coagulación se disolvió Thromboplastin®, un reactivo de PT de placenta humana, según la prescripción del fabricante, en agua destilada y se diluyó 1:2000 con un tampón consistente en Tris/HCl 50 mM, 0,01% de Phospholipon-25 (una mezcla de fosfolípidos de habas de soja), cloruro cálcico 10 mM, 0,4 U/ml de APC, pH 7,4. El reactivo se calentó antes de su uso a +37ºC. El plasma deficitario en factor V se disolvió en 1 ml de agua destilada.

En un tubito de medición se pipetearon sucesivamente

: x \mul de muestra de plasma

: y \mul de F.V-MP

: 100 \mul de Thromboplastin® 1:2000.

A continuación, se incubó a +37ºC durante 3 minutos y se inició el tiempo de coagulación por adición de 100 \mul de reactivo iniciador. El tiempo de coagulación se determinó a 405 nm.

Los volúmenes x e y se eligieron de modo que el volumen total (x + y) ascendía exactamente a 100 \mul. En este caso la variante con 0 \mul de F.V-MP corresponde a una variante del APCT a base del tiempo de tromboplastina. Los tiempos de coagulación se determinaron en las mismas muestras tal como en el Ejemplo 2.

En la Tabla 3 están recogidos los tiempos de coagulación obtenidos, así como las diferencias de los tiempos de coagulación respecto del SHP.

Al aumentar la proporción de F.V-MP en el volumen de las muestras se hacen más largos los tiempos de coagulación en virtud de la creciente carencia de factor V. No obstante, no podía neutralizarse completamente la influencia de la proteína S hasta una proporción del 75% de F.V-MP en el volumen de la muestra, de modo que debían emplearse concentraciones todavía superiores. Además, se puede seguir optimando la reactividad a través de la elección de las sustancias tampón, de las fuerzas iónicas y de la concentración de fosfolípidos. A pesar de ello, se observa que las diferencias de los tiempos de coagulación entre PS-MP y padecimiento de F.V, tanto homozigótico como también heterozigótico, se aumentan, por tanto, se mejora la capacidad de diferenciación entre los dos trastornos del sistema de proteína C/proteína S con el procedimiento también a base del PT.

TABLA 3 Tiempos de coagulación de diferentes plasmas con carencia o defectos que influyen sobre la funcionalidad del sistema de proteína C/proteína S en el procedimiento a base de un PT modificado en función de la proporción de F.V-MP en el volumen de la muestra

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Ejemplo 4 Procedimiento de acuerdo con la invención a base de un tiempo de RVV modificado

La determinación del tiempo de coagulación se efectuó en un coagulómetro automático (Behring Fibrintimer A, Firma Behringwerke; Firma Behringwerke AG, Marburg). Como reactivo de RVV se empleó el reactivo LA-Confirm® de la Firma Gradipore, Australia. Todos los demás reactivos eran de la Firma Behringwerke AG.

Para la determinación del tiempo de coagulación se disolvió 1 envase de LA-Confirm® de 2 ml con 2 ml de reactivo iniciador a base de los reactivos de sensibilidad de la APC (que contiene cloruro cálcico y proteína C activada) y antes de su uso se calentó a +37ºC (= reactivo RVV/APC). El plasma deficitario en factor V se disolvió en 1 ml de agua destilada.

En un tubito de medición se pipetearon sucesivamente

: x \mul de muestra de plasma

: y \mul de F.V-MP

y se inició el tiempo de coagulación por adición de 100 \mul de reactivo de RVV/APC. El tiempo de coagulación se determinó a 405 nm.

Los volúmenes x e y se eligieron de modo que el volumen total (x + y) ascendía exactamente a 100 \mul. En este caso, la variante con 0 \mul de F.V-MP corresponde a una variante del APCT a base del ensayo de RVV. Los tiempos de coagulación se determinaron en las mismas muestras que en el Ejemplo 2.

En la Tabla 4 están enumerados los tiempos de coagulación obtenidos, así como las diferencias de los tiempos de coagulación respecto del SHP. Tal como en las otras variantes del ensayo (Ejemplos 2 y 3) se prolongan los tiempos de coagulación a medida que aumenta la proporción de F.V-MP en el volumen de la muestra. El plasma deficitario en proteína C siempre está prolongado frente al SHP. La diferencia entre SHP y plasma deficitario en proteína S se hace menor al crecer la proporción en F.V-MP, por el contrario el efecto del padecimiento de F.V se hace mayor. De modo semejante a lo que sucede en la variante del ensayo a base del PT (Ejemplo 3), la carencia de proteína S no se neutraliza completamente con las proporciones de F.V-MP aquí recogidas, de modo que debe elegirse la proporción de F.V-MP todavía superior al 70%. Sin embargo, se refuerzan las diferencias entre un plasma con padecimiento de F.V, ya sea homozigótico o heterozigótico, con carencia o defecto en proteína S, de modo que también a base del RVVT el procedimiento de acuerdo con la invención conduce a una mejor diferenciación de un factor V más estable frente a proteína C activada, de otros trastornos del sistema de proteína C/proteína S.

TABLA 4 Tiempos de coagulación de diferentes plasmas con carencia o defectos que modifican la funcionalidad del sistema de proteína C/proteína S en el procedimiento de acuerdo con la invención a base de un RVVT modificado en función de la proporción de F.V-MP en el volumen de la muestra

4

Ejemplo 5 Neutralización de heparina por adiciones en el plasma deficitario en factor V

La heparina se adquirió de Hoffmann-La Roche, Grenzach-Whylen, (Liquemin® 25000), el Polybren de la Firma Ega-Chemie, Steinheim. Los restantes reactivos y aparatos eran de la Firma Behringwerke AG.

Plasma humano normalizado o un plasma con un defecto de padecimiento de factor V se mezcló con heparina y los tiempos de coagulación, tal como se recoge en el Ejemplo 2, se determinaron en el procedimiento de acuerdo con la invención con una proporción de 75% de F.V-MP en el volumen de la muestra. Para la neutralización de la heparina en la muestra se mezcló el plasma deficitario en factor V adicionalmente con 10 \mug/ml de Polybren.

En la Tabla 5 están recogidos los tiempos de coagulación obtenidos en presencia de 0 a 2 U/ml de heparina en las diferentes variantes del ensayo. Sin adición neutralizante de la heparina al F.V-MP los tiempos de coagulación se desvían, ya en presencia de heparina, por encima de 0,2 U/ml claramente de la muestra sin heparina. Mediante la adición de 10 \mug/ml de Polybren al F.V-MP puede efectuarse la determinación del defecto de factor V incluso en presencia de hasta 2 U/ml de heparina. Con ello es posible, en contraposición al estado actual de la técnica, la determinación del defecto de padecimiento de F.V también en muestras heparinizadas.

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TABLA 5 Neutralización de heparina en un plasma normal y en un plasma con un defecto de padecimiento de factor V por adición de Polybren en el procedimiento de acuerdo con la invención

Indicación de los tiempos de coagulación en segundos.

SHP = plasma normal; F.V-L = plasma con defecto de padecimiento de F.V homozigótico.

5

Ejemplo 6 Determinación del efecto de F.V en plasma en pacientes bajo terapia con Marcumar

De 9 plasmas de pacientes, que no recibieron Marcumar ni heparina, así como de 6 plasmas de pacientes después de trombosis, bajo terapia con Marcumar, se determinó el APCT de manera correspondiente al Ejemplo 1 y el APCV con una proporción de F.V-MP en el volumen de la muestra de 75% de manera correspondiente al Ejemplo 2.

En la Tabla 6 están recogidos los tiempos de coagulación obtenidos. Los resultados se convirtieron en % respecto de los tiempos de coagulación que se obtuvieron con SHP (= 100%). Son positivas en ambos ensayos las muestras que quedan por debajo del límite del 100%. Los plasmas no marcumarizados se encontraron positivos en ambos ensayos, es decir por debajo del límite del 100%, mientras que todos los plasmas marcumarizados quedaron negativos en el APCT, pero en el procedimiento (APCV) 5 de los 6 plasmas quedaron claramente por debajo de este límite. Por la mezcla con el F.V-MP se sustituyen en los plasmas marcumarizados todas las enzimas defectuosas, dependientes de la vitamina K. También al mezclar los plasmas con plasma normal (Tabla 6) se acortan los tiempos de coagulación. Sin embargo, esto no es suficiente para identificar muestras positivas en el APCT con muestras sustituidas de este modo.

TABLA 6 Comportamiento en la reacción de plasmas con defecto de padecimiento de F.V y de plasmas marcumarizados de pacientes después de trombosis en el APCT y el APCV

Indicación de los tiempos de coagulación respecto del SHP (= 100) en %; F.V-L = plasmas con defecto de padecimiento de F.V homozigótico; Marc = plasmas marcumarizados; Marc/SHP = plasmas marcumarizados mezclados 1+1 con plasma normal, no marcumarizado.

6

Ejemplo 7 Determinación del defecto de F.V por activación de la proteína C en el plasma deficitario en factor V añadido

La determinación del tiempo de coagulación se efectuó en un coagulómetro automático (Behring Fibrintimer A, Firma Behringwerke; Firma Behringwerke AG, Marburg). Todos los reactivos eran de la Firma Behringwerke AG.

Para la determinación del tiempo de coagulación se disolvió 1 envase de reactivo activador de proteína para reactivos de proteína C de la Firma Behringwerke con 1 envase de Pathromtin® SL (un reactivo de APTT a base de sílice; 5,5 ml). Este reactivo y la solución de cloruro cálcico (25 mM) se calentaron antes de su uso a +37ºC. El plasma deficitario en factor V se disolvió en 1 ml de agua destilada.

En un tubito de medición se pipetearon sucesivamente

: x \mul de muestra de plasma

: y \mul de F.V-MP

: 100 \mul de mezcla de activador de proteína C/Pathromtin® SL.

A continuación se incubó a +37ºC durante 3 minutos y se inició el tiempo de coagulación por adición de 100 \mul de reactivo iniciador. El tiempo de coagulación se determinó a 405 nm.

Los volúmenes x e y se eligieron de modo que el volumen total (x + y) ascendía exactamente a 100 \mul. En este caso, la variante con 0 \mul de F.V-MP corresponde a un nuevo ensayo para el rastreo de trastornos del sistema de proteína C/proteína S, tal como se describe en la solicitud de patente alemana P 44 27 785.7. Los tiempos de coagulación se determinaron en las mismas muestras que en el Ejemplo 2.

En la Tabla 7 están recogidos los tiempos de coagulación obtenidos, así como las diferencias de los tiempos de coagulación respecto del SHP. Al igual que en las otras variantes del ensayo (Ejemplos 2 a 4) se prolongan los tiempos de coagulación con proporción creciente de F.V-MP en el volumen de la muestra. Las diferencias entre SHP y plasma deficitario en proteína S se hacen menores con proporción creciente de F.V-MP, el efecto del padecimiento de F.V, por el contrario, mayor. Con una proporción de F.V-MP de 70% en el volumen de la muestra ya está neutralizado el efecto del déficit en proteína S. Los resultados son por tanto semejantes a la aplicación del procedimiento de acuerdo con la invención indicada en el Ejemplo 4, aunque en este caso no se añadió proteína C activada, sino que, alternativamente, se activó, una vez en la tanda de ensayos, una proteína C no activada.

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TABLA 7 Tiempos de coagulación de diferentes plasmas con carencia o defectos que modifican la funcionalidad del sistema de proteína C/proteína S en el procedimiento a base de un APTT modificado por activación de la proteína C una vez en la tanda de ensayos

7

Ejemplo 8 Amortiguación de la influencia del factor VIII de la muestra en un método dependiente del APTT por adición de factor VIII a un plasma deficitario en factor V

La determinación del tiempo de coagulación se efectuó en un coagulómetro automático (Behring Fibrintimer A, Firma Behringwerke; Firma Behringwerke AG, Marburg). Todos los reactivos eran de la Firma Behringwerke AG. Como fuente de factor VIII se empleó Beriate®, un concentrado de factor VIII humano de la Firma Behringwerke.

La realización del ensayo se efectuó según el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, eligiéndose una relación de mezcla de muestra y plasma deficitario en factor V de 25:75. Como plasta deficitario en factor V se empleó un plasma humano térmicamente inactivado. En esta inactivación se destruyen tanto el factor V como también el factor VIII. Para comparación, se sustituyó este plasma después de disolverlo por medio de Beriate® con factor VIII a una concentración de 1 unidad por ml. Además, se sustituyó el SHP con factor VIII de Beriate®, de modo que el contenido en factor VIII estaba comprendido entre 1 y 4 unidades/ml. Para comparación se determinó un plasma humano con defecto de padecimiento de factor V heterozigótico en el procedimiento de acuerdo con la invención.

En la Tabla 8 están recogidos los tiempos de coagulación, así como las diferencias de los tiempos de coagulación respecto del SHP (que contiene 1 U/ml de factor VIII) que se obtuvieron con el plasma deficitario en factor V sin sustitución con factor VIII o con ella. Al emplear plasma deficitario exento de factor VIII, se acortan los tiempos de coagulación en el plasma normal al aumentar el contenido en factor VIII del plasma y se acercan a los que se obtienen con un plasma con defecto de padecimiento de factor V, pero con contenido normal en factor VIII. Si, por el contrario, el plasma deficitario en factor V contiene ya 1 U/ml de factor VIII, entonces es insignificante el acortamiento del tiempo de coagulación en función del contenido en factor VIII de la muestra.

Esto demuestra que en un ensayo basado en un APTT por adición de factor VIII o mediante el empleo de reactivos que contienen factor VIII puede evitarse una identificación falsamente positiva de las muestras en virtud de elevados niveles de factor VIII.

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TABLA 8 Tiempos de coagulación de plasma normal en función del contenido en factor VIII con empleo de plasma deficitario en factor V sin factor VIII (O F.VIII) o empleando un plasma deficitario en factor V con 1 unidad de factor VIII por ml

Junto a los tiempos de coagulación para el plasma normal (SHP) con diferentes concentraciones de factor VIII (1 a 4 U/ml), están indicados los tiempos de coagulación para plasma con defecto de padecimiento de F.V heterozigótico (padecimiento de F.V), así como las diferencias respecto del plasma normal con 1 U de factor VIII/ml.

Valores en segundos.

8

Claims

1. Procedimiento para la detección cualitativa y para la determinación cuantitativa de la estabilidad del factor V de coagulación activado frente a la degradación proteolítica en una muestra de un líquido biológico, que comprende las siguientes etapas:

a): mezcla de la muestra con plasma deficitario en factor V de origen humano o animal como reactivo A, cuyo contenido en factor V capaz de funcionar frente a plasma humano normal está disminuido, y que contiene aditivos para la neutralización de heparina y factor VIII en el intervalo de concentraciones entre 0,7 y 1,3 U/ml,

b): adición de un reactivo B para la activación del factor V de la muestra,

c): adición de un reactivo C para la degradación proteolítica del factor V activado de la muestra,

d): adición de reactivos para la determinación de la actividad residual del factor Va,

ascendiendo la proporción del volumen de la muestra en el volumen total del ensayo al 20% como máximo, pero preferentemente al 10% o menos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en el caso del reactivo A se trata de plasma deficitario en factor V de origen humano.

3. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 1-2, en el que el déficit en factor V se entiende como un déficit funcional y, por tanto, se pueden emplear tanto plasmas con un contenido realmente reducido en factor V, como también plasmas que ciertamente contienen factor V, pero cuyo factor V no es activable en el procedimiento de activación empleado.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el contenido reducido en factor V del plasma se basa bien en una carencia genética o bien en un defecto del donante.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el contenido reducido en factor V del plasma se produjo por adsorción a apropiados participantes de unión afines, preferentemente a materiales de soporte recubiertos con anticuerpos contra el factor V, de modo especialmente preferido por inmunoadsorción mediante anticuerpos monoclonales contra el factor V.

6. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el factor V del plasma empleado se inactivó por tratamientos previos, empleándose de modo especialmente preferido un tratamiento térmico para la desnaturalización del
factor V.

7. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el factor V, capaz de funcionar, del plasma empleado se redujo por tratamientos previos con enzimas proteolíticas, que inactivan específicamente el factor V o el factor Va.

8. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el factor V existente en el plasma no es activable por el reactivo B.

9. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el contenido activable, capaz de funcionar, de factor V oscila entre < 1 y 50%, pero preferentemente asciende a menos del 10% del contenido de un plasma humano.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la proporción del plasma deficitario en factor V, después de su mezcla con la muestra, se encuentra entre 50-95%, pero se encuentra preferentemente en el intervalo de 60-80%.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, según el cual el plasma deficitario en factor V contiene Polybren en concentraciones entre 2 y 50 mg/l, de modo especialmente preferido en el intervalo entre 10 y 20 mg/l.

12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en el caso del reactivo con el que se mezcla la muestra se trata de agua, solución fisiológica de cloruro sódico, una solución tampón apropiada y/o de una o varias enzimas y cofactores que no son idénticos al factor V.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que en el reactivo están contenidas concentraciones de proteína S apropiadas para la reacción, preferentemente en el intervalo de concentraciones - referido a la concentración después de la mezcladura con la muestra - de 0,2-5 U/ml, de modo especialmente preferido en el intervalo de concentraciones de 0,5-2 U/ml.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que en el reactivo para la reacción están contenidas concentraciones de factor X apropiadas, preferentemente en el intervalo de concentraciones - referido a la concentración después de mezcladura con la muestra - de 0,2-5 U/ml, de modo especialmente preferido en el intervalo de concentraciones de 0,5-2 U/ml.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que en el reactivo para la reacción están contenidas concentraciones de protrombina apropiadas, preferentemente en el intervalo de concentraciones - referido a la concentración después de mezcladura con la muestra - de 0,5-10 U/ml, de modo especialmente preferido en el intervalo de concentraciones de 1,0-2 U/ml.

16. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que en los reactivos están contenidos fosfolípidos, preferentemente mezclas de fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, en concentraciones que, referido a la concentración después de mezcladura con la muestra, están en el intervalo de 0,3-0,001%, preferentemente en el intervalo de 0,01-0,1%.

17. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 1 y 12-16, en el que un reactivo para la mezcladura de la muestra contiene uno o varios de los aditivos citados en las reivindicaciones 13-16.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la activación del factor V de la muestra puede efectuarse directa o indirectamente.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la activación del factor V puede efectuarse directamente por adición de apropiadas enzimas activadoras de origen humano o animal.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que como enzima de origen humano se utiliza, preferentemente, trombina.

21. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que como enzimas de origen no humano se utilizan, preferentemente, activadores del factor V a base de veneno de serpientes, de modo especialmente preferido el activador de factor V a base del veneno de Vipera russellii.

22. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la activación indirecta del factor V de la muestra puede efectuarse por desencadenamiento de la cascada de coagulación por activación de la fase de contacto por medio de activadores de superficie, fosfolípidos e iones calcio según el principio del tiempo parcial de tromboplastina activado.

23. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la activación indirecta del factor V de la muestra puede efectuarse por desencadenamiento de la cascada de coagulación por adición de tromboplastina, fosfolípidos e iones calcio según el principio del tiempo de tromboplastina.

24. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la activación del factor V de la muestra puede efectuarse indirectamente por activación de protrombina mediante adición de sustancias activadoras de protrombina, por ejemplo a base del veneno de serpientes de Echis carinatus.

25. Procedimiento según la reivindicación 1, según el cual la degradación del factor V activado de la muestra se efectúa por adición de una enzima proteolítica de origen humano o animal.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que la degradación del factor V activado se efectúa por proteína C humana.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que la proteína C humana se añade ya en forma activada a la tanda de ensayos, preferentemente en una concentración - referido a la tanda de ensayos - de 0,02-1 U/ml, de modo especialmente preferido de 0,05-0,15 U/ml.

28. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 2 y 26, en el que la proteína C humana se añade en forma no activada, o la proteína C en el plasma deficitario en factor V se activa solo en la tanda de ensayos.

29. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 1 y 28, según el cual una enzima activadora de la proteína C está contenida en al menos uno de los reactivos, que entra en contacto con la muestra y la proteína C humana no activada, y activa a ésta.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que preferentemente para la activación de la proteína C se emplean enzimas procedentes del veneno de serpientes del género Agkistrodon.

31. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la determinación de la actividad residual del factor Va en la tanda de ensayos se efectúa mediante la determinación de la activación de protrombina para dar trombina.

32. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 1 y 31, en el que la determinación de la actividad de trombina se efectúa por determinación de la reacción de fibrinógeno con ayuda de procedimientos mecánicos, ópticos u opto-mecánicos, y el fibrinógeno procede preferentemente de la muestra, pero de modo especialmente preferido del reactivo con el que se mezcla la muestra.

33. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que la determinación de la actividad de trombina se efectúa por determinación de la reacción de un sustrato cromógeno específico de trombina mediante detección óptica.

34. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 1, 12-17 y 31, en el que la escisión de protrombina se efectúa por un activador de protrombina estimulable por el factor Va.

35. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que los activadores de protrombina empleados pueden ser de origen humano y no humano.

36. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que como activador humano de protrombina se utiliza el factor X.

37. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que como activadores no humanos de protrombina se utilizan los procedentes del ganado bovino.

38. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las etapas citadas en la reivindicación 1 pueden estar interrumpidas por períodos para la incubación de las mezclas resultantes, o pueden aparecer fases de incubación dentro de las etapas.

39. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que, por combinación de los reactivos, la muestra entra en contacto con sólo pocos, preferentemente con sólo 2 reactivos, de modo especialmente preferido con sólo 1 reactivo que contiene todos los componentes necesarios.

40. Procedimiento según la reivindicación 35, en el que como activadores no humanos de protrombina se utilizan los procedentes de veneno de serpientes, preferentemente del veneno de Notechis scutatus scutatus.

41. Procedimiento según las reivindicaciones 3 a 7, en el que el plasma deficitario en factor V, preparado según estos procedimientos, contiene factor VIII en concentraciones entre 0,7 y 1,3 U/ml, o se sustituye por adición de factor VIII purificado a estas concentraciones.

42. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que en los reactivos está contenido factor VIII, cuya concentración, después de su mezcladura con la muestra, está en el intervalo de 0,01 a 2 unidades/ml, preferentemente en el intervalo de concentraciones de 0,7 a 1,3 U/ml, estando definida 1 unidad como la cantidad funcional que está presente en 1 ml de plasma humano normal.

43. Procedimiento para la detección cualitativa y para la determinación cuantitativa de la estabilidad del factor V de coagulación activado frente a la degradación proteolítica en una muestra de un líquido biológico, que comprende las siguientes etapas:

a): mezcla de la muestra con un reactivo A, cuyo contenido en factor V capaz de funcionar frente a plasma humano normal está disminuido,

ascendiendo la proporción del volumen de la muestra en el volumen total del ensayo al 20% como máximo, pero preferentemente al 10% o menos, y en el que la activación del factor V de la muestra se efectúa directamente mediante adición de activadores del factor V a base de veneno de serpientes, de modo especialmente preferido el activador de factor V a base del veneno de Vipera russellii.

44. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que en el caso del reactivo A se trata de plasma deficitario en factor V de origen humano o animal.

45. Procedimiento según una de las reivindicaciones 43 y 44, en el que la degradación del factor V activado se efectúa por proteína C humana, que se añade a la tanda de ensayo en forma ya activada.

46. Procedimiento según una de las reivindicaciones 43 y 44, en el que la proteína C humana se añade en forma no activada.