HU230404B1 - Hígításon alapuló gátlóhatást mérő módszer - Google Patents
Hígításon alapuló gátlóhatást mérő módszer Download PDFInfo
- Publication number
- HU230404B1 HU230404B1 HU1200299A HUP1200299A HU230404B1 HU 230404 B1 HU230404 B1 HU 230404B1 HU 1200299 A HU1200299 A HU 1200299A HU P1200299 A HUP1200299 A HU P1200299A HU 230404 B1 HU230404 B1 HU 230404B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ace
- enzyme
- inhibition
- dilution
- activity
- Prior art date
Links
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title claims abstract description 87
- 238000010790 dilution Methods 0.000 title claims description 90
- 239000012895 dilution Substances 0.000 title claims description 90
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 64
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000006965 reversible inhibition Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 151
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 44
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 27
- 239000005541 ACE inhibitor Substances 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 claims description 6
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 claims description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 claims 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 claims 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 claims 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 38
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 31
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 7
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 7
- 101150100998 Ace gene Proteins 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 101710185050 Angiotensin-converting enzyme Proteins 0.000 description 4
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001631 hypertensive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000028185 Angioedema Diseases 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000773743 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 description 2
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N captopril Chemical compound SC[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 2
- 229960000830 captopril Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000056252 human ACE Human genes 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000000899 pressurised-fluid extraction Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- XKBCNTPVQJGJPY-CMDGGOBGSA-N (e)-non-1-en-1-ol Chemical compound CCCCCCC\C=C\O XKBCNTPVQJGJPY-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 1
- ZDLZKMDMBBMJLI-FDMDGMSGSA-N 2-[[2-[[(2s)-2-[[(e)-3-(furan-2-yl)prop-2-enoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)NCC(=O)O)NC(=O)\C=C\C=1OC=CC=1)C1=CC=CC=C1 ZDLZKMDMBBMJLI-FDMDGMSGSA-N 0.000 description 1
- ZNQVEEAIQZEUHB-UHFFFAOYSA-N 2-ethoxyethanol Chemical compound CCOCCO ZNQVEEAIQZEUHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048632 2-furanacryloyl-phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XMTCKNXTTXDPJX-UHFFFAOYSA-N 3-oxoalanine Chemical compound O=CC(N)C(O)=O XMTCKNXTTXDPJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZRCFAOMWRAFIC-UHFFFAOYSA-N 5-(tetradecyloxy)-2-furoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCOC1=CC=C(C(O)=O)O1 CZRCFAOMWRAFIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001290610 Abildgaardia Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 102100034599 Angiopoietin-related protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 102100030802 Beta-2-glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710180007 Beta-2-glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 240000007311 Commiphora myrrha Species 0.000 description 1
- 235000006965 Commiphora myrrha Nutrition 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241000283715 Damaliscus lunatus Species 0.000 description 1
- 244000309456 Decussocarpus nagi Species 0.000 description 1
- 235000008375 Decussocarpus nagi Nutrition 0.000 description 1
- 101100162296 Dictyostelium discoideum ahsa gene Proteins 0.000 description 1
- 206010013710 Drug interaction Diseases 0.000 description 1
- 108700039964 Duplicate Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001658031 Eris Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010019909 Hernia Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000019738 Limestone Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241001417534 Lutjanidae Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101100465000 Mus musculus Prag1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001116436 Mus musculus Xaa-Pro dipeptidase Proteins 0.000 description 1
- 235000007265 Myrrhis odorata Nutrition 0.000 description 1
- 241000819999 Nymphes Species 0.000 description 1
- WXOMTJVVIMOXJL-BOBFKVMVSA-A O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)OS(=O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O[C@]2(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]2OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]1OS(=O)(=O)O[Al](O)O Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)OS(=O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O[C@]2(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]2OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]1OS(=O)(=O)O[Al](O)O WXOMTJVVIMOXJL-BOBFKVMVSA-A 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004005 Prostaglandin-endoperoxide synthases Human genes 0.000 description 1
- 108090000459 Prostaglandin-endoperoxide synthases Proteins 0.000 description 1
- 208000035755 Psychosomatic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 108091007187 Reductases Proteins 0.000 description 1
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100033740 Tenomodulin Human genes 0.000 description 1
- 101710114852 Tenomodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 208000033774 Ventricular Remodeling Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000385223 Villosa iris Species 0.000 description 1
- 241000272195 Vultur Species 0.000 description 1
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 1
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002546 agglutinic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 108010074902 angiotensin converting enzyme secretase Proteins 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 229940127088 antihypertensive drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 230000004531 blood pressure lowering effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001808 coupling effect Effects 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000021185 dessert Nutrition 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002309 gasification Methods 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000937 inactivator Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000037 inhalation toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000004020 intracellular membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000007775 late Effects 0.000 description 1
- 238000000707 layer-by-layer assembly Methods 0.000 description 1
- 239000006028 limestone Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000004963 pathophysiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229910021420 polycrystalline silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920005591 polysilicon Polymers 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- HDACQVRGBOVJII-JBDAPHQKSA-N ramipril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](C[C@@H]2CCC[C@@H]21)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HDACQVRGBOVJII-JBDAPHQKSA-N 0.000 description 1
- 229960003401 ramipril Drugs 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 1
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
A TALÁLMÁNY ALKALM AZÁSI TERÜLETE
A találmány tárgya eljárás enzim egy gátlószere által léföebozott reverzibilis gátlóhatás tnénékéisek megállapítására, kőlönös tekintette! gyógyszeres: kezelés ImiékoByságának megállapítására. Egy különöseit előnyös megvalósítási isőá szerint egy véroyomé scfökkentő eve zíbills enömgádó gyógyszer hatékonyságát vizsgáltuk. Különösen előnyösen, a módszert a? x>etote*t'»t kenurta/ enzm (ACE) gátló (AÍ'Eij terápiában teszteltük. A találmány tárgyát képezik: enzim s. uM/tmíok, x.t η η n keketek (kitek í alkalmazása a gátlóltatás tnénékéaek megállapítására csakúgy, mint egy kw. mes, rueL a mteitans bán leírt eljárásban
A TECHNIK A ÁLLÁSA
Az: enzlmgátlo kezelés hníékortyságának vagy hatásosságának megállapításának problémája nyitván· valóan fölmerült már korábban. Ezen módszerekben mindenekelőtt ki kell alakítani egy olyan kísérleti elrendezést, tmiybea jellemzően a kezelt beteg estzimakíivitását hasonlítjuk egy egészséges kontroli csoport „őormái” aktivitási szmtjébsz, vagy egy olyan kontroli csoportéhoz, melyben a. kezelés hatásos. Ez a hagyóntásryes módszer azonban: számos problémát fölvet. Például, hogy kontroli csoportra van szükség, mely csoportban szakségszertíea különböző parofinológíaí jegyek fordulnak elő (példáit! nem ugyanabban a betegségben szenvednek): és egyéni különbségeket mn; nílusinak.
A betegek hozzáállása a másik olyan probléma, ami gyakran felszinre Lem 1 Knk-nesen. amikor sokszor kell mintát gyűjtenünk, hogy kóveföt födjük egy kezelés hatását. Mindezen knanaimak ellenére sok beteg nem hajlandó arra, hogy rendszeresen fölkeresse orvénál, ami különöseit meghlzhatatianná teszi az értékelést.
Sőt, a közvetlen aktivűásmérésí befolyásolják oiyan egyéni tulajdonságok, mitft a genetikai variabilitás. Ez azonban nem jelzi a gátló: terápia, hatékonyságát és aem is feltétlenül fiigg össze vele (8. ábra).
Egy másik módszer, amellyel monlternstű tedjttk egy enzimkezeiés hatékonyságát., az inhibitor jelenlétének meghatározása egy adott vagy a nyert testfoiyadékban. Míg azonban ez a kísérletsorozat a gyógyszer vérsamtjét követi nyomon, nem képes a gyógyszer szervezeten beiül kifejtett aktuális hatásának követésére. További problémát: jelent az előzetes tisztítás, hogy az inhibitor mennyire för hozzá az enzimhez valamink hogy az alkalmazott analitikai módszerek időigényesek ős drágák.
Hasonló problémákkal szembesülhetünk, arsukss· egy eszimgáílö bnékonyságát stkatjitk fölmérni. Számos próbálkozás törtéig már ezeknek, és hasonló ptobíémákssk a megoldására.
Az HS211Ö40Ó8I957A1 számó közzétételi jratbtm a HÍV proíeáz-inmbhor tnennylségét mérték egy konjugátnnnnai alkotott komplexében. A módszer a konjagált inhibitor és a mérni kívánt inhibitor vetsengéséu alapult.
A WÜ2OÖ1O85985AI szátnu közzétételi iratban egymással átfedésben lévő sznhsztrát speciflchású uotn.ek átdobásai szettek kelőt hóm hiztteu mntakföm Ezen megold vtean a testpia hatók omvu ugyan megítélhető, de ehhez számos, a betegektől különböző időben nyert mintára vasi szükség, 'Míg »2 USÓÖ9Ő570A számú szabadalomban egy reagens higítósdt alkalmazták, ahhoz egy potenciálisan hibás mtdekulás és egy hatékonyai adtak, amely kofoktorként kapcsolódott az enzimhez hogy lefödje a genetikai hibát,
A WO2ÖÖ5Ö25561AÍ számú közzétételt iratban a vér-plazma konesförádő arányát, valamint plazmaföhétje-köíődés mértékének arányát merték egy Időben különböző hígítása vérmintákon, .A tnődszer
1CVO0L142ISG azonban renglehetősen összeíelt és ágy tótok, hogy nem egy speetftkos enzire-inhibltor párt vizsgáltok,
A PCI u 820814)45643 szántó -szabadáfaá hejeletóesbe®. az ACE-gátiás tsértékö®ek tsegitatározasát írtak te, valamint a gátlás mértéke és ttz, angmoedeösa jelentkezése kozd összefüggést, Ex a módszer eltér-a tslálnrányutrk szerint használt, egyszerit hígításon alapáSö mérési átefödíteól
Az £88272:8285 számít szábaóalőmfean leírták, hogy az mmbiferOk jtóesiétét: n-ítóőperexidáz-aktivitás segítségévei fete kimutatni. Ez a módszer nem hozható összefüggésbe a ictea találmánnyal
K.. Sandy Pang, A. öavtd Rodrignes és Rtóxaund M. Peter által szerkesztek „Enzyree attd iransporter ' -no dne ig nte M ons víu kon\ «‘nncet \ude Neu V t. 2Λ1ό 14u\ v”8 ' 44 o igxo 5 188. oldal ) az enzim-inhibitor kapcsolat jellemzését szolgáló módszert, vatelint az -.mhihíciós állandó meghatározás? írja le. lít azonban az mhtbuorok adtak a utökróm P4S0-hez. voltak adva és jelletn&zíók a kötődésüket. A módszert nem alkalmazták az inhibitor szintjének meghatározására vagy a gátlás hat é k o -5 y sjj gáuak mérésére,
A hagyományos, hígításon alapuló etrzlregátiás ineghaíárezásá? lehetővé tevő módszereknél csak az inhibitor kaacentráclója 'változik, az irt ismerteid módszerbe® azonos® mind az inhibitor, mind az enzim, konmtóációját hígítják.
Tehát: továbbra is szükség van egy gyors és megbízható ®tódszerre, nmeilyel íneghmtóozhatö egy enzim reverzibilis gátlásának mértéke,
A lALAi.MANY RÖVID LEÍRÁSA
A salábrtány egy enzim inhibitor általi reverzibilis gátióhstás mértékének reeghntározására alkalmas eljárás, amely eljárás magában tégla!ja a következőket:
(a): legalább egy kiindulást minta biztoüitásák (hl legalább hét aligöot kivételéi az említett legalább egy kiindulási mintából;
(e) olyan reakciőelégyek készítését, amelyek tartalmazzák az alRjnotokaf és kívánt esetbe® ezen aíiqwtok különböző hígítás! toksorokkal történő hígítása érdekében reás alkotókat is tarts! oroznák, Ily -módon biztosítva, hogy ezen reakdódegyekben különböző arányba® fordul elő az enzim aktív és gátólt formája, amennyiben az inhibitor leien van;
(cl) az etnliteít enzim akiivlfásttonk mérését a reaketóelegyekben, hogy mért ákthűtásértékstet nyerjünk;
(el a mért akii vitás értékek megszorzását a megfelelő daliás! faktorokkal a számított ettzimaktivitás-értékek ítmghatároz&sa érdekében;
(1) .s legalább egy kiindulási Klímában a reverzibilis en2smgátíás mértékének .megállapítása, ahol: a számított etemáktívítás-értékek ö^zeSiggési mutatnak (korrelálnak> a reverzibilis gátló» mértékével.
Előnyösen az enzim jelen van a reakció elegybe®. Egy előnyős megvalósítási mód szerint az enzim jelen van az emlhetl legalább egy kiindulási mintában. További előnyős megvalósítási mód szerint az enzimet. a minták bármelyikéhez, előnyösen az említett reakció elegyhez adjuk további alkotórészként Egy -előnyős megvalósítási re.öá szerint izolált enzimet, vagy előnyösebb esetben tisztítót? vagy rekombínáns enzimet adunk.
Egy előnyös megvalósítást módban az említett legalább egy kiindulást minta egyetlen minta. 'További előnyös: megvalósítási snődokhah -az említett: legalább egy kiíntfokisí minta egyetlen forrósból, -például; betegtől származik: vagy tormészotes keverékből vagy mesterséges keverékből: származik, példás! egy keverékfeők amely egy ipart eljárásból, vagy aorták sorén jött létre, Szákeutóer belátja, hogy kés vagy több kiindulási minta is vehető ugyanabból az egy íórtástői, előnyösen egy időpontban:. Előnyösen kettő vagy több, kiindulási mintát
1888Ö2-4423/SG nyerünk vagy veszssk, amelyek .ugyanaz·», vagy lényegében ngyaoazön alkotőkhől állnak.
Egy preferált megvalősitási módba» a legalább egy kiindulási mmüt egy biológiai minta. amely egy biológiai szervezettől nyer; mírt-a. vagy egy biológia! niintábói származik. Egy különösen preferált oregvalósitásí subába» az «orittett legalább egy kitodoiási minta vér, vagy abból származik. Előnyösen a biológiai: minta nyerhető élőlénytők Ez az élőlény előnyösen egy állat, előnyösebben- gerinces, még előnyösebb» emlős, nagyon előnyösen emberi személy.
Egy további megvalósítási mód során az említett legalább egy knadölás; mima mikroöxganzmtasok. közresníiködésévöl keletkezik. Mikroorganizmusok köze értendő bármely prökarióíá- vagy enkarióts sejtkaltóra.
'Előnyösen a legalább egy kiindulás; mintái olya» eljárásból «verjük, amely az említett Iabibitor ttsc(ís’gvk e e'tte<íc!a\zna ne\
Előnyösen az eljárást gyógyszeres terápia hatékonyságának megállapítására végezzük el.
Egy nagyon előnyös megvalósítási tnöáa a találmánynak az, amikor az enzim az angiotenzin-konwríáz enzim: (ACF). es az említett inhibitor sz ACE egy gádószere (ACE1).
Elönjosto :a hfeításí faktorokat ágy állítjuk be. hogy azok statisztikailag. jelentős különbségeket cíeemerye/reí. a ^untfoft c’v mrkíitü is etükökben, Jemotoa iegaí.é'ő sauy o ereoseoKm.
legalább lő-szeres vagy magasabb számáért enzimaktivítás-éttékeket eredményezzenek, amikor a magas higüási faktorok mellett meghatározót) számított «azimaktivitás-értékeket ősszebasotdítjnk sz alacsony hígítást faktor mellett kapott számított eezuaaknvüás-értékkei, amennyiben az említett'. iabibitor jelen van az emlitott reakeióelegyben. Előnyősén az említett hígitásí faktorokat előre meghatározott inhibitor koncentráció alapján batátozzttk meg. ;a legalább egy kiindulási minta esetén, és az inhibitor és az enzim előre meghatározott dózishatása alapján, Előnyösen a higóási faktorokat számítással határozzuk meg. már ismert vagy korábban meghatározott paraméterek, például: inhibitor disssoeiáeiős- vagy gátlás! állandója, vagy a reakció sebességi állandója alapján. Egy további előnyös megvalósítási módban a higitási fáktorok. meghatározása kísérletesen tortémk azáltal, hogy & találmányban leír; eljárásban, különböző hígítás! laktatókat alksimszank. Előnyösen a hígítás; faktorok meghatározására azelőtt történik, mielőtt egy kiindulás; minta reverzibilis gátlás; szintjének becslésére a találmánynak megfelelően sor kerül,
A. találmány tárgyát képezi továbbá egy enzim szobsztrátjáttak valamint adott esetben további tsagemek alkalmazása annak érdekében, hagy megáhapttsttk az sazte reverzibilis gátlásának menőkét az említett ínimábái.,
A. találmány tárgyát képezi izolált enzim alkalmazása is a találmány szerinti eljárásban» toiáital megállapítjuk. az enzim reverzibilis gátlásának mértékét egy miattiban. Előnyőse» az izolált enzim tisztított vagy rekombinöns. Nagyon előnyösen a szubszttátolkoin kívül további reagenseket, vagy tovább; alkotórészeket is .alkalmazunk, vagy kiegészítésképpen ísusználask enzim aktivitás mérésére a találmány szerinti eljárásba».
A találmány tárgyát képezi készülék (műszer) enzim reverzibilis gátlása mértékének meghatározására inhibitorról & találmány szerint meghatározott irakion, ahol a készülék tartalmaz:
- eszközt arra, hogy ibgaöjon, vagy létrehozzon legalább két abqnotot a legalább egy kiindulási mintából;
eszközt arra, hogy további alkotó; északét adton az ahguotokhoz: a reakció elegyek létrehozása erdőkébe»;:
- .eszközt a reakció elegyek különböző hígítást < altos okkal: tdrtéső hlgíiására;
- eszközt az -említett reakcióeiegyocr; ívta enzim aktivitásának mérésére. méri. aktivitás értékek, nyerése érdekében;
109902-1421/40
- eszközt arra, hogy megállapítsak a reverzibilis gátlás mértekét a legalább egy klfodnlási raiaía esetében azáhal, hogy ísegszornzzuk a mért aktivitás értékekei: a megfelelő blgltási íákforekkal azért, hogy számítolt euzinr aktivitásokat kapjunk. Ennek során a számított enzim aktivitások közötti knlönlrség arányos a reverzibilis gátlóhasas mértékével.
A találmány tárgyát képezi készletek alkalmazása a találmány s στ» e!· a'-bán az enzim reverzibilis gátlást röértékésrek meghatározására, amely készletek tartalmazzák:
- a leírásban meglíatározötí kéáznlékeí
- az enzim szubszirásját
- adott esetben az említett enzimet egy Izolált tormában
- adott esetben az említeti enzim egy inhibitorát
- adott esetben egy hígító puffert
OkfeNíClÓK
A leírásban egyes számban használt névelők, az: „egy” és a szövegkörnyezettől függő módon az „ti, az” névelők a többes számot is magukban foglalják, hacsak ? .vöt egkörme mi e/J ki néni /ár;?,.
A.z „izolált” sző jelentése az „ember keze alfa! médosro a a természen-s állapotból. Ha egy ravlekttla vagy anyag eiőfordni a természetben, az akkor „ízoiáh”, ha ínegválttvík és'?.e\ ehóvolhásia kérni a/ eredeti környezetéből.
A „magában foglal vagy „magában foglaló, vagy „tartalmaz” .szavaka; oly módon keli értem a leírásban, hogy ezen; szavak jelentése nesn teljes körű, azaz kimeritek tehát a felsorolt tulajdonságokon, metodikai lépéseken vagy komponenseken iúl további tulajdonságok, metodikai lépések, illetve komponensek is •éten lehelitek.
Azon kifejezés, hogy „lényegében a kővetkezőkből: áll vagy „lényegében tartalmaz” úgy értelmezendő, hegy ezen tulajdonságok,, vagy metodikai lépések, vagy komponensek elengedhetetlenek, de további íuiajdossógok, vagy metodikai lépések, vagy komponensek is mogengödbetÖek, amelyek: nem érintik jelentősen az alkalmazás, eljárás, összetétel vagy további fontos tulajdonságok alapvető jeltem/öa 'F'etVos: megérteni, hogy ebben az esetben a „magában foglal” vagy „inasában foglaló”' vagy a: \ates;bo! álló kifejezések helyettesíihetöek a „lényegében a következőkből áll” vagy· „lényegében tartalmaz' mtejezo^ckkek ha szükséges, tovább i tények említése nélköi,
Azok a kifejezések, hogy „egyebeit rbrrás”, vagy hogy· „minták egyetlen forrásból” ágy értendőek, hrsgy létezik, vagy létezett egy olyan elegy, amelyből a minták származnak/származtak (azokból vették azokat), vagy ezek a minták az említett elegyhől szfemaznuk: olymódom hogy ebből lettek készítve, vagy oyorve, előm,ö<c« lényegében ugyanakkor. Előnyösen ezen egyetlen forrásból származó minták összetétele lém egeken megegyezik.
A kifejezés, hogy „lényegében ngyanakkor” ágy értendő, hogy időben kellően közel ahhoz, hogy az egyedien forrás összetétele lényegében nem változott, tehát lényegében megegyezett a mintavételek során.
A kifejezés, hogy két minta „lényegében megegyező: összetétele” (például ha. lsét mintavétel történt ugyanazon összetételű anyagból különböző időpontokban) azt jelenti, hogy minták összetétele kellően megegyezik ahhoz» hogy a két miméből megbízhatóan összehasonlítható eredményeket lehessen nyerni a mérések során.
109903-!.423éSG
V \3R\kB>)vU) Íiíi'VA t Ábra - Csptoprti dózis-hatása a barnán számum augiöfenzhií-konverfáló enzim aktivitására
Emelkedő Captuprií-kuseestráelök: nemlineáris módon gátolták a humán szérum ACE aktivitását. Az wxísn gátlására irányuló terápia eélía (akárcsak ACE gátié eítpteprsl esetés} az: enzim minél nagyobb mértékű gátlása, .Az enzimgá; ló gyógyszerek dózisainak: azonban határt szab a rseilékbatásuk számának növekedése. Ezért a klinikai gyakorlatban alkalmazott inhibitor ksmoenírácle (ami: a. konkrét esetben ez ACE-gátíó) leginkább a szahniaxíniáEs deztstartöntsnyban van (ábrán átmeneti hatáském jelölve}. Étre a tartományra jellemző, hogy kis változások az ájhíbítotkoítcentrációban nagy különbségekhez vezethetnek az aktuális gátió hatásban. Az ábrás bemuíatutí ACE gátlás; mértéke öktó-tól 30%-ra csökken, ba a csptopríl koncentráció 30 tiM-sóí 3 ttM-ra váhoAk (lő-szeres hígítás),
2. Ábra - Hígítás hatása a gátolt rehönsbíuáns .ACE aktivitására
Rekembítums ACE-hoz adtuk: az ACE gátló captopsált: (8,1, id és 100 nM, a köneenírációk az ábrán jelölve},, maid. az ACE aktivitás veit .mérve & hígítadan (1 szeres) és a hígított (maximum ló-szoros hígítás) mintában. A hígításnak csak kismértékű hatása volt az zW£ aktivitásra ha a kiindulási gátlóhatás alacsony volt (pl. 8,1 nM-nálj, Ezzel szemben: jelentős ÁCS aktivitás.emelkedést· detektáltunk: hígítás hatására a khmkaíktg is releváns capíoprii koncentráció mellett: (lő nMk Végül, nagyobb eaptopnl koncentráció (100 sM) mellett csak na g\ eb? mértékű t pl :b-»zores) cselén láttunk jelentés emelkedést az ACE aktivitásban,
3, ábra - A szérűim blgdásúnak elméleti hatása a eapíopriikd gátolt humán ACE-re
Az 1, egyenlet a reverzibilis enzim-gátlás általános modelljét hja le, ahol az aktuális enzim aktívum a reakció elegyben alkaittiazo-t hunt iv fikturól függ Az enzim t-knmtás értékeket i-512-szeres hígítás mellen szsntitottük ki O-ibÖb nXEcapíop ti sortéi nációkat feltételezve (az ábrán különböző szimbólumokká.! jelölve), 2 «zérum \CE koncentrációt a 10 a w t ennósteh adatok alapján becsültük, A pontúk illesztése az 1. egyenlet a,amur mrtest Az ábra azt mulatja, hogy az enzim aktivitás növekedése ahígkási faktortól (ügg, amit az enzimmhtbstor interakció előre tneghatározob (vagy Ismeri) tulajdonságaiból (pl.; Ki, kooperativitási faktor) előre meg lehet határozni. Aduit esetben a gátlóhatás becsülhető, ha összehasonlítjuk egymással az alacsony (ekkor az enzim irklmor kötött formában van) és magas tekkor az: enzim leginkább szabad, aktív állapotban vsa) higitásr faktoruk esetén mért enzim aktivitás értékeket. A gátlás mértéke akkor határozható meg, amikor az alacsony iiighási. fákforon meghatározott enzim aktivitás a magas hígítás esetied moghstártízetr értekkel kerül összehasonlításra,
4< ábra - Számított szérum ACE-gátlás hipertóniás betegek esetén
A találmányban leírt óbárás alkalmazhatóságát az aagíuteozm konvertáló enzim, és ezen enzim gátiószerelvel kezeit betegek esetén matattak be. A szérum ACE aktivhását véonintákből mértük. Magas vérnyomásban szenvedő betegeket vontunk be, Bizonyos betegek szedtek: ACE-gáílát ·(+ ..ACE gáiló-ként jelölve), míg: másoknak ez: a gyógyszer nem volt folmva (ábrán kontrollként jelölve). A s:-cr’!-ék-mn!· ·$«?Wtott ACE gátlás mértékét matatják az egyes betegek szintiéit ACE gátló terápia mellett, vág; m lkak Am írv'O \ szimbólumok, a meghatározások átlagát és a sztenderd szórást tttulagák, Látható, hogy néhány betegnek az ACE-gáilóval kezeit csoportban hasonló ACE aktivitás értéket: vékák, mim a kezeletlen, kontroll csoportban lévőknek, de az szintén nyilvánvaló, hogy a kezek betegek többségébe» alaesunyáhb enzim akta -ta;· értekek \ oltak mérhetők.
5, ábra - Különböző mértékű szérum ACE gátlás a belegekbeíí
Amikor a betegek ACE gátlásának mértékét becsültük meg a taláhnányban lein módszer szerint egy i89k02-i423/SC meglepő tényre derüli fény. A kezeletlen, ACE gátlói nem szedő betegek esetén jelentős ikb, 7S%~os) ACE g.r av •'vihető elerstg <g> cndorm \Cí ga So efen»etec A’t \fesfes. \\ v AhE gafk-vJ ss\el.
betegek jellemzően sokkal magasabb ACE gátlással mndelkeztek, Az adatok gyakorisúg^atezláskáat thisztograni) vannak ábrázolva. Az egyenes egy olyan választott, hipotetikus értéket jelöl (ÜÖAfe, amely felett az Vtl· j,at'o temp', fejteken, ó, ábra - A hígítás®» módszerrel meghatározod: ACE gátlás mértéke arányos a kezelés klinikai célpontjás ai Isértsj om&ssal)
Az ACE gátlás ínórtékésak becslése a találmányban leírták szerint történt. 4-szeresére és Aöü-szorosára hígítóit szénást minták ACE aktivitását határoztok meg, valamint megmértük a betegek vérnyomását. A látszólagos ACE gátlás mértékét a 4öÖ-szoros és 4-szeres aktivitás értekek hányadosaként számoltuk. A betegek artériás közép vérnyomás értékeit matatja az ábra 9tEb alatti (n^őé). «s feletti :(sr3 18} ACE-gátlás esetén. Az oszlopok az értekek átlagát és a sztemlerd hibát mutatják, a csillagok a jelentős különbséget jelzik a két csoport között (p“to,Ö93), Elégtelen. ÁCE-gátlásó betegeknél magasabb artériás kőzépvémyosnás értéket ntorhettünk, and arra atal, hogy a találmány hatékersytm alkalmazható egy enzim gátlásra Irányuló, reverzibilis Inhibitorral: végzett kezelés klinikai Itafesonyságárísk becslésére,
7, ábra l'vopén AC1> aktfertás emelkedése ts szértim hígításával
A találmányban leírt eljárás azl sugallja, hogy a szükséges hígítás! faktort meghatározhatjuk, ha számításba vesszük a korábban meghatározott Ki értéket és az inhibitor dózis-hatás összefüggését a vizsgált enzimen. Exogén ACE aktivitást mértünk azért, hogy megállapitsuk egy ACE-gátlÓí szedő beteg szérum rnhríájában az ACE-gátlás mértékéi. Három mérési eredmény; szemléltet az: ábra íátlagAKD). Az eredmények: azt mutatják» hogy a gátolt ACE aktivitás jelentősen növekszik hígítás hatására. Különösen, ha figyelembe vesszük, hogy a higü&tlan mírua ACE aktivitása 1 AV mí-ről több mint 1ŐÖ ACCml-re nőtt magas hígítás Itatására (128-szoros).
8, ábra - Olősrbőző koncepciók nz enzim aktivitás meghatározásában
Egy enzlro'-gáílö terápia hatékonyságának meghatározása hagyományos módon azon alapszák, hogy egy kezelt csoport enzim akovitását feltol gátlás várható) összehasonlítjuk egy kontroll csoportéval, ahol gátlás nem várható Ezt kővetőét! egy referencia tartományt határozzuk meg a kontroll csoport: enzim aktivitás értékeiből, és az cszim aktivitásokat ezen. referencia tarícntámiya! vetjük össze. A kezeletlen betegek értékei, azonban k Ί>κfe'z K- uc\ az adott befegsvgber s^rtedoktol \ alanon; a' adott erztn .Atsssfsvi e- ta'so/l :t s txtcg»eg előrehaladása során. Jelen vizsgálatban két hipertóniás betegekből álló csoport kezelését hasonlítottuk össze, ahol a kontroll csoportba, azok a betegek tartoztak, akik ACE-gáflö felírásában nem részesültek (ISA beteg), míg azon betegek, akiknek felírtak ACE-gátióf, a kezelt csoportba kerültek 1.587 beteg). Szembetűnő, hogy jelentős (mintegy· négyszeres) varjaséra vas a kezeletlen, ketbíöll csoport ACE aktivitás értékeiben, továbbá 20%: körük átfedés látható a két csoport értékei közön. Ez nagymértékben bizonytafeorsá teszi annak eldöntését, hogy a. betegnek viszonylag magas ACE aktivitása vas sikeres A.CE gátló kezeléssel, vagy a betegnek elégtelen az ACE gátló kezelése,
9, ábra - A leírt találmány klinikai hatékonyságának cllesőt'zése
Kapcsolatba léptünk azokkal a betegekkel, akiknek ACE-gátlása nem érte öl a 90%-os értéket találmányban leírt módszerrel történő egyetlen mintából végzett meghatározás során. Az érintett betegeket megkértük arra, hogy fordítsanak kellő ügyeimet a gyógyszeres .kezelésükre, különös tekintettel a felírt: ACE
IV04o2-!4 25 Kfe gátló megfelelő szedésére, és jégenex \-ssza egy további vizsgáiddá. Néhány esetbe». a. betegek, enzim gátlása meghaladta a 90%-os értéket a nmodA MAgaU során. Erős összefüggés volt a betegek vérnyomásértéke és a gyógyszeres tetet bfetesAg wghatarotM. hatékonysága között. Különösen érdekes, hogy a betegeknek •aíaewnyubb a vérnyomása volt abban aa esetben, ha az: ÁÜE-gáílás mértéke meghaladta a. 99%~os értéket összehasonlitva a 90% aUtd gátlás esetért mért vérrtyontás értékekkel. Az ábrán átlag értékek vannak mutatva <ádag*S£M),
19. ábra - Elkmímondás az ACE messysség és aktivitás között
A száram ACE areiumségsl ELEsA módszerrel, míg az aktivitást EAPGG hidrolízis atopján mértük ugyanazon minta esetében, Ezzel páthnzamosas a betegek genotípusa is meghatározásra került, A DD genotípusa betegeknek 58%-kai magasabb szérum ACE rseanyiségük volt, mint az II gemtípus&fatak, míg a szérum ACE aktivitását jelentősen kevésbé értette a genotípus.
ti. ábra ~ Endogén bhíblterra utaló jelek
Az ÁGI ínemrvdeg es akírtttas között megfigyelt következetlenség oka lehet a kismértékű ACE aktivitásbeit kui-onbvyek kimutat. mw nem alkalmas módszer is. Az ACE aktivitás meghatározáshoz egy mesterséges sz^bsetíaaí ti V\<A salamiat angioienzia Let, aa ACE íersnészefes szubsztrátjá; ítasznáityk. Szoros ősszsfiCgert rálátom». az kCl aktivitásban ezen szubsztrátok íélihaszaátása mellet·, ami a EAPöö-vel történő meghatározás alkalmassagai támasztja álé. A. kővetkezőkben a hígítás enzim aktivitására gyakorolt hatását vizsgáltuk. A terűm ACE aktivitás nem lineárisan, de nőtt a hígítás fokának növelésével, mely növekedés nem volt megfigyelhető rekotnbsuáas, tisztított éten szérumban előforduló komponensek nélküli hígítása sorát Ez a megfigyelés egy estleges ishihíter jelenlétére utal a sz.étmsbas,: összhangban a találmányban leír· igénypontokkal.
12. ábra - A terűm ACE endogén gátkíszerónek molekulatömege
Egészséges, kezeletlen önkéntesek szérum mintáit szűrtük le olyan szőrökön keresztül, melyek S9 kDa vagy 100 k.öa telető molekulatömegé fehérjék számára áíiárhaíaskmek voltak. Az 59kEto-os szűrővel végzett szűrésnek nem volt hatása. nn'g a 100 kDa-os szűrővel végzett szűrés jelentősen módosította a hígítás hatására bekövetkező enzim aktivitás változásait. Figyelemre méltó, hogy jelentősen magasabb aktivitás volt jelen a szűrt mimák ö-u· I pl í (10 ki'.ia-o$ szűrés s.
13, ábra - Szérum ACE gátlása terűm alfeussteal
Az 50 kEtenal több, de 19Ö kDa-nál kisebb meiékmatőmegge:l rendelkező- endogén Inhibitor azonosítására tért kísértek során bebizonyosodott a szérum ACE és szénát» alhmnin közötti köíesöKtaás. Elsőként a szérusn albumin rekombináiís ACE-ra gyakorolt hatása kerüli vizsgálatra. Növekvő kéncetorációban -a tanárt szérum albumin dőzisfnggÖ módón gátolta, a rekomblnáns ACE aktivitását, a Ki érték 9,6: mgfml-nem adódott. Figyelembe véve, hogy az albamm száram feoneoutráciő tartományg 49-99 mg/'ml, a fiziológiás szérum ACE-gázlás háttér ében állhat a szőrűm alhunhn jelenléte. Ezen hipotézis ellenérzés érdekében ACE volt tisztítva humán tes onM e» < zen vizsgáltok a humán száram albemin hatását Hwuáa szérum álommá hasonló módon gátolta a íis.huoít iCí. akuvlkísát, tatai ahogy azt a rekembinans ACE esetén tette. Végül azt a megfogalmazod találmányi igényt teszteltük, miszerint egy inhibitor jelenléte detektálható azáltal ;s, hogy az enzimet exegéaea adják a raaksió elegyhez. Sorozat hígításokat: készitettbok egy rekombináns ACE-t és hatná» szérum aibmnint tartalmazó mintából. Nagymértékű emelkedést tapasziáhunk a számított ACE aktivitásba» már kis hígítást tartományban fpi. 2-szeres és 8-szoros bigriásoai Is.
199992-1423/SG
A ÍAlALMANY RÉSZLETES LEÍRÁSA ?\ feltalálok fcídolgeásk egy gyors és egyszerű módszert arra, hegy ntegáíktprtsák egy enzím-gátldszer baíékostyságát egv megte. k« mintából. Jelen módszer szerbi a sneghaíározáshoz nem szükséges több mírtta beszerzése, vagy többszöri mhtíavéfet
Az enzim és iíddbhorók között! dőzte-hatás összeEiggést egy szigmoiá görifove! tehet je llemezni, mint az az 1. ábráfs látható. saját méréseink alapján. Az ábrán iáthajóak a legfontosabb enznn gátlást fázisok, melyek közül lényegesek a következők a taláhnány szempoütláhób a gátlás maximális telítési körülmények között Minden egyes enzim molekulához kötődik egy inhibitor molekula); .átmeneti mértékű gátlőhafás ügyelhető meg kisebb inbibiter koncentrációk mellen; nng « gádószer hatástalanná válik még kisebb koncentrációk mellett, tbelölyásolö hatásoktól mentes, maximális enzim aktivitás). A gyógyszerként használt inhibitorok klinikai hatása rendszerint átmeneti ntertékö, így a gátióhatás jelentős, de nem éri el t. x '0' gáfiőhstást.
A megfigyelés elméleti isáitete az, hogy a bármely reverzibilis i mmn^r-enzhn komplex stabilitása jellemezhető egy állandöval (KI), és a szabad enzim (E), a szabad mhibite? »Π v- az enzim-inhibitot komplex (El) kosesntrációla a kővetkezők xzerím: számítható { !. egyenlet):
Κί-α'ΊίΕΙ (!)
A gátolt enzim koncentrációjának aránya az ks.»« vn. lm koncentráeiöíáboz képest, ami az aktaálís gátlás mértékére (Inh) utak az alábbi egyenlet szerint 'mrmhaí > rá egyerief):
Ιοί) -:· Η <r ti) (és
Jelen találmány alapját az képezi, hogy elmek ideg lehetsegex megállapítani a mima maxitnális enzimaktivitását elégségesen, nagy kigilást: alkalmazva. Ilyen körülmények között (négy hígítás) az enzítn-mhihitor (El) komplex koneeahráciöjtt.eihanyagolhafő lehet a szabad enzim koscentraeióíáboz képest (Ei«E). Példaként tekintsünk egy reverzibilis enzimiubibitort: ha megmérjük agytmanaak a mintának az enzí inaktivitását legalább két higifáson, akkor a legtöorányebb minta megadja a gátolt enzim aktivitását (Eính). A magasabb higitásoti mért minta aktivitása íneglete- az oly-rn körülmények között mért aktivitásnak, mint atnikor az inhibitor d-xxxom.fi az eo/norol czalial -élteibe az enzim akin hasat, ama hahónk) xz mhfoitornemet· körülmények kozott mért xm.íairáoz (hasonlóan ahhoz, amikor a beteg nem veszi be az. előirt gyógyszert!. Ennek követle. met.vckcnl: a minta maximális enzimaktívüásn (Etnax, amikor E'-'-Eí) becsülhető a hígított koru.met.vek közi ^}5 ^!5ek alapúm ,.'jós, kenshncnx rá ko.vat a/ et ο n m ό u-sv t i os, o-^ \.ntt rn íbun van). Ak. enzimgátlás aktuális mértéke pedig Iánkkor El jelentős koncentrációban vas Jetem) a legkevésbé hígított: minta alapján becsülhető (ilyen körülmények között az enzim nagy része inhibitor kötött, gátolt formában van jelea).
A reverzibilis enzimgátlás mértéke tínb) egyetlen márnán beiül az alábbi egyenlet alapján becsülhető (T egyenlet):
inh Einh En-ax (fo
Jelem találmány egy alternatív módszert mutat be a reverzibilis enzimgátias mértékének meghatározására kísérletes mintákon. Nagy előnye a találmánynak, hogy közvetlen ük egyetlen mintából mérhető s reverzibilis eozimgafiás mértéke, nincs szükség arra, hogy a kap-vt credmérnt bármely más minta eredményével összehasonlítsak. A reverzibilis enzlmgádás mértékének közvetlen meghatározása kívánatos lehet, ha nincs megfelelő kontroll vagy egy bizonyos mintából szeretnénk pontos gátlás! értéket kapni. Ezek az alkalmazások magában foglalhatták egy eazlm gátlására irányaié gyógyszeres kezelés hatékonyságának ellenőrzését,
1Ö99í)2-1423(Sö fö-->\,o >s Vipivn i.ek vi íaj-nakoiog okig ,>?t >0 «•u/unek Vikinek ntríearck pl ang.etén. m keoscíta enzim, retn® Hl-V proteázok, olvadási foktérelí: só® feszfodteszterázok (pl. íwzfbdieszteróz-S, stb.), reduktázok (pl. dikidroibiáé reóuktáz, Bhdö-CoA redbksáz, szód, ctkiooxigenáz, moooammo oxidáz stb. A rxdvs kívánatos fokai a reverzibilis gátlószerek förmaiódéséoek követésére is. A módszer használható élé szervezetekből vagy körayezelben található fblyadékokbői történő toxikus anyagok jelen létének detektálására. Tág értelemben véve a taláhnányhas leírt módszer hártőely enzim-gáílószer párra alkalmazható, például, de korlátozás rtéíkül az alábbi enzimekre;:
Aidelhd-dehidrogesáz, Motmamino-oxidáz, Cikiooxigeaázok (COXk K-vltamía epexi rediföiáK, Aromáié® luamsterol-denrekiáz, Upoxigenázok, Tireoperomdáz, Axlotsrooia-ő’-^jadiHáz, InozhrraoaoföszBi-sttidmgeaáK, HMö-CoA reduk-áz, S-tesztoszföroo reduktáz, DífedrofoUt-íednktáZj Spuakmrednkíáz, 14-rednktáz, Xantin-oxidáz, 4-Mdf»xifomlpinivát-diexigenáz, RjKsoukleosíá-diszfoszfai-redoktáz, Protein. khíáz C, Bakteriális peptíáíHtanszfotáz, Kafököfoniia-ífömetiiomu/fotaz, RNS polimeráz;, Revesz: transzkrrptáz, DNS polimert®, CSABA trarazararaáz, Tirozia kinázok, öÍieinanmd-íiboH«kk;eiid-fernbb tmoszteráz, fószfoenöipiruvát-tmöszfortLZ, Barnát] eüoszólüeas elágazottláacö ammoiransxföíáz (kBCAE:), Astyartíl-prozeázok, Restre Asgioteazsö-konvertáló e tusra, Dlpeptidil pepitátok, Carbőxipepliíföz A, Humán enkefalnföz, 2őS proiessema, Eosztbáiészsaézok, Ghkozidázofo Lipázok, Cakmeurin, irtásitól poliibszlar ioszfetáz, .TOFA dekarbozíláz, Karbonsav aahldráz, Riszsidm-dokazboxliáz, Ora'ítia-dekarbaxááz, Aiasis raeemáz, DNS grtázok, Töpeizömezázök, b,7-®o®eráz, Dlhidropteoráoszistáz:, Timlálláé-szimáz, FosztoEuktokmáz, Hem-poiisneráz, Ö-Glükánsziísáz, Giiikozileeramid-sziüíáz.
Adod esetben a találmány elsődleges aWratosí területei a pepitátok és proteázok.
A találmány adott esetben alkalmazható: olyan: gátlószerek esetében, melyet enzimhez köthető betegségek késelésére használnak, vagy amelyet győgyszertelöltként azonosítottak az ilyen enzimbe.’ betegségben, rostos megjegyezni, hogy a találmányban leirt. módszer ne® csak a biológiai, mhttákba® (pl.; vét) dmható célpont aktuális gátlás- vagy akti válás mértékének mérésére alkalma hanem arrít Is használható lehet, 'mg'· megmérjük a vé-rben egy inltibítór gáílásl hatékonyságát olyas cclpvnt esetében, mely sejiszistéa tér ίκ ibdík (pb: dipeptídíl-peptidáz-4, tnertoamw-oxklázd
Az fentebb leírt elmélet azt sugallja, hogy a hígítás használható lehet egy reverzibilté entém-gáíló hatékosyságáiKík meghatározására, egyetlen sóskában függetlenül az aktuális enzim koneetürácmsulul és az enzim specifikus aktivitásától sth, A föltalálok s találmáayhan leirt módszert a rcmn-angiofcnztn-a dexzteaa rendszer kapcsán, mutatták be, ahol az angioteazm-konvertáló enzim gátló terápia hatékonyságát vizsgálták.
Aogkitsuzíö-konvertáíö enzim (ACE) egy eiak-metalioendodipeptidáz, amely az sngfoténziu 1 angloténzm 11-ve történő átalakulását katalizálja, valamit» reszt vesz egyéb peptldek métábóliztnusábaa, mint például: a braörkm® (Corvol P, Miektud A, Soubríer F, Willísrns TA. Recení advanees in teosvkdge of tlte sbuctnrs and foaeíion: of the angiosensín 1 com-erting euzyme. I Hypertens Suppí 1995; LfoS3-10.|. Az A€E-nek két tzoenzime vas, egy szosnatlkss- és egy teszhkuláris torma (klubért C et al., 1 Riói Ebem 199 i ;266:1537?k!.s. Az ACE szomatikus formáját az. ACE szekroíáz jtsttatja a keringésbe (Öpporsg SY et a!., Biöchem 1 1993 ;292 (' Pí 2):597-693.1. .Az ACF a remn-angjotetmin-aldoszferea rendszer („reom-rntgioiensls-aldosförono systeirt'b RAAS} része, amely egy fontos szabályozója a vérnyomásnak és a só-viz háztartásnak (PfoSérMAeí ah, N Engf J Med 1992;327:669-77.).
Az ACE-gátlO gyógyszerek az egyik legfeatákosyabb és. leggyakrabban alkalmazott terápiás modídáterai
199992- l-Efö.'SG
RA -\S-t»ak. .Az AL E-gatlők csökkentik .betegek ezreinek· ntortabtását kdíönbézó krtáiovasxteilüi'is betegségekben. bzasnos ianuhnanynak meglbfelőers az ACE-gátfok esökkeraik a kirtdiovaszkaláris halálozást, a a«f» halálos mmkardiáiis Infarktus vagy a szivmegállás valószínűségét stabil.koronám betegségben .(Pox Oí. Láncét 2003;562:782-S,), javítják a prognózist (öíSSl-3: írtai. I A® Col! Cardtol 1996:27:337-44.), csökkentik az 5 hetes ruortalilást míukarduilrt laiarkíns után (1S1S-4 írjál,. Láncét 1995;345:669-35,), Csökkentik: a szívelégtelenség morlallíásál ICoba E4, ei al., N Engi .1 irtsd 1991:325:303-10.) és gátolják: a bal kamra átépűlésí (Grgeaberg ö el al. Circdasmn i ‘-95.QI :2573-81.). .Az ACE-gátlök késleltetik a hipertónia kialakulását (Euders S, et al, J Hypertens 3008.26:1-187-96 ) és csökkentik a bal kamra tömeg-index értéké: bal karara hiperiróíiáhas tCuspldi C et: al. .1 Hypeneas 2002:20:2293-300.). Csökkentik a ntikroalbujsiauna iaciáesciáját és a áiabrteszes nsfepátin kialakulásának rizikóját 2-es Opusó diabétesz nidlitaszhim {Ruggeussb P, N Esgl 3 Meá 2004:351:1041-51,), valamint tovább csökkentik az újkeletű diabétesz iueilitusz kockázatát (Hoogwerf EJ, t C v,v í. n ’ Mrd 2 Ct c7 's o t s 1 /s s s í1 u b iátok 0 ) ΙΛ u ,»> '<. «/ V’ κ >.r o-> -terepét sugallják az említeti: betegségek íxnc-neci-anizn-tisában. Tanulmányoka- végeztek az ACE és s kardtevaszknsáfis megbetegedések közötti kapcádat vizsgálatára. Art találták, begy az ACb-expresszáó az ACE-gén íózereiésÁleléctös (CD) polfotorífömusa által genetikai kontroll alatt áll (Rigai B el al, 3 din Invest
1990::86:3343-6,), A D alléi jelenléte miatt kialakuló emelkedett ACE mennyiséget potenciális rizikőíáktornak ártották tv nmó-v-n i utal Satui? WfoC'fo3 n-'-t v fatuilmáuyok százai vizsgálták az ACE génotipas szerepét & nzxkóbecsíésben valamint az ACL-gátlo terápia optimalizálásában. Ezek a vizsgálatok megetöClelték a genotípus ACE menny Régére kifejlett halasát í Dl> genotípussal rendelkező betegek, esetében az k b Koncentráció másfélszer magasabb (Rigát B et al, .1 din hitest 1990:86:1343-6.), mint az. E. genotípussal rendelkezőknek), de resídszertot nem találtak pozitív ,^Zvlu„ov^ a szcjum \v 1 ixmixreg o \mlotostodar·» cet? wk urak , >vK e ϊοα a? \t 1 gátlók sikeres terápiás kezelési tubának bizonyultak.
Ezek az adatok azt sugallták, hogy a genotípus által nte^hatá-rozo-U ?\CE expressziös különbségek jól tolerálhatok az egyének szintién. Ezt: alátámasztja az a tény is, hogy a D alléi gyakrabban fordul elő (509») (Lindpaininer K, et al. N Esgl. .1 Mied 1995:332:71)6-1!,) és: evrthiciósau szorah báltérbe.
\ rtamk yt i/nit íogv <. ta j to a kapvAÍa ο o \Ci ge\nm~- v\p esve cs ak-iútás későit. A jelen tanulmány igénypontjaiban megfogalmazott eljárás alapján azt találtuk, hogy az ACE aktivitás egy endogén, inhibitor által szabályozva van, ami emberekben legalább 73%-kal csökkenti a számra ACE akti vitá-di puOerelve .az ACE aktivitást széles expressziós tartományban.
PFIDAK
Egy egészséges önkéntestől származó számra iuiníáboz: növekvő mennyiségű ÁCS gátló eapíoprilt adtunk és meghatároztok a nbsis endogén angiotetírto-kosvertáz enzim aktivitását Λ kapuit őózto-haíá» összefüggést az: 1, ábrán, láthatjuk. Megfigyelhető, hogy a gátlóbatás mértéke mraomábs telítési körülmények kézéit, míg az inhibitor hatástalanná válik egyre kisebb koueentrációk esetén (váitozaskra, maximális enzim aktivitás). A gyógyászatban használt gyógyszerek klinikai hatásukat rendszerint a görbe átmeneti fázisában lejtik ki, ahol a célpont gátlása jelentős, de nem éri: el a teljes gátlást.
A módszer nregvalósilhatóságát elsőként rekombisáns ACE «nzilrtrael teszteltük, amit egy ACE-gátlőval (eaptoprilkil) kevertünk össze maid sm-vste-cm meghigkottouk (2. ábra). Az: eredmény bizonyítoita. a módszer idkaíniazbaióságát, A minta hígítása \< F «kos tus növekedést eredntéityezeü, arai az inhibitor (1) ás az enzim:
109902- 1423/Sö (E). dissxocííkőójóra ateít, ós -ezáltal a gátolt AGE <EÍ). feiícentrációjs csőkkeaí. lövábfeá az. is: látható volt, hagy az. AGE. aktivitás növekedése arányos a gátlás mértékével: nims változás az AGE aktivitásban akta, aszókor a kezdőit gátfe elhanyagolható (eaptopní koncentfácíö OJ okit,, nagysnértéku enrelkedés látható kis hígítást faktorok esetén abban az esetben, ansikor a kiindulási inhibitor kotieenfráoiö közel megegyezik a gátlószer Ed ériekével (pl. íö nM csptondl esetés). Végül az inhibitor kiitsdnláss koncentrációját snaxíoiáEs· gátfebaíásig te se m * 1 A! ρ <. hujT v git„ t J· o árt i x \ ! k\ > π t >i - t e t tó \ h ez *· y az «szint aktivitás felszabaduljon a gátlás alól (2. ábra).
A továbbiakban a módszer tesztelése. életszere körőlmónyek között történt egy kim lkai vizsgálat sorás.
Essóogén enzim gátlásának becslése
Azon hlgltfei.fektor meghatározása, aM.a.reyes-zihüís..mhibifor hatása eihanvagoihatóyá yálik.
Az ACErgátlÓ terápia esetében a kiváltott báláé az AGE aktivitás gátlása, amit ieltóieieztöak, hogy az í, egyenlettel jellemezhetünk.
Égy választott inhibitor hatásait vizsgáltak tíz ACE aktivitására a szükséges hígstási iáktor becslése érdekében, Captopril ACE-rs gyakorolt gátló itatásának dózis-hatás görbéjét szemléltei; az ;. ábra, Az: aditíponíokat az E egyenlet alapján nendtsteárts regresszióval illesztve a stabilitási konstans (Ki} értéke a barnáé ACE-eaptoprd kentpiexnek 1.4 J nM-eak adódott.
További fontos fskternsik tekinthető a szók,séges enzim- (AGE) és inhibitor koncentráció (pl. nap-cprií). Az inhibitor koncentrációt a bevett AGE gátló gyógyszer nrennytsege, a gyógyszer ntelaholizmusís, gyógyszerek közötti, interakció,, vslaminí számos egyéb ok befolyásolja. Mindezen okok alátámasztják a hatékonyság mérésének szükségszerűségét. Az inhibitor koncentrációja gyakran limitált a maximális koncentráció tekinictében, ugyanis a rendelkezésre álló pirulák nvomyisége: korlátozott és a potenciális mellékhatások iéphe'mek fel, Következésképpen feltehető, hogy a maslntális gyégyszstr-taínentráeió nem nagyobb, mint a maximális AGE gátláshoz szükséges, Ez capfopdl esetében Élik Illői) nhí-os tartományba esik.
Homán plazma AGE koncentrációja közvetlenül lett meghatározva 110 önkéntes esetén A szénás AGE koncentráció 155aó agcnü-nek adódott (0 Jó nM).
A találmányban énükéit egyenletek értékeinek istnereíében lehetőség nyílik a hígítás Itatását modellezni, t ében a példában az L egyenletet használtak:arra,.hogyklszámhsnk a hígítás AGh aktivitásra gyakorolt hatását, \ ateí.’'ikont az inhibilor koncenttációL mtg: állaisdókófe figyelembe vett értékek: ACE koncentráció “·· OJő nM; Ki ~ 14 J xsM, A számítóit ACÉ aktivitás értékeit (aktív enzim (E) %-ábar kifejezve a teljes enzintkoneestíációboz képest (Ε+Εί)) a highásí faktor függvényében ábrázoltak (betolyú»öíva. az oldat komponenseinek koncentrációját (£; EE l) különböző kíindnlásí: inhibitor koncentrációk mellett, felölelve a teljes llzíelógiás tartományt (í),1 - iOSó akl))(! ábrái,
I Átható, hogy 12.8-5 IG-szems hígítás az a tartomány, ahol az AGE gátolt (inhibitor kötött) tormája elhanyagolható mennyiségű lesz a szabad (disszociált, maximális aktivitású) ACE-hez képest, & várható enptöpril koncentrációk mellett
Ezáltal előnyösen olyan magas hígítási faktort keli választani a minta esetében, ahol az enzim inhibitor kötött tormája elhanyagolható, ez esetünkben legalább 2öí5-sxoros, előnyösen 3Öö-szoros vagy 350-szeres, vagy még előnyösebben legalább fe)ö-szoros.
Egy nimfa esetében előnyösen az alacsony inghási faktor, ahol az enzim aktív formája elhanyagolhatónak tekinthető, legfeljebb 20- vagy 10-, vagy nagyon előnyösen legfeljebb 5- vagy 4-szeres..
109902-Í42ASG
A higítási iáktoi’ők aránya ennek meslelelően legalább- 14 vagy előnyösen legalább Sö vagy legalább 7Θ vagy legalább 100.
Fontos xnegiegyezsk begy a találmány szempontjából lényeges lehetőleg a legmagasabb hígítást l?asznáiní, hogy a gáto lattan (maximális}: eftzi® aktivitás Mesíllhetö legyen, Ez-esetbe» a gátlás mértéke nagyon pontosan meghatározható I és 5! 2-szerss: hígításon (1. táblázat). Ezt az elméleti megfontolást teszteltek. egy klimkai vizsgálat során, ahol a betegeket külőnbözO ACB-gáítókkal közeitek. Igazolást nyert, hogy a javasolt hígítás i iákíerok elegendőek .az ÁCS gátlás mérték ének meghatámzásálioz.
| Becsült gátlás 1 ás 5 52·· szeres highást alkalmazva (gátolndan %--fcan) | Beeső U gátlás - es 400- szoros hígítást alkalmazva (gátolafam %-fesn) | Elméleti gátlás igátolailan A.-hm?) | |
| Nincs cnpiopríl | 0 | 0 | 0 |
| 0,1 aki eapíopril | 0,7 | 0,2 | 2,7 |
| 1 sM eapíopril | 6,3 | 1,6 | 8,2 |
| 10 nM captoprii | 40,2 | 5.4.3 | 41,5 |
| iOO rsM eapíopril | $6,9 | 62.2 | 87.4 |
| i öílö captopril | 98,3 | 93,5 |
3.1 ,bn Vtó iklo ik«· ^ethvauk <lm„, tt crv-e
A gátlás mértékét a 2, ábránál leírtak szériát számííjnk ki, A gátlást értékeket 1, 4, 400 és 512-szem» hígításon toriéin ÁCS aktivitás mérés esetében is megadják.
Az ACE aktivitást pöthosan meg kell mérni egészen 512~szeres: hígításig, Egy eozám aktivitás mérésére: szolgáló módszer kidolgozása. ne® feltétlenül egyszerű. Különösen a tekintetben, hogy a pontosság talán tördítottas arányos » meghatározás költségével. A találmány legnehezebben kivitelezhető része: az, hogy olyan körülmények között kell aktivitást mérni, ahol az inhibitor jelen van.. de a Íratása csekély Ez magas hlgltásí lakion igényel. Számos módszert teszteltünk azért, hogy a találmány kivítelezt?®·» legyen. Végül egy eredetileg Símonetla R > ; (<s o t b, ju » Oh n no < i tö'm) ~0 n |oo' o<o s< « x, t) j{ i; totometriás módszert haszhálünsk.
A módszer részletes leírása a Módszerleírás részben található (ACE aktivitás mérés).
Ez a módszer alkalmas a szénám enzim aktivitásának 4~40Ö~szorös hlgltásí tartományban történő pontos: meghaiározására. Habár a számítod enzim aktivitások 4- és 4(tö-szoros hígításon nagy valószínűséggel alábecsültek, a kapott értekek mégis alkalmasak lehetnek a kezelés hatékonyságának megállapitására..
| Beteg kódja | AGF aktivitás | .Aktivitás aránv 1%) | Gátlás í%) | |||
| 4 •szeres hígítás | 400-ssoros hígítás | |||||
| kiért | Számított | Méri | Számított | |||
| A 02 | 1,4:6 | 5.83 | 0,37 | 147,3 | 4.0 | 96 |
| A 03 | 2.14 | 8.57 | 0,51 | 202,41 | 4,2 | 95,8 |
| A 04 | 5,55 | 4,61 | 0,52 | 208,54 | 2,2 | 97,8 |
109902- 1423íSö
| A05 | 4,64 | 18,56 | 0,37 | 149.61 | 12,4 | 87.6 |
| Λ06 | 1 «9 | 7,98: | 0,38 | 153,64 | 5.2 | 94,8 |
| A OS | 7 | 02 | 0,47 | 139,14 | 4,2 | 95,8 |
| A 10 | 0,65 | 2,62 | 0,3 | 120.71 | ··> n | 97.8 |
| All | 0.66 | 2,66 | 0,5 | AA.27 | ΐ í | 98,7 |
| A14 | 156 | 6,22 | 0,35 | A128 | 4,4 | 95.6 |
| ...........ÁS............. | ............1,35 ...... | 5,38 | 0,32 | 127 Ά | 4,2 | 95,8 |
| A = 8 | 0,45 | ISI | 0,42 | = 67,66 | .............p:............. | 98,9 |
| A 20 | 2,53 | 10,33 | ::.........0,21............ | 35.23 | 12,1 | 87,9 |
| A 21 | ..........-JA.......... | 4,59 | 0.26 | 102,05 | 1 5 | 95,5 |
| A 25 | u.42 | 1,7:: | 0.32 | 128,1 | t ' | 98,7 |
| A 27 | 1.1: | 4.89 | 0,44 | 174,45 | ? X | 97,2 |
| Λ 29 | 0,76 | 3.05 | 0,33 | 13127 | 2,3 | 97,7 |
| A 30 | 17 | 4,44 | 0.6 | 239,22 | 19 | 98,1 |
| A32 | 0,56 | 2 'í | 1X35 | 140.06 | 16 | 98,4 |
| a33 | 063 | >2 | 0.41 | 162,98 | 4,0 | 96,0 |
| A 34 | oas | 1 ^3 | 049 | 75,45 | 2,0 | 98,0 |
| A35 | 8.Γ | 32,67 | 0,39 | 156,49 | 20,9 | 79,8 |
| Λ 3 | 2,4 | 9.62 | 0,36 | 144.62 | 6,7 | 93,3 |
| A38 | 0.6? | 2.62 | 0,32 | 129.55 | 2,0 | 98,0 |
| A 39 | 1 = 5 | •16 5 | 0,39 | 157,53 | 2,9 | 97,1 |
| •\44 | 0,65 | 2.6 i | 0,18 | 70,97 | 3,7 | 96,7 |
| A 4 7 | 3.28 | 13.33 | 0.35 | •4109 | 9,3 | 90. |
| A 50 | 9.45 | 37.82 | 0,37 | = 46,56 | 25,8 | “AJ |
| A 51 | 0.59 | 2,35 | 0,38 | = 5174 | 15 | 98,5 |
| A52 | 0,63 | 2A i | 0.4 | 159,04 | 1,6 | 93,4 |
| A 53 | 0.5 | 198 | 0.4.3 | 173,97 | u | 98,9 |
| A55 | 116 | 4,62 | 0,41 | = 63,83 | 2.8 | 97,2 |
| Λ56 | = 0.53 | 42.1 | ..........0,47 | 187,48 | 22,5 | 77,5 |
| A 6 = | 4,36 | 17.45 | 0,32: | 129,46 | 13.5 | ..........36,5...........: |
| Λ 65 | 0,53 | 2,11 | 0.32 | 126,19 | .............17........... | 98,3 |
| A 66 | 3.68 | 14,74 | ..........0,36:.......... | 144,26 | 10,2 | 89,8 |
| Λ 6? | 0,90 | 3,97 | 1X39 | 154,32 | 2,6 | 97,4 |
| A 60 | 3 | 11.99 | 0,38 | 152,39 | 7,9 | 92,1 |
| A 76 | 6.57 | 26,27 | 0,41 | 165,44 | 15,9 | 843 |
| A 71 | 1,56 | 6,23 | 0,28 | 115,87 | 5,5 | 94,5 |
| A 72 | 9,63 | 38.52 | 0.24 | 95,92 | 40,2 | 59,8 |
| A 73 | 0,25 | 102 | 0,13 | 50.87 | 2,0 | 98.0 |
2. IWázat: Egyetlen mmOiböl tOrílaö azemn ΑΧΈ-gáílás slAéteek líieghatárezásü
W99Ö2S 423/SG
519 betegei vontunk be a vizsgáiéiba, Mrnden beteg szedett valamilyen tipüsú vérnyomáscsökkentő gyógyszert: szedett, kbxiiíhk: 33ő beteg ACE gátlót. Az első 58 beteg kísérletesen meghatározott adatait a. 2. táblázat -szendékért, A meri aktivitás értéseket megszoroztuk a?, aikahnasoit hígítást faktorral (4 vág , 4Cfe t begy tnegbecsSíjiik a napta.-aktivitását gátéit körtdtnéHyek között {4-sasres hígítás, ahol az ACE snh»b vn( t (Eli valamint szabad rérmába-t (E) vsa jelen) valamint miutárs a. gátióhstást elhanyagolna ' κμλ csSkkeatetíük (4ö8--szoros hígítás, ahol az ACEAnhlhítor komplex (El) elhanyagolható koncentrál, mm. s/ h3 enzimhez (E) képest). A kapott értékeket hí^ználva a 3. egyebet niagján.becsültük a gátlás mértékét
Szérűm ACE aktivitást 4·· és Wbsseres hígításon határoztuk .eieg hipertóniás betegek esetében, A nyers mérési •eredményeket megszorozod, az alkalmazott hígítási lákiorokkal (4 vagy 401)), így megkaptuk a szérűm ACE aktivitás értékeit. Ezen aktivitás értékekből képzett: aranyszámmal becsülhető az ACE-gátlás -mértéke egyetlen minta felhasználásával,
Áteráglafegt^ons^ágafesajnériór tékák hSgihtEfeapg^Mmegáfajabása
A tanulmány kivitelezéséhez azokat az értékeket hasznátmk, amikhez az ACE-gátlót nem szedő betegektől jutottunk. Megjegyzendő, hogy a találmány egy meglepően hatékony - (robosztus) .módszert ajánl a hatékonyság megállapítására kezeletlen minláix esetén. Például, ACE-gáilét nem szedd betegek esetében nagyién kiesi különbségekéi kellene mérnünk s nonnalízált 4-szezes és 400-szöros hígításon mért aktivitások tekintetében (számított gátiohatás 0 ± mérési hiba). Ezzel szemben az ACE-gáíléval hatékonyan kezelt betegek esetleg kisebb .ACE aktivitást kell mérni 4-szeres hígításon, mint 4öl)-sxoros hígításon. Meglepetésünkre a kontroll csoport gátlást érteke ΊΜ7 % (átlag * SD) volt, ami sokkal magasabb az átlagként elvárt 0 körüli értéknél (4. ábra).
A találmány alapján ez egy endogén ACE-gátló jelenlétére atal a barnán szérumban. Ez tovább neveli a módszer jeiehíösőgőt ős gyakorist t hasznát, ugyanis ennek a mgyfőfeö eodögéh gátlásnak á jelenjétől bein sikerült felfedni az ehnúh évtizedekben az intenzív kutatások ellenére, valamint a ma tnár feadiovaszkuláfes megbetegedések kezelésében sarokpontnak számító ACE gátlókkal történő kezelés sikeres bevezetésének ellenére sem. Mindazonáltal adataink azt: sugallják, hogy a szérum ACE aktivitás jelentőseit gátolt Eztolőgiás kbirtlmények között (gátlás mértéke 723*9,6 MA
Azt is kimutattuk. hogy az ACE: expresszióval ellernétbon az ACE genotípusnak kevés hatása van az ACE aktív hasra. Ezt bizonyltja, hogy az endogén inhibitor jelenléte púderek az ACE mennyiségben megfigyelhető különbségeket.
Megkíséreltük azonosítani a vélelmezett endogén inhibitort. Különböző pórusméretö uitraszürok segítségével szérűn* mintákat száriunk :(12:, ábra), Nem volt hatása az 51) kDa-os pórasméretü szűrővel történő szűrésnek. Ezzel ellentétben, a 10Ő köa-os: górustnsrefeszűrőt használva jelentősen emelkedett a száriét ACE aktivitása 4-32-szeres higiiason a kontrolihoz képest. Egy betegmintát használó kísérletben gz ACE-i ketesztköiöltisk a vele kapcsolatba lepő fehérjékkel, és n keresztköíört termékben a humán szórom aibumint vafemini az ACE volt kinmtathatö inem mutatott adatok). A köveíkezöekben a HSA ACE aktivitásra gyakorolt hatásait vizsgáltuk (13. ábra). 'HSA gátolta a rekomhisáss ACE aktivitását 9,6 mglml-es feitaaximális gábókoacenifáeioval, Fontos megemlíteni, hogy a maximális gátlóhatás ufertéke 95% (parciális gatloszer) volt
189902-1423'SG rog/ml-es 1'íSA teöceíörá'tífo tnelfett (13/A- ábra). A HSA á tísztlíoíí .szárat». ACE aktivitását' is gátolta. i 13/B, ábrái 6,1 .tag/íal ICáö értéktó. A tsmxtmális gáílekatás 95%-os volt 64 íögM mellett. Végéi rekombináns ACE-t .gáloltönk ta» szétutnmíd (I 3/C. ábra). A hígítás hatására nőtt &z. sxögén ACE aktivitás, mint ahogyan azt endogén ACE esete» láslfetjuk <11/8. ábrát.
Ezáítaí ha a HSA okozta gállóbatást a ttilálmátíc szériát bec-mlpk, a híghast faktorokat a kővetkezők szériái sjátsíoít: beállítani..
Egy miatti esetébe» a nngas hígítást lakto!' értéke, ahol az inhibitor kötolt fonna már eiEáayagolbá-o, legalább 5. előnyösen 8 vagy 10. igen előnyösen 12, 16, 20.
Egy minta esetében az alacsony hígítást foktor értéke, ahol az aktív fonna: mát elhanyagoibaté, iesléhebfe 3 vagy 2,5, igen előnyösen legfeljebb 2.
A hígítást faktorok aránya ezáltal legalább 3, előnyösen legalább 4 vagy legalább 5, vagy legalább 8.
Az irodalomban léteznek utalások egy endogén inhibitor létezésére, azonban ezt: ez Idáig sem sikerült azonosítani. Kramer és társai kisnrtatták az ACE génben egy olyas pnntnmtáciöt: a fehérje toasszmembrán régiójában, melynek következtében a keringő ACE mennyisége drátnaían megnőtt i5-szörösre) íKramers C, et al: Cttottíittfos 2001,184/1236-48.), Ez, a. mutáció legalább 8 családnál elöferdbl, de a. családtagoknak sem hipertóniát sem egyéb klinikai elváltozást nem okoz. Talán a HSA védi meg: őket az extrém magas ACE tnestnyiség lehetséges következményeitől. Eesietrtviteb és, társai egy másik ptmtntoiáciét matattak ki, amely a szérum ACE 13-szoros emelkedését okozza, de ezt as elváltozást sem: sikerült egy betegséghez sem kötni. (Nesferovítch AB et al ?EoS One 2809:4x8282.). Létezik néhány egyéb mutáció mely az ACE mennyiség «nyíre emelkedését okozza, de ezen esetekben sem ibfdöhak elő kttrdfevaszkaláris betegségek (Semmfer A, eí al.. Clin Chent bah M'ed 280ó;44'.1088-9.: Lixtaehank M, et <b. Hetrrolegy 2083/6:1:1819-28.; Eyrles M el ál I ltod Chem 2881; 276:5 525-32,1,
A szérum angiotomriö-kőnveriáz enzim patológiás mértékben emelkedett néhány graaalomátóms megbetegedésben (pl.: szarkeísiózisj, vsíasnisrí. Ismert a kapcsolata a Ganeher-fcőrmi is (Táebernün· 1 sí ah N {*!!.! EJ íir'C'4 xt A rtudds 8 <1 5^0^00-4^5^-^%% A<,%xt\.t></ k*
ACE expresszió ellenére a Arrdfevaszlmiárls í5tegbetegedések incidenciája nem különbözik sz egészséges populációtól.
A szórom aibaroitr a keringő ACE-n kívül a membrán-kötőit fonaára is hatással. vart. Ezt támsszíta alá Danser és vrm Dijk trasr-kássága. akik tíz ín vivő angíoteozirs I konverziót íarmlsnányorták különböző genotípusa emberek felső végtagjaiban {Danser AH et al. J llypertests 1999; i 7. IS67-72.:; van Dijk MA, et al. J Cardlovasc Pharmacol 2008:35:484-90.). Ezek a tanulmányok az angiotetnri-5 I — 0 kx-nverziő sebességéi í'dagetlé-mek találták az CD genotípustól, valamim: az angtodarzia ΙΕΙ arányt hasonlónak mérték H, 1D és DD genotipusü betegek esetében.
Korábban több munkacsoport is felvetette egy endogén ACE gátló- létezésének lehetőségét, de, ennek természetét nem sikerüli, tisztázni, Ltebermaa: és társai rutinszerűéi;Javasolt hígítást & szérum ACE aktív'm mérése előtt, hogy eilmírtájink: az endogéií gátlószer hatását. Ók art találták, hogy az inhibitor frhe-je természeti, moieknla tőtnege pedig 59 kDa feleld ííriebernvan 1 and Sastre A. Chert 1930:91):869-75.).
Eredményeink lehetőséget adnak gyógyszercégeknek: arra, -hegy írj típusú ACE-gátlókat fejlesszenek ki. Ezek a kővetkező generációs gyógyszerek az ACE és HSA közötti kapcsolatot stabilizálnák, ezálial «revembt Eseti gátolva az asgísstenzm 1 konverziók Ennek köszönhetően a betegnek nem kellene naponta bevennie az
109982- 1423/SÖ aCE -gátló gyógyszerét. ezzel Javulhatna a beteg együtlműkodése a kezelés során,
AllüÜkÉMh^
C \CE~gátio gyógyszerek növelhetik az eaáögés. inhibitor jelenlétében a szérum ACE gátlásának méneket Az .ACL-gatlot »zodo betegek. becsalt ACF. 'gátlásának mértéke 93 ± 8 %,. összhangban a találmány mtal ymcxítd! <4 abotl Fz r jelentős különbség; (72¾ ACE-gátlot sem szedő betegek 11 lelve 93% ACE-gátió· s/eao Nrvgek e.-eten'í ízí sugallja, hogy az A€E~gátló terápia hatékonysága az endogén inhibitor jelenlétében is meghatm >viutó Ha a. individuális, egyedi értékeket ábrázoljuk egy htsztograoton, a két csoport (az ACk-gátlót szedő illetve nem szedő betegek) meglepte: élesen elkülönülnek egymástól (5. ábra). Az 5. -ábra a 4. ábra ni itav ábrázolja htsztogram főrrnájábam A hatékony ACE-gátlő terápia határértékéi egy választott, 9ö%-nál meghhzott vonal jelzi, ilafeár ez az érlek. sénníeg esetleges és lehelne alacsonyabb vagy magasabb néhány '.m/ale.\k d, ez az eltérés mindössze az átmeneti zónába tartozó néhány beteget érinthetné. Másrészről a betegek esy < rseinüea két nagy esoportba különéltek, az egyik .csoport azokat tartalmazta, akikben a terápia elégséges, a mami·, azokat akikben, nem az;.
Az..5., ábrán bematatott hlsztogram egyérteknöen megmotatja, bopv ,-z ACE .Ax *«s szedő betegek (rs===:i58) endogén gátlás! szintje 46-<8'7% közötti tartományba esik. Ezzel szemben sz- ACE=-gátlóí szedő betegek nagy része· magasabb gátlást szintiéi rendelkezik í>-=383>, A klmlkaiiag hatékony szénán ACE gátlás szintjét iC k .s a ída manna! et t t'ockzu d beesabetjüa t zt zi<no z t\ . nczm/xst klinikailag már jelentősnek mkmtclt széram ACE-gátlás határnál (5. ábra ).
Kapcsolt a scnv.o! sással
A köveiké moxkm i kigiíásos módszerrel meghatározod ÁCE-gáilás. mértekét hasonlítottuk össze a vérnyomással tő, ábra). Az; ÁCS aktivitás 4- és Adó-szoros hígításokért mért értékei mellet a betegek vérnyomást is megmértük. A látszólagos Adó-gátlás mértékét a, 400- és 4~szeres hígításokon mért értékek arányából szájnitodak. A. 90%-os ACE gátlás! érték; alatt! (0--==68) és leletei (n-318) betegek arténás középvéntyomás értékelt matat,lak az ábrán. Az oszlopok átlag és standard hiba értékeket mutatnak, a csillagok a jelentős különbségeket szimbolizálják a két csoport közök (p-Q.003),
A megfigyeli ACE-gáöök által létrehozott vérnyomás csökkentő hatás összhangban vart nagy kiírókat vizsgálatokkal, például az EURÓPA (Fox öí,: eí al, Láncét 2003;362:782-84 vizsgálattal: mi .5,8 kigttsro-es artériás vérnyomás csökkenést deíekiálátök, míg az: EliRÖRA vizsgálatban 6,5 Flgmunes csökkenést matattak ki. Érdemes megemlíteni, hogy az EUBÖEA vizsgálatban az ACE-gstíó hatékonyságát hasonlították egy piacéból szedő csoporttá!; hasnlltották össze, míg a mi csoportjainkat az. inhibitor biokémiai hatásossága alapján határoztak meg. .A hasonló értékek azt bizonyítják, hogy a találmány alapján pontosan ki lehet szűrni azokat a betegeket, akiknél hatástalan az ACE gátlás.
Az ACE patötíxiolögísi körülmények között történő aktiválódása elvezethet hipertóniához, diabéteszhez, szívelégtelenséghez és egyéb betegségekhez is. Ez idáig nem tulajdonítottak jelentős szerepet a szénán endogén ACE-gádásasak az torgioíenzln-konvertáz enzimmel összefüggő betegségek progressziójával kapcsolatban. Miadazonáhal adataink azt is felvetik, hogy az, endogén gátlás változása Irozzájámlhat az ACE médiák betegségek progressziójához. Sőt, kapott eredményernk arra is mainak, hogy különböző ágensek indlrekí módon befolyásolhatják az ACE aktivitást azáltal, hogy módosítják az .ACE és- endogén inhibitora közötti kölcsönhatási, Így az a köiesör.hatás számos betegség esetében lehet terápiás célpont.
ÍÖ9%2-H23/SG
Szernéiviy.szabotÍ kezdte
A gátlás harékonyságáiiak meghatározása a szmélyre szabott terápiában Is hzsznáiishö vagy akár a terápia opiítnaíizálásám a megjelenő tsellékhaíásök esökkealéséze. Jelen isíáhnány arra is alkalmas, hogy íéíbsesSljök a kielégítő vagy optimális gyógyszetdozirozást annak érdekében, hogy elkerüljük a mellékhatásokat Ennek érdekében a gátióhatás: egy felső estekét kell meghatározni, vagy a dozirozást keli módosítani a megfearározott értékek alapján. .Az első esetben a klinikai tanulmányoksak kell meghatározni a gátlás azon szintjét, ahol tnmdntelis a klinikai halas. A gyógyszer dózist csökkenteni lehet azoss betegek esetében, ahol a gátlohatás magasabb, mint a maximálisan hatékony gázlohatáskésí meghatározói; ettek. Alternatív megoldás lehet, hogy a dozteozást olyan értékre csökkentjük ahol a betegnél nincs mellékhatás, maid a gátióhatás mértékét meghatározva dönthetünk ártól, hogy a beteg áltál, tolerált dózis elégséges-e az enzim gátlásához, Ha a gállöhatás elégtelen, akkor a gyógyszert ki kell venni a beteg kezeléséből. Másrészről ha az enzimgátlás kielégítő alacsony dózis melléd is, ebben az esetben & beteg kezelése optimalizálva lett, .Általánosságban kijelenthető, hogy a találmányban leírt módszer alkalmas egy enxímgátló ísrapiás dózisának. beállítására, amennyiben az optimális gátlóhatás felső- és alsó érteke meghatározásra keróh vagy előre tnoghatárosoitas rendelkezésre áll, valamint a beteg gátlási értéke jelen .módszer szentit megfeatározssm kerül. Ennek tükrében a beteg gyógyszerének dozhőzását csökkenteni kell,, ha a beteg gátlás! értéke magasabb, mint a felső hemiertck, illetve nőseim keik ha a beteg értéké nem est el ,i/ ak-o határértékei Optimális esetben a gáílólralás felső értéke rnegközolhi a maximálisan hatékony gátlás színijét, az alsó- érték pedig.közel esik ahhoz, ahol a gátlás hatástalan..
A hígításé·» módszer alkalmazható gatohuts n egbusmo-as«m,. amikor az endogén enzim aktivitása (alacsony aktivitású enzim, vagy az enzim nem .amin n>x n\n nmUbsa pl. H'Mö CsA redukiáz: stb.) vagy a deteseki érzékenysége nem. elegendő arra, ho.o nagy hígítás- lektorok mellett is meg íodjofe határozol az enzim aktivitását.
A sikeres mérés kulcsa az szögén: enzim mintához történő adása, inaid az endogén enzim aktivitás: változásának mérése. Abban az: esetben, amikor egy inhibitor vau jelen az: szögén enzim aktivitása gátolt alacsony hígításon, míg a gátolatlan skioms magas htgtiásl faktor mellett meghatárezhatő, ahogyan azt az endogén ACE esetében leirtuk.
Ezt a módszert teszteltek exogén ACE segítsé gé vek Exogén ACE-t adtunk betegek szérumához olyan mennyiségben, hogy az exogén enzim aktivitása^ legalább százszorosa legyen az endogén enzimének, Ezáltal az ACEi aktivitás mérése érzékenykve lett. Égy ACE-gátiőí szedő beteg szértnnmíntáiáhös exogén ACE-t adtunk, maid: serozsibigíiásí kószíteltetik, és megménnfe a? ACfc aktivitást (7. áfcta}. Ezen szérum exogén ACE aktivitását ábrázoltuk a 7, ábrán az expgén ACE-t tartalmazó, ACE gátlót szedő beteg szérumának hígítása részvényében.
A hajtott eredményt a 2, egyenlet szsrmí. értékeltük:: az enzim aktivitás 0,Sh AEEml vohte-sseres és 1:02,4 ACAnl } 28-szoros hígításon. Ez azt mutatja, hogy az inhibitor koncentrációja elég volt. ahhoz, hogy az ősegén ACE ak.-u.amt -t-dA-han javd-a
Meg ked érnem, ieg\ m tahtbltortsthtlum kimutatására: irány-ülő khéiteí a megíélclő enzim aegiiségt \e' bamuben okutEd megoldható. Ezáltal a módszer széles körben alkalmazható, mint például sm, hogy mzabo-Oihuk a Evzoonn ntegrendszer egy enzimére ható gyógyszer koncentrécióját széirnn, vagy
109W-1.423í$Ö rere5?rosp;nah,s foiradék eseten u- A tniaimam arra js Ekein: izhnfo. hvgs a gv misterek kétmat- \agy mikrobiológiai; előállítása során megbecsütje a gátlőszcr irataimat, vagy megbecsülje a gádoszer íartdraat természetes tblyadékokhan, Sőt mi több, Jetet technológia arra is alkalnrazható,, begy meghatározzuk reverzibilis »\ » · ·. \\ >:νω aS a, ke- í 'toiog i büket! a>\< ex kram< t i\u<\'u \o i \j»a .uc\4)
ACE afokifos mérés ellenőrzése
A keringésben lévő ACE numnylség genetikailag meghatározott, Aaoteak a betegeknek, akik nomozigóták az ACE gén D afiéiliira 56%-ka! magasabb koncentrációban volt: megtalálható a szérumában az ACE, mim azoknak a betegeknek. akik homozigóták az t alléira nézve ({> 101*7 sg/ml, n™ 28:; ID~115*5 ng/ml n~ 7Ö; DD~ IS&fcö ng/mi serem, ö= 56). (Figure lík). Az ACE aktivitás szintén emelkedett volt aDÖ homozigóta betegekbe», habár az esnelkedés mértéke 4-saspíes: blgitásou msghatárezva kisebb snértekü volt (ifo 32*2 12/nd, n~ 28; lD~31.il tkmí, n~ 76; DD« 44*1 íi/tnl seren»,.s~ 56), mint ahogyan a koneertfojció alapján várható tet-'vob».
Ez az ellentmondá» metodikai hibákkal is magyarázható, Az ACE akíivstássísétés helyességének igazolására összehasordttotíók a i .ARCra hasítást tiőtontefoás meghatározás) és az: anglotenztn 1 konverziót (HEEC alapé meghatározás). A íAFGG alapú ACE aktivitás meghatározás maradókratramt arányosnak bizonyuk az angiotenzia 1 ~ itt konverzióval, (11/ A, ábra) Mindazonáltal a EAPGG hasítás 20-szor gyorsabb és könnyebben, mérhető veit.
Másik fontos tényező a módszer hrearnram k -u estes nem befolyásolta az AGE aktivitást, amikor tisztított szöveti ACE-val végeztük a ks-ertetet tilt) ama! 1 z/e· nemben a szMnm.ACE aktivitása a hígítástól függőit ét VB ábra), amennyiben égy kétfázisú hraőte fedtünk meg egy kezdeti aktivitás emelkedést követően (tő-szores hígításig) egy plató fázis kéneshez A «Ío-M szeres ingce-Á melyet további emelkedés követ (64szeres hígítás leied), (1 VB ábra) Ezek az adamk ccv endogén tninfmer jelenlétére urainak. Hígitsthra szérum esetén az inhibitor kötődik az ACF-hez, élteit az akin dósat (gátéba), maid amikor a szeren» kifogni, az; rahhuro Ivraokítz \G1 -re-l, foheatí. annak akta.S,ote (ti ( ábra)
Mernek · 1 Y értniuták
Standard aszeptikus technikával vérmínrakat gyűjtöttünk önkéntesektől. A nahv vért őt) porcig inkubáltnk szobahőmérsékleten,: a szérum frakciót {ISOŐgm centrifugával elválasztva 25 perrag): pedig -25cC-on tsrektík további felhasználásig. Andkösguláh vénás vérből genonbálís ObS-s izoláltunk egy·' DNS izoláló kn segítségével (EtexíGene DMA kit. Cak No, 51204; Qíageu GrabB).
Az ACE akíivitáu 37cC-on határoztuk meg egy mesterséges szubszírái segítségévei (N-(3-t2iuryijacrajöyl'j-E-pbenylalanylgiycylglycine; Sígma-Aldrich; Caí. No, F? 131). A reakcíésiegy 25 mM HEFES-t (Nr2-hídmxtehy1|>tperazÍHe-N-2-ewwolfonjc· acldi, (1,5 mM F»AKX3-t, 30*3 tnAf MaCl-ot és szérumot tórtelroa/ou apBh.2 volt A móras 96-lynkú lemezen végeztük (Cremer-Slo őse; Gat, No,: 655101), egy piaié reader segítségével fNovoStar plató readeg BMO Labtech GmbEl), Az abszorbancíábao (341) sm) bekövetkező változást (340 rtníl 5 percenként mértsk 00 pere időtartamban. A mért optikai deszkás értékeket a reakcióidő thggvssyében ábráraófok. és egyenessel illesztettük. Az ACE aktivitást az alábbiak szeri»): számrtoiíuk· Akut kas- - (< h)*D. ahol 8; a csökkenés meredeksége, kr optikái deszkás csökkenése akkor, amikor t nmei FikEöö Ixnaiik, ö: szerein hígítást faktora. Az ACE aktivitását unitban adtuk meg, 1 1.5 megfelel 1 untot
1(10402-142 ESG :9
FAPGG bomlásnak pereenkem Néhány kisérfet során a reakeléelegy barnán százam albumba is taöaiinazott (HSA Cat. No.:: N1-201908-21 1, Hornná SktPtena. Mhaa&síanfcg: and tradtng ΓΗ)}.
tó A£A etotoFto5aSS:ÓAiA%Aíl
Az AÜE rnKererösőielécsós genoíipasát Rigai és társai által leírt í és D alléi PCR Sí-sphSkáctéJfe alapuló standard protokoll alapján határoztuk meg (Rigát B, etak J Óin lövést 1990^6:1343-6,1, A feisekszorozoti (mnpliSkait) termékeket 59á-os pollskrliamíá géleiekirGíórezIssel választottuk el, és etfeton-feromid festéssel fetítlk láthatóvá. Az 1 és D alléi jelenléte rendre egy 490 és egy 1:90 báztspár hosszá terméket ofodföányezefo t4 fegtSSUlfeszüfe^
Egy egészséges önkéntestől származó szérum mintát 250-szeres hígítás utáu (25 mM HEPES. pH 8,2} ultraszürtük 50 és iOÖkGa-öspörosméístü ullrasztlrokke) (Vivaspln 500, Caí. No.: VSŐ231, VS024I: Sartorías Stodtm BiOt.vbí V ntormuresí addig tsnietelíük. turné a \ n>í.zUomensueü ukíAj el ttetn erű· a k-mduiass térfogatát.
!·> Aogfeáíszislko^^
A szérűn: mintákét 37%1-ök iskubélínk 9,-5 pbí angloíenzin 1 (szlntetízáiíu: GeaScnpt USA Iné.), 30S :oM \.t( i to nA! Hí Pl > jele-uetében. pli \2 5 nM fDTA-t .tötum, e'egther í. >g\ .ea/noA a reakciót.. Az: a-tgiotenzin pepildekér azután mértük, hogy az Negyet 'leszúrtak egy ló köa-os pőrasméretö ukrsszdrövei (Vivaspta .500, Cat. No,: VSOíOl; Sartories Siediot Sloieeh), Siumsdzu gyártmányú HPLC-vel és rewz fezisó ClA-as oszloppal történt a mérés (Hypersd Goid, Cat. No,: 25085-).54630- Thermo Scfeníiftci. Az .„A” siluens 0,01% triőnoro-aeeíátot. <TFA, Eigms-AldrieN CaL No.3ö2831) ntnateazott. vízben, tatig a ,,B” eluens ö,0I% TFA4 tartalmazod aeetostotrilhett íStomt-Aldrich, Caí:. N;>.3499b}, Az: sggíotenzm pegtldeket egy 22%-ról 55% aestomtotoe «ovo gradiens eláelós pswilsl választotok el egymástél: Az anglofenzm peplidekeket: egy diódasoros detektorral deískíálmk 230 m hullámhosszon, a pepíidek jelenlétére jsíleatnzö görbe alatti területeket .pedig ismert mennyiségű pepiidet tartalmazó (kalibrációs) görbékkel hasonlítotok össze. Az sngmteuzin peptldek mennyiségét a reakcióidő foggvényőben ábrázoltok és egyenessel illesztetok. Az rmgsoierszin I konverzió kiaéítkáiát az alábbiak szerint adtok öreg: 1 omol asgiotenzirs I hasítás Imi szérum által l pere alatt
1-6 ACE.me.a!ryá.ség.meghmározása .Az ACE mennyiségéi a stotumban egy. a kereskedelmi: forgalomban kapitatő AGE El .ISA fejlesztői kittel határoztuk meg (S.&F3 Systems íné,, Cat. No.DY929) a gyártó utasításaitól csak kismértékben eltérve. Rövides: az ELISA lemezt $0 agán): befogó antitesttel fedtük le, a maradék kötőfelsziht pedig reaget-shigitó oldattal blokkoltak (Galbeöéo-fele foszfát pufferben oldott lő mgónl borjú szérum álbmnin), ióö-szorosra higüotí szérumot (magess higitóbait) .adtunk a zsebekhez, majd az antitest-amigéo kcwvfewkef Kotláéit desekeiős antitostísl jelöltük: (20 ttg/zseb). 200-szorosára hígított streptavidbi kcmjugáh torma rvroxtdu/t íktt komponense) adtunk a zsebekhez. Végül szuhsztrá- oldattal t(i,3 mg/ml ternunedt-bettzldto őyl μ.Μ H;O> 50 <;M Vv’vtu daruin k a aompiev moss,u<,g<.t s i v.kemt \> ,νι, η. nl,5 Ά1 »> a i'.Yc'tuk te \ minták optikai denzitását 450 mo-eti mértük. A mintákat legalább háromszor mértük meg. vagy legalább annyiszor, míg a standard szórás 15% alá csökkent.
1N SásfedőTsresztköfes
Az AC&AHSA. köiesonhatást tofembsfonketonális keresztkötő ágensekkel: staKlizáitnk. A kiindulási: Kegyet I órán keresztül itooháltuk 25°C-on, ami ó-szeresen hígitott szérumot, 25 nsM K£PES~ben oldott 1,25
109002- 1423/SÖ
VmM (+}, vagy 2,5 tsM. vagy 5 ntM ¢+-:--5-) sztrkctnlníidd-HN-mateissidöpröpioaamidrOrótxfecsefiséni <. xi i.s' (.t t+Mtl'1 vt D\. > > >.»ukv vet Ni ^311'i k'-'’m 3Í [ \-nmc lm. >m>n>xit»nd< > bes:a:etíiérigiíkoÍj--észíeRSM(FEGv, Thermo SclentiEc, Gat, No.221t)Sh 7,2-es- ptí-a iartaíínazutt. Áss el nem magáit keresztkötb mrslekulákaí 56 Λ trifihidróxhuetil&Ínirtonteiánnai t'IRlS, Ssgnaa-Aldrich, Cat. N0.T15Ö3) 3ö percig hkíkköliuk sXöbahőtnérséktea, Biotinált humán ACE ellenes kecske antitestet (R&D Systems Itse, Patt No.84í36Ó, ,22.6ag?tó) és íshntobílízált streptuvidin gyantát )Fterce, Gat Ne.: 20349) -adtok az efegyhez azért, hogy kikössük a kefeszíkoíoti Isrtnékekéí a gyanta felszínére. A vak 22,6 ng.üsi nem specifikus kecske ígG-t tartalmazott ACE specifikus antitest helyett. Egész, éjszakán át tartó szöbahőmérséklsfü Inkubáció után a gyantát S-ször mostuk 25 mM HEFES-sei, pH: 7,2. A. megtisztított fehérjéket elualíuk a gyantáról 10 perces tűzéssel 2x SDS sríimspufferben tSlgma-AIdrteh, Cet No,S3401).. A koreszikötött fehérjéket Wesíern-bloí analízissel tettük láthatóvá 5- 15%-os gradiens gélelekteaferézis után (Mnfi-Proíean TG.N Ereeast Cél, Gat 00,450-1086, Sio-Rad Laherstories Inc.), Az elsődleges antitest 1:1000 híghású: kecse antl-ACE antitest (Patt. No, 841365; FfeD Systems Inc.), a másodlagos 1::40000 inghasd peroxidaz: koajagáit kecske ellenes antitest volt, A biotöt zöld színre érzékeny röntgen filmre hívtuk elő (Frimax Berlin GmbH, Gat. No, 7) Waste .1.. igbímng P1 us-£C E reagens .segítségével: (Eerkln Elmér Irfe Sciences, Cat, No. NEt 10400).
1-7-1 Nlp^üngggruntés. HEAfiergS^kOróse
Az előző kísérletei: teljes szérum helyed FISA-vai és 100 kfe-os pomsutéreten ukraszürt szérummal is elvégeztük. A kiindulási: reakcióelegy SD-szeresére hígított szűrt széruméi, 0 mgónl (+), vagy 24 mgórd vagy 48 mglml (-5-5-5-) SSA-t és 5 IhAl SMliFEGfi-t tartslmazötí 25mM HEP.ES pufferbeu 7..2 ipli-n. A következő lépések megegyeztek a Rorábbtta leírtakkal. A Western-biot előhívása után a membránról az antitesteket eiíávr-lhrsttnlc 20 pere alatt 60aC-on ..stripíng” puEerbeu, ami {% nátrinm-dodseOsznlIáfet <SD'S·, Serva, Gd \k- .VTCí,, 20 niM Dl -d nonenolt (Difi, Emma \ldrcb. ( „í \e£h,''N) tartalma. o« udfi [n, purferben, 7,5-s pli-n.. Az előhívást protokollt megismételtük bfetináh humán szérum albmnln elleni, 1:50 -806 aranyban htgitett elsődleges antitestben: (Exbfe Frába, Cat Nu..fB-257-CÍC0) és ICA® 000 arányban hígítod símptavidfe-peroxidázzal (ásekson, Cat. Ne.0í 6-030-084) szert, hegy perexidází kapcsoljunk a komplexhez.
1,.7.2 .Rekotnhhdm^
Rekcmbináns ACE-HSA kölcsönhatási vizsgáltuk EL1SA lemez felszínén (Gremer Bio-One; Cat. NO.Ő55Ö6I). 300 μί fesziét púderben (FBÓ píi 7,2,. tartalma: KGI 2,7 mM, ORFö^ 1,5 stM, NaGÍ 137 tuM, NafiíFGif 8 tuM) feloldott fefeus HSA-t adtunk a zsebekbe és egész: éjszakán &t fekubáltsk szobahőmérsékleten hegy a HSA a lemez felszínéhez kötődjön. EBS-sel történő mosás után 100 gl 625 pM SMíFEGjc-öt és SMP£G:i2-t -adtok a zsebekbe, és 30 percig ískubáhuk a: lemezt, Alapos mosás után 100 pl 260 ngími rekombínáns ACE-t adtunk a zsebekbe (Rá® Sysiems, Fart Nö,84l3é7) 1 -óráig. 100 gl bioíír-áh kecskében termett humán ACE ellenes antitestet (F&D Systeiss Inc. Part bio.84l36ó, 22,ő ugród) adtunk: a lemezhez 2 órára mosás után. Mosási követően 100 pl strepiavidinnei konjugáll tonna puroxídárt (R&D Systems. Part Nö,$OOíSÓ3) adtunk 30 percre a wltekbez; Végezetül a kikötött. ACE - defekcíős anlhest - streptavidm IIRP komplexet szuhsztrát cklao&I tettük láthatóvá (amely 80 tnM eceísavat, 0,4 mgóní ie.tratttetil-bertzidiot, 0,Ső uM l'EO;-t tartalmazott) 380 om-en piaié rendet segítségével.. KoníroOként:a keresztköfe ágenst hiokhoituk ΙΟΟμΙ üfihnM'-osTris-HCi oldattal (2, esztop), vagy kihunytuk:az:eiégybőf (3. oszlop), Anc-m specifikus kötődést 1%~ •m zsclat'u oidattró ζ5 ev!>'p\\y\ ik,-,.; tkom b nsknksvs nCkui 11 o\Jop> tes/telm». ífezuss kontrollként egy szendvics ELISA-í készuettok a keteskedéhtu forgaíostban kapható EtJS.A kp segítségévek A irtéréseket
100902-1423; SG 'λ!
mjnása esetben triplíkátuxnokhsst végeztük.
S RdSABbíntogACT
Rekombmans ACE-t: a Ssc-te-Bas Topo evpresszlös rendszerrel készítettünk ííaviirege®, Cat. Ne. Al 1101}:, a gyártő utasítása szerint, RrMáss: a kérniaiiaig kompetens .£ <:<>&· törzset (lavitmgea, Gat. 10 No.G8620-Ö3) ACE gént íurtalmazó pinzmlddal: transzEirntálumk: (íaeneCopoeia;. Cat.. No. EX--T7349-Í91}, Amíbbtikutn szelekciót és ptoald szélsőét követően az: ACE gént tartalmazó pEasíSae konstrukciót DH1 OBac kompetens £. coll ((nvitrogem Cat. Ne. 18361-012} törzsbe öarasfőriaáítuk, hogy reEaotbtaáns baktnidot készítsünk., A baktnid DNS-t SE-9 rovarsepekhe (invlírogea, Cat No. :0362-100} írmu./föktahnk. ami baknievirasl: termek belőle. További SE-9 sejteket fertőztünk ezzel a baknlov hússal, Á 4. napon a rovarsejteket feeerttrifcgáliuk (1 ÖQO g, 1b perc, 4°C), a pelletst pedig PBS-bes mostuk, hogy a scjtien vésztő médiumot eltávolltssk. A peileieí RIEA. püffedjen (50 ssM Eris, 150: mM: NaCk f*A Triton A 100. 0,1% SDS, Né deoxikőlsavj homogenizáltuk azonikátor segítségévei, A feiüiúszót összeguutotíok O 500 g, 10 pere, 4°C) és egy auitm-essrélő oszlopra (Rnauer, Biotbs 40 psn Q anion exclumge coltunn, cat. no.Y4öt 1) injektáltuk 25 mM HEPES-t, 15 arM NaCl-t pH:~8,2-n tarialamö oldatban. AzACE-t gradaábsaít növekvő koncentrációjú NeCi oldattal eluálfak (tők mM-rél 540 mM-mg tsz összegyűjtött Irakclókből ACE aktivitás méréssel határoztak még az: ACE csúcsot.
A meghatározást szérumot (különböző hígításba®), ö,i mM szabsztrátot. (PAPélG. H- (3-(2Euril}akryloylj-l..-f«niiniayfl-glycil-:gÍyeiiO, 3ÖÖ mM Na€i-i és 25 mM HEPES-í (442- (Eds»xieui}uli>erazin-1etáoszalfeusav) tartalmaző. pH-:8,2-es oldatba® végeztük, λ mérések?’ 56-ivukj wBelonszökken kGien„r Slö-OneG 200: vagy 300 μΙ-ss- végtérfogsibs® végeztük. A37“G-on mért ontlkai denzítás csökkenését NovoSáar „plate render” által 340 nm-ers őeiékiáltnR. Az optikai deszkás csökkenését egyenessel illesztettük (értékekei eiiogadtefe, ha az illesztés r>0,9). Az, ACE aktivitást az alábbiak szerint számítóitok (7, egyenlőt):
Aktivstús-rfdí.HNbő, 133}^ 1993,742*0 (7) ahol es az optikai deszkás csökkenésének meredeksége, ODÖ a kiindulási optikai öenzltas, 0,133 a merőpnfíér deuzháss (25 mM HEPES és 30S: mM NaCl), 1093,792 pedig a szubsztrát teljés kondását kísérő OO változás. Bt lúgitási tálkor,
A kiindulási jellemzőkéi ebi-négyzet, teszttel vagy Fishez-féle exakt teszttel (minőségi tulajdonságok) hasonlítottuk össze, míg Ssndeni-íéle t tesztet vagy Msna-Whitnev li tesztet alkalmaztunk a mennyiségi vábozók értékelésére. SPSS 15.0-s statisztikai programcsomagot iSPSS 35 Inc., Chicago, II.. ESAs használtunk és p<O.OS szignifíkmtcia határt használtok.
TERMÉKFEJEESZFÉS
A találmánynak megfelelő műszer
A találmánynak tuegtéieiő mérőmttezer tartalmaz legalább két, lehetőleg egymásnak megfelelő minta befogadására alkalmas míníabefhgadé egységet, A mmtabefogaáő egység több mintát egyszerre belbgadut képes tárölöí: tartalmaz.-A miotaíároió arra van tervezve, hogy különböző térfogán) mimákat tudjon befogadni.
A mérőműszer tartalmaz egy hígító egységet amely kiilörsböző reagenseket tud a mintatárolőba juttatni. A blgitást követő keverés a berendezés által biztosítva var·. Ez az adagoló által valamiül s tártdó alakjával is: megvalósítható. Lehetőleg a tároló kerek alakú legyen, ezzel elkerülve a keveredő helyek lériejőttét.
Í09902-14237SO
A mérőműszerre jstenzó spéci fik »g tolnidonságök:
A mérőntttszer iart&imsz egy dstskefes rendszert, .mi dstektáini és követni képes egy «tóm reakciói, ezáltal enzim Jaio avt atomi. A dstekcfes rettoszer lehet egy spektrofctométeres rendszer, amely például tartalmaz egy lénytórtásí és egy detektor;, vagy lefest egy fluoreszcens detekdós resstaep vagy egy VV-LF (üV-VÍS) tletekolös rendszer is, adói függően, hogy milyenek & reakció komponense; és/vagy a reakció termékei vagy bármilyen egyéb módszerrel amellyel enzim akti vitás mérhcíő, A detekeiós rendszerben: lehetőleg az enzim szabsztráljának konverzióié; a sznbsztrát vagy a reakció tennék alapján követjük.
Egy előnyös változat egy lemezleoivasö i„pk;to renden) kombinálva egy vagy több keverő egységgel és putnparendszerrel szert, hogy a bigito oldatot és/vagy a reakció komponenseit & megfelelő helyre juttassa puí&reit kőrütntonyek mellett.
Egy előnyős megvalósítási mód szerit» a inirtiatiaoló küvstsa. Ebben az értelemben egy lemez zsebe megfeleli egy követtáoak lemezleoivasö esetében. Egy előnyős megvalósítási módban a küvettáknak különböző térfogatai vannak, mivel a küvetía lényét itosszának aránya különböző térfogatok esetén kisebb, totót a térfogatoknak az aránya. Lehetőleg a fettyütbosszak ősszehasonifebatoak vagy megközelítőiig egyformák, mivel a térfogatok nagymértékben különbőznek.
A mérőműszer lehetőség szerint egy adatfeldolgozó egységgel is fel van szerelve, vagy egy feldolgozó és adattároló egységgel. Ezek az egységek működőképes összeköttetésben állnak a taláimány mérőműszerével. Az adattároló egység tartalmaz égy szoftvert, ami alkalmas arra, hogy:
a hígító egységet vezérelje a megfelelő hígítások érdekében, és/vagy adatokat nyerjen a detektor egységből és/vagy elvégezze a szükséges számításokat a találmány módszerleírásának megfelelően.
Ezek által kívánt esetben a mérőműszer teljesen automatikusan működik.
A találmány tárgyát: előnyösen: reagensek vagy alkotóelemek (komponensek) is képezik, melyeket enzim szabsztráfomokhői, enzimekből, ezek inhibitoraiból, hígító puííerekböl, reakció pafferckhöl választunk. Lehetőleg az alkotóelemek készlet (kit) formában vannak, előnyösen a készülékkel együtt, vagy egy megfelelő részévei együtt, pl. küvettával vagy adathordozóval, amely programmal van ellátva.
Egy előnyös megvalósítási :möd szerint a minta vagy a mintavételi cső léi van címkézve például vönsiköddal, és. a műszer fel van szerelve: egy kádoívasővak ami együttműködik a feldolgozó egységgel. Ezáltal a mérőműszer automatikusan képes defenák» a higitáss faktort és a gátlás! szintet.
.fez A€E~gáíiők tekintetében a. laláíinám meszes áll a .gyakorlati alkalstazásro. Ez a megoldás: különöse» piefortife. Szakeínber képes arra, hogy bevezesse a módszert egyéb célpontokra is pl. eazimfohibiíor-párok esetem. Ebben az esetben a módszert, különös tekintettel a detekeióra, optimalizálni keli.
További fejlesztések kanbovaszkuíáris páciensek tompiáját célozhatják, például és konkrétat; ACE, HkfG-CoA-rednktáz., rennia és Vagy dipeptidil-peptíöáz-4 szolga lkainak célként. .A fejlesztés további területe lehet a pszichiátriai vagy pszichoszomatikus betegségekben alkalmazott enzmtimnbitorok.
EREDM ENV EK ÖSSZEFOGLALÁS A
A találmányban leírt módszer használhatóságát azACEi terápián bizonyítottak. 501 magas vémyotnásssl rendelkező betegből álló kohódban ?$? beteg szántára ACE-gsdó van felírva terápiaként. A módszert ezeken a betegeké» teszteltük, es a 387 beteg 82%-nái megfelelő gátióhatást taiáitonk. Az elégtelen gáílőhatással rendelkező betegek esetében kísérteiét tettünk az okok megállapítására. Ezeket a betegeket, megkerestük, és lÖfolOE-hOj/SG felhívtuk a Ggyeitnöket az ACE-gátlő terápia fontosságára. Tájekoz-tattuk őket, hegy a terápiájuk a méréseink szerint eiégieiets hatékonyságú és vlsszsihiviuk őket LöjwH vizsgálatra, ,¾ betegek 45%~a sem jött el a kontrolira. Az ACEi dózisának emelése a betegek föN-nál. eredményre vezeteti. A betegek 1770-ánái a. kontroli vizsgálaton tnár kielégítő gátíóhatás volt mérhető, másik 17% esetében .a mellékhatások miatt: más gyógyszerre kellett váltam. A betegek léf-s-nál nem. találtak meg: a hatástalan ACE-gátíás okát. ezekben- az esetekben az M ki tet.tpt.3 med'\fö,:VtÍjzv.iM?!tuk
A betegek vérnyomása erős kmrelámőt mutatott a hatásos: gátlással (9. ábra.)
IPARÍFEÍKASZNÁLHATÓSAG
Jelen lalálmány alkalmas atzm tmgy neveljük enzirngásló gyógyszere' „{ {\»u. vi pu. uoo v< t a! \ sem kielégítő terápia nagy terhet jelent a szociális síppá egészségagyi rendszerűek, ezáltal a személyre szabott kezelésnek jelentős gazdasági szerepe növekszik. Bűnek első lépése a eljárásban lévő, vagy tervezett terápia hatékonyságának becslése, leien találmány jelentősen hozzájárulhat ebbe.?, a lépésbe? azáltal, hogy egy egyszerű, porenciálisan egylépéses, egymhrtás módszert nyújt egy enzim mnibitm \ \>p r hatékonyságának mérésére, különösen az ACEI terápiára. Sót túl több, a találmány lehetőséget nyírit hogy beállítsak és optimalizáltuk a beteg terápiás regimentjét staélkák hogy a beteget feleslegesen terhelnénk, ezáltal növelve a beteg megfelelő hozzáállását a kezeléshez.
Általánosságban: a felálmány arra alkalmas, hogy hatékonyan: és egyszerűen vizsgáljuk, egy inlnbjtör jelenlétét vagy a- gádóhatás szintjét bármely minta esetén, mivel a módszer nem Igényel további mintát vagy kontrolit a beállítása «tán. Másrészről a találmányban leírt módszer elvégezhető reagensekkel például szuhszn itta' sm s általánosan használt egy adott enzim esetén. Mi vel lehetséges az automanzálás, ez a módszer anélkül is kivitelezhető, hogy drága vagy túlságosan specifikus berendezési igényelne..
HÍVAl'KGZÁSGK
1. Pfeítér MA. Braunwald E, Moye LA, et at. Edéét of csptepril on rnortahty and tuorhidlty in pattanta wnh leit v<ístté'tthír dvsijmatiou aftcr myocardial Införctfon. Results of the sarvivai enő veníriealar enlargement trial. I e b Ά E ίη\e^tsgatörs. ,N Esgi JMetS 1992:;327:őá9~77.
.. Ccn el P, Mu'uaá A, Soubrier E, Wllhstntí TA., Recést advaaees; in knowleáge ot the struviure and fesetmu oí the angmtensm 1 eepverting eszysrte, J Hyperífitts Srtppl 1995; IXS3-lő.
X Hóhért C. TToaot AM> Coryol P, Sonbtier f, Strueture oí the angioteosin I-eonverting enzyme gene. ivó aitennate pm moréra eorrespojíd te evoláueuary steps of a duplicateá gene. J Bioi Chem 1991:2öő: 15377-83.
4. Oppong SY, Ifeoper N'Mi Lbaraeienzatios of a secretase aeílviíy wfeieb refettses: augiotensimeonverting errzyme ften; t'ue. memlmme, Biochem ,1 1993::292 ( Pt 2);597-öÖ3.
5, Weíi L, Alherto-Gdas F, Soshrser E, Mfehaud A, Cotvol P, Cianset E. Expresston ásd characterizaüon of recmrsbinam; humán augiotensiml ooavsróng enzyme.. Evidenee fer a C-termm&i tmusmembrane ancbor and tor a. proteolytk'. pzoeesstug of the seereteá rfö;.mnbin;mt and plssma enzymes á Biel Chem 1991 ;2f>6; 5540-6
ó. í v.\ KM rtíkaey el permdoprd m n'dnetmn of eardwaseol ír evems ameng pattom* ndh sttbie emvnms sríery diseaser razsdornised, doubfc-biisd, plaoebo-coatrolied:, nmlííeenbe trial (tbc EURÓPA síudys. Láncét 2M13;7b2::7$2-8.
7, s \ mo 't' H eus < t >ri t»e íme r 'ti b- nop ’ í r< írmMkrn I gLsv. G m «< te v sgh iütnyuk váílidravm six tveeks;.ate aome ntyocaröku itstarcHoo: the GíSSI-3 tnal. Gruppé ítaliano per Itt Slndlo ílelia
Sepravvíveuza nelflnferio Mioeardico. J Ast Col! Csrdiot 1 996:23:337-44.
9. ISÍS-4-: a. rsddorsised feefcífel írtai assessiag: early őrsi eaplopríl, őrsi monersitrafe, and iatesvösess oagáesiuaa sslphaíe in 58,030 padents sfeb saspeeted: aeute? uivocardial Inlsreden. ÍSÍS-4 (Főúrid ísíeraadonsl Smdy of leiarct Survival) Colhihoíabve Oxoup:, Lanee! 1995:345:069-:80.
9. Cohn JN, Johnson G, Zxesehe S, «5 ab A cooipatison ot easlapríl wöfefeyrirslazmo-Koserbfes dináraié fe ibe treanneni of chxonie congestive heart fadm's. fe Eogl .1 Msd Í99!;325:393-tö.
10. Greenbetg B, Qainenes MA, Korlpilkd C, ot al. Effocss of lougrierm? enalapdl feerapy on cardlac feructure and fonotton in padom» wish lob veatricnlar dysftstetton, Réséit» of íhe &GLVD ochosardlography »nbsnjdy.. Ctrenbhon Ι9Ο£«| 253-M
11. tnders 9, Sebraáer J, Beígér 3, et al. The PHAEAÖ síudy: prevondoa of hypertesfeot; wtfe tlre angfetonsiíreoavertirsg eazytee inhibitor mndprtl ® partém» wltd higE-norma! blood presssre; a prospsedve, raudsröteed, eoadolfed prevenilon tria! of fee 1 Hermán Bypertessiort Leaape. .1 Bypestetís 2008;26: 1487-96,
12: Cospídá C, Maiesaa ML, Valagsssa L, sí al. Comparatívo efiberi of oandesaríaa sad vas topéi on leit: venírtoelar hyperireplty $® parteat» Wd essead&l Itypertenalon: ihe -candestixtoa messjnextt in tbe íreatnatto of caídsae Eypertrophy tCAfClí) síndy ,í Byperte?aa 2902:20:2293-300.
13. Raggenenh P, Fassi A, fiiévá AP, eí al, Frevendng. mJemihiminuíia fa type 2 diabete». N bogi 5 Msd 2094:35 i: 1941-51.
14. Hoogwerí BJ. Youag 3B. The fföPE adidy. Ramipril lomered eardíövaseaiar risk, hűi vitssoin E did Pót, Cleve Clin J Med 2900;67:28-<·3
15. Rigát B, Habért £, Altome-o-eris E, Cambien E, Corvol P, Swbder E. Aa toserdon/defertört polyaiorpdisjn in ihe angtoíensin 1-eonvsrdng eszme gene acceimdag íor fedi Ere vartasee of aeram ensyme leveri. 3 Cd® lovsai 1990:80:1343-6,
16. Cambien F, PbJrtor ö, Eecerf L, el: ah Delefem pelymorphism in ide gess fór artgloieasloOesvorísng «rtzyme ás a potom rssk feetor far rnyacardlal mrixcítoa. riafere 1992;359:641-4.
17. Sfessaes JA, 'Wbng JQ GrsoecltirsC, et al, The deledösdasePioa polymorpririm of Ide angistensin eenverdsg etízyfito gese and c&srisovaseidar-rensl nsk, J Sypsriens 1997; 15:1579-92.
18. Lsadpsfeíneí· Κ» Ffeffer MA». Kieste R, et al, A prospeedve evaluaöon of an tsagjötonsín-öoawöögr^^jróe. gesre polymorpbisai and the risk ofriehesííe hsad disease. Mfrigid Mcd 1995:332:706-11.
19. fersírsets C, Dsrdlov SM; Öeioum f, sí sí. Folsí maiadon Ja ihe stslk of angioíensfe-converdrtg eozytne estise» a drámádé bíerease fe sertsn aogietesisls-oeovertlng: enzysne bst no oardievascoísr driease. Cricrtlarien 2901:104:1236-49:
20. Mesterovsich AB, Bogarth KI), Ádsrielsev VA,: et sl, Angidtonsm i-converdng eozyme maiadon i'l'rp 1197Stop) estise» a dnsando fecmtse dr blood ACE. EtoS Cfee 2S09;4:e8283.
21. ^emmier A, Sióm R\\. triplán I fe.nifev SM, kloekgetber I f írnsbank M. Heredí'art fetpoi-ACl' erm.s dnstö fee Pí'ol 1991..eu muiatíouof somatic ACE as a potonoal parii! tn di.toaosrs; a Orsi: iainíly ostslde Enrope. Cbs Chem LabMed 2006;44; 1088-9.
22. Litmefemk M, Ke»per K, ,le«b M. et al. ífeeditan e et n\ n f angioíensig eopverímg enzyste asggesting nesrosamoidosís:. blenrolpgy 2003:61? 1819-20.
23. Eyrfes M?. Mlohaud A, 'Deitium 3, et al. locreased shedding of angrotensla-coaverdng onzyrae bv a írutodioo ídenidied !:?, ihe slatlk region, .1 Btol Chem 2091:2^6:5525-32,
199992-1423/SC
5:5
24, Uebennaa .1, Bsatlsr { Üeredíen of ssraaa angtemsiss-coaverthig esxyíse in Gasekefs dísease. hí Esgl .1 Med í$76;2$4:S442-4,
25, Siuddy P, Bírd B, Jutass DG Sérts® aagisfeasiu-eoavertíag eazyree (SACE) re sareredösis aaá olher grutrelerestot-s disarders. Laseet 1678:2433 1-4.
26, fhres&r Ali, Beiarea .1, Österöp AP, Adraréaa! PJ, Sehslekarep MA, A>eSmm ϊ to asgísíensls: M caftversíoa la tóé breare; -feröan® aad lég. Eílect e l tóé saatóiensi® esnverőag eszysre gsss iaseAlan/delsdöa ptóyreorphAni, .1 Myperteas 199$; 174867-72.
26. vsa Dók MA Krooa 1, R;nnper AM. Bconasma 1\ Dasser AH, Csatig PC. The angwler^tn-cen'.crtmg eszyme gene puiynuirphisni and tesponses io angíoteasins a®d hradykiaia is tóé barna® rerearm, j Cardunasc Ptemacoi 2öd0;35;484-96.
28. Llebensua 3, S&sire A. As axíghjtessia-eouvsríreg eszyw i ACfc) rtórbasr 'ín hstsaa serre® Iscressed ssssiiivity csf Ibe sernm ACE aasay ibr deiestisg aeíivs sarctódosi.y Cbesí ΐ«*ο.$ό.$Ν*-?5.
189962-1423/861
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOKL asgiotenzm konvertáló enzim (ACE) reverzibilis gátlása szintjének megállapítására, amely eljárásban;(a) legalább egy kiindulási mintát nyerünk, (bí legalább ké; alsquotot vesztlak: a legalább egy kiindulási mintából, (ö) reakcióeíegyeket késztihnk, amelyek: az ollqöötokat és kívánt esetben más tsikoíOkal tartalmaznak, miáltal ezen aHqoototó különböző hilíásgi fektotokka] higlfiok, és ily módon bmositjuk, hogy a hígítás hatására ezen reakclóeiegyekben különböze arányban fordul eiö az ACE aktív és gátolt alakja amennyiben ACE inhibitor van jelen a legalább egy kiindulási mintában, (d) mérjük az. ACE aktivitását ezen reakcióé legyekben, nnákal mért ACE aktivitás-értékeket tiverünk.(e.s a mért ACE aktivitás-értékeket megszorozzuk a rseksk megfeleld hlgltásí Viktorokkal, miáltal számítottACE aktivitás-értékeket kapunk, (1) megállapítjuk & legalább egy kiindulási mintában jelen lévé reverzibilis ACE gátlás szintjét azáltal, hogy a különböző higitási faktorokkal hígított: aüquotokro a száraitok ACE: akoivhás-értékek között; eltérés összefüggés! mutat a revetzsbilis gátlás szintjével, abol a bígítási faktorok ágy vannak íuegöatározva, hogy a számított eoziusakíivítás-értékek statisztikailag jelentős mértékben különböznek, amikor a magas hígítás! lakion; értéket összehasöríilijnk az alacsony hígítást lakion! értékkel, amikor az; inhibitor jelen van a reascióeiegybem
- 2, Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az ACE jelen van az említett legalább egy mintában,
- 3, Az 1, igénypont szerimí eljárás, ahol azACE-t a reakcióé légyhez további alkotórészként adj nk hozzá,
- 4. Az 1-3. Igénypontok baromlvíke szét int; eljárás, ahol a legalább egy kiindulási minta biológiai minim amelyet egy biológiai szerveseitől nyerőnk, vagy biológiai mintából állítjuk elő.
- 5. A 4, igénypont szerinti eljárás, ahol a legalább egy kiindulási minta vér, vagy vérből száímáztk,ö. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a legalább egy kiindulási minta mikroorganizmusok közreműködésével keletkezeit,
- 7, Az 1-3. Igénypomok bánnelyske szerinti eljárás, ahol a legalább egy kiindulási mustét az i-süsblior termelésére vagy kifejlesztésére alkalmazott -eljárás során nyerjtik.
- 8, Az 1-7. igénypontok bármely lse szersstli eljárás, ahol az eljárást gyógyszeres terápia hatékonyságának megállaplíásásr; végezzük,
- 9, Az t-8. igényportKsk bármelyike szerint; eljárás, ahol a hígítás! faktorokat ügy határttzzuk meg, hogy a számítod ACE akti vitás-értékek legalább S-szSrös vagy nagyobb, előnyösebben legalább lö-szeres vagy’ uagyebb különbséget kapunk a számítod. ACE aktivitás-értékekben, amikor a magas higitási faktora értéket ősszebasonliijnb az alacsony hlgltásí faktoré értékkel, ometmyiben ACE inhibitor van jelen a reakcióelegyben.fik A 9, Igénypont szerinti eljárás, ahol az említett hlgltásí faktorokat a legalább egy kiindulási minta előre meghatározott mhjhfier koneeniráelöja és az ACE inhifaltorral történő gátlásársak előre megl;atározoít dózis-hasas összefüggése alapján határozzak' meg,Π, A 9. igénypont szeműi eijá a , ,nos u crniitett hígítást faktorokat kísérletes ötön határozzuk meg ágy·; hogy különböző higitási faktorokat havrahrk egy. az 1. igénypontban deftmáli eljárásban,
- 12, ACE szubsztrásjánok és adott esetben további reagenseknek az sikatetazása az 1-11. igénypontok1Ö9902-H23SÖ ?120ö2í!9 bármelyike szerinti epárásban nz ACE. említett iah^kemiü történő reverzibilis gátlása szintiének meghatározására,IX Izolál- ACE aikaltnazása tíz 1-1 i. igényponíok bármelyike szerint; eljárásban az ACE inhibitora ábnis reverzibilis gátlásának megái iapitásávni gyógyszeres terápia hatékonyságának megállapítására, ahol az: izolált enzim emikeit inhibitora gyógyszer,
- 14, A 13 , igénypont szerinti alkalmazás, ahol az izolált A CB tisztitött vagy rekombináns,
- 15. Szöbszízátokfől különböző reagensek alkalmazása az 1-li. igénypontok bármelyike szerinti eitáíásbast az ACE aktivitásának utegbatátozására, ló. KészSiék az ACE inhibitor álfáit teverzlbdk- enz-mgáőas mértékének meghatározására az 1-15. igénypontok bármely lsében megbatározott módon, amvb koszé tök uirtatsnaz:- eszközt legalább két aliqnot fogadására, vagy vételére legalább egy kiindulási mintából,- eszközt további komponensek hozzáadására az aliqootokhoz reakcióé legyek; iétrebozására,- eszközt a reakoióeísgyek hígítására különböző hígítást Shkíorehkak- eszközt az ACB említett: reakeiéelegyben történő aktivitásának mérésére a mért aktivitás-értékek meghatározására,- eszközt a legalább egy kimániásl mintában jelen lévő reverzibi lis gátlás mértékének meghatározására, amely adatfeldolgozó egységgel és adattároló egységgel is fel van szerelve, amelyek működőképes összeköttetésben állnak a találmány mérőműszerével, és az sdattarölő égység tartalmaz programot, ami alkebna·, ara, hogy:- ehege.vv λ szükséges számitásokat az 1, igénypontnak megfelelően a mért ACE aktivitás-értékek megfelelő higifási fehíötral történő szorzásává! és Így számított ACE aktivitás-értékek eiöállitásávtth almi az így számított ACE aktivitás értékek közötti eltérés összefüggést motat a reverzibilis gátlás szintjével.
- 17. Készlet alkalmazása az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban az ACE inhibitora általi reverzibilis gátlása mértékének megabatározására, amely készlet tartalmaz:- adott esetben a 16. igénypontnak szerinti készüléket.- az ACB sztsbsztráíját,- adott esetben az ACE-· izolált tormában,- átlőtt esetben az ACE egy inhibitorát,- adott esetben egy higttöpulfert.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU1200299A HU230404B1 (hu) | 2012-05-18 | 2012-05-18 | Hígításon alapuló gátlóhatást mérő módszer |
| SI201331634T SI2664920T1 (sl) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Preizkus zaviranja na temelju razredčila |
| EP13168263.5A EP2664920B1 (en) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Dilution based inhibition assay |
| PL13168263T PL2664920T3 (pl) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Test hamowania oparty na rozcieńczeniu |
| HUE13168263A HUE047866T2 (hu) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Hígításalapú inhibíciós vizsgálat |
| DK13168263.5T DK2664920T3 (da) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Fortyndingsbaseret inhibitionsassay |
| ES13168263T ES2761897T3 (es) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Ensayo de inhibición basado en dilución |
| RS20191586A RS59757B1 (sr) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Test inhibicije zasnovan na razblaženju |
| HRP20192205TT HRP20192205T1 (hr) | 2012-05-18 | 2019-12-09 | Test inhibicije na bazi razrjeđivanja |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU1200299A HU230404B1 (hu) | 2012-05-18 | 2012-05-18 | Hígításon alapuló gátlóhatást mérő módszer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP1200299A2 HUP1200299A2 (en) | 2013-11-28 |
| HU230404B1 true HU230404B1 (hu) | 2016-04-28 |
Family
ID=89990739
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU1200299A HU230404B1 (hu) | 2012-05-18 | 2012-05-18 | Hígításon alapuló gátlóhatást mérő módszer |
| HUE13168263A HUE047866T2 (hu) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Hígításalapú inhibíciós vizsgálat |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HUE13168263A HUE047866T2 (hu) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | Hígításalapú inhibíciós vizsgálat |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2664920B1 (hu) |
| DK (1) | DK2664920T3 (hu) |
| ES (1) | ES2761897T3 (hu) |
| HR (1) | HRP20192205T1 (hu) |
| HU (2) | HU230404B1 (hu) |
| PL (1) | PL2664920T3 (hu) |
| RS (1) | RS59757B1 (hu) |
| SI (1) | SI2664920T1 (hu) |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8629312D0 (en) | 1986-12-08 | 1987-01-14 | Deacon B | Fastening devices |
| US5260872A (en) * | 1991-10-04 | 1993-11-09 | Abbott Laboratories | Automated testing system |
| EP0711838B2 (de) | 1994-11-10 | 2007-06-20 | Dade Behring Marburg GmbH | Verfahren zum spezifischen Nachweis eines aktivierten Gerinnungsfaktors V mit einer erhöhten Stabilität gegenüber aktiviertem Protein C |
| WO2001085985A1 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-15 | United States Army Medical Research And Material Command | Assay for detecting, measuring and monitoring the activities and concentrations of proteins and methods of use thereof |
| US6586198B2 (en) * | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Vanderbilt University | Method of identifying susceptibility to angiotensin converting enzyme inhibto- and vasopeptidase-inhibitor-associated angioedema |
| WO2003025561A1 (fr) | 2001-09-14 | 2003-03-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de mesure simultanee de la valeur rb et du taux de liaison aux proteines plasmatiques |
| US6821744B2 (en) | 2002-10-29 | 2004-11-23 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method, assay, and kit for quantifying HIV protease inhibitors |
| WO2007059966A1 (en) * | 2005-11-23 | 2007-05-31 | Georg Dewald | Detection and treatment of drug associated angioedema |
-
2012
- 2012-05-18 HU HU1200299A patent/HU230404B1/hu not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-05-17 EP EP13168263.5A patent/EP2664920B1/en active Active
- 2013-05-17 ES ES13168263T patent/ES2761897T3/es active Active
- 2013-05-17 DK DK13168263.5T patent/DK2664920T3/da active
- 2013-05-17 HU HUE13168263A patent/HUE047866T2/hu unknown
- 2013-05-17 RS RS20191586A patent/RS59757B1/sr unknown
- 2013-05-17 SI SI201331634T patent/SI2664920T1/sl unknown
- 2013-05-17 PL PL13168263T patent/PL2664920T3/pl unknown
-
2019
- 2019-12-09 HR HRP20192205TT patent/HRP20192205T1/hr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2664920B1 (en) | 2019-09-18 |
| HUE047866T2 (hu) | 2020-05-28 |
| DK2664920T3 (da) | 2019-12-16 |
| SI2664920T1 (sl) | 2020-02-28 |
| ES2761897T3 (es) | 2020-05-21 |
| EP2664920A1 (en) | 2013-11-20 |
| PL2664920T3 (pl) | 2020-04-30 |
| HUP1200299A2 (en) | 2013-11-28 |
| RS59757B1 (sr) | 2020-02-28 |
| HRP20192205T1 (hr) | 2020-02-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Widjaja et al. | Inhibiting interleukin 11 signaling reduces hepatocyte death and liver fibrosis, inflammation, and steatosis in mouse models of nonalcoholic steatohepatitis | |
| Chung et al. | Endocrine-exocrine signaling drives obesity-associated pancreatic ductal adenocarcinoma | |
| Kone et al. | Protein interactions with nitric oxide synthases: controlling the right time, the right place, and the right amount of nitric oxide | |
| Baughman et al. | NeuCode proteomics reveals Bap1 regulation of metabolism | |
| Ludvigsen et al. | Expression and distribution of somatostatin receptor subtypes in the pancreatic islets of mice and rats | |
| US20180355008A1 (en) | Erythroferrone and erfe polypeptides and methods of regulating iron metabolism | |
| JP6565121B2 (ja) | 代謝障害を治療する方法 | |
| Cao et al. | Chronic administration of the nitroxyl donor 1-nitrosocyclo hexyl acetate limits left ventricular diastolic dysfunction in a mouse model of diabetes mellitus in vivo | |
| Glaser et al. | Linkage of metabolic defects to activated PIK3CA alleles in endothelial cells derived from lymphatic malformation | |
| Althurwi et al. | Early changes in cytochrome P450s and their associated arachidonic acid metabolites play a crucial role in the initiation of cardiac hypertrophy induced by isoproterenol | |
| Karlina et al. | Identification and characterization of distinct brown adipocyte subtypes in C57BL/6J mice | |
| Cyranka et al. | Abcc5 knockout mice have lower fat mass and increased levels of circulating GLP‐1 | |
| CA2557181A1 (en) | Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in muscle cells | |
| Brunt et al. | Heme oxygenase-1 inhibits pro-oxidant induced hypertrophy in HL-1 cardiomyocytes | |
| Li et al. | Perivascular adipose tissue‐derived relaxing factors: release by peptide agonists via proteinase‐activated receptor‐2 (PAR2) and non‐PAR2 mechanisms | |
| Akagi et al. | Type XVI collagen is expressed in factor XIIIa+ monocyte-derived dermal dendrocytes and constitutes a potential substrate for factor XIIIa | |
| EA010860B1 (ru) | Антиинфарктные молекулы | |
| HU230404B1 (hu) | Hígításon alapuló gátlóhatást mérő módszer | |
| Zhao et al. | Variations of thioredoxin system contributes to increased susceptibility to apoptosis in cardiomyocytes of type 2 diabetic rats | |
| CN106699867B (zh) | 一种Leg1蛋白、Leg1基因及其在非人类中的应用 | |
| CN106883294B (zh) | 一种hLeg1蛋白及其应用和药物 | |
| Freitas et al. | TCTEX1D4 interactome in human testis: unraveling the function of dynein light chain in spermatozoa | |
| Du et al. | Kv1. 5 channels are regulated by PKC-mediated endocytic degradation | |
| Ogunbiyi et al. | Bioactive compounds found in Cucumis sativus demonstrate optimal binding affinity to PTP1B. | |
| Alghanem et al. | Effect of Insulin and Pioglitazone on Protein Phosphatase 2A Interaction Partners in Primary Human Skeletal Muscle Cells Derived from Obese Insulin-Resistant Participants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FH91 | Appointment of a representative |
Representative=s name: DANUBIA SZABADALMI ES JOGI IRODA KFT., HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |