EA010860B1 - Антиинфарктные молекулы - Google Patents

Антиинфарктные молекулы Download PDF

Info

Publication number
EA010860B1
EA010860B1 EA200401032A EA200401032A EA010860B1 EA 010860 B1 EA010860 B1 EA 010860B1 EA 200401032 A EA200401032 A EA 200401032A EA 200401032 A EA200401032 A EA 200401032A EA 010860 B1 EA010860 B1 EA 010860B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
animal
molecule
sample
infarction
hibernation
Prior art date
Application number
EA200401032A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401032A1 (ru
Inventor
Джеймс Э. Скиннер
Джерри М. Анчин
Original Assignee
Викор Текнолоджиз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Викор Текнолоджиз, Инк. filed Critical Викор Текнолоджиз, Инк.
Publication of EA200401032A1 publication Critical patent/EA200401032A1/ru
Publication of EA010860B1 publication Critical patent/EA010860B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/18—Kallidins; Bradykinins; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9453—Cardioregulators, e.g. antihypotensives, antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Abstract

Раскрываются композиции и способы лечения ишемии и молекулы, относящиеся к состояниям гибернации.

Description

Настоящая заявка заявляет приоритет согласно предварительной заявке США № 60/354,678, поданной 6 февраля 2002 года, предварительной заявке США № 60/392,133, поданной 28 июня 2002 года, и предварительной заявке США № 60/429,278, поданной 25 ноября 2002 года. Предварительные заявки 60/354,678, 60/392,133 и 60/429,278 все включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте.
Предпосылки изобретения
Многие небольшие и среднего размера млекопитающие, обитающие в холодных регионах, вступают в длительное и контролируемое состояние спячки (гибернации) в течение зимних месяцев, когда пища становится менее доступной. Действительные гибернаторы, такие как суслики, лесные сурки и мыши, готовятся к зимней спячке, накапливая большие количества жира в организме. Некоторые, такие как лесные сурки, также откладывают запасы пищи в своих норах. Когда животные впадают в гибернацию, у них происходят физиологические изменения. Снижается частота сердечных сокращений, происходят изменения метаболизма, и изменяется их способность к пробуждению.
В настоящей заявке раскрываются способы оценки состояния гибернации у млекопитающего в различное время в период гибернации. Настоящая заявка также раскрывает, что впадающие в зимнюю спячку животные могут пережить события пробуждения, скорее, в начале периода гибернации и в конце периода гибернации, чем в середине периода гибернации. Кроме того, раскрывается, что фракции плазмы, полученные от животных, находящихся в раннем состоянии гибернации, но не от животных, находящихся в среднем состоянии гибернации, содержат молекулы, оказывающие действие на ишемию в модели крыс и которые можно использовать для лечения ишемии. Кроме того, в данной заявке показано, что такие молекулы включают РРА и его производные, а также брадикинин и его производные.
Краткое описание изобретения
Раскрываются композиции и способы, которые в одном отношении относятся к зависящим от состояния способам определения интересующих молекул. Также раскрываются композиции и способы, которые в одном отношении относятся к молекулам, обладающим антиинфарктными и антиишемическими свойствами.
Следует понимать, что как приведенное выше общее описание, так и следующее далее подробное описание приводятся только в качестве примера и иллюстрации и не являются ограничением настоящего изобретения в том виде, как оно заявлено.
Краткое описание фигур
Прилагаемые фигуры, которые включены в данное описание и являются его частью, иллюстрируют некоторые варианты воплощения изобретения и вместе с описанием изобретения служат для объяснения его принципов.
Фиг. 1 показывает эффект пробуждения в ранний и поздний периоды гибернации на динамику сердечных сокращений и смертность у взрослых и молодых особей лесных сурков. Животных будили в середине декабря и в середине января путем вытягивания за лапы в течение 8 мин, пока животное не оказывалось на спине. Такой стимул в середине января приводил к сильной брадикардии и полному пробуждению, связанными с гибелью в течение 6-12 ч 4 из 4 особей. Стимул в середине декабря не приводил к пробуждению, брадикардии или гибели.
На фиг. 2 представлена идентификация зависящих от состояния белков в Ό2- и НЕ2-фракциях, как было выявлено в 2-мерных δΌδ-гелях. Два верхних блока показывают белки в состоянии #1 (ΝΕ2) и в состоянии #2 (Ό2, 02) с наложением сверху состояния #1 (правый верхний блок). При наложении только очень светлый эпицентр показан для каждого пятна состояния #1, оставляя его окружение, как это видно на схеме, от серого до белого. Увеличение, показанное в нижнем левом блоке, показывает сравнение при наложении состояния #1 на состояние #2 в области 32 кДа (очерченной), а увеличение, представленное в нижнем правом блоке, показывает такое же сравнение в области 66 кДа (очерчено). Эти пятна состояния #2 без соответствующего наложенного пятна являются, таким образом, опосредованными состоянием #2 (наклонные пунктирные маркеры). Один из эффектов таких зависящих от состояния белков можно видеть на моделях инсульта, представленных на фиг. 1. Диапазон р1 составил 4-7.
На фиг. 3 показана идентификация пятен методом ЖХ/М8/М8, при этом представляющие интерес пятна (обведены кружочком) являются специфическими либо для материала состояния #1 (ΝΕ2), либо для материала состояния #2 (Ό2). Представляющие интерес пятна расположены на 2-мерных ВАТ8гелях. ВЛТ8-гели являются менее чувствительными и количественными, чем 2О8Э8-гели (предыдущая фигура), поскольку только 9 зависящих от состояния пятен было обнаружено при диапазоне р1 4-7 (пара слева - 4, а пара справа - 7).
Фиг. 4 показывает Э2-специфическую молекулу, предотвращающую инсульт. Сравнения методом ВЛТ8 полос Ό2 с полосами 8А (контроль) и ΝΕ2 (его ближайший контроль) показывают три Э2-специфические молекулы (обведены кружочком). Три верхних среза показывают объем инфаркта в модели МСАО у мыши. Только ткань с функционирующими митохондриями принимала красное (темное) окрашивание ТТС (2%).
На фиг. 5 показано полученное при помощи компьютера сравнение 2Э-гелей. представляющих разные состояния. Э2-гель сравнивали с его ближайшим контролем ΝΕ2. Гели, содержащие С8Р и мочу (ги
- 1 010860 бернация), сравнивали с их полученными летом контролями. Каждую из 3 пар гелей подвергали компьютерной обработке для пространственного выравнивания пятен. Плотность серебряных вкраплений каждого пятна нормализовали к его собственному гелю для компенсации разницы концентраций в объемах жидкости (т.е. общее количество белка в каждом геле считалось постоянным). Затем подсчитывали разницу между каждой парой пятен. Пятна, содержащие более чем двукратное увеличение состояния #2 (гибернация), показаны в зеленом цвете. Те незначительные увеличения плотности пятен состояния #2, которые относили за счет разницы концентраций, не компенсированной процедурой нормализации, показаны сплошным темным цветом. Те пятна, которые показывают двукратное или более сильное уменьшение состояния #2, показаны как светлые пятна. Пятна, не претерпевшие изменения между этими двумя состояниями, очерчены темным.
Фиг. 6 показывает эффект времени введения инъекции Ό2 на размер церебрального инфаркта в модели окклюзии среднемозговой артерии у мыши. В результате предварительной обработки Ό2 за 2 ч до 1-часовой окклюзии среднемозговой артерии получали минимальный размер инфаркта (вертикальные линии - 8Ό). Прогрессивно более удаленное время инъекций приводило к прогрессивно увеличивающимся размерам инфаркта, но эффект был нелинейным. Обработка Ό2 методом диализа в 8М-мочевине для вытеснения белка из альбуминового носителя и с мембранной отсечкой 10 кДа для удаления пептидов обеспечивала значительно более высокий эффект на размер инфаркта при инъекции через 1 ч.
Фиг. 7 показывает фингерпринтинг (отпечатки пальцев) полипептидов ниже 10 кДа, полученный методом ЖХ/М8/М8. Было обнаружено, что 8 молекул в ряду пептидов изменились в процессе ранней стадии гибернации (Ό2) по сравнению с поздней стадией гибернации (ΝΕ). Один из них был идентифицирован как фибринопептид А. Из восьми два пептида являются более распространенными в поздней стадии гибернации (1310 и 2011).
Фиг. 8 показывает результаты для пептида: масса 1620,9 Да.
Фиг. 9 показывает результаты для пептида: масса 904,4 Да.
Фиг. 10 показывает результаты для пептида: масса 904,4 Да.
Фиг. 11 показывает результаты для пептида: масса 904,4 Да - *ВРРОБ8РБ.
Фиг. 12 показывает средние значения и стандартные отклонения для групп обработки БРА-Ιί и другими молекулярными фракциями.
Фиг. 13 показывает эффект скорости рециркуляции мочевины в крови у крыс, которая обеспечивается в/в инъекциями Ό2 или Ό01 (20 мг/кг) или альбуминового контроля (Хепо, 20 мг/кг). Каждому животному вводили во время ноль 1 мг мочевины с двойной меткой (меньше чем 1% от общего количества мочевины). Присутствие мочевины с одной меткой на уровне, превышающем естественный фон, можно объяснить только отщеплением 2 меченых атомов азота и их обратной рециркуляцией с образованием дополнительной однократно меченной мочевины. Ось у показывает для каждой крысы, в каком количестве однократно меченная мочевина относительно немеченой мочевины (% мольной фракции) в течение времени присутствует выше базовой линии естественной однократно меченной мочевины (избыток). На время 3-6 ч после инъекции средняя разница между группой Ό2 и Ό01 и группой альбумина была статистически значимой (Р<0,025). Никакая инъекция не вызывала какого-либо изменения среднего артериального давления.
Фиг. 14 показывает эффект С-концевых фрагментов БРА\т на объемы инфаркта у мыши после временной ишемии. Всех мышей подвергали 1-часовой церебральной ишемии с последующей 24-часовой реперфузией. Животным вводили следующие инъекции: ничего, носитель (физиологический раствор) или С-концевые фрагменты БРА\т (в дозе 10 мг/кг) внутривенно по окончании ишемии. Животных умерщвляли на второй день и обрабатывали для определения объема инфаркта, р<0,02 для С-концевого фрагмента (I) и С-концевого фрагмента (Ъ) по сравнению с отсутствием введения, р<0,004 для С-концевого фрагмента (I) по сравнению с физиологическим раствором и р<0,003 для С-концевого фрагмента (Ь) по сравнению с физиологическим раствором.
Фиг. 15 показывает эффект С-концевых фрагментов БРАет на объемы инфаркта у мыши после временной ишемии. Всех мышей подвергали 1-часовой церебральной ишемии с последующей 24-часовой реперфузией. Животным вводили следующие инъекции: ничего, носитель (физиологический раствор) или С-концевые фрагменты БРА\т (в дозе 10 мг/кг) внутривенно по окончании ишемии. Животных умерщвляли на второй день и обрабатывали для определения объема инфаркта. Объем инфаркта указан в мм3.
Фиг. 16 показывает эффект БРА на объемы инфаркта у мыши после временной ишемии. Всех мышей подвергали 1-часовой церебральной ишемии с последующей 24-часовой реперфузией. Животным вводили носитель (физиологический раствор) или БРА (0,625; 2,5 и 10 мг/кг) внутривенно по окончании ишемии. Животных умерщвляли на второй день и обрабатывали для определения объема инфаркта, р<0,0001 для всех значений по сравнению с контролем, за исключением БРА 10, р<0,0047.
Фиг. 17 показывает эффект Ό2 на объемы инфаркта у мыши до и после временной ишемии. Всех мышей подвергали 1-часовой церебральной ишемии с последующей 24-часовой реперфузией. Животным вводили носитель (физиологический раствор) или Ό2 (в дозе 5 мг/кг) внутривенно до или по окончании ишемии. Животных умерщвляли на второй день и обрабатывали для определения объема инфаркта. Индивидуальные объемы инфаркта для каждого животного. Объемы инфаркта указаны в мм3.
- 2 010860
Фиг. 18 показывает формулу для цикло [(Ν-ε-1-Ь-лизин, 6-глицин)брадикинина], циклического варианта брадикинина, где аргинин на Ν-концевом участке брадикинина замещен Ь-лизином, а серин в положении 6 брадикинина замещен глицином. Замыкание цикла осуществляется через пептидную связь, образованную карбонильной группой аргинина и ε-аминогруппой лизина.
Подробное описание изобретения
Перед тем, как приступить к описанию соединений, композиций, изделий, устройств и/или способов, которые раскрываются и описываются в настоящей заявке, следует указать, что композиции и способы не ограничиваются конкретными способами синтеза или конкретными рекомбинантными биотехнологическими способами, если не указано иное, или конкретными реагентами, если не указано иное, и, безусловно, могут меняться. Также следует понимать, что используемая в данном описании терминология предназначена только для целей описания конкретных вариантов воплощения изобретения и не предназначена для его ограничения.
А. Определения.
Аббревиатуры: МСАО - окклюзия среднемозговой артерии; ТТС - хлорид трифенилтетразолия; Ι.ν. внутривенный (в/в); ЕРА\т - последовательность фибринопептида А сурка; С-конец (I) - С-концевой фрагмент ЕРА, где в положении 4 находится изолейцин; и С-конец (Ъ) - С-концевой фрагмент ЕРА, где в положении 4 находится лейцин.
Как это используется в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают также и формы множественного числа, если только из контекста не следует иное. Так, например, термин фармацевтический носитель включает смеси двух или более таких носителей и т. п.
Указанные в данном описании пределы могут быть выражены как от приблизительно одного конкретного значения и/или до приблизительно другого конкретного значения. Когда указаны такие пределы, другой вариант осуществления изобретения включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Подобным образом, когда значения указаны как приблизительные при помощи предшествующего значению слова приблизительно, следует понимать, что конкретное значение представляет собой другой вариант воплощения изобретения. Также следует понимать, что конечные точки каждого из указанных пределов являются важными как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки. Следует также понимать, что в данном описании раскрывается большое количество значений и что каждое значение также раскрывается как приблизительное этого конкретного значения в дополнение к такому значению как таковому. Например, если раскрывается значение 10, тогда также раскрывается значение приблизительно 10. Также специалистам должно быть понятно, что также раскрываются значения меньше чем или равное, больше чем или равное значению и возможные пределы между значениями. Например, если раскрывается значение 10, также раскрываются значения меньше чем или равно 10, а также больше чем или равно 10. Также следует понимать, что повсеместно в материалах настоящей заявки представлены данные в различных форматах и что эти данные представляют конечные точки, и исходные точки, и пределы для любой комбинации указанных значений. Например, если раскрывается конкретное значение 10 и конкретное значение 15, должно быть понятно, что значения, большие чем, большие чем или равные, меньшие чем, меньшие чем или равные, и равные 10 и 15 должны также считаться как раскрытые между 10 и 15.
Во всех разделах текста данной заявки имеются ссылки на различные публикации. Раскрытие этих публикаций во всей их полноте включено в настоящую заявку посредством ссылки для более полного описания известного уровня техники. Указанные в них ссылки также индивидуально и конкретно включены в настоящую заявку посредством ссылки для описания содержащегося в них материала, обсуждаемого в предложении, в котором есть указание на эту ссылку.
Раскрываются компоненты, предназначенные для использования в получении раскрываемых композиций, а также сами композиции, предназначенные для использования в способах, раскрываемых в настоящей заявке. Эти и другие материалы раскрываются в настоящей заявке, и следует понимать, что когда раскрываются комбинации, подгруппы, взаимодействия, группы и т.д. этих веществ, то, хотя конкретная ссылка на каждое из различных отдельных таких соединений и их комбинаций и перестановок не может быть полно раскрыта, в данной заявке конкретно подразумевается и описывается каждое из вышеперечисленного. Например, если раскрывается и обсуждается конкретный ЕРА и обсуждаются различные модификации, которые могут осуществляться в применении к различным молекулам, включая ЕРА, конкретно подразумеваются каждая комбинация и перестановка ЕРА, а также возможные модификации, если конкретно не указано иное. Так, если раскрывается класс молекул А, В и С, а также класс молекул Ό, Е и Е и пример комбинации молекул А-Э. тогда, даже если не указано отдельно, каждое из индивидуальных и совместно рассматриваемых значений комбинаций А-Е, А-Е, Β-Ό, В-Е, В-Е, С-Э, С-Е и С-Е считается как раскрытое в данной заявке. Подобным образом, также является раскрытым любой подвид этих комбинаций. Так, например, подгруппы А-Е, В-Е и С-Е должны считаться раскрытыми. Это относится ко всем аспектам настоящей заявки, включая, но не ограничиваясь этим, стадии способов получения и применения раскрываемых композиций. Так, в случае различных дополнительных стадий, ко
- 3 010860 торые могут быть осуществлены, должно быть понятно, что каждую из таких дополнительных стадий можно осуществить любым из конкретных вариантов осуществления или комбинацией вариантов осуществления раскрываемых способов.
Необязательный или необязательно означает, что описываемое далее событие или обстоятельство может иметь, а может и не иметь место и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство имеет место и когда оно не имеет места.
Праймеры представляют собой подвид зондов, способных поддерживать определенный тип ферментативной манипуляции и которые могут гибридизоваться с являющейся мишенью нуклеиновой кислотой таким образом, что может произойти ферментативная манипуляция. Праймер может быть получен из любой комбинации нуклеотидов, или производных нуклеотидов, или известных из уровня техники аналогов, не вмешивающихся в ферментативную манипуляцию.
Зонды представляют собой молекулы, способные взаимодействовать с являющейся мишенью нуклеиновой кислотой, как правило, последовательность-специфическим образом, например через гибридизацию. Гибридизация нуклеиновых кислот хорошо известна из уровня техники и обсуждается в данном описании. Обычно зонд может быть получен из любой комбинации нуклеотидов, или производных нуклеотидов, или известных из уровня техники аналогов.
В. Композиции и способы.
Раскрываются композиции и способы, имеющие отношение к ишемии, такой как ишемия сердца и церебральная ишемия. Раскрываются композиции и способы, уменьшающие инфаркт, который может произойти в результате ишемических событий. Каждый год происходит 600000 новых или повторных инсультов, в 1995 году это явилось причиной 157991 смерти (1 из каждых 14,6 смертей). В настоящее время 4000000 человек пережили инсульт, и это число продолжает увеличиваться. Начало инсультов в 80% случаев является ишемическим и в 20% случаев - геморрагическим. Инсульт является третьей наиболее распространенной причиной смертности и основной причиной потери трудоспособности в США. Последствия и размер инфаркта после очаговой церебральной ишемии определяют как по некротической (параптоз) гибели клеток, так и по более поздней потере нервных клеток в пограничной зоне ишемии (запрограммированная гибель клеток, или апоптоз). Недавно появились терапевтические методы лечения ишемического инсульта, однако, такие методы не являются достаточными.
Раскрываются зависящие от состояния способы выделения желаемых соединений. Также раскрываются зависящие от состояния способы выделения соединений, обладающих антиинфарктными свойствами. Антиинфарктные молекулы были идентифицированы в крови находящихся в состоянии гибернации животных и были выделены и описаны в настоящей заявке.
Из раскрываемого в данном описании должно быть понятно, что высокая смертность животных в первый год гибернации связана с молекулами, обладающими антиинфарктными свойствами. У животных первого года гибернации наблюдается высокая смертность, до 77%, по данным полевых исследований сурков (Иоопап, В. СгоипбНод Мойа1Иу. ^ΐΐάΐΐίε Соп1го1 Тес1шо1оду. (8ер1.): 1-2, 2000. \\л\лу.\ус1сс11.сот/11Ь1.111т. 2000). До 77% смертности у молодых особей, 30% у взрослых особей (данные, полученные в природе, путем мечения и повторной поимки). Согласно сообщениям показатель смертности у взрослых особей, определенный методами мечения и повторной поимки, составил около 30%. Более молодые животные залегают на зимовку позднее, пробуждаются позднее, и такие молодые особи с меньшим весом тела имеют меньше вероятности для выживания. Часто считают, что опосредующим фактором здесь являются недостаточные запасы бурого жира (голодание), но аутопсия постоянно показывает достаточное количество жира у этих молодых жертв.
1. Подсостояния гибернации.
Когда млекопитающие впадают в зимнюю спячку, происходит ряд физиологических изменений, которые должны иметь место как в начале гибернации, как описано в данной заявке, так и постоянно в процессе гибернации. Например, частота сердечных сокращений в период гибернации у животных должна снижаться, а также многие другие функции обмена веществ, включая репликацию клеток. Кроме того, должен измениться цикл мочевины для предотвращения вызываемой мочевиной токсичности у животного. Так, существуют относительные различия между млекопитающими в состоянии гибернации по сравнению с млекопитающими, не находящимися в состоянии гибернации. В настоящей заявке раскрываются также различия в самом состоянии гибернации у млекопитающих в период гибернации. Раскрываются способы оценки молекулярного различия между состояниями гибернации, а не только между состоянием гибернации и состоянием негибернации. Например, существуют физиологические различия и молекулярные различия между млекопитающими, находящимися в ранней стадии гибернации, по сравнению с поздней стадией. Состояние (или подсостояния) гибернации может характеризоваться, например, физиологией, эндокринной секрецией или поведением. Примером физиологии является то, что частота сердечных сокращений ниже нормальных физиологических пределов; примером эндокринной секреции является относительное повышение фибринопептида-А в кровообращении; примером поведения является полная активизация при пробуждении из состояния спячки с или без неожиданной смерти.
Можно определить, что начало гибернации происходит, когда имеет место снижение нормального сердечно-сосудистого состояния у животного. Такое снижение может представлять собой, например,
- 4 010860 точку, в которой частота сердечных сокращений животного составляет 80% или меньше от нормальной частоты сердечных сокращений в состоянии покоя. В некоторых вариантах воплощения изобретения гибернация начиналась, когда наблюдается статистически значимая разница между частотой сердечных сокращений в состоянии покоя и пониженной частотой, в сопоставлении со снижением, вызванным, например, сном. Значение р<0,05 считается значимым. При наступлении гибернации температура животного обычно также снижается и животное свертывается в клубок. Конечное пробуждение характеризуется как состояние, которое следует за гибернацией, когда животное остается пробужденным и не возвращается в позднюю стадию гибернации. Конечное пробуждение также можно определить как время, когда частота сердечных сокращений находящегося в гибернации животного увеличивается до нормальной для этого животного частоты сердечных сокращений после того, как животное находилось в состоянии гибернации. Обычно в природе животные начинают покидать свое убежище и начинают искать пищу в момент конечного пробуждения.
Следует понимать, что наступление гибернации определяет точку, с которой различные животные могут быть нормализованы. Раскрывается, что существует различие между фракциями плазмы крови, взятой в различные периоды гибернации у животного, находящегося в состоянии гибернации. Раскрываются подсостояния, полученные на 1-100 дни после наступления гибернации. Раскрываются подсостояния, полученные на 1-100 дни до конечного пробуждения. Должно быть понятно, что 1 день после наступления гибернации можно считать подсостоянием гибернации, отличным от того, которое наблюдается через 5 дней после наступления гибернации, которое может быть подсостоянием, отличным от наблюдаемого, например, за 1 день до конечного пробуждения. Также должно быть понятно, что подсостояния, включающие ряд дней после наступления гибернации, также раскрываются в данном описании. Например, период с 1 по 5 день после гибернации может представлять собой подсостояние, отличное от наблюдаемого в период с 20 по 25 дни. Например, подсостояния с повышенным содержанием антиинфарктных молекул представляют собой подсостояния, включающие 1-30 дни, или 4-25 дни, или 10-20 дни, или 13-18 дни после наступления гибернации, и подсостояния с пониженным содержанием антиинфарктных молекул представляют собой подсостояния, включающие 30-60 дни, или 35-55 дни, или 40-50 дни, или 43-48 дни после наступления гибернации. Также раскрываются подсостояния, наблюдаемые через каждые 14 дней после наступления гибернации или через каждые 14 дней после взятия первого образца, например дни 1, 14, 28, 42, 56, 70, 84, 98, и/или 112, или дни 10, 24, 38, 52, 66, 80, 94, 108, и/или 122. Другие раскрываемые подсостояния представляют собой время 1 с, 1 мин, 1 ч, 1 день, 1 неделя, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев или 6 месяцев после наступления гибернации.
Раннюю стадию гибернации можно определить как время после наступления гибернации, но до средней стадии гибернации. Среднюю стадию гибернации можно определить как время после ранней стадии гибернации и до поздней стадии гибернации. Позднюю стадию гибернации можно определить как время после средней стадии гибернации до конечного пробуждения.
Ранняя стадия гибернации может быть ассоциирована с состоянием, в котором у пробудившегося от гибернации животного наблюдается пониженное количество случаев брадикардии и смертей (типично, отсутствие смертей). Ранняя стадия гибернации также ассоциируется с повышенной секрецией РРЛ и брадикинина (по сравнению со средней стадией гибернации). Например, ранняя стадия гибернации обычно представляет собой время, когда сердечно-сосудистая динамика достигает низкой точки (например, частота сердечных сокращений снижается примерно до 4 с на одно биение) и температура тела снижается примерно до 35-40°С. Кроме того, в настоящем описании раскрывается, что на ранней стадии гибернации в кровотоке присутствуют молекулы, которые, помимо прочего, защищают животное от ишемии и индуцируют рециркуляцию мочевины.
Средняя стадия гибернации может быть ассоциирована с состоянием, в котором у пробудившегося от гибернации животного наблюдается повышенное количество случаев брадикардии и смертей. Средняя стадия гибернации также ассоциируется с пониженной секрецией РРЛ и брадикинина (по сравнению с ранней стадией гибернации). Поскольку оба подсостояния соотносятся во времени и возникают относительно друг друга и относительно начала и завершения гибернации, дата также может ассоциироваться с общим термином средняя стадия гибернации.
Как показано в настоящей заявке, средняя стадия гибернации обычно ассоциируется с находящимся в гибернации животным, сохраняющим энергию путем снижения количества молекул в системе кровообращения, включая те молекулы, которые защищают животное от ишемии. Весьма вероятно, что существуют другие регуляторные молекулы, секреция которых также прекращается.
Позднюю стадию гибернации можно наблюдать как состояние, при котором повышается количество антиинфарктных молекул, включая РРА и брадикинин, по отношению к количеству антиинфарктных молекул в течение средней стадии гибернации, и это количество сходно с количеством на ранней стадии гибернации. Должно быть понятно, что разные стадии гибернации, например ранняя, средняя и поздняя, не перекрываются в течение конкретного года или цикла гибернации конкретного животного, но они могут перекрываться в сопоставлении по годам. Например, в некоторые годы гибернация может быть очень короткой, например ранний период гибернации может завершиться в начале декабря, а в другие годы гибернация может быть долгой, например ранняя стадия гибернации может заканчиваться в конце
- 5 010860 декабря. Например, раннюю стадию гибернации можно рассматривать как 15±15 дни после начала; среднюю стадию как 45±15 дни после начала и позднюю стадию как 60±30 дни после начала.
Разные подсостояния также можно определить как количество дней до наступления гибернации. Раскрываются 1-75 дни до наступления гибернации. Например, обычно подавляется аппетит, и это начинается у некоторых животных в дикой природе даже с первой недели октября, но, в основном, наблюдается у всех диких животных в течение нескольких недель в середине-конце ноября до начала периода гибернации. Как было показано, это подсостояние не связано с повышением уровней фибринопептида-А или вызванной пробуждением брадикардией. Также рециркулярующие мочевину молекулы секретируются на ранней стадии гибернации, и они обычно присутствуют в течение 1-21 дня после наступления гибернации, но они не могут секретироваться при отключении метаболизма и при отсутствии образования мочевины. Таким образом, гибернацию рассматривают как набор различных физиологических, химических и поведенческих подсостояний, которые временно проявляются как перекрывающиеся и неперекрывающиеся подпериоды.
В основном, рассматривая физиологические и поведенческие события, которые возникают либо самопроизвольно, либо вызваны экспериментальными средствами и которые имеют место в разное время в течение периода гибернации, например такие, как вызванная пробуждением смерть, в данной заявке раскрывают, что для молекул плазмы можно описать различные состояния, такие как секреторные состояния. После описания различных состояний, например, путем указания времени после наступления гибернации или, например, путем оценки физиологического состояния для каждого описанного состояния могут быть получены образцы плазмы или других тканей, таких как мышечная или нервная ткань, двух различных состояний, например ранней стадии гибернации и средней стадии гибернации.
Эти образцы тканей затем можно сравнивать при помощи таких методов, как ГХ масс-спектрометрия, фракционирование или гель-хроматография. Различие молекулярного состава образцов тканей затем можно оценить на различную активность, связанную с гибернацией, или с другими физиологическими характеристиками. Молекула, представляющая собой отличие, может быть затем, например, дополнительно очищена или получена синтетическим путем или дополнительно охарактеризована.
В данной заявке раскрывается, что животные, впадающие в зимнюю спячку, такие как сурки, претерпевают сильный сердечно-сосудистый стресс при пробуждении от спячки. Однако животные, впадающие в зимнюю спячку, способны лучше справиться с этим стрессом на ранней и поздней стадиях гибернации, например, соответственно, в 1-30 дни и 60-90 дни после наступления гибернации, чем на средней стадии гибернации, например в 31-59 дни после наступления гибернации. При помощи раскрываемых в данной заявке способов были обнаружены молекулы, которые присутствуют на ранней и поздней стадиях гибернации в плазме животных, таких как сурки, способные помогать впадающим в зимнюю спячку животным, таким как сурки, а также другим животным преодолеть стресс, вызванный пробуждением от состояния гибернации. Такие молекулы присутствуют в меньших количествах на средней стадии гибернации. Две такие молекулы представляют собой ТРА и его производные, и брадикинин и его производные, и функциональные варианты каждой из таких молекул.
Также раскрывается, что эти молекулы способны снижать инфаркт при введении животным, у которых произошла окклюзия артерии. Раскрываемые композиции, таким образом, можно вводить субъекту, перенесшему событие, которое влечет за собой инфаркт, такое как инсульт (удар) или сердечный приступ.
Раскрываются способы выделения белков и пептидов при сравнении зависящих от состояния фракций молекул, собранных у животных, находящихся в состоянии гибернации. Эти небольшие, зависящие от состояния отличия в физиологии используют для сбора отдельных фракций молекул, которые при исследовании методами, используемыми в протеомике (например, методом двумерного гель-электрофореза в 8Э8-ПААГ. объединенным методом масс-спектроскопии ЖХ/М8/М8 и т.д.), привели как к выделению, так и к идентификации соответствующей молекулы, лежащей в основе главного эффекта в той или другой модели специфического биоанализа, которые можно соотнести с физиологией и моделями гибернации.
Раскрываются модели, где модель представляет собой модель инсульта, такую как модель грызуна, в которой после окклюзии среднемозговой артерии в течение 1 ч восстанавливают кровоток и позже исследуют размер инфаркта с использованием окрашивания оставшейся жизнеспособной ткани хлоридом трифенилтетразолия (ТТС, 1%). Варианты такой модели инсульта включают частичную или долговременную окклюзию любой церебральной артерии и любой вид млекопитающих, хотя модели грызунов являются наиболее типичными для сохранения испытываемых материалов. В этой модели были испытаны многие соединения различного назначения (например, те или другие виды ингибиторов рецепторов глутамата, ингибиторов фактора некроза опухоли и т.д.).
В настоящей заявке раскрывается, что гибернация аналогична сну в том, что состоит из трудноуловимых подсостояний. Например, сон можно подразделить на два состояния, синхронизированное и несинхронизированное ЭЭГ-состояния. Кроме того, исследование показывает, что существует значительная разница в физиологической основе этих дух основных подсостояний. В настоящей заявке раскрывается, что гибернация представляют собой аналог десинхронизированного сна как такового (т.е. КЕМ
- 6 010860 сна), поскольку оба состояния ассоциируются с нейросекрецией, атонией и потерей автономного тонуса (как симпатической, так и парасимпатической ветвей). Это означает, что существуют также подсостояния этого подсостояния сна. В процессе состояния сна с быстрым движением глаз (КЕМ-сон) наблюдается заметное благоприятное воздействие на вентрикулярную эктопию и чувствительность сердца к смертельной аритмии в модели ишемии миокарда у свиньи. Латентное состояние между началом КЕМ-сна, определенном по ЭЭГ-критериям, и началом благоприятного воздействия на сердечно-сосудистую систему, определенном по ЭЭГ-критериям, составил 20-30 с, что свидетельствовало о нейрогуморальном механизме действия. Кроме того, исследования показали, что благоприятное воздействие на аритмогенез сообщалось сердцу через вегетативную нервную систему и исходило из невральной активности в лобных долях головного мозга (8кшпет, 1.Е., КебисРоп οί сагб1ас уи1пегаЬШ1у бигшд КЕМ к1еер ίη Иге ρίβ. Ιη: 81еер Э|5огбсг8. ВаДс апб Сйшса1 Кекеагск, ебйеб Ьу М. Скаке апб Ε.Ό. ХУей/тап. Ыете Уогк: 8рес1гиш РиЬйсабопк, 1983, рр. 49-63; 8кшпет, 1.Е., I. Атег. Со11. Сагбюк, 5: 88В94В, (1985)), той части головного мозга, которая инициирует ЭЭГ-синхронизацию и сон (8кшпет, 1.Е., ПоидНк, Е.М., апб Нагрет, К.М. Нщкег сегеЬга1 геди1абоп οί сатбюуаксШат апб текри-аЮту Гипсбоп. 1п: Ргшс1р1ек апб Ртасбсе οί 81еер Мебкше. Еббеб Ьу М.Н. Кгудег, Т. Ко11т апб У.С. Эетеп1. У.В. 8аипбегк Со., Сйар1ет 27, рр. 276-293, (1989)). Оказалось трудным отбирать образцы молекул из интерстициальной области головного мозга в процессе КЕМ, поскольку этот период очень короткий. Так как КЕМ является высоконейросекреторным состоянием головного мозга, сопровождаемым отключением обеих ветвей вегетативной нервной системы и мышечной атонией, искали аналогичное состояние головного мозга, и оно было обнаружено у млекопитающего в состоянии гибернации. Было сделано предположение, что такое состояние представляет собой длительное состояние, позволяющее осуществлять адекватный отбор образцов молекул, секретируемых не находящимися в состоянии гибернации животными в процессе КЕМ-сна.
Раскрываются: 1) вынужденное пробуждение, сопровождаемое сильной брадикардией, на средней стадии гибернации, неизбежно ведущее к смерти; и 2) вынужденное пробуждение и сопровождающая его брадикардия либо на ранней, либо на поздней стадии гибернации, результатом чего является успешное пробуждение.
Раскрывается, что относительная ишемия, обусловленная метаболической потребностью, создаваемой поведением пробуждения, которая недостаточно поддерживается кровотоком (несоответствующая брадикардия), не может быть преодолена на средней стадии гибернации, поскольку присутствует недостаточное количество антиинфарктных молекул. Раскрывается, что молекулярные фракции, экстрагированные у животных на ранней и поздней стадиях гибернации, содержат молекулы, которые могут регулировать и обеспечивать успешное пробуждение, не приводя к смерти животного, но молекулы, полученные на средней стадии гибернации, не могут. В модели инсульта у грызунов было обнаружено, что только фракции, полученные на ранней и поздней стадии гибернации, содержали антиинфарктную молекулу.
Дифференциальные сравнения с молекулярной фракцией, полученной на средней стадии гибернации, с использованием различных методов (2Э-гели, ЖХ/М8/М8) привели к идентификации раскрываемых антиинфарктных молекул. Таким способом очистки, в зависимости от состояния, было получено 9 белков и 5 пептидов, которые активировались на ранней стадии гибернации по сравнению со средней стадией гибернации.
Раскрывается, что гибернация имеет подсостояния. Также раскрывается, что нечетко различимое разграничение на независимые подсостояния связано с различными профилями нейросекреции. Также раскрывается, что такие связанные с гибернацией подсостояния обычно возникают в процессе бодрствования, до гибернации, если они связаны с ишемией.
Также раскрываются зависящие от подсостояния гибернации профили нейросекреции, ведущие к потере аппетита. Раскрывается, что сравнение фракций плазмы, взятой до и после того, как впадающие в зимнюю спячку животные прекращают прием пищи, может в результате вывести на выделение и идентификацию специфической молекулы, которая подавляет аппетит в предшествующий гибернации период бодрствования. Данные, подтверждающие такое дифференциальное сравнение, представлены в табл. 15.
Таблица 15. Пищевое поведение сурка.
Наблюдения осуществляли на 6 сурках, которых отлавливали и изучали на протяжении всего периода гибернации. Ежедневная пища составляла 1 небольшую морковку, 1/2 яблока, 1 лист капусты и воду без ограничения. Потребление пищи отмечали 24 ч спустя; несъеденную пищу удаляли из клетки, перед тем как положить на блюдо для пищи свежую.
Дата Пищевое поведение животных, обобщенное на дату наблюдения
1 сентября 6 из 6 потребляли, в основном, всю пищу ежедневно.
1 октября 6 из 6 потребляли почти всю пищу; 2 ели значительно меньше, но съели яблоки.
1 ноября 2 из 6 потребляли почти всю пищу; 4 ели значительно меньше, но съели яблоки.
30 ноября 2 из 6 съели некоторое количество пищи; 3 съели очень мало; 1 съел совсем мало пищи.
1 декабря Всю пищу убрали и животных больше не беспокоили; в течение 1 недели все 6 были спокойными (т.е. в состоянии гибернации), как было определено 24-часовым отслеживанием активности.
- 7 010860
Способ определения молекул в зависящих от состояния фракциях связанных с гибернацией образцов плазмы, цереброспинальной жидкости, мочи или других биологических скоплений молекул раскрывается как для состояний бодрствования, так и гибернации у впадающих в зимнюю спячку животных.
Раскрываются применения зависящих от состояния способов захвата связанных с гибернацией молекул. Раскрываются молекулы или частично или, по существу, очищенные фракции молекул, которые содержат молекулы, связанные с: 1) предотвращением повреждения головного мозга при инсульте, 2) предотвращением повреждения миокарда при сердечном приступе и 3) рециркуляцией мочевины в крови при почечной недостаточности или другом состоянии.
Раскрываются РРЛ и связанные с ЕРЛ молекулы, такие как молекулы, имеющие идентичность с ЕРЛ, обладающие антиинфарктным действием. Раскрываются антиинфарктные молекулы. В случае возникновения случайного тромбоза в сосуде с интактным просветом для кровотока (т.е. в неразрезанном сосуде), тогда перед тем, как может начаться тромболиз для удаления закупорки, произойдет случайная ишемия в расположенных ниже по ходу потока тканях. Примеры такого случайного свертывания крови связаны с гематомами, низким перфузионным давлением, позиционной закупоркой сосуда и т.д. Ишемическое повреждение, вызванное образованием случайного сгустка, может быть устранено при помощи свободных ЕРА-фрагментов, или вариантов, или производных, которые были выделены. Если ЕРА вытекает из организма из-за разреза или разрыва сосуда, тогда с ишемией труднее бороться, но если кровоток остается неповрежденным, тогда выброс в кровоток нефосфорилированного ЕРА может иметь селективное преимущество антиинфарктной функции в процессе растворения сгустка и восстановления циркуляции крови.
2. Ишемия.
а) Механизмы умеренной нейро- и кардиопротекции.
Молекулы для защиты от ишемии искали давно, основываясь на наблюдениях, что нейроны могут разрушать сами себя посредством сверхактивного возбудительного процесса. Глутамат и его рецепторы, некоторые из которых вовлечены в процессы познавания и запоминания, по-видимому, являются основной причиной этого сверхвозбуждения (Мюйаейб Е.К. Ргод. №итоЬю1. 1998, 54 (4): 369-15). Ь-Глутамат представляет собой наиболее распространенную систему передачи возбуждения в головном мозге позвоночных, и в дополнение к его действиям в качестве синаптического трансмиттера он производит долгосрочные изменения в метаболизме и жизнеспособности нейронов.
Такие действия производятся через активацию двух основных классов рецепторов, тех, которые образуют ионные каналы, и тех, которые связываются с С-белками для контроля метаболизма. Фармакологическая и физиологическая характеристика этих различных форм рецепторов вывела на определение трех ионных каналов и трех (групп) метаболических рецепторов. На сегодняшний день идентифицировано более 25 генов для специфических субъединиц этих рецепторов, и еще 5 белков, по-видимому, функционируют как субъединицы рецептора или как ассоциированные с рецептором белки (такие последовательности для таких белков можно найти в СеиЬаик, и они включены в настоящую заявку во всей их полноте посредством ссылки). Регуляция экспрессии таких белковых субъединиц, их локализация в нейронах и глиальных мембранах и их роль в определении физиологических свойств рецепторов глутамата представляет сегодня область научных исследований. Как ионотропные, так и метаботропные рецепторы связываются с множеством внутриклеточных мессенджеров, таких как Са2+, циклический АМР, реактивные формы кислорода, и эти связи инициируют множество сигнальных каскадов, которые определяют рост, дифференциацию и выживание нейронов. Аайб е1 а1. обнаружили два небольших пептида с некоторой антиинфарктной активностью, которые работают через рецептор ΝΜΩΛ. Аайб е1 а1., Зееиее, 298: 846850 (2002), включенный в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к антиинфарктным молекулам (Еу5-Ееи-8ег-8ег-11е-С1и-8ег-А5р-Уа1 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 104) (Туг-С1у-Агд-Еу8-Еу8-Агд-Агд-С1и-Агд-Агд-Агд 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 105).
Такие находки, связанные с Ь-глутаматом, привели к предположению, что если один или несколько рецепторов глутамата или субклеточные связи блокированы, тогда, возможно, возбуждение-смерть, возникающие в результате глутаматного демпинга во время ишемического повреждения, можно предотвратить. Лубелузол представляет собой одну из таких молекул, которая, действительно, блокирует эффект стимуляции рецептора глутамата (Ьезаде А.8., е1 а1., 1. Рйаттасо1. Ехр. Тйет. 1996, 279: 759-66). Однако клинические испытания показали, что он не проявил себя как полезный с медицинской точки зрения для лечения пациентов, зарегистрированных в течение 8 ч после начала инсульта (Стойа 1., СетеЬтоуабе. Όίδ. 2001, 12: 258-63). Существует несколько других линий доказательств, подтверждающих другие умеренно эффективные антиинсультные воздействия. Молекула эндотелиальной адгезии была предложена в качестве основного кандидата, вызывающего инсульт и некротическую гибель клеток, в которых она образуется. Молекула ΤΝΕ-альфа (фактор некроза опухоли альфа) через второй мессенджер, керамид, приводит к активации 1САМ-1 (молекула-1 межклеточной адгезии), молекулы, вызывающей связывание моноцитов и макрофагов с эндотелиальной выстилкой мелких кровеносных сосудов (Сшщ I., е1 а1., Ат. 1. РЬ.у8ю1. 1999, 276: 01171-83). Этот механизм также проявляет действие ишемического предкондиционирования в головном мозге (Сйеи Υ., е! а1., 1. СегеЬ. В1оой Е1о\т Ме!аЬ. 2001, 21: 34-40), феномен, являющийся чрезвычайно востребованным, поскольку ведет к сохранению тканей как в моделях инфаркта го
- 8 010860 ловного мозга, так и сердца. Однако в небольшом клиническом испытании было обнаружено, что вмешательство в механизм ТИЕ-1САМ-моноцит мышиного антитела против 1САМ человека (ЕийтотаЬ) имеет негативный результат (Еигиуа К., е! а1., 8!гоке 2001 Νον.; 32 (11): 2665-74).
Предкондиционирование сначала было исследовано в миокарде. Предыдущий опыт с ишемией (т.е. предкондиционирование), как было обнаружено, ведет к меньшему объему инфаркта в более поздний период после восстановления, когда артерию освобождали. Первоначально было показано, что миокардиальный механизм включал ингибирующий д-белок, связанный с аденозиновым рецептором (НакЫт1 М.\У.. е1 а1., Мо1. Се11 Вюсйет. 186: 19-25). Со времени ранней аденозин-д1-циклазной гипотезы было обнаружено, что феномен предкондиционирования является более сложным.
Предкондиционирование имеет две фазы (ВоШ В. Тйе 1а1е рйаке о£ ргесопййюшпд. Сйс. Век. 2000, 87 (11): 972-83). В отличие от ранней фазы предкондиционирования, которая длится 2-3 ч и защищает от инфаркта миокарда, но не от образования поверхностных повреждений, существует поздняя фаза, которая длится 3-4 дня и, действительно, защищает от инфаркта и от поверхностного повреждения сердечной ткани. Этот более длительный эффект может, таким образом, иметь большее клиническое значение. Позднее предкондиционирование представляет собой полигенный феномен, который требует одновременной активации множества реагирующих на стресс генов. Химические сигналы, высвобождаемые сублетальным ишемическим стрессом (такие как ΝΟ, реактивные формы кислорода и аденозин), запускают комплексный каскад сигнальных событий. Эти события включают активацию протеинкиназы С, протеинтирозинкиназ 8гс и нуклеарного фактора каппа-В и завершаются повышенным синтезом индуцируемой синтазы ΝΟ, циклооксигеназы-2, альдозоредуктазы, супероксиддисмутазы Мп и, возможно, других кардиозащитных белков. Аналогичная последовательность может быть запущена разными стимулами, такими как сердечный стресс, физическая нагрузка и цитокины. Таким образом, оказалось, что позднее предкондиционирование является универсальным ответом сердца на стресс, в целом. Важно, что кардиозащитное действие позднего предкондиционирования можно воспроизвести фармакологически при помощи клинически релевантных средств (например, доноров ΝΟ, агонистов аденозинового рецептора, производных эндотоксина или агонистов опиоидных рецепторов).
Однако и в мозге, и в сердце сохранение тканей в результате либо церебрального, либо сердечного предкондиционирования является незначительным, при этом большая часть инфаркта все же проявляется. Это незначительное количество сохраненных тканей составляет, например, от 25 до 35% (Еигиуа К., е! а1., 1. СегеЬ. В1оой Е1о\г Ме!аЬ. 2001 3: 226-32; Эа\\'коп Ό.Α., е! а1., 1. СегеЬ. В1оой Е1о\г Ме1аЬ. 1999, 6: 616-23; аий №1\\'ак1иго Н., е! а1., Вгаш Век. 1997, 778 (2): 265-71) для пути метаболизма Т№-1САМ в головном мозге при обеспечении предишемического лечения.
b) Поверхностно поврежденная ткань: механизм 100% восстановления функции.
Феномен восстановления неконтрактильной функции ишемической сердечной ткани был обнаружен в 1980-х годах после хирургического вмешательства, связанного с восстановлением сосудов у пациентов, страдающих тяжелым ишемическим заболеванием сердца (Соорег Н.А., Вгаииета1й Е., Согоп. Айегу Όίκ. 2001 12: 387-92). Миокард, который выдержал временное сублетальное повреждение, но имеет потенциал для полного восстановления со временем, называют поверхностно поврежденным миокардом. Кратковременное поверхностное повреждение миокарда обычно наблюдают после шунтирования коронарной артерии.
Гибернационный миокард аналогичен поверхностно поврежденному, но это хроническое состояние, которое может быть вызвано либо хроническим низким кровоснабжением, либо постоянно повторяющимся поверхностным повреждением. Например, когда у пациентов со стенокардией повышаются потребности в кислороде, возникают длительные периоды ишемии, которые приводят к многочисленным эпизодам поверхностных повреждений, и эта серия, в конечном итоге, приводит к гибернационному миокарду. Когда миоциты постоянно снабжаются при низкой скорости кровоснабжения, они просто теряют свою способность к сокращению, но они не гибнут, а происходит некротическое растворение. Наоборот, после восстановления кровообращения эти клетки, даже после нескольких лет дисфункции, восстанавливают свои сократительные свойства. Восстановление обычно более полное в поверхностно поврежденной ткани, чем в гибернационной ткани, при этом последняя обычно имеет небольшие островки некротического повреждения в своей массе.
Взаимосвязь между поверхностно поврежденным, гибернационным и предкондиционированным миокардом еще полностью не выяснена (Еи!!егтап Ь.С., ЬетЬегд Ь., Ат. I. Сгй. Саге 2000 9: 430-6), но подобно эффектам ишемии в головном мозге, когда изменяются как ионные, так и метаболические пути, контролируемые глутаматом, в лежащей в основе этого молекулярной биологии, вероятно, прослеживаются полигенные пути. Эти пути молекулярной динамики, которая меняется, по-видимому, зависят от конкретных зависимостей от состояния, присутствующих в момент модификации, включая различие между видами (К1т 8.1., е! а1., Сйс. Век. 2001 Ос!. 26; 89: 831-7).
c) Модели ишемии.
Со времени введения в медицину одобренного ЕЭА тромболиза с использованием таких активаторов тканевого плазминогена, как 1РА, модели инсульта и сердечного приступа изменились, вместо длительной окклюзии сосудов для получения инфаркта, используют кратковременную окклюзию. Для ими
- 9 010860 тации реального с медицинской точки зрения времени между началом окклюзии и инъекцией тромболитического средства и лекарственного средства-кандидата время окклюзии в большинстве моделей животных снизилось от 24 до 1-2 ч (т.е. окклюзию прекращают для имитации тромболиза и повреждение ткани определяют гистологически через 24 ч).
Часто в случаях модели ишемии сердца исследуют контрольную группу, называемую группой предкондиционирования, для сравнения нового лекарственного средства-кандидата с такой нелекарственной защитой. На моделях сердечного предкондиционирования ранее было установлено, что у каждого животного, у которого наблюдали кратковременные ишемические приступы, эти приступы не приводили к необратимому повреждению ткани. Существуют доказательства того, что этот физиологический защитный механизм связан в аденозиновым рецептором и опосредован д-белком.
Полагают, что защиту ткани посредством такого предкондиционирования можно отнести к поверхностному повреждению сердечной ткани (реверсия не окращающейся ткани) или сердечной гибернации (частичная реверсия несокращающейся ткани), что происходит после повторного установления длительной ишемии, как происходит при шунтировании коронарной артерии. Разница между поверхностно поврежденными и гибернационными тканями заключается в наличии или отсутствии какойлибо невосстанавливаемой дисфункции ткани.
Контрольные группы предкондиционирования обычно показывают сохранение ткани только до 3050%, что существенно меньше, чем ожидаемое для любого из новых лекарственных средств, которые могли бы оказывать действие по ограничению размера инфаркта.
Полагают, что даже кратковременная окклюзия вызовет некоторое необратимое повреждение ткани. Например, 1-часовая окклюзия может привести к образованию некоторой отдаленной ткани в объеме ишемии, способной к реверсированию повреждения ткани, но некоторая центральная масса ткани уже станет неспособной к восстановлению и в результате омертвеет.
Раскрываемые молекулы и фракции могут обеспечить 100% реверсирование инфаркта у некоторых животных, у которых была вызвана 1-часовая окклюзия (мышь-МСАО), в том числе реверсирование в центральной массе ткани, и, таким образом, очевидно, что должны быть решены проблемы повреждения центральной ткани по сравнению с периферийным повреждением. При предварительной обработке раскрываемыми в настоящей заявке молекулой(ами) и фракциями после 1-часовой окклюзии наблюдали 100% сохранение ткани спустя 24 ч у всех животных. Инъекция соответствующей(их) молекулы (молекул) оказалась эффективной, когда инъекцию вводили в течение времени вплоть до 8 ч после начала 1часовой ишемии. Для мыши необходимо лишь 1/20 часть инъецируемого материала по сравнению с крысой, что делает мышь более эффективной для многочисленных исследований.
Раскрываются способы, в которых стадия анализа включает использование мышиной модели вызванной МСАО церебральной ишемии или ишемии миокарда. Также раскрываются способы, в которых на стадии анализа для исследования ишемии миокарда или церебральной ишемии при окклюзии коронарной артерии используют модель крысы или модель любого другого животного, например модели млекопитающих. Также раскрываются способы, использующие животные модели ангиогенеза новых сосудов, ремоделирования старых сосудов, где коллатеральный анастомоз раскрывают шире для наполнения дистальных концов блокированных сосудов, реперфузионного повреждения, где большие количества аккумулированных побочных продуктов ишемии поступают в отдаленные ишемические ткани и/или в ишемических тканях происходит индуцированное осмосом повреждение органелл или мембран и где любой другой орган становится ишемическим или где все органы и ткани становятся ишемическими в результате ишемии всего организма, вызванной временной остановкой сердца (фибрилляция желудочков) или блокадой кровотока (например, зажим аорты). Существует множество других моделей, в дополнение к более традиционным моделям ишемии (окклюзия сосудов)/инфаркта (вызванного некроза). Например, инфаркт может быть вызван травмой от механического удара, коагулопатией от яда змеи и т. д. Таким же образом ишемия может медленно вызываться амероидными констрикторами, образуемыми в мелких отдаленных сосудах вводимыми инфузией микросферами, и т.д. Кроме того, эти модели могут включать глобальные варианты модуляции, такие как выключенный ген (например, делеция рецептора миокарда), биоповеденческие модификации (например, психосоциальный стресс) и т.д.
С. Композиции.
Раскрываются композиции, обладающие антиинфарктными свойствами. Раскрывается зависящий от состояния способ, в котором фракции альбумина (например, гелевая колонка аГП-Ыис). выделенные из фракции средней стадии гибернации, экстрагированной, например, через 6 недель после наступления гибернации, и из фракции ранней стадии гибернации, экстрагированной, например, через 2 недели после наступления гибернации, показали 9 белков и 5 пептидов, которые были дифференциально экспрессированы в ранней и средней стадиях гибернации. Фракции фильтровали (отсечка 10 кДа) с получением субфракций белка и пептида, и после испытания на мышиной модели МСАО было показано, что обе фракции обеспечивали антиинфарктное действие. Два из полученных пептидов, как было показано, дифференциально активируются, а три были идентифицированы методом ЖХ/Μδ/Μδ как матричные артефакты. При помощи используемого в протеомике метода фингерпринтинга и секвенирования бе ηονο пептиды были идентифицированы как фибринопептид-А (ЕРА) и брадикинин. Молекулу ЕРА систематически
- 10 010860 исследовали в модели МСАО у мыши, синтезируя различные фрагменты ЕРЛ. В данной заявке раскрывается, что фиксированная на С-конце область является активным фрагментом ЕРЛ, который обладает антиинфарктными свойствами. Было показано, что синтезированный брадикинин и Оек-Лгд-брадикинин также обладают антиинфарктными свойствами в мышиной модели МСАО. С использованием колонок с обращенной фазой были идентифицированы дополнительные пептиды (отсечка ниже 10 кДа, ЖХ/М8/М8) в дифференциальных фракциях Ό2 по сравнению с ΝΕ2.
Раскрываемые композиции можно выделить с использованием зависящих от состояния способов, раскрываемых в настоящей заявке, или они относятся к молекулам, которые можно выделить с использованием зависящих от состояния способов, раскрываемых в настоящей заявке, или они представляют собой молекулы, которые имитируют функцию молекул, которые могут быть выделены с использованием зависящих от состояния свойств, раскрываемых в настоящей заявке. Раскрываются способы сравнения ранней и средней стадий гибернации, которые привели к идентификации 9 белков в дифференциальных состояниях. Также раскрываются зависящие от состояния способы, в которых сравнивают множество различных молекул в различных подсостояниях гибернации, как до, так и в период подсостояний гибернации. Такие модификации были осуществлены, и их можно осуществить при помощи молекулярных методов двумерного гель-электрофореза и используемого в протеомике объединенного метода ЖХ/М8/М8. Зависящие от состояния сравнения и идентификацию молекул можно осуществлять и различными другими молекулярными методами, в частности такими, как метод сравнения наборов генов и, в основном, метод любого другого сравнения, подходящий для идентификации специфических зависящих от состояния молекул.
Должно быть понятно, что при использовании молекул, выделенных у животного с использованием зависящих от состояния способов, раскрываемых в настоящей заявке, такую молекулу можно использовать при разной степени чистоты. Например, зависящие от состояния способы могут обеспечить плазму, которую можно фракционировать на основе, например, размера, или заряда, или гидрофобности. Одну или все из таких процедур или другие процедуры можно использовать для повышения специфической активности образца. Фракции можно отслеживать на их активность, например отслеживать их антиинфарктные свойства, на модели крысы или мыши, как описано в настоящей заявке. Сырые биоматериалы, такие как кровь, сначала можно обработать с получением плазмы. Затем плазму можно очистить различными способами. Плазму можно очистить с использованием аффинной матрицы (например, аГП-де1 Ыие), которая отделяет фракцию альбумина от других материалов плазмы. Такую фракцию альбумина можно затем очистить с использованием любого из различных способов, в которых используют разницу, например, в размере пор, скрученности, заряде, молекулярной массе, гидрофобности и/или растворимости.
Затем фракцию альбумина можно фракционировать на основе размера, например, используя молекулярные сита или мембраны, имеющие отсечку молекулярной массы, например, 3,5, 7, 10, 15, 20, 30, 50, 75, 100, 150 и 200 кДа.
1. Фракции, полученные у животных в период гибернации.
Раскрываются фракцииплазмы, выделенные в период гибернации у животных, таких как сурок, обладающие антиинфарктными свойствами, где фракцию получают от находящегося в состоянии гибернации животного в период вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 дней после начала гибернации или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 или 40 дней до окончательного пробуждения от гибернации. Раскрываются фракции плазмы, выделенные у животного в состоянии гибернации, такого как сурок, обладающие антиинфарктными свойствами, где фракцию получают от находящегося в состоянии гибернации животного в период 1-25 дней, или 5-20 дней, или 10-18 дней, или 14 дней после начала гибернации или 2-6 недель, 3-6 недель, 4-6 недель или 5 недель до окончания гибернации животного или всей колонии.
Раскрываются фракции плазмы, выделенные у животного в состоянии гибернации. Находящимся в состоянии гибернации животным может быть любое впадающее в зимнюю спячку животное. Например, находящееся в состоянии гибернации животное может представлять собой млекопитающее (например, суслик, медведь, лесной сурок, сурок, скунс, летучая мышь), насекомое (например, комар, оса, пчела), рыбу (например, даллия), рептилию (например, змея, черепаха), земноводное (например, лягушка) или птицу (например, козодой).
Раскрываются фракции плазмы и молекулы, идентифицированные в таких фракциях, обладающие антиинфарктным действием в течение многих часов после начала ишемии. Например, результаты, представленные на фиг. 6, показывают положительные результаты через 6 ч после ишемии. Диализованная 02-фракция при введении путем инъекции через 1 ч после начала ишемии обеспечивает отсутствие или минимальный объем инфаркта у большинства субъектов. Раскрываются молекулы, обладающие идентичностью с ЕРЛ сурка и ЕРЛ человека (фиг. 8). В настоящей заявке раскрывается, что соответствующие зависящие от состояния молекулы, обнаруженные у грызунов (сурок, крыса, мышь), проявляют эффективное действие по предотвращению инсульта у различных видов, таких как человек. Благодаря их первостепенной важности для выживания в период ишемии (например, врожденной ишемии, условной ишемии при сублетальной физической нагрузке, циркуляторной ишемии, ишемии при гибернации и т.д.) такие молекулы, вероятно, были функционально законсервированы среди видов млекопитающих в ходе эволюции.
- 11 010860
Раскрываются фракции плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающие молекулу, где молекула обладает антиинфарктной активностью и где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 1-25 дней после начала гибернации.
Также раскрываются фракции, где фракции выделяют путем сбора крови животного через 10-19 дней после начала гибернации, или где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 14, 15 или 16 дней после начала гибернации, или где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 15 дней после начала гибернации.
Раскрываются фракции плазмы находящегося в стадии гибернации животного, включающие молекулу, где молекула обладает антиинфарктной активностью, и где фракцию выделяют путем сбора крови животного, где первое животное находится в ранней стадии гибернации, и где фракция не включает никакого количества крови второго животного, если второе животное находится в средней стадии гибернации.
Раскрываются фракции плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающие молекулу, где молекула обладает антиинфарктной активностью и где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 1-25 дней до окончательного пробуждения животного.
Также раскрываются фракции, где фракции выделяют путем сбора крови животного за 10-20 дней до окончательного пробуждения животного, где фракции выделяют путем сбора крови животного за 14, 15 или 16 дней до окончательного пробуждения животного и где фракции выделяют путем сбора крови животного за 15 дней до окончательного пробуждения животного.
Также раскрываются фракции плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающие молекулу, где молекула обладает антиинфарктной активностью, и где фракцию выделяют путем сбора крови первого животного, где первое животное находится в поздней стадии гибернации, и где фракция не включает никакого количества крови второго животного, если второе животное находится в средней стадии гибернации.
Раскрываются фракции, где антиинфарктная активность представляет собой церебральную антиинфарктную активность, и фракции, где антиинфарктная активность представляет собой кардиальную антиинфарктную активность или обе активности.
Раскрываются фракции плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающие молекулу, где молекула индуцирует рециркуляцию мочевины и где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 1-25 дней после начала гибернации.
Также раскрываются фракции, обладающие активностью рециркуляции мочевины, где фракции выделяют путем сбора крови животного через 10-20 дней после начала гибернации, или где фракции выделяют путем сбора крови животного через 14, 15 или 16 дней после начала гибернации, или где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 15 дней после начала гибернации.
Раскрываются фракции плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающие молекулу, где молекула индуцирует рециркуляцию мочевины, и где фракцию выделяют путем сбора крови первого животного, где первое животное находится в ранней стадии гибернации, и где фракция не включает никакого количества крови второго животного, если второе животное находится в средней стадии гибернации.
Также раскрываются фракции плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающие молекулу, где молекула индуцирует рециркулирование мочевины и где фракции выделяют путем сбора крови животного за 1-25 дней до окончательного пробуждения животного.
Также раскрываются фракции, где фракции выделяют путем сбора крови животного за 10-20 дней до окончательного пробуждения животного, где фракции выделяют путем сбора крови животного за 14, 15 или 16 дней до окончательного пробуждения животного и где фракции выделяют путем сбора крови животного за 15 дней до окончательного пробуждения животного.
Также раскрываются фракции плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающие молекулу, где молекула индуцирует рециркуляцию мочевины, и где фракции выделяют путем сбора крови первого животного, где первое животное находится в поздней стадии гибернации, и где фракция не включает никакого количества крови второго животного, если второе животное находится в средней стадии гибернации.
2. Способы очистки антиинфарктных молекул.
Также раскрываются способы очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающие: 1) взятие образца у находящегося в состоянии гибернации животного, 2) взятие контрольного образца у находящегося в состоянии гибернации животного, 3) сравнение образца с контрольным образцом.
Раскрываются способы очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающие: 1) взятие образца у находящегося в состоянии гибернации животного, 2) взятие второго образца у находящегося в состоянии гибернации животного, 3) сравнение образца со вторым образцом.
Раскрываются способы очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающие: 1) взятие образца у находящегося в состоянии гибернации животного, 2) взятие второго образца у находящегося в состоянии гибернации животного в другом подсостоянии, 3) сравнение образца со вторым образцом.
- 12 010860
Раскрываются способы очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающие: 1) взятие образца у находящегося в состоянии гибернации животного по состоянию на первое время, 2) взятие второго образца у находящегося в состоянии гибернации животного по состоянию на второе время, где первое время и второе время являются разными, 3) сравнение образца со вторым образцом.
Раскрываются способы очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающие: 1) взятие образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного, 2) взятие второго образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного, 3) сравнение образца крови со вторым образцом крови.
Также раскрываются способы, где стадия сравнения образца и второго образца включает анализ экспрессии генов в образце и втором образце, и способы, где стадия сравнения образца и второго образца включает анализ экспрессии белков в образце и втором образце.
Раскрываются способы, где образец и второй образец получают из крови, мочи, спинальной жидкости или цереброспинальной жидкости, тканей, органов, клеток.
Раскрываются способы, где животное представляет собой млекопитающего, такого как суслик, медведь, сурок, скунс или летучая мышь.
Раскрываются способы, где образец крови получают у животного, находящегося в ранней или поздней стадии гибернации.
Раскрываются способы, где второй образец крови получают у животного, находящегося в средней стадии гибернации.
Раскрываются способы, где образец крови получают у животного через 1-25 дней после начала гибернации.
Раскрываются способы, где второй образец крови получают у животного через 26-60 дней после начала гибернации.
Раскрываются способы, где стадия сравнения включает идентификацию дифференциально регулируемых молекул, где дифференциально регулируемые молекулы присутствуют в образце в количестве, отличном от второго образца.
Раскрываются способы, где идентификация дифференциально регулируемых молекул включает фракционирование образца и второго образца.
Также раскрываются способы, где фракционирование происходит путем отбора молекул с М.м. 10 кДа или меньше.
Раскрываются способы, где фракционирование включает стадию разделения молекул в образце крови и втором образце по заряду, гидрофобности, гидрофильности, липофильности, скрученности, молекулярной массе, методом аффинной хроматографии белков, пептидов или углеводов или по растворимости.
Раскрываются способы, где аффинное разделение включает использование хроматографии аГП-де1 Ыие.
Раскрываются способы, где идентификация включает анализ образцов методами ГХ-масс-спектроскопии, гель-хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии или ГХ/М8/М8 массспектроскопию осуществляют с использованием стандартных процедур (жидкостная хроматография, объединенная с масс-спектрометрией).
Раскрываются способы, где высокоэффективная жидкостная хроматография включает хроматографию с обращенной фазой, и способы, где гель-хроматография включает двумерный полиакриамидный гель-электрофорез.
Раскрываются способы, где способ дополнительно включает очистку дифференциально регулируемых молекул с получением очищенных дифференциально регулируемых молекул.
Раскрываются способы, где способ дополнительно включает анализ антиинфарктной активности очищенных диференциально регулируемых молекул.
Раскрываются способы, где стадия анализа включает использование модели вызванной МСАО церебральной ишемии у мыши. Также раскрываются способы, использующие модели ангиогенеза новых сосудов, ремоделирования, реперфузионного повреждения и тесты для ишемии различных органов.
Раскрываются способы, где антиинфарктная активность представляет собой церебральную антиинфарктную активность, и способы, где антиинфарктная активность представляет собой кардиальную антиинфарктную активность.
3. Фибриноген А (БРА).
а) Структура молекулы БРА.
БРА представляет собой фрагмент растворимого фибриногена, который высвобождается при расщеплении фибриногена тромбином. Катализируемое тромбином (11а) расщепление растворимого фибриногена (БЫд) с образованием фибрина (БЫп) является конечным протеолитическим событием в каскаде коагуляции. Такие растворимые БЫп мономеры самопроизвольно полимеризуются с образованием нерастворимой сети БЫп, которая стабилизируется катализируемым фактором Х111а перекрестным сшиванием остатков 1у§ и д1и цепей а и д. Такая сеть БЫп представляет собой основной белковый компонент гемостатической пробки.
Плазменный фибриноген представляет собой гликопротеин массой примерно 340000 кДа, который синтезируется в печени. Он циркулирует у животных при концентрации 2,6 мг/мл. Он состоит из связан
- 13 010860 ного дисульфидными связями димера, состоящего из 3 пар связанных дисульфидными связями неидентичных полипептидных цепей (Аа, ВЬ и д).
ЕРА представляет собой Ν-концевой фрагмент цепи Аа, который содержит участки перекрестной сшивки фактора Х111а и 2 сайта фосфорилирования. ЕЬд обычно является полностью фосфорилированным после синтеза, но циркулирует только при 20-30% фосфорилирования. В результате высвобождения ЕРА путем расщепления в К.16-617 образуется ЕЬп I, экспонирующий сайт полимеризации (17-20) на цепи Аа. Эти участки связываются с комплементарными участками на И домене ЕЬп с образованием протофибрил. Последующее 11а-расщепление ЕРВ (К14-615) из цепи ВЬ раскрывает дополнительные сайты полимеризации и активирует боковой рост сети ЕЬп. Таким образом, обычно ЕРА составлен из Νконцевых аминокислот вплоть до сайта расщепления тромбина, что обычно происходит в сайте расщепления К-6. Таким образом, один путь определения ЕРА представляет определение по сайту расщепления тромбина и, таким образом, является относительной системой. Как правило, должно быть 11-20 аминокислот, расположенных к Ν-концу от сайта расщепления. Таким образом, один путь обсуждения относительных положений ЕРА представляет собой обсуждение этого положения относительно сайта расщепления, например, 3 аминокислот к Ν-концу от сайта расщепления или 7 аминокислот к Ν-концу от сайта расщепления. Например, в ЕРА сурка последовательность АЕ6 будет представлять, соответственно, 7, 6 и 5 аминокислот к концу от сайта расщепления.
Структура фрагментов фибриногена, включая ЕРА, в настоящее время исследуется и моделируется, например, при помощи тромбина (Майш, Р.И., е! а1., 1. Βίοί. Сйет. 267 рр. 7911 (1992); ЫиЬЬк, М.Т., е! а1., Еиг. 1. Вюейет. 206 рр. 187 (1992); Магйп, Р.И., е! а1., Вюейетщйу 35 рр. 13030 (1996); Ма1котек1, М.6., е! а1., Вюейет. 1. 326 рр. 815 (1997)). Такие структуры можно использовать для обнаружения структурных миметиков ЕРА и вариантов, сохраняющих функции ЕРА, такие как антиинфарктные свойства. Например, известны контакты тромбина с подобластью ЕРА (например, 6ЕЕЬАЕ666У). Известно, что эта подобласть обладает антиинфарктными свойствами. Таким образом, миметики этой подобласти можно выделить путем моделирования с использованием тромбина и сравнения координат контактов тромбина с известной подобластью и подобластью, представляющей интерес. Молекулы, связывающиеся с тромбином аналогичным образом, как можно ожидать, должны обладать такими же свойствами ЕРА человека и фрагментов ЕРА человека, такими как антиинфарктные свойства, т.к. являются эквивалентными в известном анализе ЕРА - связывании с тромбином. Как раскрывается в настоящей заявке, эту информацию можно объединить с комбинаторными химическими методами и процедурами скрининга для выделения молекул, обладающих свойствами ЕРА. Например, в определенном типе анализа связывания молекулы могут связываться с тромбином, а затем для конкуренции этим молекулам можно использовать ЕРА или его фрагмент. Молекулы, отобранные в этом конкурентном анализе связывания, дадут молекулы, обладающие свойствами связывания, аналогичными ЕРА, что обеспечивает аналогичные функциональные свойства, такие как антиинфарктная активность.
Из обсуждения, представленного в настоящем описании, должно быть понятно, что существуют самые разнообразные последовательности ЕРА. Например, существуют последовательности ЕРА, которые можно получить от самых разных животных. Также существуют последовательности, которые можно получить от находящихся в состоянии гибернации животных. Табл. 1 показывает примерный перечень последовательностей ЕРА, полученных от ряда различных животных. Последовательности можно сравнивать при помощи стандартных методов с получением процента идентичности для любой из последовательностей. Кроме того, при помощи обсуждаемых в данном описании способов можно получить консенсусную последовательность. Должно быть понятно, что любое сравнение раскрываемых в настоящем описании последовательностей, которое может быть выполнено для получения процента идентичности, конкретно раскрывается вместе с конкретной идентичностью. Например, последовательности человека и сурка отличаются по 4 из 15 положений. Это дает примерно 74% идентичность между ЕРА человека и сурка. Также должно быть понятно, что конкретные фрагменты также можно сравнивать на их идентичность. Например, фрагмент, включающий 10 аминокислот, наиболее близко расположенных от сайта расщепления (6ЕЕЬАЕ666У), отличается у человека и сурка только 1 аминокислотой, что указывает на 90% идентичность этого фрагмента у человека и сурка. Такой тип анализа можно осуществить для любой последовательности ЕРА.
Как раскрывается в настоящем описании, ЕРА человека работает в модели крысы. ЕРА человека и крысы имеют 11 отличий из 15, что указывает на 13% идентичность. Однако следует отметить, что положения 3, 4 и 8 являются высококонсервативными и также сохраняются у крысы. Таким образом, раскрываются последовательности, сохраняющие 6, 6 и Е в положениях 3, 4 и 8 к Ν-концу от сайта расщепления, соответственно, но возможны и другие варианты. Ниже представлены конкретные ЕРА-производные, которые могут быть испытаны в модели МСАО мыши: Табл. 1 представляет ряд последовательностей ЕРА. Эти последовательности отличаются в положениях с 1 по 5, меньше отличаются в положениях с 6 по 10 и имеют 100% гомологию в положениях 11-16.
Дозу можно определить, например, по эффективной дозе плазмы 5 мг/кг как составляющую 1/1000 от 5 мг/кг, плазмы, 0,005 мг/кг фармакофора. Доза 0,005 мг/кг йек-агд-ВК была эффективной.
- 14 010860
Таблица 1
Последовательность Источник 5Е0 ΙΌ ΝΟ:
Вариабельная Активность % д
Консервативная
область область (от
Ν-концу к С-концу)
ΑϋΤϋΚ СЕЕЬАЕССбУВ Сурок 1
А036Е ООГЬАЕбббУВ Человек 2
ΤϋΤΕΟΚ ОЕЕЬЗЕбббУК Мышь 3
АТбТТ 3ΕΕΙΕΑ66ΟΙΒ Крыса 4
ТОРОАОЕ бЕЕЬАЕббСУВ Одногорбый 5
верблюд
ΤΌΡϋΑΟΚ СЕЕЬАЕбббУВ Лама 6
АЕУ£)ОК ОЕГЬАЕОббУК Свинья 7
ТКТЕЕ СЕЕ13Е666УВ Осел 8
ТКЭЕ 6ТГ1АЕ666УВ Кенгуру 9
ЕЭОЗ бЕГЬАЕСССУК Буйвол 10
АОТОЕ ОЕГЬАЕббСУВ. Гиббон 11
ТКАТЕ СЕЕЬАЕбббУВ Тапир 12
АООЗОРУббЕЕЬАЕбббУК Козел 13
АОбЗОРАЗСЕГЬТЕббОУК Мунтжак 14
ΑΌΤΟϋ бОПТЕбббУВ Дрил 15
ТЕЕСЕ ГЬНЕСССУК Лошадь 16
АОбЗОРАббЕГЬАЕбббУК Мышь 17
ГОТКЕЗО ЕЪАЕбббУК Серый тюлень 18
ТКТЕ бЗЕЬАЕСббУВ Вомбат 19
ΤΝ3ΚΕ СЕЕ1АЕ6С6УВ Волк 20
ΤΝ3ΚΕ 6ЕГ1АЕ666УВ Собака 21
ЗОРАб бЕГЬАЕбббУВ Олень 22
ТЕТТЕ бОПАЕбббУВ Носорог 23
ЕОбЗОРРЗбОЕЬТЕбббУВ Корова 24
АОТбЕ бОГЬАЕбббУВ Макак 25
У0Р6Е5Т ГЮЕбАТбВ КРОЛИК 26
ТОСКЕ СЕЕЬАЕбббУВ Медведь 27
АООбК ТТЕЕКЕббббВ Курица 28
бЕЕЬАЕбббУВ 13,4 Синтетическая 89
бЕЕЬАЕбббУ 27,8 Синтетическая 29
СЕЕЬАЕССб 27,2 Синтетическая 30
бЕЕЬАЕбб 22,9 Синтетическая 31
СЕЕЬАЕС 17,5 Синтетическая 32
бЕЕЬАЕ 28,7 Синтетическая 33
СЕРБА 27,3 Синтетическая 34
ЕЕЬАЕбббУК 26,2 Синтетическая 35
ЕЬАЕбббУВ 14,1 Синтетическая 36
ЬАЕСббУК 28,4 Синтетическая 37
АЕбССУВ 15,6 Синтетическая 38
ЕббСУВ 19,9 Синтетическая 39
ЕЕЬАЕ 16,4 Синтетическая 40
ГЬАЕб 22,2 Синтетическая 41
ЬАЕбб 25,8 Синтетическая 42
АЕббб 36,8 Синтетическая 43
ЕбббУ 31,1 Синтетическая 44
бббУВ 13,9 Синтетическая 45
АЕЕЬАЕбббУВ 5,6 Синтетическая 46
САГЬАЕСССУВ 18,3 Синтетическая 47
бЕАЬАЕСббУВ 18,7 Синтетическая 48
СЕЕААЕ6ССУВ 22,4 Синтетическая 49
СЕЕЬбЕОббУК 15,4 Синтетическая 50
СЕЕЬААбббУВ 21,8 51
СЕЕЬАЕАббУК 19,0 52
бЕГЬАЕСАСУВ 28,9 53
СЕЕЬАЕССАУВ 16, 9 54
бЕГЬАЕбббАК 32,3 55
ОЕЕЬАЕббСУА 24,8 56
АЕГЬАЕСССРВ УР067 96
СЕГЬАЕбСбРВ УР068 97
АЕбббРВ УР069 98
бббРК УР070 99
ЕЕЕЬАЕбббУВ УР071 100
АСббУВ УР072 101
ГббУВ УР073 102
АбУВ УР074 103
АУК УР075
ЕбУВ УР076 104
ГУК УР077
Аминокислотные остатки в субстрате, который подвергается расщеплению, обозначены как Р1, Р2, Р3 или Р4 и т.д. в направлении к Ν-концу от разорванной связи. Расщепление происходит между Р1 и Р1', при этом Р1 состоит из аминокислоты аргинина в молекуле РРА, а Р1' обозначает аминокислоту, расположенную к с-концу от аргинина в исходной молекуле фибриногена.
Ь) ЕРА и тромбоз.
ЕРА представляет собой молекулу, являющуюся побочным продуктом в реакции коагуляции, которая образуется, когда тромбин взаимодействует с фибриногеном с образованием нерастворимого фибрина (кровяной сгусток) плюс свободный ЕРА. Свободный ЕРА обычно рассматривают как хороший маркер образования фибрина (ϋΙΙαηί Е., Сакаш М., С1ш. СЫш. Ас!а 2001 8ер. 15; 311 (1): 33-9). ЕРА расположен на Ν-конце молекулы фибриногена, которая при расщеплении приводит к образованию кровяного сгустка. Реакция коагуляции происходит, когда тромбин прикрепляется к вариабельному участку ЕРА, тогда как ЕРА является связанным с фибриногеном. Такое прикрепление возникает при помощи фосфорилирования серина в положении 3 (Машет М.С., е! а1., Вюсйеткйу 1998 Арг. 28; 37 (17): 5888-902). После отщепления ЕРА он экспонирует связи оставшегося фибриногена, которые подвергаются сшивке с другими экспонированными пептидными связями других молекул фибриногена с образованием длинных фибриновых цепей. Уровни ЕРА можно измерить и использовать в качестве маркера клинических состояний заболевания. ЕРА повышен у пациентов с острым инфарктом миокарда, и его уровни повышаются в связи с активацией факторов свертывания крови XI и IX, которые участвуют в активации фибриногена тромбином (Мшпета М.С., е! а1., Ат!епокс1ег. ТйготЬ. Уакс. Βίο1. 2000 Νον.; 20 (11): 2489-93). Фактор XII приводит к коагуляции, способствуя отщеплению ЕРА от фибриногена (Ζίΐο Е., е! а1., С1гси1а!юп 2000 Ос!. 24; 102 (17): 2058-62). Протромбиновый фрагмент (П.2) увеличивается как в связи с ЕРА, так и ишемическими событиями как в области сердца, так и головного мозга (Со!е В., е! а1., 8!гоке 2000 Аид.; 31 (8): 1856-62). Содержание ЕРА в моче повышается у пациентов с болью в груди, которым оказывают неотложную помощь, и это связано с повышенным риском смерти (8опе1 А., е! а1., С1тси1а!юп 2000 8ер. 5; 102 (10): 1107-13).
В экспериментах с животными были исследованы ЕРА-корреляты. У кроликов эволюционная модификация конца вариабельного участка ЕРА в положении 7 (Тйт) предотвращает действие хабутобина, тромбинподобного фермента из яда змеи, по отщеплению ЕРА и ускорению летальной коагулопатии (№цте Т., е! а1., Тохюоп. 2000 Аид.; 38 (8): 1029-41). Тканевый фактор (ТЕ), действующий выше протромбина в пути коагуляции, в целом, как оказалось, опосредует коагуляцию, которая образуется в моделях ишемии/реперфузионного повреждения в выделенном сердце кролика (Аттадашап Ь., е! а1., Согоп. Аг!егу ϋΐδ. 2000 8ер.; 11 (6): 481-7).
ЕРА и тромболиз являются связанными (растворение сгустка). Ό-Димерная молекула получается в результате тромболитической конверсии нерастворимого фибрина (т.е. действие по растворению сгустка), и имеются доказательства, показывающие, что количество этой молекулы увеличивается у некоторых пациентов с острым и хроническим инсультом без существенного увеличения ЕРА Цпсе В., е! а1., ТйтотЬ. Век. 1999 №ν. 1; 96 (3): 169-74). Однако тромболиз при инъекции активатора тканевого плазминогена, вызывающего преобразование плазминогена в плазмин и начало фибринолиза, образующего Ό-димер, приводит к заметному повышению ЕРА; такое повышение может происходить в процессе ингибирования тромбина гепарином (ЕаккЬепбет К., е! а1., 8!токе 1999 Ос!.; 30 (10): 2101-4). Тем не менее, ЕРА может повышаться, не вызывая при этом коагуляцию, и тромболиз может происходить и без изменения уровней ЕРА, хотя обычно это все же происходит при инъекции активаторов тканевого плазминогена (!РА'к).
Повышение уровня ЕРА в процессе тромболиза можно отнести за счет его состояния фосфорилирования. Высокомолекулярный фибриноген (т.е. в котором положение 3 8ег является фосфорилированным) является протромботическим, поскольку фосфорилирование способствует прикреплению тромбина к этой молекуле, как описано выше, способствуя отщеплению ЕРА (Машет М.С., е! а1., Вюсйеткйу 1998 Арг. 28; 37 (17): 5888-902). Высокомолекулярный фибриноген - это то, что больше всего связано с сопутствующими коронарными ишемическими событиями у пациентов с острым инфарктом миокарда (Ведапоп Е., е! а1., ТйтотЬ. Наеток!. 1999 №ν.; 82 (5): 1403-5). Это имеет смысл, поскольку фосфорилирование фибриногена ведет к протромботическому состоянию.
Тромбоз является прямо противоположным тромболизу, тем не менее, неожиданные результаты получают, когда оба эти состояния вызываются одновременно. Фибриноген в кровотоке является на 95% фосфорилированным в период 20-35 ч после обработки ТРА, что приводит к раскрытию закупоренного коронарного сосуда. Однако уровни и фосфорилированого фрагмента ЕРА и НМЖфибриногена повышены у пациентов, которые не демонстрируют раскрытия сосудов после лечения тромболиза (Ведапоп Е., е! а1., ТйтотЬ. Наеток!. 1993 Эес. 20; 70 (6): 978-83). Это объясняется тем, что успешный тромболиз некоторым образом приводит к пониженному фосфорилированию 8ег в положении 3 свободного ЕРА как в его свободном состоянии, так и в связанном с фибриногеном состоянии. Таким образом, по-видимому, существует негативная обратная связь между тромболизом и тромбозом, которая включает фосфорилирование ЕРА. Нефосфорилированный свободный ЕРА, по-видимому, должен быть антитромботическим.
4. Брадикинин.
а) Структура брадикинина.
Брадикинин представляет собой другой специфический активируемый пептид Ό2 по сравнению с
- 16 010860
ΝΕ2. Брадикинин представляет собой пептид, обнаруженный в 1909г., и его описанные ранее известные действия включают: 1) сердечно-сосудистое действие (т.е. сосудосуживающее действие), 2) сенсорно-болевое восприятие (активатор рецептора) и 3) свертывание крови (т.е. путем активации выше путей протромбина (как указано выше)).
Брадикинин представляет собой провоспалительный пептид (ВРРСР8РРК), который высвобождает ся из кининогена под действием фермента калликреина. Брадикинин также является сильным сосудорасширяющим средством, средством, сокращающим различные виды внесосудистой гладкой мускулатуры (например, бронхиальной), и активатором повышенной проницаемости сосудов. Он также вызывает боль, основной показатель воспаления.
Из настоящего описания должно быть понятно, что существуют различные последовательности брадикинина, например последовательности брадикинина, которые могут быть получены от различных видов животных (см., например, табл. 2). Также существуют последовательности, которые могут быть получены от животных, находящихся в состоянии гибернации. Табл. 2 показывает примерный перечень последовательностей брадикинина от ряда различных животных и синтетических последовательностей. Эти последовательности можно сравнивать, и, как обсуждается в данном описании, можно получить процент идентичности для каждой из последовательностей с использованием стандартных методов. Кроме того, используя описываемые здесь способы, можно получить консенсусную последовательность. Должно быть понятно, что любое сравнение раскрываемых здесь последовательностей, которое можно осуществить для получения процента идентичности, конкретно раскрывается вместе с конкретной идентичностью. Например, радужная форель и сурок отличаются по 4 из 10 положений. Это дает приблизительно 60% идентичность между РРА радужной форели и сурка. Также должно быть понятно, что можно сравнивать и конкретные фрагменты на их идентичность. Например, фрагмент, включающий 10 аминокислот непосредственно у сайта расщепления (гррдГкрГ), отличается у радужной форели и сурка 2 аминокислотами, что указывает на 80% идентичность для этого фрагмента у человека и сурка. Такой тип анализа можно выполнить для каждой последовательности РРЛ.
Как раскрывается в данном описании, раскрываемая антиинфарктная молекула, например С-концевой фрагмент РРА сурка, применима в модели крысы или мыши.
В табл. 2 представлен ряд молекул брадикинина и вариантов и таблица (ВК). Антиинфарктные свойства ВК могут осуществляться молекулами, родственными ВК, такими как В9340, и другими производными ВК, содержащими аналоги аминокислот или других химических заместителей, включенных в молекулу. Антиинфарктные свойства ВК могут быть описаны, как указано ниже, с использованием, например, модели инфаркта мыши МСАО.
Последовательности имеют идентичность, и эту идентичность можно определить, как описано ниже.
Таблица 2 Брадикинин и типичные варианты
Наимено в а ние Последовательность Источник ЗЕО ю N0: Активность/% ингибирования ΑΤΙΙ, анализ связывания
Брадикинин Агд-Рго-Рго-С1у-РЬе- Синтети- 57 12
Зег-Рго-Рйе-Агд ческая
Ьуз-(Без- Ьуз-Агд-Рго-Рго-61у- 58 98
Агд9, РЬе-Зег-Рго-Ьеи
ЬеиВ)-
Брадикинин
Ное 140 БАгд-Агд-Рго-Нур-С1у- 59 29
ТЫ-5ег-0Т1с-01с-Агд
БРЬе7] Агд-Рго-Рго-С1у-РЪе- 60 9
Брадикинин Бег-БРИе-РЬе-Агд
Без-Агд9] Агд-Рго-Рго-С1у-РЪе- 61 92
Брадикинин Зег-Рго-РЬе
- 17 010860 [ТМ5,8,Б₽Ъ Агд-Рго-Рго-61у~ТМ- 62 53 е7] Зег-БРИе-ТЫ-Агд
Брадикинин
Ν- Ν-Адамантанацетил- 63 61
Адамантанац БАгд-Агд-Рго-Нур-С1уетил-БАгдО- ТЫ-Зег-БРЬе-ТЫ-Агд
НурЗ,
ТЫ5,8,
БРЪе7]
Брадикинин
Ν- Ν-Адамантанкарбонил- 64 63
Адамантан- БАгдО-НурЗ, ТЫ5,8, карбонил- БРЬе7] Брадикинин
БАгд-АгдРго-НурС1у-ТЬ1Зег-БРЬеΤΗί-Агд
[ЬузО] Ьуз-Агд-Рго-Рго-61у- 65 29
Брадикинин РЬе-Зег-Рго-РЪе-Агд
Меб-ЬузО] Меб-Ъуз-Агд-Рго-Рго- 66 38
Брадикинин С1у-РЬе-5ег-Рго-РНе-
Агд
ЬузО-А1аЗ] Ьуз-Агд-₽го-А1а-С1у- 67 18
Брадикинин РЬе-Зег-Рго-РЬе-Агд
[ТугО] Туг-Агд-Рго-Рго-С1у- 68 33
Брадикинин РЪе-Зег-Рго-РИе-Агд
[Туг8] Агд-Рго-Рго-С1у-РЬе- 69 -1
Брадикинин Зег-Рго-Туг-Агд
Туг5] Агд-Рго-Рго-С1у-Туг- 70 13
Брадикинин Зег-Рго-Рйе-Агд
11е-ЗегО]- 11е-Зег-Агд-Рго-Рго- 71 29
Брадикинин С1у-РЬе-Зег-Рго-РЬе-
Агд
[ЬузО-НурЗ] Ьуз-Агд-Рго-Нур-С1у- 72 13
- 18 010860
Брадикинин РЪе-Зег-Рго-РИе-Агд
[ (рС1)РЬе5, Агд-Рго-Рго-С1у- 73
8] (рС1)РЬе-Зег-Рго-
Брадикинин (рС1)РЬе-Агд
Брадикинин Агд-Рго-Рго 74 -2
(1-3)
Брадикинин Агд-Рго-Рго-С1у-РЬе 75 1
(1-5)
Брадикинин Агд-₽го-Рго-С1у-РЪе- 76 -12
(1-6) Зег
Брадикинин Агд-Рго-Рго-С1у-РЬе- 77 55
(1-7) Зег-Рго
Брадикинин Рго-Рго-З1у-Р11е-Зег- 78 -6
(2-7) Рго
Брадикинин Рго-Рго-С1у-РЬе-5ег- 79 -13
(2-9) Рго-РИе-Агд
В9340 БАгд-Агд-Рго-Нур-СЛу- ТЪ1-5ег-01д1-01с-Агд 80 35
В9430 БАгд-Агд-Рго-Нур-С11у- 1д1-5ег-Б1д1-01с-Агд 81 70
КРРСГЗРГК Сурок 57
КРРСБЗРГК Человек 57
Ι3ΒΡΡ6Γ3ΡΓΚ Человек 82
КЯРРСИЗРЪН Радужная 83
форель
ЕРРСЕТРГН Красноу- 84
хая
черепаха
КРРСГЗРГЯ Травяная 85
лягушка
Т1с=тетрагидроизохинолин-3 '-карбоновая кислота
О1с=октагидроиндо-2'-карбоновая кислота
ТЫ=бета-[2-тиенил] аланин
Нур=гидроксипролин
Антиинфарктные свойства брадикинина могут осуществляться молекулами, родственными брадикинину, обладающими антиинфарктной активностью. Например, бек-атд-ВК обладает активностью, аналогичной или даже большей, чем сам ВК. Эек означает боковую цепь. Например, бек-Атд9 относится к
- 19 010860 брадикинину без С-концевого Агд.
Ь) Функциональные аналоги брадикинина.
Существуют различные варианты брадикинина, многие из которых представлены в табл. 2. Многие из этих вариантов включают нестандартные аминокислотные производные. Например, существуют аналоги Сегерой (также известные как КМР-7 или лобрадамил) (Агд-Рго-Нур-61у-ТЫ-8ег-Рго-Туг (Ме)р81(СН2МН)-Агд, 8ЕЦ ΙΌ N0: 90), лизилбрадикинин (брадикинин с добавленным на Ν-конце лизином), брадикинин с добавленным на С-конце лизином, трифторацетатная соль 7-метоксикумарин-4-ацетил [А1а7-(2,4-динитрофенил)Ьу89]брадикинина (МОСАс-Агд-Рго-Рго-61у-Рйе-8ег-А1а-Рйе-Ьу8-П№, 8ЕЦ ΙΌ N0: 91), Э-Агд-[Нур3, Э-РНе7. Ьеи8] брадикинин (П-Агд-Агд-Рго-Нур-61у-Рйе-8ег-О-Рйе-Ьеи-Агд, 8ЕЦ ΙΌ N0: 92), Э-Агд-[Нур3, 0-РНе7|брадикинин (П-Агд-Агд-Рго-гидрокси-Рго-61у-Рйе-8ег-0-Рйе-Рйе-Агд, 8ЕЦ ΙΌ N0: 93), Э-Агд-[Нур3, ТЫ5,8, 0-РНе7|брадикинин (П-Агд-Агд-Рго-гидрокси-Рго-61у-Ь-(2-тиенил) Л1а-8ег-П-Рйе-Ь-(2-тиенил)А1а-Агд, 8ЕЦ ΙΌ N0: 94), трифторацетатная соль Ьу8-(бе8-Агд9, Ьеи8)брадикинина (бе§(Агд10, Ьеи9)каллидин Н-Ьу8-Агд-Рго-Рго-61у-Рйе-8ег-Рго-Ьеи, 8ЕЦ ΙΌ N0: 95).
Циклические аналоги брадикинина обладают желаемыми свойствами, такими как улучшенная стабильность и повышенная активность и улучшенная специфическая активность. Циклические аналоги брадикинина раскрываются в патенте США № 4187217, который включен в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к вариантам брадикинина. Пример циклического варианта брадикинина показан на фиг. 18. Также существуют различные варианты брадикинина, которые содержат непептидные связи и неаминокислотные аналоги (например, патент США № 5162497, который включен в настоящую заявку посредством ссылки), по крайней мере, что касается материала, относящегося к брадикинину и вариантам брадикинина.
Также существует большое количество различных вариантов брадикинина и молекул, функционирующих подобно брадикинину, таких как функциональные аналоги брадикинина, которые можно найти, например, в НаибЬоок оГ ЕхрепшепЫ РБагтасо1оду, уо1. XXV. Вгаб1к1И1п, КаШбт апб КаШкют. Еб. Е. 6. Егбок. 8рйидегУег1ад, Вег1т-Не1бе1Ьегд, №\ν Уогк, 1970, рр. 1-768, который включен в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к функциональным аналогам брадикинина.
5. Антиинфарктные свойства.
Антиинфарктные свойства РРА или родственных РРА молекул (например, С-концевой фрагмент, 11-мер), или брадикинина или родственных брадикинину молекул (например, ΌΕδ-агд-брадикинин), или любых других антиинфарктных молекул, раскрываемых в настоящей заявке, можно оценить путем определения уменьшения объема инфаркта по сравнению с контролем. Используя модель мыши МСА0, можно определить количество инфарктной ткани после ишемического события. Объем инфаркта можно определить при помощи анализа, и, чем меньше объем инфаркта после ишемического события, тем более активной является испытываемая молекула в предотвращении и реверсировании инфаркта. Например, средний объем инфаркта можно определить как процент от общего объема ткани. Средний объем инфаркта для 11-мерного фрагмента РРА составил 18,5%, что было значительно ниже по сравнению с 54,7% для контролей (р<0,0001). Диапазон объемов инфаркта для ряда различных испытанных животных для производных РРА составил 0-44% по сравнению с 34-71% для контролей. Средний объем инфаркта для ВК составил 33,2%, и 17,0% - для баВК, и 18,0% - для баВК в сочетании с С-концевым фрагментом. Средний объем инфаркта для объединенных групп ВК и баВК (25,2%) был статистически значимым по сравнению с 54,7% для контрольных групп (р<0,003). Диапазон объемов инфаркта для более эффективного баВК составил 9-27% по сравнению с 34-71% для контрольных групп.
Таким образом, один путь определения антиинфарктой эффективности определенной молекулы включает получение инфарктного коэффициента - отношения среднего объема инфаркта контрольной группы, например, без введения молекулы или носителя к среднему объему инфаркта, который имеет место при введении молекулы. Объем инфаркта в этом инфарктном коэффициенте сам по себе представляет отношение количества затронутой инфарктом ткани к общему объему ткани (% инфарктной ткани). Эти объемы можно определить, как раскрывается ниже. Так, антиинфарктная молекула, такая как РРА, или ВК, или их производные, может представлять собой молекулу, имеющую инфарктный коэффициент больше чем 1, или больше чем или равный 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 100000, или больше. Это можно определить, рассмотрев средние объемы или абсолютные объемы для данного испытания. Другой путь определения, является ли молекула антиинфарктной молекулой, состоит просто в рассмотрении абсолютного количества затронутого инфарктом объема, обнаруженного в модели МСАО мыши после введения молекулы. Например, раскрываются антиинфарктные молекулы, такие как РРА, ВК или их производные, которые обеспечивают затронутый инфарктом объем, меньше чем или равный 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%. Это можно определить либо как средние значения, либо как абсолютный объем из данных одного испытания.
6. Композиции, идентифицированные с использованием зависимости от состояния.
В данном описании раскрываются способы идентификации молекул, которые связаны с определен
- 20 010860 ными физиологическими состояниями. Было определено, что раскрываемые способы функционируют, когда состояния являются очень близкими, например, по времени, физиологии и характеристикам. Один пример, который обсуждался в данном описании, представляет собой идентификацию молекул, связанных с антиинфарктной активностью, которые могут быть обнаружены у животных в состоянии гибернации. Этот способ идентификации включал сравнение фракций состояний, наиболее близко соседствующих с гибернацией, для определения разницы, а не сравнение фракций состояния гибернации с фракциями отличного от гибернации состояния. Такая концепция наиболее близкого соседства может быть применима к ряду различных физиологических состояний. Это обеспечивает определение в рамках подсостояния подсостояний и ближайших соседствующих подсостояний. Например, гибернация, пищевое поведение, сон, гипноз, качательные движения при беременности, сила притяжения, невесомость, секс, возникающая после приема пищи эйфория, психотические явления, такие как биполярное, солнечное воздействие, например, вызывающее эйфорию, темные круги в глазах, например, из-за возникающей депрессии, физические нагрузки, гипербаризм или состояния, связанные со стрессом, - все это состояния, которые могут иметь подсостояния и близко соседствующие состояния.
Существуют различные физиологические проявления, которые можно отслеживать, такие как биение сердца, кровяное давление, частота дыхания, ЭЭГ или движение глаз. Это можно измерить любыми способами. Один способ обобщения и анализа таких состояний представляет собой использование нелинейного модифицированного алгоритма соотнесения размерных точек (ΡΌ2ί). В течение многих лет было известно, что измерение изменения частоты сердечных сокращений (НКУ) с использованием линейного стохастического алгоритма (стандартное отклонение, энергетические спектры и т.д.) можно использовать для прогнозирования возможности смерти от аритмии у госпитализированных пациентов с заболеваниями сердца. Прогнозирование (например, статистические данные, касающиеся чувствительности, специфичности и относительного риска), однако, не было очень успешным, таким образом, алгоритм не оказался клинически полезным для отдельных пациентов. Патенты США №№ 5720924 и 5709214 показывают, что анализ НКУ при помощи нелинейного детерминистического алгоритма ΡΌ2ί обнаружил гораздо лучшее прогнозирование, чем линейный стохастический анализ (включены в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к использованию алгоритма ΡΌ2ί).
Таким образом, аналитическое определение ΡΌ2ί является детерминистическим и основано на причинном изменении данных. Для этого не требуется стационарности, и, на самом деле, в этом определении отслеживают непостоянные изменения данных; оно является чувствительным как к хаотическим, так и к нехаотическим линейным данным. Это аналитическое определение основано на предшествующих аналитических определениях, которые вместе являются алгоритмами для определения соотносимых размеров, и оно нечувствительно к непостоянству данных. В силу такой характеристики ΡΌ2ί может прогнозировать клинический результат с большой чувствительностью и специфичностью, что недоступно для других определений. Такое прогнозирование можно улучшить при помощи алгоритма учета помех (заявка на патент США на имя 8к1ппет, 2003). Такой нелинейный алгоритм считается полезным, поскольку способен отслеживать изменения состояния, которые со временем происходят в биологическом организме. Наиболее стохастические измерения требуют постоянства данных, что означает, что генератор данных не может изменить состояние в процессе продуцирования этих данных; т.е. его стохастические свойства не могут измениться (среднее значение, стандартное отклонение и другие параметры должны оставаться без изменения). Однако серии биологических данных постоянно меняют состояние. При решении проблемы нестационарности данных, присущей большей части, если не всем, биологических данных, прогнозирование при помощи алгоритма ΡΌ2ί смерти от аритмии сегодня является клинически полезным. Раскрывается такое устройство, устройство, включающее алгоритм ΡΌ2ί или аналогичный алгоритм, которое можно использовать для получения физиологических данных между состояними и подсостояниями. Такие устройства можно использовать для определения возникающих неуловимых изменений состояния (т.е. подсостояния), т.е. их можно использовать для определения физиологических отличий в рамках состояния, которые определяют два подсостояния. Такие подсостояния могут быть связаны с высвобождением целевой молекулы.
а) Способ ближайшего соседнего подсостояния.
Способ ближайшего соседнего подсостояния характеризуется тем, что устанавливают присутствие двух различных состояний, т. е. подсостояний, содержащихся в рамках предыдущего состояния. Например, в состоянии гибернации, как раскрывается в данном описании, существуют, например, два разных подсостояния, возникающих в связи с брадикардией, которые использовали для идентификации молекул, защищающих от инфаркта. В процессе состояния гибернации существует подсостояние, когда внезапное пробуждение очень часто приводит к случаям смерти. Ближайшее соседнее состояние представляет собой точку в состоянии гибернации, когда пробуждение не приводит к частым случаям смерти. Сравнение подсостояния, приводящего к смерти, с ближайшим соседним подсостоянием, или контролем, не приводящим к смерти, может обеспечить очень специфические молекулярные сравнения, ассоциированные с физиологией.
Таким образом, состояние можно рассматривать как бинарное состояние, такое как сон по сравнению с пробуждением, голод по сравнению с насыщением, болезнь по сравнению со здоровьем и т.д.
- 21 010860
Подсостояние можно охарактеризовать как определенное состояние в рамках состояния, которое определяется и которое дополнительно подразделяет состояние. При определении физиологии или поведения можно разграничивать одно подсостояние от другого в рамках общего состояния, являющегося контрольным. Когда такие подсостояния объединяют с методами, используемыми в протеомике и геномике, для определения молекулярных отличий, могут быть идентифицированы физиологически релевантные молекулы. Такой подход, как продемонстрировано в данном описании, позволяет определить многие молекулярные отличия, а в некоторых случаях - все отличия, связанные с физиологией.
Ь) Различные типы состояний.
Физиологические подсостояния, помимо тех, в которых присутствуют антиинфарктные молекулы, временно присутствуют для поддержания более значительного общего состояния, такого как гибернация. Например, у находящихся в состоянии гибернации беременных самок медведя, у которых отсутствует мочеиспускание, образуются комплексные молекулы во все больших и больших количествах для растущего плода, так что у них должна быть соответствующая физиология, чтобы справиться с накоплением мочевины в крови, и препятствующая, таким образом, и уремической токсичности в их собственном организме. В настоящем описании раскрываются физиологические данные, которые показывают, что мочевина с двойной меткой, инъецированная лабораторным крысам, находящимся в нормальном состоянии бодрствования (1, 2 или 3 мг/крыса), может быть стимулирована в/в инъекцией связанных с гибернацией фракций молекул (т.е. Ό2, Ό01 при дозе 20 мг/кг) с образованием мочевины с одной меткой (т.е. рециркуляционной мочевины). По состоянию на 3 ч после инъекции связанной с гибернацией фракции молекул, среднее значение, превышающее индивидуальное для каждого животного фоновое значение, составило примерно 50% по сравнению с контролем (в/в, ксеноальбумин, 20 мг/кг) (р<0,025) и становилось даже более значимым по состоянию на 6 ч после инъекции (р<0,01). По состоянию на 6 ч после инъекции, было обнаружено повышение скорости рециркуляции мочевины более чем в 13 раз.
7. Композиции, идентифицированные методом скрининга с использованием раскрываемых композиций/комбинаторной химии.
Должно быть понятно, что то, что ЕРА и брадикинин обладают антиинфарктными свойствами, означает, что знание того, с чем взаимодействуют ЕРА и брадикинин, можно использовать для идентификации молекул, функционирующих подобно ЕРА и брадикинину в конкретном анализе, и затем эти молекулы могут быть испытаны в моделях инфаркта, которые были раскрыты, для определения их активности. Например, имеющуюся информацию о связывании ЕРА и тромбина можно использовать для выделения молекул, которые связываются с тромбином так же, как и ЕРА, и эти молекулы могут быть испытаны в известных моделях инфаркта.
Например, раскрываются эксперименты по отбору, в которых выделяют конкурирующие ингибиторы связывания ЕРА и тромбина. Таким образом, существует множество путей получения антиинфарктных молекул, в том числе молекул, которые могут быть получены путем синтеза молекул, которые можно выделить методами скрининга.
Также должно быть понятно, что можно выделить множество молекул, включающих, но не ограничивающихся этим, варианты белков, антитела, функциональные нуклеиновые кислоты и пептидные миметики. Далее следует обсуждение тех или других молекул, включая малые молекулы, которые могут быть определены как обладающие антиинфарктными свойствами подобно ЕРА и брадикинину. Должно быть понятно, что ЕРА и брадикинин относятся ко всем вариантам и производным ЕРА и брадикинина, соответственно, т.е. они обладают некоторой степенью идентичности с ЕРА и брадикинином. Молекулы, которые могут функционировать как ЕРА и/или брадикинин, но не имеют структуры на основе аминокислот, называют антиинфарктными молекулами, обладающими особыми свойствами, такими как активность ЕРА или активность брадикинина.
Раскрываются способы получения антиинфарктной молекулы, включающие синтезирование антиинфарктной молекулы или варианта антиинфарктной молекулы, где антиинфарктная молекула может быть очищена способом, включающим: 1) взятие образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного, 2) взятие второго образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного, 3) сравнение образца крови со вторым образцом крови, где образец крови берут в период, составляющий меньше чем или равный 25 дней после начала гибернаци, а второй образец крови берут в период, составляющий больше чем 25 дней после начала гибернации, и где антиинфарктная молекула присутствует в больших количествах в образце крови по сравнению со вторым образцом крови.
Раскрываются способы получения антиинфарктной молекулы, включающие синтезирование антиинфарктной молекулы или варианта антиинфарктной молекулы, где антиинфарктная молекула может быть очищена способом, включающим: 1) взятие образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного, 2) взятие второго образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного, 3) сравнение образца крови со вторым образцом крови, где образец крови берут в период, составляющий меньше чем или равный 25 дней до конца гибернации, а второй образец крови берут в период, составляющий больше чем 25 дней после начала гибернации, но больше чем за 25 дней до окончания гибернации, и где антиинфарктная молекула присутствует в больших количествах в образце крови по сравнению со вторым образцом крови.
- 22 010860
Также раскрываются способы идентификации антиинфарктной молекулы, включающие введение молекулы модели мыши с МСАО, сравнение антиинфарктной активности молекулы с антиинфарктой активностью ЕРА в модели мыши с МСАО и отбор молекулы, если антиинфарктная активность молекулы составляет по меньшей мере 20% от активности ЕРА.
Раскрываются способы идентификации ингибитора взаимодействия между брадикинином и рецептором ангиотензина II, включающие контактирование клетки, экспрессирующей рецептор типа 2 ангиотензина II, с предполагаемым ингибитором в присутствии брадикинина; определение количества брадикинина, связавшегося с рецептора типа 2 ангиотензина II; где снижение связывания брадикинина с рецептором типа 2 ангиотензина II указывает на то, что это вещество является ингибитором.
Раскрываются способы идентификации ингибитора взаимодействия между брадикинином и рецептором типа 2 ангиотензина II, включающие контактирование клетки, экспрессирующей рецептор типа 2 ангиотензина II, с предполагаемым ингибитором в присутствии брадикинина, где рецептор типа 2 ангиотензина II включает донор флуоресценции, где брадикинин включает акцептор флуоресценции; и измерение передачи энергии методом резонанса флуоресценции (ЕКЕТ), где уменьшение ЕКЕТ по сравнению с полученным значением ЕКЕТ в клетке, которая не контактировала с предполагаемым ингибитором, указывает на присутствие ингибитора.
Раскрываются способы идентификации ингибитора взаимодействия между брадикинином и рецептором типа 2 ангиотензина II, включающие контактирование клеточной системы с предполагаемым ингибитором, где клеточная система включает рецептора типа 2 ангиотензина II, где клеточная система включает брадикинин, где рецептор типа 2 ангиотензина II включает донор флуоресценции и где брадикинин включает акцептор флуоресценции; и измерение передачи энергии методом резонанса флуоресценции (ЕКЕТ) до контактирования клеточной системы с предполагаемым ингибитором и после контактирования клеточной системы с предполагаемым ингибитором, где уменьшение ЕКЕТ в клеточной системе, когда предполагаемый ингибитор контактировал с предполагаемым ингибитором, указывает на присутствие ингибитора. Клеточная система означает клетку, содержащую необходимые компоненты для функционирования и анализа, как раскрывается в настоящей заявке.
Раскрываются способы, дополнительно включающие стадию испытания идентифицированного ингибитора в ίη νίνο модели инфаркта и отбор молекул, уменьшающих инфаркт в моделях животных.
Раскрываются способы, где предполагаемый ингибитор обнаружен в библиотеке молекул.
Раскрываются способы скрининга антиинфарктной молекулы, модулирующей рецептор типа 2 ангиотензина II, включающие контактирование модели инфаркта животного, известной в качестве экспрессирующей рецептор ангиотензина II, с предполагаемой антиинфарктной молекулой в отсутствие экзогенного брадикинина; оценку на наличие инфаркта; и соотнесение отсутствия инфаркта с присутствием антиинфарктного миметика брадикинина, который модулирует рецептор ангиотензина II.
Раскрываются способы скрининга антиинфарктной молекулы, которая модулирует рецептор типа 2 ангиотензина II, включающие контактирование модели инфаркта животного, известной в качестве экспрессирующей рецептор ангиотензина II, с предполагаемой антиинфарктной молекулой в отсутствие брадикинина; определение отсутствия или наличия; и соотнесение отсутствия инфаркта с присутствием антиинфарктной молекулы, которая модулирует рецептор ангиотензина II.
Раскрываются способы, где предполагаемый антиинфарктный миметик представляет собой агонист или антагонист рецептора ангиотензина II.
Раскрываются способы идентификации предполагаемой антиинфарктной молекулы, включающие контактирование клетки, экспрессирующей рецептор типа 2 ангиотензина II, с предполагаемой антиинфарктной молекулой в присутствии брадикинина; определение уменьшения связывания брадикинина с рецептором типа 2 ангиотензина II и соотнесение уменьшения связывания брадикинина с рецептором типа 2 ангиотензина II с присутствием антиинфарктной молекулы.
Должно быть понятно, что эти способы можно использовать для обнаружения ингибиторов взаимодействия между брадикинином и рецептором типа 2 ангиотензина II.
Раскрываются способы идентификации предполагаемой антиинфарктной молекулы, включающие контактирование клетки, экспрессирующей рецептор типа 2 ангиотензина II, функционально связанный с донором флуоресценции, с брадикинином, функционально связанным с акцептором флуоресценции, и предполагаемой антиинфарктной молекулой; и измерение передачи энергии методом резонанса флуоресценции (ЕКЕТ), где уменьшение ЕКЕТ по сравнению с величиной ЕКЕТ, измеренной в клетке, которая не контактировала с предполагаемой антиинфарктной молекулой, указывает на присутствие антиинфарктной молекулы.
Должно быть понятно, что раскрываемые способы могут дополнительно включать испытание выделенных соединений или композиций в модели животного, например ишемии. Например, размер инфаркта, который происходит в присутствии выделенных молекул, можно измерить и сравнить с размером инфаркта, который имеет место в отсутствие молекулы. Модели животных, как раскрывается в настоящей заявке, также можно использовать для бе ηονο выделения антиинфарктных молекул, как раскрывается в настоящей заявке. В частности, модели животных можно использовать для конкурентного связывания предполагаемой антиинфарктной молекулы, например, с брадикинином, или ЕРА, или их
- 23 010860 вариантами или производными.
Раскрываемые способы также можно использовать с библиотеками молекул для скрининга активных композиций или соединений. Обычно способы включают стадию отделения активных молекул от неактивных молекул при скрининге библиотеки, как раскрывается в настоящей заявке.
Раскрываются способы лечения субъектов, нуждающихся в уменьшении инфаркта, включающие введение эффективного количества выделенных молекул с использованием раскрываемых способов.
Должно быть понятно, что раскрываемые способы можно применить на практике для церебрального инфаркта, инфаркта миокарда или других типов инфаркта.
Должно быть понятно, что инфаркты, представляющие собой области некротической ткани, могут возникать разными путями, но обычно инфаркт возникает в результате ишемии, или снижения количества кислорода в области ткани. Потеря кислорода и последующая реперфузия, если это происходит, могут вызвать образование некротической ткани. Раскрываемые способы разработаны для снижения эффектов ишемических событий, такие как инфаркты, вызванные реперфузией и/или кислородной недостаточностью. Такие типы событий возникают, например, во время инсульта, когда происходит блокада кровеносного сосуда в церебральной ткани, приводящая к ишемии или событиям, связанным с сердечной деятельностью, таким как сердечный приступ, где блокада коронарной артерии вызывает ишемию.
Лечение ишемии обычно включает уменьшение блокады. Например, нитроглицерин лечит ишемию (раскрывает закупоренные коронарные сосуды несколько больше нормы и снимает стенокардическую боль от ишемии). Задержка кровотока вызывает ишемию. Модель МСАО у мыши воспроизводит ишемию и устанавливает стадию возникновения инфаркта, как правило, на момент 24 ч. Происходит именно предотвращение/лечение инфаркта, т.к. кровоток восстанавливается во время инъекции раскрываемых композиций, и поэтому ткань уже больше не является ишемической. Антиинфарктные молекулы иногда называют нейропротекторными лекарственными средствами. Существует множество различных типов молекул, которые могут обладать антиинфарктной активностью, как у БРА или брадикинина. Примеры таких соединений обсуждаются ниже.
а) Функциональные нуклеиновые кислоты.
Функциональные нуклеиновые кислоты представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, которые обладают специфической функцией, такой как связывание молекулы-мишени или катализ специфической реакции. Функциональные молекулы нуклеиновых кислот можно разделить на следующие категории, которые не должны рассматриваться как ограничивающие. Например, функциональные нуклеиновые кислоты включают антисмысловые молекулы, аптамеры, рибозимы, образующие триплекс молекулы и внешние направляющие последовательности. Функциональные молекулы нуклеиновых кислот могут действовать как аффекторы, ингибиторы, модуляторы и стимуляторы специфической активности, которой обладает молекула-мишень, или функциональные молекулы нуклеиновых кислот могут обладать бе поуо активностью, независимой от каких-либо других молекул.
Функциональные молекулы нуклеиновых кислот могут взаимодействовать с любой макромолекулой, такой как ДНК, РНК, полипептиды или углеводные цепи. Таким образом, функциональные нуклеиновые кислоты могут взаимодействовать с мРНК БРА или брадикинина или молекулами, с которыми они взаимодействуют, такими как тромбин или его фрагменты, или геномной ДНК БРА или брадикинина или молекулами, с которыми они взаимодействуют, такими как тромбин или его фрагменты, или они могут взаимодействовать с полипептидом БРА или брадикинина или молекулами, с которыми они взаимодействуют, такими как тромбин или его фрагменты. Часто функциональные нуклеиновые кислоты разработаны для взаимодействия с другими нуклеиновыми кислотами на основе гомологии последовательностей между молекулой-мишенью и молекулой функциональной нуклеиновой кислоты. В других ситуациях специфическое распознавание между функциональной молекулой нуклеиновой кислоты и молекулоймишенью не основано на гомологии последовательностей между функциональной молекулой нуклеиновой кислоты и молекулой-мишенью, а, скорее, основано на образовании третичной структуры, которая позволяет осуществить специфическое распознавание.
Антисмысловые молекулы предназначены для взаимодействия с являющейся мишенью молекулой нуклеиновой кислоты через происходящее по правилам либо не по правилам спаривание оснований. Взаимодействие антисмысловой молекулы и молекулы-мишени предназначено для инициации разрушения молекулы-мишени через, например, РНКазу и опосредованный распад гибрида РНК-ДНК. Альтернативно, антисмысловая молекула предназначена для прерывания функции процессинга, которая обычно должна осуществляться на молекуле-мишени, такой как транскрипция или репликация. Антисмысловые молекулы могут быть сконструированы на основе последовательности молекулы-мишени. Существуют различные способы оптимизации антисмысловой эффективности путем обнаружения наиболее доступных участков молекулы-мишени. Примеры способов включают ш νίίτο эксперименты по отбору и исследованию модификаций ДНК с использованием ΌΜ8 и ИЕРС. Предпочтительно, чтобы антисмысловые молекулы связывались с молекулой-мишенью с константой диссоциации (кб) меньше чем 10-6. Более предпочтительно, чтобы антисмысловые молекулы связывались с кб меньше чем 10-8. Еще более предпочтительно, чтобы антисмысловые молекулы связывались с молекулой-мишенью с кб меньше чем 10-10. Также еще более предпочтительно, чтобы антисмысловые молекулы связывались с молекулой-мишенью
- 24 010860 с к,| меньше чем 10-12. Типичные примеры способов и процедур, которые могут быть полезными при конструировании и использовании антисмысловых молекул, можно найти в следующих патентах США (но этот перечень не является ограничивающим): 5135917, 5294533, 5627158, 5641754, 5691317, 5780607, 5786138, 5849903, 5856103, 5919772, 5955590, 5990088, 5994320, 5998602, 6005095, 6007995, 6013522, 6017898, 6018042, 6025198, 6033910, 6040296, 6046004, 6046319 и 6057437.
Аптамеры представляют собой молекулы, которые взаимодействуют с молекулой-мишенью предпочтительно специфическим образом. Как правило, аптамеры представляют собой небольшие нуклеиновые кислоты длиной в пределах 15-50 оснований, которые складываются в определенные вторичные или третичные структуры, такие как стержнепетлевые или 6-квартеты. Аптамеры могут связываться с небольшими молекулами, такими как АТР (патент США 5631146) и теофилин (патент США 5580737), а также с большими молекулами, такими как обратная транскриптаза (патент США 5786462) и тромбин (патент США 5543293). Аптамеры могут связываться с молекулой-мишенью очень прочно с к,| менее чем 10-12 М. Предпочтительно, когда аптамеры связываются с молекулой-мишенью с кй меньше чем 10-6. Более предпочтительно, когда аптамеры связываются с молекулой-мишенью с к,| меньше чем 10-8. Еще более предпочтительно, когда аптамеры связываются с молекулой-мишенью с к,| меньше чем 10-10. Также предпочтительно, когда аптамеры связываются с молекулой-мишенью с к,| меньше чем 10-12. Аптамеры могут связываться с молекулой-мишенью с высокой степенью специфичности. Например, были выделены аптамеры, которые имеют отличие более чем в 10000 раз в сродстве связывания между молекулоймишенью и другой молекулой, которая отличается только по одному положению в молекуле (патент США 5543293). Предпочтительно, когда аптамер имеет кй с молекулой-мишенью по меньшей мере в 10 раз меньше, чем к,| с фоновой связывающейся молекулой. Более предпочтительно, когда аптамер имеет кй с молекулой-мишенью по меньшей мере в 100 раз меньше, чем к,| с фоновой связывающейся молекулой. Еще более предпочтительно, когда аптамер имеет к,| с молекулой-мишенью по меньшей мере в 1000 раз меньше, чем к,| с фоновой связывающейся молекулой. Предпочтительно, когда аптамер имеет кй с молекулой-мишенью по меньшей мере в 10000 раз меньше, чем к,| с фоновой связывающейся молекулой. Предпочтительно, когда осуществляют сравнение, например, полипептида, чтобы фоновая молекула представляла другой полипептид. Например, при определении специфичности аптамеров БРА или брадикинина или молекул, с которыми они взаимодействуют, таких как тромбин или его фрагменты, фоновый белок может быть сывороточным альбумином. Репрезентативные примеры получения и использования аптамеров для связывания ряда различных молекул-мишеней можно найти в следующих патентах США (но этот перечень не является ограничивающим): 5476766, 5503978, 5631146, 5731424, 5780228, 5792613, 5795721, 5846713, 5858660, 5861254, 5864026, 5869641, 5958691, 6001988, 6011020, 6013443, 6020130, 6028186, 6030776 и 6051698.
Рибозимы представляют собой молекулы нуклеиновых кислот, способные катализировать химическую реакцию либо на внутримолекулярном, либо на межмолекулярном уровне. Таким образом, рибозимы представляют собой каталитические нуклеиновые кислоты. Предпочтительно, когда рибозимы катализируют межмолекулярные реакции. Существует много различных типов рибозимов, которые катализируют реакции нуклеазного типа или полимеразы нуклеиновых кислот, которые основаны на рибозимах, обнаруженных в природных системах, таких как рибозимы акулы-молота (например, но не ограничиваясь ими, следующие патенты США: 5334711, 5436330, 5616466, 5633133, 5646020, 5652094, 5712384, 5770715, 5856463, 5861288, 5891683, 5891684, 5985621, 5989908, 5998193, 5998203, заявка АО 9858058 на изобретение Ьийтад и 8ргоа1, заявка АО 9858057 на изобретение Ьийтад и 8ргоа1, заявка АО 9718312 на изобретение и 8ргоа1), рибозимы в виде шпилек (например, но не ограничиваясь ими, следующие патенты США: 5631115, 5646031, 5683902, 5712384, 5856188, 5866701, 5869339 и 6022962) и 1е1гаЬушепа-рибозимы (например, но не ограничиваясь ими, следующие патенты США: 5595873 и 5652107). Также существует множество рибозимов, которые не были обнаружены в природных системах, но которые были сконструированы для катализа специфических реакций йе ηονο (например, но не ограничиваясь ими, следующие патенты США: 5580967, 5688670, 5807718 и 5910408). Предпочтительные рибозимы расщепляют РНК- или ДНК-субстраты и более предпочтительно расщепляют РНК-субстраты. Рибозимы обычно расщепляют нуклеиново-кислотные субстраты через распознавание и связывание с мишеневым субстратом с последующим расщеплением. Такое распознавание часто основано, большей частью, на происходящих по правилам и не по правилам взаимодействиях пар оснований. Такое свойство делает рибозимы особенно хорошими кандидатами для нацеливания специфического расщепления нуклеиновых кислот, поскольку распознавание являющегося мишенью субстрата основано на последовательности мишеневых субстратов. Репрезентативные примеры, как можно получить и использовать рибозимы для катализа ряда различных реакций, можно найти в следующих патентах США (но этот перечень не является ограничивающим): 5646042, 5693535, 5731295, 5811300, 5837855, 5869253, 5877021, 5877022, 5972699, 5972704, 5989906 и 6017756.
Образующие триплекс функциональные молекулы нуклеиновых кислот представляют собой молекулы, которые могут взаимодействовать либо с двухцепочечной, либо с одноцепочечной нуклеиновой кислотой. Когда молекулы триплекса взаимодействуют с мишеневым участком, образуется структура, называемая триплексом, в которой присутствуют три цепи ДНК, образующие комплекс в зависимости
- 25 010860 от спаривания оснований как по ^а18оп-Сг1ск, так и по НоодЧееп. Молекулы триплекса являются предпочтительными, поскольку они могут связываться с мишеневыми участками с высоким сродством и специфичностью. Предпочтительно, чтобы образующие триплекс молекулы связывались с молекулой-мишенью с к4 меньше чем 10-6. Более предпочтительно, чтобы образующие триплекс молекулы связывались с ка меньше чем 10-8. Еще более предпочтительно, чтобы образующие триплекс молекулы связывались с молекулой-мишенью с ка меньше чем 10-10. Также предпочтительно, чтобы образующие триплекс молекулы связывались с молекулой-мишенью с ка меньше чем 10-12. Репрезентативные примеры получения и использования образующих триплекс молекул для связывания ряда различных молекул-мишеней можно найти в следующих патентах США (но этот перечень не является ограничивающим): 5176996, 5645985, 5650316,5683874, 5693773, 5834185, 5869246, 5874566 и 5962426.
Внешние направляющие последовательности (ЕС8) представляют собой молекулы, которые связываются с мишеневой молекулой нуклеиновой кислоты, образуя комплекс, и этот комплекс распознается РНКазой Р, которая расщепляет молекулу-мишень. ЕС8 могут быть сконструированы для специфического нацеливания на выбранную молекулу РНК. РНКаза Р способствует процессингу транспортной РНК (1РНК) в клетке. Бактеримальная РНКаза Р может быть рекрутирована для расщепления, по существу, любой последовательности РНК с использованием ЕС8, являющегося причиной того, что мишеневый комплекс РНК:ЕС8 имитирует природного субстрата 1РНК (заявка XVΟ 92/03566 на изобретение Υа1е и Еогйег и А11тап, 8с1епсе 238: 407-409 (1990)).
Подобным образом, направляемое ЕС8/РНКазой Р расщепление РНК можно использовать для расщепления желаемых мишеней в эукариотических клетках (Ύιιηη е! а1., Ргос. №И. Асаа. 8с1. И8А 89: 80068010 (1992); заявка νΟ 93/22434 на изобретение Υа1е; заявка νΟ 95/24489 на изобретение Υа1е; Υиаη и А1!тап, ЕМВΟ 1. 14: 159-168 (1995), и Саггага е! а1., Ргос. N311. Асаа. δα. (И8А) 92: 2627-2631 (1995)). Репрезентативные примеры получения и использования молекул ЕС8 для способствования расщеплению ряда различных молекул-мишеней можно найти в следующих патентах США (но этот перечень не является ограничивающим): 5168053, 5624824, 5683873, 5728521, 5869248 и 5877162.
Ь) Комбинаторная химия.
Раскрываемые композиции можно использовать в качестве мишеней для любого комбинаторного метода идентификации молекул или макромолекулярных молекул, которые взаимодействуют с раскрываемыми композициями, желаемым образом. Нуклеиновые кислоты, пептиды и родственные молекулы, раскрываемые в настоящей заявке, можно использовать в качестве мишеней для комбинаторных подходов. Также раскрываются композиции, идентифицированные при помощи комбинаторных методов или методов скрининга, в которых композиции, раскрытые в табл. 1 или 2, или их части используют в качестве мишени в комбинаторном или скрининговом протоколе или композиции, которые взаимодействуют с последовательностями, представленными в табл. 1 или 2, или их части используют в качестве мишени в комбинаторном или скрининговом протоколе.
Должно быть понятно, что при использовании раскрываемых композиций в комбинаторных методах или методах скрининга можно идентифицировать молекулы, такие как макромолекулярные молекулы, которые обладают конкретными желаемыми свойствами, такими как ингибирование или стимулирование функции молекулы-мишени. Молекулы, идентифицированные и выделенные с использованием раскрываемых композиций, таких как композиции, раскрытые в табл. 1 или 2, или их части или композиции, которые взаимодействуют с последовательностями, представленными в табл. 1 или 2, или их части, также раскрываются в настоящей заявке. Таким образом, продукты, полученные с использованием комбинаторного или скринингового подхода, включающего использование раскрываемых композиций, таких как композиции, раскрытые в табл. 1 или 2, или их части или композиции, которые взаимодействуют с последовательностями, представленными в табл. 1 или 2, или их части, также считаются раскрытыми в настоящей заявке. Комбинаторная химия включает, но не ограничивается этим, все способы выделения небольших молекул или макромолекул, которые способны связываться либо с небольшой молекулой, либо с другой макромолекулой, типично, итеративным способом. Белки, олигонуклеотиды и сахара являются примерами макромолекул. Например, молекулы олигонуклеотидов с определенной функцией, каталитической или связывания лиганда, можно выделить из сложной смеси случайных олигонуклеотидов способом, который был назван ίη уйго генетика (ЬхоЧак, ΤΙΒ8 19: 89, 1992). В этом способе синтезируют большую группу молекул, несущих случайные и определенные последовательности, и подвергают такую сложную смесь, например приблизительно 1015 отдельных последовательностей в 100 мкг 100 нуклеотидов РНК, некоторой селекции и обогащению. Посредством повторных циклов аффинной хроматографии и ПЦР амплификации молекул, связывающихся на колонке с лигандом, Е11тд!оп и 8хо51ак (1990) установили, что 1 из 1010 молекул РНК образует такую структуру, которая связывается с небольшими молекулами красителя. Были также выделены молекулы ДНК, обладающие такими свойствами связывания с лигандом (Е11тд!оп апа 8хо51ак 1992; Воск е! а1., 1992). Методы, направленные на выполнение аналогичных задач, существуют для небольших органических молекул, белков, антител и других макромолекул, которые известны специалистам в данной области. Набор молекул для скрининга на желаемую активность, основан ли он на небольших органических библиотеках, олигонуклеотидах или антителах, в широком смысле называют комбинаторной химией. Комбинаторные методы являются особенно подхо- 26 010860 дящими для определения реакций связывания между молекулами и для выделения молекул, обладающих специфической активностью связывания, часто называемых аптамерами, когда макромолекулы представляют собой нуклеиновые кислоты.
Существует множество способов выделения белков, которые обладают либо бе поуо активностью, либо модифицированной активностью. Например, библиотеки представления фагов использовались для выделения различных пептидов, которые взаимодействуют со специфической мишенью (см., например, патенты США №№ 6031071; 5824520; 5596079 и 5565332, которые включены в настоящее описание посредством ссылки, по крайней мере, в том, что касается материала, относящегося к представлению фагов, и способов, относящихся к комбинаторной химии).
Предпочтительный способ выделения белков, обладающих заданной функцией, описан КоЬеПк и 8хок1ак (КоЬейк К.У. апб 8хок1ак к\У. Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 94 (23): 12997-302 (1997)). Такой способ комбинаторной химии объединяет функциональную активность белков с генетической способностью нуклеиновых кислот. Образуется молекула РНК, где молекула пурамицина является ковалентно присоединенной к 3'-концу молекулы РНК. 1п νίΙΐΌ трансляция такой модифицированной молекулы РНК приводит к правильному белку, кодируемому РНК, которая подлежит трансляции. Кроме того, из-за присоединения пурамицина, пептидильного акцептора, который не может быть удлинен, растущая петидная цепь присоединяется к пурамицину, который присоединен к РНК. Таким образом, молекула белка связывается с генетическим материалом, который ее кодирует. Теперь можно осуществлять обычные процедуры отбора 1п νίΙΐΌ для выделения функциональных пептидов. По окончании процедур отбора по функции пептидов осуществляют традиционные манипуляции с нуклеиновыми кислотами для амплификации нуклеиновой кислоты, которая кодирует выбранные функциональные пептиды. После амплификации генетического материала новую РНК подвергают транскрипции с пурамицином по 3'-концу, транслируется новый пептид, и осуществляют следующий функциональный раунд отбора. Таким образом, отбор белков можно осуществлять итеративным способом, таким же, как и способ отбора нуклеиновых кислот. Транслируемый пептид регулируется последовательностью РНК, связанной с пурамицином. Эта последовательность может представлять собой любую из случайной последовательности, созданной для оптимальной трансляции (т.е. без стоп-кодонов и т.д.), или это может быть вырожденная последовательность известной молекулы РНК для поиска улучшенной или измененной функции известного пептида. Условия для амплификации нуклеиновых кислот и ш ν 11го трансляции хорошо известны специалистам среднего уровня, и их предпочтительно осуществляют, как описано КоЬеПк и 8хок1ак (КоЬеПк К.У. апб 8хок1ак к\У. Ргос. ЫаД. Асаб. 8с1. И8А, 94 (23): 12997-302 (1997)).
Следующий предпочтительный способ, относящийся к комбинаторным способам, разработанным для выделения пептидов, описан Сокеп е! а1. (Сокеп В.А., е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 95 (24): 14272-7 (1998)). Этот способ использует и модифицирует двухгибридную технологию. Двухгибридные системы дрожжей являются полезными для определения и анализа взаимодействия белок:белок. Двухгибридная система, первоначально описанная в дрожжах 8асскаготусек се1^151ае, является мощным молекулярногенетическим методом идентификации новых регуляторных молекул, специфических в отношении представляющего интерес белка (Е1е1бк апб 8опд, ЫаШге 340: 245-6 (1989)). Сокеп е! а1. модифицировали этот метод таким образом, чтобы можно было идентифицировать новые взаимодействия между синтетическими или полученными инженерными методами пептидными последовательностями, которые связываются с выбранной молекулой. Преимущество такой технологии в том, что выбор осуществляют во внутриклеточной среде. В этом способе используют библиотеку пептидных молекул, которые связываются с доменом кислотной активации. Выбранный пептид, например внеклеточная часть композиций, раскрытых в табл. 1 или 2, или их частей или композиций, которые взаимодействуют с последовательностями, представленными в табл. 1 или 2, или их частей, связывается с ДНК-связывающим доменом белка, активирующего транскрипцию, такого как Са1 4. Применяя двухгибридный метод к такого типа системе, можно идентифицировать молекулы, связывающиеся с ЕРА или брадикинином, или молекулы, с которыми они взаимодействуют, такие как тромбин, или их фрагменты.
Используя методику, хорошо известную специалистам в данной области, в сочетании с различными комбинаторными библиотеками, можно выделить и охарактеризовать те небольшие молекулы или макромолекулы, которые связываются или взаимодействуют с желаемой мишенью. Можно сравнить относительное сродство связывания этих соединений и идентифицировать оптимальные соединения при помощи анализов конкурентного связывания, хорошо известных специалистам в данной области.
Методы получения комбинаторных библиотек и скрининга комбинаторных библиотек для выделения молекул, которые связываются с желаемой мишенью, хорошо известны специалистам в данной области. Репрезентативные приемы и методы можно найти в следующих патентах США, но этот перечень не является ограничивающим: 5084824, 5288514, 5449754, 5506337, 5539083, 5545568, 5556762, 5565324, 5565332, 5573905, 5618825, 5619680, 5627210, 5646285, 5663046, 5670326, 5677195, 5683899, 5688696,
5688997, 5698685, 5712146, 5721099, 5723598, 5741713, 5792431, 5807683, 5807754, 5821130, 5831014,
5834195, 5834318, 5834588, 5840500, 5847150, 5856107, 5856496, 5859190, 5864010, 5874443, 5877214,
5880972, 5886126, 5886127, 5891737, 5916899, 5919955, 5925527, 5939268, 5942387, 5945070, 5948696,
5958702, 5958792, 5962337, 5965719, 5972719, 5976894, 5980704, 5985356, 5999086, 6001579, 6004617,
- 27 010860
6008321,6017768, 6025371, 6030917,6040193, 6045671, 6045755, 6060596 и 6061636.
Комбинаторные библиотеки могут быть получены из широкого ряда молекул при помощи различных приемов синтеза. Например, библиотеки, содержащие конденсированные 2,4-пиримидиндионы (патент США 6025371), дигидробензопираны (патенты США 60177 68 и 5821130), амидные спирты (патент США 5976894), амиды гидроксиаминокислот (патент США 5972719), углеводы (патент США 5965719), 1,4-бензодиазепин-2,5-дионы (патент США 5962337), циклические соединения (патент США 5958792), амиды биариламинокислот (патент США 5948696), тиофены (патент США 5942387), трициклические тетрагидрохинолины (патент США 5925527), бензофураны (патент США 5919955), изохинолины (патент США 5916899), гидантоин и тиогидантоин (патент США 5859190), индолы (патент США 5856496), имидазолпиридоиндол и имидазолпиридобензотиофены (патент США 5856107), замещенные 2-метилен-2,3дигидротиазолы (патент США 5847150), хинолины (патент США 5840500), РНК (патент США 5831014), содержащие метки соединения (патент США 5721099), поликетиды (патент США 5712146), субъединицы морфолино (патенты США 5698685 и 5506337), сульфамиды (патент США 5618825) и бензодиазепины (патент США 5288514).
Скрининг молекул, аналогичных тромбину, для ингибирования связывания ЕРА представляет собой способ выделения желаемых соединений.
Как используется в данном описании, комбинаторные способы и библиотеки включают традиционные методы скрининга и библиотеки, а также методы и библиотеки, используемые в повторяющихся процессах.
с) Компьютерное моделирование лекарственных средств.
Раскрываемые композиции можно использовать в качестве мишеней для способов молекулярного моделирования либо для идентификации структуры раскрываемых композиций, либо для идентификации потенциальных или реальных молекул, таких как небольшие молекулы, которые взаимодействуют желаемым образом с раскрываемыми композициями. Нуклеиновые кислоты, пептиды и родственные молекулы, раскрываемые в настоящей заявке, можно использовать в качестве мишеней в любой программе или способе молекулярного моделирования.
Должно быть понятно, что при использовании раскрываемых композиций в способах моделирования обеспечивается возможность идентификации молекул, таких как макромолекулярные молекулы, которые обладают конкретными желаемыми свойствами, такими как ингибирование или стимулирование функции молекулы-мишени. Молекулы, идентифицированные и выделенные с использованием раскрываемых композиций, таких как композиции, раскрытые в табл. 1 или 2, или их части или композиции, которые взаимодействуют с последовательностями, представленными в табл. 1 или 2, или их части, также раскрываются в настоящей заявке. Таким образом, продукты, полученные при помощи подходов молекулярного моделирования, в которых используют раскрываемые в настоящей заявке композиции, такие как композиции, раскрытые в табл. 1 или 2, или их части или композиции, которые взаимодействуют с последовательностями, представленными в табл. 1 или 2, или их части, также считаются как раскрытые в настоящей заявке.
Таким образом, один путь выделения молекул, которые связываются с выбранной молекулой, представляет собой путь через рациональный дизайн. Это достигается посредством информации о структурах и компьютерного моделирования. Методы компьютерного моделирования делают возможным визуализацию трехмерной атомной структуры выбранной молекулы и рациональный дизайн новых соединений, которые будут взаимодействовать с молекулой. Трехмерная конструкция, как правило, зависит от данных кристаллографического рентгеноструктурного анализа или данных ЯМР выбранной молекулы. Молекулярная динамика требует данных о силах, полученных в полевых исследованиях. Системы компьютерной графики позволяют прогнозировать, как новое соединение будет связываться с молекулой-мишенью, и делают возможным экспериментальное манипулирование со структурами соединения и молекулы-мишени для улучшения специфичности связывания. Для прогнозирования, каким будет взаимодействие молекула-соединение при внесении небольших изменений в одно или оба взаимодействующих вещества, необходимы программы молекулярной механики и сложные компьютерные вычислительные программы, обычно сочетаемые с предназначенными в помощь пользователю, запускаемыми при помощи меню интерфейсами между программой молекулярного конструирования и пользователем.
Примерами систем молекулярного моделирования являются программы СНАКМт и ρυΛΝΤΛ. Ро1удеп Согрогайоп, Аа1!йат, МА. СНАКМт осуществляет функции минимизации энергии и молекулярной динамики. ЦиАКТА осуществляет конструирование, графическое моделирование и анализ молекулярных структур. ОиА№ТА позволяет осуществлять интерактивное конструирование, модификацию, визуализацию и анализ поведения молекул друг с другом.
Многие статьи посвящены компьютерному моделированию лекарственных средств, взаимодействующих с конкретными белками, например Койутеп, е! а1., 1988 Ас!а Рйагтасеийса Еептса 97, 159-166; К1рка, №\ν 8с1еп!15! 54-57 (.Типе 16, 1988); МсКша1у апй Кокктапп, 1989 Аппи. Кеу. Рйагтасо1. ТоХсю1. 29, 111-122; Репу апй Пау1е8, ОЗАК: Циапй!айуе 8йис!иге-Активность Ке1айопкЫр8 ш Игид Эейдп рр. 189-193 (А1ап К. Ь188, 1пс. 1989); Ье\\'15 апй Иеап, 1989 Ргос. К. Зос. Ьопй. 236, 125-140 апй 141-162; а также касающиеся модели фермента для компонентов нуклеиновых кислот, Анкете, е! а1., 1989 1. Ат. Сйет.
- 28 010860
8ос. 111, 1082-1090. Другие компьютерные программы, которые отбирают и графически отображают химические вещества, доступны от таких фирм, как ВюПеыдп, 1пс., Ракайепа, СА., А11е11х, 1пс, М1кк1ккаида, Оп1апо, Сапайа, и НурегсиЬе, 1пс., СатЬпйде, Оп!апо. Хотя эти программы, прежде всего, были разработаны для применения к лекарственным средствам, специфическим в отношении конкретных белков, их можно адаптировать для моделирования молекул, специфически взаимодействующих с конкретными участками ДНК или РНК после идентификации такого участка.
Хотя описанное выше представлено со ссылкой на конструирование и получение соединений, которые могут влиять на связывание, можно также осуществлять скрининг библиотек известных соединений, включая натуральные продукты или синтетические химические вещества, и биологически активные вещества, включая белки, для выявления соединений, изменяющих связывание с субстратом или ферментную активность.
й) Антитела.
(1) Общая характеристика антител.
Термин антитела в данном описании используется в широком смысле и включает как поликлональные, так и моноклональные антитела. В дополнение к интактным молекулам иммуноглобулина, термин антитела также включает фрагменты или полимеры таких молекул иммуноглобулина и человеческие или гуманизированные варианты молекул иммуноглобулина или их фрагменты, выбранные за их способность имитировать ЕРА, или брадикинин, или их фрагменты, например антиинфарктные свойства ЕРА, брадикинина или их фрагментов, раскрываемых в настоящей заявке. Антитела могут быть испытаны на их желаемую активность при помощи ш уйго анализов, описанных в настоящей заявке, или аналогичными способами, после чего испытывают их ш νί\Ό терапевтическую и/или профилактическую активность в соответствии с известными методами клинических испытаний. Также раскрываются функциональные эквиваленты антител.
Термин моноклональное антитело, как он используется в настоящем описании, относится к антителу, полученному из, по существу, гомогенной популяции антител, т.е. отдельные антитела в пределах популяции являются идентичными, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольшой субпопуляции молекул антител. Охватываемые настоящей заявкой моноклональные антитела конкретно включают химерные антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям антител, которые были получены от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(цепей) является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям антител, которые были получены от другого конкретного вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они проявляют желаемую антагонистическую активность (см. патент США № 4816567 и Моткоп е! а1., Ргос. Ν!1. Асай. 8сг И8А, 81: 6851-6855 (1984)).
Раскрываемые моноклональные антитела можно получить с использованием любой процедуры, обеспечивающей продуцирование антител. Например, моноклональные антитела можно получить с использованием гибридомных способов, таких как описанные КоЫег апй М11к!ет, №!иге, 256: 495 (1975). В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируют агентом иммунизации для выработки лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с агентом иммунизации.
Моноклональные антитела также можно получить методами рекомбинантной ДНК, такими как описанные в патенте США № 4816567 (СаЬ111у е! а1.). ДНК, кодирующую раскрываемые моноклональные антитела, можно легко выделить и секвенировать с использованием традиционных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Можно также получить библиотеки антител или активных фрагментов антител и провести отбор с использованием метода представления фага, например, как описано в патенте США № 5804440, Вийоп е! а1., и патенте США № 6096441, ВагЬак е! а1.
1п ν Иго способы также являются подходящими для получения моновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в частности ЕаЬ-фрагментов, можно осуществлять с использованием рутинных процедур, известных из уровня техники. Например, расщепление можно осуществлять с использованием папаина. Примеры расщепления с использованием папаина описаны в XVО 94/29348, опубликованной 22 декабря 1994, и патенте США № 4342566. Папаиновое расщепление антител обычно дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых ЕаЬ-фрагментами, каждый включает один антигенсвязывающий сайт, и остаточный Ес-фрагмент. Обработка пепсином дает фрагмент, который включает два антигенсвязывающих сайта и который все еще способен к перекрестному связыванию с антигеном.
Фрагменты, независимо от того, присоединены они к другим последовательностям или нет, также могут включать вставки, делеции, замены или другие избранные модификации конкретных областей или конкретных аминокислотных остатков, при условии, что активность антитела или фрагмента антитела существенно не меняется и не ухудшается по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела. Такие модификации могут обеспечить некоторые дополнительные свойства, такие как
- 29 010860 удаление/добавление аминокислот, способных к дисульфидному связыванию, повышение биодолговечности, изменение секреторных характеристик и т. д. В любом случае, антитело или фрагмент антитела должны обладать биоактивными свойствами, такими как специфическое связывание с их родственным антигеном. Функциональные или активные участки антитела или фрагмента антитела можно определить путем мутагенеза специфического участка белка с последующей экспрессией и анализом экспрессированного полипептида. Такие способы хорошо знакомы специалистам в данной области и могут включать сайт-специфический мутагенез нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или фрагмент антитела (2о11ег, МЛ. Сигг. Θρΐη. Вю1есЬпо1. 3: 348-354, 1992).
Как он использован в данном описании, термин антитело или антитела может также относиться к человеческому антителу и/или гуманизированному антителу. Многие нечеловеческие антитела (например, полученные от мышей, крыс и кроликов), естественно, являются антигенными у человека и, таким образом, могут вызвать нежелательные иммунные реакции при их введении человеку. Поэтому использование человеческих или гуманизированных антител в способах по настоящему изобретению уменьшает возможность того, что антитело, введенное человеку, вызовет нежелательную иммунную реакцию.
(2) Человеческие антитела.
Человеческие антитела можно получить любым методом. Примеры методов получения человеческих моноклональных антител включают методы, описанные Со1е е! а1. (Мопос1опа1 АпбЬоб1еб апб Сапсег Тйегару, А1ап В. Ь188, ρ. 77, 1985), и Воегпег е! а1. (1. 1ттипо1., 147 (1): 86-95, 1991). Человеческие антитела (и их фрагменты) также можно получить при помощи библиотек представления фагов (НоодепЬоот е! а1., 1. Мо1. Вю1., 227: 381, 1991; Магкб е! а1., 1. Мо1. Вю1., 222: 581, 1991).
Человеческие антитела также можно получить от трансгенных животных. Например, были описаны трансгенные мутантные мыши, способные продуцировать полный набор человеческих антител в ответ на иммунизацию (см., например, .какоЬоуЩ е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 90: 2551-255 (1993); ^акοЬον^!8 е! а1., Ыа!иге, 362: 255-258 (1993); Вгиддегтапп е! а1., Уеаг ш 1ттипо1., 7: 33 (1993)). Конкретно, гомозиготная делеция гена соединительной области тяжелой цепи антитела (1(Н)) у таких мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител, а успешный перенос цепочки генов антител зародышевой линии человека в организм такой мутированной в зародышевой линии мыши обеспечивает продуцирование человеческих антител при введении антигена.
(3) Гуманизированные антитела.
Методы гуманизации антител обычно включают использование технологии рекомбинантной ДНК для манипуляции с ДНК последовательностью, кодирующей одну или несколько полипептидных цепей молекулы антитела. Следовательно, гуманизированная форма нечеловекого антитела (или его фрагмента) представляет собой химерное антитело или цепь антитела (или его фрагмент, такой как Εν, ЕаЬ, ЕаЬ' или другая антигенсвязывающая часть антитела), которое содержит часть антигенсвязывающего сайта от нечеловеческого (донорного) антитела, интегрированную в каркас человеческого (реципиентного) антитела.
Для генерирования гуманизированных антител остатки одного или нескольких определяющих комплементарность участков (СОВ) молекулы реципиентного (человеческого) антитела замещают остатками одного или нескольких СОВ молекулы донорного (нечеловеческого) антитела, известного как обладающее желаемыми антигенсвязывающими свойствами (например, некоторой степенью специфичности и аффинности в отношении являющегося мишенью антигена). В некоторых случаях Εν-каркасные (ЕВ) остатки человеческого антитела заменяют соответствующими остатками нечеловеческих антител. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, не обнаруженные ни в реципиентном антителе, ни в импортированной последовательности СОВ, ни в каркасных последовательностях. Как правило, гуманизированное антитело включает один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, не являющегося человеком. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки СОВ и, возможно, некоторые остатки ЕВ замещены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов. Гуманизированные антитела обычно содержат по меньшей мере часть константной области антитела (Ес), типично человеческого антитела (1опез е! а1., Ыа!иге, 321: 522-525 (1986), Веюйтапп е! а1., Ыа!иге, 332: 323-327 (1988), апб Ргеб!а, Сигг. Орт. 8!гис!. Вю1., 2: 593-596 (1992)).
Способы гуманизации нечеловеческих антител хорошо известны из уровня техники. Например, гуманизированные антитела могут быть генерированы в соответствии с методами Шш!ег апб со-^огкегб (1опез е! а1., Ыа!иге, 321: 522-525 (1986), В1есктапп е! а1., Ыа!иге, 332: 323-327 (1988), Уебюеуеп е! а1., 8с1епсе, 239: 1534-1536 (1988)), путем замещения соответствующих последовательностей человеческого антитела одной или несколькими последовательностями СОВ грызунов. Способы, которые можно использовать для получения гуманизированных антител, также описаны в патенте США № 4816567 (СаЬШу е! а1.), патенте США № 5565332 (НоодепЬоот е! а1.), патенте США № 5721367 (Кау е! а1.), патенте США № 5837243 (Эео е! а1.), патенте США № 5939598 (Кисйебараб е! а1.), патенте США № 6130364 (ЛакоЬогНх е! а1.) и патенте США № 6180377 (Могдап е! а1.).
(4) Введение антител.
Введение антител можно осуществить, как раскрывается ниже. Существуют также способы использования нуклеиновых кислот для доставки антител. Антитела-мимики против ЕРА или брадикинина ши
- 30 010860 рокого действия и фрагменты антител также можно вводить пациентам или субъектам в виде препарата нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), кодирующего антитело или фрагмент антитела таким образом, что собственные клетки пациента или субъекта принимают эту нуклеиновую кислоту и продуцируют и секретируют кодируемое антитело или фрагмент антитела. Доставку нуклеиновых кислот можно осуществлять любым способом, например, как раскрывается в данном описании.
8. Рецепторы.
Было показано, что раскрываемые в настоящей заявке молекулы, ΡΡΑ и ВК, а также их варианты обладают антиинфарктными свойствами после ишемических событий, например, в головном мозге и сердце. Должно быть понятно, что эти молекулы опосредуют такие эффекты через молекулярные взаимодействия. Раскрываются способы и композиции, использующие ΡΡΑ и ВК, а также их варианты, для выделения и определения молекулярных взаимодействий и путей сигнальной трансдукции, отвечающих за антиинфарктное действие, которым обладают эти молекулы. Эти молекулы, например, можно использовать для отбора рецепторов и других известных молекул для поиска происходящих взаимодействий, а также их можно использовать в скрининговых анализах для идентификации новых рецепторов и молекул, с которыми они взаимодействуют.
Например, ΡΡΑ использовали в скрининге 150 рецепторов для определения, с какими рецепторами ΡΡΑ может взаимодействовать. Один путь оценки взаимодействий ΡΡΑ включает рассмотрение, в каком количестве ΡΡΑ может модулировать определенный рецептор по отношению к его природному лиганду. В табл. 13 и 14 раскрываются исследования связывания лиганд-рецептор, которое, например, модулируется больше чем на 20% (ингибирование или возбуждение) человеческой формой фибринопептида-А (ΡΡΑ-й).
Таблица 13
Ингибирование при 10 мкм ΡΡΑ11
Брадикинин В1 24%
Холецистокинин 33%
Эстроген ЕКа 33%
Инозиттрифосфат ΙΡ3 33%
Калиевые каналы [Ка] 25%
Тиролиберин 23%
Таблица 14
Стимулирование при 10 мкм ΡΡΑ11
Фактор роста эндотелия сосудов 22 %
Глутамат АМРА 30%
Серотонин 5-НТ 2а 21%
а) Рецепторы брадикинина.
Брадикинин также использовали для скринингового отбора 150 рецепторов, как описано выше и как описано в примерах. Этот анализ использовали для определения наличия связывания брадикинина с каким-либо рецептором из панели рецепторов. Этот анализ показал, что брадикинин связывался с ангиотензиновым рецептором типа 2 (АТ2). Брадикинин ингибировал связывание ΑΤΙΙ на рецепторе АТ2. Панель вариантов и производных брадикинина использовали для идентификации важных участков связывания брадикинина.
(1) Путь ангиотензина.
Рецептор АТ2 представляет собой часть пути ренин-ангиотензина ΙΙ. Ангиотензин ΙΙ играет важную роль в регуляции жидкости и натрия и участвует в каскаде ренина. Ангиотензинген превращается в ангиотензин Ι посредством фермента ренина. Существуют ферменты, называемые ангиотензинпревращающими ферментами (АСЕ), которые превращают ангиотензин I в ангиотензин II. Ангиотензин II связывается с рецепторами типа 1 ангиотензина ΙΙ (ΑΤ1) и вызывает вазоконстрикцию и секрецию альдостерона, помимо прочего, например, контроля секреции вазопрессина и АСТН. Молекулы, которые блокируют взаимодействие ΑΤ1/ΑΤΠ, используют в качестве терапевтических средств для лечения различных сердечных состояний, включая гипертензию. Например, лосартан (Со/ааг) (суточная доза 25-100 мг), валсартан (Июуап®) (суточная доза 80-160 мг), ирбесартан (ΑναρίΌ*) (суточная доза 75-300 мг), канде
- 31 010860 сартан (А!асапб®) (суточная доза 4-16 мг) входят в этот класс соединений, т.е. блокаторов АТ1.
Блокаторы АТ1 обладают действием, подобным действию ингибиторов АСЕ, т.к. они снижают эффект стимуляции АТ1, вызванной АТП. Однако ингибиторы АСЕ также снижают распад брадикинина, и такое действие может быть связано с некоторыми благоприятными и неблагоприятными эффектами этого класса лекарственных средств. Поэтому существует потенциал дифференцирования клинических эффектов для этих двух классов лекарственных средств.
Ангиотензин [/гипертензин I представляет собой декапептид, имеющий последовательность ΌΚν УШ РЕН Ь (8Еф ГО N0: 86). АСЕ гидролизует С-концевой дипептид (Н1к, Леи), образуя АТП, имеющий последовательность ΌΚν УШ РЕ (8Еф ГО N0: 87). Ангиотензин III, содержащий Ν-концевой Акр, удаленный из АТП (ΚνΥ ШР Е, 8Е0 ГО N0: 88), является менее активным, чем ангиотензин II. Ангиотензин III индуцирует высвобождение альдостерона, и он ингибирует деградацию энкефалинов и потенциирует аналитическую активность Ме!-энкефалина.
Ангиотензин II взаимодействует с двумя типами связанных с 6-белком мембранных рецепторов, АТ1 (тип 1) и АТ2 (тип 2). АТ1 имеет три основные изоформы (крысиный АТ1А 359 аа; АТ1В/АТ III, 359 аа; и АТ1С, 177 аа, которые вместе с другими изоформами можно найти в бепЫапк). Структурный анализ показал, что рецепторы АТ1 крысы содержат семь трансмембранных доменов, тогда как №конец является внеклеточным, а С-конец является внутриклеточным. Связывание АТП с рецепторами АТ1 активирует фосфатидилинозит-кальциевый каскад. Рецепторы АТ1 экспрессируются, по меньшей мере, в печени, почках, аорте, легких, матке, яичниках, селезенке, сердце, надпочечниках и гладких мышцах сосудов. Ген АТ2 (хромосома х) кодирует белок из 363 аа (8Еф ГО N0: 89, номер доступа №_000677, ангиотензиновый рецептор II, тип 2; ангиотензиновый рецептор 2 [Ното кар1епк]).
8ЕТ) ГО N0: 89 дпк!1а!! ккпйкдПГ дкшкдппе к!1пскцкрк бкк1ба1рй ννίίΓνί^Π п1ууу[1Гс сцкдрккукк 1у1Гп1ауаб 1111а!1р1те а!уукугубу 1ГдрутскуГ
121 дкГ1!1пшГа кГГйстку бгус|кх'1урГ 1кс|ггпр\ус.|а кугурктест ас1кк1р!Гу
181 ГгбугПеу1 дупаатаГр рекуацтекад 1а1ткш1дГ пр1Ша!с уГдкккПк
241 1пкудкпгН гбцу1ктааа уу1аГис\у1 рПкИПба 1атетдушкс еу1ау1б1а1
301 рГаШдйп ксупрГусГ удпгГс|С|к1г куГгурйге1 цдкгектксг кккк1гете!
361 Гук
Высокий уровень экспрессии наблюдается в миометрии и более низкие уровни - в надпочечниках. Стимуляция рецепторов АТ1 и АТ2 дает разные эффекты. Например, рецепторы АТ1 повышают вазоконстрикцию, а рецепторы АТ2 повышают вазодилатацию. Также считается, что рецепторы АТ2 повышают количество N0, который может быть кардиозащитным. Исследования у мышей с выключенным геном рецептора показали, что потеря рецептора АТ2 вызывает восстановление сердца после инфаркта миокарда (ЛЫкага 8. е! а1., Сиси1а!юп 2002 0с1. 106: 2244-9). Оказалось, что АТ1 и АТ2 активируются в процессе инфаркта миокарда. Рецептор АТ2 участвует в каскаде почечной вазодилатации. Этот каскад включает продукцию брадикинина, оксиси азота и циклической 6МР. Эта роль может нейтрализовывать действие и активность рецептора АТ1. Считается, что АТ1 и АТ2, оба участвуют в апаптозе, поскольку блокирование взаимодействий АТ1 и АТ2 АТП предотвращает апаптоз, но стимуляция АТ2 вызывает апоптоз. 0по Н. апб НЫтИки, Мрроп Кткко, 2002, 0с1. 60: 1987.
(2) Антагонисты и агонисты АТЛ2.
Раскрываются антагонисты и агонисты рецептора типа 2 ангиотензина II. Например, РО123177 и РЛ123319 (Т1ттегтапк Р.В., е! а1., Ркагтасо1. Кеу. 1993 1ип.; 45 (2): 205-51, Апдю!епкт II гесер!огк апб апдю!епкт II гесер!ог ап!адошк!к, включенный посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к антагонистам и агонистам АТ1 и АТ2 и их структурам) и СР642112А [никотинилТуг-Лук (2-Агд)-Н1к-Рго-Пе-0Н], функционируют как антагонисты рецептора АТ2. Антитела, направленные на рецептор типа 2 АТП, также могут функционировать как агонисты и антагонисты.
Агонисты и антагонисты ангиотензинового рецептора раскрываются, например, в ^11ттд!оп, Л.Е. 19880. Апдю!епкт II гесерЮг кнЫ1урек: ке1есйуе ап!адошк!к апб Гипсйопа1 согге1а!ек, Еигореап Неай Лигпа1. 15 8ирр1. Ό: 79-87, 1994; ^йттд!оп, Л.Е. 19880-0400. №\у регкресйуек ш апдю!епкш кук1ет соп!го1, Лигпа1 оГ Нитап Нурейепкюп. 7 8ирр1. 2: 819-31, 1993; апб Лтк Ό.Τ, е! а1., Апдю!епкш гесер!огк: б1к(г1Ыи11оп, Цдпайпд апб Гипсйоп, С11шса1 8сЛпсе (2001) 100, (481-492) (рг1п(еб ш 6геа! Вгйаш, включенных в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к использованию пути ангиотензина и структуре антагонистов и агонистов АТ2 и АТ1).
Различные антагонисты и их действие на инфаркт обсуждаются в Хи е! а1. (АТ(1) апб АТ(2) гесер!ог ехргеккюп апб Ы1оскабе айег аси!е 1кскет1а-герегГик1оп т 1ко1а!еб теогктд га! кеаг!к, Ат. 1. Ркукю1. Неай С1гс. Ркукю1. 282 (4): Н206-15 (2002)); Еогб е! а1. (Апдю!епкт II гебисек 1пГагс( Чхе апб как по еГГес! оп рокЫкскетЛ соп!гасй1е букГипсйоп т 1ко1а!еб га! кеаг!к, Вг. 1. Ркагтасо1. 134 (1): 38-45 (2001)); Еогб е! а1. (Скагас1еп/а1юп оГ сагбюрго!есйоп теб1а!еб Ыу АТ2 гесер!ог ап!адошкт аГ!ег 1кскет1а-герегГикюп ш 1ко1а!еб теогктд га! кеаг!к, 1. Сагбюуакс. Ркагтасо1. Ткег. 5 (3): 211-21 (2000)); и Еогб е! а1. (0ррокйе еГГес!к оГ апдю!епкт АТ1 апб АТ2 гесер!ог ап!адотк!к оп гесоуегу оГ тескапЛа1 Гипсйоп аГ!ег 1кскет1а-герегГикюп т 1ко1а!еб теогктд га! кеаг!к, Сйси1а!юп 94 (12): 3087-9 (1996)), которые во всей их полноте включены в
- 32 010860 настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к модуляции рецептора типа 2 ангиотензина II. Должно быть понятно, что материал, содержащийся в этих ссылочных документах, может быть использован заявителями для подтверждения пунктов формулы изобретения, не включающих материал, содержащийся в этих ссылках.
9. Аспекты, относящиеся ко всем подходящим композициям.
a) Сходство последовательностей.
Из обсуждаемого здесь должно быть понятно, что термины гомология и идентичность означают то же самое, что сходство. Таким образом, например, если используется слово гомология в применении к двум неприродным последовательностям, должно быть понятно, что это необязательно указывает на эволюционную взаимосвязь между этими двумя последовательностями, а, скорее, указывает на сходство или сопоставимость между последовательностями нуклеиновых кислот. Многие из способов определения гомологии между двумя эволюционно родственными молекулами рутинно применяют к любым двум или более нуклеиновым кислотам или белкам в целях определения сходства последовательностей, независимо от того, являются ли они эволюционно родственными или нет.
В основном, должно быть понятно, что один путь определения известных вариантов и производных (или тех, которые могут возникнуть) раскрываемых в настоящей заявке генов и белков - это путь через определение вариантов и производных в свете гомологии с конкретными известными последовательностями. Такая раскрываемая здесь идентичность конкретных последовательностей также обсуждается в других разделах данного описания. Как правило, раскрываемые здесь варианты генов и белков обычно имеют по меньшей мере около 70-99% гомологии с установленной последовательностью или природной последовательностью.
Специалистам должно быть понятно, как определить гомологию двух белков или нуклеиновых кислот, таких как гены. Например, гомологию можно подсчитать после выравнивания двух последовательностей так, чтобы гомология находилась на самом высоком уровне.
Другой путь подсчета гомологии - через опубликованные алгоритмы. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществить посредством алгоритма локальной гомологии, διηίΐΐι апб ХУа1егтап Α6ν. Арр1. МаШ. 2: 482 (1981), алгоритма гомологии при выравнивании, №ееб1етап апб Уипксб, I. Мо1. Вю1. 48: 443 (1970), поиском сходства методом Реагкоп апб Ыртап, Ргос. №111. Асаб. δα. и.8.А. 85: 2444 (1988), использования этих алгоритмов в компьютерных программах (САР, ВЕ8ТР1Т, РА8ТА и ТРА8ТА в пакете программ ХУбсопбп Сепебск, Сепебск СотрШег Сгоир, 575 8аепсе Όγ., Маб1коп, XVI) или путем анализа.
Такие же виды гомологии могут быть получены для нуклеиновых кислот, например, посредством алгоритмов, которые раскрываются в 2икег, М. 8аепсе 244: 48-52, 1989, Чаедег е! а1., Ргос. №аб. Асаб. 8а. И8А 86: 7706-7710, 1989, Чаедег е! а1., МеШобк Епхуто1. 183: 281-306, 1989, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к выравниванию нуклеиновых кислот. Должно быть понятно, что, как правило, можно использовать любой из способов и что в некоторых случаях результаты этих различных способов могут отличаться, но квалифицированному специалисту должно быть понятно, что при определении идентичности одним из этих способов будет считаться, что последовательности имеют установленную идентичность и раскрываются в настоящей заявке.
Например, как используется в данном описании, последовательность, указанная как имеющая определенный процент гомологии с другой последовательностью, относится к последовательностям, которые имеют указанную гомологию, подсчитанную любым одним или несколькими из описанных выше способов подсчета. Например, первая последовательность имеет гомологию 80%, как здесь определено, со второй последовательностью, если согласно подсчетам методом 2икег первая последовательность имеет 80% гомологии со второй последовательностью, даже если согласно подсчетам любым другим методом первая последовательность не имеет 80% гомологии со второй последовательностью. В качестве другого примера можно указать, что первая последовательность имеет гомологию 80%, как здесь определено, со второй последовательностью, если согласно подсчетам и методом 2икег и методом Реагкоп и Ыртап первая последовательность имеет 80% гомологии со второй последовательностью, даже если согласно подсчетам методом 8111161 и ХУа1егтап методом №ееб1етап и Уипксб, методами Чаедег или любым другим методом подсчета первая последовательность не имеет 80% гомологии со второй последовательностью. В качестве еще одного примера можно указать, что первая последовательность имеет гомологию 80%, как здесь определено, со второй последовательностью, определенную с использованием каждого из методов подсчета (хотя на практике разные методы подсчета часто дают разные проценты гомологии).
b) Гибридизация/селективная гибридизация.
Термин гибридизация обычно означает управляемое последовательностью взаимодействие между по меньшей мере двумя молекулами нуклеиновых кислот, такими как праймер или зонд и ген. Управляемое последовательностью взаимодействие означает взаимодействие, которое происходит между двумя нуклеотидами, или аналогами нуклеотидов, или производными нуклеотидов нуклеотидспецифическим образом. Например, С, взаимодействующий с С, или А, взаимодействующий с Т, представляют собой управляемые последовательностью взаимодействия. Обычно управляемые последова
- 33 010860 тельностью взаимодействия происходят на \Уа15оп-Спек-стороне или Ноодйееп-стороне нуклеотида. Гибридизация двух нуклеиновых кислот зависит от различных условий и параметров, которые известны специалистам в данной области. Например, от концентрации солей, рН и температуры реакции зависит, будет или нет происходить гибридизация двух молекул нуклеиновых кислот.
Параметры для селективной гибридизации между двумя молекулами нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения условия селективной гибридизации можно определить как жесткие условия гибридизации. Например, жесткость гибридизации контролируется как температурой, так и концентрацией солей на любой из стадий гибридизации или промывки. Например, условия гибридизации для достижения селективной гибридизации могут включать гибридизацию в растворе с высокой концентрацией ионов (6х88С или 6х88РЕ) при температуре примерно на 12-25°С ниже т.пл. (температура плавления, при которой половина молекула диссоциирует от их гибридизационных партнеров) с последующей промывкой при сочетании условий температуры и концентрации солей, выбранных так, чтобы температура промывки была примерно на 5-20°С ниже т.пл. Условия температуры и концентрации солей легко определяются эмпирическим путем в предварительных экспериментах, в которых образцы стандартной ДНК, иммобилизованной на фильтрах, подвергают гибридизации с меченой нуклеиновой кислотой, представляющей интерес, и затем промывают в условиях разной жесткости. Температура гибридизации обычно выше для гибридизаций ДНКРНК и РНК-РНК. Для получения нужной жесткости можно использовать условия, описанные выше или известные из уровня техники (8атЫтоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЫога1огу Мапиа1, 2пб Еб., Со1б 8ртшд НагЫог ЬаЫогаФгу, Со1б 8ргшд НагЫог, №\ν Уогк, 1989; Кипке1 е1 а1., Ме11юЙ5 Епхуто1. 1987: 154: 367, 1987, включенный в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к гибридизации нуклеиновых кислот). Предпочтительные жесткие условия гибридизации для гибридизации ДНК: ДНК включают температуру примерно 68°С (в водном растворе) в 6х88С или 6х88РЕ с последующей промывкой при 68°С. Жесткость гибридизации и промывки, если желательно, может быть снижена по мере снижения желаемой степени комплементарности, а также в зависимости от обогащения С-С или А-Т любой области, где проводится поиск вариабельности. Подобным образом, жесткость гибридизации и промывки, если желательно, может быть соответственно повышена при повышении желаемой гомологии, а также в зависимости от обогащения С-С или А-Т любой области, где желательна высокая гомология, как это все известно из уровня техники.
Еще один путь определения селективной гибридизации включает рассмотрение количества (процентного) одной из нуклеиновых кислот, связанной с другой нуклеиновой кислотой.
Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения условия селективной гибридизации являются такими, когда по меньшей мере около 60, 65, 70-100% ограничивающей нуклеиновой кислоты связывается с неограничивающей нуклеиновой кислотой. Обычно неограничивающий праймер присутствует, например, в 10- или 100- и 1000-кратном избытке. Такой тип анализа можно осуществлять в условиях, когда оба праймера, ограничивающий и неограничивающий, присутствуют в количестве, например, в 10 раз, или в 100 раз, или в 1000 раз меньше их кб, или когда только одна из молекул нуклеиновых кислот присутствует в количестве в 10 раз, или в 100 раз, или в 1000 раз выше, или обе молекулы нуклеиновых кислот присутствуют в количестве выше их кб.
Следующий путь определения селективной гибридизации включает рассмотрение процентного количества праймера, который был подвержен ферментной манипуляции в условиях, где гибридизация необходима для инициации желаемой ферментной манипуляции. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения условия селективной гибридизации являются такими, когда по меньшей мере около 60, 65, 70-100% праймера подвергаются ферментной манипуляции в условиях, промотирующих ферментную манипуляцию, например, когда ферментная манипуляция представляет собой удлинение ДНК, тогда условия селективной гибридизации должны быть такими, когда по меньшей мере 60, 65, 70100% молекул праймера удлиняются. Предпочтительные условия также включают условия, предлагаемые изготовителем или описанные в известном уровне техники как подходящие для осуществляемой при помощи фермента манипуляции.
Так же, как и в случае гомологии, должно быть понятно, что существует ряд способов, раскрываемых в настоящей заявке, для определения степени гибридизации между двумя молекулами нуклеиновых кислот. Должно быть понятно, что эти способы и условия могут обеспечивать разные проценты гибридизации между двумя молекулами нуклеиновых кислот, но, если не указано иное, соответствие параметрам любого из способов будет достаточным. Например, если необходима 80% гибридизация, и при условии, что гибридизация проходит в требуемых параметрах в любом из указанных способов, такая гибридизация считается раскрытой в настоящей заявке.
Специалистам должно быть понятно, что если композиция или способ соответствуют любым из таких критериев определения гибридизации, либо объединенным, либо взятым отдельно, то такая композиция или способ раскрываются в настоящей заявке.
с) Нуклеиновые кислоты.
В настоящей заявке раскрывается множество молекул, которые являются молекулами на основе
- 34 010860 нуклеиновых кислот, включая, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие, например ЕРА, брадикинин или их фрагменты, а также различные функциональные нуклеиновые кислоты. Раскрываемые нуклеиновые кислоты состоят, например, из нуклеотидов, аналогов нуклеотидов или заменителей нуклеотидов. Неограничивающие примеры этих и других молекул обсуждаются ниже. Должно быть понятно, что, например, когда вектор экспрессируется в клетке, тогда экспрессируемая мРНК типично будет состоять из А, С, С и и. Также должно быть понятно, что, когда, например, антисмысловую молекулу вводят в клетку или клеточное окружение путем, например, экзогенной доставки, выгодно, чтобы антисмысловая молекула состояла из аналогов нуклеотидов, которые уменьшают распад антисмысловой молекулы в клеточной среде.
(1) Нуклеотиды и родственные молекулы.
Нуклеотид представляет собой молекулу, которая содержит составляющую основания, составляющую сахара и фосфатную составляющую. Нуклеотиды могут связываться друг с другом через их фосфатные составляющие и составляющие сахаров, образуя межнуклеозидное сцепление. Составляющая основания нуклеотида может представлять собой аденин-9-ил (А), цитозин-1-ил (С), гуанин-9-ил (С), урацил-1-ил (И) и тимин-1-ил (Т). Составляющая сахара нуклеотида представляет собой рибозу или дезоксирибозу. Фосфатная составляющая нуклеотида представляет собой пентавалентный фосфат. Неограничивающим примером нуклеотида является 3'-АМР (3'-аденозинмонофосфат) или 5'-СМР (5'-гуанозинмонофосфат).
Аналог нуклеотида представляет собой нуклеотид, включающий некоторый вид модификации любого из основной, сахарной или фосфатной составляющей. Модификации нуклеотидов хорошо известны из уровня техники и включают, например, 5-метилцитозин (5-те-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин и 2-аминоаденин, а также модификации в составляющих сахара и фосфата.
Заменители нуклеотидов представляют собой молекулы, обладающими такими же функциональными свойствами, как и нуклеотиды, но не содержащие фосфатной составляющей, такие как пептидные нуклеиновые кислоты (РNА). Заменители нуклеотидов представляют собой молекулы, распознающие нуклеиновые кислоты способом \Уа1коп-Спск или Ноодк!ееп, но которые связываются вместе через фрагмент, отличный от фосфата. Заменители нуклеотидов способны соответствовать структурам типа двойной спирали при взаимодействии с подходящей нуклеиновой кислотой, которая является мишенью.
Также возможно связывание других типов молекул (конъюгаты) с нуклеотидами или аналогами нуклеотидов для повышения, например, клеточного поглощения. Конъюгаты могут быть химически связанными с нуклеотидами или аналогами нуклеотидов. Такие конъюгаты включают, но не ограничиваются этим, липидные составляющие, такие как составляющая холестерина (Ъе!ктдег е! а1., Ргос. №111 Асаб. 8с1. И8А, 1989, 86, 6553-6556).
Взаимодействие \Уа1коп-Спск представляет собой по меньшей мере одно взаимодействие с ^а!копСпск-стороной нуклеотида, аналога нуклеотида или заменителя нуклеотида. \Уа1коп-Спск-сторона нуклеотида, аналога нуклеотида или заменителя нуклеотида включает С2, Ν1 и С6 положения нуклеотида на основе пурина, аналога или заменителя этого нуклеотида и С2, N3, С4 положения нуклеотида на основе пиримидина, аналога или заменителя этого нуклеотида.
Взаимодействие Ноодк!ееп представляет собой взаимодействие, происходящее на Ноодк!еепстороне нуклеотида или аналога нуклеотида, открытой в большой бороздке дуплексной ДНК. Ноодк!еепсторона включает положение N7 и реакционноспособные группы (Ν42 или О) в положении С6 пуриновых нуклеотидов.
(2) Последовательности.
Существует множество последовательностей, относящихся к генам ЕРА, брадикинина или их фрагментам, которые можно найти в СепЬапк, например на й!ίр://^^^.риЬтеб.дον, и эти последовательности и другие включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте, по крайней мере, что касается содержащихся в них отдельных субпоследовательностей.
Одна конкретная последовательность, представленная в табл. 1, для ЕРА человека используется здесь в качестве примера, демонстрирующего раскрываемые композиции и способы. Должно быть понятно, что описание, относящееся к этой последовательности, подходит к любой последовательности, относящейся к ЕРА, или любой последовательности, раскрытой в данной заявке, если конкретно не указано иное. Специалистам в данной области известны пути разрешения несоответствий и расхождений последовательностей и адаптирования композиций и способов, относящихся к конкретной последовательности, к другим соответствующим последовательностям (т.е. последовательностям ЕРА или брадикинина). Могут быть сконструированы праймеры и/или зонды для любой последовательности ЕРА или брадикинина на основе информации, раскрываемой в настоящей заявке и известной из уровня техники.
(3) Праймеры и зонды.
Раскрываются композиции, включающие праймеры и зонды, способные взаимодействовать с ЕРА, брадикинином или их фрагментами, раскрытыми в данном описании. В некоторых вариантах осуществления изобретения праймеры используют для поддержки реакций амплификации ДНК. Обычно праймеры должны быть способными к удлинению специфическим в отношении последовательности образом. Удлинение праймера специфическим в отношении последовательности образом включает любые способы, в которых последовательность и/или композиция молекулы нуклеиновой кислоты, с которой прай
- 35 010860 мер гибридизуется или связывается каким-либо другим образом, управляет или влияет на композиции или последовательность продукта, полученного удлинением праймера. Удлинение праймера специфическим в отношении последовательности образом поэтому включает, но не ограничивается этим, ПЦР, секвенирование ДНК, удлинение ДНК, полимеризацию ДНК, транскрипцию РНК или обратную транскрипцию. Технические приемы и условия, амплифицирующие праймер специфическим в отношении последовательности образом, являются предпочтительными. В некоторых вариантах осуществления изобретения праймеры используют для реакций амплификаци ДНК, таких как ПЦР или прямое секвенирование. Должно быть понятно, что в некоторых вариантах осуществления изобретения праймеры также можно удлинить с использованием неферментных методов, где, например, нуклеотиды или олигонуклеотиды, используемые для удлинения праймера, являются модифицированными таким образом, что они вступают в химическое взаимодействие для удлинения праймера специфическим в отношении последовательности образом. Обычно раскрываемые праймеры гибридизуются с нуклеиновой кислотой РРА, нуклеиновой кислотой брадикинина и/или фрагментов, или они гибридизуются с комплементом нуклеиновой кислоты РРА, нуклеиновой кислоты брадикинина и/или их фрагментов.
б) Доставка композиций к клеткам.
(1) Доставка нуклеиновых кислот.
Существует ряд композиций и способов, которые можно использовать для доставки нуклеиновых кислот к клеткам либо ίη νίίτο, либо ίη νίνο. Эти способы и композиции, в основном, можно подразделить на два класса: системы доставки на основе вирусов и невирусные системы доставки. Например, нуклеиновые кислоты могут быть доставлены посредством ряда систем прямой доставки, таких как электропорация, липофекция, осаждение фосфатом калия, плазмиды, вирусные векторы, вирусные нуклеиновые кислоты, фаговые нуклеиновые кислоты, фаги, космиды, или посредством переноса генетического материала в клетки или носители, такие как липосомы. Подходящие средства трансфекции, включая вирусные векторы, химические трансфектанты или физико-механические способы, такие как электропорация и непосредственная диффузия ДНК, описаны, например, в ΑοΙΓΓ. ТА., е! а1., 8с1епсе, 247, 1465-1468 (1990); апб ΑοΙΓΓ, ТА. Ыа!иге, 352, 815-818 (1991). Такие способы хорошо известны в данной области техники и легко адаптируются для использования с композициями и способами, описанными в настоящей заявке. В некоторых случаях эти способы можно модифицировать для специфического использования с большими молекулами ДНК. Кроме того, эти способы можно использовать для нацеливания на некоторые заболевания и клеточные популяции с использованием нацеливающих характеристик носителя.
В описываемых здесь способах, которые включают введение и внедрение экзогенной ДНК в клетки субъекта (т.е. генная трансдукция или трансфекция), нуклеиновые кислоты могут иметь форму депротеинизированной ДНК или РНК или нуклеиновые кислоты могут находиться в векторе для доставки нуклеиновых кислот к клеткам, посредством чего кодирующая ДНК, или ДНК, или фрагмент находятся под транскрипционным контролем промотора, как должно быть понятно специалистам в данной области, а также энхансеров. Вектор может представлять собой коммерчески доступный препарат, такой как аденовирусный вектор (Диап!ит Β^ο!есйηο1οд^е8, 1пс. (Ъауа1, ДиеЬес, Сапаба).
В качестве одного примера можно указать векторную доставку посредством системы вируса, например ретровирусную векторную систему, которая может упаковывать рекомбинантный ретровирусный геном (см., например, Рак!ап е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ст И.8.А. 85: 4486, 1988; МШет е! а1., Μο1. Се11. Βίο1. 6: 2895, 1986). Рекомбинантный ретровирус затем можно использовать для инфицирования и доставки, таким образом, к инфицированным клеткам нуклеиновой кислоты, кодирующей широко нейтрализующее антитело (или его активный фрагмент). Конкретный способ введения измененной нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающего, конечно, не ограничивается использованием ретровирусных векторов. Широкодоступными являются и другие способы для осуществления таких процедур, включая аденовирусные векторы (Мйаш е! а1., Нит. Оепе ТБет. 5: 941-948, 1994), аденоассоциированные вирусные (ААУ) векторы (Сοοбтаη е! а1., Β1οο6 84: 1492-1500, 1994), лентивирусные векторы (Ыа1б1ш е! а1., 8с1епсе 272: 263-267, 1996), псевдотипированные ретровирусные векторы (Адта^а1 е! а1., Ехрег. НетаЮ1. 24: 738-747, 1996). Можно также использовать методы физической трансдукции, такие как липосомная доставка и опосредованные рецепторами и другие эндоцитозные механизмы (см., например, 8с11\\'аг1хепЬегдег е! а1., Β1οο6 87: 472-478, 1996). Раскрываемые композиции можно использовать в сочетании с любым из этих или другими, обычно используемыми способами генного переноса.
В качестве одного примера можно указать, что при доставке кодирующей антитело нуклеиновой кислоты или какой-либо другой нуклеиновой кислоты, кодирующей миметик РРА или брадикинина или их фрагмент или кодирующей конкретный вариант РРА или брадикинина или их фрагмент, которую используют в раскрываемых здесь способах, к клеткам субъекта в аденовирусном векторе, доза для введения аденовируса человеку может варьировать примерно от 107 до 109 бляшкообразующих единиц (рГи) на инъекцию, но может доходить и до 1012 рГи на инъекцию (Стук1а1, Нит. Оепе ТБет. 8: 985-1001, 1997; А1уагех апб Сипе1, Нит. Оепе ТБет. 8: 597-613, 1997). Субъекту можно вводить одну инъекцию или, если необходимы дополнительные инъекции, их можно повторять с шестимесячными интервалами (или другими подходящими интервалами времени, что определит квалифицированный врач) в течение неопределенного периода и/или до тех пор, пока не будет установлена эффективность лечения.
- 36 010860
Парентеральное введение нуклеиновой кислоты или вектора, если его используют, обычно определяют как инъекцию. Композиции для инъекции можно получать в традиционных формах, либо в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для получения раствора или суспензии в жидкости непосредственно перед инъекцией, либо в виде эмульсий. Недавно пересмотренный подход к парентеральному введению включает использование систем медленного или замедленного высвобождения для поддержания постоянной дозы. См., например, патент США № 3610795, включенный в настоящую заявку посредством ссылки.
Дополнительное обсуждение подходящих композиций и различных путей введения терапевтических соединений см., например, в Кет1пд!оп: Т11е 8с1епсе апб ΡπκΙ^ о£ Ρ1ι;·ιηη;·ιον (191Н еб.) еб. Α.Κ. Сеппаго, Маск ΡυόΙίδΗίπβ Сотрапу, Еак!оп, ΡΑ 1995.
Нуклеиновые кислоты, доставляемые к клеткам, которые должны интегрироваться в геном клеткихозяина, типично содержат интеграционные последовательности. Эти последовательности часто являются относящимися к вирусам последовательностями, особенно при использовании систем на основе вирусов. Такие вирусные интеграционные системы также могут быть включены в нуклеиновые кислоты, доставку которых осуществляют при помощи систем, не основанных на нуклеиновых кислотах, или при помощи средства доставки, такого как липосома, так чтобы нуклеиновая кислота, содержащаяся в системе доставки, могла быть интегрированной в геном хозяина.
Другие общие способы интеграции в геном хозяина включают, например, системы, разработанные для осуществления гомологичной рекомбинации с геномом хозяина. Такие системы обычно опираются на последовательность, фланкирующую нуклеиновую кислоту, которая должна экспрессироваться, имеющую достаточную гомологию с последовательностью-мишенью в геноме клетки-хозяина, чтобы произошла рекомбинация между векторной нуклеиновой кислотой и мишеневой нуклеиновой кислотой, приводящая к интеграции доставленной нуклеиновой кислоты в геном хозяина. Такие системы и способы, необходимые для осуществления гомологичной рекомбинации, известны специалистам в данной области.
(2) Ненуклеиновокислотные системы.
Раскрываемые композиции могут быть доставлены к клеткам-мишеням различными способами. Например, композиции могут быть доставлены путем электропорации, или путем липофекции, или путем осаждения фосфатом кальция. Выбранный механизм доставки будет частично зависеть от типа являющейся клетки-мишени и от того, осуществляется доставка, например, ш у1уо или ш уйго.
Таким образом, композиции могут включать, помимо раскрываемых композиций или векторов, например, липиды, такие как липосомы, такие как катионные липосомы (например, ΌΘΤΜΑ, ΌΟΡΕ, ЭСхолестерин) или анионные липосомы. Липосомы могут, кроме того, включать белки для облегчения нацеливания на конкретную клетку, если это желательно. Введение композиции, включающей соединение и катионную липосому, можно осуществлять в кровь, поступающую в являющийся мишенью орган, или путем ингаляции для введения в мишеневые клетки дыхательных путей. Информацию о липосомах см., например, в Впдйат е! а1., Αт. 1. Кекр. Се11. Мо1. Вю1. 1: 95-100 (1989); Ре1дпег е! а1., Ριυα №111. Αсаб. 8с1. υδΑ 84: 7413-7417 (1987); И.8 Ρа!. Ыо. 4897355. Кроме того, соединение можно вводить в виде компонента микрокапсулы, которая может быть нацелена на конкретные типы клеток, такие как макрофаги, или когда диффузия соединения или доставка соединения из микрокапсулы рассчитана для специальной скорости или дозирования.
В описанных выше способах, которые включают введение и поглощение экзогенной ДНК в клетки субъекта (т.е. генная трансдукция или трансфекция), доставку композиций к клеткам можно осуществлять через различные механизмы. Один такой пример включает доставку через липосомы с использованием коммерчески доступных липосомных препаратов, таких как ^IΡΟΕЕСΤIN. υΡΟΕΈί.’ΤΑΜ[ΝΕ (бШСО-ВКЬ, Шс., СаййегкЬигд, ΜΌ), 8υΡΕКΕΕСΤ (фадеп, Шс. Нббеп, Сегтапу) и ΤКΑN8ΡΕСΤΑΜ (йгошеда Вю!ес, Шс., Мабкоп, XVI), а также других липосом, полученных в соответствии со стандартными процедурами, известными из уровня техники. Кроме того, нуклеиновые кислоты или векторы могут доставляться ш у1уо путем электропорации, такая технология доступна от бепейошск, Шс. (8ап П1едо, СΑ), а также посредством аппарата δΟΝΟΡΟΡΑΓΊΟΝ (Ш1аКх Ρйа^тасеиΐ^са1 Согр., ^скоп, ΑΖ).
Такие вещества могут находиться в растворе, суспензии (например, инкорпорированные в микрокапсулы, липосомы или клетки). Они могут быть нацелены на конкретный тип клеток через антитела, рецепторы или лиганды рецепторов. Следующие ссылки являются примерами использования такой технологии для нацеливания конкретных белков на опухолевую ткань (8еп!ег, е! а1., В1осоп|ица1е Сйет., 2: 447-451 (1991); Вадкйа^е, Κ.Ό., Вг. 1. Сапсег, 60: 275-281 (1989); Вадкйа^е, е! а1., Вг. 1. Сапсег, 58: 700703 (1988); 8еп!ег, е! а1., В1осоп)ида!е Сйет., 4: 3-9 (1993); Ва!!еШ, е! а1., Сапсег Iттипо1. Iттипо!йе^., 35: 421-425 (1992); Ρ^е!е^8ζ апб МсКегШе, Iттипо1од. Кеу1е№, 129: 57-80 (1992); апб КоЙбег, е! а1., Вюсйет. Ρйа^тасо1., 42: 2062-2065 (1991)). Такие методы можно использовать в применении к различным другим типам клеток. Носителями являются такие, как невидимые и другие конъюгированные с антителами липосомы (включая опосредованное липидами нацеливание лекарственного средства на карциному толстой кишки), опосредованное рецептором нацеливание ДНК через специфические в отношении клеток лиганды, направляемое лимфоцитами нацеливание на опухоль и высокоспецифическая ретровирусная доставка к клеткам глиомы мыши ίπ у1уо. Следующие ссылки являются примерами использования такой
- 37 010860 технологии для нацеливания конкретных белков на опухолевую ткань: Нидйеч е1 а1., Сапсег Рекеагсй, 49: 6214-6220 (1989); апй Ьйапдег апй Ниапд, ВюсЫтса е! В1орйу51са Ас!а, 1104: 179-187 (1992). Как правило, рецепторы являются вовлеченными в пути эндоцитоза либо конститутивно, либо под действием лиганда. Такие рецепторы образуют кластеры в окаймленных клатрином ямках, проникают в клетку в окаймленных клатрином везикулах, проходят через подкисленную эндосому, в которой происходит сортировка рецепторов, и затем либо рециркулируют к поверхности клетки, накапливаясь внутриклеточно, либо распадаются в липосомах. Пути интернализации служат множеству функций, таким как поглощение питательных веществ, удаление активированных белков, клиренс макромолекул, условно-патогенное проникновение вирусов и токсинов, диссоциация и разрушение лиганда и регулирование уровня рецепторов. Многие рецепторы проходят более одного внутриклеточного пути, в зависимости от типа клетки, концентрации рецепторов, типа лиганда, валентности лиганда и концентрации лигандов. Молекулярный и клеточный механизмы опосредованного рецептором эндоцитоза были описаны в Вго^п апй Сгеепе, ΌΝΑ апй Се11 Вю1о§у 10: 6, 399-409 (1991).
(3) 1п ν^νο/еx νί\Ό.
Как описано выше, композиции можно вводить в фармацевтически приемлемом носителе, и они могут быть доставлены к клеткам субъекта ш νί\Ό и/или ех νί\Ό посредством различных механизмов, хорошо известных из уровня техники (например, поглощение депротеинизированной ДНК, слияние с липосомами, внутримышечная инъекция ДНК посредством генного ружья, эндоцитоз и т.д.).
При применении ех νί\Ό способов клетки или ткани можно удалить и поддерживать вне организма в соответствии со стандартными протоколами, известными в технике. Композиции можно вводить в клетки посредством любого механизма переноса генов, такого как, например, доставка гена, опосредованная фосфатом кальция, электропорация, микроинъекция или протеолипосомы. Трансдуцированные клетки затем можно вводить путем инфузии (например, в фармацевтически приемлемом носителе), или они могут быть снова трансплантированы в организм субъекта гомотопическим путем при помощи стандартных способов, подходящих для данного типа клеток или тканей. Известны стандартные способы трансплантации или инфузии различных клеток в организм субъекта.
е) Системы экспрессии.
Доставляемые в клетки нуклеиновые кислоты обычно содержат системы контроля экспрессии. Например, вводимые гены в вирусных и ретровирусных системах обычно содержат промоторы и/или энхансеры, способствующие контролю экспрессии желаемого генного продукта. Промотор обычно представляет собой последовательность или последовательности ДНК, которая функционирует, когда находится в относительно фиксированном местоположении по отношению к сайту инициации транскрипции. Промотор содержит элементы ядра, необходимые для основного взаимодействия РНК-полимеразы и факторов транскрипции, и может содержать расположенные левее элементы и элементы ответа.
(1) Вирусные промоторы и энхансеры.
Предпочтительные промоторы, контролирующие транскрипцию из векторов в клетках-хозяевах млекопитающего, можно получить из различных источников, например геномов вирусов, таких как полиома, вирус обезьяны 40 (8У40), аденовирус, ретровирусы, вирус гепатита В и наиболее предпочтительный цитомегаловирус, или из гетерологичных промоторов млекопитающих, например бета-актинового промотора. Ранние и поздние промоторы вируса 8У40 можно удобно получать в виде фрагмента рестрикции 8У40, который также содержит начало репликации вируса 8У40 (Б1ег§, е! а1., №11иге. 273: 113 (1978)). Предранний промотор цитомегаловируса человека удобно получать в виде фрагмента рестрикции НшйШ Е (Сгееп^ау, Р.1. е! а1., Сепе 18: 355-360 (1982)). Конечно, промоторы из клетки-хозяина или родственных видов также можно использовать в соответствии с настоящим изобретением.
Энхансер обычно относится к последовательности ДНК, которая функционирует на незафиксированном расстоянии от сайта инициации транскрипции и может находиться либо 5' (Ьа1Ш1п5, Ь., е! а1., Ргос. Асай. 8сг 78: 993 (1981)), либо 3' (Ьикку, М.Ь., е! а1., Мо1. Се11 Вю. 3: 1108 (1983)) по отношению к единице транскрипции. Кроме того, энхансеры могут находиться в пределах интрона (Вапегр, 1.Б., е! а1., Се11 33: 729 (1983)), так же, как и самой кодирующей последовательности (ОкЬогпе, Т.Б., е! а1., Мо1. Се11 В1о. 4: 1293 (1984)). Они обычно составляют от 10 до 300 п.о. в длину, и они функционируют в цисположении. Функцией энхансеров является повышение транскрипции от ближайших промоторов. Энхансеры также часто содержат элементы ответа, опосредующие регуляцию транскрипции. Промоторы также могут содержать элементы ответа, опосредующие регуляцию транскрипции. Энхансеры часто определяют регуляцию экспрессии гена. Хотя сегодня известно много энхансерных последовательностей из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, фетопротеин и инсулин), обычно одна будет использовать энхансер вируса эукариотических клеток для общей экспрессии. Предпочтительными примерами являются энхансер 8У40 на поздней стороне от начала репликации (100-270 п.о.), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне от начала репликации и аденовирусные энхансеры.
Промотор и/или энхансер могут быть специфически активированы либо под действием света, или специфических химических процессов, запускающих их функцию. Системы можно регулировать реагентами, такими как тетрациклин и дексаметазон. Также существуют пути усиления экспрессии генов ви
- 38 010860 русных векторов при воздействии облучением, таким как гамма-облучение, или алкилирующими химиотерапевтическимим средствами.
В некоторых вариантах осуществления изобретения промоторный и/или энхансерный участок может действовать как конститутивный промотор и/или энхансер для получения максимальной экспрессии участка единицы транскрипции, подлежащей транскрипции. В некоторых конструкциях промоторный и/или энхансерный участок является активным во всех типах эукариотических клеток, даже если он экспрессируется только в определенном типе клетки в определенное время. Предпочтительным промотором такого типа является СМV-промотор (650 оснований). Другими предпочтительными промоторами являются ^40-промоторы, цитомегаловирус (полноразмерный промотор) и ретровирусный вектор ЬТР.
Было показано, что все специфические регуляторные элементы могут быть клонированы и использованы для конструирования векторов экспрессии, которые селективно экспрессируются в специфических типах клеток, таких как клетки меланомы. Промотор глиального фибриллярного ацетопротеина (СРАР) использовали для селективной экспресси генов в клетках глиального происхождения.
Векторы экспрессии, используемые в эукариотических клетках-хозяивах (клетки дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных, человека или клетки, содержащие ядро), могут также содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции, что может влиять на экспрессию мРНК. Такие участки транскрибируются как полиаденилированные сегменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей белок фактора ткани. 3'-Нетранслируемые участки также включают сайты терминации транскрипции. Предпочтительно, чтобы единица транскрипции также содержала участок полиаденилирования. Одним преимуществом такого участка является то, что он повышает вероятность того, что транскрибируемая единица будет процессироваться и транспортироваться как мРНК. Идентификация и использование сигналов полиаденилирования в экспрессирующих конструкциях являются четко установленными. Предпочтительно, чтобы сигналы гомологичного полиаденилирования использовались в трансгенных конструкциях. В некоторых единицах транскрипции участок полиаденилирования происходит из сигнала раннего полиаденилирования §ν40 и состоит из 400 оснований. Также предпочтительно, чтобы транскрибируемые единицы содержали другие стандартные последовательности, отдельно или в комбинации с указанными выше последовательностями для повышения экспрессии из конструкции или улучшения ее стабильности.
(2) Маркеры.
Вирусные векторы могут включать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует маркерный продукт. Такой маркерный продукт используют для определения, был ли доставлен ген в клетку и был ли экспрессирован после доставки. Предпочтительными маркерными генами являются ген Е. со11 1ас2, который кодирует β-галактозидазу, и зеленый флуоресцентный белок.
В некоторых вариантах осуществления изобретения маркер может быть селектируемым маркером. Примерами подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающего являются дигидрофолатредуктаза (ОНРК), тимидинкиназа, неомицин, аналог неомицина С418, гидромицин и пурамицин. При успешном переносе таких селектируемых маркеров в клетки-хозяева млекопитающего трансформированная клетка-хозяин млекопитающего может выжить, если она находится под селективным давлением. Существует две разные широко используемые категории селективных режимов. Первая категория основана на метаболизме клетки и использовании мутантной клеточной линии, которая не способна к росту независимо от дополненной среды. Два примера представляют собой клетки СНО ЭНЕЕ и клетки ЬТК мыши. Эти клетки не обладают способностью расти без добавления таких питательных веществ, как тимидин или гипоксантин. Поскольку эти клетки не содержат определенные гены, необходимые для полного пути синтеза нуклеотидов, они не могут выжить без дополненной среды, содержащей отсутствующие нуклеотиды. Альтернативой добавления среды является введение интактного гена ЭНЕЕ или ТК в клетки, в которых отсутствуют соответствующие гены, с изменением, таким образом, их связанных с ростом потребностей. Отдельные клетки, которые не были трансформированы геном ЭНЕЕ или ТК, не смогут выжить в недополненной среде.
Вторая категория представляет собой доминантную селекцию, которая включает схему селекции, используемую в любом типе клеток, и не требует использования мутантной клеточной линии. Такие схемы, как правило, используют лекарственное средство для прекращения роста клетки-хозяина. Такие клетки, которые содержат новый ген, будут экспрессировать белок, сообщающий резистентность к лекарственному средству, и переживут селекцию. Примеры такой доминантной селекции используют лекарственные средства, такие как неомицин (§ои1йеги, Р. аиб Вегд, Р., ί. Мо1ес. Арр1. Сепе1. 1; 327 (1982)), микофеноловую кислоту (МиШдаи, Е.С. апб Вегд, Р. 8аепсе 209: 1422 (1980)) или гигромицин (§идбеп, В., е1 а1., Мо1. Се11 Вю1. 5: 410-413 (1985)). Три примера используют бактериальные гены под эукариотическим контролем для сообщения резистентности к соответствующему лекарственному средству С418 или неомицину (генетицин), хдр! (микофеноловая кислота) или гигромицину, соответственно. Другие включают аналог неомицина С418 и пурамицин.
Г) Пептиды.
(1) Варианты белков.
Как было указано выше, существует множество вариантов РРА, брадикинина и/или их фрагментов,
- 39 010860 которые известны и рассматриваются в настоящей заявке. Помимо известных функциональных ЕРА, брадикинина и/или их фрагментов, видовых гомологов, существуют производные ЕРА, брадикинина и/или их фрагменты, которые также являются функциональными в раскрываемых способах и композициях. Варианты и производные белков хорошо известны специалистам в данной области, и они могут включать модификации аминокислотных последовательностей. Например, модификации аминокислотных последовательностей обычно попадают в один или более из трех следующих классов: варианты замены, вставки или делеции. Вставки включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Вставки обычно должны быть меньшими вставками по сравнению с амино- или карбоксиконцевыми слияниями, примерно на 1-4 остатка. Производные иммуногенных гибридных белков, такие как описанные в примерах, получают путем слияния полипептида, достаточно большого для передачи иммуногенности последовательности-мишени путем перекрестного сшивания ίη νίίΐΌ или посредством культуры рекомбинантных клеток, трансформированных ДНК, кодирующей слияние. Делеции характеризуются удалением одного или нескольких аминокислотных остатков из последовательности белка. Как правило, удаляется не более примерно 2-6 остатков на любом участке в молекуле белка. Такие варианты обычно получают путем сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей белок, получая, таким образом, ДНК, кодирующую вариант, а затем осуществляя экспрессию ДНК в культуре рекомбинантных клеток. Методы осуществления заместительных мутаций в предварительно определенных сайтах в ДНК, имеющей известную последовательность, хорошо известны, например М13-праймерный мутагенез и ПЦР мутагенез. Аминокислотные замещения обычно имеют место по отдельным остаткам, но могут происходить в нескольких различных положениях одновременно; вставки обычно включают порядка 1-10 аминокислотных остатков; а делеции - в пределах 1-30 остатков. Делеции или вставки предпочтительно осуществляют в смежных парах, т.е. делеция 2 остатков или вставка 2 остатков. Замены, делеции, вставки или любое их сочетание можно объединять для получения конечной конструкции. Мутации не должны приводить к тому, чтобы последовательность выходила за пределы рамки считывания, и предпочтительно не должны создавать комплементарные области, которые могут образовывать вторичную структуру мРНК. Варианты замен представляют собой такие варианты, когда по меньшей мере один остаток был удален, а другой остаток вставлен на его место. Такие замены обычно осуществляют в соответствии с приведенными ниже табл. 4 и 5 и их называют консервативными заменами.
Таблица 4
Сокращенные наименования аминокислот
Аминокислота Сокращенное наименование
Аланин А1аА
Аллосолейцин А11е
Аргинин Агдй
Аспарагин Α3ΠΝ
Аспарагиновая кислота АзрО
Цистеин СузС
Глутаминовая кислота 61иЕ
Глатамин С1п0
Глицин С1уС
Гистидин НгзН
Изолейцин 11е1
Лейцин ЪеиЬ
Лизин ЬувК
Фенилаланин РЬе Г
Пролин РгоР
Пироглутаминовая кислота С1и
Серин ЗегЗ
Треонин ТЬгТ
Тирозин ТугУ
Триптофан ТгрИ
Валин . Уа1У
- 40 010860
Таблица 5
Аминокислотные замены
Существенные изменения в функции или иммунологической идентичности осуществляются путем выбора замен, которые менее консервативны, чем те, которые указаны в табл. 5, т.е. выбора остатков, которые в большей степени отличаются действием по поддержанию: (а) структуры полипептидного каркаса в области замещения, например, в виде листообразной или спиралевидной конформации, (Ь) заряда или гидрофобности молекулы на участке, который является мишенью, или (с) основной части боковой цепи. Замены, от которых, как правило, ожидают наибольшего существенного изменения свойств белка, представляют собой такие, которые включают: (а) замещение гидрофобного остатка, например лейцила, изолейцила, фенилаланила, валила или аланила, гидрофильным остатком, например серилом или треонилом (или наоборот); (Ь) замещение цистеина или пролина каким-либо другим остатком (или наоборот); (с) замещение электроотрицательного остатка, например глутамила или аспартила, остатком, имеющим электроположительную боковую цепь, например лизилом, аргинилом или гистидилом (или наоборот); или (б) замещение остатка, не имеющего боковой цепи, в данном случае, например, глицина, остатком, имеющим большую боковую цепь, например фенилаланином (или наоборот); (е) увеличение количества участков для сульфирования и/или гликозилирования.
Например, замена одного аминокислотного остатка другим, биологически и/или химически схожим, известна специалистам в данной области как консервативная замена. Например, консервативная замена включает замену одного гидрофобного остатка другим или одного полярного остатка другим. Замены включают комбинации, такие как, например, С1у, А1а; Уа1, 11е, Ьей; Акр, С1и; Акп, С1п; 8ег, ТЬг; Ьук, Агд; и РЬе, Туг. Такие варианты консервативных замен каждой полностью раскрытой последовательности включены в мозаичные полипептиды, представленные в настоящей заявке.
Заместительный или делеционный мутагенез можно использовать для вставки сайтов для Ν-гликозилирования (Акп-Х-ТЬг/8ег) или О-гликозилирования (8ег или ТЬг). Делеции цистеина или других лабильных остатков также могут быть желательными. Делеции или замены потенциальных сайтов протео
- 41 010860 лиза, например Агд, осуществляют, например, путем делеции одного из основных остатков или замещения его глутаминильным или гистидильным остатками.
Некоторые посттрансляционные дериватизации являются результатом действия рекомбинантных клеток-хозяев на экспрессированный полипептид. Глутаминильный и аспарагинильный остатки часто подвергаются посттрансляционному деаминированию до соответствующих глутамильного и аспарильного остатков. Альтернативно, деаминирование этих остатков происходит в слабокислотных условиях. Другие посттрансляционные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильного или треонильного остатков, метилирование о-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (Т.Е. Сге1дЫоп, Рго1е1пк: 81гис1иге апб Мо1еси1аг Ргорегйек, \У.Н. Бгеетап & Со., 8ап Бгапстсо рр. 79-86 (1983)), ацетилирование Ν-концевого амина и, в некоторых случаях, амидирование С-концевого карбоксила.
Должно быть понятно, что один путь определения вариантов и производных раскрываемых здесь белков - это путь через определение вариантов и производных по гомологии/идентичности с конкретными известными последовательностями. Специально раскрываются варианты тех или иных белков, раскрываемых в настоящей заявке, которые имеют по меньшей мере 70, или 75, или 80, или 85, или 90, или 95% гомологию с установленной последовательностью. Специалисты в данной области легко могут понять, как определить гомологию двух белков. Например, гомологию можно подсчитать после выравнивания этих двух последовательностей так, чтобы получить самую высокую степень гомологии.
Другой путь подсчета гомологии - через опубликованные алгоритмы. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществить посредством алгоритма локальной гомологии, 8111611 апб \Уа1егтап Абν. Арр1. Маб1. 2: 482 (1981), алгоритма гомологии при выравнивании, №еб1етап апб ХУшъсН. 1. Мо1. Вю1. 48: 443 (1970), поиском сходства методом Реагкоп апб Ыртап, Ргос. №111. Асаб. 8с1. и.8.А. 85: 2444 (1988), использования этих алгоритмов в компьютерных программах (САР, ВЕ8ТБ1Т, БА8ТА и ТБА8ТА в пакете программ ХУйсопйп Сепейск, Сепебск СотрШег Сгоир, 575 8с1епсе Όγ., Маб1коп, XVI) или путем анализа.
Такие же виды гомологии могут быть получены для нуклеиновых кислот, например, посредством алгоритмов, которые раскрываются в 2икег, М. 8с1епсе 244: 48-52, 1989, 1аедег, е! а1., Ргос. №·ι!1. Асаб. 8с1. И8А 86: 7706-7710, 1989, 1аедег, е! а1., Мебюбк Епхуто1. 183: 281-306, 1989, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к выравниванию нуклеиновых кислот.
Должно быть понятно, что описание консервативных мутаций и гомологии можно объединить в любой комбинации, такой как объединения, имеющие по меньшей мере 70% гомологию с конкретной последовательностью, где варианты представляют собой консервативные мутации.
Поскольку в настоящем описании обсуждаются различные белки и последовательности белков, должно быть понятно, что раскрываются также и нуклеиновые кислоты, которые могут кодировать такие последовательности белков. Это включает все вырожденные последовательности, относящиеся к конкретной последовательности белка, т.е. все нуклеиновые кислоты, имеющие последовательность, которая кодирует одну конкретную последовательность белка, а также все нуклеиновые кислоты, включая вырожденные нуклеиновые кислоты, кодирующие раскрываемые варианты и производные белковых последовательностей. Таким образом, хотя здесь не может быть описана каждая конкретная последовательность нуклеиновой кислоты, на самом деле, она раскрывается и описывается в настоящей заявке через раскрываемую последовательность белка. Также должно быть понятно, что, хотя никакая аминокислотная последовательность не указывает, какая конкретно последовательность ДНК кодирует этот белок, присутствующий в организме, где конкретные варианты раскрываемого белка описаны в настоящей заявке, известная последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует этот белок в конкретном организме, из которого происходит этот белок, также является известной и раскрыта и описана в настоящей заявке.
Должно быть понятно, что существует множество аминокислотных и пептидных аналогов, которые могут быть включены в раскрываемые композиции. Например, существует множество Ό аминокислот или аминокислот, которые имеют другой функциональный заместитель, отличный от аминокислот, представленных в табл. 1 и 2. Раскрываются противоположные стереоизомеры природных пептидов, а также стереоизомеры пептидных аналогов. Эти аминокислоты можно легко включать в полипептидные цепи, заряжая тРНК молекулы выбранной и создавая генетические конструкции, которые используют, например, терминирующие кодоны, для вставки аналогичной аминокислоты в пептидную цепь сайт-специфическим способом (Тйогкоп, е! а1., Мебюбк ш Мо1ес. Вю1. 77: 43-73 (1991); 2о11ег, СиггеШ Оршюп ш Вю1есйпо1оду, 3: 348-354 (1992); 1ЫЫа, Вю1ес11по1оду & Сепейс Ре\'1е\\'к 13: 197-216 (1995); СаЫ11 е! а1., Т1В8, 14 (10): 400-403 (1989); Веппег, Т1В Тес1., 12: 158-163 (1994); 1ЫЫа апб Неппеске, ВюЛесЬпо1о§у, 12: 678-682 (1994), все включены в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к аминокислотным аналогам).
Могут быть получены молекулы, напоминающие пептиды, но которые не связаны посредством природных пептидных связей. Например, связи для аминокислот или аминокислотных аналогов могут включать Ο^ΝΕ--, --СН28--, --СН2--СН2--, --СН=СН-- (цис- или транс-), --СОСН2--, --СН(ОН)СН2-- и
- 42 010860
--СНН2ЗО-- (информацию об этих и других связях можно найти в Зра!о1а, А.Е. ш Сйегакйу апй Вюсйеткйу оГ Ат1по аайк, Рерййек, апй Рго!етк, В. Аетк!е1п ейк., Магсе1 Иеккег, №\ν Уогк, р. 267 (1983); Зра!о1а, А.Е., Уеда Эа1а (Магсй 1983), Уо1. 1, 1ккие 3, Рерййе ВаскЬопе МойШсайопк (депега1 геу1ете); Мог1еу, Тгепйк Рйагт. Зск (1980) рр. 463-468; Нийкоп, Ό. е! а1., 1п!. 1. Рер!. Рго!. Кек. 14: 177-185 (1979) (--СН2ЫН--, СН2СН2--); Зра!о1а, е! а1., ЫГе Зск 38: 1243-1249 (1986) (--СН Н2--8); Напп, 1., Сйет. Зос. Регкт Тгапк. I 307-314 (1982) (--СН--СН--, цис- и транс-); А1тцшк!, е! а1., .1. Мей. Сйет. 23: 1392-1398 (1980) (--СОСН2--); 1епп1пдк-АЫ!е, е! а1., Те!гайейгоп Ьей. 23: 2533 (1982) (--СОСН2--); Зхе1ке, е! а1., Еигореап Арр1п, ЕР 45665 СА (1982): 97: 39405 (1982) (--СН(ОН)СН2--); Но11айау, е! а1., Тейайейгоп. Ье!!. 24: 4401-4404 (1983) (--С(ОН)СН2--); апй НгиЬу Ьйе Зск 31: 189-199 (1982) (--СН2--З--), каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. Особенно предпочтительная непептидная связь представляет собой --СН2ХН--. Должно быть понятно, что пептидные аналоги могут иметь больше 1 атома между атомами связи, например Ь-аланин, д-аминомасляная кислота и т. п.
Аминокислотные аналоги, и аналоги, и пептидные аналоги часто обладают усиленными или желаемыми свойствами, такими как более экономичное производство, лучшая химическая стабильность, улучшенные фармакологические свойства (период полувыведения, абсорбция, активность, эффективность и т.д.), измененная специфичность (например, широкий спектр биологической активности), пониженная антигенность и др.
Ό-Аминокислоты можно использовать для получения более стабильных пептидов, поскольку Όаминокислоты не распознаются пептидазами и т.п. Систематическую замену одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности Ό-аминокислотой такого же типа (например, Ό-лизин вместо Ь-лизииа) можно использовать для получения более стабильных пептидов. Цистеиновый остаток можно использовать для циклизации или связывания вместе двух или более пептидов. Это может быть выгодным для сдерживания пептидов в конкретных конформациях (К|/о апй 61егаксй, Апп. Кеу. Вюсйет. 61: 387 (1992), включен в настоящую заявку посредством ссылки).
д) Фармацевтические носители/доставка фармацевтических продуктов.
Как описано выше, композиции можно также вводить ш у1уо в фармацевтически приемлемом носителе. Под фармацевтически приемлемым подразумевают вещество, не являющееся биологически или иным образом нежелательным, т. е. вещество, которое можно вводить субъекту вместе с нуклеиновой кислотой или вектором, не вызывая при этом каких-либо нежелательных биологических эффектов или вредных взаимодействий с другими компонентами фармацевтической композиции, в которой оно содержится. Естественно, выбирают такой носитель, чтобы получить минимальную деградацию активного ингредиента или минимальные неблагоприятные побочные эффекты у субъекта, как должно быть хорошо известно специалистам в данной области.
Композиции можно вводить перорально, парентерально (например, внутривенно), путем внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, чрескожным путем, экстракорпореально, местным путем и т.п., включая местное интраназальное введение или введение путем ингаляции. Как используется в данном описании, местное интраназальное введение означает доставку композиций в нос и носовые проходы через одну или обе ноздри и может включать доставку посредством спреевого механизма или капельного механизма или через аэрозолизацию нуклеиновой кислоты или вектора. Введение композиции путем ингаляции можно осуществлять через нос или рот посредством такого механизма доставки, как спрей или капли. Доставку также можно осуществлять непосредственно в любую область системы дыхания (например, легких) через интубацию. Точное количество композиции, которое необходимо, для разных субъектов будет разным в зависимости от вида, возраста, веса и общего состояния субъекта, тяжести подлежащего лечению аллергического состояния, конкретной используемой нуклеиновой кислоты или вектора, пути их введения и т.п. Таким образом, невозможно определить точное количество для каждой композиции. Однако подходящее количество может определить специалист средней квалификации при помощи рутинного экспериментирования, используя содержащиеся в настоящей заявке указания.
Парентеральное введение композиции, если его используют, обычно определяют как инъекцию. Композиции для инъекции можно получать в традиционных формах, либо в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для получения раствора или суспензии в жидкости непосредственно перед инъекцией, либо в виде эмульсий. Недавно пересмотренный подход к парентеральному введению включает использование систем медленного или замедленного высвобождения для поддержания постоянной дозы. См., например, патент США № 3610795, включенный в настоящую заявку посредством ссылки.
Вещества могут находиться в растворе, суспензии (например, включенными в микрокапсулы, липосомы или клетки). Такие композиции могут быть нацелены на конкретный тип клеток посредством антител, рецепторов или лигандов рецепторов. Следующие ссылочные документы являются примерами использования такой технологии нацеливания специфических белков на опухолевую ткань (Зеп!ег, е! а1., Вюсои)ида!е Сйет., 2: 447-451 (1991); Вадкйа^е, Κ.Ό., Вг. 1. Сапсег, 60: 275-281 (1989); Вадкйа^е, е! а1., Вг. ί. Сапсег, 58: 700-703 (1988); Зеп!ег, е! а1., Вюсои)ида!е Сйет., 4: 3-9 (1993); ВайеШ, е! а1.., Сапсег 1ттипо1. 1ттипо1йег., 35: 421-425 (1992); Р1е1егкх и МсКепх1е, 1ттипо1од. Кеу1е^к, 129: 57-80 (1992); и КоГПег, е! а1., Вюсйет. Рйагтасо1., 42: 2062-2065 (1991)). Носителями являются такие, как невидимые и другие
- 43 010860 конъюгированные с антителами липосомы (включая опосредованное липидами нацеливание лекарственного средства на карциному толстой кишки), опосредованное рецептором нацеливание ДНК через специфические в отношении клеток лиганды, направляемое лимфоцитами нацеливание на опухоль и высокоспецифическая ретровирусная доставка к клеткам глиомы мыши ш νί\Ό. Следующие ссылки являются примерами использования такой технологии для нацеливания специфических белков на опухолевую ткань: Нидкек е! а1., Сапсег Кекеагск, 49: 6214-6220 (1989); и Ьйхтдег апб Ниапд, ВюсЫтюа е! ВюркуДса Ас!а, 1104: 179-187 (1992). Как правило, рецепторы являются вовлеченными в пути эндоцитоза либо конститутивно, либо под действием лиганда. Такие рецепторы образуют кластеры в окаймленных клатрином ямках, проникают в клетку в окаймленных клатрином везикулах, проходят через подкисленную эндосому, в которой происходит сортировка рецепторов, и затем либо рециркулируют к поверхности клетки, накапливаясь внутриклеточно, либо распадаются в липосомах. Пути интернализации служат множеству функций, таким как поглощение питательных веществ, удаление активированных белков, клиренс макромолекул, условно-патогенное проникновение вирусов и токсинов, диссоциация и разрушение лиганда и регулирование уровня рецепторов. Многие рецепторы входят в более чем один внутриклеточный путь, в зависимости от типа клетки, концентрации рецепторов, типа лиганда, валентности лиганда и концентрации лигандов. Молекулярный и клеточный механизмы опосредованного рецептором эндоцитоза были описаны в Вго\уп апб Сгеепе, ΌΝΛ апб Се11 Вю1оду 10: 6, 399-409 (1991).
(1) Фармацевтически приемлемые носители.
Композиции, включая антитела, можно использовать терапевтически в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
Подходящие носители и их композиции описаны в КеттдЮп: Тке 8аепсе апб Ргасксе оГ Ркагтасу (19!к еб.) еб. А.К. Сеппаго, Маск РиЬккЫпд Сотрапу, Еайоп, РА 1995. Обычно в композиции используют подходящее количество фармацевтически приемлемой соли, чтобы сделать композицию изотонической. Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают, но не ограничиваются этим, физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. рН раствора составляет предпочтительно от около 5 до около 8 и более предпочтительно от около 7 до около 7,5. Кроме того, носители включают препараты замедленного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, при этом такие матрицы представляют собой формованные изделия, например пленки, липосомы или микрочастицы. Специалистам должно быть понятно, что некоторые носители могут быть более предпочтительными, в зависимости, например, от пути введения и концентрации вводимой композиции.
Фармацевтические носители известны специалистам в данной области. Наиболее типично они представляют собой стандартные носители для введения лекарственных средств человеку, включая растворы, такие как дистиллированная вода, физиологический раствор и забуференные растворы до физиологического уровня рН. Композиции можно вводить внутримышечно или подкожно. Другие соединения можно вводить в соответствии со стандартными процедурами, которые используют специалисты в данной области.
Фармацевтические композиции помимо выбранной молекулы могут включать носители, загустители, разбавители, буферы, консерванты, поверхностно-активные вещества и т. п.
Фармацевтические композиции могут также включать один или несколько активных ингредиентов, таких как антимикробные средства, противовоспалительные средства, анестетики и т.п.
Фармацевтические композиции можно вводить различными путями в зависимости от того, какое лечение желательно, местное или системное, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным (включая офтальмологическое, вагинальное, ректальное, интраназальное), пероральным, путем ингаляции или парентеральным, например путем капельного внутривенного вливания, путем подкожной, внутрибрюшинной или внутримышечной инъекции.
Раскрытые в настоящей заявке антитела можно вводить внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, внутриполостным или чрескожным путем.
Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и используемые для инъекций органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, растворы спирт/вода, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактаты Рингера или нелетучие масла. Внутривенные носители включают агенты пополнения жидкостей и питательных веществ, агенты пополнения электролитов (такие, как агенты на основе декстрозы Рингера) и т. п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, антимикробные средства, антиоксиданты, хелатообразующие агенты, и инертные газы, и т. п.
Композиции для местного введении могут включать мази, лосьоны, гели, кремы, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Традиционные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимыми или желательными.
Композиции для перорального введения включают порошки или гранулы, суспензии или растворы
- 44 010860 в воде или неводных средах, капсулы, саше или таблетки. Загустители, отдушки, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие средства или связующие средства могут быть желательными.
Возможно введение некоторых композиций в виде фармацевтически приемлемых кислотно- или основно-аддитивных солей, образуемых взаимодействием с неорганическими кислотами, такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, перхлорная кислота, азотная кислота, тиоциановая кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота, или путем взаимодействия с неорганическими основаниями, такими как гидроксид натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия, и органическими основаниями, такими как моно-, ди-, триалкил и ариламины и замещенные этаноламины.
(2) Терапевтические применения.
Эффективные дозы и схемы введения композиций можно определить эмпирическим путем, и такое определение находится в компетенции специалистов. Предельные дозы для введения композиций достаточно большие, чтобы обеспечить желаемый эффект с оказанием действия на симптомы. Доза не должна быть такой большой, чтобы вызывать неблагоприятные побочные эффекты, такие как нежелательные перекрестные реакции, анафилактические реакции и т. п. Как правило, доза варьирует в зависимости от возраста, состояния, пола и степени заболевания у пациента, пути введения и от того, включены ли другие лекарственные средства в схему лечения, и может быть определена специалистом. Дозу может регулировать врач в случае противопоказаний. Доза может меняться, и ее можно вводить 1 или несколько раз ежедневно в течение 1 или нескольких дней. Руководство можно найти в литературе, касающейся выбора подходящей дозы для определенного класса фармацевтических средств. Например, руководство по выбору подходящих доз для антител см., например, в НапйЬоок о£ Мопос1опа1 Ап!1Ьой1ек, Ееггопе, е! а1., ейк., №дек РиЬйсайопк, Рагк В1йде, Ν.Ι. (1985), сй. 22 апй рр. 303-357; 8тйй, е! а1., АпйЬоШек ш Нитап П1адпок1к апй Тйегару, НаЬег, е! а1., ейк., Рагеп Ргекк, №\ν Уогк (1977), рр. 365-389. Типичная суточная доза антитела, используемого отдельно, может составлять от около 1 мкг/кг до 100 мг/кг веса тела в сутки или более, в зависимости от факторов, перечисленных выше.
После введения описанных композиций, таких как антитело или другая молекула, такая как фрагмент ЕРА, брадикинин или его фрагмент, для осуществления или имитации взаимодействия между ЕРА, брадикинином или их фрагментом, например, и их родственным рецептором, эффективность терапевтической молекулы можно оценить различными способами, хорошо известными квалифицированному специалисту. Например, квалифицированному специалисту среднего уровня должно быть понятно, что композиция, такая как антитело или фрагмент, описанные в настоящей заявке, является эффективной для образования или имитации взаимодействия ЕРА, брадикинина или их фрагмента с рецептором у субъекта, если, например, согласно наблюдениям композиция уменьшает объем инфаркта, который наблюдался в любой из описанных в настоящей заявке моделей. Антиинфарктную активность можно измерить при помощи анализов, описанных в настоящей заявке. Раскрывается любое изменение активности, но раскрывается 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 или 95% уменьшение инфаркта относительно контроля.
Доставку других молекул, взаимодействующих с рецепторами ЕРА и брадикинина, которые ингибируют взаимодействие с ЕРА, брадикинином и/или их фрагментами, которые не обладают специфической фармацевтической функцией, но которые могут быть использованы для отслеживания изменений в клеточных хромосомах или, например, для доставки диагностических инструментов, можно осуществлять способами, аналогичными описанным для фармацевтических продуктов.
Описанные композиции и способы также можно использовать, например, в качестве инструментов для выделения и испытания новых кандидатов для лекарственных средств для различных видов ишемических заболеваний, инсульта и коронарных заболеваний.
й) Чипы и микронаборы определенного порядка.
Раскрываются чипы, где по меньшей мере один адрес представляет собой последовательности или часть последовательностей, которые представлены в любой из последовательностей нуклеиновых кислот, раскрытых в настоящей заявке. Также раскрываются чипы, где по меньшей мере один адрес представляет собой последовательности или часть последовательностей, которые представлены в любой из пептидных последовательностей, раскрытых в настоящей заявке.
Также раскрываются чипы, где по меньшей мере один адрес представляет собой вариант последовательностей или части последовательностей, которые представлены в любой из последовательностей нуклеиновых кислот, раскрытых в настоящей заявке. Также раскрываются чипы, где по меньшей мере один адрес представляет собой вариант последовательностей или части последовательностей, которые представлены в любой из пептидных последовательностей, раскрытых в настоящей заявке.
ί) Средства для компьютерного считывания.
Должно быть понятно, что описанные нуклеиновые кислоты и белки могут быть представлены в виде последовательности, состоящей из нуклеотидов или аминокислот. Существует множество способов представления таких последовательностей, например нуклеотид гуанозин может быть представлен как С
- 45 010860 или д. Подобным образом, аминокислота валин может быть представлена как ναΐ или V. Специалистам должно быть известно, как можно представить или выразить любую последовательность нуклеиновой кислоты или белка любым из существующих путей, каждый из которых считается раскрытым в настоящей заявке. В данном описании специально рассматривается представление таких последовательностей на считываемых компьютером средствах, таких как коммерчески доступные дискеты, магнитофонные ленты, чипы, жесткие диски, компакт-диски и видеодиски или другие считываемые компьютером средства. Также раскрываются двухкодовые представления описанных последовательностей. Специалистам известно, что представляют собой считываемые компьютером средства. Таким образом, в настоящей заявке раскрываются считываемые компьютером средства, на которых последовательности нуклеиновых кислот или белков записываются, хранятся или сохраняются.
Раскрываются считываемые компьютером средства, включающие последовательности и информацию, касающуюся последовательностей, раскрытых в настоящей заявке.
Ц Наборы.
В настоящей заявке раскрываются наборы, составленные для реагентов, которые могут использоваться при осуществлении на практике способов, раскрытых в настоящей заявке. Наборы могут включать любой реагент или комбинацию реагентов, которые обсуждались в настоящей заявке или которые считаются необходимыми или выгодными для осуществления на практике способов, раскрытых в настоящей заявке. Например, наборы могут включать праймеры для осуществления реакций амплификации, которые обсуждались в некоторых вариантах осуществления способов, а также буферы и ферменты, необходимые для использования праймеров, если это предполагается.
Ό. Способы получения композиций.
Композиции, раскрытые в настоящей заявке, и композиции, необходимые для осуществления раскрытых здесь способов, можно получить с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, для таких конкретных реагентов или соединений, если конкретно не указано иное.
1. Синтез нуклеиновых кислот.
Например, нуклеиновые кислоты, такие как олигонуклеотиды, предназначенные для использования в качестве праймеров, можно получить стандартными способами химического синтеза или их можно получить с использованием ферментных способов или любого другого известного способа. Такие способы могут охватывать от стандартного ферментого расщепления с последующим выделением нуклеотидного фрагмента (см., например, ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!оту Мапиа1, 2пй Εάίΐίοη (Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬота!оту Ргекк, Со1й Зрппд НагЬог, Ν.Υ., 1989) Скар!ет8 5, 6) до чисто синтетических способов, например цианоэтилфосфорамидитный способ с использованием синтезатора ДНК системы 1Плюс Мййдеп или Весктап (например, автоматического синтезатора модели 8700 от Мййдеп-Вюкеатсй, Вит1шд!оп, МА или АВ1 модели 380В). Синтетические способы, используемые для получения олигонуклеотидов, также описаны 1ки!а, е! а1., Апп. Кеу. ВюсНет. 53: 323-356 (1984) (способы, использующие фосфотриэфир и фосфит-триэфир) и Штид, е! а1., Ме11юЙ5 Еп/уток 65: 610-620 (1980) (способ, использующий фосфотриэфир). Молекулы пептидных нуклеиновых кислот можно получить при помощи способов, таких как описанные МеНеп, е! а1., Вюсопщд. СНет. 5: 3-7 (1994).
2. Синтез пептидов.
Один способ получения описанных белков включает связывание двух или более пептидов или полипептидов вместе методами химии белков. Например, пептиды или полипептиды могут быть химически синтезированы при помощи имеющегося на сегодняшний день лабораторного оборудования с использованием либо Етос (9-флуоренилметилокикарбонил), либо Вос (трет-бутилоксикарбонил) метода (Аррйей Вюкуйетк, 1пс., Еок!ег Сйу, СА). Специалистам должно быть понятно, что пептид или полипептид, соответствующие описанным белкам, можно, например, синтезировать путем стандартных химических реакций. Например, пептид или полипептид можно синтезировать и не отщеплять от смолы, где он синтезируется, тогда как другой фрагмент пептида или белок можно синтезировать и затем отщепить от смолы, делая доступной, таким образом, концевую группу, которая функционально блокирована на другом фрагменте. Посредством реакций конденсации пептидов эти два фрагмента могут ковалентно связываться пептидной связью по их карбоксильному и аминоконцам, соответственно, с образованием антитела или его фрагмента (Сгап! СА (1992) 8уп!йейс Рерййек: А Икет Сшйе. \У.Н. Егеетап апй Со., Ν.Υ. (1992); Войапкку, М. апй ТгоЧ В., Ей. (1993) Рппс1р1е5 о£ Рерййе ЗугИНекА. Зрппдет^ейад 1пс., ΝΥ (который включен в настоящую заявку посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к синтезу пептидов). Альтернативно, пептид или полипептид независимо синтезируют ш у1уо, как описано в настоящей заявке. После выделения эти независимые пептиды или полипептиды могут быть связаны с образованием пептида или его фрагмента через аналогичные реакции конденсации пептидов.
Например, ферментное лигирование клонированных или синтетических пептидных фрагментов позволяет соединять относительно короткие пептидные фрагменты с получением более крупных пептидных фрагментов, полипептидов или целых белковых доменов (АЬгаНткеп, Ь., е! а1., Вюсйетщйу, 30: 4151 (1991)). Альтернативно, естественное химическое лигирование синтетических пептидов можно использовать для синтетического конструирования крупных пептидов или полипептидов из более коротких пептидных фрагментов. Этот способ состоит из двухстадийной химической реакции (Оагеоп, е! а1., ЗупШеык
- 46 010860 о£ Рго!етк Ьу №!ке С1ет1са1 Ыдабоп. 8с1епсе, 266: 776-779 (1994)). Первая стадия представляет собой хемоселективную реакцию незащищенного синтетического пептида-тиоэфира с другим незащищенным пептидным сегментом, содержащим аминоконцевой остаток Сук с получением тиоэфирсвязанного промежуточного продукта как исходного ковалентного продукта. Без изменения условий реакции этот промежуточный продукт подвергается самопроизвольной быстрой внутримолекулярной реакции с образованием природной пептидной связи в сайте лигирования (Ваддюйш, М., е! а1. (1992) ЕЕВ8 Ье!!. 307: 97101; С1агк-Ье^1к I., е! а1., 1. Вю1. С1ет., 269: 16075 (1994); С1агк-Ье^1к I., е! а1., Вюсйетщйу, 30: 3128 (1991); Ва_)агаШпат, К., е! а1., Вюсйет1к!гу 33: 6623-30 (1994)).
Альтернативно, незащищенные пептидные сегменты химически связывают, при этом связь, образующаяся между пептидными сегментами как результат химического лигирования, является неприродной (непептидной) связью (8с1то1хег. М., е! а1., 8с1епсе, 256: 221 (1992)). Такой метод использовался для синтеза аналогов доменов белка, а также больших количеств относительно чистых белков с полной биологической активностью (беЬ1к1е М11!оп В.С., е! а1., Тес11пк|иек ш Рго!ет С1ет1к!гу IV. Асабетк Ргекк, \ем Уогк, рр. 257-267 (1992)).
3. Способы получения композиций.
Раскрываются способы получения композиций, а также получения промежуточных продуктов, приводящих к композициям. Например, раскрываются белки, родственные ЕРА или брадикинину, такие как представленные в табл. 1 и 2, соответственно. Существует множество способов, которые можно использовать для получения таких композиций, такие как способы химического синтеза и стандартные способы молекулярной биологии. Должно быть понятно, что способы получения этих и других раскрываемых композиций конкретно раскрываются в настоящей заявке.
Раскрываются молекулы нуклеиновых кислот, полученные способом, включающим функциональное связывание молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации, с последовательностью, кодирующей последовательности из табл. 1 и 2, с последовательностью, контролирующей экспрессию нуклеиновой кислоты.
Раскрываются молекулы нуклеиновых кислот, полученные способом, включающим функциональное связывание молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, кодирующую пептид, представленный в последовательностях из табл. 1 и 2, с последовательностью, контролирующей экспрессию нуклеиновой кислоты.
Раскрываются молекулы нуклеиновых кислот, полученные способом, включающим функциональное связывание молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, кодирующую пептид, имеющий 80% идентичность с пептидом, представленным в последовательностях из табл. 1 и 2, с последовательностью, контролирующей экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты.
Раскрываются нуклеиновые кислоты, полученные способом, включающим функциональное связывание молекулы нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, кодирующую пептид, имеющий 80% идентичность с пептидом, представленным в последовательностях из табл. 1 и 2, где любые изменения в последовательностях из табл. 1 и 2 являются консервативными изменениями, с последовательностью, контролирующей экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты.
Раскрываются клетки, полученные способом трансформации клетки любой из раскрытых нуклеиновых кислот. Раскрываются клетки, полученные способом трансформации клетки любой из неприродных раскрытых нуклеиновых кислот.
Раскрываются любые из описанных пептидов, полученных способом экспрессии любой из описанных нуклеиновых кислот, кодирующих эти пептиды. Раскрываются любые из неприродных описанных пептидов, полученные способом экспрессии любой из описанных нуклеиновых кислот. Раскрываются любые из описанных пептидов, полученные способом экспрессии любой из неприродных описанных нуклеиновых кислот.
Раскрываются животные, полученные способом трасфицирования клетки в организме животного любой из молекул нуклеиновых кислот, описанных в настоящей заявке, или любым из описанных пептидов. Раскрываются животные, полученные способом трасфицирования клетки в организме животного любой из молекул нуклеиновых кислот, описанных в настоящей заявке, где животное является млекопитающим. Также раскрываются животные, полученные способом трасфицирования клетки в организме животного любой из молекул нуклеиновых кислот, описанных в настоящей заявке, где животное представляет собой мышь, крысу, кролика, корову, овцу, свинью или обезьяну.
Также раскрываются животные, полученные способом введения животному клетки, описанной в настоящей заявке.
Е. Способы использования композиций.
1. Способы использования композиций в качестве инструментов для исследований.
Раскрытые в настоящей заявке композиции можно использовать в различных способах в качестве инструментов для исследований. Например, описанные композиции и способы можно использовать в моделях инфаркта при исследовании ишемии, а также в качестве реагентов для выделения молекул, воздействующих на инфаркт.
Композиции можно, например, использовать в качестве мишеней в протоколах комбинаторной хи
- 47 010860 мии или других скрининговых протоколах для выделения молекул, обладающих желаемыми функциональными свойствами в отношении инфаркта.
Раскрываемые композиции можно использовать, как обсуждается в настоящей заявке, либо в качестве реагентов в микронаборах определенного порядка, либо в качестве реагентов для зондирования или анализа существующих микронаборов определенного порядка. Композиции также можно использовать в любом известном скрининговом анализе, связанном с чипами/микронаборами определенного порядка. Композиции также можно использовать любым известным способом применения вариантов описанных композиций для компьютерного считывания, например, для исследования родства или для проведения анализа молекулярного моделирования, связанного с описанными композициями.
2. Способы модуляции эффектов ишемии и лечения инфарктов.
Раскрываются способы модуляции эффектов инсульта и коронарного заболевания и приступа или любого другого заболевания, где ишемия вызывает образование некротической ткани. Например, одной из характеристик инсульта или сердечного приступа, вызванного окклюзией сосудистой сети, или любого другого состояния, характеризующегося потерей или снижением притока крови к конкретной ткани, является наступление инфаркта или поврежденная или омертвевшая ткань. Инфаркт вызывается ишемическим событием, потерей кислорода из-за потери притока крови к ткани. Ишемическое событие представляет собой любое событие, когда снижается доставка кислорода к ткани или клетке. Раскрываемые здесь композиции можно использовать в способах уменьшения инфаркта, вызванного ишемией. Раскрываемые способы включают введение одной или нескольких из раскрываемых композиций нуждающемуся в этом субъекту. Нуждающийся субъект может быть любым субъектом, который может испытывать, испытывает или испытал ишемическое событие. Должно быть понятно, что раскрываемые композиции способны обеспечить 100% восстановление ткани в модели ишемии у мыши, как раскрывается в настоящей заявке.
В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции можно вводить в течение ишемического события или в течение 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 или более часов после ишемического события. Когда ткань является, действительно, поврежденной тканью, а не гибернационной тканью, тогда ее сохранение может занимать и более 20 ч и, на самом деле, может происходить годами после ишемического события. Основной разницей между двумя типами нефункциональной ткани является то, что поверхностно поврежденная ткань обычно восстанавливается полностью, а гибернационная ткань обычно имеет островки некроза, которые сохраняются в ней. Также поверхностно поврежденная ткань может оставаться нефункциональной в течение нескольких лет, как в медленно закрывающихся коронарных артериях при заболевании сердца, но после операции и раскрытия артерий она возвращается к нормальному функционированию.
Композиции можно вводить в любой концентрации, которая является эффективной для снижения эффектов ишемии. Например, композиции можно вводить в количестве, эквивалентном по меньшей мере 0,0001, 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг. Например, можно использовать аллометрические преобразования, чтобы на основании дозы, используемой, например, в модели мыши, выйти на эквивалентную дозу для человека или другого животного. Например, можно использовать общую площадь поверхности тела для получения эквивалентов для различных видов. Например, доза 10 мг/кг у мыши представляет собой 30 мг/м2 общей площади поверхности тела. Такая доза у человека, т.е. доза 30 мг/м2, эквивалентна 0,76 мг/кг для человека, имеющего вес 70 кг.
Другой путь определения дозы включает наблюдение концентрации в крови. Например, доза для человека 0,76 мг/кг составит примерно до 7,6 мг/л (70 кгх0,76 мг/кг=53,2 мг, 53,2 мг/7 л=7,6 мг/л=7,6 мкг/мл). Таким образом, раскрываются уровни содержания в плазме РРА или его производных, или брадикинина или его производных, или любых других активных молекул, описанных в настоящей заявке, после введения, которое составляет, например, по меньшей мере 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100 или 1000 мкг/мл. Эти расчеты были получены в расчете на 7 л крови, но они могут меняться в зависимости от разных объемов крови с использованием для расчета описанных здесь методов.
Дозы также можно регулировать путем анализа динамики фармакофора и кинетики фармакофора, которые регулируют не только, например, активность активного вещества, но также регулируют скорость, с которой, например, активное вещество метаболизируется в организме субъекта.
Должно быть понятно, что раскрываемые композиции можно использовать в комбинации друг с другом, а также в комбинации с другими терапевтическими средствами для лечения или профилактики эффектов ишемии. Например, человеческий !РА можно в некоторых случаях применять для уменьшения образования сгустка. Раскрываемые композиции можно вводить в комбинации с ША. Другим примером является Р1а\зх'|Л| и композиции, составляющие Р1а\зх™. Р1а\зх™ является антитромбоцитным средством, которое помогает удерживать тромбоциты в крови от слипания с образованием сгустков. Р1а\зх™ помогает защитить пациентов от следующего сердечного приступа или инсульта.
Раскрываются способы уменьшения инфаркта у субъекта, включающие введение субъекту РРА.
Раскрываются способы, в которых РРА включает структуру, имеющую по меньшей мере 20 или 70%, или любой другой процент, как раскрывается в настоящей заявке, идентичности с 8ЕО Ш ΝΟ: 2.
- 48 010860
Также раскрываются способы, в которых аминокислоты 8, 12 и 13 8ЕО ГО N0: 2 не изменяются, и способы, в которых любые изменения по аминокислотам 7, 9 и 15 8Е0 ГО N0: 2 представляют собой консервативные замены.
Раскрываются способы, в которых ЕРА включает аминокислоты, имеющие по меньшей мере 40, или 70%, или любой другой процент, как раскрывается в настоящей заявке, идентичности с аминокислотами 6-16 8Е0 ГО N0: 2, и способы, в которых аминокислоты 8, 12 и 13 не изменяются, и способы, в которых любые изменения по аминокислотам 7, 9 и 15 представляют собой консервативные замены.
Раскрываются способы, в которых ЕРА снижает объем инфаркта, присутствующий в мышиной модели МСА0. Также раскрываются способы, в которых инфаркт уменьшается по меньшей мере на 20, 40, 60, 80% или на любое процентное количество в пределах от 20 до 100%, как раскрывается в настоящей заявке.
Раскрываются способы, в которых инфарктный коэффициент в модели МСА0 у мыши больше чем или равен 1,1, 1,5, или 2, или любому другому коэффициенту, как раскрывается в настоящей заявке.
Также раскрываются способы, в которых коэффициент определяют, используя средние захваченные инфарктом объемы. Раскрываются способы, в которых средний объем инфаркта в модели МСАО у мыши меньше чем или равен 90, 70, 50 или 30% или составляет любое процентное количество в пределах от 20 до 100%, как раскрывается в настоящей заявке.
Раскрываются способы уменьшения инфаркта у субъекта, включающие введение субъекту композиции, где композиция включает пептидную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 34, 8Е0 ГО N0: 40, 8ЕО ГО N0: 41, 8Ер ГО N0: 42, 8ЕО ГО N0: 43, 8ЕО ГО N0: 44; 8ЕО ГО N0: 45, 8ЕО ГО N0: 96-103, ЛУК. или ЕУВ, или любую другую функциональную последовательность ЕРА, раскрытую в настоящей заявке.
Раскрываются способы, в которых ЕРА имеет последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 29, 8ЕО ГО N0: 30, 8ЕО ГО N0: 31, 8ЕО ГО N0: 32, 8ЕО ГО N0: 33, 8ЕО ГО N0: 34, 8ЕО ГО N0: 35, 8ЕО ГО N0: 36, 8ЕО ГО N0: 37, 8ЕО ГО N0: 38, 8ЕО ГО N0: 39, 8ЕО ГО N0: 40, 8ЕО ГО N0: 41, 8ЕО ГО N0: 42, 8ЕО ГО N0: 43, 8ЕО ГО N0: 44, 8ЕО ГО N0: 45, 8ЕО ГО N0: 46, 8ЕО ГО N0: 47, 8ЕО ГО N0: 48, 8ЕО ГО N0: 49, 8ЕО ГО N0: 50, 8ЕО ГО N0: 51, или 8ЕО ГО N0: 52, 8ЕО ГО N0: 53, 8ЕО ГО N0: 54, 8ЕО ГО N0: 55, 8Е0 ГО N0: 56, 8Е0 ГО N0: 89, или 8Е0 ГО N0: 96-103, АУВ или ЕУВ, или любую другую функциональную последовательность ЕРА, раскрытую в настоящей заявке.
Раскрываются способы, в которых ЕРА имеет последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 46, 8ЕО ГО N0: 45, 8ЕО ГО N0: 36, 8ЕО ГО N0: 50, 8ЕО ГО N0: 38, 8ЕО ГО N0: 40, или 8ЕО ГО N0: 54, 8ЕО ГО N0: 32, 8ЕО ГО N0: 47, 8ЕО ГО N0: 48, 8ЕО ГО N0: 52, или 8ЕО ГО N0: 39, или любую другую функциональную последовательность ЕРА, раскрытую в настоящей заявке.
Раскрываются способы, в которых инфаркт представляет собой церебральный инфаркт, и способы, в которых инфаркт представляет собой кардиальный инфаркт. Также раскрываются способы, в которых инфаркт представляет собой любой тип инфаркта.
Раскрываются способы уменьшения инфаркта у субъекта, включающие введение субъекту брадикинина.
Раскрываются способы, в которых брадикинин включает структуру, имеющую 60, или 80%, или любой другой процент, как раскрывается в настоящей заявке, идентичности с 8Е0 ГО N0: 57. Также раскрываются способы, в которых любые вариации от 8Е0 ГО N0: 57 представляют собой консервативные замены.
Раскрываются способы, в которых брадикинин не имеет основной аминокислоты на С-конце, и способы, в которых основная аминокислота представляет собой Агд, Ьук или Ηίδ.
Раскрываются способы, в которых брадикинин включает основную аминокислоту на №конце, и способы, в которых основная аминокислота представляет собой Агд, Ьук или Ηίδ.
Раскрываются способы, в которых брадикинин имеет последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 57, 8ЕО ГО N0: 58, 8ЕО ГО N0: 59, 8ЕО ГО N0: 60, 8ЕО ГО N0: 61, 8ЕО ГО N0: 62, 8ЕО ГО N0: 63, 8ЕО ГО N0: 64, 8ЕО ГО N0: 65, 8ЕО ГО N0: 66, 8ЕО ГО N0: 67, 8ЕО ГО N0: 68, 8ЕО ГО N0: 70, 8ЕО ГО N0: 71, 8ЕО ГО N0: 72, 8ЕО ГО N0: 73, 8ЕО ГО N0: 75, 8ЕО ГО N0: 77, 8ЕО ГО N0: 80, 8ЕО ГО N0: 81, 8Е0 ГО N0: 82, 8Е0 ГО N0: 83, 8Е0 ГО N0: 84 или 8Е0 ГО N0: 85, или любую другую функциональную последовательность брадикинина, раскрытую в настоящей заявке.
Раскрываются способы, в которых брадикинин имеет последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 58, 8ЕО ГО N0: 61, 8ЕО ГО N0: 62, 8ЕО ГО N0: 63, 8ЕО ГО N0: 64, 8ЕО ГО N0: 77 или 8ЕО ГО N0: 81. Также раскрываются способы, в которых брадикинин имеет последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0: 58 или 8Е0 ГО N0: 61, или любую другую функциональную последовательность брадикинина, раскрытую в настоящей заявке.
Также раскрываются способы уменьшения инфаркта у субъекта, нуждающегося в уменьшении инфаркта, включающие введение субъекту эффективного количества антагониста рецептора ангиотензина ΙΙ в фармацевтически приемлемой форме.
Раскрываются способы уменьшения инфаркта у субъекта, в которых антагонист рецептора типа 2 ангиотензина ΙΙ представляет собой брадикинин.
Раскрываются способы лечения субъекта, нуждающегося в уменьшении инфаркта, включающие введение субъекту эффективного количества брадикинина в фармацевтически приемлемой форме, в ко
- 49 010860 торых брадикинин модулирует рецептор ангиотензина ΙΙ, уменьшая, таким образом, инфаркт.
Е. Примеры.
Следующие примеры раскрываются таким образом, чтобы предоставить специалистам в данной области полное раскрытие и описание, как можно получить и оценить соединения, композиции, изделия, устройства и/или способы, заявленные настоящим изобретением, и являются чисто иллюстративными и не предназначены для ограничения объема, если только специально не указано. Были предприняты меры для обеспечения точности цифровых значений (например, количеств, температуры и т.д.), но возможны некоторые ошибки и отклонения. Если не указано иное, части являются массовыми частями, температура указана в градусах Цельсия или как комнатная температура, а давление является атмосферным давлением или около атмосферного.
1. Пример 1. Активные фракции и молекулы.
Раскрывается очищенная фракция молекул (фракция альбумина, А£й-де1-Ь1ие), экстрагированная из плазмы находящихся в состоянии гибернации сурков (УРЕ). Специфические субфракции, Ό1 и Ό2, собирали на ранней стадии гибернации сурков (середина декабря, 6 недель в состоянии гибернации) в научно-исследовательском институте Ое1а\таге Vа!е^ Сар 8с1епсе 1п8Й!и!е. Образцы плазмы отдельных животных объединяли. Ό1 и Ό2 были идентичны, за исключением того, что они были получены в разных сериях опытов очистки образцов. Простую контрольную фракцию экстрагировали у находящихся в активном состоянии сурков в июле (8А). Партии материалов лиофилизовали и хранили при -70°С.
Наиболее близкую контрольную фракцию получали аналогичным образом после сбора плазмы во время поздней стадии гибернации на исследовательской станции №г111 ЕаЧегп \νίΗ1ίίο £асШ1у (УРЕ-С1). ΝΉ собирали в два разных периода времени и не объединяли. ΝΉ1 собирали в середине декабря, а ΝΉ2 собирали в середине января.
Искали модели для биоанализа, работающие с внутривенной (в/в) инъекцией веществ, в отличие от интрацеребральной (и/ц) инъекции, прежде всего, для устранения трудностей, связанных с прохождением медицинских доз молекул белка и/или пептида через гематоэнцефалический барьер. Полученные 01/02, ΝΉ1, ΝΉ2 и 8А материалы были, таким образом, испытаны на их в/в действие на кровяное давление у 15 спонтанно гипертензивных крыс (8НК) и на подавление аппетита у 25 страдающих ожирением крыс 2искег. Побочные токсические эффекты оценивали путем наблюдения общей анатомии и веса отдельных внутренних органов. Никакого эффекта, подобного токсичности, не наблюдали при в/в дозах (50 мг/кг), которые на основании первоначальных данных были известны как максимально эффективные для стимуляции рециркуляции мочевины в крови (5 мг/кг). Дозы Ό1 и Ό2 по меньшей мере до 800 мг/кг оказались нетоксичными. Двум дополнительным 8НК-животным инъецировали большие дозы Ό2 (800 мг/кг) двумя частями с интервалом 30 мин. И опять не наблюдали никаких эффектов на кровяное давление, аппетит, токсичность органов или смертность в течение 24 ч.
Материалы Ό2, ΝΉ2 и 8А были затем испытаны на их действие, связанное с сохранением ткани в мышиной модели окклюзии среднемозговой артерии (МСАΟ). В этой модели мышь оперировали под анестезией хлоралгидратом и среднемозговую артерию полностью пережимали на 1 ч. Затем производили реверсию окклюзии с восстановлением церебрального кровотока, что подтверждали измерениями лазерным методом Оорр1ег. В течение 24 ч после начала МСАΟ наблюдали двигательное поведение животного и размер инфаркта (окрашивание ТТС, 2%). Инъекции Ό2 (хвостовая вена, 4 мг/кг) в 21 мышь через 1 ч после начала 1-часовой МСАΟ показали замечательное сохранение ткани в течение 24 ч в трех отдельных повторных экспериментах (р<0,01, !-критерий). В отличие от этого, инъекции ΝΉ2 не показали сохранения ткани по сравнению с аналогичными дозами 8А (Ν8, !-критерий). У 6 из 21 животных, получавших Ό2, наблюдали 90-100% сохранение (т.е. от минимального до необнаруживаемого инфаркта при дозе 4 мг/кг), а для 02-группы, в целом, сохранение ткани составило 63% (табл. 7).
В испытании доза-ответ было обнаружено, что в/в доза Ό2 5 мг/кг была оптимальной в модели МСАΟ (12 мышей). Последующее исследование времени введения инъекции показало, что предварительная обработка Ό2 (5 мг/кг, в/в), инъецируемого за 2 ч до церебральной ишемии (МСАΟ), обеспечивала 100% сохранение ткани у всех субъектов (6 мышей). Такие же результаты были получены при введении инъекции через 0,5 ч после начала МСАΟ. Статистически значимое уменьшение объема инфаркта по состоянию на 24 ч было обнаружено для инъекций, вводимых через 2, 4 и 6 ч после начала МСАΟ, но не после 8 ч (табл. 7). Это показывает, что профилактическое, а также постишемическое лечение (6 ч после МСАΟ) является полезным.
В исследовании методом диализа 02-материал был диализован против воды, хлорида натрия (2М) и мочевины (8М) в течение 24 ч с использованием мембранных молекулярных сит, пропускающих молекулы 3,5, 7 или 10 кДа (т.е. пропускающих пептиды из 02 в большие объемы диализирующего раствора). Было обнаружено, что каждая из удерживаемых фракций с молекулами больше мембранных отсечек является эффективной в сохранении ткани в модели МСАΟ. Однако удержанные молекулы, диализованные против мочевины, были даже более эффективными, т. к. в этом случае большинство животных (9 мышей) показали отсутствие или минимальные объемы инфаркта (показано ниже, фиг. 6). Такой метод диализа согласуется с вариантом, когда белок является вытесненным из его носителя или ингибирующий пептид является удаленным, любой из этих вариантов затем обеспечивает более устойчивое сохранение
- 50 010860 ткани, когда Ό2 вводят через 1 ч после начала МСАО.
Исследования поведения подтвердили отсутствие инфаркта или его небольшой размер у мышей, которым вводили Ό2. Каждой мыши через 24 ч после выздоровления от 1-часовой ишемии давали возможность передвижения в свободном пространстве. Нормальные мыши обычно запрыгивают на небольшой ящик, расположенный в неогороженном пространстве; каждое животное с предшествующей ишемией оценивали на его способность запрыгивать на верх ящика. Кроме того, следили за сгибанием конечностей, а также за принудительными движениями (движение по кругу). Животные с 90-100% сохранением ткани не показали никакого дефицита движений. Контрольные животные с церебральным инфарктом все показали гемиплегию.
Первоначально двумерный гель-электрофорез (808-РАСЕ) осуществляли, сравнивая 8А- и Э2фракции, для дополнительной очистки активного компонента. Примерно 40 белков, большей частью в пределах 32 кДа, были идентифицированы таким дифференциальным методом. Было примерно 20 гибернационно-специфических и 20 положительно регулируемых белков с плотностью пятен, более чем в 2 раза большей, чем у 8А-контролей. Еще один метод, который использовали для идентификации зависящих от состояния АО-белков, включал применение ВАТ8-гелей, которые получали разрезанием 8А- и 20-гелей на полоски одинаковой р1, а затем использовали параллельно для разделения по молекулярной массе. После определения ВАТ8- или обычного АО-пятна, которое представляло интерес, его затем идентифицировали способом, объединяющим метод масс-спектроскопии (ЖХ/М8/М8) и метод биоинформатики фингерпринтинг, для определения последовательности.
Используя дифференциальное ΝΕ2 против ϋ2 сравнение, получали количественные 20 (двухмерные) гели, где программа выстраивает в линию характерные пятна, количественно измеряет их плотность и затем отмечает те, которые показывают разницу в 2 или больше раз. Таким образом, было показано, что только 9 пятен чистого белка являются положительно регулируемыми и/или гибернационно-специфическими (показано ниже на фиг. 2, 3, 5). Некоторые из этих пятен также были обнаружены в С8Р-дифференциалах, и затем те, которые представляли интерес, были выделены. Эти пятна можно обрабатывать, как описано в настоящей заявке, для дальнейшей очистки и идентификации активных компонентов.
ЖХ/М8/М8 осуществляли на пептидных фракциях ϋ2 и ΝΕ2, используя центрифугирование для фильтрации молекул ниже 10 кДа. Одну из этих дифференциальных молекул идентифицировали традиционным методом фингерпринтинга, но по меньшей мере пять других не могли так легко идентифицировать. Эта пептидная фракция, однако, не представляет большого интереса, поскольку она не содержит активный ингредиент для предотвращения инсульта и не является одним из 9 белков, наблюдаемых в дифференциальных ϋ2 по сравнению с ΝΕ2 20-гелях.
Было сделано заключение, что молекула(ы) белка в ОА-фракции, но не в ΝΕ2 или в 8А, производит действие на ишемическую церебральную ткань у мышей, которое предотвращает или сводит к минимуму инсульт после 1-часовой МСАО. О2-Молекула(ы) не вызывает никаких явных признаков токсических эффектов у крыс в дозе, в 10 раз превышающей среднюю эффективную дозу, наблюдаемую у мышей. Соответствующая молекула после значительной церебральной ишемии может привести к существенному сохранению ткани в модели инсульта при введении вплоть до 6 ч после МСАО. Чистую молекулярную форму, в действительности, можно наблюдать как один из 9 белков, показанных на фиг. 3, 5.
а) Методы.
(1) Средства наблюдения за гибернацией.
Средства наблюдения за гибернацией на станции ΝοΠίι Еак!ет АйбБГе представляли собой помещение площадью 1000 кв. футов с регулируемой температурой, вмещающее примерно 100 сурков. Животных по отдельности помещали в проволочные клетки, в которых были гнезда из соломы. Каждое животное проверяли каждые 3-4 дня под освещением красным светом для определения стадии гибернации. Все образцы крови, взятые во время гибернации, брали посредством интракардиальной пункции, используя гибернацию в качестве анестезии.
Средства наблюдения за гибернацией в институте Ое1а\таге Аа!ег Сар 8с1епсе 1пк!1!и!е представляли собой помещение площадью 500 кв. футов с регулируемой температурой, вмещающее примерно 20 сурков. Животных по отдельности помещали в клетки со звукоизоляцией, разделенные на два отсека, из прессованной древесины толщиной 3/4-дюйма с проволочным дном в отсеке для пищи. В отсеке для сна было гнездо из соломы. Более крупный отсек для гибернации был совершенно темным. За животными наблюдали при помощи прослушивающего устройства и их не проверяли вплоть до завершения наблюдений, за исключением момента 6 недель после начала гибернации.
(2) Виды животных.
Сурки являются источником гибернационной плазмы. Лабораторных крыс использовали для исследований токсичности, т.к. это наиболее традиционно используемые животные. Спонтанно гипертензивных крыс (8НВ) и крыс, страдающих ожирением Дискет), использовали для исследований гипертензии и аппетита и для оценки токсичности. Мышей С57 использовали в исследованиях окклюзии среднемозговой артерии, поскольку этих животных наиболее часто используют в качестве модели инсульта.
(3) Сбор плазмы (середина декабря и середина января).
У сурков либо брали образцы крови 10 мл посредством интракардиальной пункции, либо путем
- 51 010860 взятия крови через интракардиальную пункцию, или из кровоизлияния в грудную клетку после удаления сердца (т.е. гемолизированная плазма). Сбор крови осуществляли 2 раза, в середине декабря (6 недель в состоянии гибернации) и в середине января (10 недель в состоянии гибернации). Гибернацию инициировали 1 ноября, помещая животных в клетки для наблюдения за гибернацией и обеспечивая их только водой. Температура на исследовательской станции №г111 Еайегп ТПбБГе (№№) была постоянной, 35°С, а в исследовательском институте Ое1а\\'аге Та1ег 6ар 8с1епсе !п8111и1е (ΌΤΟδΙ) колебалась между 35 и 36°С. После сбора кровь центрифугировали на холоде (№№) или помещали на лед для последующего разделения при комнатной температуре (ΌΤΟδΙ). После разделения (5хд в течение 10 мин) декантированную плазму замораживали для хранения.
(4) Получение молекулярных фракций для испытания.
Ό1/Ώ2 получали из ΌνθδΙ-плазмы, собранной посредством интракардиальной пункции в середине декабря; О211ето получали из гемодиализированной крови, собранной из вытекающей из аорты в грудную клетку крови. После АГГ1-де1-очистки материал лиофилизировали и вводили в миллиграммовых количествах (шкала Мей1ег), растворенных в физиологическом растворе. Доза составила 50 мг/кг (испытания токсичности у крыс) и 5 мг/кг (исследования инфаркта у мышей). Все инъекции вводили в виде болюса в хвостовую вену в объеме 0,1 мл (мыши) и 0,5 мл (крысы).
NΕ1, NΕ2 получали из NΕV-плазмы, собранной посредством интракардиальной пункции в середине декабря (NΕ1) и в середине января (NΕ2). Лиофилизированные материалы, вводимые путем инъекции, взвешивали и растворяли, как указано выше. Дозы и инъекции были такими же, как и для Ό1 и Ό2.
8А получали так же, как и для Ό2, за исключением того, что плазму собирали летом, в августе, от бодрствующих и активных сурков, находящихся под воздействием седативного средства кетамина (25 мг/кг).
С8Р брали из дорсальной пункции твердой мозговой оболочки в области большого отверстия. Зимние пробы брали у анестезированных сурков, а летние пробы брали у анестезированных кетамином сурков (35 мг/кг). Очищенную жидкость вводили путем инъекции в хвостовую вену мышей в объеме 100 мкл. Интрацеребральные инъекции осуществляли в боковой желудочек (объем 100 мкл) через открытую твердую мозговую оболочку при удаленной находящейся снаружи кости (площадь 20 мм2).
Мочу брали у летних и зимних животных и использовали только в определениях методом двумерного полиакриламидного гель-электрофореза и 2П-ВАТ8 (анализ двумерных полос двух Ό-разделений).
(5) Молекулярное просеивание Ό2.
Материал Ό2 (30 мг) растворяли в 600 мкл мочевины, №101 или воды при концентрации 50 мг/мл. Растворенный материал герметично закрывали внутри мешочка для диализа с 10 или 3,5 кДа отсечкой по типу змеиной кожи. Герметично закрытый мешочек затем помещали в 100 мл подходящего буфера (такой же, как использовали для растворения) и оставляли для диализа на 18 ч при 2-6°С. Затем буфер для диализа заменяли свежим буфером, что снова повторяли через 3 ч. Диализованный буфером материал затем диализовали исключительно против дистиллированной воды в течение 24 ч. Конечный материал, полученный в результате диализа, затем лиофилизировали традиционными методами (вакуум, улавливание воды и т.д.). Инъекцию в хвостовую вену осуществляли в дозе 5 мг/кг в объеме 0,1 мл.
(6) Измерение КК-интервалов.
ЭКГ записывали при помощи низкошумовых усилителей (ϋΓΙ 2280, 20000 усиление, от 0,1 до 1000 Гц), соединенных с низкошумовыми электродами Шегшеб А10005), которые были закреплены на гладкой стороне лап. Осуществляли цифровое преобразование данных ЭКГ при 1000 Гц (ЖИопа! Ичйгшпепй) и записывали на диск (компьютер Сотрац). К-Волну идентифицировали по первому нулевому пересечению верхней кривой (положительная полярность), которая имела бШб! больше чем 10 единиц, но меньше чем 15 (устанавливали визуально). Количество точек данных между последовательными К-волнами использовали как меру КК-интервала (мс). Визуальное подтверждение КК-интервалов проверяли вручную, используя 10% данных, с выводом на экран компьютера. Артефакты, вызванные действием ЭМГ, легко определяли при помощи статистики аномальных значений.
(7) Модель окклюзии среднемозговой артерии (мышь).
Мышь С57 (Сйаг1е8 Кйег) оперировали под анестезией хлоралгидритом (в/б). Разрез делали на шее вблизи правой внутренней сонной артерии. Полиэтиленовый обтуратор, имеющий диаметр несколько больший, чем диаметр средней церебральной артерии у ее раздвоения с внутренней сонной артерией, вставляли из положения в цервикальной области в месте разветвления внутренней и внешней сонной артерий. Вещества для в/в инъекции вводили в момент, пока обтуратор был на месте, с интервалом как 30, так и 60 мин. Все инъекции осуществляли через иглу для подкожных инъекций 36-да, введенную в хвостовую вену. Во всех случаях обтуратор удаляли после 1-часовой ишемии. Возобновление церебрального кровотока через ранее ишемическое кортикальное поле подтверждали при помощи измерения кровотока в открытой кортикальной поверхности лазером Эорр1ег. Цервикальные и краниальные раны затем закрывали, и животное выздоравливало в теплом спокойном окружении (1-2 ч). После полного выздоровления животное возвращали в его клетку.
(8) Оценка церебрального инфаркта по поведению и ТТС-окрашиванию.
Через 24 ч после выздоровления после хирургической операции животное обследовали на двигательное поведение. Вытяжение или сгибание конечностей, противоположных ишемическому полуша
- 52 010860 рию, сравнивали с ипсилатеральными конечностями, взятыми в качестве контроля. Животное помещали в свободное пространство с расположенным в нем небольшим ящиком высотой примерно 2 дюйма. Нормальные мыши обычно запрыгивают на небольшой ящик в течение нескольких секунд. Отмечали любое отклонение прыгучести. Если животное не передвигалось само, его принуждали легким подталкиванием сзади. Затем животных обезглавливали и удаляли черепную кость. Твердую мозговую оболочку разрезали микроножницами и цельный головной мозг извлекали. Затем его помещали в металлическую форму, используемую для быстрого разрезания головного мозга на секции при помощи лезвий. Срезы головного мозга размером 2 мм затем помещали в 2% раствор хлорида трифенилтетразолия и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем срезы фотографировали при помощи видеокамеры и записывали на компьютерный диск. Затем использовали программу от ММН для определения области инфаркта для каждого среза головного мозга. Объем инфаркта нормализовали относительно контралатеральной стороны к контролю для эффектов церебрального отека. Откалиброванные результаты являются измерением объема инфаркта, выраженного в куб. мм.
(9) Токсичность (общее состояние органов, артериального давления, пищевого поведения).
Животных 8НВ (С1аг1ек Вкег) оперировали под анестезией барбитуратом (35 мг/кг). Полиэтиленовый катетер помещали в брюшную аорту (способ ^еекк, 25). Разрез закрывали и животному давали выздороветь в течение 24 ч. Инъекции испытываемого вещества в хвостовую вену вводили в процессе непрерывного наблюдения за давлением крови. Пищевое поведение наблюдали ежедневно у крыс Ζι,κΙ^γ (С1аг1ек Вкег) по прибавке в весе. Животным вводили инъекции испытываемых веществ через хвостовую вену и взвешивали ежедневно в течение 3 недель. Корм и воду давали неограниченно. После завершения исследования кровяного давления и пищевого поведения животных умерщвляли и внутренние органы извлекали, проверяли на отклонения и взвешивали.
(10) Хирургия.
Крыс (8ргадие ИаМу) обоего пола весом примерно 350-450 г анестезировали пентобарбиталом натрия и помещали в небольшой дыхательный аппарат для животных (Нагеагб Аррага!ик), снабженный трахеотомической трубкой (ПЭ 200 полиэтиленовая трубка). Отслеживали потребности в вентиляции легких. Слева делали торакотомию для раскрытия области сердца. Принудительную вентиляцию затем устанавливали на такие скорость и объем, которые были установлены в предыдущий период мониторинга. Через область мышцы, содержащей БАИ, продергивали хирургическую шелковую нить 4-0 при помощи полукруглой иглы размером 26-да. Уровень составил примерно 1/3 расстояния от предсердия до верхушки легкого. Концы 4-0 шовного материала прочно удерживали вместе, 1 раз завязывали и закрепляли при помощи быстро высвобождаемого зажима. После 45 мин полной окклюзии БАИ, определенной по темно-синему окрашиванию левого вентрикулярного поля, шовный материал высвобождали и ткань в месте, где ранее была наложена лигатура, массажировали для обеспечения полного высвобождения надавливания внутренней лигатуры. Отмечали моментальный возврат артериального давления и, если возникала реперфузионная фибрилляция, осуществляли дефибрилляцию при помощи холодного хлопкового тампона, которым осторожно протирали поверхность сердца. Все испытываемые вещества (Ό2 и ΝΕ2) вводили инъекцией через шейный катетер сразу после высвобождения лигатуры. После изменения фибрилляции до нормального синусового ритма животное оставляли под анестезией при помощи дополнительных инъекций барбитурата в течение 3 ч.
По прошествии 3 ч наложенный вокруг БАИ шов снова затягивали и в левое предсердие вводили краситель Ишкрегке В1ие для заполнения всех нормально заполняемых коронарных артерий. Сердце извлекали, промывали в физиологическом растворе и разрезали с получением срезов толщиной 2 мм с использованием формы и 6 лезвий. Делали фотографии обеих сторон срезов (цифровая камера Саппоп, 2,1 мегапикселя каждый). Срезы затем помещали в инкубационную ванну, содержащую 1% хлорида трифенилтетразолия, при 38°С. Через 30 мин инкубации в ТТС срезы фотографировали второй раз.
(11) Анализ размера инфаркта.
Синий краситель показывал нормальную зону (ΝΖ), как можно видеть на первой серии фотографий. Область риска - это то, что остается на фотографиях вне зоны ΝΖ. Краситель диффундирует из ткани в процессе инкубации в ТТС и становится менее интенсивным на второй серии фотографий, таким образом, ΝΖ должна быть определена в первой серии. Во второй серии каждую поверхность каждого из 7 срезов ткани исследовали на окрашивание ТТС (регенерированная ткань в области риска, ТТС) и захваченную инфарктом ткань в области риска (ЮТ). Измеряли две поверхности каждого среза, и значения усредняли, и на основании этих измерений получали объемное измерение размера инфаркта (%) для каждого субъекта (ТТС/ТТС+ЮТ). Представляющие интерес области на цифровых снимках измеряли в пикселях с использованием программы Р1ю1ок1юр и независимо подтверждали при помощи программы !таде1 (от ΝΙΉ).
(12) Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа.
Очистка низкомолекулярных пептидов из фракций альбумина: 539 мкг каждой альбуминовой фракции (Ό2 и ΝΕ2) добавляли к 25 мМ буфера Тпк до общего объема 200 мкл и пропускали через фильтровальное устройство 3 кДа Аткоп. Просачивание из каждого образца собирали как <3 кДа пептидную фракцию альбумина.
- 53 010860 (13) Подготовка немеченых пептидов для МАЬО1-анализа.
мкл каждой пептидной фракции разводили в 25- или 50-кратном объеме и пропускали через колонку С18 'Х1р-Г1р' для очистки от мешающих проведению МАЬО1-анализа веществ. Очищенные пептиды элюировали в МАЬП1-матрице и их наносили в виде пятна на МАЬО1-мишень для последующего анализа.
(14) ЖХ/М8/М8.
мкл 0,1% муравьиной кислоты добавляли к 50 мкл раствора 1САТ и помещали в 8рееб Уас. Объем уменьшали до 10 мкл и вводили в колонку 75 мкМ наноВЭЖХ со скоростью потока 200 нл/мин. Элюирование пептидов происходило с использованием градиента 40 или 70 мин непосредственно в массспектрометр Мюготакк 0ТОР2 с электроспреем.
(15) Анализ последовательностей бе ηоνо.
Был определен порядок следования следующих ионов: т/ζ 809, 904, 1010, 1012, 1621 и 1662. Ионы т/ζ 809 и 1010 являются матричными ионами из процесса ионизации МАЬОф т/ζ 1012 представляет собой третий изотоп т/ζ 1010. Анализ т/ζ 1662 оказался неубедительным, анализ т/ζ 904 и 1621 описан ниже.
539 мкг каждой фракции альбумина (Ό2 и №Е#2) добавляли к 25 мМ буфера Тпк до общего объема 200 мкл и пропускали через фильтровальное устройство 3 кДа МУ Атюоп (можно использовать любое устройство для фильтрации на основе молекулярной массы). Просачивание из каждого образца собирали как <3 кДа пептидную фракцию альбумина. Это вещество загружали на колонку с обращенной фазой для ЖХ/М8/М8 анализа. Градиентный поток подавали при помощи насоса для бинарной жидкости для ЖХ МюгоТесЬ 8с1епбйс иИга-Р1ик II и разбрызгивали со скоростью до 200 нл/мин. Прилагаемый потенциал 1800 В в верхней части колонки обеспечивал ионизацию электроспреем элюента, который затем вводили в работающий в тандеме масс-спектрометр 0-ТоГ2. Пептидные ионы, наблюдаемые выше установленного порога в процессе градиентного элюирования, автоматически запускали инструмент для выбора желаемой т/ζ в первом масс-спектрометрическом анализаторе и осуществления вызванной низкоэнергетическим столкновением диссоциации (СШ) с анализом полученных ионов продукта во втором масс-спектрометрическом анализаторе. Полученные данные, касающиеся ионов продукта, интерпретировали вручную.
(16) Подготовка животных.
Крыс оперировали и в яремную вену имплантировали катетеры для в/в инъекций, а в подключичную артерию имплантировали катетеры для измерения среднего артериального давления. По меньшей мере через 5 дней восстановления после операции животным давали неомицин (капсула 100 мг в 500 мл питьевой воды) в течение 3 дней для снижения кишечных бактерий (т. е. организмов, которые могли бы рециркулировать некоторое количество мочевины). В день взятия образца крови артериальный катетер подсоединяли к тензиометрическому датчику 81а1йат (откалиброванный) для измерения кровяного давления. Катетер, имплантированный в яремную вену, подсоединяли к небольшому шприцу для инъекций, содержащему 1 мг мочевины с двойной меткой, растворенной в 0,5 мл физиологического раствора. Принятый за базовую линию образец крови (0,5 мл) брали через катетер, имплантированный в яремную вену, и затем вводили путем инъекции меченую мочевину. Затем брали дополнительные образцы крови на время 15 мин, 1, 2, 3 и 6 ч (каждый по 0,5 мл). Образцы хранили на льду до отделения плазмы.
Отделение плазмы осуществляли путем центрифугирования при 3хд в течение 10 мин с последующим пипетированием. Примерно 0,3 мл образцы плазмы затем отдельно метили, замораживали и хранили до отправки для анализа в МеИЬоНс 8о1ибопк Шс.
(17) Суммарные данные, полученные при использовании 15№2-мочевины и '^-мочевины.
Для получения стабильных результатов анализа меченной изотопом мочевины образцы плазмы сначала депротеинизировали при помощи ацетонитрила. После центрифугирования осуществляли циклизацию мочевины до 2-гидродипиримидина и обрабатывали В8РТА. Полученное ТМ8-производное преобразовывали в гептафторбутильное производное в соответствии со способом №е1коп и Вио (№е1коп ЧЕ, Вио ТЬ Аккау оГ к1аЬ1е 1ко1оре игеа Ш Ью1одюа1 Г1шбк Ьу ке1ес1еб юп топбоппд. С’1т. СШт. Ас!а. 1988 Чип 30; 175 (1): 59-65). Использовали газовый хроматограф НеМеб-Раскагб 5890, соединенный с массспектрометром 5989А, автоматически настраиваемым на режим положительной химической ионизации (РСЧ) в соответствии с указаниями изготовителя. Получали стандартный график, включающий немеченую 15№2-мочевину (СатЬпбде ЬоЮре ЬаЬогаЧогу) и 15№£-мочевину (СБ№ йоЧорек), и анализировали. Отслеживали ионы, представляющие естественную, или немеченую, мочевину (т/х=293), |5№|-мочевину (т/х=294) и 15№2-мочевину (т/х=295). Полученные значения общей площади сравнивали со стандартной кривой и использовали для подсчета мольных фракций на основании конечных данных.
(18) Концентрация мочевины.
Для определения концентрации мочевины (ммоль/л) в плазме использовали спектрофотометрический анализ цветной реакции между мочевиной и диацетилмонооксимом. Этот анализ основан на методе Сгоскег (Сгоскег СЬ. Вар1б беЧегтШабоп оГ игеа пбгодеп Ш кегит ог р1акта \\б1юи1 бергоКипхабоп. Ат. Ч. Меб. ТесЬпо1. 1967 8ер.-Ос!.; 33 (5): 361-5), и набор для анализа является коммерчески доступным от 81дта П1адпокбск (81дта Ргосебиге №о. 535). Получали и анализировали кривую концентрации. Концентрацию как контролей, так и образцов определяли непосредственно на основании калибрационной кривой. В конце результат преобразовывали из азота мочевины, содержащейся в крови (мг/дл), в концентра
- 54 010860 цию мочевины (моль/л).
(19) Статистика.
Применяли обычные параметрические методы статистического анализа, использующие метод случайных отклонений, объективную выборку и однонормальную дистрибуцию образцов. Для всех сравнений независимых образцов использовали ΐ-критерий Стьюдента. Степень бета для пределов отклонений образцов, наблюдаемых в полученных данных, была больше чем 90% для п больше 8.
Ь) Результаты.
(1) Случаи самопроизвольных и связанных с вынужденным пробуждением от гибернации смертей.
Табл. 6 показывает стадийность поведения в процессе гибернации и случаи самопроизвольных смертей и в результате вынужденного пробуждения, каждый из которых наблюдали независимо в двух испытаниях с использованием отдельных средств обеспечения гибернации. Табл. 6 показывает случаи гибели, связанные с: 1) животным, находящимся в стадии глубокой гибернации (Ό), или 2) пробуждением в течение последнего периода наблюдения (б). Испытание 1 проводили на крупной коммерческой станции (Ыог1Ь Еак1егп У11б11Ге) и животных наблюдали с ноября по февраль, немного беспокоя их каждые 3-4 дня. Испытание 2 проводили в небольшом спокойном помещении для гибернации (Ое1атаге \Уа1ег Сар 8с1епсе 1п8111и(е), и животных совершенно не беспокоили, и вели наблюдения только при помощи системы иПегсот. После примерно 6 недель нахождения в состоянии гибернации 9 животных в испытании 1 побеспокоили 21 декабря, как показано знаками минус. Таким же образом всех животных в испытании 2 побеспокоили 18 декабря. Такое же беспокойство было снова причинено 4 животным в том же испытании 2, которое было сделано 12 января, что привело к вынужденному пробуждению и последующей гибели в течение 12 ч (Ό). Во всех случаях причиняемое беспокойство представляло собой примерно 10-минутную процедуру, во время которой положение животного изменяли в вытянутое положение на спине (взятие образцов крови, записи ЭКГ).
В испытании 1 было задействовано 16 взрослых особей с весом тела 3,2-5,9 кг и 6 молодых особей менее чем 3,2 кг. Молодые особи имели резец менее 2 мм. 5-6 молодых особей умерли самопроизвольно (83%) в течение периода гибернации с 1 ноября по 20 февраля, тогда как только 7 из 16 взрослых особей (44%) умерли в процессе этого периода. При этих подсчетах не включали животных, используемых для получения образцов плазмы Ό2, ΝΕ1 и ΝΕ2 или для вызванной вынужденным пробуждением гибели в испытании (все данные прилагаются).
В середине декабря каждое из 9 животных в испытании 1 (2 молодые особи, 7 взрослых особей) будили, вытягивая конечности, пока животное оставалось в положении на спине; также брали образцы крови. 3 сурка не находились в состоянии гибернации, но 5 взрослых особей и 1 молодая особь находились в глубокой гибернации. Процедура пробуждения не привела к гибели какого-либо животного в течение 24 ч, и у всех 6 животных гибернация продолжилась. Было 9 случаев самопроизвольного пробуждения до полного бодрствования (указано подчеркиванием) до 26 декабря и 7 случаев после, и ни в одном из случаев не было обычного самопроизвольного перехода к бодрствованию, связанного с гибелью.
В испытании 2 каждое животное сначала наблюдали при помощи ЭКГ-электродов, прикрепленных к ладоням их конечностей. Животные включали 4 взрослых и 4 молодых сурка, все в состоянии глубокой гибернации в середине декабря (21 декабря). 4 молодых и 4 взрослых животных будили, вытягивая конечности, оставляя животное в положении на спине (табл. 6). Ни в одном случае пробуждение не привело к полному бодрствованию, но во всех случаях ЭКГ показывала частичное пробуждение, как продемонстрировано на фиг. 1 (пробуждение). То есть КК-интервалы начали систематически уменьшаться в течение 8-минутного периода пробуждения, но они возвращались к прежнему уровню в течение 2 ч. Ни одно из животных не умерло.
В середине января 2 молодых и 2 взрослых животных (испытание 2) были пробуждены при помощи той же процедуры. У всех 4 животных КК-интервалы сокращались в процессе и после процедуры пробуждения, и в течение 2 ч наблюдались эпизоды сильной брадикардии. Затем каждое животное, разбуженное до полного бодрствования, становилось амбулаторным, и затем в течение 6-12 ч все животные погибли (Л).
Фиг. 1 показывает примеры сильной брадикардии среди данных наблюдения за сердцем. ККИнтервалы иногда включали значительные ЭМГ-артефакты (дрожание'), но ровное систематическое сокращение КК-интервалов возникало и было подтверждено путем наблюдения последовательных ОК8комплексов. На фиг. 1 линия показывает, что в середине января, после пробуждения, животное возвращали в гнездо из соломы и оно принимало свернутое в клубок положение в течение 52 мин. Электроды оставляли присоединенными и вели записи через 2 ч, когда животное становилось амбулаторным, но еще не было достаточно подвижным для того, чтобы покинуть гнездо. Тип дрожания проявлялся как мышечные сокращения, более медленные, чем при обычной дрожи, и это было заметно у всех животных. Наблюдения не вели в период между 2 и 6 ч после начала пробуждения, давая животным возможность возврата в состояние гибернации.
В течение 6-12 ч после начала процедуры пробуждения каждое из 4 разбуженных в середине января животных было обнаружено мертвым за пределами его гнездового отсека. В 3 случаях животное было найдено мертвым в отсеке для питания, и в одном случае животное взобралось на стену высотой 1 фут, чтобы выбраться из своей открытой клетки.
- 55 010860
Гибель в процессе гибернации
Таблица 6
N N N N М 0 0 Б Б Б Б Б σ σ σ σ σ σ σ σ Г Г
А И 1 7 21 24 27 30 5 8 11 15 18 21 26 2 5 9 12 16 19 25 29 2 14
Испытание 1: Наблюдение за стадией гибернации
σ 3,6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 а
σ 3,1 5 5 5 5 5 5 4 3 2 3 4 3 3 5 5 5 а
σ 2,7 5 5 5 5 3 4 3 3 2 2 4 3 3 2 2 2 2 2 2 4 5 3
σ 3,2 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 а
σ 3,1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 -5 5 5 3 3 2 2 2 2 2 ϋ
σ 3,1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 а
Α 3,4 5 5 5 5 5 5 5 5 2 3 5 5 3 2 2 2 2 2 1 3 5 3
Α 4,1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2 2 2 Э
Α 4,5 5 5 5 5 3 3 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 а
Α 5,3 5 5 5 5 5 5 5 5 2 2 2 2 3 2 4 4 3 3 3 3 3 5
Α 4,9 5 5 5 5 3 4 5 5 2 3 5 5 5 5 5 5 3 3 1 2 2 3
Α 4,4 5 5 5 4 5 4 3 3 3 3 -3 2 2 3 5 5 3 3 2 3 5 3
Α 3,8 5 5 5 5 5 5 4 а
Α 4,6 5 5 5 5 2 3 3 5 5 5 -5 5 5 а
Α 5,9 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 -5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 а
Α 4,2 5 5 5 5 5 5 4 3 5 3 -3 О
Α 3,2 5 5 5 5 2 2 2 2 5 3 -2 2 2 2 1 2 2 ϋ
Α 4,8 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 ’З ϋ
Α 3,3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 2 2 3 2 2 2 2 3 3
Α 3,8 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 3 3 3 5 3 3 2 2 2 3 3
Α 4,6 5 5 5 5 3 4 5 5 5 5 4 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2
Α 4,3 5 5 5 4 3 3 3 5 2 2 4 3 5 5 5 5 3 3 2 2 2 2
Α 4,6 5 5 5 4 5 4 2 2 1 2 *2 ΝΕ1
Α 4,3 5 5 4 3 5 4 3 3 2 2 *2
Α 3,6 5 5 5 5 5 5 5 5 3 2 *2
Α 2,7 5 5 4 4 3 3 3 3 3 3 *2
Α 4,4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2 -2 2 3 5 5 5 3 3 *2 ΝΕ2
Α 5,4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 2 *2
Α 4,6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 2 2 2 2 2 2 2 1 *1
Α 4,6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 2 2 2 2 2 2 1 1
σ 2,8 5 5 5 5 5 5 3 2 2 2 -3 3 2 2 2 2 3 3 *2
Испытание 2: Без причинения беспокойства, за исключением записей ЭКГ
А 4,5 5 5 -1 *1 01, 02
А 3, 6 5 5 -1 *1
σ 2,9 5 5 -1 *1
4 2,8 5 5 -1 *1
А 3,8 5 5 -1 1 • - • -1 р
А 3,5 5 5 -1 1 • • • Р
σ 2,4 5 5 -1 1 • • -1 0
σ 2,1 5 5 -1 1 • - • -1 р
- 56 010860
Аде (А): 1=молодые особи (1 год), А=взрослые особи. Вес (А, в килограммах, 1 ноября). Стадия гибернации (даты указаны в верхней части таблицы): 5=бодрствование, 4=состояние оцепенения, 3=в состоянии гибернации, но реагирует на прикосновение разгибанием из свернутого в клубок положения, 2=в состоянии гибернации, но медленно реагирует на прикосновение частичным разгибанием, 1=в состоянии глубокой гибернации, не реагирует на прикосновение. Случаи гибели (выделенные жирным шрифтом): И=самопроизвольная смерть после подтвержденной гибернации в течение предыдущих 3 дней, й=самопроизвольная смерть после подтвержденного бодрствования в течение предыдущих 3 дней, И=вызванная пробуждением: смерть в течение 6-12 ч после вынужденного пробуждения. Вынужденное пробуждение: -п=животное вытягивается из свернутого в комок положения, оставаясь на указанной стадии. Самопроизвольное пробуждение: стадия 5 каждого пробуждения подчеркнута. Образцы плазмы (выделены жирным шрифтом): *=образцы плазмы, взятые на указанной стадии состояния гибернации; справа сокращенно указаны объединенные образцы.
(2) Ό2, но не ΝΕ2, предотвращает инсульт.
Измеряли эффекты инъекций в хвостовую вену 5 мг/кг молекулярных фракций Ό2 и его ближайшего аналога, взятого в качестве контроля, ΝΕ2. Результаты показывают, что белковая/пептидная фракция (Ό2) может предотвратить гибель клеток и утрату двигательной функции в мышиной модели инсульта. У мышей С57 производили окклюзию среднемозговой артерии посредством обтуратора, вставленного во внутреннюю сонную артерию вблизи ее расхождения с внешним ответвлением. После 1-часовой окклюзии Ό2 или взятый в качестве контроля его ближайший аналог ΝΕ2 вводили путем в/в инъекции (4 мг/кг, хвостовая вена). Обтуратор затем удаляли и животному давали восстановиться. Восстановление нормального кровотока подтверждали посредством измерений при помощи лазера Иорр1ег. Спустя 24 ч наблюдали поведение животных на нарушение двигательной способности и затем умерщвляли. Головной мозг каждого животного быстро извлекали, разрезали с получением 2 мм срезов и инкубировали в хлориде трифенилтетразолия (ТТС, 2%). ТТС-молекулы связываются с нормально функционирующими митохондриями и превращают жизнеспособные нейроны в темно-окрашенную красную ткань. Получали срезы от животного, которому была введена инъекция Ό2 через 1 ч после начала ишемии. Животное затем показывало нормальное поведение и отсутствие нарушения двигательной способности. Срезы также получали от животных, которым была введена ΝΕ-инъекция через 1 ч после начала ишемии. Все инъекции вводили через 1 ч после начала МСАО. Результаты показывают, что молекула(ы), полученная на ранней стадии гибернации, обладает эффектом сохранения ткани в модели МСАО у мыши. Такая молекула(ы) не присутствует на более поздних стадиях гибернации (ΝΕ2), и ее отсутствие связывают с высокой частотой случаев самопроизвольной и вызванной пробуждением смертности.
Количественные измерения объема инфаркта (в куб.мм) представлены в табл. 7 для каждого из 3 повторных экспериментов с Ό2 и ее контролями (ΝΕ2, 8А). В четвертом эксперименте с Ό2 инъекции в хвостовую вену осуществляли через 30 мин после начала окклюзии среднемозговой артерии, когда обтуратор был еще на месте. Собирали окрашенные срезы от членов некоторых из этих подгрупп и от животных, которым вводили цереброспинальную жидкость, а также вещество, которое также обеспечивает существенное сохранение ткани. В повторных экспериментах (К.1-Р3) в стандартной мышиной модели церебральной ишемии использовали инъекции в хвостовую вену зависящих от состояния молекулярных фракций Ό2 и ΝΕ2. Каждая пара срезов была получена от одного животного с наибольшим количеством сохраненной ткани в этой группе. Две цифры справа от каждой метки показывают количество животных в каждой группе, которые демонстрируют 100% сохранение по сравнению с животными, у которых наблюдали меньшее сохранение. Среднее сохранение для трех повторных экспериментов с Ό2 составляет 77% по сравнению с NΕ2-контролем, показывающим 0% сохранения (р<0,001). В этой модели использовали 1-часовую окклюзию среднемозговой артерии (анестезия хлоралгидратом) с последующим восстановлением кровотока и инъекцией испытываемого вещества в хвостовую вену. Размер инфаркта определяли при помощи окрашивания хлоридом трифенилтетразолия (2%) и компьютерной программы объемных измерений. Инъекции включали внутривенную инъекцию Ό2 и ΝΕ2 в хвостовую вену в дозе 10 мг/кг, и внутривенную инъекцию 100 мкл С8Б, и внутрикожную инъекцию 2,5 мкл С8Б.
Заметное сохранение ткани от поражения инфарктом было подтверждено нормальным поведением в открытом поле, включая запрыгивание на верх расположенного в поле небольшого ящика. Все частичные сохранения ткани от поражения инфарктом ассоциировались лишь с частичным восстановлением двигательных функций (слабость конечностей и неточность при запрыгивании). Все контроли показали обычную поведенческую гемиплегию, выражающуюся в принудительном движении по кругу и, в основном, в отсутствии непринудительных движений в открытом поле.
Доза-ответ для объема инфаркта (т. е. сохранение ткани) показаны в табл. 7. Необходимо отметить перевернутую И-образную кривую для более высоких доз. Наиболее эффективная доза составляет 5 мг/кг, т.к. она ассоциируется с наименьшим объемом инфаркта.
Значительно более высокие дозы исследовали у взрослых особей крыс (п=25) без какой-либо явной токсичности. Дозы 50 мг/кг, вводимые путем инъекции в хвостовую вену, существенно не влияли на общую анатомию органов или вес органов, артериальное давление, температуру или поведение питания. Последнее наблюдали в течение 3-недельного периода при ежедневных инъекциях. Высокие дозы, до
- 57 010860
800 мг/кг, две дополнительные 5НК крысы переносили без изменения их кровяного давления или гибели в течение 24 ч.
Фракции молекул ΝΕ2. 8Л и ΟΌ статистически не отличались друг от друга. Объединение их вместе в качестве контролей (п=16) и сравнение их с группой Ό2 (п=21) дало статистически высоко значимую разницу (р<0,001, ΐ-критерий). имеющую бета степень (Ьс1а>0.90).
Таблица 7
Объем церебрального инфаркта (мм3) в модели МСАО у мыши
Различные фракции, вводимые инъекцией через 1 час
ϋ2 Ц2Ьето ΝΕ2 ЗА НС Γ- ιον НСЕ- IV
23,12 37,88 55,92 74,68 41,56 34,92
32,41 28,36 69,41 95,41 27,21 21,61
88,24 88,52 78,48 79,88 46,32
59,52 77,81 100,04 91,16 43,24
83,21 55,96 82,31 89,48
0 8,32 62,77 89,58
66,81 37,61 75,11 74,62
78,32 7,24
53,95 42,71 74,86236 84,97 39,58 28,26 Сред- нее
0,019173 0,003136076 0,287991 0,00001 0,00008 Р- знач.
02-фракция, вводимая инъекцией через 0,5 часа
Мышь— 1 Мышь- 2 Мышь-3 Мышь — 4 Мышь- 5 Мышь- 6 Мышь- 7 Мьппь- 8
4,49 33.62 106,57 11,62 0,00 4,22 70,93 0,00
Мышь- 9 Мышь- 10
8,45 29,35 26,93 Среднее
0,000774 Р-знач.
Доза-ответ, 02-фракция, инъекция через·1 час
ЗА 5 мг/кг Б2 1 мг/кг Ό2 5 мг/кг 02 10 мг/кг ϋ2 20 мг/кг
89,58 18,52 10,52 15,88 47,17
74,62 24,38 3,65 14,92 48,01
82,11 21,45 7,09 15,41 47,59 среднее
(3) Обработка Ό2 методами молекулярных сит и диализа: повышение активности.
Как показано в табл. 8 ниже (эксперименты с использованием молекулярных сит). при помещении материала Ό2 внутрь закрытых мембранных мешочков с отсечками фильтров 10 и 3.5 кДа с последующим осуществлением диализа этого материала против 8М мочевины. 2М Ν;·ιΟ1 или воды для вымывания пептидов в течение 24-часового периода и в условиях холода (4°С) активная молекула не устраняется. Наоборот. обработка мочевиной. по-видимому. повышает активность активной молекул в Ό2. Диализ может повысить активность вымыванием любого возможного пептидного ингибитора или вытеснением активного ингредиента из его белкового носителя (альбумин). В результате было обнаружено. что одна или несколько молекул. имеющих массу выше 10 кДа. представляют собой молекулу или молекулы. несущие активный ингредиент. т.к. они сохранялись в диализованном материале Ό2. и при последующем испытании в модели МСАО у мыши было обнаружено. что эти молекулы являются эффективными.
- 58 010860
Таблица 8
Фильтрация Ό2 методом молекулярных сит (10 и 3,5 кДа) и диализа (мочевина, соль, вода): эффект (4 мг/кг) на объем инфаркта (мм3) в модели ΜСΑΟ у мыши (3 на группу)
Обработка ϋ2 Мышь 1 Мышь 2 Мышь 3 Среднее Станд. Откл. р-анач.
Мочевина 10 кДа 25,10 00,00 5,15 10,08 13,25 0,0026
Мочевина 3,5 кДа 02,50 32,34 11,63 15,49 15,29 0,0053
ЫаС1 10 кДа 32,18 29,87 47,75 36,60 09,73 0,0101
ЫаС1 3,5 кДа 42,41 10,68 34,33 29,14 16,49 0,0163
НгО 10 кДа 27,79 33,21 71,66 44,22 23,92 0,1229
Н2О 3,5 кДа 37,25 20,73 46,81 34,93 13,19 0,0156
□2 (необработанный) 38,71 32,85 16,22 29,26 11,67 0,0075
ΝΕ2-Контроль 82,31 62,77 75,11 73,40 09,88
(4) Идентификации методом 20-гелей и фингерпринтингом.
Фиг. 24 (верхний рисунок) показывает 2 двумерных 8Ο8-ΡΑ6Ε геля, в которых осуществляют визуализацию материалов 8Α (состояние #1, ΝΕ) и Ό2 (состояние #2, Ό2) в виде пятен чистых белков специфической рI (ось х) и массы (ось у). Многие из небольших пятен в состоянии #1 серые, без интенсивного черного цвета в эпицентре. Таким образом, единственный черный пиксель при компьютерной визуализации был помещен в эпицентр каждого так, чтобы обеспечить возможность наложения прозрачного слоя поверх черного и наложения на гель состояния #2. В увеличенных квадратах картины наложения состояния #1 на состояние #2 небольшое серое пятно состояния #2 с находящимся около него единственным пикселем состояния #1 указывает, что оба пятна (т.е. белки) присутствуют в обоих состояниях. Поэтому эти серые пятна состояния #2 без находящегося рядом единственного пикселя состояния #1 являются специфическими для состояния #2. В увеличенных квадратах (на нижнем снимке) наклонные маркеры показывают некоторые специфические для состояния #2 белки. При подсчете всех специфических для состояния #2 пятен по всему 20-гелю было обнаружено 20 пятен. Еще 20 пятен (приблизительно) были полностью активированы в состоянии #2, как можно видеть по по меньшей мере в 2 раза большей плотности при окрашивании кумасси синим (т.е. от светло-серых до темных черных эпицентров).
После идентификации представляющего интерес пятна его подвергали жидкостной хроматографии, объединенной с методом масс-спектроскопии (ЖХ/М8/М8). Сначала пятно на геле вырезали и белок элюировали. Затем чистые молекулы инжектировали в луч света масс-спектроскопии и измеряли их массу. Находясь в луче, они подвергались бомбардировке вторым лучом, который разрушал молекулы в предварительно определенных аминокислотных связях. При помощи этого последнего луча получали фрагменты, являющиеся такими же специфическими для молекулы, как отпечатки пальцев для человека. После получения такого молекулярного отпечатка пальцев (фингерпринтинга) проводили его поиск во всех крупных базах данных, где такой отпечаток пальцев мог быть депонирован, вместе с его структурой. Если представляющее интерес пятно является уже известным белком, его легко идентифицировать.
Фиг. 3 показывает расположение этих идентифицированных дифференциальных пятен на ΕΑΤδгеле, который идентичен 2О-гелю, за исключением того, что после установления градиента рI его разрезают на полоски, которые помещают рядом с полосками от другого состояния, располагая их поочередно. Затем проводят анализ градиента массы всех пар чередующихся полосок. Необходимо отметить, что на βΑΤδ-геле можно идентифицировать не так много пятен состояния #2, как на 20-808-гелях более высокого разрешения. То есть было обнаружено только 9 зависящих от состояния пятен (синие кружки) при рI 4-7 на ВΑΤ8-геле по сравнению с 20, обнаруженными на 2О-геле более высокого разрешения, показанном на фиг. 2. Три идентифицированных белка, как было обнаружено, имеют структуры, аналогичные имеющимся в базе данных (макроглобулин 2 альфа, сывороточный амилоид А1 и транстиретин, являющийся специфическим для лета).
Фиг. 4 показывает ВΑΤ8-гель с пятнами, представляющими интерес (обведенные кружком), полученные в пределах рI 6-6,5. Такие более узкие пределы рI показали большинство дифференциальных пятен, наблюдаемых также на фиг. 3 для пределов 4-7. ΝΕ2, в качестве наилучшего контроля, показывает
- 59 010860 полосы белка, не обнаруженные в 8А.
На фиг. 5 показаны гели самого высокого разрешения с лучшими и ближайшими контролями. В результате таким способом идентифицируются самые малые зависящие от состояния пятна, одно из которых лежит в основе эффекта сохранения ткани в модели МСАО (Ό2-ΝΒ2). Блоки С8Б и мочи на этой фигуре представляют сравнение материалов зимней гибернации с их соответствующими летними контролями. Ό2 сравнивали с его ближайшим соседом ΝΞ2. В этих двух 2Ό-гелях каждая пара соответствующих пятен была выбрана для количественного сравнения с помощью компьютерной программы (Сепопис 8о1ийопк, 1пс.), где компьютер рассчитывает координаты эпицентров соответствующих пятен при помощи плавно изменяющегося пространственного градиента в одном 20-геле, который продолжает изменяться до максимального выравнивания всех пятен. Пятна сначала были пространственно выровнены, а затем интенсивность серого окрашивания каждого пятна нормализовали ко всему гелю, содержащему это пятно; такую нормализацию осуществляли для компенсации разницы концентраций между равными объемами образцов, используемых для получения гелей; такой способ предполагает равное содержание белка для каждого геля. Затем определяли относительную разницу в содержании белка между двумя состояниями для каждого пятна на основании его нормализованной по шкале серого интенсивности.
Вместо 40 зависящих от состояния увеличений, обнаруженных для Ό2 по сравнению с 8А (фиг. 3), только 9 было обнаружено для Ό2 по сравнению с ΝΞ (фиг. 5, верхний левый блок, темные пятна, фиг. 3). Кроме того, в этом последнем сравнении было обнаружено 4 пятна, которые показывали уменьшение больше чем в 2 раза в период состояния #2 (гибернация, желтые пятна). С8Б (гибернация по сравнению с негибернацией) показал даже большее количество активированных белков (зеленые пятна), некоторые из которых присутствовали из-за разницы концентраций, не компенсированной нормализацией (синие пятна). Моча показала еще большее количество активированных белков и их метаболических фрагментов.
(5) Время инъекции определяет размер инфаркта.
Фиг. 6 показывает, что предварительное лечение Ό2 (5 мг/кг) может почти полностью предотвратить церебральный инфаркт в модели МСАО у мыши. Вертикальные линии показывают ± стандартные отклонения от среднего. Понятно, что инъекция в течение времени 30 мин-2 ч после начала 1-часовой МСАО также может оказать огромный эффект на снижение объема инфаркта (р<0,001), особенно после обработки Ό2 8М мочевиной (мочевинный диализ). Также уменьшение инфаркта, в среднем, на 20% можно получить при помощи инъекций вплоть до 6 ч после начала МСАО (Р<0,05).
(6) Пептиды в Ό2.
Фиг. 7 показывает результаты анализа ЖХ/М8/М8 для Ό2 и ΝΞ2, когда каждое вещество является отфильтрованным путем центрифугирования через мембрану 10 кДа. Один из этих присутствующих в Ό2 пептидов был идентифицирован методами молекулярного фингерпринтинга и биоинформатики как фибринопептид А. Поскольку было обнаружено слишком мало пептидов в дифференциальном Ό2 по сравнению с ΝΞ2 сравнении таким методом, были предприняты поиски другого дифференциального подхода.
В так называемом способе 1САТ идентификации зависящих от состояния пептидов используют мечение цистеина, в зависимости от состояния, двумя разными изотопами дейтерия (дейтерий-2 и дейтерий-8). Однако было обнаружено, что не было достаточного количества молекул с меченым цистеином в пептидной фракции Ό2, т.е. ниже отсечки 10 кДа, чтобы этот способ имел практическое значение.
(7) Данные.
Оказывается, что большая часть связанных с гибернацией смертей происходит на поздней стадии гибернации, начиная или после 26 декабря и вплоть до конца января (табл. 6). Такие обобщенные случаи смертности следуют после периодов гибернации (5 Ό) или бодрствования (7 б). Случаи смерти при пробуждении, которые следуют немедленно за вынужденным пробуждением, происходят в середине января (4 О), но они не случаются в середине декабря. Ни самопроизвольное, ни вынужденное пробуждение в середине декабря не приводило к такому количеству смертей, как в середине января.
Оказалось, что смерти при самопроизвольном или вынужденном пробуждении в январе связаны с потерей одной или нескольких молекул, циркулирующих в крови, которые присутствуют и являются защитными, когда происходит пробуждение в начале-середине декабря. Такое циркулирование декабрьской молекулы (фракция Ό2), как оказалось, включает механизм защиты от ишемического поражения (табл. 7), и такая защита не присутствует в январе (фракция ΝΞ2).
Защита против ишемического поражения должна развиваться для предотвращения повреждения ткани головного мозга и сердца в процессе начала и пробуждения от гибернации. Пример такого поражения имеет место, когда амбулаторное поведение, связанное с бодрствованием, адекватно не поддерживается кровообращением (фиг. 1). Такой физиологический риск наблюдается во всех случаях вынужденного пробуждения в середине января, но не в середине декабря.
Обобщение самопроизвольных смертей после 26 декабря (т.е. справа от центральной вертикальной линии в табл. 6) показывает, что 50% смертей животных произошли в течение 3-недельного периода после указанной даты. Общий показатель смертности в результате самопроизвольных смертей вплоть до середины февраля составляет 55% (12 из 22 животных). Случаев самопроизвольных смертей гораздо больше среди молодых особей (83%, 5 из 6), чем у взрослых особей (50%, 8 из 16).
- 60 010860
Самопроизвольное пробуждение в середине декабря (испытание 1, подчеркнуто, 9 случаев) не сопровождалось неизбежной смертью, такое открытие предполагает присутствие в изобилии защищающей от ишемии молекулы, и эта гипотеза подтверждается инъекцией фракции молекул декабрьской плазмы, Ό2, в мышиную модель инсульта (табл. 7). Инъекция фракции плазмы середины января, N82, не оказывала никакого эффекта в модели инсульта, и именно отсутствие защитной молекулы связывают с высокой смертностью в течение этого периода высокой смертности (табл. 7).
Вынужденное пробуждение в период середины декабря (все по состоянию на 21 декабря в испытании 1 и все по состоянию на 15 декабря в испытании 2) не приводило ни к каким смертным случаям. Скорее, находящиеся в состоянии гибернации животные, которые, как можно было бы предположить на основании данных ЭКГ, по меньшей мере, частично пробуждались (фиг. 1, середина декабря), все успешно возвращались к гибернации (фиг. 1, выжившие). Нужно отметить, что два случая гибели животных по состоянию на 26 декабря в испытании 1 произошли через 5 дней после вынужденного пробуждения и поэтому не связаны с этим стимулом. Вынужденное пробуждение в период высокой смертности в середине января, наоборот, приводило к амбулаторному поведению и сильной брадикардии и следующей в результате этого смерти 100% этих животных.
Почему смерть не всегда наступает в январе в процессе вынужденного пробуждения (табл. 6, подчеркнуто), можно объяснить либо: 1) лучшей согласованностью между метаболической потребностью (амбулаторное поведение) и поддержкой со стороны системы кровообращения у этих выживших животных, либо 2) второй активной секрецией защищающей от ишемии молекулы, сопровождающей самопроизвольное пробуждение, но не вынужденное пробуждение. Первая возможность маловероятна, поскольку все животные, испытавшие вынужденное пробуждение в январе (испытание 2), умерли в течение 12 ч без каких-либо признаков развития поддерживающей физиологии. Однако вторая возможность, как можно сделать вывод на основании наблюдений защитного эффекта молекулы (молекул), присутствующей на ранней стадии гибернации, но не на поздней стадии, кажется более вероятной. А именно, секреция защищающей от ишемии молекулы (молекул) является временной в начале гибернации и ее высокий уровень не продолжается в течение всего периода гибернации, захватывая январь; поэтому молекула должна секретироваться второй раз как часть естественного процесса пробуждения. Самопроизвольное пробуждение в январе, приводящее к смерти, может быть, подобно вынужденным пробуждениям, таким быстрым, что происходит недостаточная секреция защитных молекул, т.е. то, что необходимо для выживания.
Как оказалось, защитная молекула представляет собой белок массой выше 10 кДа, и поэтому она не вымывается в процессе диализа с удалением пептидов (табл. 8). Все из дифференциальных положительно регулируемых и/или зависящих от состояния молекул, которые являются кандидатами для антиинсультного действия, можно видеть на фиг. 5. Четыре идентифицированные молекулы представляют собой макроглобулин 2 альфа, сывороточный амилоид А1, транстиретин и фибринопептид А (фиг. 3 и 7).
Специфическая антиинсультная молекула может представлять одно из 9 темных пятен, показанных на фиг. 5 (О2-№2), где используют ближайший контроль. Поскольку эффективная молекула также обнаружена в С8Е, фракции молекул, обладающей собственным нейрозащитным действием (фиг. 6, табл. 7), сравнение двух верхних блоков на фиг. 5 может поэтому привести даже к меньшему количеству представляющих интерес пятен. Большое зеленое пятно слева от большого пятна альбумина является единственным точно перекрывающимся пятном, которое показывают два верхних блока. Другое пятно внизу слева от этого может быть перекрывающимся пятном.
Можно провести исследование некоторых молекулярных фракций материала Ό2 с использованием биоанализа МСА0 для отслеживания, какие субфракции обладают эффективностью, и оно представляет собой еще один путь выделения молекул, обладающих желаемыми свойствами.
Эта же антиинсультная молекула, по-видимому, должна обладать эффективностью против сердечного приступа, поскольку оказалось, что она также защищает от смерти в результате ишемии при пробуждении от гибернации, когда присутствуют сердечно-сосудистые факторы, такие как показанные на фиг. 1. Нет никаких оснований полагать, что такая антиишемическая молекула является специфической для головного мозга, когда ее собирают из крови.
(8) Идентификация фибринопептида А в пептидных фракциях Ό2 и №2 методом ЖХ/М8/М8 (отсечка 3 кДа).
На фиг. 7 представлены спектры как для отфильтрованного вещества Ό2 (отсечка 3 кДа), так и для отфильтрованного вещества N82 (отсечка 3 кДа). В обоих случаях просачивание Ό2 или N82 анализировали объединенным методом ЖХ и масс-спектроскопии (ЖХ/М8/М8). Был определен порядок следования следующих ионов: т/ζ 809, 904, 1010, 1012, 1621 и 1662. Ионы т/ζ 809 и 1010 являются матричными ионами из процесса ионизации МАЛОЕ т/ζ 1012 представляет собой третий изотоп т/ζ 1010. Анализ т/ζ 1662 оказался неубедительным, анализ т/ζ 904 апб 1621 описан выше. Понятно, что фибринопептид А это ион, представленный т/ζ 1621, а брадикинин - это пик, представленный т/ζ 904. Другие пики были идентифицированы как фрагменты матрицы, удерживающей исходный материал (звездочки). Шесть пептидов присутствовали в большем изобилии во фракции N82 средней стадии гибернации (знак минус).
(9) Уникальная структура ЕРА сурка.
Табл. 9 показывает последовательность ЕРА сурка.
- 61 010860
Таблица 9 Последовательность фибринопептида-А сурка (ЕРА-те), определенная методом ЖХ/МЗ/МЗ в сочетании с фрагментами трипсинизации
АБТБК бЕГЬАЕбЗСУ сурок* * Аминокислота в положении 9, Ь, фактически, может быть также I, поскольку обе аминокислоты приблизительно одинаковой молекулярной массы и эта масса не была адекватно распределена в массах фрагментов. Мышь имеет в этом положении Ь, как и большинство других видов, представленных в табл. 1 выше. Таким образом, фрагменты как с Ь, так и с I в положении 9 раскрываются в настоящей заявке.
После экстенсивного анализа данных ионов продукта была предложена указанная частичная последовательность пептида. Необходимо отметить, что лейцин/изолейцин являются изомерными и не могут быть распознанными низкоэнергетическим методом СШ. Вторую аликвоту 15 мкл образца Ό2 дериватизировали (Ν-ацетилирование) добавлением 1 мкл чистого уксусного ангидрида. Нужно иметь в виду, что Ν-ацетилирование дериватизирует группы первичного амина (Ν-конец и боковая цепь лизина). Реакции давали осуществиться в течение 5 мин и полученный раствор анализировали методом ЖХ/МЗ/МЗ, как описано выше.
Указанная полная пептидная последовательность стала очевидной после изучения обеих серий ионных данных продукта. Присутствие лизина в положении 5 сильно влияло на картину фрагментации в недериватизированном образце. Преобразование в менее основную боковую цепь после Ν-ацетилирования обеспечивало возможность более полной фрагментации при повторном анализе модифицированного пептида. Поиски в публично доступной базе данных на основании выведенной последовательности показали, что этот пептид представляет собой фибринопептид А.
Последовательность молекулы, представленной пиком т/ζ 904, была определена как йек-агд1 брадикинин (см. фиг. 10-11).
(10) Уникальная функция ЕРА человека (ЕРА-Н), испытанного в модели МСАО у мыши.
Табл. 9, приведенная ниже, показывает результаты испытания ЕРА-11 в мышиной модели инсульта. Была обнаружена статистическая значимость (р<0,01) между средними объемами инфаркта для ЕРА-Н и ΝΕ2. Каждая ячейка представляет одну мышь. Такие же данные представлены на фиг. 12 с указанием средних значений и стандартных отклонений.
Эти результаты показывают статистически значимую разницу между Б2-пептидами и МЕ2-пептидами в обеспечении заметного снижения объема инфаркта (Р<0,01). Они также показывают, что один из этих пептидов, ЕРА-Н, в дозе 10 мкг/кг (т.е. 1/1000 от дозы Ό2) способен обеспечить статистически значимое снижение размера инфаркта в модели МСАО у мыши.
Таблица 9
Эффект полученных в состоянии гибернации фракций молекул и синтезированного фибринопептида-А человека (ЕРА-Н) на размер инфаркта (мм3) в модели МСАО у мыши
02 ΝΕ2 5АА ЕРА- П О2-0 Ό2- 200 Б2- 600 ΝΕ2 -0 ΝΕ- 200 ΝΕ- 600 Декабрь ΟΟΙ Январь Д02
14,94 57,92 50, 66 20,76 9,10 43,50 3,80 76,40 78,40 41,40 35,96 22,98
34,54 60, 64 47,84 53,72 13,8 0 7,60 4,60 50,66 41,70 69,40 3,70 13,80
0,00 64,80 34,76 10,6 0 28,30 7,20 75,60 45,20 61,30 27,80 6,80
78,42 4,20 11,50 19,60 20,50 48,60 0,00 7,90
9,70 0,00
0,00
О2=фракция альбумина ранней стадии гибернации; ΝΕ=ΝΕ2 средней стадии гибернации; ЗАА=сывороточный амилоид А; Ό2-0, Ό2-200, Ό2-600, ΝΕ2-0, ΝΕ2-200, МЕ2-600=концентрация №С1, используемого для элюирования материала из анионообменной колонки. Вводимая доза всех испытываемых веществ для всех животных составляла 10 мкг/мл.
- 62 010860
Таблица 10
Инфаркт Ипсилатер. Контралатер. Инфаркт Ипсилатер. Контралатер. Инфаркт Илсила- тер. Контралатер. Инфаркт Ипсилатер. Контра- латер.
Срез 1 п X 1 Срез 2 2 2 Срез 3 3 3 Срез 4 4 4
0 5,16 4,99 0 8,77 8, 63 0 10,25 10,26 0 10,94 10,13
0 5, 52 5, 42 0 8,83 8,77 0 10,45 9,79 0 9,29 9,01
0 4,98 4,98 0 8,89 8,54 0 10,2 9,84 0 10,16 9,44
0,46 6,51 5, 57 0,98 9,19 8,53 0,45 10,24 10, 87 0 9,67 10,12
0 6, 52 N0 Зу 0 8,75 9,07 0,75 10,08 9,63 0 8,87 9,7
0 5,78 N0 Зу 0 8,92 8,68 0 10,28 9,72 0 9,67 9,69
1,11 6, 96 N0 5у 1,88 10,3 8,89 0,64 10,82 10,31 0, 35 10,2 9,83
0,34 5,1 5, 18 0,45 8,87 9, 21 0,76 10,82 10,19 0, 43 10,56 10,24
0 5,13 4,79 0,04 8,47 8,51 1,32 10,74 9,43 4, 66 11,25 9,34
1,77 6,89 6,03 2,12 10,23 9,51 2,51 11,76 10,88 2,15 10,49 9,32
2,12 6,43 5,71 3,29 10,15 9,14 2,17 11,32 9,94 3,37 10,78 10,38
1,71 6,47 6,96 3,13 9,77 9,3 3,11 10, 99 10,32 0,39 11,1 10,16
1,58 7,14 N0 Зу 2,26 10,49 3,2 2,29 11,49 10,81 2,58 10,81 10,72
0 5,29 5,07 0 8,8 8, 63 2,26 10, 69 10,15 5,53 11,28 9,44
2,33 5,36 4,03 5,39 9,25 7,48 7,51 10,4 8,39 7,24 10,48 8,88
2,54 5, 09 N0 Зу 5,79 10,14 8,28 5,24 11,21 8,84 0 9,47 9,19
5,34 5,92 4,13 7,8 10,18 8,45 4,83 11,29 9,62 0,31 10,83 9,22
2,8 4,44 5,15 6,43 9, 98 8,79 6,31 10,83 9, 63 3,92 11,86 9,63
3,04 6,28 4,69 5,15 8, 91 7,91 5,3 10,09 9 5,29 9,59 9,02
3,5 6,35 5,65 5,04 9,5 8,98 6, 61 10,48 9,25 6,04 9,54 9,14
2,7 4,89 4,8 4,41 9,36 7,59 4,51 9, 93 9,33 5,04 9,91 8,71
2, 84 5,75 5,17 4,02 9,22 8,06 5,42 10,47 8,79 7,12 10,27 8,49
4,09 6,81 5,14 5,87 10,47 7,98 6, 64 10,27 9, 66 5,02 9 9,1
Табл. 10 показывает необработанные данные для ТРН-Ь-инъекций (в/в) в модели МСАО у мыши. Каждый ряд показывает для каждой мыши площадь инфаркта (мм2) в каждом из четырех смежных 2 мм срезов (от рострального до каудального) и соответствующих областях ипсилатерального и контралатерального полушарий (мм2). 5 субъектам, показанным в нижней части таблицы, вводили летнюю фракцию альбумина в качестве контроля (8А). Дозы и общий объем инфаркта для каждого животного показаны в табл. 11.
Таблица 11
Молекула (молекулы) (в/в) / доза (мкг/а) Группа * Ипсилатер. объем/2 % объема инфаркта
ЕРА 62,5 2 43,17 0
ЕРА 250 2 41,51 0
РРА 250 4 41,81 0
ЕРА 62,5 3 43,71 4,9
РРА 250 6 41,92 1,8
ЕРА 250 7 42,38 0
ГРА^уг 62,5 3 46,86 10
ЕРАЪуг 62,5 5 43,18 5,5
ЕРА 250 8 43,78 19,1
ЕРА 15,625 4 48,06 21,9
РВА 15,625 5 47,29 28,9
РВА 62,5 1 47,12 19,9
РВА 62,5 4 48,91 22,1
РВА 62,5 5 44,35 23,8
РВА 250 1 43,41 62,8
РРА 250 3 43,19 34,4
РВА 250 5 46,61 45,3
ЕРАЕуг 62,5 6 45,26 50,4
ЗА 400000 1 42,05 53,6
ЗА 400000 2 43,82 59,2
ЗА 400000 3 42,03 48,8
ЗА 400000 4 43,72 55,8
ЗА 400000 5 44,46 58,9
- 63 010860
Табл. 11 показывает эффект инъекций РРА-Ιί (в/в) на % объема инфаркта в модели МСАО у мыши. Каждый ряд относится к одному животному, как в табл. 7, и показывает вводимые инъекцией молекулы (РРА=РРА-й, последовательность человека), дозу в микрограммах/животное, идентификационный номер группы дозирования (#), половину объема ипсилатерального полушария (мм3) и % объема инфаркта ипсилатерального полушария. Нижняя часть таблицы показывает контроли (летние фракции альбумина, 8А). !-Критерий среднего расхождения в % объема инфаркта между верхней и нижней частью таблицы имеет объединенный альфа-уровень р<0,00005.
Первые испытанные субцепочки РРА представляли собой разделенные С-концевой и Ν-концевой фрагменты. РРА и его пептидные фрагменты были синтезированы и испытаны в модели МСАО у мыши. Человеческая форма РРА (РРА-Б), но не форма, полученная от сурка (РРА-ν), является эффективной в качестве антиинфарктной молекулы, как показано в табл. 10-12. Ν-Концевой РРА-ν не является эффективным. Однако С-концевой фрагмент является эффективным. Кроме того, эффективность С-концевого фрагмента усиливают путем совместного введения другого положительно регулируемого Э2 по сравнению с ΝΕ2 пептида, брадикинина.
Таблица 12 Эффекты в модели МСАО у мыши (% инфаркта в ипсилатеральном полушарии) в/в инъекции (250 мкг/мышь РРА-Ιί или его молярного эквивалента) синтезированного фибринопептида А сурка (РРА-ν либо с I, либо с Ь в положении 9), или его фосфорилированной формы в 3-м положении (Р11 РРА-ν), либо его субцепочечных фрагментов (Ν-конец или С-конец), либо брадикинина (Эек-Агд-ВК, абВК; брадикинин, ВК), либо абВК в сочетании с С-концевым фрагментом; средние значения для групп выделены жирным шрифтом
₽РА(1)-и ГРА(Ъ)-м РЬ РРА-н Ν-конец С-комец(1)
21 49 25 60 44
46 53 24 65 1
34 48 52 64 8
58 43 70 69 10
47
Групп*
<средни·
39,7 48,2 43,6 Значения > 64,5 15,7
физиологический
С-конец(Ь) ДаВК ВК <1аВК+С-конец раствор ничего
15 17 23 7 71 34
36 9 16 19 54 48
34 27 27 18 60 70
0 15 67 28 61 53
42
21,2 17 33,2 18 57,6 51,2
Объединенные группы*:
Контроли ЕРА-х ВК С-конец-н ГРА-Ь
34 49 17 44
48 53 9 1
70 48 27 8
53 43 15 10
71 21 23 15
54 46 16 36
60 34 27 34
61 58 67 0
42
54,7 44 25,2 18,5 19,4
0,0842 0,00300 0,00010 0,00003
0,0421
*РРА-\г (I, Ь), объединенный и сопоставленный с объединенными контролями, не был статистически значимым при применении традиционно используемого одностороннего !-критерия (р<0,0421). В отличие от этого, С-концевой РРА-ν (С-конец-ν) был статистически высокозначимым (р<0,00010).
- 64 010860
Группы ВК также были высокозначимыми, по отдельности или объединенные вместе (р<0,00300). Группа ЕРА-й из предыдущей таблицы (ЕРА-й) была наиболее статистически значимой из всех групп (р<0,00003). Комбинация йаВК с С-концевым фрагментом не показала статистически лучшие результаты.
(11) Другой положительно регулируемый Ό2 по сравнению с ΝΕ2 пептид, брадикинин.
Брадикинин влияет на размер инфаркта и может оказывать действие, усиливающее эффект ЕРА на инфаркт. Данные, полученные от 8 контрольных мышей, которым вводили физиологический раствор, показывают среднее процентное значение размера инфаркта 52%; данные, полученные от 8 дополнительных мышей, обработанных С-концевым фрагментом ЕРА-ν, показали среднее процентное значение размера инфаркта 35% (Р<0,5). Размер инфаркта был еще больше уменьшен у 8 других мышей (до 19%) при сочетании 11-мера с брадикинином (Р<0,05, табл. 12).
(12) Рециркулирование мочевины.
Считается целесообразным, что белые медведи в состоянии беременности и гибернации должны продуцировать белки, но, тем не менее, они не страдают от уремической токсичности. Поэтому было сделано предположение о механизме рециркуляции мочевины. Данные, полученные от крыс, дают основание предположить, что рециркуляция мочевины происходит у видов, не впадающих в зимнюю спячку (лабораторные крысы), и скорость увеличивается в 13 раз при внутривенном введении (10 мг/кг) фракции альбумина, экстрагированной из плазмы находящегося в состоянии гибернации сурка. Результаты представлены на фиг. 13. В соответствии с маркировкой использовали Ό2 или Ό01, и не было обнаружено никакой разницы в антиинфарктной эффективности или эффективности действия по рециркуляции мочевины между этими двумя фракциями.
Действие Ό2 или его эквивалента Ό01 - вещества, связанного с состоянием гибернации, на стимуляцию рециркуляции мочевины в крови крысы показано на фиг. 13. Медицинским показанием здесь является уремическая токсичность, неблагоприятное медицинское состояние, которое возникает при почечной недостаточности и пробуждении от наркоза. Фиг. 13 показывает эффект связанных с гибернацией фракций альбумина (Ό2, Ό01 в дозе 20 мг/кг) по сравнению с контрольной группой, которой вводили чистый альбумин (Хепо альбумин, 20 мг/кг).
Данные ясно показывают (Р<0,025), что связанные с гибернацией фракции альбумина стимулируют продукцию мочевины с одной меткой выше базовой линии присутствия природной мочевины с одной меткой (т.е. некоторые Ν15 встречаются в природе). Это можно объяснить только отщеплением дважды меченных атомов азота мочевины и их включением в имеющую одну метку мочевину. По прошествии времени после первоначальной инъекции (1 мг) мочевины с двойной меткой некоторое количество ее выводится. Это также происходит с некоторым количеством однократно меченного вещества. Пул вещества с двойной меткой по прошествии 6 ч составил только 1/9 часть (среднее значение для всех субъектов) того, что было на время инъекции. Таким образом, скорость рециркуляции, фактически, в 9 раз выше через 6 ч, чем показанная на фиг. 13 как 5-6-кратное увеличение по сравнению с контролями.
2. Пример активности ЕРА.
Фибринопептид А испытывали на эффективность в модели окклюзии среднемозговой артерии (МСАО) у мыши. В этом испытании два препарата карбоксиконцевой части фибринопептида А были испытаны в модели МСАО. Один вариант содержал изолейцин в положении 4, тогда как другой вариант содержал лейцин в положении 4. Внутривенную (в/в) инъекцию вариантов фибринопептида А, включая С-концевой 11-мер ЕРА, начинали вводить через 1 ч после начала МСАО. Головной мозг вырезали, окрашивали хлоридом трифенилтетразолия (ТТС) и исследовали на объем инфаркта визуально. Эти соединения сравнивали с вариантами отсутствия какой-либо инъекции и с введением физиологического раствора контрольным животным. Инъекция С-концевых фрагментов ЕРА показала защитный эффект при дозе 10 мг/кг, обеспечивая защиту больше чем 66%. В целом, С-концевая часть ЕРА - 10 мг/кг - была эффективной при снижении степени МСАО в головном мозге с последующей индукцией ишемии/реперфузии у мыши.
Также обеспечивается ряд концентраций для ЕРА. Фибринопептид А испытывали на эффективность в модели окклюзии среднемозговой артерии (МСАО) у мыши. Внутривенную (в/в) инъекцию соединения УТ1 (фибринопептид А, ЕРА) начинали вводить через 1 ч после начала МСАО. Головной мозг вырезали, окрашивали хлоридом трифенилтетразолия (ТТС) и исследовали на объем инфаркта визуально. Инъекция ЕРА показала переменные эффекты, при этом доза 2,5 мг/кг показала наилучшую защиту (больше чем 60%). ЕРА при дозе 0,625 мг/кг и 10 мг/кг продемонстрировал более чем 50% защиту головного мозга. Все дозы показали уменьшение объема инфаркта в головном мозге мыши. В целом, ЕРА 2,5 мг/кг был наиболее эффективным в снижении степени МСАО в головном мозге с последующей индукцией ишемии/реперфузии у мыши.
а) Методы и материалы.
(1) Планирование эксперимента.
Модель инсульта у мыши, окклюзия среднемозговой артерии (МСАО). Мышей подвергали 1-часовой МСАО с последующей 24-часовой реперфузией. С-Концевые фрагменты ЕРА инъецировали по окончании ишемии (10 мг/кг) и на второй день мышей умерщвляли и исследовали объем инфаркта при помощи окрашивания ТТС. ЕРА инъецировали по окончании ишемии (0,625, 2,5 или 10 мг/кг) и на второй день мышей умерщвляли и исследовали объем инфаркта при помощи окрашивания ТТС. Эти срезы сравнивали с контрольными животными и животными, которым вводили физиологический раствор.
- 65 010860 (2) Способы 1п νί\Ό.
Самцам мышей С57ВЬ/6 (1асккоп ЬаЬогаЮгу), весом примерно 25 г каждый, обеспечивали свободный доступ к пище и воде до и в процессе эксперимента. Животным давали акклиматизироваться в течение 1 недели перед началом эксперимента. Животным вводили инъекции композиций при 200 мкл/мышь при указанных дозах. Мышам вводили внутривенную инъекцию через 1 ч после начала ишемии.
(3) Индукция ишемии.
У каждой мыши индуцировали 1-часовую церебральную ишемию с последующей 24-часовой реперфузией. По окончании ишемического периода животным вводили композицию в указанных дозах и через 24 ч исследовали на объем инфаркта. Левую сонную артерию (ССА) раскрывали, делая разрез по серединной линии шеи. Верхние тиреоидную и затылочную артерии электрокоагулировали и разделяли. Микрохирургический зажим накладывали вокруг начала внутренней сонной артерии (1СА). Дистальный конец ЕСА лигировали 6-0 шелком и отделяли. Шелк 6-0 свободно завязывали вокруг ЕСА-культи. Зажим удаляли и отполированный в пламени конец 5-0 найлонового шовного материала (покрытого поли-Ь-лизином) осторожно вставляли в ЕСА-культю. Петлю из шелка 6-0 затягивали вокруг культи и найлоновый шовный материал продвигали примерно на 11 мм (в зависимости от веса тела) внутрь и через внутреннюю сонную артерию (1СА) после удаления аневризматического зажима, пока он не достиг передней мозговой артерии (АСА), обеспечивая, таким образом, окклюзию передней соединяющей и средней мозговых артерий. После пробуждения от наркоза животное возвращали в клетку. После того как найлоновый шовный материал оставался на месте в течение 1 ч, животное снова анестезировали, шовный материал удаляли и разрез закрывали.
(4) Определение объема инфаркта.
Для определения объема инфаркта животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Головной мозг извлекали, разрезали с получением 4 срезов по 2 мм, захватывая весь пораженный инфарктом участок, и помещали в 2% хлорид трифенилтетразолия (ТТС) на 30 мин через 24 ч. Затем срезы помещали на ночь в 4% параформальдегид. Определяли площадь инфаркта в каждом срезе при помощи компьютерной системы анализа изображения, состоящей из компьютера Ротеег МасшЮкк, снабженного картой с рамкой захвата Ошск СарЮге, камерой НкасШ ССЛ, установленной на штативе для камеры. Использовали программу МН 1таде Апа1ук1к 8ойтеаге, версия 1.55. Изображения улавливали и определяли общую область инфаркта на каждом срезе. Все измерения делал один оператор слепым методом (что касается обработки). Суммируя объемы инфаркта на отдельных срезах, рассчитывали общий объем инфаркта.
(5) Статистический анализ.
Результаты выражали в виде среднего значения±стандартное отклонение (8Ό). Значимость разницы данных объема инфаркта анализировали, используя 1-критерий.
(6) Группы обработки.
Все группы подвергали МСАО. Животных (17 животных) подвергали инъекции ЕРА-производных и 23 животных подвергали инъекциям для исследования концентрации после МСАО. Группы: 1) ничего, 2) физиологический раствор, 3) С-концевой фрагмент ЕРА сурка (I) при 10 мг/кг, 4) С-концевой фрагмент ЕРА сурка (Ъ) при 10 мг/кг, 5) ЕРА при 0,625 мг/кг, 6) ЕРА при 2,5 мг/кг, 7) ЕРА при 10 мг/кг.
Ь) Результаты.
(1) Ишемия у мышей.
В этих испытаниях определяли относительную тяжесть ишемии. Данные были получены от мышей с ишемическим поражением, которым внутрибрюшинно вводили композиции в указанных дозах.
(а) Область инфаркта.
В сравнении с группой, которой не вводили ничего, и с группой, которой вводили носитель (физиологический раствор), область инфаркта в головном мозге существенно уменьшалась у животных, которых обрабатывали С-концевым ЕРАте. С-Концевой (I) ЕРАте (10 мг/кг) показал 66% уменьшение объема инфаркта. С-Концевой (Ь) ЕРАте при дозе 10 мг/кг показал такое же изменение в объеме инфаркта 67% (табл. 16). Объемы инфаркта представлены в виде графика на фиг. 14 и 15. Процент уменьшения объема инфаркта в головном мозге представлен в табл. 16.
Таблица 16
Процент уменьшения инфаркта в головном мозге
Соединение Процент уменьшения объема инфаркта
Ничего -
Носитель -
С-концевой фрагмент (I) ЕТАи, 10 мг/кг 66%
С-концевой фрагмент (Ь) ΕΤΑν, 10 мг/кг 67%
- 66 010860
Процентное уменьшение сравнивали с контрольными животными, которым вводили носитель. Данные, используемые для представления на фиг. 15, показаны в табл. 17.
Таблица 17
Ничего Физиологический С-концевой С-концевой
раствор фрагмент (I) фрагмент (Ь)
38,250 81,730 51,330 11,360
67,200 64,910 8,630 33,790
82,370 72,370 12,810 39,420
76,820 68,550 17,250 2,670
49, 680
для полученных результатов представлены
Статистические данные указаны в мм3.
в табл. 18. Объемы инфаркта
Статистический анализ объемов инфаркта Ничего Физиологический СТаблица 18
С-
раствор концевой концевой
фрагмент фрагмент
(I) (Щ
Количество 4 5 4 4
определений
Минимальный 38,25 49, 68 8,630 2,670
В процентном выражении составляющий
25%
Средний
72,01
68,55
15,03
22,58
В процентном выражении составляющий 75%
Максимальный 82,37 81,73 51,33 39,42
Среднее 66,16 67,45 22, 51 21,81
значение
Стандартное 19,63 11,74 19,54 17,60
отклонение
Стандартная 9, 817 5,251 9,768 8,800
ошибка
Ниже 95% С1 34,92 52,87 -8,582 -6,194
Выше 95% С1 97,40 82,03 53,59 49,81
В этом испытании было 7 случаев гибели животных. Большая часть случаев гибели животных приходится на группы, которым вводили физиологический раствор или не вводили ничего. В каждой из обрабатываемых групп было по одному случаю гибели животного.
В сравнении с группами, которым вводили носитель, у животных, обработанных ЕРА, область инфаркта головного мозга значительно уменьшалась. ЕРА (2,5 мг/кг) показал значительно большее снижение объема инфаркта по сравнению с другими дозами. ЕРА в дозе 0,625 и 10 мг/кг показал одинаковое изменение в снижении объема инфаркта, однако, не такое существенное, как при введении ЕРА в дозе 2,5 (табл. 19). Объемы инфаркта представлены в виде графика на фиг. 16. Процент уменьшения объема инфаркта в головном мозге представлен в табл. 19. Как показано в таблице, ЕРА в дозе 2,5 мг/кг показал 66% снижение объема инфаркта по сравнению с носителем.
- 67 010860
Таблица 19
Процент снижения объема инфаркта в головном мозге
Соединение Процент снижения объема инфаркта
Носитель
ЕРА, 0,625 мг/кг 52%
ЕРА, 2,5 мг/кг 66%
ЕРА, 10 мг/кг 57%
Процентное уменьшение сравнивали с контрольными животными, которым вводили носитель. Таблица 20
Отдельные объемы инфаркта для каждого животного; объемы инфаркта указаны в мм3
ЕРА 0,625 ЕРА 2,5 ЕРА 10 Физиологический раствор
42,350 34,850 91,580 92,340
50,620 5,180 5,220 76,450
52,180 7,290 47,610 88,120
23,510 25,560 10,390 69,530
41, 490 24,870 37,650 90,410
65,190 41,730 71,030 82,430
14,230 58,310 11,940
29,710 6,770
Таблица 21
Статистические данные для фиг. 16 представлены в табл. 21.
Статистический анализ объемов инфаркта
В процентном
Физиологический
Минимальный 14,23 5,180 5, 220 69, 53
В процентном 26,61 16,08 8,580 72,99
Максимальный 65,19 58,31 91,58 92,34
Среднее 39, 91 28,26 35,27 83,21
значение
Стандартное 16,67 18,79 32,70 8, 863
отклонение
Стандартная 5,894 7,103 11,56 3, 618
ошибка
Ниже 95% С1 25,97 10,87 7,934 73,91
Выше 95% С1 53,85 45,64 62, 61 92, 51
- 68 010860
В испытании пределов концентраций было 8 случаев гибели животных. Большинство случаев гибели животных имели место в группе, которой вводили дозу 0,625 мг/кг (6 из 8), тогда как 2 случая из 8 было в группе, которой вводили дозу 2,5 мг/кг. В группе, получавшей дозу 10 мг/кг, не было ни одного случая гибели животного. Непонятно, почему были случаи гибели животных в группе 0,625 мг/кг.
3. Пример получения данных по рецептору брадикинина.
а) Процедура.
В этом анализе измеряют связывание [125I]С6Р-42112А с рецепторами ангиотензина АТ2 человека. Клетки НеЛа, стабильно трансфицированные плазмидой, кодирующей рецептор ангиотензина АТ2 человека, использовали для получения мембран в модифицированном Тпк НС1 рН 7,4 стандартными способами. Аликвоту мембран 0,5 мкг инкубировали с 0,025 нМ [125Г|С6Р-42112А в течение 3 ч при 37°С. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 10 мкМ [8аг1,Пе8]ангиотензина II (мембранный белок может меняться от партии к партии, используемую концентрацию по необходимости нужно регулировать). Мембраны отфильтровывали и промывали 3 раза и фильтры проверяли на радиоактивность (подсчитывали) для определения специфически связанного [125ЦС6Р-42112А. Соединения скринировали при 10 мкМ. Исследование связывания АТП осуществляли, по существу, как описано в ^ЪйеЫгеаб, 8.Е., е! а1., Кабюйдапб С6Р42112А: а поуе1 Ыдк аГйпйу апб Ыдк ке1ес!туе йдапб Гог 1Пе с11агас1епха1юп оГ апдю!епкш АТ2 гесер!огк. Вюскет. Вюркук. Кек. Сотт. 181: 1365-1371, 1991 (включенном в настоящее описание посредством ссылки, по крайней мере, что касается материала, относящегося к характеристике рецептора АТП).
Ы) Результаты.
Результаты показывают, что Кб АТП для С6Р-42112А составила 0,012 нМ с Втах, составляющим 2,900 цмоль/мг белка. Специфическое связывание было определено как 90%. Это молекула с самым высоким связыванием, которую использовали в конкурентном анализе с испытываемыми молекулами.
Табл. 21а показывает ссылочные данные, которые можно использовать для сравнения различных уровней связывания с рецептором АТП.
Таблица 21а
Соединение ИК50 (нМ) Ки (нМ) пН
Ангиотензин II (человека) 0,16 0,052 1,1
[Заг\ Не8] Ангиотензин II 0,085 0, 028 1,0
ССР-42112А 0,024 0,0078 1,1
*Сараласин 0,28 0,091 0,9
*Указывает используемый стандартный ссылочный агент С6Р-42112А=никотиновая кислота-ТугЩ-бензоилкарбонил-Агд)Ьук-Н1к-Рго-Пе-0Н.
Табл. 22 и табл. 2 показывают результаты, полученные в анализе связывания рецептора АТП, для различных аналогов брадикинина. Результаты выражены в % ингибирования связывания АТП с рецептором АТП. Табл. 22 показывает различные варианты брадикинина, расположенные по порядку в зависимости от их способности к ингибированию. Например, 8Еф ГО N0: 58 ингибировала 98% АТП от связывания с рецептором АТП. С другой стороны, брадикинин (8Еф ГО N0: 57) ингибировал 12% АТП от связывания с рецептором АТП, что меньше, чем у наиболее активных соединений. 8Еф ГО N0: 58 отличается от 8Е0 ГО N0: 12 тем, что 8Еф ГО N0: 58 имеет дополнительный Лук на ^концевом участке пептида и замещение С-концевого Рке-Агд брадикинина (8Еф ГО N0: 58) на Леи.
В соответствии с обозначениями 8Еф ГО N0: 58 и брадикинина (8Еф ГО N0: 57) 8Еф ГО N0: 77, которая просто представляет собой первые 7 ^концевых аминокислот брадикинина (8Еф ГО N0: 57), что означает удаление С-концевого Рке-Агд из брадикинина, ингибирует связывание АТЛ/АТЛ-рецептора на 55%. Эти результаты показывают, что основной заряд находится на С-концевом участке брадикинина (8Еф ГО N0: 57), снижая способность брадикинина конкурировать с АТП за связывание с АТЛ-рецептором. Также добавление основного заряда на ^концевом участке брадикинина связано с повышением конкурентной способности в отношении связывания АТП с рецептором АТП (8Еф ГО N0: 58, 98%, 8Е0 ГО N0: 61, 92%). 8Еф ГО N0: 62, 63 и 64 имеют С-концевой АК6 и в то же время демонстрируют ингибирование, возможно, из-за подавления отрицательного заряда, вероятно, благодаря уникальной структуре этих пептидов, что вызвано производными адамантана.
В табл. 22 показан размер инфаркта в головном мозге для вариантов ВК по сравнению с группой, получавшей носитель. Варианты ВК, показанные в табл. 22, представлены в порядке их активности. 8Еф ГО N0: 58, 61 и 77 были значимыми до р<0,05. Значения р были получены в результате объединения всех обработанных физиологическим раствором животных, представленных в табл. 28, и сравнения с экспериментальными животными, представленными в табл. 23, с использованием одностороннего !-критерия. Любое значение р<0,05 считалось статистически значимым.
- 69 010860
Таблица 22
Наименование % ингибирования ΑΤΙΙ рецептора Последовательность Химическое наименование 5Е0 1Б N0. % ишемического поражения Р- значение
УР041 98 1»уз-Агд-Рго-Рго-С31у-Рке- Зег-Рго-Ьеи Ьуз-(Без-Ахд9, Ьеи8)Брадикинин 58 12,9 0,0071
УР044 92 Агд-Рго-Рго-(31у-РЬе-Зег- Рго-РЬё (Оез-Агд*] Брадикинин 61 13,2 0,0025
УР060 55 Агд-₽го-Рхо-61у-РЬе-5ег- Рго Брадикинин(1-7) 77 18,1 0,0263
УР045 53 Ахд-Рхо-Рхо-С1у-ТЫ-ЗехБРЪе-ТЫ-Агд [ТЫ5,8,ОРке7] Брадикинин 62 25,7 0,4483
УР046 61 Ν-Адамантанацетил-ОАгд- Агд-Рго-Нур-С1у-ТЫ-Зег- ррке-ТЫ-Агд Ν-АдмантанацетилЭАхдО-НурЗ, ТЫ5,8 г 0РЬе7] Брадикинин 63 31,8 0,7653
ν₽064 70 ОАгд-Агд-Рго-Нур-С1у-1д1- 5ег-01д1-01с-Агд В9430 81 34,2 0,5935
νΡ047 63 Ν-Адамантанкарбонил-ОАгд- Агд-Рго-Нур-51у-ТЫ-5ег- ОРЬе-ТМ-Агд Ν-Адмантанкарбонил- БагдО-НурЗ, ТЫ5,8, БРЬе7]Брадикинин 64 35,2 0,3779
Агд-Рго-Рго-С1у-РЪе-8егРго-РЬе-Агд Брадикинин 57
УРО4 9 38 МеД-Ьуз-Ахд-Рхо-Рхо-С1уРЪе-Зег-Рго-РЬе-Агд МеЪ-ЬузО]Брадикинин 66
ν₽063 35 БАгд-Агд-Рго-Нур-С1у-Тк1- 5ег-О1д1-О1с-Агд В9340 80
УР051 33 Тух-Ахд-Рхо-Рхо-С1у-РЬе- Зег-Рго-РЬе-Агд [ТухО]Брадикинин 68
УР042 29 БАгд-Агд-Рго-Нур-б1у-ТЬ1Зег-О-Т1с-О1с-Агд Ное 140 59
УР048 29 Ьуз-Агд-Рго-Рго-С1у-₽кеЗег-Рго-РЬе-Агд [ЬузО]Брадикинин 35
УР054 29 11е-Зех-Ахд-Рхо-Рхо-С1у- РЬе-Зег-Рго-РНе-Агд 11е-8ег0]Брадикинин 71
УР050 18 Ъуз-Агд-₽го-А1а-С1у-РГ1е- Зег-Рго-РЬе-Ахд ЬузО-А1аЗ]Брадикинин 67
УР053 13 Ахд-Рхо-Рхо-С1у-Тух-Зех- . Рго-РЬе-Агд Туг5]Брадикинин 70
УР055 13 Ьуз-Агд-Рго-Нур-С1у-РНеЗег-Рго-РЬе-Агд [ЬузО-НурЗ] Брадикинин 72
УР040 12 Ахд-Рхо-Рго-С1у-₽Ье-ЗегРхо-РЪе-Ахд Брадикинин 57
УР043 9 Агд-Рго-Рго-С1у-РЪе-ЗегОРЬе-РЬе-Агд [БРИе7]Брадикинин 60
νΡ058 1 Агд-Рго-Рго-С1у-РЪе Брадикинин (1-5) 75
νΡ052 -1 Агд-Рго-Рго-С1у-РЬе-5ег- Рхо-Тух-Ахд [Туг8]Брадикинин 69
νΡ057 -2 Агд-Рхо-Рхо Брадикинин (1-3) 74
νΡ061 -6 Рхо-Рго-Б1у-Рке-Зег-Рго Брадикинин (2-7) 78
УР059 -12 Ахд-Рхо-Рго-С1у-РЪе-Зех Брадикинин (1-6) 76
УР062 -13 Рхо-Рхо-61у-Рке-Зех-РхО’Рке-Ахд Брадикинин (2-9) 79
- 70 010860
Различные варианты брадикинина были испытаны в модели МСА0 мыши, как раскрывается в приведенных здесь примерах. Результаты этих экспериментов раскрыты в табл. 22. Варианты брадикинина с самым сильным связыванием с АТ2-рецептором были также наиболее эффективными в профилактике ишемического поражения.
Данные, которые использовали для получения данных, представленных в табл. 22, показаны в табл. 23. Цифры, указанные вверху колонки, относятся к животным, используемым в конкретном эксперименте для указанного варианта. Например, в некоторых экспериментах использовали 9 параллельных животных, подвергаемых окклюзии и последующему введению варианта ЕРА. Объем инфаркта определяли при помощи компьютерной системы анализа изображения, состоящей из компьютера Ро\\гег Масш!о8Й, снабженного картой с рамкой захвата Цшск Сар!иге, камерой НйасЫ ССЭ, установленной на штативе для камеры. Использовали программу МН 1таде Апа1у818 8оГЩаге, версия 1.55. Изображения улавливали и определяли общую область инфаркта на каждом срезе. Все измерения делал один оператор слепым методом (что касается обработки). Суммируя объемы инфаркта на отдельных срезах, рассчитывали общий объем инфаркта. Результаты выражали как среднее значение±стандартное отклонение (8Ό).
Таблица 23
Животное № 1 2 3 4 5 Всего Среднее значение
νΡ041 Общая площадь поражения 7, 1 20,4 5,3 0,0 32, 9 8,2 8,7
Общая площадь 64,2 64,8 63,2 61,6 253,8 63, 5 1,4
Ишемическое поражение, % 11,1 31, 5 8,4 0,0 12,9 13,4
УР044/ 010 Общая площадь поражения 12 г 3 4,7 11,4 11,6 3, 5 43, 5 8,7 4,2
Общая площадь 63,1 63,8 72,1 67,3 64, 4 330, 6 66,1 3,7
Ишемическое поражение, % 19,5 7,3 15,9 17,2 5,5 13,2 5, 3
УР045 Общая площадь поражения 21,3 4,5 23,1 20,3 69, 2 17,3 8,6
Общая площадь 66,1 63,3 71,3 66,3 269,0 67,2 3,3
Ишемическое поражение, % 31,2 7,2 32,4 30,6 25,7 12,1
гибель животного
УР046 Общая площадь поражения 11,8 30, 1 19, 9 22,7 84, 6 21,1 7,6
Общая площадь 66,7 66, 4 66,3 66,7 266,1 66,5 0,2
Ишемическое поражение, % 17,7 45, 3 30,1 34,0 31,8 13,8
гибель животного
УР047 Общая площадь поражения 27,5 23,5 20,9 19,9 91,8 23,0 3,4
Общая площадь 67,7 63,7 64,0 65,4 260,7 65,2 1,8
Ишемическое поражение, % 40,6 37, 0 32,6 30,5 35,2 4,0
νρ060 Общая площадь поражения 12,4 14, 8 6, 6 14,6 18,7 67, 1 13,4 4,4
Общая площадь 72,1 78,5 69,8 73,5 76,8 370, 6 74,1 3,5
.Ишемическое поражение, % 17,2 18,9 9,4 19,8 24,3 18,1 4,8
УР064 Общая площадь поражения 11,7 34,6 14,6 32,9 93,8 23,4 12,0
1 Общая площадь 64,9 72,8 62,7 74,1 274, 6 68,6 5,7
Ишемическое поражение, % 18,0 47,5 23,2 44,4 34,2 14,8
гибель животного гибель животного гибель животного
- 71 010860
4. Пример 4. Время введения фракции Ό2.
Фракцию Ό2, выделенную у сурков в состоянии гибернации, испытывали на эффективность в модели окклюзии среднемозговой артерии (МСАО) у мыши. Внутривенную (в/в) инъекцию Ό2 начинали вводить за 2 ч до или в различное время вплоть до 8 ч после окончания МСАО. Головной мозг извлекали, окрашивали хлоридом трифенилтетразолия (ТТС) и исследовали на объем инфаркта при помощи анализа изображения. Инъекция Ό2 показала существенную защиту головного мозга до церебральной ишемии и реперфузионного поражения. Кроме того, Ό2 показала существенную защиту от ишемического и реперфузионного поражения при введении вплоть до 6 ч после ишемического поражения. Ό2 вводили в дозах 5 мг/кг в виде одной болюсной внутривенной инъекции. В целом, Ό2 была эффективной в ограничении распространения МСАО в головном мозге при обработке вплоть до 6 ч после индукции ишемии/реперфузии у мыши.
а) Материалы и методы.
(1) Планирование эксперимента.
Модель инсульта у мыши, окклюзия среднемозговой артерии (МСАО). Мышей подвергали 1-часовой МСАО с последующей 24-часовой реперфузией. Ό2 вводили за 2 ч до ишемического поражения или по окончании ишемии (0,5, 1, 2, 4, 6 или 8 ч после начала реперфузии) и на второй день мышей умерщвляли и исследовали на объем инфаркта при помощи ТТС-окрашивания. Мышам вводили одну болюсную внутривенную инъекцию Ό2 в конечной дозе 5 мг/кг.
(2) Способы 1п νί\Ό.
Самцам мышей С57ВЬ/6 (Засккоп ЬаЫота1оту), весом примерно 25 г каждый, обеспечивали свободный доступ к пище и воде до и в процессе эксперимента. Животным давали акклиматизироваться в течение 1 недели перед началом эксперимента. Животным вводили инъекции УТ1 фракции (Ό2) при 200 мкл/мышь в дозе 5 мг/кг. Мышей внутривенно инъекцировали в указанные периоды времени до и после окончания ишемии.
(3) Индукция ишемии.
У каждой мыши индуцировали 1-часовую церебральную ишемию с последующей 24-часовой реперфузией. До или по окончании ишемического периода (указанное время) животным вводили Ό2 в дозе 5 мг/кг и через 24 ч исследовали на объем инфаркта. Левую сонную артерию (ССА) раскрывали, делая разрез по серединной линии шеи. Верхние тиреоидную и затылочную артерии электрокоагулировали и разделяли. Микрохирургический зажим накладывали вокруг начала внутренней сонной артерии (1СА). Дистальный конец ЕСА лигировали 6-0 шелком и отделяли. Шелк 6-0 свободно завязывали вокруг ЕСАкульти. Зажим удаляли и отполированный в пламени конец 5-0 найлонового шовного материала (покрытого поли-Ь-лизином) осторожно вставляли в ЕСА-культю. Петлю из 6-0 шелка затягивали вокруг культи и найлоновый шовный материал продвигали примерно на 11 мм (в зависимости от веса тела) внутрь и через внутреннюю сонную артерию (1СА) после удаления аневризматического зажима, пока он не достиг передней мозговой артерии (АСА), обеспечивая, таким образом, окклюзию передней соединяющей и средней мозговых артерий. После пробуждения от наркоза животное возвращали в клетку. После того как найлоновый шовный материал оставался на месте в течение 1 ч, животное снова анестезировали, шовный материал снимали и разрез закрывали.
4) Определение объема инфаркта.
Для определения объема инфаркта животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Головной мозг извлекали, разрезали с получением 4 срезов по 2 мм, захватывая весь пораженный инфарктом участок, и помещали в 2% хлорид трифенилтетразолия (ТТС) на 30 мин через 24 ч после реперфузии. Затем срезы помещали на ночь в 4% параформальдегид. Определяли площадь инфаркта в каждом срезе при помощи компьютерной системы анализа изображения, состоящей из компьютера Ро\тег МасшЮкй снабженного картой с рамкой захвата Ошск СарШте, камерой НйасЫ ССЭ, установленной на штативе для камеры. Использовали программу N14 1таде Апа1ук1к 8ойгеате, версия
1.55. Изображения улавливали и определяли общую площадь инфаркта на каждом срезе. Все измерения делал один оператор слепым методом (что касается обработки). Суммируя объемы инфаркта на отдельных срезах, рассчитывали общий объем инфаркта.
(5) Статистический анализ.
Результаты выражали в виде среднего значения±стандартное отклонение (8Ό). Значимость разницы величин объемов инфаркта анализировали, используя ί-критерий. Все животные были включены в испытание.
(6) Группы обработки.
Все группы подвергали МСАО. Животным (27 животных) вводили инъекцию БРА после МСАО. Группы были следующими. Группа 1, контрольные мыши, отсутствие ишемии/реперфузионного поражения; группа 2, контрольные мыши, 1-часовая ишемия и 24-часовая реперфузия, введение носителя через 1 ч после ишемии; группа 3, 1-часовая ишемия и 24-часовая реперфузия, введение Ό2 за 2 ч до поражения; группа 4, 1-часовая ишемия и 24-часовая реперфузия, введение Ό2 через 0,5 ч после поражения; группа 5, 1-часовая ишемия и 24-часовая реперфузия, введение Ό2 через 1 ч после поражения; группа 6, 1-часовая ишемия и 24-часовая реперфузия, введение Ό2 через 2 ч после поражения; группа 7, 1-часовая ишемия и 24-часовая реперфузия, введение Ό2 через 4 ч после поражения; группа 8, 1-часовая ишемия и 24-часовая реперфузия, введение Ό2 через 6 ч после поражения; группа 9, 1-часовая ишемия и 24-часовая реперфузия, введение Ό2 через 8 ч после поражения.
- 72 010860
Ь) Результаты.
(1) Ишемия у мышей.
В этом испытании определяли относительную тяжесть ишемии. Данные получали от мышей с ишемическим поражением, которым внутрибрюшинно вводили фракцию Ό2 в дозе 5 мг/кг. В этом испытании отсутствовали случаи гибели животных.
(а) Область инфаркта.
В сравнении с группой, которой вводили носитель, область инфаркта в головном мозге значительно уменьшалась у животных, обработанных Ό2. Ό2 (за 2 ч до ишемии) показал наибольшее уменьшение объема инфаркта, чем при введении в другое время. Ό2, введенный через 0,5 и 1 ч после реперфузии, показал одинаковое изменение в уменьшении объема инфаркта, однако, не такое значительное, как Ό2, введенный за 2 ч до ишемии (табл. 24). Объемы инфаркта представлены в виде графика на фиг. 17. Процент уменьшения объема инфаркта в головном мозге представлен в табл. 24. Как видно из табл. 24, Ό2, введенный за 2 ч до ишемии, показал 88%-ное уменьшение объема инфаркта по сравнению с носителем.
Таблица 24
Процентное уменьшение объема инфаркта головного мозга
Соединение Процент уменьшения объема инфаркта
Контроль -
Контроль, ишемия 0%
ϋ2 за 2 часа до ишемии 88%
02 через 0,5 час после ишемии . 80%
02 через 1 час после ишемии 75%
02 через 2 часа после ишемии 65%
02 через 4 часа после ишемии 34%
ϋ2 через 6 часов после ишемии 20%
02 через 8 часов после ишемии 0%
Процентное уменьшение сравнивали с контрольными животными, обработанными носителем.
Кроме того, при более раннем времени введения было существенное защитное действие от ишемического и реперфузионного поражения.
(Ь) Данные по животным.
Таблица 25
Номер животного 1 2 3 Среднее 30
значение
Контроль 0, 0 0,0 0,0 0,000 0, 000
Ничего 87,960 79,550 109,780 92,430 9,008308
Предварительная 0,000 8, 360 26,780 11,71333 7,910452
обработка за 2
часа Пост-обработка 12,4300 5,9200 36,5100 18,28667 9,303447
через 0,5 час
Пост-обработка 23,860 4, 900 41,690 23,48333 10,62203
через 1 час
Пост-обработка 35,780 12,940 48,560 32,42667 10,41841
через 2 часа
Пост-обработка 58,4300 42,7900 81,2600 60,82667 11,1698
через 4 часа
Пост-обработка 74,900 55,870 91,220 73,99667 10,21466
через 6 часов
Пост-обработка 90,42 113,860 76,950 93,74332 10,78379
через 8 часов
- 73 010860
5. Пример 5. Варианты ΡΡΑ.
Некоторые варианты ΡΡΑ были испытаны на эффективность в модели окклюзии среднемозговой артерии (ΜСΑΟ) у мыши. Эти варианты включали мутантные варианты с делецией как на С-, так и на Νконце, а также мутанты, имеющие замещение аланиновым остатком одной аминокислоты одновременно, начиная с Ν-конца и продолжая по всей последовательности до С-концевого остатка. Внутривенную (в/в) инъекцию варианта ΡΡΑ вводили через 1 ч после ΜСΑΟ. Головной мозг вырезали, окрашивали хлоридом трифенилтетразолия (ТТС) и исследовали на объем инфаркта при помощи анализа изображения. Инъекция ΡΡΑ показала существенную защиту головного мозга до церебральной ишемии и реперфузионного поражения. Варианты ΡΡΑ вводили в виде одной болюсной внутривенной инъекции.
a) Материалы и методы.
(1) Планирование эксперимента.
Модель инсульта у мыши, окклюзия среднемозговой артерии (ΜСΑΟ). Мышей подвергали 1-часовой ΜСΑΟ с последующей 24-часовой реперфузией. Варианты ΡΡΑ вводили через 1 ч после начала реперфузии и на второй день мышей умерщвляли и исследовали на объем инфаркта при помощи ТТС окрашивания. Мышам вводили одну болюсную внутривенную инъекцию варианта ΡΡΑ в конечной эквивалентной дозе в расчете на исходный пептид (С-концевой фрагмент ΡΡΑ сурка) 10 мг/кг.
(2) Способы 1п у1уо.
Самцам мышей С57ВЬ/6 (1асккоп ЬаЬога!огу), весом примерно 25 г каждый, обеспечивали свободный доступ к пище и воде до и в процессе эксперимента. Животным давали акклиматизироваться в течение 1 недели перед началом эксперимента. Животным вводили инъекции вариантов ΡΡΑ при 200 мкл/мышь при эквивалентной дозе 10 мг/кг. Мышам вводили внутривенную инъекцию в указанные периоды времени до и после окончания ишемии.
(3) Индукция ишемии.
У каждой мыши индуцировали 1-часовую церебральную ишемию с последующей 24-часовой реперфузией. До и по окончании ишемического периода (указанное время) животным вводили инъекцию варианта ΡΡΑ в эквивалентной дозе 10 мг/кг и через 24 ч исследовали на объем инфаркта. Левую сонную артерию (ССА) раскрывали, делая разрез по серединной линии шеи. Верхние тиреоидную и затылочную артерии электрокоагулировали и разделяли. Микрохирургический зажим накладывали вокруг начала внутренней сонной артерии (Κ'Α). Дистальный конец ЕСА лигировали 6-0 шелком и отделяли. Шелк 6-0 свободно завязывали вокруг ЕСА-культи. Зажим удаляли и отполированный в пламени конец 5-0 найлонового шовного материала (покрытого поли-Ь-лизином) осторожно вставляли в ЕСА-культю. Петлю из 6-0 шелка затягивали вокруг культи и найлоновый шовный материал продвигали примерно на 11 мм (в зависимости от веса тела) внутрь и через внутреннюю сонную артерию (ΚΑ) после удаления аневризматического зажима, пока он не достиг передней мозговой артерии (АСА), обеспечивая, таким образом, окклюзию передней соединяющей и средней мозговых артерий. После пробуждения от наркоза животное возвращали в клетку. После того как найлоновый шовный материал оставался на месте в течение 1 ч, животное снова анестезировали, шовный материал снимали и разрез закрывали.
(4) Определение объема инфаркта.
Для определения объема инфаркта животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Головной мозг извлекали, разрезали с получением 4 срезов по 2 мм, захватывая весь пораженный инфарктом участок, и помещали в 2% хлорид трифенилтетразолия (ТТС) на 30 мин через 24 ч после реперфузии. Затем срезы помещали на ночь в 4% параформальдегид. Определяли область инфаркта в каждом срезе при помощи компьютерной системы анализа изображения, состоящей из компьютера Ρо\νе^ Маст!о§й, снабженного картой с рамкой захвата Ошск Сар!иге, камерой НйасЫ ССЭ, установленной на штативе для камеры. Использовали программу №Н Ийаде ΑικιΚδίδ 8ойтеаге, версия
1.55. Изображения улавливали и определяли общую площадь инфаркта на каждом срезе. Все измерения делал один оператор слепым методом (что касается обработки). Суммируя объемы инфаркта на отдельных срезах, рассчитывали общий объем инфаркта.
(5) Статистический анализ.
Результаты выражали в виде среднего значения±стандартное отклонение (8Ό). Значимость разницы величин объемов инфаркта анализировали, используя !-критерий. Все животные были включены в испытание.
b) Результаты.
(1) Ишемия у мышей.
В этих исследованиях оценивали относительную тяжесть ишемии. Данные получали от мышей с ишемическим поражением, которым внутрибрюшинно инъецировали вариант ΡΡΑ в дозе, эквивалентной дозе 10 мг/кг непроцессированного С-концевого ΡΡΑ сурка (АС ΡΡΑ). В этом исследовании было 30 случаев гибели животных. Используемые дозы указаны в табл. 29. Табл. 30 представляет сравнение последовательностей ΡΡΑ человека и сурка.
- 74 010860
Таблица 29
Молекула МИ Фактор мг/кг
УР012 935 1,64 16,4
УР013 835,9 1,84 18,4
νΡ014 778,8 1,97 19,7
УР015 721,8 2,13 21,3
УР016 664,7 2,31 23,1
УР017 535,6 2,87 28,7
УР018 1034,1 1,49 14,9
УР019 905 1,70 17,0
УР020 757,8 2,03 20,3
УР021 644,7 2,38 23,8
УР022 573,6 2,68 26,8
νΡ023 607,7 2,53 25,3
νΡ024 535,6 2,87 28,7
УР025 445,5 3,45 34,5
νρ026 389,4 3,95 39,5
УР027 417,4 3, 68 36, 8
νΡ028 444,5 3,46 34, 6
УР029 1105,2 1,39 13, 9
УР030 1033,2 1,49 14, 9
УР031 1015,1 1,51 15,1
УР032 1049,1 1,46 14,6
УР033 1077,2 1,43 14,3
УР034 1033 1,49 14,9
ν₽035 1105,2 1,39 13,9
νΡ036 1105,2 1,39 13,9
νρϋ37 1105,2 1,39 13,9
νΡ038 1063,1 1,45 14,5
УР039 1006,1 1,53 15,3
Исходное соединение представляет собой УР-001 ММ=1536.8. Это соединение испытывали в дозе мг/кг.
Испытываемые соединения УР-012-УР039 - при эквивалентной дозе в соответствии с ММ.
Пептид Ν-концевой фрагмент С-концевой фрагмент
ЕРА человека
Положение 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16
ЗЕЙ Ю N0:2 А1а Азр Зег С1у С1и С1у Азр РЬе Ьеи А1а С1и С1у С1у С1у Уа1 Агд
ИС ЕРА
ЗЕЙ 10 N0:1 А1а Азр ТЬг Азр Ьуз С1у С1и РЬе Ьеи А1а С1и С1у С1у 61у Уа1 Агд
(а) Область инфаркта.
В табл. 26 показана область инфаркта в головном мозге животных. которым вводили варианты РРА. по сравнению с группой. которой вводили носитель. Варианты РРА. указанные в табл. 26. представлены
- 75 010860 в порядке их активности. 8ЕЦ ΙΌ NО: 46, 45, 35, 50, 38, 40, 54, 32, 47 и 48 были значимыми до р<0,05. Значения р были получены в результате объединения всех обработанных физиологическим раствором животных, представленных в табл. 28, и сравнения с экспериментальными животными, представленными в табл. 27, с использованием одностороннего !-критерия. Любое значение р<0,05 считалось статистически значимым.
Таблица 26
Ами но кисло т ная последовательность Мутация или делеция % ишемического Соединение # 5Ε<2 10 N0 Примечание
поражения Р-значение
А1а~С1и-РЬе-Ьеи-А1а- А1а в 5, 6 УР029 46 А1а более
С1и-С1у-51у-С1у-Уа1- положении гидрофобный, чем
Агд 6 <0,0001 С1у на С-конце
С1у-й1у-61у-7а1-Агд С-концевой 13,9 УР028 45 5-мерный активный
5-мер (12- пептид
1 XV/ Λ ΓιΠΟΟ V / V V V о
РЬе-Ьеи-А1а-61и-51у- С-концевая 14,1 УР019 36 Удаление
С1у-С1у-Уа1-Агд деления отрицательного
С1у, Б1и заряда на С-конце
(3-16) 0,0048
С1у-51и-Р)1е-Ьеи-С1у- Б1у В 15,4 УРОЗЗ 50 Очень схож с
С1и-01у-51у-С1у-Уа1- положении исходным пептидом
Агд 10 0,0101
А1а-Б1и-Б1у-С1у-Б1у- С-концевая 15,6 ν?0 21 38 Содержит 5-мерный
Уа1-Агд деления активный пептид как
51у, 51и, РЬе, Ьеи 0,0044 УРО 2 8
(10-16)
61и-РИе-Ьеи-А1а-С1и С-концевой 16,4 УР023 40
5-мер (7-
11) 0,0147
Б1у-61и-РЬе-Ьеи-А1а- А1а в 16,9 νΡ037 54 А1а более
С1и-С1у“С1у-А1а-Уа1- положении гидрофобный и
Агд 14 больше, чем С1у в
0,0101 этом положении
С1у-С1и-РЬе-Ьеи-А1а- Ы-концевая 17,5 УР015 32
61и-Б1у деления
С1у, С1у,
7а1, Агд
(6-12) 0,0233
С1у-А1а-РЬе-Ьеи-А1а- А1а в 18, 3 УРОЗО 47 Потеря
Б1и-Б1у-61у-Б1у-Уа1- положении прокимального Ν-
Агд 7 концевого
0,0154 кислотного заряда
О1у-Б1и-А1а-Ьеи-А1а- А1а в 18,7 УРОЗ! 8 А1а менее
С1и-61у-Б1у-Б1у-7=1- положении тттл пглп/Ь/лГлиытл тл * ·<
Агд 8 меньше, чем РЬе в
0)0485 этом положении
- 76 010860
С1у-С1и-РЬ1е-Ьеи-А1а- А1а в 19,0 νΡ035 52 А1а более
С1и-А1а'-(з1у-’С1у-7а1- положении гидрофобный и
Агд 12 больше, чем 51у в
0,0732 этом положении
С1и-е1у-С1у-С1у-Уа1- С-концевая 19,9 УР022 39 Содержит 5-мерный
Агд деления активный пептид как
С1у, С1и, УР028
РЬе, Ьеи,
А1а (11-
16) 0,0667
С1у-С1и-РНе-Ьеи-А1а- А1а в 21,8 УР034 51 Потеря внутреннего
А1а-С1у-С1у-С1у-Уа1- положении кислотного заряда
Агд 11 0,1482
РНе-Ьеи-А1а-С1и-С1у С-концевой 12,2 УР024 41 Не содержит
5-мер минимально активный
0,2183 пептид
<31у-С1ц-РЪе-А1а-А1а- А1а в 22,4 УР032 49 А1а менее
О1и-С1у-С1у-С1у-Уа1- положении гидрофобный и
Агд 9 меньше, чем Ьеи в
А 1 ΛΛ1 и г 4- V Όί- этом положении
С1у-С1ц-РЬе-Ьеи-А1а- Ν-концевая 12,9 УР014 31 Делеция С-концевых
С1и-С1у-С1у деления 0,1098 гидрофобных
С1у, Уа1, основных элементов
Агд (6-13)
СХу-СЬи-РЬе-Ьеи-АЗ-а- А1а в 24,8 УР039 56 Потеря Ν-концевого
С1и-С1у-С1у-С1у-Уа1“ положении основного заряда
А1а 16 0,1707
1еи-А1а-С1и-61у-С1у С-концевой 25,8 ν₽025 42 Не содержит
5-мер минимально активный
0,4764 пептид
(31и-РЬе-Ьеи-А1а-С1и- С-концевая 26,2 УР018 35 Потеря С-концевого
С1у-С1у-С1у-Уа1-Агд делеция гидрофобного
61 у (7-16) 0,5248 остатка
Сг1у-(э1и“РНе-Ьеи-А1а- Ν-концевая 27,2 ν₽013 30 Потеря Ν-концевого
<31и-С1у-С1у-С1у делеция основного заряда
Уа1, Агд
(6-14) 0, 6441
С1у-С1и-РЬе-Ьеи-А1а Ν-концевая' 27,3 νΡ017 34 Потеря Ν-концевого
делеция основного заряда
С1и, С1у,
Й1у, 01у,
Уа1, Агд
(6-10) 0,6395
<31у-(31и-РЬе-Ьеи-А1а- Ν-концевая 27,8 0,5080 ΥΡ012 29 Потеря Ν-концевого
- 77 010860
С1и-С1у-С1у-С1у-Уа1 деления
Агд (6-15)
Ьеи-А1а-С1и-С1у-<51у- С-концевая 28,4
61у-Уа1-Агд деления
<31у, 0111, РЬе (9-16) 0,7229
61у-С1и-РЬе-Ьеи-А1а- Ы-концевая 28,7
С1и деления С1у, С1у, С1у, Уа1, Агд (6-11) 0,8376
С1у-С1и-РЬе-Ъеи-А1а- А1а в 28, 9
С1и-С1у-А1а-61у-Уа1- положении
Агд 13 0,8329
61и-61у-С1у-С1у-Уа1 С-концевой 31,1
5-мер 0,8641
С1у-С1и-РЬе-Ьеи-А1а- А1а в 32, 3
С1и-С1у-С1у-С1у-А1а- положении
Агд 15 0,7000
А1а-(31и-<51у-61у-С1у С-концевой 36, 8
5-мер 0,1948 <0,0001
О1у-С1и-РЬе-Ьеи-А1а- Исходный 13,4
О1и-С1у-С1у-С1у-Уа1- пептид
Агд
Контроль Никакой 30, 5
{физиологический обработки
раствор}
основного заряда
УР020 37 Потеря С-концевого гидрофобного остатка
УР016 33 Потеря Ν-концевого основного заряда
νΡ036 53 А1а более гидрофобный и больше, чем С1у в этом положении
УР027 44
νΡ038 55 Структурное изменение
УР026 43
УР007 89
Данные, которые использовали для получения данных, представленных в табл. 26, показаны в табл. 27. Цифры, указанные вверху колонки, относятся к животным, используемым в конкретном эксперименте для указанного варианта. Например, в некоторых экспериментах использовали 9 параллельных животных, подвергаемых окклюзии и последующему введению варианта ЕРА. Область инфаркта в каждом разрезе определяли при помощи компьютерной системы анализа изображения, состоящей из компьютера Ротеег Маст^кй, снабженного картой с рамкой захвата ршск СарНие камерой НйасЫ СС1 λ установленной на штативе для камеры. Использовали программу МН 1таде Апа1ук1к Зойтеаге, версия 1.55. Изображения улавливали и определяли общую площадь инфаркта на каждом срезе. Все измерения делал один оператор слепым методом (что касается обработки). Суммируя объемы инфаркта на отдельных срезах, рассчитывали общий объем инфаркта. Результаты выражали как среднее значение±стандартное отклонение (8Ώ).
Таблица 27
Животное № 1 2 3 4 5
УР001 Общая площадь поражения 1,5 26,9 16,7 26,5 12,6
Общая площадь 67,2 67,5 69,2 71,0 65, 6
Ишеми- ческое пораже- ние, % 2,3 39,9 24,1 37,3 19,2
νροοι Общая площадь поражения 23,4 20,6 5,2 11,3 7,3
Общая площадь 73,0 71,9 69,4 65,7 68,4
6 7 8 9 Всего Средн знач 3Ω
24,8 2,8 3,3 4,5 119,5 13,3 10,8
68,1 67,6 68,8 72,0 616, 8 68,5 2,0
36,4 4,1 4,8 6,2 19,4 15,7
12,1 8,2 7,1 95,4 11,9 6,7
66,8 69,3 73,5 557,9 69, 7 3,2
- 78 010860
□битая площадь
Общая площадь
ИшемиОбщая площадь поражеОбшая площадь
Ишемипоражеплощадь поражеОбшая площадь
ИшемиОбщая площадь
Общая площадь ишемиОбшая площадь
Общая площадь ишемиОбшая площадь
- 79 010860
Общая площадь 64,2 62,4 64,8 191,4 63,8 1/3
Ишемическое поражение, % 23,3 35, 8 34,0 31,0 6,8
Общая площадь поражения 27,0 6,8 16,9 24,6 75,3 18,8 9,1
Общая площадь 72,6 69,7 66,1 67,9 276,3 69,1 2,8
Ишемическое поражение, % 37,2 9,8 25,5 36,1 27,2 12,7
гибель животного гибель живот- ного
УР014 Общая площадь поражения 16,7 14,9 5,6 16,0 53,2 13,3 5,2
Общая площадь 68,8 66, 3 63,0 67,3 265,3 66, 3 2,4
Ишемическое поражение, % 24,2 22,4 8,9 23,8 20,0 7,3
νΡ014 Общая площадь поражения 19,2 22,7 19,3 4,3 26,1 91,5 18,3 8,3
Общая площадь 69,2 75, 8 67,2 71,9 69,6 353,7 70, 7 3,3
Ишемическое поражение, % 27,7 29, 9 28,7 5,9 37,5 25,9 11,8
УР015 Общая площадь поражения 6,0 15,7 17,3 11,7 12,0 62, 6 12,5 4,4
Общая площадь 72,9 73,2 69,3 70,2 71,0 356,6 71, 3 1,7
Ишемическое поражение, % 8,2 21,4 24,9 16,7 16,8 17,6 7,2
УР016 Общая площадь поражения 12,8 28,0 14,4 27,6 82,8 20,7 8,3
Общая площадь 73,2 73,2 75,0 69,1 290,5 72,6 2,5
Ишемическое пораже- ние, % 17,4 38,3 19,2 40, 0 28,7 12,1
гибель животного гибель животного гибель животного
УР017 Общая площадь поражения 32,5 18,7 1Ц7 15,3 78,2 19,5 9,1
- 80 010860
Общая площадь 73,9 70,2 70,2 72,3 286,6 71,6 1,8
Ишемическое поражение, % 44,0 26,6 16, 7 21,2 27,3 12,0
гибель животного
νροΐδ Общая площадь поражения 10,1 17,7 16,1 27,1 71,0 17,7 7,1
Общая площадь 58,7 67,8 67,7 72,1 266,3 66, 6 5,6
Ишемическое поражение, % 17,1 26,2 23,8 37,6 26,2 8,5
гибель животного гибель животного
УР019 Общая площадь поражения 12,4 4,9 11,8 12,2 5,2 46,3 9,3 3,9
Общая площадь 62,4 62,5 64,3 64,8 74,5 328,5 65,7 5,0
Ишемическое поражение, % 19,8 7,8 18,3 18,8 6,9 14,1 5, 6
гибель животного гибель животного
УР020 Общая площадь поражения 28,4 3,8 7,4 23,1 23, 4 13, 5 29,3 128, 8 18,4 10,2
Общая площадь 65, 8 64,0 63,7 61,6 63,7 63, 5 70,3 452,7 64,7 2,8
Ишемическое поражение, % 43,1 5,9 11,5 37,4 36,7 21,2 41,7 28,4 15,2
гибель животного гибель животного гибель животного
УР021 Общая площадь поражения 13,0 8,3 8,4 17,0 6,8 13,7 67,1 11,2 4,0
Общая площадь 72,3 72,8 70,4 71,8 70,3 72,4 430,1 71,7 1,1
Ишемическое поражение, % 17,9 11,4 11,9 23,7 9,6 18,9 15,6 5,5
гибель животного
УР022 Общая площадь поражения 12,4 5,5 15,6 12,2 26,7 72,4 14,5 7,8
Общая площадь 68,4 74,1 75,5 71,0 74,5 363,5 72,7 2,9
гибель животОбшая площадь ишемипоражегибель живот
Обшая площадь
Общая площадь
ИшемиОбшая площадь поражеОбшая площадь ишемиплошадь
Общая площадь
ИшемиОбшая площадь
Общая площадь
Ишеми- 82 010860
гибель животного гибель животного гибель животного
УР028 Общая площадь поражения 1/7 12,2 9/5 14,3 37,7 9,4 5,5
Общая площадь 63,9 69,2 67,5 70,7 271,3 67,8 2,9
Ишемическое поражение, % 2,7 17,6 14,1 20,2 13,9 7,8
УР029 Общая площадь поражения 3,2 6,1 5,5 1/7 1/4 18,0 3,6 2,2
Общая площадь 66,1 67,7 64,7 60,6 60,1 319,1 63,8 3,4
Ишемическое поражение, % 4, 9 9,1 8,6 2,8 2,3 5,6 3,0
УР030 Общая площадь поражения 2,3 13,7 3,2 19,0 13,5 24,7 7,0 83,3 11,9 8,3
Общая площадь 61,1 67,4 61,3 66,8 65,8 65,8 66,0 454,2 64,9 2,6
Ишемическое поражение, % 3,7 20,3 5,2 28,4 20,5 37,5 10, 6 18,3 12,0
νΡ031 Общая площадь поражения 13,2 17,2 3,3 27,1 5,6 66,3 13,3 9,6
Общая площадь 71,3 71,9 72, 0 70,2 68,2 353,5 70,7 1/ 6
Ишемическое поражение, % 18,5 23,9 4,5 38,6 8,2 18,7 13,5
гибель животного
УР032 УР032 Общая площадь поражения Общая площадь Ишемическое поражение, % Общая площадь поражения 5,6 63,3 8,8 28,1 14,0 67, 6 20,8 14,0 18,9 67,6 28,0 2,5 6,8 60,5 11,2 31,4 45,3 259,0 76,0 11,3 64,8 17,5 19,0 6,3 3,5 8,8 13,4
Общая площадь 70,2 69,2 66,3 70,3 276,0 69,0 1/9
Ишемическое поражение, % 40,0 20,3 3,7 44,7 27,2 18,9
- 83 010860
Общая площадь
Общая площадь
ИшемиОбшая площадь
Обитая площадь
ИшемипоражеОбшая площадь
Общая площадь
ИшемиОбшая площадь поражеОбшая площадь
ИшемиОбшая площадь площадь
ИшемиОбшая площадь
Общая площадь
Ишеми- 84 010860
УР039 Общая площадь поражения 10,8 17,8 11,5 14,3 18,1 72,4 14,5 3,4
Общая площадь 63,7 63,4 62,3 67,5 62,3 319,2 63,8 2,2
Ишемическое поражение/ % 16,9 28,0 18,4 21,2 29,0 22,7 4,9
УР039 Общая площадь поражения 20,6 18,3 17,8 20,2 76,9 19,2 1,4
Общая площадь 75,4 70,8 68,6 72,1 286, 9 71,7 2,8
Ишемическое поражение, % 27,3 25,9 25,9 28,1 26,8 1,1
Животное Ν' 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Всего Средн 3ϋ
знач
νροοι Общая площадь поражения 1,5 26,9 16,7 26,5 12,6 24,8 2,8 3,3 4,5 119,5 13,3 10,8
Общая площадь 67,2 67,5 69,2 71,0 65,6 68,1 67,6 68,8 72,0 616,8 68,5 2,0
Ишемическое поражение, % 2,3 39,9 24,1 37,3 19,2 36,4 4,1 4,8 6,2 19,4 15,7
νροοι Общая площадь поражения 23,4 20,6 5,2 11,3 7,3 12,1 8,2 7,1 95,4 11,9 6,7
Общая площадь 73,0 71,9 69,4 65,7 68,4 66,8 69,3 73,5 557,9 69,7 3,2
Ишемическое поражение, % 32,1 28,6 7,5 17,2 10,7 18,2 11,9 9,7 17,1 11,2
УР007 Общая площадь поражения 0,0 0,0 15,8 14,4 2,6 0,0 28,0 12,1 72,9 9,1 10,2
Общая площадь 59,5 60,8 67, 6 71,9 63,5 66,0 67,8 66,3 523,4 65,4 4,0
Ишемическое поражение, % 0,0 0,0 23,4 20,0 4,1 0,0 41,3 18,2 13,4 15,0
гибель животного
УР007 Общая площадь поражения 59,5 60,8 106, 9 106,3 70,2 74,5 14,9 9,5
Общая площадь 119,0 121, 6 197,9 198,3 137, 8 335,6 67,1 1,3
Ишемическое поражение, % 54,0 47,1 7,1 16,2 15,2 22,2 14,0
- 85 010860
УР007 Общая площадь поражения 10, 8 17,8 11,5 14,3 18,1 72,4 14,5 3,4
Общая площадь 63,7 63, 4 62,3 67,5 62,3 319,2 63,8 2,2
Ишемическое поражение, % 16, 9 28,0 18,4 21,2 29,0 22,7 5,5
УР007 Общая площадь поражения 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,1 10,5 14,5 1, 6 3,6
Общая площадь 71,5 70,7 70,8 71,2 69,1 69,0 68,1 70,3 68,5 629,3 69,9 1,2
Ишемическое поражение, % 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 5,8 15,3 2,3 5,2
νΡ012 Общая площадь поражения 22,1 33, 9 0,0 19,4 13,1 88,5 17,7 12,4
Общая площадь 67,0 79,2 71,5 64,2 80,2 362, 0 72,4 7,1 9,8 362,0 72,4 7,1
Ишеми- ческое пораже- ние, % 33,0 42, 8 0,0 30,2 16,3 24,5 16,6 68,0 24,5 16,6
гибель животного
νΡ012 Общая площадь поражения 15,0 22, 4 22,1 59,4 19,8 4,2
Общая площадь 64,2 62, 4 64,8 191,4 63,8 1,3
Ишемическое поражение, % 23,3 35,8 34,0 31,0 6, 8
Общая площадь поражения 27,0 6, 8 16,9 24,6 75,3 18,8 9,1
Общая площадь 72,6 69,7 66,1 67,9 276,3 69,1 2,8
Ишемическое поражение, % 37,2 9,8 25,5 36,1 27,2 12,7
гибель животного гибель животного
УР014 Общая площадь поражения 16,7 14,9 5, 6 16,0 53,2 13, 3 5,2
Общая площадь 68,8 66,3 63,0 67,3 265,3 66,3 2,4
Ишемическое поражение, % 24,2 22,4 8, 9 23,8 20, 0 7,3
- 86 010860
УР014 Общая площадь поражения 19,2 22,7 19,3 4,3 26,1
Общая площадь 69,2 75,8 67,2 71,9 69, 6
Ишемическое поражение/ % 27,7 29,9 28,7 5, 9 37,5
УР015 Общая площадь поражения 6,0 15,7 17,3 11,7 12,0
Общая площадь 72,9 73,2 69,3 70,2 71,0
Ишемическое пораже- ние, % 8/2 21,4 24,9 16,7 16,8
УР016 Общая площадь поражения 12,8 28,0 14,4 27, 6
Общая площадь 73,2 73,2 75,0 69,1
Ишемическое поражение, % 17,4 38,3 19,2 40,0
гибель животного гибель животного гибель животного
УР017 Общая площадь поражения 32,5 18,7 11,7 15,3
Общая площадь 73,9 70,2 70,2 72,3
Ишемическое пораже- 44,0 26, 6 16,7 21,2
ние, %
гибель животного
νροιθ Общая площадь поражения 10,1 17,7 16,1 27,1
Общая площадь 58,7 67,8 67,7 72,1
Ишемическое поражение, % 17,1 26,2 23,8 37,6
гибель животного гибель животного
91,5 18,3 8,3
353,7 70,7 3,3
25,9 11,8
62,6 12,5 4,4
356,6 71,3 1,7
17,6 7,2
82,8 20,7 8,3
290,5 72, 6 2,5
28,7 12,1
78,2 19,5 9,1
286, 6 71,6 1,8
27,3 12,0
71,0 17,7 7,1
266,3 66,6 5,6
26,2 8,5
- 87 010860
ν₽019 Общая площадь поражения 12,4 4,9 11,8 12,2 5,2 46,3 9,3 3,9
Общая площадь 62,4 62,5 64,3 64,8 74,5 328,5 65,7 5,0
Ишемическое поражение, % 19, 8 7,8 18,3 18,8 6, 9 14, 1 5, 6
гибель животного гибель животного
ΥΡ020 Общая площадь поражения 28,4 3,8 7,4 23,1 23,4 13,5 29, 3 128,8 18,4 10,2
Общая площадь 65,8 64,0 63,7 61,6 63,7 63,5 70,3 452,7 64,7 2,8
Ишемическое поражение, % 43,1 5,9 11,5 37,4 36,7 21,2 41,7 28,4 15,2
гибель животного гибель животного гибель животного
УР021 Общая площадь поражения 13,0 8,3 8,4 17,0 6,8 13,7 67,1 11,2 4,0
Общая площадь 72,3 72,8 70,4 71,8 70,3 72, 4 430,1 71,7 1,1
Ишемическое поражение, % 17,9 11,4 11,9 23,7 9,6 18,9 15,6 5,5
гибель животного
ΥΡ022 Общая площадь поражения 12,4 5,5 15,6 12,2 26,7 72,4 14,5 7,8
Общая площадь 68,4 74,1 75,5 71,0 74,5 363,5 72,7 2,9
Ишемическое поражение, % 18,2 7,4 20,6 17,2 35,8 19, 9 5,8
гибель животного
ΥΡ023 Общая площадь поражения 0,0 8,2 13,0 7,0 32,6 60,8 12,2 12,3
Общая площадь 73,8 69,6 75,5 70,8 81,9 371,5 74,3 4,9
Ишемическое поражение, % 0,0 11,8 17,2 9,9 39,8 16, 4 7,2
гибель животного
- 88 010860
УР024 Общая площадь поражения 6,2 29,8 19,9 6,9 62,8 15,7 11,3
Общая площадь 68,7 71,2 70,6 70,2 280,7 70,2 1,1
Ишемическое поражение, % 9,0 41,9 28,2 9,8 22,2 15,8
гибель животного гибель живот- ного
УР025 Общая площадь поражения 8,6 20,6 18,8 24,6 72,5 18,1 6,8
Общая площадь 68,8 71,6 69,5 71,0 280,9 70,2 1/3
Ишемическое поражение, % 12,5 28,7 27,0 34,6 25,8 9,4
УР026 Общая площадь поражения 25,4 21,7 17,4 27,5 26,0 118,0 23,6 4,1
Общая площадь 62,7 65,2 64,3 61,1 67,2 320,5 64,1 2,4
Ишемическое поражение, % 40,5 33,3 27,0 45,1 38,7 36,8 7,9
гибель животного
УР027 Общая площадь поражения 19,2 11,4 31,3 24,9 16,4 103,3 20,7 7,7
Общая площадь 65,9 65,0 68,4 68,7 63,9 331,9 66,4 2,1
Ишемическое поражение, % 29,2 17,6 45,7 36,3 25,7 31,1 11,9
гибель животного гибель животного гибель животного
УР028 Общая площадь поражения 1,7 12,2 9,5 14,3 37,7 9,4 5,5
Общая площадь 63,9 69,2 67,5 70,7 271,3 67,8 2,9
Ишемическое поражение, % 2,7 17,6 14,1 20,2 13,9 7,8
УР029 Общая площадь поражения 3,2 6,1 5,5 1,7 1,4 18,0 3,6 2,2
Общая площадь 66,1 67,7 64,7 60,6 60,1 319,1 63,8 3,4
Ишемическое поражение, % 4,9 9,1 8,6 2,8 2,3 5, 6 3,0
- 89 010860
Общая площадь
Ишеминие, %
Общая площадь
Общая площадь
ИшемиОбиая площадь
Общая площадь
ИшемиОбшая площадь поражеОбшая площадь
ИшемиОбщая площадь
ИшемипоражеОбщая площадь
Общая площадь
Ишеми- 90 010860
УР035 Общая площадь поражения 19,2 14,5 2,0 13,2 48,9 12,2 7,3
Общая площадь 66,7 63,0 65,5 62,9 258,1 64,5 1,9
Ишемическое поражение, % 28,8 23,0 3,0 21,0 19,0 11,1
УР036 Общая площадь поражения 20,8 15,5 16,8 12,5 27,0 92,5 18,5 5,6
Общая площадь 63,6 59,8 67,1 64,5 65,3 320,3 64,1 2,7
Ишемическое поражение, % 32,7 25,8 25,0 19,4 41,3 28,9 5,4
гибель животного гибель животного
УР037 Общая площадь поражения 6,0 6,7 21,1 16,5 14,3 3,9 68, 4 11,4 6,9
Общая площадь 63,1 67,9 68,7 70,0 69,1 65,2 404,1 67,4 2,7
Ишемическое поражение, % 9,5 9,8 30,7 23,6 20,6 6, 0 16, 9 10,5
УР038 Общая площадь поражения 32,1 29,5 21,3 1,7 94, 6 23,7 9,2
Общая площадь 76,5 73,4 71,6 67,7 289,2 72,3 3,7
Ишемическое поражение, % 41,9 40,2 29,8 17,3 32,3 11,4
гибель животного гибель животного
УР039 Общая площадь поражения 10,8 17,8 11,5 14,3 18,1 72,4 14,5 3,4
Общая площадь 63,7 63,4 62,3 67,5 62,3 319,2 63,8 2,2
Ишеми- ческое пораже- ние, % 16,9 28,0 18,4 21,2 29,0 22,7 4,9
УР039 Общая площадь поражения 20,6 18,3 17,8 20,2 76, 9 19,2 1,4
Общая площадь 75,4 70,8 68,6 72,1 286, 9 71,7 2,8
Ишемическое поражение, % 27,3 25,9 25,9 28,1 26,8 1,1
- 91 010860
Таблица 28. Контрольные животные. которым вводили физиологический раствор. В контрольной группе использовали 42 животных. Контрольную группу испытывали в течение того же периода времени. что и группы обработки. Группа. получавшая физиологический раствор. показала процент ишемического поражения. в среднем. 30.5 при стандартном отклонении 3.27. Эту группу использовали для получения р-значений. указанных в табл. 22 и 26.
Таблица 28
Животное № 1 2 3 4 5 6 7 Всего Сравн. знач. Контроль
Общая площадь поражения 4,27 18,66 20,30 32,36 75,59 18,90 11,51 60,89
Общая площадь 60,73 66,32 67,19 69,73 263,97 65,99 3,79 5,75
Ишемическое поражение, % 7,03 28,14 30,21 46,41 28,64 16,16 56,43
Общая площадь поражения 13,72 20,11 29, 90 63,73 21,24 8,15 38,36
Общая площадь 69,38 63,53 65,45 198,36 66,12 2,98 4,51
Ишемическое пораже- ние, % 19,78 31,65 45, 68 32,13 12, 97 40,37
Общая площадь поражения 15,51 20,43 31,30 29,30 0,00 96,54 24,14 7,44 30,83
Общая площадь 70, 38 66,39 70,15 66,39 68,50 273,31 68,33 2,24 3,28
Ишемипораже- ние, % 22,04 30,77 44,62 44,13 0,00 35,32 10,97 31,07
Общая площадь поражения 6,31 24,09 27,49 30,65 24,44 112,98 22,60 9,48 41, 97
Общая площадь 60,24 70,36 67, 33 69,67 65,64 333,24 66,65 4,05 6,07
- 92 010860
Ишеми- ческое пораже- ние, % 10,47 34,24 40,83 43,99 37,23 33,90 15,16 44,72
Общая площадь поражения 7,29 22,28 21,31 18,77 18,18 10,99 29,37 128,19 18,31 7,33 40,02
Общая площадь 57,30 63,10 61,66 66,36 67,65 67,82 69,02 452,91 64,70 4,21 6,51
Ишемическое поражение, % 12,72 35,31 34,56 28,29 26,87 16,20 42,55 28,30 10,48 37,03
Общая площадь поражения 7,29 22,28 21,31 18,77 18,18 87,83 17,57 5, 99 34,12
Общая площадь 57,30 63,10 61,66 66,36 67, 65 316,07 63,21 4,09 6,47
Ишемическое поражение, % 12,72 35,31 34,56 28,29 26,87 27,79 10,48 37,72
Общая площадь поражения 1,42 18,51 31,80 15,05 20,78 87,56 7,51 10,96 62,61
Общая площадь 67,60 69,25 71,23 67,19 69,73 345,20 69,04 1,60 2,32
Ишемическое поражение, % 2,09 26,73 44,64 22,40 29,80 25,13 15,36 61,10
Общая площадь поражения 13,72 20,11 29, 90 63,73 21,24 8,15 38,36
Общая площадь 69,38 63,53 65,45 198,3 6 66,12 2, 98 4, 51
Ишемическое поражение,· % 19,78 31, 65 45,68 32,37 12,97 40,06
Общая площадь поражения 17, 61 15,23 24,40 15,11 31,12 103,47 20, 69 6, 95 33,56
Общая площадь 65, 48 66,91 66,73 65, 94 68,56 333,62 66, 72 1,18 1,77
Ишемическое поражение, % 26,89 22,76 36,57 22,91 45,39 30,91 9,85 31,87
30,50 3,27 10,73

Claims (122)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1) взятие образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного,
1) взятие образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного,
1) взятие образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного,
1) взятие образца у находящегося в состоянии гибернации животного по состоянию на первое время,
1) взятие образца у находящегося в состоянии гибернации животного,
1) взятие образца у находящегося в состоянии гибернации животного,
1. Фракция плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, содержащая молекулу, где молекула обладает антиинфарктной активностью и где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 1-25 дней после начала гибернации.
2) взятие второго образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного,
2) взятие второго образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного,
2) взятие второго образца крови у находящегося в состоянии гибернации животного,
2) взятие второго образца у находящегося в состоянии гибернации животного по состоянию на второе время, где первое время и второе время являются разными,
2) взятие второго образца у находящегося в состоянии гибернации животного в другом подсостоянии,
2) взятие второго образца у находящегося в состоянии гибернации животного,
2. Фракция по п.1, где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 10-20 дней после начала гибернации.
3) сравнение молекул образца со вторым образцом,
3) сравнение молекул образца со вторым образцом,
3) сравнение молекул образца со вторым образцом,
3) сравнение молекул образца со вторым образцом,
3) сравнение молекул образца со вторым образцом,
3) сравнение молекул образца со вторым образцом,
3. Фракция по п.1, где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 14-16 дней после начала гибернации.
4) выделение молекулы образца, экспрессия которой отличается от экспрессии во втором образце,
4) выделение молекулы образца, экспрессия которой отличается от экспрессии во втором образце,
4) выделение молекулы образца, экспрессия которой отличается от экспрессии во втором образце,
4) выделение молекулы образца, экспрессия которой отличается от экспрессии во втором образце,
4) выделение молекулы образца, экспрессия которой отличается от экспрессии во втором образце,
4) выделение молекулы образца, экспрессия которой отличается от экспрессии во втором образце,
4. Фракция по п.1, где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 15 дней после начала гибернации.
5) исследование молекулы на антиинфарктную активность,
5) исследование молекулы на антиинфарктную активность,
5) исследование молекулы на антиинфарктную активность,
5) исследование молекулы на антиинфарктную активность,
5) исследование молекулы на антиинфарктную активность,
5) исследование молекулы на антиинфарктную активность,
5. Фракция плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающая молекулу, где молекула обладает антиинфарктной активностью, и где фракцию выделяют путем сбора крови первого животного, которое находится в ранней стадии гибернации, и где фракция не включает никакого количества крови второго животного, если второе животное находится в средней стадии гибернации.
6) идентификацию молекулы с антиинфарктной активностью, где образец крови берут в период, составляющий меньше чем или равный 25 дней до окончания гибернации, а второй образец крови берут в период, составляющий больше чем 25 дней после начала гибернации, но больше чем за 25 дней до окончания гибернации, и где антиинфарктная молекула присутствует в больших количествах в образце крови по сравнению со вторым образцом крови.
6) идентификацию молекулы с антиинфарктной активностью, где образец крови берут в период, составляющий меньше чем или равный 25 дней после начала гибернаци, а второй образец крови берут в период, составляющий больше чем 25 дней после начала гибернации, и где антиинфарктная молекула присутствует в больших количествах в образце крови по сравнению со вторым образцом крови.
6) идентификацию молекулы с антиинфарктной активностью.
6) идентификацию молекулы с антиинфарктной активностью.
6) идентификацию молекулы с антиинфарктной активностью.
6) идентификацию молекулы с антиинфарктной активностью.
6. Фракция плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, включающая молекулу, где молекула обладает антиинфарктной активностью и где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 1-25 дней до окончательного пробуждения животного.
7. Фракция по п.6, где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 10-20 дней до окончательного пробуждения животного.
8. Фракция по п.6, где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 14-16 дней до окончательного пробуждения животного.
9. Фракция по п.6, где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 15 дней до окончательного пробуждения животного.
10. Фракция плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, содержащая молекулу, где молекула обладает антиинфарктной активностью, и где фракцию выделяют путем сбора крови первого животного, которое находится в поздней стадии гибернации, и где фракция не включает никакого количества крови второго животного, если второе животное находится в средней стадии гибернации.
11. Способ по п.1, где антиинфарктная активность представляет собой церебральную антиинфарктную активность.
12. Способ по п.1, где антиинфарктная активность представляет собой кардиальную антиинфарктную активность.
13. Фракция плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, содержащая молекулу, где молекула индуцирует рециркуляцию мочевины и где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 1-25 дней после начала гибернации.
14. Фракция по п.13, где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 10-20 дней после начала гибернации.
15. Фракция по п.13, где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 14-16 дней после начала гибернации.
16. Фракция по п.13, где фракцию выделяют путем сбора крови животного через 15 дней после начала гибернации.
17. Фракция плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, содержащая молекулу, где молекула индуцирует рециркуляцию мочевины, и где фракцию выделяют путем сбора крови первого животного, где первое животное находится в ранней стадии гибернации, и где фракция не включает никакого количества крови второго животного, если второе животное находится в средней стадии гибернации.
18. Фракция плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, содержащая молекулу, где молекула индуцирует рециркуляцию мочевины и где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 1-25 дней до окончательного пробуждения животного.
19. Фракция по п.18, где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 10-20 дней до окончательного пробуждения животного.
20. Фракция по п.18, где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 14-16 дней до окончательного пробуждения животного.
21. Фракция по п.18, где фракцию выделяют путем сбора крови животного за 15 дней до окончательного пробуждения животного.
22. Фракция плазмы находящегося в состоянии гибернации животного, содержащая молекулу, где молекула индуцирует рециркуляцию мочевины, и где фракцию выделяют путем сбора крови первого животного, где первое животное находится в поздней стадии гибернации, и где фракция не включает никакого количества крови второго животного, если второе животное находится в средней стадии гибернации.
23. Способ очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающий:
24. Способ очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающий:
25. Способ очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающий:
26. Способ очистки молекулы, обладающей антиинфарктной активностью, включающий:
27. Способ по пп.23-26, где стадия сравнения образца и второго образца включает анализ экспрессии генов в образце и втором образце.
28. Способ по пп.23-26, где стадия сравнения образца и второго образца включает анализ экспрессии белков в образце и втором образце.
29. Способ по пп.23-25, где образец и второй образец получают из крови, мочи, спинальной жидкости или цереброспинальной жидкости, тканей, органов, клеток.
30. Способ по п.26, где образец и второй образец получают из мочи, спинальной жидкости или цереброспинальной жидкости, тканей, органов, клеток.
31. Способ по пп.23-26, где животное представляет собой млекопитающее.
32. Способ по п.31, где млекопитающее является сусликом, медведем, сурком, скунсом или летучей мышью.
33. Способ по пп.23-26, где образец крови получают от животного, находящегося в ранней стадии гибернации или поздней стадии гибернации.
34. Способ по пп.23-26, где второй образец крови получают от животного, находящегося в средней стадии гибернации.
35. Способ по п.33, где второй образец крови получают от животного, находящегося в средней стадии гибернации.
36. Способ по пп.23-26, где образец крови получают от животного через 1-25 дней после начала гибернации.
37. Способ по пп.23-26, где второй образец крови получают от животного через 26-60 дней после начала гибернации.
38. Способ по п.36, где второй образец крови получают от животного через 26-60 дней после начала гибернации.
39. Способ по пп.23-26, где стадия сравнения включает идентификацию дифференциально регулируемых молекул, где дифференциально регулируемые молекулы присутствуют в образце в количестве, отличном от второго образца.
40. Способ по п.39, где идентификация дифференциально регулируемых молекул включает фракционирование образца и второго образца.
41. Способ по п.40, где фракционирование происходит путем отбора молекул с молекулярной массой 10 кДа или меньше.
42. Способ по п.40, где фракционирование включает стадию разделения молекул в образце крови и втором образце по заряду, гидрофобности, гидрофильности, липофильности, скрученности, молекулярной массе, по методу аффинной хроматографии белков, пептидов или углеводов или по растворимости.
43. Способ по п.42, где аффинное разделение включает использование аГГ1-де1 Ы1ие хроматографии.
44. Способ по п.39, где идентификация включает анализ образцов методами ГХ-масс-спектроскопии,
45. Способ по п.44, где высокоэффективная жидкостная хроматография включает обращенно-фазовую хроматографию.
46. Способ по п.44, где гель-хроматография включает двумерный электрофорез на полиакриамидном геле.
47. Способ по п.39, где способ дополнительно включает очистку дифференциально регулируемых молекул с получением очищенной дифференциально регулируемой молекулы.
48. Способ по п.47, где способ дополнительно включает анализ антиинфарктной активности очищенной диференциально регулируемой молекулы.
49. Способ по п.48, где стадия анализа включает использование модели, вызванной ΜСΑΟ церебральной ишемии у мыши.
50. Способ по п.48, где антиинфарктная активность представляет собой церебральную антиинфарктную активность.
51. Способ по п.48, где антиинфарктная активность представляет собой кардиальную антиинфарктную активность.
52. Способ уменьшения инфаркта у субъекта, включающий введение субъекту ΡΡΑ.
53. Способ по п.52, где ΡΡΑ включает структуру, имеющую по меньшей мере 20% идентичности с 8ЕО ГО ΝΟ: 2, и где аминокислоты 8, 12 и 13 не изменяются.
54. Способ по п.53, где любое изменение по аминокислотам 7, 9 и 15 представляет собой консервативные замены.
55. Способ по п.52, где ΡΡΑ включает структуру, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с 8ЕО ГО ΝΟ: 2.
56. Способ по п.55, где любое отклонение от 8ЕО ГО ΝΟ: 2 представляет собой консервативную замену.
57. Способ по п.52, где ΡΡΑ включает аминокислоты, имеющие по меньшей мере 40% идентичности с аминокислотами 6-16 8ЕО ГО ΝΟ: 2, и где аминокислоты 8, 12 и 13 не изменяются.
58. Способ по п.57, где любое отклонение от аминокислот 7, 9 и 15 представляет собой консервативные замены.
59. Способ по п.52, где ΡΡΑ включает структуру, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с аминокислотами 6-16 8ЕО ГО ΝΟ: 2.
60. Способ по п.59, где любое отклонение от 8ЕО ГО ΝΟ: 2 представляет собой консервативную замену.
61. Способ по пп.52-60, где ΡΡΑ уменьшает размер инфаркта, который присутствует в модели ΜСΑΟ у мыши.
62. Способ по п.61, где инфаркт уменьшается по меньшей мере на 20%.
63. Способ по п.61, где инфаркт уменьшается по меньшей мере на 40%.
64. Способ по п.61, где инфаркт уменьшается по меньшей мере на 60%.
65. Способ по п.61, где инфаркт уменьшается по меньшей мере на 80%.
66. Способ по пп.52-60, где инфарктный коэффициент в модели ΜСΑΟ у мыши составляет по меньшей мере 1,1.
67. Способ по пп.52-60, где инфарктный коэффициент в модели ΜСΑΟ у мыши больше или равен 1,5.
68. Способ по пп.52-60, где инфарктный коэффициент в модели ΜСΑΟ у мыши больше или равен 2.
69. Способ по п.68, где коэффициент определяют, используя средние объемы инфарктного поражения.
70. Способ по п.69, где средний объем инфаркта в модели ΜСΑΟ у мыши меньше или равен 90%.
71. Способ по п.69, где средний объем инфаркта в модели ΜСΑΟ у мыши меньше или равен 70%.
72. Способ по п.69, где средний объем инфаркта в модели ΜСΑΟ у мыши меньше или равен 50%.
73. Способ по п.69, где средний объем инфаркта в модели ΜСΑΟ у мыши меньше или равен 30%.
74. Способ уменьшения инфаркта у субъекта, включающий введение субъекту композиции, включающей пептидную последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 34, 8ЕО ГО ΝΟ: 40, 8ЕО ГО ΝΟ: 41, 8ЕО ГО ΝΟ: 42, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 43, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 44, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 45, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 96-103, ΑνΚ или ТУК.
75. Способ по п.52, где ΡΡΑ имеет последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 29, 8ЕО ГО ΝΟ: 30, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 31, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 32, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 33, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 34, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 35, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 36, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 37, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 38, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 39, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 40, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 41, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 42, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 43, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 44, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 45, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 46, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 47, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 48, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 49, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 50, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 51 или 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 52, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 53, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 54, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 55, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 56, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 89, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 96-103, .ЛУК или ТУК.
76. Способ по п.52, где ΡΡΑ имеет последовательность, представленную в 8ЕО ГО ΝΟ: 46, 8ЕО ГО ΝΟ: 45, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 36, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 50, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 38, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 40 или 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 54, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 32, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 47, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 48, 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 52 или 8ЕЕ) ГО ΝΟ: 39.
77. Способ по п.52, где инфаркт представляет собой церебральный инфаркт.
78. Способ по п.52, где инфаркт представляет собой кардиальный инфаркт.
79. Способ уменьшения инфаркта у субъекта, включающий введение субъекту брадикинина.
80. Способ по п.79, где брадикинин включает структуру, имеющую по меньшей мере 60% идентичности с 8ЕЦ ГО NО: 57.
81. Способ по п.80, где любое отклонение от 8ЕЦ ГО NО: 57 представляет собой консервативные замены.
82. Способ по п.79, где брадикинин включает структуру, имеющую по меньшей мере 80% идентичности с 8ЕЦ ГО NО: 83.
83. Способ по п.80, где любое отклонение от 8ЕЦ ГО NО: 57 представляет собой консервативные замены.
84. Способ по п.79, где брадикинин не имеет основную аминокислоту на С-конце.
85. Способ по п.84, где основная аминокислота представляет собой Агд, Ьук или Н1к.
86. Способ по п.85, где брадикинин включает основную аминокислоту на Ν-конце.
87. Способ по п.86, где основная аминокислота представляет собой Агд, Ьук или Н1к.
88. Способ по п.79, где брадикинин включает основную аминокислоту на Ν-конце.
89. Способ по п.88, где основная аминокислота представляет собой Агд, Ьук или Н1к.
90. Способ по п.79, где брадикинин имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО NО: 57, 8ЕО ГО ΝΌ: 58, 8ЕО ГО ΝΌ: 59, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 60, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 61, 8ЕЕ) ГО \О: 62, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 63, 8ЕЕ) ГО ЫО: 64, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 65, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 66, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 67, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 68, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 70, 8ЕЕ) ГО \О: 71, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 72, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 73, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 75, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 77, 8ЕЕ) ГО \О: 80, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 81, 8ЕЕ) ГО ЫО: 82, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 83, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 84 или 8ЕЕ) ГО \О: 85.
91. Способ по п.79, где брадикинин имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО NО: 58, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 61, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 62, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 63, 8ЕЕ) ГО ЫО: 64, 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 77 или 8ЕЕ) ГО ΝΌ: 81.
92. Способ по п.79, где брадикинин имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО NО: 58.
93. Способ по п.79, где брадикинин имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО NО: 61.
94. Способ по п.79, где инфаркт представляет собой церебральный инфаркт.
- 94 010860
95. Способ по п.79, где инфаркт представляет собой кардиальный инфаркт.
- 95 010860 гель-хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, ГХ/М8/М8 масс-спектроскопии.
96. Способ получения антиинфарктной молекулы, включающий синтезирование антиинфарктной молекулы или варианта антиинфарктной молекулы, где антиинфарктная молекула может быть очищена способом, включающим:
- 96 010860
- 97 010860
97. Способ получения антиинфарктной молекулы, включающий синтезирование антиинфарктной молекулы или варианта антиинфарктной молекулы, где антиинфарктная молекула может быть очищена способом, включающим:
98. Способ идентификации антиинфарктной молекулы, включающий введение молекулы в модели МСАО у мыши, сравнение антиинфарктной активности молекулы с антиинфарктой активностью РРА в модели МСАО у мыши и отбор молекулы, если антиинфарктная активность молекулы составляет по меньшей мере 20% от активности РРА.
99. Способ уменьшения инфаркта у субъекта, нуждающегося в уменьшении инфаркта, включающий введение субъекту эффективного количества антагониста рецептора типа 2 ангиотензина II в фармацевтически приемлемой форме.
100. Способ по п.99, где инфаркт связан с инсультом.
101. Способ по п.99, где инфаркт связан с ишемией сердца.
102. Способ по п.99, где антагонист рецептора типа 2 ангиотензина II представляет собой брадикинин.
103. Способ по п.102, где брадикинин включает структуру, имеющую 60% идентичности с 8ЕЦ ГО ЫО: 57.
104. Способ по п.103, где любое отклонение от 8ЕО ΙΌ N0: 57 представляет собой консервативные замены.
105. Способ по п.102, где брадикинин включает структуру, имеющую 80% идентичности с 8ЕЦ ΙΌ N0: 83.
106. Способ по п.105, где любое отклонение от 8ЕЦ ΙΌ N0: 57 представляет собой консервативные замены.
107. Способ по п.102, где брадикинин не имеет основную аминокислоту на С-конце.
108. Способ по п.107, где основная аминокислота представляет собой Агд, Ьук или Н18.
109. Способ по п.108, где брадикинин включает основную аминокислоту на Мконце.
110. Способ по п.109, где основная аминокислота представляет собой Агд, Ьук или Н18.
111. Способ по п.102, где брадикинин включает основную аминокислоту на Мконце.
112. Способ по п.111, где основная аминокислота представляет собой Агд, Ьук или Н18.
113. Способ по п.102, где брадикинин имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 57,
8ЕО ΙΌ N0: 58, 8ЕО ΙΌ N0: 59, 8ЕО ΙΌ N0: 60, 8ЕО ΙΌ N0: 61, 8ЕО ΙΌ N0: 62, 8ЕО ΙΌ N0: 63, 8ЕО ΙΌ
N0: 64, 8ЕО ΙΌ N0: 65, 8ЕО ΙΌ N0: 66, 8ЕО ΙΌ N0: 67, 8ЕО ΙΌ N0: 68, 8ЕО ΙΌ N0: 70, 8ЕО ΙΌ N0: 71,
8ЕО ΙΌ N0: 72, 8ЕО ΙΌ N0: 73, 8ЕО ΙΌ N0: 75, 8ЕО ΙΌ N0: 77, 8ЕО ΙΌ N0: 80, 8ЕО ΙΌ N0: 81, 8ЕО ΙΌ
N0: 82, 8ЕО ΙΌ N0: 83, 8ЕО ΙΌ N0: 84 или 8ЕО ΙΌ N0: 85.
114. Способ по п.102, где брадикинин имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 58, 8ЕО ΙΌ N0: 61, 8ЕО ΙΌ N0: 62, 8ЕО ΙΌ N0: 63, 8ЕО ΙΌ N0: 64, 8ЕО ΙΌ N0: 77 или 8ЕО ΙΌ N0: 81.
115. Способ по п.102, где брадикинин имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 58.
116. Способ по п.102, где брадикинин имеет последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 61.
117. Способ по п.102, где инфаркт связан с инсультом.
118. Способ идентификации ингибитора взаимодействия между брадикинином и рецептором типа 2 ангиотензина ΙΙ, включающий контактирование клетки, экспрессирующей рецептор типа 2 ангиотензина ΙΙ, с предполагаемым ингибитором в присутствии брадикинина; определение количества брадикинина, связавшегося с рецептором типа 2 ангиотензина ΙΙ; где снижение связывания брадикинина с рецептором типа 2 ангиотензина ΙΙ указывает на присутствие ингибитора.
119. Способ идентификации ингибитора взаимодействия между брадикинином и рецептором типа 2 ангиотензина ΙΙ, включающий контактирование клетки, экспрессирующей рецептор типа 2 ангиотензина ΙΙ, с предполагаемым ингибитором в присутствии брадикинина, где рецептор типа 2 ангиотензина ΙΙ включает донор флуоресценции, где брадикинин включает акцептор флуоресценции; и измерение передачи энергии методом резонанса флуоресценции (ЕВЕТ), где уменьшение ЕВЕТ в сравнении с полученным значением ЕВЕТ в клетке, которая не контактировала с предполагаемым ингибитором, указывает на присутствие ингибитора.
120. Способ идентификации ингибитора взаимодействия между брадикинином и рецептором типа 2 ангиотензина ΙΙ, включающий контактирование клеточной системы с предполагаемым ингибитором, где клеточная система включает рецептор типа 2 ангиотензина ΙΙ, где клеточная система включает брадикинин, где рецептор типа 2 ангиотензина ΙΙ включает донор флуоресценции и где брадикинин включает акцептор флуоресценции; и измерение передачи энергии методом резонанса флуоресценции (ЕВЕТ) до контактирования клеточной системы с предполагаемым ингибитором и после контактирования клеточной системы с предполагаемым ингибитором, где уменьшение ЕВЕТ в клеточной системе, когда предполагаемый ингибитор находится в контакте с предполагаемым ингибитором, указывает на присутствие ингибитора.
121. Способ по пп.118-120, дополнительно включающий стадию испытания идентифицированного ингибитора в модели инфаркта ш νί\Ό и отбор молекул, которые уменьшают инфаркт в модели животного.
122. Способ по пп.118-120, где предполагаемый ингибитор обнаружен в библиотеке молекул.
EA200401032A 2002-02-06 2003-02-05 Антиинфарктные молекулы EA010860B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35467802P 2002-02-06 2002-02-06
US39213302P 2002-06-28 2002-06-28
US42927802P 2002-11-25 2002-11-25
PCT/US2003/003614 WO2003065997A2 (en) 2002-02-06 2003-02-05 Anti-infarction molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401032A1 EA200401032A1 (ru) 2005-12-29
EA010860B1 true EA010860B1 (ru) 2008-12-30

Family

ID=27739154

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401032A EA010860B1 (ru) 2002-02-06 2003-02-05 Антиинфарктные молекулы

Country Status (16)

Country Link
US (1) US7811992B2 (ru)
EP (3) EP2311852A1 (ru)
JP (2) JP2005532263A (ru)
KR (2) KR20040096554A (ru)
CN (1) CN1856504B (ru)
AT (1) ATE469167T1 (ru)
AU (1) AU2003209030B2 (ru)
BR (1) BR0307470A (ru)
CA (1) CA2475112A1 (ru)
DE (1) DE60332756D1 (ru)
EA (1) EA010860B1 (ru)
HK (1) HK1083202A1 (ru)
MX (1) MXPA04007586A (ru)
TW (1) TW200307554A (ru)
WO (1) WO2003065997A2 (ru)
ZA (1) ZA200407103B (ru)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7670833B2 (en) * 2002-08-08 2010-03-02 Biochain Institute, Inc. High throughput analysis for molecular fractions
EP1566183A1 (en) * 2004-02-20 2005-08-24 ZLB Behring GmbH Use of factor XIII for stimulating the perfusion of ischemic tissue
PL1750862T3 (pl) 2004-06-04 2011-06-30 Teva Pharma Kompozycja farmaceutyczna zawierająca irbesartan
CN101153054B (zh) * 2006-09-30 2012-02-22 北京市肿瘤防治研究所 用于血管生成治疗的小肽及其应用
WO2009043469A2 (en) * 2007-09-11 2009-04-09 Mondobiotech Laboratories Ag Use of pneumadin as a therapeutic agent
KR20100058548A (ko) * 2007-09-11 2010-06-03 몬도바이오테크 래보래토리즈 아게 치료제로서의 옥트레오티드의 용도
GB2476751B (en) * 2008-10-08 2013-08-07 Bedrock Inv S Llc Measuring shivering during therapeutic temperature control
BRPI1009569A2 (ru) * 2009-03-09 2016-03-22 Mitchell J Melling
US10786543B2 (en) 2015-09-22 2020-09-29 The Johns Hopkins University P75NTR antagonists and treatment of acute and chronic cardiac disease
WO2022261336A1 (en) * 2021-06-09 2022-12-15 Fauna Bio Incorporated Methods and compositions comprising functional genomics of hibernating mammals

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5767269A (en) * 1996-10-01 1998-06-16 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1601438A (ru) 1968-10-17 1970-08-24
SU798098A1 (ru) 1977-12-14 1981-01-23 Ордена Трудового Красного Знамениинститут Органического Синтезаан Латвийской Ccp Циклический аналог брадикинина,обла-дАющий СпОСОбНОСТью СОздАВАТь пРОлОНги-РОВАННый дЕпРЕССОРНый эффЕКТ B эКСпЕРиМЕН-TE ,A ТАКжЕ ВАСКул РНую пРОНи-цАЕМОСТь B эКСпЕРиМЕНТЕ
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
NO812612L (no) 1980-08-06 1982-02-08 Ferring Pharma Ltd Enzym-inhibitorer.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5834185A (en) 1986-10-28 1998-11-10 Johns Hopkins University Formation of triple helix complexes of single stranded nucleic acids using nucleoside oligomers which comprise pyrimidine analogs, triple helix complexes formed thereby and oligomers used in their formation
US5162497A (en) 1987-09-24 1992-11-10 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Bradykinin analogs with non-peptide bond
US5294533A (en) 1988-07-05 1994-03-15 Baylor College Of Medicine Antisense oligonucleotide antibiotics complementary to the macromolecular synthesis operon, methods of treating bacterial infections and methods for identification of bacteria
US5866701A (en) 1988-09-20 1999-02-02 The Board Of Regents For Northern Illinois University Of Dekalb HIV targeted hairpin ribozymes
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5624824A (en) 1989-03-24 1997-04-29 Yale University Targeted cleavage of RNA using eukaryotic ribonuclease P and external guide sequence
US5168053A (en) 1989-03-24 1992-12-01 Yale University Cleavage of targeted RNA by RNAase P
JP2507895B2 (ja) 1989-12-19 1996-06-19 工業技術院長 リボザイムの新規合成系
ATE139258T1 (de) 1990-01-12 1996-06-15 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5084824A (en) 1990-03-29 1992-01-28 National Semiconductor Corporation Simulation model generation from a physical data base of a combinatorial circuit
US5731424A (en) 1990-06-11 1998-03-24 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity TGFβ nucleic acid ligands and inhibitors
US6001988A (en) 1990-06-11 1999-12-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US6030776A (en) 1990-06-11 2000-02-29 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel SELEX
US5723289A (en) 1990-06-11 1998-03-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel selex
US5869641A (en) 1990-06-11 1999-02-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of CD4
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5861254A (en) 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
US5780228A (en) 1990-06-11 1998-07-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands to lectins
US5795721A (en) 1990-06-11 1998-08-18 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of ICP4
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5503978A (en) 1990-06-11 1996-04-02 University Research Corporation Method for identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase
US5846713A (en) 1990-06-11 1998-12-08 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HKGF nucleic acid ligands and inhibitors
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5476766A (en) 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5543293A (en) 1990-06-11 1996-08-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. DNA ligands of thrombin
US5135917A (en) 1990-07-12 1992-08-04 Nova Pharmaceutical Corporation Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides
US5612205A (en) 1990-08-29 1997-03-18 Genpharm International, Incorporated Homologous recombination in mammalian cells
US5271941A (en) 1990-11-02 1993-12-21 Cho Chung Yoon S Antisense oligonucleotides of human regulatory subunit RI.sub.α of cAMP-dependent protein kinases
ATE176239T1 (de) 1990-11-21 1999-02-15 Iterex Pharma Lp Synthese äquimolarer mischungen vielzähliger oligomere, speziell oligopeptidmischungen
US5683874A (en) 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
US6028186A (en) 1991-06-10 2000-02-22 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of cytokines
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
US5449754A (en) 1991-08-07 1995-09-12 H & N Instruments, Inc. Generation of combinatorial libraries
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
DE69233331T3 (de) 1991-11-22 2007-08-30 Affymetrix, Inc., Santa Clara Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5596079A (en) 1991-12-16 1997-01-21 Smith; James R. Mimetics of senescent cell derived inhibitors of DNA synthesis
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ATE140482T1 (de) 1992-04-28 1996-08-15 Univ Yale Gezielte spaltung von rna mittels eukaryontischer rnase p und externe führungssequenz
US5972699A (en) 1992-05-14 1999-10-26 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting herpes simplex virus replication
US5989906A (en) 1992-05-14 1999-11-23 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting P-glycoprotein (mdr-1-gene)
US6017756A (en) 1992-05-14 2000-01-25 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting hepatitis B virus replication
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
US5610054A (en) 1992-05-14 1997-03-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecule targeted against Hepatitis C virus
US5646020A (en) 1992-05-14 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hammerhead ribozymes for preferred targets
EP0653488B1 (en) 1992-07-02 2003-04-09 Sankyo Company Limited Looped, hairpin ribozyme
US5646042A (en) 1992-08-26 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. C-myb targeted ribozymes
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5652138A (en) 1992-09-30 1997-07-29 The Scripps Research Institute Human neutralizing monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus
US5721099A (en) 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5891684A (en) 1992-10-15 1999-04-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Base-modified enzymatic nucleic acid
US5807683A (en) 1992-11-19 1998-09-15 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
US5811300A (en) 1992-12-07 1998-09-22 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. TNF-α ribozymes
US5612215A (en) 1992-12-07 1997-03-18 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Stromelysin targeted ribozymes
JPH08505531A (ja) 1993-01-15 1996-06-18 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク Ｒｎａバイナリ・プローブとリボザイムリガーゼを用いたｒｎａ検定法
US5786138A (en) 1993-01-29 1998-07-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Hyperstabilizing antisense nucleic acid binding agents
DK0622119T3 (da) 1993-04-23 2000-04-10 Roche Diagnostics Gmbh System til forråd af testelementer
DE69420137T2 (de) 1993-06-03 1999-12-23 Therapeutic Antibodies Inc Herstellung von antikörperfragmenten
DE69425890D1 (de) 1993-06-04 2000-10-19 Us Health Verfahren zur behandlung von kaposi-sarcoma mit antisense-oligonukleotide
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US5962426A (en) 1993-06-25 1999-10-05 Yale University Triple-helix forming oligonucleotides for targeted mutagenesis
PT748382E (pt) 1993-09-02 2003-03-31 Ribozyme Pharm Inc Acidos nucleicos enzimaticos contendo nao-nucleotidos
US5712146A (en) 1993-09-20 1998-01-27 The Leland Stanford Junior University Recombinant combinatorial genetic library for the production of novel polyketides
CN1525171A (zh) 1993-10-01 2004-09-01 ŦԼ�и��ױ��Ǵ�ѧ���� 用标示物编码的多元组合化学库
US5861288A (en) 1993-10-18 1999-01-19 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Catalytic DNA
US5616466A (en) 1993-11-05 1997-04-01 Cantor; Glenn H. Ribozyme-mediated inhibition of bovine leukemia virus
US5578716A (en) 1993-12-01 1996-11-26 Mcgill University DNA methyltransferase antisense oligonucleotides
US5712384A (en) 1994-01-05 1998-01-27 Gene Shears Pty Ltd. Ribozymes targeting retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
US5641754A (en) 1994-01-10 1997-06-24 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Antisense oligonucleotide compositions for selectively killing cancer cells
US5683899A (en) 1994-02-03 1997-11-04 University Of Hawaii Methods and compositions for combinatorial-based discovery of new multimeric molecules
US5631359A (en) 1994-10-11 1997-05-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hairpin ribozymes
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5639647A (en) 1994-03-29 1997-06-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'-deoxy-2'alkylnucleotide containing nucleic acid
US5869248A (en) 1994-03-07 1999-02-09 Yale University Targeted cleavage of RNA using ribonuclease P targeting and cleavage sequences
AU690656B2 (en) 1994-03-11 1998-04-30 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
JPH09510711A (ja) 1994-03-23 1997-10-28 ザ ペン ステート リサーチ ファウンデーション 組合せライブラリー中の化合物を同定する方法
CA2185918A1 (en) 1994-04-05 1995-10-12 Genzyme Corporation Determination and identification of active compounds in a compound library
US5688997A (en) 1994-05-06 1997-11-18 Pharmacopeia, Inc. Process for preparing intermediates for a combinatorial dihydrobenzopyran library
US6017768A (en) 1994-05-06 2000-01-25 Pharmacopeia, Inc. Combinatorial dihydrobenzopyran library
US5595873A (en) 1994-05-13 1997-01-21 The Scripps Research Institute T. thermophila group I introns that cleave amide bonds
US5683902A (en) 1994-05-13 1997-11-04 Northern Illinois University Human papilloma virus inhibition by a hairpin ribozyme
US5580967A (en) 1994-05-13 1996-12-03 The Scripps Research Institute Optimized catalytic DNA-cleaving ribozymes
US5650316A (en) 1994-06-06 1997-07-22 Research Development Foundation Uses of triplex forming oligonucleotides for the treatment of human diseases
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5998193A (en) 1994-06-24 1999-12-07 Gene Shears Pty., Ltd. Ribozymes with optimized hybridizing arms, stems, and loops, tRNA embedded ribozymes and compositions thereof
US5633133A (en) 1994-07-14 1997-05-27 Long; David M. Ligation with hammerhead ribozymes
US5939268A (en) 1994-07-26 1999-08-17 The Scripps Research Institute Combinatorial libraries of molecules and methods for producing same
AU3222795A (en) 1994-08-09 1996-03-07 Ciba-Geigy Ag Antitumor antisense oligonucleotides
US5648331A (en) 1994-08-26 1997-07-15 G.D. Searle & Co. Method of inhibiting tissue ischemia and reperfusion injury
US5688670A (en) 1994-09-01 1997-11-18 The General Hospital Corporation Self-modifying RNA molecules and methods of making
US5989908A (en) 1994-09-12 1999-11-23 City Of Hope Modulation of drug and radiation resistant genes
US5599706A (en) 1994-09-23 1997-02-04 Stinchcomb; Dan T. Ribozymes targeted to apo(a) mRNA
US5856103A (en) 1994-10-07 1999-01-05 Board Of Regents The University Of Texas Method for selectively ranking sequences for antisense targeting
JPH08113591A (ja) 1994-10-14 1996-05-07 Taiho Yakuhin Kogyo Kk オリゴヌクレオチド及びこれを有効成分とする制癌剤
US5985356A (en) 1994-10-18 1999-11-16 The Regents Of The University Of California Combinatorial synthesis of novel materials
US6004617A (en) 1994-10-18 1999-12-21 The Regents Of The University Of California Combinatorial synthesis of novel materials
US6030917A (en) 1996-07-23 2000-02-29 Symyx Technologies, Inc. Combinatorial synthesis and analysis of organometallic compounds and catalysts
US6045671A (en) 1994-10-18 2000-04-04 Symyx Technologies, Inc. Systems and methods for the combinatorial synthesis of novel materials
US5603351A (en) 1995-06-07 1997-02-18 David Sarnoff Research Center, Inc. Method and system for inhibiting cross-contamination in fluids of combinatorial chemistry device
US5619680A (en) 1994-11-25 1997-04-08 Berkovich; Semyon Methods and apparatus for concurrent execution of serial computing instructions using combinatorial architecture for program partitioning
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US5688696A (en) 1994-12-12 1997-11-18 Selectide Corporation Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound
US5683873A (en) 1995-01-13 1997-11-04 Innovir Laboratories, Inc. EGS-mediated inactivation of target RNA
US5631146A (en) 1995-01-19 1997-05-20 The General Hospital Corporation DNA aptamers and catalysts that bind adenosine or adenosine-5'-phosphates and methods for isolation thereof
US5994320A (en) 1995-02-06 1999-11-30 Regents Of The University Of Minnesota Antisense oligonucleotides and methods for treating central nervous system tumors
US5958702A (en) 1995-02-06 1999-09-28 Benner; Steven Albert Receptor-assisted combinatorial chemistry
US5627210A (en) 1995-02-06 1997-05-06 Chiron Corporation Branched combinatorial libraries
IT1275862B1 (it) 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
US5770715A (en) 1995-03-22 1998-06-23 Toagosei Co., Ltd. Hammerhead-like nucleic acid analogues and their synthesis
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
US5834318A (en) 1995-05-10 1998-11-10 Bayer Corporation Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins
US5807754A (en) 1995-05-11 1998-09-15 Arqule, Inc. Combinatorial synthesis and high-throughput screening of a Rev-inhibiting arylidenediamide array
US5646031A (en) 1995-05-16 1997-07-08 Northern Illinois University SArMV and sCYMVI hairpin ribozymes
EP0833944B1 (en) 1995-06-07 2009-01-07 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands that bind to and inhibit dna polymerases
US5646285A (en) 1995-06-07 1997-07-08 Zymogenetics, Inc. Combinatorial non-peptide libraries
US6040296A (en) 1995-06-07 2000-03-21 East Carolina University Specific antisense oligonucleotide composition & method for treatment of disorders associated with bronchoconstriction and lung inflammation
US5891737A (en) 1995-06-07 1999-04-06 Zymogenetics, Inc. Combinatorial non-peptide libraries
US5693773A (en) 1995-06-07 1997-12-02 Hybridon Incorporated Triplex-forming antisense oligonucleotides having abasic linkers targeting nucleic acids comprising mixed sequences of purines and pyrimidines
US5958792A (en) 1995-06-07 1999-09-28 Chiron Corporation Combinatorial libraries of substrate-bound cyclic organic compounds
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5910408A (en) 1995-06-07 1999-06-08 The General Hospital Corporation Catalytic DNA having ligase activity
EP0839152B1 (en) 1995-06-21 2002-03-13 Martek Biosciences Corporation Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same
US5962337A (en) 1995-06-29 1999-10-05 Pharmacopeia, Inc. Combinatorial 1,4-benzodiazepin-2,5-dione library
US5877021A (en) 1995-07-07 1999-03-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. B7-1 targeted ribozymes
US5834588A (en) 1995-07-14 1998-11-10 Yale University (Cyanomethylene) phosphoranes as carbonyl 1,1-dipole synthons for use in constructing combinatorial libraries
NO953680D0 (no) 1995-09-18 1995-09-18 Hans Prydz Cellesyklusenzymer
WO1997014709A1 (en) 1995-10-13 1997-04-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Antisense oligomers
US5874443A (en) 1995-10-19 1999-02-23 Trega Biosciences, Inc. Isoquinoline derivatives and isoquinoline combinatorial libraries
ATE213019T1 (de) 1995-11-14 2002-02-15 Vimrx Holdings Ltd Chimäre oligomere mit einer rns- spaltungsaktivität
JPH11507245A (ja) 1995-11-21 1999-06-29 アイシーエヌ・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｉｌ―８およびｉｌ―８受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる睡瘍増殖の阻害
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US6031071A (en) 1996-01-24 2000-02-29 Biophage, Inc. Methods of generating novel peptides
WO1997029757A1 (en) 1996-02-15 1997-08-21 National Institutes Of Health Rnase l activators and antisense oligonucleotides effective to treat rsv infections
US5880972A (en) 1996-02-26 1999-03-09 Pharmacopeia, Inc. Method and apparatus for generating and representing combinatorial chemistry libraries
US5877162A (en) 1996-03-14 1999-03-02 Innovir Laboratories, Inc. Short external guide sequences
US5847150A (en) 1996-04-24 1998-12-08 Novo Nordisk A/S Solid phase and combinatorial synthesis of substituted 2-methylene-2, 3-dihydrothiazoles and of arrays of substituted 2-methylene-2, 3-dihydrothiazoles
US5709214A (en) 1996-05-02 1998-01-20 Enhanced Cardiology, Inc. PD2i electrophysiological analyzer
GB9610813D0 (en) 1996-05-23 1996-07-31 Pharmacia Spa Combinatorial solid phase synthesis of a library of benzufuran derivatives
GB9610811D0 (en) 1996-05-23 1996-07-31 Pharmacia Spa Combinatorial solid phase synthesis of a library of indole derivatives
US5792431A (en) 1996-05-30 1998-08-11 Smithkline Beecham Corporation Multi-reactor synthesizer and method for combinatorial chemistry
US5792613A (en) 1996-06-12 1998-08-11 The Curators Of The University Of Missouri Method for obtaining RNA aptamers based on shape selection
US5840500A (en) 1996-07-11 1998-11-24 Trega Biosciences, Inc. Quinoline derivatives and quinoline combinatorial libraries
US5955590A (en) 1996-07-15 1999-09-21 Worcester Foundation For Biomedical Research Conjugates of minor groove DNA binders with antisense oligonucleotides
AU4153497A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Eli Lilly And Company Combinatorial process for preparing substituted thiophene libraries
US5886127A (en) 1996-08-28 1999-03-23 University Of South Florida Combinatorial method of forming cascade polymer surfaces
US5886126A (en) 1996-08-28 1999-03-23 University Of South Florida Combinatorial method of forming cascade polymer surfaces
US5877214A (en) 1996-09-12 1999-03-02 Merck & Co., Inc. Polyaryl-poly(ethylene glycol) supports for solution-phase combinatorial synthesis
DE19639937C1 (de) 1996-09-27 1998-03-12 Siemens Ag Schaltungsanordnung mit zwischen Registern angeordneten kombinatorischen Blöcken
US5916899A (en) 1996-10-18 1999-06-29 Trega Biosciences, Inc. Isoquinoline derivatives and isoquinoline combinatorial libraries
US5874566A (en) 1996-10-25 1999-02-23 Hisamitsu Pharmaceutical Co. Inc. Il-15 triplex oligonucleotides
US6051698A (en) 1997-06-06 2000-04-18 Janjic; Nebojsa Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6025371A (en) 1996-10-28 2000-02-15 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US5945070A (en) 1996-10-31 1999-08-31 Merck & Co., Inc. Reaction vessel filter for combinatorial chemistry or biological use
US5972719A (en) 1996-11-05 1999-10-26 Pharmacopeia, Inc. Combinatorial hydroxy-amino acid amide libraries
US5965719A (en) 1996-11-15 1999-10-12 Sunsorb Biotech, Inc. Combinatorial synthesis of carbohydrate libraries
FR2756566B1 (fr) * 1996-12-04 1999-01-08 Fournier Ind & Sante Peptides agonistes du recepteur b2 de la bradykinine, procede de preparation et utilisation en therapeutique
US5859190A (en) 1997-02-04 1999-01-12 Trega Biosciences, Inc. Combinatorial libraries of hydantoin and thiohydantoin derivatives, methods of making the libraries and compounds therein
US5925527A (en) 1997-02-04 1999-07-20 Trega Biosciences, Inc. Tricyclic Tetrahydroquinoline derivatives and tricyclic tetrahydroquinoline combinatorial libraries
US5856107A (en) 1997-02-04 1999-01-05 Trega Biosciences, Inc. Combinatorial libraries of imidazol-pyrido-indole and imidazol-pyrido-benzothiophene derivatives, methods of making the libraries and compounds therein
US6046004A (en) 1997-02-27 2000-04-04 Lorne Park Research, Inc. Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones
US6045755A (en) 1997-03-10 2000-04-04 Trega Biosciences,, Inc. Apparatus and method for combinatorial chemistry synthesis
US5976894A (en) 1997-04-14 1999-11-02 Pharmacopeia, Inc. Combinatorial amide alcohol libraries
US5948696A (en) 1997-06-16 1999-09-07 Pharmacopeia, Inc. Combinatorial biaryl amino acid amide libraries
WO1998058058A1 (en) 1997-06-19 1998-12-23 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hammerhead ribozymes with extended cleavage rule
US6300483B1 (en) 1997-06-19 2001-10-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions inducing cleavage of RNA motifs
FR2765243B1 (fr) 1997-06-30 1999-07-30 Usinor Acier inoxydable austenoferritique a tres bas nickel et presentant un fort allongement en traction
JPH1142091A (ja) 1997-07-25 1999-02-16 Toagosei Co Ltd アンチセンス核酸化合物
US6046319A (en) 1997-10-22 2000-04-04 University Technologies International, Inc. Antisense oligodeoxynucleotides regulating expression of TNF-α
US6008321A (en) 1998-03-16 1999-12-28 Pharmacopeia, Inc. Universal linker for combinatorial synthesis
US6294519B1 (en) 1998-05-01 2001-09-25 University Of Kentucky Research Foundation Method for treating ischemia
NZ507775A (en) 1998-05-01 2003-04-29 Zymogenetics Inc Method for treating cytokine mediated hepatic injury using deltorphins
AU756200B2 (en) 1998-05-01 2003-01-09 University Of Kentucky Research Foundation, The Method for treating ischemia
US6007995A (en) 1998-06-26 1999-12-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of TNFR1 expression
US6013522A (en) 1999-02-23 2000-01-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of human Smad1 expression
JP2000262495A (ja) * 1999-03-18 2000-09-26 Kanagawa Acad Of Sci & Technol 哺乳動物の寿命の判定方法および哺乳動物の抵抗性の判定方法
US6025198A (en) 1999-06-25 2000-02-15 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Ship-2 expression
US6033910A (en) 1999-07-19 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of MAP kinase kinase 6 expression
US6815425B1 (en) 1999-10-22 2004-11-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Pharmaceutical composition containing pGLU-GLU-PRO-NH2 and method for treating diseases and injuries to the brain, spinal cord and retina using same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5767269A (en) * 1996-10-01 1998-06-16 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003209030B2 (en) 2009-02-05
EP2363405A1 (en) 2011-09-07
US7811992B2 (en) 2010-10-12
TW200307554A (en) 2003-12-16
CN1856504A (zh) 2006-11-01
CN1856504B (zh) 2010-12-29
KR20040096554A (ko) 2004-11-16
DE60332756D1 (de) 2010-07-08
AU2003209030A1 (en) 2003-09-02
KR20100094569A (ko) 2010-08-26
EP2311852A1 (en) 2011-04-20
EP1572168B1 (en) 2010-05-26
ATE469167T1 (de) 2010-06-15
BR0307470A (pt) 2006-12-19
MXPA04007586A (es) 2005-06-08
JP2005532263A (ja) 2005-10-27
US20030228371A1 (en) 2003-12-11
EA200401032A1 (ru) 2005-12-29
CA2475112A1 (en) 2003-08-14
ZA200407103B (en) 2006-10-25
WO2003065997A2 (en) 2003-08-14
WO2003065997A3 (en) 2005-09-22
EP1572168A2 (en) 2005-09-14
EP1572168A4 (en) 2008-01-09
JP2010202653A (ja) 2010-09-16
HK1083202A1 (en) 2006-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102066413B (zh) 用于预防和治疗组织损伤相关疾病和病症的组织保护肽和肽类似物
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
JP2010202653A (ja) 抗梗塞分子
JP2021534823A (ja) 抗ｂｃｍａ単一ドメイン抗体及びその適用
EP4035680A1 (en) Therapy for diabetes using stem cell migration agent
EA012567B1 (ru) Нуклеиновая кислота, кодирующая il-32, белок il-32, антитело к il-32 и способы применения белка и антитела
Kisilevsky et al. Pathogenesis of amyloidosis
JP2010099072A (ja) Ｇｂｓ毒素受容体
EP1622935A2 (en) Spex compositions and methods of use
JP2003523723A (ja) ヘルマンスキー−パドラック症候群タンパク質相互作用タンパク質およびその使用の方法
JPH07505524A (ja) Ｉｆｎ受容体認識因子，そのタンパク質配列および使用方法
AU2004230705A1 (en) Diagnosis of hyperinsulinemia and type II diabetes and protection against same
US20230128075A1 (en) Monoclonal antibodies targeting hsp70 and therapeutic uses thereof
AU2020368759A1 (en) Diabetes therapy targeting abnormal stem cells
CN111139299A (zh) Josd2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用
Towbin et al. Molecular genetics of cardiomyopathies and myocarditis
JPWO2006030802A1 (ja) Ｂａｆｆ抑制剤又は阻害剤のスクリーニング方法
Raskin SYMPOSIA S1
Fluman INVESTIGATING THE COUPLING MECHANISM IN THE E. COLI MULTIDRUG TRANSPORTER, MdfA, BY FLUORESCENCE SPECTROSCOPY
Mahajan Thrombin receptor interactions with creatine kinase: Energy for signal transduction
EP1089794A2 (en) Methods for inhibiting tef-3 activity
WO2001089555A1 (en) Compositions with anti-proliferative activities and methods for use thereof
JP2003274974A (ja) 薬物のスクリーニング方法
EP1187625A1 (en) Structure-based design of compounds that inhibit detrimental cytotoxic t lymphocyte responses
JP2002515873A (ja) 免疫寛容を誘起するペプチド組成物およびその利用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU