CN1856504A - 抗梗塞分子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于治疗缺血的一些组合物和方法，也公开了与冬眠各状态相关的一些分子。

Description

抗梗塞分子
本申请要求以2002年2月6日递交的序列号为No.60/354,678的美国临时申请、2002年6月28日递交的序列号为No.60/392,133的美国临时申请和2002年11月25日递交的序列号为No.60/429,278的美国临时申请为优先权。所述序列号为60/354,678、60/392,133和60/429,278临时申请均全部作为参考引入本说明书中。
技术领域
本发明涉及抗梗塞分子。本发明还涉及从冬眠动物中提取抗梗塞分子的方法。。
背景技术
在冬季的几个月中当食物减少时，生活于北温带的许多小型和中型哺乳动物会进入一个长期的和受控的冬眠状态。例如黄鼠、土拨鼠和老鼠等真正的冬眠动物通过在体内囤积大量脂肪的方式来为冬眠作准备。一些动物，例如土拨鼠还在其洞穴中储藏食物。当动物进入冬眠后，其生理状态发生改变。所述改变包括心率的降低、新陈代谢的改变和被唤醒的能力的改变。
本发明公开的是在冬眠中多个时间点对冬眠动物的状态进行评估的方法。本发明还公开的是，在冬眠早期和晚期发生唤醒事件，比冬眠中期发生唤醒事件时，冬眠中的动物更可能存活。此外也公开了以下事实，在大鼠模型中，冬眠早期而不是冬眠中期的动物血浆成分中含有可以影响缺血的分子，该分子可用于治疗缺血。而且，本发明为出所述分子包括FPA(血纤肽A)及其衍生物，和缓激肽及其衍生物。
发明内容
本发明公开了一些组合物和方法，其在某个方面上与用于鉴定感兴趣分子的状态依赖性方法有关。本发明还公开了一些组合物和方法，他们在某个方面上与具有抗梗塞和抗缺血特性的分子有关。
需要理解是，上文的概略描述和下文的详细描述均仅为例证性和说明性的，并不构成对本发明及权利要求的限制。
附图说明
附图属于本说明书并构成了说明书的一部分，附图与说明书一起对一些实施方案进行了解释，并用于阐述本发明的原理。
附图1为，在冬眠早期和晚期将成年和幼年美洲旱獭唤醒，对其心跳动力学和死亡率的影响。通过在动物仰卧时使其四肢伸展8分钟，在12月中旬和1月中旬将其唤醒。在1月中旬实施的所述刺激导致严重的心动过缓和完全唤醒，其中4只受试动物在6-12小时内全部死亡。在12月中旬实施的所述刺激则没有导致唤醒、心动过缓或死亡。
附图2显示了D2和NE2成分中的状态依赖性蛋白的鉴定结果，如双向(2D)SDS(十二烷基磺酸钠)凝胶中所示。图中上方两个方格显示了状态1(NE2)和状态2(D2，02)中的蛋白质，其中状态2的右上部分有状态1的覆盖图。在所述覆盖图中，状态1中的每个点只显示为一个高亮点，其周围为灰色至白色的空白区域。图中左下方的放大图是含有状态1覆盖图的状态2的32kDa(千道尔顿)区域(框内部分)的比较图，右下方的放大图是含有状态1覆盖图的状态2的66kDa区域(框内部分)的比较图。那些没有相关覆盖点的状态2中的点即为状态2依赖性的(如斜点线所示)。所述纯化的状态依赖性蛋白质的作用之一可见于附图1的中风模型中。pI(等电点)为4-7。
附图3显示了蛋白质点LC/MS/MS(液相色谱/质谱/质谱)的鉴定结果，感兴趣的点(画圈的)即为状态1NE2或状态2D2的特异性物质。所述感兴趣的点位于双向BATS凝胶中。BATS凝胶在敏感性和定量方面均不及双向SDS凝胶(见前图)，在pI 4-7的范围内只发现9个状态依赖性点(左侧泳道对的PI为4，右侧泳道对的PI为7)。
附图4显示了能够预防中风的D2特异性分子。在BATS凝胶上将D2条带与SA(一个对照)、NE2(与其最接近的对照)的条带进行比较，得到3个D2特异性分子(画圈的)。图上部的3张切片显示了小鼠在MCAO(中脑动脉梗塞)模型中的梗塞体积。只有含有功能性线粒体的组织吸收红色(深色)TTC(氯化三苯基四唑)(2％)染料。
附图5显示了状态依赖性双向凝胶的计算机比较结果。D2凝胶与最接近的对照例NE2进行了比较。CSF(脑脊液)和尿的凝胶(冬眠期的样品)与其夏季样品对照例进行了比较。所述3对凝胶均使用计算机对其中的点进行空间比对。每个点的银粒密度根据其所在的胶进行标准化，以校正流体容积中的浓度差异(即，设想每块凝胶中的总蛋白量是相同的)。然后，计算每个点对之间的差异。状态2(冬眠)中密度增加超过2倍的点显示为绿色。状态2中密度轻度增加的点显示为填充的黑色，所述点被认为是由未被标准化步骤所校正的浓度差异造成的。状态2中密度降低2倍或更多的点显示为亮色。那些在两种状态间没有密度改变的点显示为未填充的黑色轮廓线。
附图6显示了给中脑动脉梗塞小鼠注射D2的时间对其脑梗塞范围的影响。在1小时的中脑动脉梗塞之前2小时用D2预处理小鼠，其结果为无梗塞或梗塞程最小度(垂直条-SD[标准差])。D2注射时间的逐渐延迟导致了梗塞范围的逐步增加，但其作用是非线性的。使用8M(摩尔/升)尿素对D2进行透析以使蛋白质从白蛋白载体上脱离，同时使用截止值为10kDa的膜去除肽段，所述两种操作可以使在1小时时间点注射D2所产生的减小梗塞范围的作用显著提高。
附图7显示了LC/MS/MS测定的10kDa以下多肽的指纹。对冬眠早期(D2)和冬眠晚期(NE)进行比较，发现所述肽范围内的8个分子发生了改变。其中的一个被鉴定为血纤肽A。8个分子中的2个在冬眠晚期更为丰富(1301和2011)。
附图8显示了一个肽的分析结果：分子量为1620.9Da。
附图9显示了一个肽的分析结果：分子量为904.4Da。
附图10显示了一个肽的分析结果：分子量为904.4Da。
附图11显示了一个肽的分析结果：分子量为904.4Da-*RPPGFSPF。
附图12显示了FPA-h(人FPA)和其他分子成分治疗组的平均值和标准差。
附图13显示了对大鼠静脉注射D2或D01(20mg/kg)或白蛋白对照(Xeno，20mg/kg)后对其血液尿素循环率的影响。将每只动物在0时间点注射1mg双标记的尿素(少于总尿素的1％)。出现高于自然背景水平的单标记尿素只能解释为，双标记氮被切断后循环返回形成额外的单标记尿素。y轴代表随着时间，在每只大鼠中，相对于未标记尿素，有多少单标记尿素(摩尔成分的百分比)出现在自然单标记尿素的基线之上(超出部分)。在注射后3-6小时，D2和D01组与白蛋白组的平均差异具有统计学上的显著性(P＜0.025)。任何一次注射后的平均动脉血压均无改变。
附图14显示了小鼠发生短暂性缺血后FPAw(美洲旱獭FPA)的C(羧基)末端片段对梗塞体积的影响。全部小鼠在脑缺血1小时后实施24小时的再灌注。在缺血结束时，对动物不注射任何物质或静脉内注射载体(盐水)或FPAw的C末端片段(10mg/kg[毫克每千克])。第二天处死动物以测定梗塞体积。与不注射任何物质相比，C末端片段(I)和C末端片段(L)的p＜0.02；与注射盐水相比，C末端片段(I)的p＜0.004；与注射盐水相比，C末端片段(L)的p＜0.003。
附图15显示了小鼠发生短暂性缺血后FPAw的C末端片段对梗塞体积的影响。全部小鼠在脑缺血1小时后实施24小时的再灌注。在缺血结束时，对动物不注射任何物质或静脉内注射载体(盐水)或FPAw的C末端片段(10mg/kg)。第二天处死动物以测定梗塞体积。梗塞体积以立方毫米(mm3)为单位列出。
附图16显示了小鼠发生短暂性缺血后FPA对梗塞体积的影响。全部小鼠在脑缺血1小时后实施24小时的再灌注。在缺血结束时对动物静脉内注射载体(盐水)或FPA(0.625mg/kg、2.5mg/kg和10mg/kg)。第二天处死动物以测定梗塞体积。与对照相比，除了10mg/kg FPA的p＜0.0047以外，其余所有的值的p＜0.0001。
附图17显示了在小鼠发生短暂性缺血之前和之后施用D2对梗塞体积的影响。全部小鼠在脑缺血1小时后实施24小时的再灌注。在缺血结束之前或在缺血结束时对动物静脉内注射载体(盐水)或D2(5mg/kg)。第二天处死动物以测定梗塞体积。每只动物对应于一个梗塞体积。梗塞体积以立方毫米(mm3)为单位列出。
附图18显示了环[(N-ε-1-左旋赖氨酸，6-甘氨酸)-缓激肽]的分子式，其为缓激肽的一种环状变异体，其中，缓激肽N(氨基)末端的精氨酸被左旋赖氨酸取代，缓激肽第6位的丝氨酸被甘氨酸取代。该环由精氨酸的羰基和赖氨酸的ε氨基形成的肽键所闭合。
具体实施方式
在公开或描述本发明中的化合物、组合物、物质、设备和/或方法前，需要理解以下事实：除非另有说明，本发明中的组合物和方法不受限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法或特定试剂，这是因为所述物质或方法当然可能会发生改变。同样也需要理解的是，本发明所用的术语仅用于描述特定实施方案，并非用于限制其范围。
A.定义
缩写：MCAO，中脑动脉梗塞；TTC，氯化三苯基四唑；I.V.，静脉内；FPAw，美洲旱獭的血纤肽A序列；C末端片段(I)，第4位是异亮氨酸的血纤肽A的C末端片段；C末端片段(L)，第4位是亮氨酸的血纤肽A的C末端片段。
除非上下文明确指明，本说明书和所附权利要求中的单数形式“一个”、“一种”和“所述的”均包括复数形式。例如，“一种药用载体”包括两种或两种以上这样载体的混合物，依此类推。
在本发明中，范围可表示为从“大约”一个特定值和/或到“大约”另一个特定值。当这样一个范围被表述时，另一个实施方案包括从这一特定值和/或到另一特定值。相似地，当数值通过使用先行词“大约”来表述为近似值时，应当理解，所述特定值构成了另一个实施方案。应当进一步理解：每一个范围的端点对于与其他端点相关和独立于其他端点而言均十分重要。还应理解：本发明公开的数值除了表示该值本身以外，还表示该特定值的“大约””值。例如，如果公开了数值“10”，则“大约为10”也被公开。还应理解：当公开一个数值时，“小于或等于”该值、“大于或等于该值”和数值之间的可能范围也就被公开了，熟练的技术人员能够准确理解其含义。例如，如果公开了数值“10”，“小于或等于10”和“大于或等于10”也就被同时公开。还应理解：在本申请中，数据被表示为许多不同的形式，这些数据代表了终点、起点和任意数据点结合形成的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和“15”，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10或15以及10-15的范围也就被同时公开。
在本申请中引用了各种出版物。所述出版物整体引入本申请中作为参考，以更加详尽地描述本技术的状况。将所披露的参考文献中所包含的内容个别地并逐一地引入本发明并作为参考，所述内容在参考文献所依赖的句子中进行了讨论。
本发明公开了用于制备本发明组合物的组分，同时公开了使用本发明组合物的方法。本发明公开这些物质以及其他物质，应当理解，当这些物质的组合、子集、相互作用和群组等已经被披露，同时这些组分的各种个体、全体组合及排列没有被一一公开时，则每种情况均进行特定考虑和描述。例如，如果公开和论述了一种特定的FPA，以及论述了可对包括FPA在内的大量分子进行的多种修饰，除非有相反的启示，否则每一种可能的FPA与修饰的组合和排列均在预期之内。因此，如果公开了由分子A、B和C组成的类和由分子D、E和F组成的类，以及所述分子组合的一个例子A-D，则即使没有一一单独叙述，但是每一种个体的全体的预期的有意义的组合均应认为也是公开的，所述组合指A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。类似地，这些分子的任何子集或组合也应是公开的。因此，可认为例如A-E、B-F和C-E的亚组也是公开的。所述概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于所公开的化合物的制造和使用方法中的步骤。因此，如果还有可实施的多种额外步骤，则应理解每个所述额外步骤均可在所公开方法的任何特定实施方案或多个实施方案的组合中实施。
“选择的”或“选择地”指后续描述的事件或情况可能发生也可能不发生，也指包括对发生和没有发生所述事件或情况的实例的描述。
“引物”指探针的一个亚类，其能够辅助某些类型的酶促操作，也可以与靶核酸杂交，从而能够发生所述酶促操作。引物可以由本领域可获得的核苷酸、核苷酸衍生物或核苷酸类似物的任意组合而制得，其不会干扰酶促操作。
“探针”指通常能以序列特异性的方式与靶核酸相互作用的分子，所述方式例如杂交。核酸的杂交为本领域所熟知并在此论述。通常，探针可以由本领域可获得的核苷酸、核苷酸衍生物或核苷酸类似物的任意组合而制得。
B.组合物和方法
本发明公开的是与缺血相关的组合物和方法，所述缺血例如心脏缺血和脑缺血。本发明所公开的组合物和方法减轻了由于缺血事件所引发的梗塞。每年新发或再发的中风患者超过600,000人，其中1995年死亡数超过157,991人(每14.6个死亡者中有1个为中风患者)。到目前为止，有4,000,000名中风后的存活者，且这个数字还在持续增加中。在中风的起因中，80％是缺血，20％是出血。在美国，中风为排名第三的最常见的致死因素，并且是导致残疾的主要因素。局灶性脑缺血的结局和梗塞范围由缺血边缘区域的“坏死性”(类似坏死性(paraptosis))细胞的死亡和迟发性神经细胞的死亡来确定(程序性细胞死亡或凋亡)。近来出现了针对缺血性中风的治疗方法，但是所述治疗的效果并不足够好。
本发明公开了用于分离所需化合物的状态依赖性方法。本发明还公开了用于分离具有抗梗塞特性的化合物的状态依赖性方法。抗梗塞分子已经在冬眠动物的血液中被鉴定和分离出来，并在本发明中公开。
如本发明所公开的，可以理解一周龄冬眠动物的高死亡率与具有抗梗塞特性的分子相关。一周龄冬眠动物的死亡率很高，其在美洲旱獭的野外研究中高达77％(Noonan，R.Groundhog Mortality，WildlifeControl Technology，(9月)：1-2，2000，www.wctech.com/hbt.htm，2000)。幼年动物的死亡率高达77％，而成年动物的死亡率为30％(数据来自于标记后再捕获的野生动物)。据报道，使用标记后再捕获方法研究的成年动物的死亡率约为30％。入穴冬眠较晚、唤醒也较晚的体重较轻的幼年动物更不易于存活。通常认为棕色脂肪储量不足(即饥饿)是导致死亡的原因，但是这些死亡幼年动物尸检的结果始终显示其具有充足的脂肪。
1.冬眠的亚状态
当哺乳动物进入冬眠状态时必定发生许多生理变化，所述变化发生在冬眠开始时即发生，并如本发明所公开的，贯穿于整个冬眠期。例如，冬眠动物的心率必定降低，包括细胞复制在内的许多其他代谢功能也同时降低。此外，尿素循环必须发生改变以防止动物发生尿素中毒。因此，处于冬眠状态的和非冬眠状态的哺乳动物之间存在相对的差异。在此公开的还有哺乳动物的冬眠状态之间的差异。公开的方法可用于评估哺乳动物的冬眠状态之间的分子差异，而不仅仅只用于冬眠状态和非冬眠状态之间的分子差异。例如，处于冬眠早期和晚期的哺乳动物之间存在着生理差异和分子差异。可从例如生理、内分泌或行为的状态来描述冬眠状态(或亚状态)的特征。生理状态的一个例子是心率降低到正常生理范围之下；内分泌状态的一个例子是循环中血纤肽A相对升高；行为状态的一个例子是彻底唤醒处于迟钝状态的冬眠动物时，发生或不发生意外死亡。
可以将动物正常心血管功能状态发生降低时定义为“冬眠的开始”。所述降低的例子如动物的心率降至其正常静息心率的80％或以下。在某些实施方案中，当静息心率和降低的心率之间的差异具有统计学上的显著性时，就认为冬眠已经开始了，这样可以排除例如由睡眠造成的心率降低的干扰。p＜0.05即认为具有统计学上的显著性。在冬眠开始时，通常也会发生动物体温下降和动物卷曲身体至球状的现象。末期唤醒的特征是动物在冬眠后被唤醒而处于觉醒的状态，且不再重新进入晚期冬眠。也可将“末期唤醒”定义为在动物冬眠后其心率增加至正常水平的时间。在野外，动物通常在末期唤醒的时间开始离开其洞穴并去寻找食物。
需要理解的是，“冬眠的开始”定义了一个可用于标准化不同动物的时间点。本发明公开了以下事实，即在冬眠状态中，在不同时间从冬眠动物中获得的血浆成分存在差异。冬眠开始后以下天数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100天的亚状态已经被披露。末期唤醒前以下天数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100天的亚状态也已被披露。应当理解，冬眠开始后1天与冬眠开始后5天为不同的冬眠亚状态，而后者又与例如末期唤醒前1天是不同的亚状态。还应理解，包括冬眠开始后一段日期范围的亚状态也已被公开。例如，冬眠开始后第1天至第5天的日期范围可以是与第20天至第25天不同的亚状态。例如，抗梗塞分子浓度升高的亚状态由冬眠开始后1-30天、4-25天、10-20天或13-18天的亚状态所组成，抗梗塞分子浓度下降的亚状态由冬眠开始后30-60天、35-55天、40-50天或43-48天的亚状态所组成。冬眠开始后间隔为14天的亚状态或第一次取样后间隔为14天的亚状态也已被公开。例如，第1、14、28、42、56、70、84、98和/或112天，或第10、24、38、52、66、80、94、108和/或122天。其他公开的亚状态是指冬眠开始后的1秒、1分钟、1小时、1天、1个星期、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月的亚状态。
可将“冬眠早期”定义为冬眠开始后至冬眠中期前的一段时间。可将“冬眠中期”定义为冬眠早期后至冬眠晚期前的一段时间。可将“冬眠晚期”定义为冬眠中期后至末期唤醒的一段时间。
冬眠早期与某种状态相关，在所述状态中将动物从冬眠中唤醒，其发生心动过缓和死亡的几率较低(通常不发生死亡)。冬眠早期也与FPA和缓激肽的分泌增加(与冬眠中期相比)相关。例如，在冬眠早期，心血管动力水平降至低点(如，心率降至大约4秒一次)，体温降至约35℃-40℃。此外，正如本发明所公开，在冬眠早期，在参与循环的物质中，其中一些分子能够保护动物免遭缺血损伤并诱导尿素循环。
冬眠中期与某种状态相关，在所述状态中将动物从冬眠中唤醒，则发生心动过缓和死亡的几率较高。冬眠中期也与FPA和缓激肽的分泌降低相关(与冬眠早期相比)。因为所述两个亚状态在时间上是相关的，其开始也是彼此联系并与冬眠的开始和结束相关，因此日期也可以与“冬眠中期”这个集合性术语相关。
如本发明所述，冬眠中期通常也与冬眠动物保存能量相关，所述动物通过减少循环中分子的数量，包括能够保护动物免遭缺血损伤的分子的数量来保存能量。其他调节分子也极有可能在不为所知的情况下停止了。
“冬眠晚期”可被视为某种状态，在所述状态中相对于冬眠中期抗梗塞分子的量，包括FPA和缓激肽在内的抗梗塞分子的量增加，所述抗梗塞分子的量与冬眠早期类似。需了解例如分为早期、中期和晚期的各种冬眠状态，其在给定的一年内或在一只给定动物的冬眠循环中是不重叠的，但是在不同年份间是可以重叠的。例如，在一些年份中，冬眠期可能非常短以致于在12月上旬冬眠早期就结束了，而在其他年份中，冬眠期可能较长以致于在12月下旬冬眠早期才结束。例如，冬眠早期可被视为冬眠开始后15±15天，冬眠中期为冬眠开始后45±15天，冬眠晚期为冬眠开始后60±30天。
不同的亚状态也可由冬眠开始前的天数来定义。冬眠开始前的1-75天已经被公开。例如，在野外的某些动物中，食欲受抑制的现象一常常开始于10月的第一周，但在野外的全体动物中，通常观察到该现象是在冬眠开始前的11月中下旬的几周内出现。所述亚状态未显示与血纤肽A增加或唤醒引起的心动过缓相关。类似地，在冬眠早期分泌尿素循环分子，并通常在冬眠开始的1-21天出现，但是如果新陈代谢被关闭、尿素没有形成，就不会分泌所述分子。这样，冬眠可视为各种生理、化学和行为的亚状态的集合，所述亚状态暂时以重叠或非重叠亚时期的形式出现。
通常，通过考虑生理和行为事件，例如唤醒诱发的死亡，所述事件自然发生于或由实验手段引发于冬眠中的不同时间，在此公开了例如分泌状态等不同状态可用于描述血浆分子。一旦描述了不同状态，则可从例如冬眠早期和中期的两个不同状态中获得血浆或例如肌肉或神经组织等其他类型组织的样品，所述不同状态指根据冬眠开始后的时间进行描述，或例如对每个所述状态的生理情况的评估来进行描述。
然后，可用以下任何技术比较所述组织样品：GC(气相色谱)质谱、分离或凝胶色谱。然后，所述组织样品的分子组成的差异可用于评估与冬眠相关的或与任何其他生理特性相关的各种活性。然后，可对代表所述差异的分子作进一步处理，例如进一步纯化、合成制造或进一步研究其特征。
本发明公开这样的事实，即，例如美洲旱獭等处于冬眠中的动物在从冬眠中唤醒时遭受了严重的心血管应激。然而，冬眠中的动物在冬眠早期和晚期比中期能够更好地处理所述应激，所述冬眠早期、晚期和中期分别例如冬眠开始后的1-30天、60-90天和31-59天。使用本发明公开的技术，发现出现在冬眠早期和晚期例如美洲旱獭的冬眠动物血浆中的分子，能够帮助例如美洲旱獭的冬眠动物和其他动物处理从冬眠状态中唤醒的应激。所述分子在冬眠中期数量较少。两种所述分子是FPA及其衍生物，和缓激肽及其衍生物，以及每种分子的功能变异体。
本发明还公开，当将所述分子施用于患有动脉梗塞的动物时，能够减轻其梗塞程度。这样，可以将所述公开的组合物施用于与梗塞事件有关的受试对象，所述事件例如“中风”或“心脏病发作”。
本发明公开的方法可用于根据从冬眠动物中采集的成分的“状态依赖性”分子的比较结果来分离蛋白质和肽。这些生理上细微的状态依赖性差异被用于采集不同的分子成分，当使用蛋白质组的方法(例如，2D SDSPAGE(聚丙烯酰胺)凝胶电泳，LC/MS/MS串联质谱等)检测所述分子成分时，可以完成相关分子的分离和鉴定，所述相关分子在一个或另一个特定生物检测模型中具有主要作用，所述模型与冬眠生理和模型相关。
本发明公开了一些模型，其中一个模型是中风模型，例如啮齿动物的中风模型，其中，中脑动脉梗塞1小时后进行再灌注，之后对残余存活组织进行氯化三苯基四唑(TTC，1％)染色来检测梗塞范围。尽管能够保存检测物质的常用动物是啮齿动物，但是所述中风模型的变异体还包括任何脑动脉的部分或永久梗塞和所有种类的哺乳动物。在所述模型中，基于各种基本原理(例如，各种谷氨酸受体抑制物、肿瘤坏死因子抑制物等中的一种或另一种)，对多种化合物进行了检测。
如本发明所公开的，冬眠与睡眠相似，而睡眠也包括了一些微妙的亚状态。例如，睡眠可被分为同步脑电图状态的和非同步脑电图状态(EEG)两种状态。进一步的研究显示，在所述两个主要亚状态的基础生理状况之间存在相当大的差异。如本发明所公开的，冬眠与去同步化睡眠本身(例如，REM(快动眼)睡眠)类似，所述两个状态均与神经分泌、张力缺失和自律性张力缺失(包括交感和副交感神经分支)相关。这意味着也存在所述睡眠亚状态的亚状态。在猪心肌缺血模型中，在快动眼睡眠(REM sleep)状态期间，对改善猪心肌缺血模型的心室异位性搏动和致命性心律不齐的心脏疾病易患性具有显著的有益作用。由EEG标准确定的快动眼睡眠的开始与由ECG(心电图)标准确定的有益心血管作用的开始之间的潜伏期为20-30秒，该发现提示所述作用中具有神经体液机制。进一步的研究显示，对发生心律不齐的有益作用起源于额叶的神经活动，并由植物性神经系统传递到心脏(Skinner，J.E.，Reduction ofcardiac vulnerability during REM sleep in the pig，见《Sleep Disorder，Basic and Clinical Research》一书，由M.Chase和E.D.Weitzman编著，纽约：Spectrum Publications，1983，49-63页；Skinner，J.E.，J.Amer.Coll.Cardiol.，5：88B94B，(1985))，所述额叶是脑的一部分，其能够启动EEG同步化和睡眠(Skinner，J.E.，Douglis，F.M.，和Harper，R.M.Higher cerebral regulation of cardiovascular and respiratoryfunction，见《Principles and Practice of Sleep Medicine》一书，由M.H.Kryger，T.Roth和W.C.Dement.编著，W.B.Saunders Co.，27章，276-293页，1989)。由于快动眼维持时间很短，因此在该期间内从脑的间隙中采集所述分子被证明是十分困难的。因为快动眼是大脑的高度神经分泌状态，并伴随着植物性神经系统两个分支的关闭和肌张力缺失，所以人们对相似的脑状态进行了寻找并在冬眠的哺乳动物中发现了这种脑状态。后者预计将维持很长时，允许采集到足够的在非冬眠动物快动眼睡眠中所分泌的分子。
如本发明中所披露，伴有严重的心动过缓的冬眠中期的唤醒总是导致死亡；和2)冬眠早期和晚期的唤醒及其辅助性的心动过缓导致了成功的唤醒。
如本发明所公开的，因为冬眠中期出现的抗梗塞分子不足，所以无法克服该期间内因代谢要求产生的相对缺血，所述代谢要求由唤醒行为产生，所述相对缺血状态是由于没有得到循环(不适当的心动过缓)的足够支持。如本发明所公开的，从冬眠早期和晚期动物中采集的分子成分含有可以调节和产生能被成功唤醒而不发生死亡的分子，但是冬眠中期的分子则不具备所述功能。在啮齿动物的中风模型中，发现只有在冬眠早期和晚期的成分中才含有抗梗塞分子。采用各种蛋白质组技术(2D凝胶、LC/MS/MS)与冬眠中期分子成分进行差异比较，从而鉴定出了本发明所公开的抗梗塞分子。这个状态依赖性的纯化方法产生了9种蛋白质和5种肽，与冬眠中期相比，所述蛋白质和肽在冬眠早期被上调了。
如本发明所公开的，冬眠具有多个亚状态。也如本发明所公开的，将整个冬眠过程微妙地分割成多个亚状态是与神经分泌的不同情况相联系的。也如本发明所公开的，如果所述冬眠相关亚状态与缺血相关，则它们也通常出现在冬眠前的清醒时期。
本发明公开了可以导致食欲丧失的冬眠的亚状态依赖性神经分泌图。如本发明所公开的，对恰好在冬眠动物停止进食之前和之后采集的血浆成分进行比较，可以分离和鉴定在冬眠前清醒期间抑制食欲的特定分子。表15中显示了支持所述差异比较的可用数据。
表15.美洲旱獭的进食行为捕获了6只美洲旱獭并对其整个冬眠期进行了研究，从而获得下列观察结果。每日供应的食物为，1棵小胡萝卜，半只苹果，1片卷心菜叶，水不限量供应。在24小时后观察食物的消耗量；在将新鲜食物放入食物盘前，把笼子里未吃完的食物清空。
日期       在观察日中总结的动物进食行为
9月1日     每天，全部6只美洲旱獭吃掉了绝大部分食物。
10月1日    全部6只美洲旱獭吃掉了绝大部分食物；其中2只进食量明显减少，但还吃苹果。
11月1日    6只美洲旱獭中的2只吃掉了绝大部分食物；其中4只进食量明显减少，但还吃苹果。
11月30日   6只美洲旱獭中的2只吃掉了一些食物；3只仅吃了少许食物；1只仅吃了非常少的食物。
12月1日    清空所有食物，并不再打扰动物；根据24小时监视其活动性，发现1周内全部6只美洲旱獭均保持安静(即进入冬眠)。
公开了用于发现冬眠相关样品的状态依赖性成分中的分子的方法，其可用于研究冬眠动物的清醒和冬眠状态，所述冬眠相关样品指血浆、脑脊液、尿或其他生物分子组。
本发明公开了状态依赖性方法在搜寻冬眠相关分子中的用途。如本发明所公开的，分子，或部分或基本上纯化的分子成分中含有的分子与以下情况有关：1)预防中风时的脑损伤，2)预防心脏病发作时的心肌损伤，和3)在肾脏衰竭和任何其他情况下使血液中的尿素循环。
本发明公开了具有抗梗塞作用的FPA和FPA相关分子如与FPA具有同一性的分子。本发明公开了抗梗塞分子。如果在下游管腔完整的血管中(即，不是在受到切割的血管中)意外形成血栓，则在溶栓作用开始去除阻塞之前，下游组织将会遭受意外缺血。这种意外血凝块的例子与挫伤、低灌注压和定位血管梗塞等相关。由意外血凝块形成而导致的缺血损伤可由所释放的自由FPA片段或其变异体或其衍生物来弥补。如果由于血管被切开或切断导致FPA流到身体外部，则其对抗缺血的作用就会降低，但是如果循环是完整无损的，则在血凝块溶解和循环恢复之前，进入循环的未磷酸化的FPA可以发挥抗梗塞功能的选择性优势。
2.缺血
a)适度的神经和心脏保护机制
神经元可以通过过度活跃的兴奋过程对自身进行破坏，根据这一观察结果，在过去对缺血的保护性分子进行了寻找。一些谷氨酸及其受体参与了学习和记忆过程，所述过程似乎是导致过度兴奋的根本原因(Michaelis EK.Prog Neurobiol 1998，54(4)：369-15)。左旋谷氨酸是脊椎动物脑中最普遍的兴奋性递质系统，其除了具有突触递质的行为外，还对神经元的新陈代谢和生存能力造成了长期的改变。
通过激活形成离子通道和与G蛋白偶联来控制代谢的两类常见类型受体而产生所述作用。根据所述各种形式受体的药理学和生理学特征，定义了3类离子通道和3(组)代谢受体。目前鉴定出的所述受体的特定亚单位的基因已经超过25个，另5个蛋白质可能起受体亚单位或受体相关蛋白功能(所述蛋白质的序列可在Genbank中找到，并全部作为引用加入到本发明中)。目前的研究领域是所述蛋白质亚单位的表达调控、其在神经元和神经胶质膜上的定位和其在确定谷氨酸受体的生理特性过程中的作用。离子型受体和代谢型受体均与多种细胞内信使相偶联，所述信使例如Ca2+、环一磷酸腺苷(cAMP)和活性氧，所述偶联启动多个信号传导级联，其决定神经元的生长、分化和存活。Aarts等人发现具有一些抗梗塞活性的通过NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体起作用的两个小肽。见Aarts等，Scuence，298：846850，(2002)的文章，其中至少作为与抗梗塞分子相关的物质引入本发明作为参考(Lys-Leu-Ser-Ser-Ile-Glu-Ser-Asp-Val SEQ ID NO：104)(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg SEQ ID NO：105)。
上述关于左旋谷氨酸的发现引发了如下猜测，如果阻断一个或一个以上的谷氨酸受体或亚细胞偶联，则可能能够预防在缺血损伤中伴随谷氨酸大量增加而出现的兴奋性死亡。芦贝鲁唑(lubeluzole)是所述分子中的一种，其能够保证阻断刺激谷氨酸受体所引起的作用(Lesage AS等，J Pharmacol Exp Ther 1996，279：759-66)。然而在一个临床实验中显示，对中风发作后8小时的患者施用该物质进行治疗后其被证明是没有治疗作用的(Grotta J；Cerebrovasc Dis 2001，12：258-63)。其他具有中度效果的抗中风干预措施获得了另外几条证据的支持。一个内皮细胞粘附分子可能是造成中风和中风引起的坏死性细胞死亡的原因的最主要候选者。TNFα(肿瘤坏死因子α)通过一种称为神经酰胺的第二信使引起ICAM-1(细胞内粘附分子1)的上调，所述ICAM-1可以使单核细胞和巨噬细胞结合到小血管内壁的内皮细胞上(Ginis I等，Am J Physiol1999，276：C1171-83)。所述机制也表现了脑缺血的“预适应”现象(ChenY等，J Cereb Blood Flow Metab 2001，21：34-40)，由于能够在脑和心脏的梗塞模型中使组织存活，因此该现象非常具有吸引力。然而在一个小型临床实验中，发现使用鼠抗人ICAM抗体(Enlimomab)干预TNF-ICAM-单核细胞机制，却呈现否定结果(Furuya K等，Stroke 2001 11月；32(11)：2665-74)。
在心肌中首先研究的是预适应现象。先前经历过一次缺血(即“预适应”)可以在晚些时候由动脉结扎导致的缺血过程中，减小恢复后的梗塞范围。最初的研究显示心肌机制涉及到与腺苷受体相连的抑制性g蛋白(Hashimi MW等，Mol Cell Biochem 186：19-25)。由于早期的腺苷-gi-环化酶假说，预适应现象明显变得更为复杂。
预适应分为两个时期(Bolli R.The late phase of preconditioning，Circ Res 2000，87(11)：972-83)。持续2-3小时的早期预适应能够保护心肌免于梗塞损伤但却不能免除“昏厥”状态，与此不同，持续3-4天的晚期预适应则能够保护心脏组织免受梗塞和昏厥损伤。因此，这种长期作用可与临床应用具有更大的相关性。晚期预适应是一个多基因现象，其需要同时激活多个应激反应性基因。亚致命性缺血应激导致一些化学信号分子的释放(例如NO(一氧化氮)、活性氧和腺苷)，从而触发了信号传导事件的复杂级联。所述事件包括蛋白激酶C、Src蛋白酪氨酸激酶和核因子κB(NFκB)的激活，并在可诱导的NO合成酶、环加氧酶2、醛糖还原酶、锰过氧化物歧化酶和其他可能的心脏保护蛋白的合成增加中达到顶点。类似的次序可以被各种刺激触发，例如热应激、运动和细胞因子等。因此总的来说，晚期预适应是心脏对应激的普遍反应。需着重指出的是，临床相关制剂(例如，NO供体、腺苷受体激动剂、内毒素衍生物或阿片样物质受体激动剂)可以从药理学上再现晚期预适应的心脏保护作用。
然而，在脑和心脏中，预适应只具有中度的组织挽救作用，严重梗塞仍旧会表现出来。所述中度组织挽救作用，例如，在脑缺血前进行治疗，对TNF-ICAM通路的保护作用是25-35％(FuruyaK等，J Cereb BloodFlow Metab 2001，3：226-32；Dawson DA等，J Cereb Blood Flow Metab1999，6：616-23；和Nawashir H等，Brain Res 1997，778(2)：265-71)。
b)“昏厥”组织：100％恢复功能的机制
在20世纪80年代，对患有严重缺血性心脏病的患者实施血管再造手术后，发现缺血心脏组织的无收缩功能的恢复现象(Cooper HA，Braunwald E.，Coron Artery Dis 2001 12：387-92)。遭受短暂亚致命性损伤的心肌在经过一段时间后仍具有完全恢复的潜能，具有所述功能的心肌称为“昏厥”心肌。短暂的心肌昏厥状态通常见于冠状动脉搭桥手术后。
“冬眠”心肌类似于昏厥心肌，是由长期低灌注或反复昏厥造成的一种慢性状态。例如，当心绞痛患者的氧需求增加、缺血期延长时，会导致反复多次昏厥，这一系列事件最终形成了冬眠心肌。当肌细胞长期处于低灌注率的状态时，它们只是失去了收缩的能力，但是不会死亡也不会出现坏死性消融。一旦循环恢复，即使经历了数年的功能障碍之后所述细胞仍能够恢复其收缩特性。昏厥组织通常比冬眠组织能够更彻底地恢复，而且冬眠组织中常常含有坏死损伤形成的小岛。
昏厥心肌、冬眠心肌和预适应心肌之间的关系还不完全清楚(Futterman LG，Lemberg L.，Am J Crit Care 2000 9：430-6)，但是与经历脑缺血并改变了离子型和代谢型谷氨酸控制通路的作用类似，上述状态的心肌的分子生物学基础类似于多基因通路。被改变的分子动力学通路可能决定于特定的状态依赖性，所述状态依赖性出现于调整时期，其中包括种属差异(Kim SJ等，Circ Res 2001 10月，26；89：831-7)。
c)缺血模型
由于使用如tPA的组织型血纤维蛋白溶酶原激活物，将FDA(美国食品与药品管理局)批准的溶栓作用引入药物中，因此能够将中风和心脏病发作模型由血管长期梗塞变为短期梗塞。为了模仿接近医学实际的、介于梗塞发生和注射溶栓剂与候选药物之间的时期，在多数动物模型中梗塞时间从24小时减至1-2小时(即，疏通梗塞以模仿溶栓作用并在24小时后从组织学角度对组织损伤进行检测)。
在心脏缺血模型中，一个称为“预适应”的对照组常常被用来将新的候选药物与所述非药物保护作用进行比较。在“心脏预适应”过程中，每只动物都具有先前短期缺血的经历，该经历不会产生永久性的组织损害。有证据显示该生理保护性机制是与腺苷受体相关并且是由G蛋白介导的。
认为“预适应”的组织保护作用可能与“心脏昏厥”(非收缩组织的逆转)或“心脏冬眠”(非收缩组织的部分逆转)相关，所述组织保护作用在长期缺血再次发生后出现，例如在冠状动脉搭桥术中的同种异体移植(allographs)后出现。昏厥组织和冬眠组织的差异在于是否具有未逆转的组织功能障碍。
预适应控制通常只能保护最多达30-50％的组织，其明显低于具有限制梗塞范围作用的新药的预期作用。
据猜测即使短期血管梗塞也会产生一些不可逆的组织损害。例如，血管梗塞1小时可能产生梗塞区域边缘组织的可逆性组织损伤，但是某些中心组织已经无力逆转并最终坏死。
本发明公开的分子和成分可以在血管梗塞1小时的一些动物中(小鼠MCAO)产生100％的梗塞逆转效果，该效果包括梗塞中央核心区域的逆转，因此需要研究核心区域相对于外周区域损伤组织的逆转情况。在预先施用本发明公开的分子和成分的情况下，在血管梗塞1小时后，对所有动物在24小时时观察到的组织挽救效果为100％。使缺血持续时间为1小时，8小时后注射相关分子，该方法显示具有疗效。小鼠的注射剂量仅为大鼠的1/20，这可以使小鼠更能胜任于多种研究。
如本发明所公开的方法，其中检测步骤包括使用小鼠的脑MCAO模型和心肌缺血模型。如本发明所公开的方法，其中检测步骤包括使用冠状动脉梗塞的心肌缺血或脑缺血大鼠模型或任何其他动物模型，例如哺乳动物模型。如本发明所公开的方法，包括使用新血管形成的动物模型、老血管重塑的动物模型，在该模型中侧支吻合口增宽以灌注闭塞血管的远端，也包括使用再灌注损伤动物模型，在该模型中大量积累的缺血副产物进入远端缺血组织和/或渗透诱发的细胞器或膜损伤发生于缺血组织中，其中，由短暂心脏停搏(例如，心室纤维性颤动)或血流阻塞(例如，主动脉出口被夹)引起的全身缺血可以造成任何其他器官的缺血或全部器官和组织的缺血。还有各种其他模型附属于更加常规的缺血(血管闭塞)/梗塞(造成坏死)模型。例如，梗塞可由机械撞击引起的创伤造成，也可由蛇毒引起的凝血病造成，也可由其他因素造成。类似的缺血也可由特殊压缩物缓慢诱发，也可由在细小的终末血管中注入微球造成，也可由其他因素造成。而且，所述模型可由整体变异体进行调整，所述整体变异体例如基因敲除的变异体(例如，心肌受体缺失)、生物行为的变异体(例如，社会心理应激)等等。
C.组合物
本发明公开的组合物具有抗梗塞特性。本发明公开了一种状态依赖性方法，其中，从例如冬眠开始后6周的冬眠中期中采集的成分和例如冬眠开始后2周的冬眠早期中采集的成分中分离出的白蛋白成分(例如，亲和性蓝色凝胶柱)，显示在冬眠早期和中期中有9种蛋白质和5种肽呈现差异化的表达。所述白蛋白成分经过滤(截止值为10kDa)后分为蛋白质和肽的亚成分，在小鼠MCAO模型中测试后显示所述蛋白质和肽亚成分均具有抗梗塞作用。其中2种肽显示出差异化上调的特征，3种被LC/MS/MS鉴定为基质伪影。使用蛋白质组的“指纹识别”方法及从头测序，所述2种肽被鉴定为血纤肽A(FPA)和缓激肽。通过合成FPA的各种片段，在小鼠MCAO模型中系统地测试了FPA分子。如本发明所公开的，FPA的C末端固定区域是其活性片段，具有抗梗塞特性。合成的缓激肽和Des-Arg-Bradykinin(脱精氨酸的缓激肽)在小鼠MCAO模型中也具有抗梗塞特性。使用反相柱可以从D2与NE2的差异成分中鉴定出更多的肽(低于10kDa的截止值，LC/MS/MS)。
本发明公开的组合物可以通过使用本发明公开的状态依赖性方法分离出来，或者所述组合物与通过使用本发明公开的状态依赖性方法分离出的分子相关，或者所述组合物是这样的分子，其能够模仿通过本发明公开的状态依赖性特性而分离得到的某些分子的功能。本发明公开了一些对冬眠早期和冬眠中期进行比较的技术方法，该方法得到了9种状态差异性蛋白质。本发明也公开了一些状态依赖性方法，该方法可用于比较冬眠亚状态与冬眠亚状态之前和期间的许多不同分子。所述鉴定过程能够由2D凝胶电泳的分子方法和串联LC/MS/MS的蛋白质组方法完成。状态依赖性比较和分子鉴定可由许多其他分子技术完成，例如，特别是，基因列阵比较技术，以及一般地，适于鉴定特定状态依赖性分子的任何其他技术。
可以理解的是，当使用本发明公开的状态依赖性方法从动物中分离分子时，所述分子可以以不同的纯度水平来使用。例如，使用状态依赖性方法可以制造血浆，可以根据例如大小、电荷或疏水性的特性对其进行分离。所述的一个或全部步骤，或其他步骤，可用于提高样品的特异性活性。如本发明所公开的，监测得到的成分以观察活性，所述活性为例如大鼠或小鼠模型中的抗梗塞特性。可将例如血液等未经加工的生物物质首先制成血浆。而后血浆可用各种方法进行纯化。血浆可使用亲和基质(例如，Affi-Gel Blue)进行纯化，亲和基质可从其他基于血浆的物质中分离出白蛋白成分。而后可以使用许多方法纯化所述白蛋白成分，所述方法利用例如孔的大小、弯曲度、电荷、分子量、疏水性和/或溶解性的差异。
白蛋白成分可以根据大小进行分离，例如，通过分子筛或膜，其分子量的截止值例如是3.5kD、7kD、10kD、15kD、20kD、30kD、50kD、75kD、100kD、150kD或200kD。
1.冬眠动物的成分
本发明公开的具有抗梗塞特性的血浆成分是从例如美洲旱獭的冬眠动物中分离得到的，所述成分从冬眠开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或40天的冬眠动物中获得，或者从冬眠末期唤醒前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或40天的冬眠动物中获得。本发明公开的具有抗梗塞特性的血浆成分是从例如美洲旱獭的冬眠动物中分离得到的，所述成分从冬眠开始后1-25天、5-20天、10-18天或14天的冬眠动物中获得，或者从冬眠结束前2-6周、3-6周、4-6周或5周的冬眠动物或整个冬眠动物群体中获得。
本发明公开的血浆成分分离自冬眠中的动物。所述冬眠中的动物可以是任何冬眠中的动物。例如，所述冬眠中的动物可以是哺乳动物(例如，黄鼠、熊、美洲旱獭(土拨鼠)、旱獭、臭鼬和蝙蝠)、昆虫(例如，蚊子、黄蜂和蜜蜂)、鱼(例如，黑鱼)、爬行动物(例如，蛇和海龟)、两栖动物(例如，蛙)或鸟(例如，poorwill)。
本发明公开的血浆成分和分子是从那些在缺血开始后许多小时中具有抗梗塞作用的成分中鉴定出来的。例如，附图6中显示了缺血开始后6小时的阳性结果。在缺血开始后1小时注射经过透析的D2成分，使绝大部分受试个体的梗塞体积减小至零或最小。本发明公开的分子与美洲旱獭的FPA和人的FPA相同(附图8)。本发明公开的相关状态依赖性分子发现于啮齿动物中(美洲旱獭、大鼠和小鼠)，所述分子在例如人的其他物种中能够有效地预防中风。因为在缺血期间所述分子对于动物体的存活极其重要(例如，分娩时缺血、亚致命性运动中相对缺血、循环缺血和冬眠缺血等)，所以在进化过程中其可能在哺乳动物种类间具有功能上的保守性。
本发明公开的冬眠动物的血浆成分包含一种分子，其中，所述分子具有抗梗塞活性，所述成分从冬眠开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天采集的动物血液中分离得到。
本发明公开了一些成分，所述成分从冬眠开始后10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天采集的动物血液中分离得到，或者从冬眠开始后14、15或16天采集的动物血液中分离得到，或者从冬眠开始后15天采集的动物血液中分离得到。
本发明公开的冬眠动物的血浆成分包含一种分子，其中，所述分子具有抗梗塞活性，所述成分从第一只动物的血液中分离得到，所述第一只动物处于冬眠早期，但如果第二只动物处于冬眠中期，则所述成分不包括第二只动物的任何血液。
本发明公开的冬眠动物的血浆成分包含一种分子，其中，所述分子具有抗梗塞活性，所述成分从末期唤醒前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天采集的动物血液中分离得到。
本发明还公开了一些成分，所述成分从末期唤醒前10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天采集的动物血液中分离得到，或者从末期唤醒前14、15或16天采集的动物血液中分离得到，或者从末期唤醒前15天采集的动物血液中分离得到。
本发明公开的冬眠动物的血浆成分包含一种分子，其中，所述分子具有抗梗塞活性，所述成分从第一只动物的血液中分离得到，所述第一只动物处于冬眠晚期，但如果第二只动物处于冬眠中期，则所述成分不包括第二只动物的任何血液。
本发明公开了一些成分，其中，所述成分的抗梗塞活性是指脑的抗梗塞活性，所述成分的抗梗塞活性也指心脏抗梗塞活性或两者兼具。
本发明公开的冬眠动物的血浆成分包含一种分子，其中，所述分子能够诱导尿素循环，所述成分从冬眠开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天采集的动物血液中分离得到。
本发明公开了一些具有尿素循环活性的成分，其中，所述成分从冬眠开始后10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天采集的动物血液中分离得到，或者从冬眠开始后14、15或16天采集的动物血液中分离得到，或者从冬眠开始后15天采集的动物血液中分离得到。
本发明公开的冬眠动物的血浆成分包含一种分子，其中，所述分子能够诱导尿素循环，所述成分从第一只动物的血液中分离得到，所述第一只动物处于冬眠早期，但如果第二只动物处于冬眠中期，则所述成分不包括第二只动物的任何血液。
本发明公开的冬眠动物的血浆成分包含一种分子，其中，所述分子能够诱导尿素循环，所述成分从末期唤醒前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天采集的动物血液中分离得到。
本发明公开了一些成分，所述成分从末期唤醒前10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天采集的动物血液中分离得到，或者从末期唤醒前14、15或16天采集的动物血液中分离得到，或者从末期唤醒前15天采集的动物血液中分离得到。
本发明公开的冬眠动物的血浆成分包含一种分子，其中，所述分子能够诱导尿素循环，所述成分从第一只动物的血液中分离得到，所述第一只动物处于冬眠晚期，但如果第二只动物处于冬眠中期，则所述成分不包括第二只动物的任何血液。
2.纯化抗梗塞分子的方法
本发明公开的纯化具有抗梗塞活性分子的方法包括：1)从冬眠动物中采集样品，2)从冬眠动物中采集对照样品，3)比较样品和对照样品。
本发明公开的纯化具有抗梗塞活性分子的方法包括：1)从冬眠动物中采集样品，2)从冬眠动物中采集第二份样品，3)比较样品和第二份样品。
本发明公开的纯化具有抗梗塞活性分子的方法包括：1)从冬眠动物中采集样品，2)从处于不同亚状态的冬眠动物中采集第二份样品，3)比较样品和第二份样品。
本发明公开的纯化具有抗梗塞活性分子的方法包括：1)在第一个时间从冬眠动物中采集样品，2)在第二个时间从冬眠动物中采集第二份样品，其中第一个时间和第二个时间是不同的，3)比较样品和第二份样品。
本发明公开的纯化具有抗梗塞活性分子的方法包括：1)从冬眠动物中采集血液样品，2)从冬眠动物中采集第二份血液样品，3)比较血液样品和第二份血液样品。
本发明公开了一些方法，其中，比较样品和第二份样品的步骤包括检测样品和第二份样品的基因表达；本发明还公开了一些方法，其中，比较样品和第二份样品的步骤包括检测样品和第二份样品的蛋白表达。
本发明公开了一些方法，其中，样品和第二份样品采自血液、尿液、脊髓液或脑脊液、组织、器官或细胞。
本发明公开了一些方法，其中，动物是哺乳动物，例如黄鼠、熊、美洲旱獭、旱獭、臭鼬或蝙蝠。
本发明公开了一些方法，其中，血液样品采自处于冬眠早期或晚期的动物。
本发明公开了一些方法，其中，第二份样品采自处于冬眠中期的动物。
本发明公开了一些方法，其中，样品采自冬眠开始后1-25天的动物。
本发明公开了一些方法，其中，第二份样品采自冬眠开始后26-60天的动物。
本发明公开了一些方法，其中，比较步骤包括鉴定经差异调节的分子，与第二份样品相比，所述经差异调节的分子在样品中的存在量不同。
本发明公开了一些方法，其中，鉴定经差异调节的分子的方法包括对样品和第二份样品进行分离。
本发明公开了一些方法，其中，通过采集小于或等于10kDa的分子来进行分离。
本发明公开了一些方法，其中，分离方法包括根据电荷，疏水性，亲水性，亲脂性，弯曲度，分子量，蛋白质、肽或碳水化合物亲和层析或溶解性的不同从血液样品和第二份样品中分离分子的步骤。
本发明公开了一些方法，其中，亲和分离方法包括使用Affi-GelBlue层析。
本发明公开了一些方法，其中，鉴定方法包括使用GC质谱、凝胶层析、高效液相色谱或LC/MS/MS质谱来分析样品，在所述分析过程中使用标准步骤(液相色谱与质谱串联)。
本发明公开了一些方法，其中，高效液相色谱包括反相色谱；本发明还公开了一些方法，其中凝胶层析包括双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。
本发明公开了一些方法，其中，所述方法还包括纯化经差异调节的分子以得到纯化的经差异调节的分子。
本发明公开了一些方法，其中，所述方法还包括检测纯化的经差异调节的分子的抗梗塞活性。
本发明公开了一些方法，其中，检测步骤包括使用脑缺血的小鼠MCAO模型。本发明还公开了一些方法，所述方法使用新生血管形成模型、血管重塑模型和再灌注模型，及用于全身缺血实验中。
本发明公开了一些方法，其中，抗梗塞活性指脑的抗梗塞活性；本发明还公开了一些方法，其中抗梗塞活性指心脏的抗梗塞活性。
3.血纤肽A(FPA)
a)FPA分子的结构
FPA是可溶性纤维蛋白原的片段，其由凝血酶切割纤维蛋白原而释放出来。凝血酶(IIa)催化切割可溶性纤维蛋白原(Fbg)而形成纤维蛋白(Fbn)，所述过程是血液凝固级联中的最终的蛋白分解事件。所述可溶性Fbn单体自发多聚化形成不可溶的Fbn网络，该Fbn网络通过被凝血因子XIIIa催化的a和g链上的赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)残基的交联而得到稳定。所述Fbn网络是止血栓的主要蛋白成分。
血浆纤维蛋白原是在肝脏中合成的分子量约为340,000kd的一种糖蛋白。其在动物血液循环中的浓度为2.6mg/ml。其为由二硫键连接的二聚物，所述二聚物包括3对二硫键连接的不同多肽链(Aa、Bb和g)。
FPA是Aa链的N末端，其含有凝血因子XIIIa的交联位点和2个磷酸化位点。Fbg在合成后通常是完全磷酸化的，但是在循环中的Fbg只被磷酸化20-30％。在R16-G17位置切割而释放FPA的过程产生FbnI，并暴露出了Aa链的多聚化位点(17-20)。所述区域与Fbn的D结构域的互补区域结合，从而形成原纤维。随后，IIa从Bb链上切割FPB(R14-G15)，从而暴露了更多的多聚化位点，而且促进了Fbn网络向侧方生长。因而，FPA通常由N末端氨基酸与凝血酶切割位点之间的肽链组成，所述切割位点通常在R-G位置。因此，定义FPA的一种方法就是采用凝血酶的切割位点来定义，这样，所述定义方法是一种相关系统。通常是切割位点N末端方向的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。因此，一种讨论FPA相对位置的方式就是讨论切割位点的位置，例如，切割位点N末端方向的3个氨基酸，或切割位点N末端方向的7个氨基酸。例如，美洲旱獭FPA的AEG序列分别是切割位点末端方向的7、6和5个氨基酸。
通过例如凝血酶的方法已经解决并模拟了包括FPA在内的纤维蛋白原的结构(Martin，P.D.等，J Biol Chem 267第7911页(1992)；Stubbs，M.T.等，Eur J Biochem 206第187页(1992)；Martin，P.D.等，Biochemistry 35第13030页(1996)；Malkowski，M.G.等，Biochem J326第815页(1997))。所述结构可用于寻找保留FPA功能的FPA及变异体的结构模拟物，所述功能为例如抗梗塞特性。例如，与FPA亚区域接触的凝血酶序列是已知的(例如，GEFLAEGGGV)。已知所述亚区域具有抗梗塞特性。这样，通过用凝血酶建模并与已知凝血酶亚区域的触点比较来分离得到所述亚区域的模拟物，所述已知凝血酶亚区域与感兴趣的亚区域一致。预期以类似的方式与凝血酶结合的分子具有与人FPA和人FPA片段相同的特性，这是因为在已知的FPA凝血酶结合实验中所述分子具有等效性，所述特性例如抗梗塞特性。如本发明所公开的，所述信息也可与组合化学技术和筛选步骤结合，以分离得到具有FPA特性的分子。例如，在某些类型的结合实验中一些分子可以与凝血酶结合，而后所述分子可能竞争不过FPA或其片段。在所述竞争性结合实验中采集到的分子将会产生具有类似于FPA结合特性的分子，FPA具有相似的功能特性，例如抗梗塞活性。
根据对所讨论的本发明的理解，FPA有多种序列。例如，可以从各种不同的动物中采集到FPA的多种序列。也可从冬眠动物中采集到多种序列。表1中列举了从各种不同动物中采集到的一些FPA序列。可以对所述序列进行比较，使用标准技术可以从任何序列中得到在此处讨论的同一性百分数。此外，使用此处讨论的技术可以获得共有序列。可以理解的是，本发明公开的可用于得出同一性百分数的序列之间的任何比较结果与特定的同一性一起被特定地公开了。例如，人和美洲旱獭在15个位点中有4个是不同的。由此，人和美洲旱獭FPA的同一性为74％。也可以理解的是，也可比较特定片段的同一性。例如，在人与美洲旱獭之间，离切割位点最近的含有10个氨基酸的片段(GEFLAEGGGV)中只有1个氨基酸不同，因此在这个片段上，人与美洲旱獭之间的同一性为90％。所述类型的分析可用于任何FPA序列。
如本发明所公开的，人FPA能够在大鼠模型中起作用。人和大鼠FPA的15个氨基酸中的11个氨基酸不同，同一性为13％。然而需指出的是，位点3、4和8是高度保守的，在大鼠中也同样保守。这样，在本发明公开的序列中，保留切割位点N末端方向的3、4和8位点分别为G(甘氨酸)、G和F(苯丙氨酸)，但是其他位点可能发生改变。本发明公开的下列特定FPA衍生物可在小鼠MCAO模型中测试：表1提供了许多FPA序列。所述序列在位点1-5之间有变异，在位点6-10之间变异较少，在位点11-16之间具有100％的同源性。
剂量可通过例如以下方式确定，如果血浆的有效剂量为5mg/kg，则药效团(pharmocaphore)的剂量为其1/1000，即0.005mg/kg。des-Arg-BK的起效剂量为0.005mg/kg。
表1
  序列   来源   SEQ ID NO(序列号)：
  可变保守区域(N末端至C末端)   活性％   q
  ADTDK   GEFLAEGGGVR   美洲旱獭   1
  ADSGE   GDFLAEGGGVR   人   2
  TDTEDK  GEFLSEGGGVR   小鼠   3
  ATGTT   SEFIEAGGDIR   大鼠   4
  TDPDADE GEFLAEGGGVR   单峰驼   5
  TDPDADK GEFLAEGGGVR   羊驼   6
  AEVQDK  GEFLAEGGGVR   猪   7
  TKTEE   GEFISEGGGVR   驴   8
  TKDE    GTFIAEGGGVR   袋鼠   9
  EDGS    GEFLAEGGGVR   水牛   10
  ADTGE   GEFLAEGGGVR   长臂猿   11
  TKATE   GEFLAEGGGVR   貘   12
  ADDSDPVGGEFLAEGGGVR   山羊   13
  ADGSDPASGEFLTEGGGVR   麂   14
  ADTGD   GDFITEGGGVR   鬼狒   15
  TEEGE   FLHEGGGVR   马   16
  ADGSDPAGGEFLAEGGGVR   驼鹿   17
  TDTKESD FLAEGGGVR   灰海豹   18
  TKTE    GSFLAEGGGVR   袋熊   19
  TNSKE   GEFIAEGGGVR   狼   20
  TNSKE   GEFIAEGGGVR   狗   21
  SDPAG   GEFLAEGGGVR   鹿   22
  TETTE   GDFIAEGGGVR   犀牛   23
  EDGSDPPSGDFLTEGGGVR   牛   24
  ADTGE   GDFLAEGGGVR   猕猴   25
  VDPGEST FIDEGATGR   兔   26
  TDGKE   GEFIAEGGGVR   熊   27
  AQDGK   TTFEKEGGGGR   小鸡   28
          GEFLAEGGGVR   13.4   合成物   89
          GEFLAEGGGV   27.8   合成物   29
          GEFLAEGGG   27.2   合成物   30
          GEFLAEGG   22.9   合成物   31
          GEFLAEG   17.5   合成物   32
          GEFLAE   28.7   合成物   33
  GEFLA   27.3   合成物   34
  EFLAEGGGVR   26.2   合成物   35
  FLAEGGGVR   14.1   合成物   36
  LAEGGGVR   28.4   合成物   37
  AEGGGVR   15.6   合成物   38
  EGGGVR   19.9   合成物   39
  EFLAE   16.4   合成物   40
  FLAEG   22.2   合成物   41
  LAEGG   25.8   合成物   42
  AEGGG   36.8   合成物   43
  EGGGV   31.1   合成物   44
  GGGVR   13.9   合成物   45
  AEFLAEGGGVR   5.6   合成物   46
  GAFLAEGGGVR   18.3   合成物   47
  GEALAEGGGVR   18.7   合成物   48
  GEFAAEGGGVR   22.4   合成物   49
  GEFLGEGGGVR   15.4   合成物   50
  GEFLAAGGGVR   21.8   51
  GEFLAEAGGVR   19.0   52
  GEFLAEGAGVR   28.9   53
  GEFLAEGGAVR   16.9   54
  GEFLAEGGGAR   32.3   55
  GEFLAEGGGVA   24.8   56
  AEFLAEGGGPR   VP067   96
  GEFLAEGGGPR   VP068   97
  AEGGGPR   VP069   98
  GGGPR   VP070   99
  FEFLAEGGGVR   VP071   100
  AGGGVR   VP072   101
  FGGVR   VP073   102
  AGVR   VP074   103
  AVR   VP075
  FGVR   VP076   104
  FVR   VP077
将被切割底物中的氨基酸残基标记为P1、P2、P3或P4等，所述标记从切开的化学键向N末端方向算起。切割发生于P1和P1’之间，其中，P1由FPA分子中的精氨酸组成，P1’指原始纤维蛋白原分子中所述精氨酸的C末端方向的氨基酸。
b)FPA和血栓形成
FPA是凝结反应的一种副产物分子，在凝血酶与纤维蛋白原相互作用时产生了不溶的纤维蛋白(一种血凝块)和自由FPA。自由FPA通常被认为是纤维蛋白形成的良好的标志物(Ottani F，Galvani M.，Clin ChimActa 2001年9月15日；311(1)：33-9)。FPA位于纤维蛋白原分子的N末端，纤维蛋白原被切割后导致血凝块的形成。当FPA与纤维蛋白原接触时，如果凝血酶锚定在FPA的可变区，则凝血反应就会发生。第3位丝氨酸发生磷酸化可以帮助发生所述锚定作用(Maurer MC等，Biochemistry1998年4月28日；37(17)：5888-902)。一旦FPA被切割下来，暴露出的残余纤维蛋白原的肽键与其他纤维蛋白原分子暴露的肽键交联，从而形成了纤维蛋白长链，其中，可以检测FPA的水平并将其用作临床疾病状态的标志。发生急性心肌梗塞的患者中FPA增加，FPA的增加也与凝血因子XI和IX的激活相关，所述两种凝血因子参与纤维蛋白原的凝血酶激活过程(Minnema MC等，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000年，11月；20(11)：2489-93)。因子XII通过帮助从纤维蛋白原上切下FPA而导致血液凝结(Zito F等，Circulation 2000年10月，24；102(17)：2058-62)。凝血酶原片段(f1.2)的增加与心脏和脑中的FPA及缺血事件有关(CoteR等，Stroke 2000年8月；31(8)：1856-62)。在出现胸痛的急诊室患者中尿中的FPA增加，所述情况与死亡风险的增加有关(Sonel A等，Circulation 2000年9月5日；102(10)：1107-13)。
在动物研究中检测了FPA的相关物。在兔子中，FPA可变区末端7位(苏氨酸)的进化改变可以防止Habutobin切割FPA及防止促成致命的凝血病，所述Habutobin是一种来源于蛇毒的类似于凝血酶的酶(Nejime T等，Toxicon 2000年8月；38(8)：1029-41)。在整个凝血通路中在凝血酶原上游起作用的组织因子(TF)显示出能够介导血液凝结的作用，该作用出现在分离的兔心脏的缺血/再灌注损伤模型中(Armaganian L等，Coron Artery Dis 2000年9月；11(6)：481-7)。
FPA和溶栓作用是相关联的(血凝块溶解)。D二聚体的产生是不溶性纤维蛋白溶栓性转化作用的结果(即，血凝块溶解作用)，且有证据提示所述二聚体在一些急性和慢性中风患者体内含量增加，而FPA却无明显的增加(Ince B等，Thromb Res 1999年11月1日；96(3)；169-74)。然而，通过注射组织型血纤维蛋白溶酶原激活物引起的血栓溶解会导致FPA显著增加，所述激活物使血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，并启动了纤维蛋白溶解过程，该过程产生了D二聚体；所述FPA的增加可发生于通过肝素抑制凝血酶的过程中(Fassbender K等，Stroke 1999年10月；30(10)：2101-4)。不知何故，FPA可以增加而不引起血液凝结，也不知何故，可以出现溶栓作用而FPA水平却没有改变，尽管所述变化在注射组织型血纤维蛋白溶酶原激活物(tPA’s)时是经常发生的。
溶栓过程中FPA的增加与其磷酸化状态相关。高分子量纤维蛋白原(即，其中第3位丝氨酸被磷酸化)是促血栓形成的，如上所述，磷酸化作用帮助凝血酶锚定在所述分子上，从而协助FPA被切割下来(MaurerMC等，Biochemistry 1998年4月28日；37(17)：5888-902)。在急性心肌缺血(MI)患者中，与再发的冠脉缺血事件最为相关的是高分子量纤维蛋白原(Reganon E等，Thromb Haemost 1999年11月；82(5)：1403-5)。所述情况是有意义的，因为纤维蛋白原的磷酸化导致了促血栓形成的状态。
血栓形成作用与血栓溶解作用是对立的，然而当两者均被诱发时所出现的结果是无法预料的。在组织型血纤维蛋白溶酶原激活物(TPA)治疗后20-35小时期间，循环中95％的纤维蛋白原呈磷酸化状态，其导致阻塞的冠状血管开放。然而，在溶栓治疗后未显示冠脉开放的患者中，磷酸化的FAP片段和高分子量(HMW)纤维蛋白原均增加(Reganon E等，Thromb Haemost 1993年12月20日；70(6)：978-83)。所述现象意味着，成功的溶栓作用以某种方式引起自由FPA中第3位丝氨酸磷酸化程度的降低，所述磷酸化程度降低的现象同时见于其自由状态和结合在纤维蛋白原上的状态中。因此，所述现象似乎是溶栓作用对血栓形成作用的负反馈，该负反馈作用包括了FPA的磷酸化。因而未磷酸化的自由FPA似乎具有抗血栓形成的作用。
4.缓激肽
a)缓激肽的结构
缓激肽是另一种在D2相对于NE2的比较中特异性上调的肽。缓激肽是一种在1909年发现的肽，先前描述了其已知作用，所述功能包括：1)心血管作用(即，血管收缩)，2)痛觉感知(受体激活物)，和3)血液凝结(即，激活凝血酶原通路)。
缓激肽是激肽释放酶从激肽原中释放出来的促炎症肽(RPPGFSPFR)。缓激肽也是有效的血管舒张剂，各种不同种类血管外平滑肌(例如，支气管)的收缩剂，和增加血管通透性的诱导剂。其也引起作为炎症主要体症的疼痛。
如本发明的讨论所理解的，缓激肽具有各种序列。例如，可以从各种不同的动物(见表2中的例子)中获得多个缓激肽序列。也可以从冬眠动物中获得多个缓激肽序列。表2中列举了从各种不同动物中获得的多个缓激肽序列和合成序列。使用标准技术来比较所述序列和从任何所述序列中获得本发明讨论的同一性百分数。此外，使用本发明讨论的技术可以获得共有序列。可以理解的是，用于获得同一性百分数的公开序列之间的任何比较都与特定同一性一起被特定地公开了。例如，虹鳟鱼和美洲旱獭在10个位点中的4个是不同的。这导致在虹鳟鱼和美洲旱獭FPA之间产生了60％的同一性。可以理解的是，也可比较特定片段的同一性。例如，在虹鳟鱼和美洲旱獭之间，在离切割位点(rppgfspf)最近的含有10个氨基酸的片段中有2个氨基酸不同，表明人和美洲早獭的所述片段的同一性为80％。所述类型的分析可用于任何FPA序列。
如本发明所公开的，例如美洲旱獭FPA的C末端的公开抗梗塞分子能够在大鼠或小鼠模型中起作用。
表2提供了许多缓激肽分子及其变异体和表格(BK(缓激肽))。BK的抗梗塞特性可由与BK相关的分子实施，所述分子例如B9340，也可由具有类似氨基酸的其他BK衍生物或整合入BK的其他化学取代物来实施。例如可以使用本发明所述的MCAO小鼠梗塞模型，来描述BK的抗梗塞特性。
表2.缓激肽及其示例性变异体。
所述分子具有同一性，且可用本发明所述的方法确定该同一性。
 名称   序列   来源   SEQ IDNO：   活性/％抑制ATII(血管紧张素II)结合实验
 缓激肽   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   合成物   57   12
 Lys-(Des-Arg9，Leu8)-缓激肽   Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu   58   98
 Hoe 140   (DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi--Ser-DTic--Oic-Arg   59   29
 [DPhe7]缓激肽   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg   60   9
 [Des-Arg9]缓激肽   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe   61   92
 [Thi5，8，DPhe7]缓激肽   Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg   62   53
 [N-乙酰金刚烷-DArg0-Hyp3，Thi5，   N-乙酰金刚烷-DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg   63   61
  8，DPhe7]缓激肽
  N-羰基金刚烷-DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg   N-羰基金刚烷-DArg0-Hyp3，Thi5，8，DPhe7]缓激肽   64   63
  [Lys0]缓激肽   Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   65   29
  [Met-Lys0]缓激肽   Met-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   66   38
  [Lys0-Ala3]缓激肽   Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   67   18
  [Tyr0]缓激肽   Tyr-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   68   33
  [Tyr8]缓激肽   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Tyr-Arg   69   -1
  Tyr5]缓激肽   Arg-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ser-Pro-Phe-Arg   70   13
  [Ile-Ser0]-缓激肽   Ile-Ser-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   71   29
  [Lys0-Hyp3]缓激肽   Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   72   13
  [(pCl)Phe5，8]缓激肽   Arg-Pro-Pro-Gly-(pCl)Phe-Ser-Pro-(pCl)Phe-Arg   73
  缓激肽(1-3)   Arg-Pro-Pro   74   -2
  缓激肽(1-5)   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe   75   1
  缓激肽(1-6)   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser   76   -12
  缓激肽(1-7)   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro   77   55
  缓激肽(2-7)   Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro   78   -6
  缓激肽(2-9)   Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   79   -13
  B9340   DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DIgl-Oic-Arg   80   35
  B9430   DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Igl-Ser-DIgl-Oic-Arg   81   70
  RPPGFSPFR   美洲旱獭   57
  RPPGFSPFR   人   57
  ISRPPGFSPFR   人   82
  KRPPGWSPLR   虹鳟鱼   83
  RPPGFTPFR   红耳滑龟   84
  RPPGFSPFR   草蛙   85
Tic＝四氢异喹啉3’羧酸
Oic＝八氢吲哚2’羧酸
Thi＝β-[2-噻吩基]丙氨酸
Hyp＝羟基脯氨酸
缓激肽的抗梗塞特性可由具有抗梗塞活性的缓激肽相关分子来实施。例如，Des-Arg-BK的抗梗塞活性类似于或大于BK自身。Des用于描述侧链。例如，Des-Arg9指没有C末端Arg(精氨酸)的缓激肽。
b)缓激肽的功能类似物
缓激肽具有各种变异体，其中许多在表2中列出。许多所述变异体含有非标准氨基酸衍生物。例如，存在以下类似物：Cereport(也称为RMP-7或lobradami)(Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Pro-Tyr(Me)-psi(CH2NH)-Arg，SEQID NO：90)，赖氨酰缓激肽(在N末端加入赖氨酸的缓激肽)，在C末端加入赖氨酸的缓激肽，7-甲氧基香豆素-4-乙酰基[Ala7-(2，4-二硝基苯)Lys9]-缓激肽三氟乙酸盐(MOCAc-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys-DNP，SEQ ID NO：91)，D-Arg-[Hyp3，D-Phe7，Leu8]-缓激肽(D-Arg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-D-Phe-Leu-Arg，SEQ ID NO：92)，D-Arg-[Hyp3，D-Phe7]-缓激肽(D-Arg-Arg-Pro-羟基-Pro-Gly-Phe-Ser-D-Phe-Phe-Arg，SEQ IDNO：93)，D-Arg-[Hyp3，Thi5，8，D-Phe7]-缓激肽(D-Arg-Arg-Pro-羟基-Pro-Gly-b-(2-噻吩基)Ala-Ser-D-Phe-b-(2-噻吩基)Ala-Arg，SEQ IDNO：94)，Lys-(des-Arg9，Leu8)-缓激肽三氟乙酸盐(des(Arg10，Leu9)-赖氨酰缓激肽H-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu，SEQ ID NO：95)。
缓激肽的环状类似物具有所需的特性，例如稳定性增加、活性增加和特异性活性增加。缓激肽的环状类似物在专利号为4,187,217的美国专利中公开，所述环状类似物至少作为与缓激肽变异体相关的物质被引用入本发明中。环状变异体的一个例子见附图18。也存在许多缓激肽变异体，其含有非肽键和非氨基酸的类似物。(例如，在专利号为5,162,497的美国专利中，所述类似物至少作为与缓激肽和缓激肽变异体相关的物质被引用入本发明中。)
也存在大量与缓激肽功能类似的缓激肽变异体和分子，例如，缓激肽的功能性类似物，所述变异体和分子见于某些书中，例如《实验药理学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)》第25卷，《缓激肽、赖氨酰缓激肽和激肽释放酶(Bradykinin，Kallidin and Kallikrein)》，E.G.Erdos编辑，Springer-Verlag，柏林-海德堡，纽约，1970，1-768页，所述变异体和分子至少作为与功能性缓激肽类似物相关的物质被引用入本发明中。
5.抗梗塞特性
通过与对照例对梗塞体积缩小这一特征进行比较，可检测FPA或FPA相关分子(例如，C末端和11聚体)、缓激肽或缓激肽相关分子(例如，Des-Arg-缓激肽)、或本发明公开的任何其他抗梗塞分子的抗梗塞特性。通过使用小鼠MCAO模型，可以确定缺血事件后梗塞组织的范围。对梗塞体积进行检测，缺血事件后的梗塞体积越小，则待测分子预防或逆转梗塞的能力越强。例如，可以将平均梗塞体积用组织总体积的百分数来确定。施用11聚体FPA片段后的平均梗塞体积为18.5％，显著低于对照的54.7％(p＜0.0001)。对许多不同动物施用FPA衍生物后的梗塞体积的范围是0-44％，而对照动物为34-71％。施用BK后的平均梗塞体积为33.2％，施用daBK为17.0％，将daBK与C末端联合施用为18.0％。联合施用BK和daBK后的平均梗塞体积(25.2％)与对照(54.7％)相比，具有统计学上的显著性(p＜0.003)。施用更为有效的daBK后的梗塞体积的范围是9-27％，而对照为34-71％。
这样，确定一种给定分子抗梗塞效率的方法是获得其梗塞比率，所述梗塞比率是对照例的(例如，不施用所述分子或施用载体)平均梗塞体积与施用所述分子的平均梗塞体积的比率。所述梗塞比率中的梗塞体积其自身是梗塞组织体积与全部组织体积的比率(以百分数表示梗塞组织体积)。可以如本发明所述确定所述体积。因而，例如FPA、BK或其衍生物等抗梗塞分子的梗塞比率大于1，或大于等于1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25、30、35、40、45、50、60、65、70、75、80、85、90、100、500、1000、2000、5000、10000、100000或更高。在一个给定实验中，可以通过观察平均体积或绝对体积来确定所述梗塞比率。如果一种分子是抗梗塞分子，则可在小鼠MCAO模型中施用所述分子，再通过简单地观察绝对梗塞体积来确定梗塞程度。例如，本发明公开的例如FPA、BK及其衍生物等抗梗塞分子，施用所述分子之后的梗塞体积小于或等于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在单个实验中，所述结果可被确定为平均值或绝对值。
6.使用状态依赖性鉴定的组合物
本发明公开了一些方法，其用于鉴定与某种生理状态相关的分子。当状态与某些条件高度关联时，本发明公开的方法被鉴定为是有效的，所述条件例如时间、生理状态或特征。本发明讨论的一个例子是鉴定与抗梗塞活性相关的分子，所述活性出现于冬眠动物中。在所述鉴定方法中，通过比较最邻近的冬眠成分来鉴定差异，而不是比较冬眠成分和非冬眠成分。所述最邻近的概念可应用于许多不同的生理状态。根据所述概念，可以在一个亚状态内、多个亚状态中和最接近的多个亚状态中有所发现。例如，下列所有状态均可含有多个亚状态和最接近的多个亚状态：冬眠、进食行为、睡眠、催眠、摇动怀孕期(rocking motion pregnancy)、重力、失重、性行为、餐后欣快、精神病发作例如躁狂型抑郁、晒太阳导致的例如欣快、明暗交替导致的例如抑郁、运动、高压状态或应激相关状态。
可被监测的生理状态有多种，例如心跳、血压、呼吸频率、EEG或眼球运动。所述生理状态可用任何方法检测。用于采集和分析所述类型状态的一种方法，使用了非线性改良的点关联维数(PD2i)算法。如许多年来所知的那样，心率可变性(HRV)的测量方法可用于预测发生在住院心脏病患者中的由心律失常导致的死亡，所述测量方法通过一种线性随机算法(标准差、功率谱等)来实现。然而，所述可预测性(即，敏感性、特异性或相对危险性统计)并不是很理想，因而对于单个患者而言，所述算法不能用于临床。美国专利5,720,924和5,709,214中显示，使用非线性确定算法PD2i分析HRV，比线性随机分析具有好得多的可预测性(所述算法至少作为与使用PD2i算法相关的材料引入本发明中)。
因而，PD2i的分析方法是确定性的，而且建立在数据中所产生的变化的基础之上。所述方法不需要稳态而实际上是追踪数据中的非稳态变化；而且其对杂乱和非杂乱的线性数据都是敏感的。所述分析方法基于以前的一些分析方法并对非稳态数据是不敏感的，所述以前的分析方法总体上都是用于估计关联维数的算法。由于这一特征，所以PD2i预测的临床结果具有高度的敏感性和特异性，而其他方法则无法做到。通过考虑干扰的算法(2003年Skinner的美国专利申请)可以加强所述方法的预测性。因为所述非线性算法能够追踪生物体时间状态中的变化，所以该算法被认为是成功的。大部分随机方法需要数据的稳定性，这意味着数据的创造者不能在产生数据状态的时候改变状态；这就是说，数据的随机特性是无法改变的(平均数、标准差和其他参数必需保持不变)。然而，生物数据系列却不断地改变状态。通过解决即使不是全部也是大部分的生物数据中固有的数据非稳态问题，PD2i预测心律失常导致的死亡的方法目前可用于临床。如本发明所公开的，所述整合了PD2i算法或类似算法的方法可用于检测状态和亚状态之间的生理学数据。所述方法可用于鉴定所出现的状态的微妙变化(即，亚状态)，即，其可用于鉴定包括两个亚状态中的生理学差异。所述亚状态与靶分子的释放相关。
a)“最邻近亚状态方法”
最邻近亚状态方法的特征是，识别出先前的状态中包括两个不同的状况即不同的亚状态。例如，在冬眠状态中，本发明公开了例如出现与心动过缓相关的两个不同亚状态，所述两个亚状态被用于鉴定具有抗梗塞作用的分子。在冬眠状态中存在一个突然唤醒导致高发死亡的亚状态。最邻近亚状态是冬眠中的一个时间点，在这个时间点上唤醒不会导致死亡数的增加。将诱发死亡的亚状态与不诱发死亡的最邻近亚状态或对照例进行比较，可以得到与生理状态相关的非常特异的分子比较结果。
因此，“状态”可被认为是二元的状态，例如睡眠和清醒、饥饿和饱食、患病和健康等。亚状态的特征是状态中的一种状况，其可被确定并被用于将状态进一步细分。定义的生理或行为特征必需在作为对照的整个状态中把一个亚状态与另一个亚状态分离开。当将所述亚状态与蛋白质组和基因组技术联合用于鉴定分子差异时，可将生理相关的分子鉴定出来。本发明所述的方法可用于鉴定许多分子差异，而且在某些例子中，全部差异均与生理学相关。
b)不同类型的状态
除了那些含有抗梗塞分子的亚状态之外，短暂出现的生理亚状态也支持一个更大的总体状态，该状态例如冬眠。例如，不排尿的怀孕的冬眠熊为成长中的胎儿制造了越来越多的复杂分子，因此它们必须具有一种基础生理活动来处理血液中堆积的尿素，从而进行预防使它们自己免患尿毒症。如本发明所公开的，生理数据显示，向正常的清醒的实验室大鼠中注射的双标记尿素(每只大鼠注射1、2或3mg)，可被静脉注射与冬眠相关的分子成分(即，20mg/kg的D2、D01)而激活，形成单标记尿素(即，“再循环”尿素)。在注射与冬眠相关的分子成分后3小时，与对照(IV，Xeno白蛋白，20mg/kg)相比，每只动物在各自的背景上平均增加了约50％(p＜0.025)，在注射后6小时所述差异更为显著(p＜0.01)。在注射后6小时出现了刺激后最高的再循环率，其超过了正常尿素再循环率的13倍。
7.采用已公开的组合物/组合化学方法进行筛选而鉴定的组合物
可以理解的是，FPA和缓激肽具有抗梗塞特性的事实意味着，在特定实验中与FPA和缓激肽相互作用的物质可用于鉴定与FPA和缓激肽功能类似的分子，然后在公开的梗塞模型中检测所述功能类似的分子以确定其活性。例如，可以获得的FPA和凝血酶的结合信息可用于分离像FPA一样与凝血酶结合的分子，然后在公开的梗塞模型中检测所述分子。例如，公开了分离FPA与凝血酶结合的竞争性抑制物的选择实验。这样，有许多方法可以制备抗梗塞分子，所述分子包括可由合成方法制备的分子，或可由筛选方法分离得到的分子。
可以理解的是各种分子均可以被分离，蛋白质变异体、抗体、功能性核酸和肽模拟物为其中的一小部分。接下来是对所述分子和其他分子的论述，所述其他分子包括可鉴定为具有FPA和缓激肽那样抗梗塞特性的小分子。可以理解的是，FPA和缓激肽分别涉及全部FPA和缓激肽变异体和衍生物，即所述变异体和衍生物与FPA和缓激肽具有某种程度的同一性。将具有类似于FPA和/或缓激肽的功能却不具备基于氨基酸的结构的一些分子称为抗梗塞分子，其具有例如FPA活性或缓激肽活性的特殊特性。
本发明公开了制备抗梗塞分子的方法，该方法包括合成抗梗塞分子或抗梗塞分子的变异体，其中抗梗塞分子可由以下方法纯化，该方法包括：1)从冬眠动物中采集血液样品，2)从冬眠动物中采集第二份血液样品，3)比较所述血液样品和第二份血液样品，其中，所述血液样品采集自冬眠开始后25天或25天内的期间内，第二份血液样品采集自冬眠开始后超过25天的期间内，其中，所述血液样品中抗梗塞分子的量多于第二份血液样品中抗梗塞分子的量。
本发明公开了制备抗梗塞分子的方法，该方法包括合成抗梗塞分子或抗梗塞分子的变异体，其中抗梗塞分子可由以下方法纯化，该方法包括：1)从冬眠动物中采集血液样品，2)从冬眠动物中采集第二份血液样品，3)比较所述血液样品和第二份血液样品，其中，所述血液样品采集自冬眠结束前25天或25天内的期间内，第二份血液样品采集自冬眠开始后25天后、但冬眠结束前25天前的期间内，其中，所述血液样品中抗梗塞分子的量多于第二份血液样品中抗梗塞分子的量。
本发明公开了鉴定抗梗塞分子的方法，该方法包括在小鼠MCAO模型中施用所述分子，在小鼠MCAO模型中比较所述分子的抗梗塞活性和FPA的抗梗塞活性，如果所述分子的抗梗塞活性至少为FPA活性的20％，则选择该分子。
本发明公开了鉴定抑制物的方法，所述抑制物是抑制缓激肽与血管紧张素II受体的相互作用，该方法包括：在缓激肽存在的条件下，将表达2型血管紧张素II受体的细胞和假定的抑制物接触；检测结合在2型血管紧张素II受体上的缓激肽的量；其中，结合在2型血管紧张素II受体上的缓激肽减少即鉴定出了一种抑制物。
本发明公开了鉴定抑制物的方法，所述抑制物是抑制缓激肽与血管紧张素II受体的相互作用，该方法包括：在缓激肽存在的条件下，将表达2型血管紧张素II受体的细胞和假定的抑制物接触，其中，2型血管紧张素II受体含有荧光供体，缓激肽含有荧光受体；检测荧光共振能量转移(FRET)，其中，与没有接触假定抑制物的细胞的FRET检测结果相比，FRET的结果降低则提示抑制物的存在。
本发明公开了鉴定缓激肽和2型血管紧张素II受体相互作用抑制物的方法，该方法包括：将假定抑制物与细胞系统接触，其中，所述细胞系统含有2型血管紧张素II受体，所述细胞系统还含有缓激肽，2型血管紧张素II受体含有荧光供体，缓激肽含有荧光受体；在假定抑制物接触细胞系统之前和之后检测荧光共振能量转移(FRET)，其中，当假定抑制物与细胞系统接触时，如果所述细胞系统的FRET结果降低，则鉴定出了一种抑制物。细胞系统涉及含有本发明所述的发挥功能和进行检测所必需组分的细胞。
本发明公开了一些方法，其还包括在梗塞体内模型中检测鉴定出的抑制物的步骤，和选择能够在动物模型中减轻梗塞的分子。
本发明公开了一些方法，其中，在分子库中发现了假定抑制物。
本发明公开了用于筛选能够调节2型血管紧张素II受体的抗梗塞分子的方法，该方法包括：在不存在外源性缓激肽的条件下，将假定的抗梗塞分子与已知表达血管紧张素II受体的梗塞动物模型接触；检测梗塞状况；将未发生梗塞与能够调节血管紧张素II受体的缓激肽抗梗塞模拟物的存在相关联。
本发明公开了用于筛选能够调节2型血管紧张素II受体的抗梗塞分子的方法，该方法包括：在不存在缓激肽的条件下，将假定的抗梗塞分子与已知表达血管紧张素II受体的梗塞动物模型接触；检测是否发生梗塞；将未发生梗塞与能够调节血管紧张素II受体的抗梗塞分子的存在相关联。
本发明公开了一些方法，其中，假定的抗梗塞分子模拟物是血管紧张素II受体的激动剂或拮抗剂。
本发明公开了鉴定假定抗梗塞分子的方法，该方法包括：在缓激肽存在的条件下，将假定抗梗塞分子与表达2型血管紧张素II受体的细胞接触；对与2型血管紧张素II受体结合的缓激肽的减少情况进行检测；将抗梗塞分子的存在与结合于2型血管紧张素II受体的缓激肽的减少相关联。
可以理解的是，所述方法可用于寻找缓激肽和2型血管紧张素II受体相互作用的抑制物。
本发明公开了鉴定假定抗梗塞分子的方法，该方法包括：将功能性偶联了荧光受体的缓激肽和假定抗梗塞分子，与功能性偶联了荧光供体的表达2型血管紧张素II受体的细胞接触；检测荧光共振能量转移(FRET)，其中，与未接触假定抗梗塞分子细胞的FRET检测结果相比，FRET降低则提示抗梗塞分子的存在。
可以理解的是，本发明公开的方法还可包括在动物模型中检测分离出的化合物和组合物，所述动物模型例如缺血动物模型。例如，可以检测所述分离出的分子存在时的梗塞范围，并与所述分子不存在时的梗塞范围进行比较。本发明公开的动物模型也可用于再次分离抗梗塞分子，该过程如本发明所述。一些特殊动物模型可用于竞争性地比较假定抗梗塞分子和例如缓激肽、FPA或变异体或衍生物。
本发明公开的方法也可用于在分子库中筛选活性组合物或化合物。如本发明所公开的，当筛选分子库时，所述方法通常会使用从无活性分子中分离活性分子的步骤。
本发明公开了治疗需要减轻梗塞情况的受试对象的方法，该方法包括施用有效剂量的分子，所述分子通过本发明公开的方法分离得到。
可以理解的是，本发明公开的方法可用于脑梗塞、心肌梗塞或其他类型的梗塞。
可以理解的是，梗塞为发生组织坏死的区域，其可由各种方式引起，但通常由组织区域的缺血或供氧减少引起。一旦发生氧缺乏及继发的再灌注，则会导致发生组织坏死。本发明公开的方法设计用于减轻缺血事件的影响，例如由再灌注和/或氧缺乏导致的梗塞。在例如发生中风时会出现所述事件，其中脑组织中的血管阻塞会导致缺血，或在例如心脏病发作的心脏事件中会出现所述事件，其中冠状动脉阻塞导致缺血。
缺血的治疗措施通常包括减轻阻塞。例如，硝酸甘油可用于治疗缺血(使阻塞的冠状血管舒张并稍稍超过正常状态，使缺血造成的心绞痛消失)。抑制血流可导致缺血。小鼠MCAO模型可形成缺血状态，且通常将梗塞发生的状态设置在缺血后24小时。在注射本发明公开的组合物时血流被重建，因而组织也不再缺血，这就是预防/治疗梗塞的方式。某些时候，抗梗塞分子被称为“神经保护药物”。有各种不同类型的分子可具有FPA或缓激肽抗梗塞活性。将在此讨论示例性化合物。
a)功能性核酸
功能性核酸是具有特定功能的核酸，所述特定功能例如与靶分子结合或催化特定反应。功能性核酸可分为以下类别，但并不意味着只限于以下类别。例如，功能性核酸包括反义分子、适体(aptamers)、核酶、三链形成的分子和外导向序列。功能性核酸分子可作为靶分子特定活性的影响物、抑制物、调节物和刺激物，或具有独立于任何其他分子的新活性。
功能性核酸分子可与任何大分子相互作用，所述大分子例如DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、多肽或碳水化合物链。因而，功能性核酸可与下列物质相互作用：FPA、缓激肽或与功能性核酸相互作用分子如凝血酶或其片段的mRNA；或FPA、缓激肽或与功能性核酸相互作用分子如凝血酶或其片段的基因组DNA；或FPA、缓激肽或与功能性核酸相互作用的分子如凝血酶或其片段的多肽。功能性核酸通常设计用于与其他核酸相互作用，该作用基于靶分子和功能性核酸分子的序列同源性。在其他情况中，功能性核酸分子和靶分子的特异性识别不是建立在它们的序列同源性之上，而是建立在形成的可以发生特异性识别的三级结构的基础之上。
反义分子设计用于通过典型或非典型碱基配对与靶核酸相互作用。反义分子和靶分子之间的相互作用如此设计以促进靶分子的降解，所述降解过程通过例如RNAseH(RNA酶H)介导的RNA-DNA杂合体的降解来实现。替代性地，反义分子也可设计用于阻断靶分子上发生的正常加工功能，所述功能例如转录或复制。可根据靶分子的序列来设计反义分子。通过寻找靶分子的最易接近的区域，有许多方法用于使反义分子的效率最优化。所述方法例如体外选择实验和使用DMS(硫酸二甲酯)和DEPC(焦碳酸二乙酯)的DNA修饰研究。优选反义分子与靶分子结合的解离常数(Kd)小于10-6。更优选反义分子与靶分子结合的解离常数小于10-8。更进一步优选反义分子与靶分子结合的解离常数小于10-10。还优选反义分子与靶分子结合的解离常数小于10-12。有助于设计和使用反义分子的方法和技术的代表性例子可见于以下非限制性美国专利：5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6,025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319和6,057,437。
适体是与靶分子相互作用的分子，所述相互作用优选以特殊的方式发生。适体通常是长度在15-50个碱基的小分子核酸，其折叠成为规定的二级和三级结构，所述结构例如茎环或G四合体。适体可以结合小分子，例如ATP(三磷酸腺苷)(美国专利5,631,146)和茶碱(theophyline)(美国专利5,580,737)，也可以结合大分子，例如逆转录酶(美国专利5,786,462)和凝血酶(美国专利5,543,293)。适体可以与靶分子紧密结合，其解离常数小于10-12M。优选适体与靶分子结合的解离常数小于10-6。更优选适体与靶分子结合的解离常数小于10-8。更进一步优选，适体与靶分子结合的解离常数小于10-10。还优选，适体与靶分子结合的解离常数小于10-12。适体可以以非常高的特异性与靶分子结合。例如，在靶分子和其他分子仅有一个位点不同的情况下，分离得到的适体在结合亲和力上的差别大于10000倍(美国专利5,543,293)。优选，适体与靶分子结合的解离常数至少低于结合于背景分子的10倍。更优选，适体与靶分子结合的解离常数至少低于结合于背景分子的100倍。更进一步优选，适体与靶分子结合的解离常数至少低于结合于背景分子的1000倍。优选，适体与靶分子结合的解离常数至少低于结合于背景分子的10000倍。优选，当使用例如多肽进行比较时，背景分子是一种不同的多肽。例如，当确定适体与某些物质的结合特异性时，背景蛋白质可以是血清白蛋白，所述物质是FPA、缓激肽、与其相互作用的分子如凝血酶、或它们的片段。如何制备和使用适体去结合各种不同靶分子的代表性例子可见于以下非限制性的美国专利：5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776和6,051,698。
核酶是能够在分子内和分子间催化化学反应的核酸。因此，核酶是催化性核酸。优选，核酶催化分子间反应。有多种不同核酶催化核酸酶或核酸多聚酶类型的反应，该反应基于在自然系统中发现的核酶，例如槌头状核酶(例如下列美国专利，但不仅限于这些专利：5,334,711、5,436,330、5,616,466、5,633,133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5,998,203、Ludwig与Sproat的WO 9858058、Ludwig与Sproat的WO 9858057和Ludwig与Sproat的WO 9718312)、发夹状核酶(例如下列美国专利，但不仅限于这些专利：5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339和6,022,962)和四膜虫核酶(例如下列美国专利，但不仅限于这些专利：5,595,873和5,652,107)。也有许多核酶不是在自然系统中发现的，但是被重新设计改造为具有催化特定反应的能力(例如下列美国专利，但不仅限于这些专利：5,580,967、5,688,670、5,807,718和5,910,408)。优选，核酶切割RNA或DNA底物，更优选，核酶切割RNA底物。核酶切割核酸底物时通常先识别和结合在目标底物上，然后将其切割。所述识别过程通常主要基于典型或非典型碱基相互作用。由于识别目标底物是基于目标底物的序列，因此所述特性使核酶成为核酸目标特异性切割的特别合适的候选物。如何制备和使用核酶去催化各种不同反应的代表性例子可见于以下非限制性的美国专利：5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906和6,017,756。
三链形成的功能性核酸分子是能够与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链分子与靶区域相互作用时，形成了一种称为三螺旋的结构，在所述结构中存在三条DNA链形成的复合物，该过程依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对。因为三链分子结合靶区域的亲和力和特异性很高，所以该分子是优选的。优选，三链形成的分子结合靶分子的解离常数小于10-6。更优选，三链形成的分子结合靶分子的解离常数小于10-8。更进一步优选，三链形成的分子结合靶分子的解离常数小于10-10。还优选，三链形成的分子结合靶分子的解离常数小于10-12。如何制备和使用三链形成的分子去催化各种不同靶分子的代表性例子可见于以下非限制性的美国专利：5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566和5,962,426。
外导向序列(EGSs)是能够与靶核酸分子结合而形成复合物的分子，Rnase P(RNA酶P)识别该复合物并切割其中的靶分子。EGSs可被设计为特异性地定向于所选择的RNA分子。RNAse P帮助在细胞中加工转移RNA(tRNA)。使用EGS招募RNAse P使其实际上可以切割任何RNA序列，所述EGS使靶RNA：EGS复合物模仿自然tRNA底物(Yale的公开号为WO 92/03566的专利申请，Forster和Altman，Science238：407-409(1990))。
类似地，真核EGS/RNAse P定向的RNA切割可用于在真核细胞中切割所需靶标(Yuan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8006-8010(1992)；Yale的公开号为WO 93/22434的专利申请；Yale的公开号为WO 95/24489的专利申请；Yuan和Altman，EMBO J 14：159-168(1995)；Carrata等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92：2627-2631(1995))。如何制备和使用EGS分子去帮助切割各种不同靶分子的代表性例子可见于以下非限制性的美国专利：5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162。
b)组合化学
本发明公开的组合物可作为任何组合技术的目标，以所需的方式鉴定与所述组合物相互作用的分子或大分子。本发明公开的核酸、肽和相关分子也可作为组合方法的目标。本发明公开了通过组合技术或筛选技术鉴定出来的组合物，其中，将在表1、表2或它们的一部分中公开的组合物作为组合或筛选实验方法中的目标，或者，将与表1、表2或它们的一部分中的序列相互作用的组合物作为组合或筛选实验方法中的目标。
可以理解的是，当在组合技术或筛选技术中使用本发明公开的组合物时，会鉴定出具有所需的特别特性的诸如大分子等一些分子，所述特性例如抑制作用、刺激作用或靶分子的功能。本发明也公开了使用公开的以下组合物鉴定和分离出的分子，所述组合物例如是在表1、表2或它们的一部分中公开的组合物，或与表1、表2或它们的一部分中的序列相互作用的组合物。因而，也认为在本发明中公开了在组合或筛选方法中使用本发明公开的组合物生产的产物，所述组合物是在表1、表2或它们的一部分中公开的组合物，或与表1、表2或它们的一部分中的序列相互作用的组合物。
组合化学方法包括但不限于分离能够与小分子或另一个大分子结合的小分子或大分子的全部方法，所述组合化学方法通常以迭代法实施。大分子的例子如蛋白质、寡核苷酸和糖。例如，具有催化或配体结合等给定功能的寡核苷酸可以从随机寡核苷酸的复杂混合物中分离得到，所述过程称为“体外遗传学”(Szostak，TIBS 19：89，1992)。合成含有随机和给定序列的大分子库，而且将这个复杂混合物进行某些选择和富集加工，所述复杂混合物例如，100μg的100个核苷酸长的RNA中约有1015个单独序列。通过对柱上与配体结合的分子进行反复亲和层析和PCR(聚合酶链反应)扩增，Ellington和Szostak(1990)估计1010个RNA分子中的1个折叠成能够结合小分子染料的形式。也分离得到了具有所述配体结合行为的DNA分子(Ellington和Szostak，1992；Bock等，1992)。存在具有相似目标的、用于本领域技术人员所熟知的有机小分子、蛋白质、抗体和其他大分子的技术。不论是否从有机小分子库、寡核苷酸或抗体中筛选具有理想活性的多批分子，所述方法都可以被概括性地称为组合化学。组合技术特别适合于定义分子之间的结合相互作用和用于分离具有特异性结合活性的分子，并当大分子是核酸时，通常将所述具有特异性结合活性的分子称为适体。
分离蛋白质的方法有许多，所述蛋白质具有新活性或经过修饰的活性。例如，噬菌体展示库可用于分离大量的与特定靶点相互作用的肽(例如，参见美国专利号6,031,071、5,824,520、5,596,079和5,565,332，至少因为所述专利中的物质和方法分别与噬菌体展示和组合化学相关，所以将其以引用的方式加入到本发明中)。
Roberts和Szostak描述了分离具有给定功能的蛋白质的优选方法(Roberts R.W.和Szostak J.W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(23)12997-302(1997))。所述组合化学方法结合了蛋白质的功能能力和核酸的遗传能力。生成RNA分子时，其3’末端共价结合了嘌呤霉素嘌呤霉素分子。体外翻译所述经过修饰的RNA分子，得到了正确的蛋白质，该蛋白质由用于翻译的RNA编码。此外，因为嘌呤霉素的结合，而嘌呤霉素为不能延伸的肽酰受体，所以延伸中的肽链结合在嘌呤霉素上，而嘌呤霉素又结合在RNA上。这样，蛋白质分子就结合在编码它的遗传物质上。这时，可以使用普通体外选择步骤来分离功能肽。一旦完成肽功能的选择步骤，就使用传统的核酸操作步骤扩增编码经选择得到的功能肽的核酸。在扩增遗传物质后，转录3’末端结合有嘌呤霉素的新RNA，翻译新肽，然后进行另一轮的功能选择。因此，就像核酸选择技术一样，可以以迭代的方式进行蛋白质选择。翻译得到的肽受结合有嘌呤霉素的RNA序列的控制。所述RNA序列可以是为了获得最佳翻译效率(即，无终止密码子等)而设计的任何随机序列，也可以是已知RNA分子的简并序列，该序列用于寻找已知肽的改良的或改变的功能。核酸扩增和体外翻译的条件是本领域普通技术人员所熟知，但优选使用Roberts和Szostak的条件(Roberts R.W.和Szostak J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(23)12997-302(1997))。
Cohen等描述了设计用于分离肽的组合方法中的另一种优选方法(Cohen B.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(24)：14272-7(1998))。所述方法使用并修改了双杂交技术。酵母双杂交系统用于检测和分析蛋白质与蛋白质之间的相互作用。最初在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中描述的所述双杂交系统是鉴定新的调节分子的强大的分子遗传学技术，所述调节分子对感兴趣的蛋白质是特异的(Fields andSong，Nature 340：245-6(1989))。Cohen等改进了所述技术，使之能够鉴定一种选定分子与合成的或由基因工程制备的肽序列之间的新的相互作用。所述类型技术的好处在于在细胞内环境中进行选择。所述方法使用与酸激活结构域结合的肽分子库。选定的肽结合于例如Gal4的转录激活蛋白的DNA结合结构域，所述选定的肽例如，在表1、表2或它们的一部分中公开的组合物的胞外部分，或者，与表1、表2或它们的一部分中公开的序列相互作用的组合物。通过在所述类型的系统中实施双杂交技术，可以鉴定出与FPA或缓激肽结合的分子，或者与FPA或缓激肽相互作用的分子如凝血酶，或者所述分子的片段。
将本领域普通技术人员已知的方法学和各种组合库结合起来，可用于分离那些小分子或大分子并描述其特征，所述两种分子与所需靶点结合或相互作用。可以比较所述化合物的相对结合亲合力，也可以使用竞争性结合研究来鉴定最佳化合物，所述方法为本领域普通技术人员所熟知。
建立组合库的技术和筛选组合库以分离分子的技术均为本领域普通技术人员所熟知，所述分子与所需靶点结合。代表性的技术和方法见于但不限于下列美国专利：5,084,824、5,288,514、5,449,754、5,506,337、5,539,083、5,545,568、5,556,762、5,565,324、5,565,332、5,573,905、5,618,825、5,619,680、5,627,210、5,646,285、5,663,046、5,670,326、5,677,195、5,683,899、5,688,696、5,688,997、5,698,685、5,712,146、5,721,099、5,723,598、5,741,713、5,792,431、5,807,683、5,807,754、5,821,130、5,831,014、5,834,195、5,834,318、5,834,588、5,840,500、5,847,150、5,856,017、5,856,496、5,859,190、5,864,010、5,874,443、5,877,214、5,880,972、5,886,126、5,886,127、5,891,737、5,916,899、5,919,955、5,925,527、5,939,268、5,942,387、5,945,070、5,948,696、5,958,702、5,958,792、5,962,337、5,965,719、5,972,719、5,976,894、5,980,704、5,985,356、5,999,086、6,001,579、6,004,617、6,008,321、6,017,768、6,025,371、6,030,917、6,040,193、6,045,671、6,045,755、6,060,596和6,061,636。
使用许多不同的合成技术,可以从一个广泛的分子阵列中建立组合库。例如,所述组合库含有以下物质：稠合2，4-嘧啶二酮(美国专利6,025,371)、二羟苯并吡喃(美国专利6,017,768和5,821,130)、醇酰胺(美国专利5,976,894)、羟基氨基酸酰胺(美国专利5,972,719)、糖类(美国专利5,965,719)、1，4-苯二氮卓-2，5-二酮(美国专利5,962,337)、环状化合物(美国专利5,958,792)、联芳氨基酸酰胺(美国专利5,948,696)、噻吩(美国专利5,942,387)、三环四羟基喹啉(美国专利5,925,527)、苯并呋喃(美国专利5,919,955)、异喹啉(美国专利5,916,899)、乙内酰脲和乙内酰硫脲(美国专利5,859,190)、吲哚(美国专利5,856,496)、咪唑-吡啶-吲哚和咪唑-吡啶-苯并噻吩(美国专利5,856,107)取代的2-亚甲基-2，3-二羟噻唑(美国专利5,847,150)、喹啉(美国专利5,840,500)、PNA(肽核酸)(美国专利5,831,014)、含有的杂乱物质(containing tags)(美国专利5,721,099)、聚酮化合物(美国专利5,712,146)、吗啉亚基(美国专利5,698,685和5,506,337)、硫酰胺(美国专利5,618,825)和苯二氮卓(美国专利5,288,514)。
筛选类似于凝血酶的分子来抑制FPA结合是分离所需化合物的一种方法。
在本发明中使用的方法和库包括常规的筛选方法和库，也包括在迭代方法中使用的方法和库。
c)计算机辅助药物设计
可将本发明公开的组合物用作任何分子建模技术的目标，用于鉴定其结构或者鉴定潜在的或实际的分子如小分子，所述分子以所希望的方式与本发明公开的组合物相互作用。本发明公开的核酸、肽和相关分子均可用作任何分子建模程序或方法的目标。
可以理解的是，当在建模技术中使用本发明公开的组合物时，将会鉴定出具有特定所需性质的分子例如大分子，所述性质例如抑制作用、刺激作用或靶分子的功能。本发明还公开了使用本发明公开的组合物鉴定或分离出来的分子，所述组合物例如，在表1、表2或它们的一部分中公开的组合物，或者，与表1、表2或它们的一部分中的序列相互作用的组合物。因而，也认为在本发明中公开了在分子模建方法中使用本发明公开的组合物生产的产物，所述组合物例如，在表1、表2或它们的一部分中公开的组合物，或者，与表1、表2或它们的一部分中的序列相互作用的组合物。
因此，通过合理的设计是分离与选定分子结合的分子的一种方法。所述方法通过结构信息和计算机建模实现。计算机建模技术能够使选定分子的三维原子结构可视化，也能够对将会与所述分子相互作用的新化合物进行合理设计。三维结构的构建通常依赖于选定分子的X射线结晶分析数据和NMR(核磁共振)成像数据。分子动力学分析需要力场数据。计算机图形系统能够预测新化合物如何与靶分子连接，并能够对化合物和靶分子的结构进行实验操作，使其达到完美的结合特异性。在预测分子和化合物的相互作用时，如果其中的一个或两个发生细微的改变，则需要分子力学软件和具有强大计算能力的计算机，通常在分子设计程序和用户之间还结合了用户友好的菜单驱动界面。
分子建模系统的例子如CHARMm和QUANTA程序，由美国马塞诸塞州(MA)沃尔瑟姆(Waltham)的Polygen Corporation开发。CHARMm程序执行能量最小化和分子动力学功能的计算。QUANTA程序执行结构构建、图形建模和分子结构分析的计算。QUANTA程序允许计算机和使用者之间进行交互式的结构构建、修改、可视化和分子行为分析。
许多文章评述了与特定蛋白质相互作用的药物的计算机建模，所述文章例如，Rotivinen等，1988 Acta Pharmaceutica Fennica 97，159-166；Ripka，New Scientist 54-57(1988年6月16日)；McKinaly和Rossmann，1989Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol. 29，111-122；Perry和Davies，《QSAR：Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design》，189-193页(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis和Dean，1989 Proc.R.Soc.Lond.236，125-140和141-162；和关于核酸组分的模型酶的文章，Askew等，1989 J. Am.Chem.Soc.111，1082-1090。用于筛选化学制剂和以图形方式描述化学制剂的其他计算程序可从某些公司获得，所述公司例如BioDesign，Inc.，Pasadena，CA.，Allelix，Inc，Mississauga，Ontario，加拿大，和Hypercube，Inc.，Cambridge，Ontario。虽然所述程序起初设计用在对特定蛋白质具有特异性的药物中，但是一旦DNA或RNA的特定区域被鉴定出来，则所述程序也适用于设计与该区域特异性相互作用的分子。
虽然上述内容涉及可以改变结合情况的化合物的设计和生成，但是也可以通过筛选已知化合物的库来寻找能够改变底物结合特性或酶促活性的化合物，所述已知化合物包括自然产物或合成的化学制剂和包括蛋白质在内的生物活性物质。
d)抗体
(1)抗体概述
本发明中使用的术语“抗体”是指广义的抗体，其包括多克隆抗体和单克隆抗体。只要以下物质由于具有模拟FPA、缓激肽或它们的片段的特性(例如本发明所公开的FPA、缓激肽或它们的片段的抗梗塞特性)的能力而被选中，则本发明中的“抗体”不仅包括完整的免疫球蛋白分子，还包括所述免疫球蛋白分子的片段或多聚物、人免疫球蛋白分子或人源化的免疫球蛋白分子及它们的片段。使用本发明公开的体外实验方法或类似方法来检测希望抗体所具备的活性，之后根据已知临床实验方法来检测其体内治疗和/或预防活性。在本发明中还公开了抗体的功能性等效物。
本发明中的“单克隆抗体”是指从高度同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了少部分抗体分子中可能存在的自然发生的突变外，群体中的单个抗体之间是相同的。只要“嵌合”抗体或其一部分表现出所希望的拮抗剂活性，则本发明中的单克隆抗体就特定地包括这类“嵌合”抗体，其中，所述嵌合抗体重链和/或轻链的一部分与以下抗体的相应序列相同或同源，该抗体来自于特定物种或属于特定抗体类别或亚类别，而所述嵌合抗体中的一条链(或多条链)的剩余部分与以下抗体的相应序列相同或同源，该抗体来自于另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类别，或所述物种的抗体或所述类别的抗体的片段(见美国专利4,816,567和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。
可使用任何能够制备单克隆抗体的方法制备本发明公开的单克隆抗体。例如，可以使用杂交瘤方法来制备单克隆抗体，所述方法例如Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)。在杂交瘤方法中，通常使用免疫剂来免疫小鼠或其他合适的宿主动物，以诱导产生制造或能够制造抗体的淋巴细胞，所述抗体能够特异性地与免疫剂结合。
所述单克隆抗体也可由DNA重组方法来制备，所述DNA重组方法例如见于美国专利4,816,567(Cabilly等)中。使用常规方法(例如使用寡核苷酸探针，该探针能够特异性与编码鼠抗体重链和轻链的基因结合)能够很容易地对编码本发明公开的单克隆抗体的DNA进行分离和测序。使用噬菌体展示技术也能够产生和筛选抗体或活性抗体片段的库，例如见于Burton等的美国专利5,804,440和Barbas等的美国专利6,096,441中。
体外方法也适于制备一价抗体。对抗体进行消化可以产生该抗体的片段，尤其是Fab片段(抗原结合片段)，所述过程可由为本领域已知的常规技术完成。例如，可使用木瓜蛋白酶来完成所述消化过程。利用木瓜蛋白酶进行消化的例子见于1994年12月22日公布的WO 94/29348专利申请公开文本和美国专利4,342,566中。木瓜蛋白酶消化抗体后通常产生两个相同的抗原结合片段和一个剩余的Fc(可结晶片段)片段，所述抗原结合片段被称为Fab片段，每个该片段具有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理所述抗体后产生了具有两个抗原结合位点的一个片段，该片段还具有交联抗原的能力。
与未经修饰的抗体或抗体片段相比，如果经过修饰的抗体或抗体片段的活性没有显著改变或降低，则无论所述片段是否与其他序列结合，所述片段的特定区域或特定氨基酸残基还可含有插入、缺失、替代或其他选择性修饰。所述修饰可以产生一些额外特性，例如，移除/加入具有二硫化物结合能力的氨基酸、延长其生物寿命或改变其分泌特征等。无论如何，抗体或抗体片段必须具有生物活性，例如与其同源抗原的特异性结合特性。通过对蛋白质特定区域进行突变并随后对其表达的多肽进行检测，可以鉴定出抗体或抗体片段的功能或活性区域。所述方法对本领域中普通技术人员而言是显而易见的，还可包括对编码抗体或抗体片段的核酸进行位点特异性突变(Zoller，M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3：348-354，1992)。
本发明中使用的“一种抗体”或“多种抗体”也指人类抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(例如，那些来源于小鼠、大鼠或兔等的抗体)在人体内具有天然抗原性，因此将其施用于人时会产生不希望有的免疫反应。因此，在所述方法中使用人或人源化抗体降低了在将抗体施用于人体后引起的不希望的免疫反应的几率。
(2)人类抗体
可使用任何技术来制备人类抗体。制备人单克隆抗体的技术的例子见下列文章：Cole等(Monoclonal Antibodies and Caner Therapy，Alan R.Liss，77页，1985)、Boerner等(J.Immunol.，147(1)：86-95，1991)。使用噬菌体展示文库也可制备人类抗体(和人类抗体片段)(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381，1991；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581，1991)。
也可从转基因动物中获得人类抗体。例如，已经描述了免疫后能够产生人类抗体的全部组成成分的转基因、突变小鼠，参见下列文章：Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-255(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immunol.，7：33(1993)。特别地，嵌合小鼠和种系突变小鼠中的抗体重链绞链区(J(H))基因的纯合性缺失，导致内源性抗体的生成完全被抑制；将人种系抗体基因阵列成功转移进所述种系突变的小鼠中，导致受到抗原刺激的小鼠能够产生人类抗体。
(3)人源化抗体
抗体人源化技术通常包括使用重组DNA技术对编码抗体分子一条或多条肽链的DNA序列进行操作。因此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合的抗体或抗体链(或其片段，例如Fv(可变区)、Fab、Fab’或抗体的其他抗原结合部分)，其含有非人(供体)抗体的抗原结合位点的一部分，所述部分整合入人类(受体)抗体的结构中。
为了产生人源化抗体，来自于受体(人类)抗体分子的一个或一个以上互补决定区(CDRs)中的残基被供体(非人类)抗体分子的一个或一个以上CDRs中的残基所取代，所述非人类抗体分子已知具有理想的抗原结合特性(例如，针对靶抗原的某种水平的特异性和亲和力)。在一些例子中，人类抗体Fv框架(FR)的残基被相应的非人类抗体的残基取代。人源化抗体也可含有一些残基，所述残基在受体抗体和整合入的CDR或框架序列中均不存在。通常，人源化抗体含有一个或一个以上来自例如非人类动物来源的氨基酸残基。在实践中，人源化抗体通常是这样的人类抗体，其中，一些CDR残基也可能包括FR残基，被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代。人源化抗体通常至少含有抗体恒定区(Fc)的一部分，所述恒定区通常属于人类抗体(Jones等，Nature，321：522-525(1986)，Reichmann等，Nature，332：323-327(1988)，和Presta，Curr.Opin.Struct.Biol.，2：593-596(1992))。
本领域的技术人员熟知将非人源抗体进行人源化处理的方法。例如，可以采用Winter及其同事介绍的方法产生人源化的抗体(Jones等，Nature，321：522-525(1986)，Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)，Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，即用人源抗体的相应序列替代啮齿类CDRs或CDR序列。以下美国专利也阐述了生产人源化抗体的方法：4,816,567(Cabilly等)、5,565,332(Hoogenboomet等)、5,721,367(Kay等)、5,837,243(Deo等)、5,939,598(Kucherlapati等)、6,130,364(Jakobovits等)和6,180,377(Morgan等)。
(4)抗体的施用
按照本发明公开的方法施用抗体。还存在采用核酸传送抗体的方法。广泛的抗FPA或缓激肽模拟物抗体和抗体片段，以编码抗体或抗体片段的核酸制备物形式(例如，DNA或RNA)给病人或受试对象使用。病人或受试对象的自身细胞摄取核酸，并产生和分泌编码的抗体或抗体片段。可按照例如本发明公开的任何方法传送核酸。
8.受体
本发明公开FPA、BK和它们的突变体等分子，在缺血事件后显示出抗梗塞的特性，所述缺血事件例如脑和心脏缺血。已经知道这些分子是通过分子相互作用介导如上效应的。为了分离和鉴定与抗梗塞效应相关的分子相互作用和信号转导通路，本发明公开了使用FPA、BK和它们的突变体的方法和组合物。例如，这些分子可以用于筛选受体和其它已知分子以寻找发生的相互作用，也可以用于筛选分析，以鉴定与这些分子相互作用的新受体和分子。
例如，用FPA筛选150种受体，以判断哪个受体可与FPA相互作用。评价FPA相互作用的一种方法是，看FPA相对于其天然配体而言调节特定受体的数量。配体-受体结合的研究公开在表13和14中，例如，使用人型的血纤维蛋白肽A(FPA-h)调节配体-受体结合大于20％(抑制和兴奋)。
表13 FPAh 10微摩抑制
  缓激肽B1   24％
  缩胆囊素   33％
  雌激素ERa   33％
  三磷酸肌醇IP3   33％
  钾通道[Ka]   25％
  促甲状腺激素释放激素   23％
表14 FPAh 10微摩刺激
  血管内皮生长因子   22％
  谷氨酸AMPA   30％
  5羟色胺5-HT2a   21％
a)缓激肽受体
缓激肽也用于筛选上面讨论的相同的150种受体，并在实施例中讨论。这一分析用来决定在一组受体中是否有与缓激肽结合的受体。这一分析指示，缓激肽可结合2型血管紧张素受体(AT2)。缓激肽可抑制ATII与AT2受体的结合。应用一组缓激肽突变体和衍生物来识别缓激肽的重要结合区。
(1)血管紧张素通路
AT2受体是肾素-血管紧张素II通路的一部分。血管紧张素II在体液和钠的调节起重要作用，并且参与肾素的级联反应。肾素酶将血管紧张素原转换为血管紧张素I。血管紧张素转化酶(ACE)将血管紧张素I转换为血管紧张素II。血管紧张素II结合1型血管紧张素II受体(AT1)，导致血管收缩和醛固酮分泌，还控制血管加压素和ACTH(促肾上腺素皮质激素)的分泌。在各种心脏疾病(例如高血压)的治疗中使用阻断AT1与ATII相互作用的分子。例如，洛沙坦(科素亚)(每日剂量25-100毫克)，缬沙坦(代文)(每日剂量80-160毫克)，厄贝沙坦(Avapro)(每日剂量75-300毫克)，坎地沙坦(Atacand)(每日剂量4-16毫克)，它们均是这一类组合物的成员，即AT1阻断剂。
AT1阻断剂与ACE抑制剂有相似的作用，因为它们均降低ATII对AT1的刺激作用。然而，ACE抑制剂也减少缓激肽的降解，此作用是这类药物的有利效果也是不良效果。因此，这两类药物存在潜在的不同的临床作用。
血管紧张素I/血管紧张肽I是十肽，其序列为DRV YIH PFH L(SEQID NO：86)。ACE水解C-末端的二肽(组氨酸，亮氨酸)，产生ATII，其序列为DRV YIH PF(SEQ ID NO：87)。将血管紧张素II的N-末端天冬氨酸去除，形成血管紧张素III(RVY IHP F，SEQ ID NO：88)，血管紧张素III比血管紧张素II的作用弱。血管紧张素III引起醛固酮的释放，抑制脑啡肽的降解，增强Met-脑啡肽的麻醉活性。
血管紧张素II与两种类型G蛋白偶联膜受体相互作用，所述G蛋白偶联膜受体为AT1(1型)和AT2(2型)。AT1有3种主要的亚型(大鼠AT1A359个氨基酸；AT1B/AT III，359个氨基酸；和AT1C，177个氨基酸，与其它亚型一起均可由Genbank中查得)。结构分析显示，大鼠AT1受体具有7次跨膜的结构域，N-末端在胞外，C-末端在胞内。ATII与AT1受体结合激活磷脂酰肌醇-钙级联。AT1受体至少在以下器官和组织表达：肝、肾、主动脉、肺、子宫、卵巢、脾、心脏、肾上腺和血管平滑肌。AT2基因(染色体x)编码363个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：89，接收号NP_000677，血管紧张素II受体，2型；血管紧张素受体2[智人])。
SEQ ID NO：89
1      gnstlatt   sknitsglhf givnisgnne stlncsqkps dkhldaipil yyiifvigfl
61     nivvvtlfc  cqkgpkkvss iyifnlavad llllatlplw atyysyrydw lfgpvmckvf
121    gsfltlnmfa siffitcmsv dryqsviypf lsqrrnpwqa syivplvwcm aclsslptfy
181    frdvrtieyl gvnacimafp pekyaqwsag ialmknilgf iiplifiatc yfgirkhllk
241    tnsygknrit rdqvlkmaaa vvlafiicwl pfhvltflda lawmgvinsc eviavidlal
301    pfaillgftn scvnpflycf vgnrfqqklr svfrvpitwl qgkresmscr kssslremet
361    fvs
其在子宫肌层高表达，在肾上腺表达水平较低。
刺激AT1和AT2受体产生不同的效应。例如AT1受体增加血管收缩，AT2受体增加血管舒张。认为AT2受体增加NO，而NO具有保护心脏的作用。基因敲除小鼠AT2受体研究显示，丢失AT2受体导致心梗后心脏破裂(recupture)。(Ichihara S.等，Circulation，2002年10月，106：2244-9)。心梗期间，AT1和AT2似乎被上调。AT2受体参与肾脏的血管舒张剂级联。此级联包括产生缓激肽、一氧化氮和cGMP。这一作用与AT1受体执行的功能和活性相反。认为AT1和AT2受体均参与凋亡，作为AT1和AT2受体阻断剂的ATII与之相互作用阻止凋亡，但是刺激AT2导致凋亡。Ono H.和Ishimitsu，Nippon Rinsho，2002年10月，60：1987。
(2)ATII2拮抗剂和激动剂
本发明公开了2型血管紧张素II受体的拮抗剂和激动剂。例如，PD123177和PD123319(Timmermans PB，等，Pharmacol Rev，1993年6月；45(2)：205-51)，血管紧张素II受体和血管紧张素II受体的拮抗剂，(至少作为与AT1和AT2拮抗剂、激动剂以及它们结构相关的文献，引入作为参考)，CPG42112A[烟碱基-Tyr-Lys(2-Arg)-His-Pro-Ile-OH]，为AT2受体拮抗剂。2型ATII受体的抗体也能起到激动剂和拮抗剂的功能。
例如，在Wilmington，DE 19880中，讨论了血管紧张素受体激动剂和拮抗剂。血管紧张素II受体亚型：选择性拮抗剂和功能相关物(Angiotensin II receptor subtypes：selective antagonists andfunctional correlates)，European Heart Journal，附刊15 D：79-87，1994；Wilmington，DE 19880-0400。New perspectives inangiotensin system control，Journal of Human Hypertension.7副刊2：S19-31，1993；和Dinh，D.T.等，Angiotensin receptors：distribution，signaling and function，Clinical Science(2001)100，(481-492)(英国印刷，至少作为调控血管紧张素通路和AT1、AT2拮抗剂与激动剂的结构相关的文献，引入作为参考)。
Xu等已经讨论了各种拮抗剂和它们对梗塞的效应。(“(AT(1)and AT(2)receptor expression and blockade after acute ischemia-reperfusion in isolated working rat hearts)”，Am.J.Physiol.HeartCirc.Plzysiol 282(4)：H206-15(2002))；Ford等(“(AngiotensinII reduces infarct size and has no effect on post-ischemiccontractile dysfunction in isolated rat hearts)”Br.J.Pharmacol.134(1)：38-45(2001))；Ford等(“(Characterization ofcardioprotection mediated by AT2 receptor antagonism afterischemia-reperfusion in isolated working rat hearts)”J.Cardiovasc.Pharmacol.Ther.5(3)：211-21(2000))；和Ford等(“(Opposite effects of angiotensin AT1 and AT2 receptor antagonistson recovery of mechanical function after ischemia-reperfusion inisolated working rat hearts)”Circulation 94(12)：3087-9(1996))，本发明引入了以上文献关于调节2型血管紧张素II受体的全部物质。可以理解，申请人可以使用这些文献中包含的材料，来支持权利要求中未包含在所述材料中的主题。
9.所有适当的组合物的应用性
a)序列相似性
可以这样理解，这里使用的术语同源性和一致性等价于相似性。例如，如果在两个非天然序列间使用同源性一词，理解为这两个序列不必有进化关系，而是关注它们的核酸序列相似性或相关性。为了测量序列相似性的目的，许多用于检测进化相关分子的同源性的方法通常可以应用于两个或更多核酸或蛋白，而不管它们是否在进化上相关。
通常，可以理解，一种定义本发明公开的基因或蛋白质的任何已知变异体和衍生物或其它可能出现的物质的方式是通过定义变异体和衍生物与特异已知序列的同源性。这里公开的特异序列的一致性，在本发明的其它处亦有讨论。通常，本发明公开的基因和蛋白的突变体，与所述序列或天然序列的同源性至少大约为70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。在该领域中，测定两种蛋白或核酸序列(例如基因)同源性的技术是容易理解的。例如，将两序列进行比对后可以计算它们的同源性，以使同源性达到其最高水平。
另一种计算同源性的方法是采用公布的运算法则。序列比较的最佳比对由Smith和Waterman的局部同源性运算法则得出，Adv.Appl.Math.2：482(1981)，或由Needleman和Wunsch的同源性比对法则得出，J.MoLBiol.48：443(1970)，或由Pearson和Lipman的相似性查找方法得出，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444(1988)，或由这些运算法则进行计算得出(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在威斯康星遗传软件包(the Wisconsin Genetics Software Package)中，遗传计算机小组(Genetics Computer Group)，575 Science Dr.，Madison，威斯康星)，或由目测方法得出。
例如，使用以下公开的运算法则能够得到核酸的相同类型的同源性：Zuker，M.Science 244：48-52，1989，Jaeger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710，1989，Jaeger等Methods  Enzymol.183：281-306，1989，至少作为与核酸比对相关的材料，本发明引入上述文献。可以理解，任何有代表性的方法都可以使用，且在某特定例子中，不同方法的结果可能不同，但本领域技术人员理解，如果这些方法中的至少有一种方法发现序列的一致性，则这些序列可以说具有所述的一致性，并在本发明中公开。
例如，本发明中所使用的那样，一个序列与另一个序列具有特定的百分比同源性，说明序列的所述同源性可由上述一种或一种以上的计算方法得出。例如，第一个序列与第二个序列相比，如果使用Zuker计算法得同源性为80％，即使采用任何其它计算方法得到的同源性均不为80％，则根据本发明的定义，两序列的同源性为80％。另一个例子，如果经Zuker计算法和Pearson和Lipman计算法计算，第一个序列与第二个序列的同源性为80％，即使经Smith和Waterman计算法、Needleman和Wunsch计算法、Jaeger计算法或任意其它计算方法计算两序列的同源性不为80％，则根据本发明的定义，两序列的同源性为80％。再一个例子，如果经每一种计算法计算，第一个序列与第二个序列的同源性均为80％，则根据本发明的定义，两序列的同源性为80％(尽管实际中不同的计算方法经常会产生不同的同源性计算百分比结果)。
b)杂交/选择性杂交
术语“杂交”通常指，至少两条核酸分子间，例如引物或探针与基因，序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用是指，发生在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸的衍生物间，以核苷酸特异的方式相互作用。例如，G与C相互作用，A与T相互作用即是序列驱动的相互作用。典型的序列驱动相互作用发生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面。两条核酸的杂交受本领域技术人员已知的许多条件和参数的影响。例如，盐的浓度、pH、反应温度均会影响两条核酸分子是否能杂交。
两条核酸分子间选择性杂交的参数是本领域普通技术人员众所周知的。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件被定义为严格的杂交条件。例如，杂交的严格度由杂交和/或洗脱步骤的温度和盐浓度控制。例如，完成选择性杂交的杂交的条件包括，在高离子强度溶液(6×SSC，6×SSPE)，温度大约在低于Tm(融解温度，在此温度下，一半的杂交体分子解离)12～25℃下杂交，紧接着在选定的温度和盐溶液下洗脱，洗脱温度一般约低于Tm 5～20℃。在预实验中很容易根据经验确定温度和盐条件，在预实验中，固定在滤膜上的参考DNA，与所关心的标记核酸杂交，然后在不同的严格条件下洗脱。对DNA-RNA、RNA-RNA杂交，杂交温度通常较高。使用上述的条件或本领域已知的条件达到上述严格度。(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约，1989；Kunkel等Methods Enzymol.1987：154：367，1987，至少作为核酸杂交的材料引入本发明)。对DNA:DNA杂交优选的严格杂交条件是，在约68℃(水溶液)6×SSC，6×SSPE，然后68℃下洗脱。当所需的互补程度降低时，如果愿意，可以随之降低杂交和洗脱的严格性，进一步而言，这一严格性依赖于在其中寻找差异的区域的G-C、A-T的富集程度。类似地，当需要增加同源性时，如果愿意，可以随之增加杂交和洗脱的严格性，进一步而言，这一严格性依赖于在其中寻找差异的区域G-C、A-T的富集程度，希望这一区域具有很高的同源性，所有这些在本领域中都是已知的。
另一种定义选择性杂交的方法是看其中一条核酸结合另一条核酸的量(百分比)。例如，在一些实施方案中，选择性杂交的条件是限制性核酸与非限制性核酸结合的量至少约为60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％。通常，非限制性引物超过例如10倍、100倍或1000倍。可以在下述条件下进行分析：限制性和非限制性引物均低于它们的Kd值10倍、100倍或1000倍；核酸分子之一低于其Kd值10倍、100倍或1000倍；一条核酸分子或两条核酸分子高于它们的Kd值。
另一种定义选择性杂交的方法是看在需要杂交来促进期望的酶操控条件下，获得酶操控的引物百分比。例如，在一些实施方案中，选择性杂交的条件是，在促进酶调控的条件下，引物百分比至少约为60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％。例如，如果被酶调控的是DNA延长，则选择性杂交的条件是至少约为60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的引物分子被延长。优选的条件包括厂商建议的条件或本领域指导的适于酶酶执行调控的条件。
像同源性一样，本发明公开了测定两条核酸分子的杂交水平的多种方法，这是可以理解的。同样可以理解，这些方法和条件得出的两条核酸分子的杂交百分比是不同的，除非另有说明，任意一种满足该参数的方法均足以应用。例如，如果想获得80％的杂交，无论这些方法中哪个，只要杂交能够获得所需要的参数，都认为被本发明公开了。
本领域的技术人员知道，如果一种组合物或方法满足判定杂交的任意一个标准，或者全部满足或者只满足一条，则此组合物或方法在此公开。
C)核酸
本发明公开了基于核酸的多种分子，包括例如编码如FPA、缓激肽、或它们的片段的核酸，本发明还公开了多种功能性核酸。公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸的类似物、核苷酸的替代物组成。在本发明中公开了这些非限制性的例子和其它分子。应理解，例如当载体在细胞中表达时，表达的mRNA通常由A、C、G、U组成。同样，应理解，如果，例如通过外源递送方法，将反义分子导入细胞或细胞环境，由核苷酸类似物组成的反义分子更有利，因为核苷酸类似物减少了反义分子在细胞环境中的降解。
(1)核苷酸和相关分子
核苷酸是包含碱基部分、糖基部分和磷酸部分的分子。核苷酸可由它们的磷酸部分和糖基部分连接起来，形成一个核苷内的连接。核苷酸的碱基部分可以是9’腺嘌呤(A)、1’胞嘧啶(C)、9’鸟嘌呤(G)、1’尿嘧啶(U)和1’胸腺嘧啶(T)。核苷酸的糖基部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价磷。核苷酸的非限制性例子为3’-AMP(3’-腺苷单磷酸)或5’-GMP(5’-鸟苷单磷酸)。
核苷酸的类似物是碱基、糖、磷酸部分上进行了某种类型的修饰的核苷酸。对核苷酸进行修饰在本领域中是众所周知的，包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺苷，同时也可对糖或磷酸基团进行修饰。
核苷酸的替代物是与核苷酸具有相似的功能特性的分子，但不包含磷酸部分，所述核苷酸的替代物例如肽核酸(PNA)。核苷酸的替代物以Watson-Crick或Hoogsteen方式识别核酸，但它们不是通过磷酸部分连接起来。核苷酸的替代物与合适的目的核酸相互作用能够形成双螺旋结构。
核苷酸或核苷酸的类似物也可以连接其它类型分子(结合物)以增强例如细胞的摄取。用化学的方法将结合物连接到核苷酸或核苷酸的类似物上。这种结合物包括，但不限于，诸如胆固醇基团等脂基团。(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)Watson-Crick相互作用是指与核苷酸、核苷酸类似物、或核苷酸替代物的Watson-Crick面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物、或核苷酸替代物的Watson-Crick面包括C2、N1、和C6位置的嘌呤碱基核苷、核苷酸类似物或核苷酸替代物，和C2、N3、C4位置的嘧啶碱基核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物。
Hoogsteen相互作用是指发生在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面上的相互作用，所述Hoogsteen面暴露在DNA双螺旋的大沟中。Hoogsteen面包含N7位置，和嘌呤核苷酸C6位置的反应基团(NH2或O)。
(2)序列
多种序列与FPA、缓激肽、它们的片段的基因有关，这些序列可以在Genbank中查找，例如网址http：//www.pubmed.gov，整体将这些序列和其它序列以及其中所包含的单个序列引入本发明作为参考。
表1中列出了一个特殊的序列，即人源的FPA，并将其作为一个例子举例说明本发明公开的组合物和方法。应理解，除非另有说明，与这一序列有关的描述适用于与FPA相关的任何序列或本发明公开的任何序列。本领域的技术人员知道如何处理序列的差异和不同，并知道相对于其它相关序列(即FPA或缓激肽的序列)，如何调整与特定序列有关的组合物和方法。根据本发明公开的信息和本领域已知的信息，可以为任何FPA或缓激肽序列设计引物和/或探针。
(3)引物和探针
本发明公开的组合物包括引物和探针，它们能够与本发明公开的FPA、缓激肽或它们的片段相互作用。在某个实施方案中，将引物用于DNA扩增反应。通常，引物能够以序列特异的方式延伸。在序列特异的方式下引物的延伸包括许多方法，其中与引物杂交的或其它方式相互作用的核酸分子的序列和/或组合物，指导或影响由引物延伸产生的产物的组合物或序列。因此，在序列特异的方式下引物的延伸包括，但不限于：PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA多聚化、RNA转录或反转录。优选在序列特异的方式下扩增引物的技术和条件。在某些实施方案中，将引物用于DNA扩增反应，例如PCR和直接测序。在某些实施方案中，使用非酶学技术延伸引物也是可以理解的，例如对用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸进行修饰，这样能够用化学反应的方法以序列特异的方式延伸引物。本发明公开了与FPA核酸、缓激肽核酸和/或它们的片段杂交的引物，或与FPA核酸、缓激肽核酸和/或它们的片段的互补序列杂交的引物。
d)将组合物递送至细胞
(1)核酸递送
有许多可用于将核酸递送至细胞的方法和组合物，所述细胞包括体内或体外细胞。这些方法和组合物大体上分为2类：基于病毒的递送系统和基于非病毒的递送系统。例如，能通过许多直接递送系统将核酸递送至细胞，方法例如电穿孔、脂质体、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒，或通过转移细胞内或载体内的基因物质，所述载体如阳离子脂质体。合适的转染方法包括病毒载体、化学转染剂或物理—机械方法如电穿孔和DNA的直接融合，例如在下面文章中有描述：Wolff，J.A.等，Science，247，1465-1468，(1990)；Wolff，J.A.Nature，352，815-818，(1991)。所述组合物和方法在本领域中为人熟知并容易修改使用。在某个实施方案中，对所述方法进行修改，以满足特殊的功能如携带大DNA分子。进一步，利用靶向特性的载体，使用这些方法能够靶向某些疾病或细胞群体。
本发明描述的方法中，包含施用和摄取外源DNA使其进入受试对象的细胞中(例如基因转导或转染)，可以将核酸以裸露的DNA、RNA形式，或位于载体中的形式，递送至细胞，正如本领域普通技术人员熟知的一样，编码DNA、DNA或片段在启动子和增强子的转录调控之下。载体可以通过通过商购获得，例如腺病毒载体(Quantum Biotechnologies，Inc.(Laval，Quebec，加拿大)。
作为一个例子，可以通过病毒系统递送载体，所述病毒载体例如逆转录病毒载体系统，它可以将重组的逆转录基因组打包(参见Pastan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：4486，1988；Miller等，Mol.Cell.Biol.6：2895，1986)。然后可将重组的逆转录病毒用于转染，并由此将编码广泛中和抗体的核酸(或其活性片段)转入细胞。当然，将改变的核酸引入细胞的确切方法不仅仅限制于使用逆转录病毒载体。还可广泛应用其它技术，包括使用腺病毒(Mitani等，Hum.Gene Ther.5：941-948，1994)，腺相关病毒(AAV)载体(Goodman等，Blood 84：1492-1500，1994)，慢病毒载体(Naidini等，Science 272：263-267，1996)，假型逆转录病毒载体(Agrawal等，Exper.Hematol.24：738-747，1996)。也可使用物理转导技术，例如脂质体递送和受体介导的机制和其它细胞外机制(参见，例如Schwartzenberger等，Blood 87：472-478，1996)。本发明公开的组合物可以使用任意上述的方法或其它常用的基因转移方法。
作为一个例子，如果编码抗体的核酸或其它核酸以腺病毒为载体应用已知的方法转入受试对象的细胞中，给人类施用的腺病毒量为107-109噬斑形成单位(pfu)/每次注射，但也可高达1012pfu/每次注射，所述其它核酸编码FPA、缓激肽或它们片段的模拟物，或编码FPA、缓激肽或它们片段的特定变异体(Crystal，Hum.Gene Ther.8：985-1001，1997；Alvarez和Curiel，Hum.Gene Ther.8：597-613，1997)。一个受试对象可以接受一次注射，或者，如果必须进行额外注射，他们可以每隔6个月后再次注射(或其它合适的时间间隔，这由熟练的执业医生决定)，对注射时间不作限制，直到治疗起效。
如果采用胃肠道外给予核酸或载体，一般为注射剂型。可将注射物制成常规剂型，为液体溶液或悬液、注射前易于制成液体悬液的固体形式，或乳剂。最新改进的胃肠道外给药包括使用缓释或控释系统，以维持固定的剂量。参见美国专利3,610,795，并引入作为参考。此外，关于合适的制剂和治疗化合物的各种给药途径的讨论，参见，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(第19版)，A.R.Gennaro编辑，Mack Publishing Company，Easton，PA 1995。
被递送至细胞并整合入宿主细胞基因组的核酸通常含有整合序列。这些整合序列通常是病毒相关序列，尤其是使用病毒载体时更是如此。也可以将这些病毒整合系统插入核酸中，当使用非核酸递送体系如脂质体递送所述核酸时，包含其中的核酸可以整合入宿主基因组。
整合入宿主基因组的其它常用技术包括，例如设计用于促进与宿主基因组同源重组的体系。这些体系通常依赖于预表达核酸的侧翼序列，这些序列与宿主基因组中靶序列充分同源，载体核酸和靶核酸发生重组，导致递送的核酸整合入宿主基因组。本领域技术人员已知促进同源重组的必要体系和方法。
(2)非核酸系统
本发明公开的组合物可以通过多种方法进入靶细胞。如电穿孔、脂转染或磷酸钙沉淀。所选的递送机制部分依赖于靶细胞的类型，和在体内还是在体外发生所述递送。
因此，组合物除了包含公开的例如组合物或载体，还包含脂质如脂质体，脂质体例如阳离子脂质体(例如DOTMA、DOPE、DC-胆固醇)或阴离子脂质体。如果需要，脂质体可进一步与蛋白结合以易于靶向特定细胞。给予的组合物包含化合物和阳离子脂质体，所述组合物能够经血液传入靶器官或吸入呼吸道并进入呼吸道的靶细胞。关于脂质体，参见，例如Brigham等，Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.1：95-100(1989)；Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：7413-7417(1987)；美国专利号：4,897,355。例如，化合物可作为微胶囊的组分靶向特异的细胞，例如巨噬细胞，或者使化合物从微胶囊中扩散出来或转运出来时具有指定的速率或剂量。
上述的方法中涉及施用和摄取外源DNA使其进入受试对象的细胞中(基因转导或转染)，将组合物递送入细胞可以通过许多机制。举一个例子，可以通过脂质体，使用市售的脂质体脂质体制剂，例如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)，SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，德国)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，还有其它根据本领域标准方法开发的脂质体。此外，核酸和载体在体内能通过电穿孔递送，该技术可从Genetronics，Inc.(SanDiego，CA)得到，及依靠SONOPORATION仪器(ImaRx PharmaceuticalCorp.，Tucson，AZ)的方法。
可将所述物质制成溶液、悬液(混合入微颗粒、脂质体或细胞)。通过抗体、受体或受体配体，能够将这些物质靶向特异的细胞类型。以下参考文献是使用特异蛋白靶向肿瘤组织的技术的例子(Senter，等，Bioconjugate Chem.，2：447-451，(1991)；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60：275-281，(1989)；Bagshawe，等，Br.J.Cancer，58：700-703，(1988)；Senter，等，Bioconjugate Chem.，4：3-9，(1993)；Battelli等，Cancer Immunol.Immunother.，35：421-425，(1992)；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews，129：57-80，(1992)；Roffler等，Biochem.Pharmacol，42：2062-2065，(1991))。这些技术同样适于各种其它特定类型的细胞。载体例如“秘密行动(Stealth)”和其它连接有抗体的脂质体(包括脂质介导药物靶向到结肠癌)、通过细胞特异配体由受体介导的DNA靶向、淋巴细胞指导的肿瘤靶向、小鼠神经胶质瘤细胞的体内高特异性治疗用逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用特异蛋白靶向肿瘤组织的技术的例子(Hughes等，Cancer Research，49：6214-6220，(1989)；Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104：179-187，(1992))。总的来讲，受体参与细胞内吞作用通路，所述内吞作用或者是组成性的或者是由配体引起。这些受体在由网格蛋白包被的小凹中聚集，并通过网格蛋白包被的小泡进入细胞，通过酸化的包涵体，在这里受体被分选，然后分选后的受体或者循环至细胞表面而保存在细胞内，或者被溶酶体降解。内化通路执行各种功能，如营养物的摄取、被激活的蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的分离或降解、受体水平的调节。许多受体采用一条以上的细胞内通路，这取决于细胞的类型、受体浓度、配体的类型、配体价态和配体浓度。受体介导的内吞作用的分子和细胞机制在下文中综述(Brown和Greene，DNA and Cell Biology 10：6，399-409(1991))。
(3)体内/离体
如上所述，可以使用药学上可以接受的载体施用组合物，并将所述组合物递送入体内和/或离体的受试对象的细胞，本领域已知递送的各种机制(例如裸DNA的摄取、脂质体融合、通过基因枪肌内注射DNA、内吞作用等)。
如果使用离体方法，可根据本领域熟知的标准实验方案，取出并在体外培养细胞和组织。组合物可以通过任何基因转移机制进入细胞，所述机制包括：例如磷酸钙介导的基因递送、电穿孔、微注射、蛋白脂质体。使用标准的方法将转化的细胞注入(用药物学可接受的载体)或同伦(homotopically)移植回患者的细胞或组织类型中。向受试对象移植或注入各种细胞的标准方法是已知的。
e)表达系统
递送到细胞的核酸通常带有表达控制系统。例如，病毒或逆转录病毒系统的插入基因通常包含启动子、和/或增强子，以有助于控制目的基因产物的表达。启动子是DNA的一个序列或许多序列，其在与转录起始位点相对固定的位置行使功能。启动子包含与RNA聚合酶和转录因子相互作用的核心元件，此外启动子也可包含上游元件和效应元件。
(1)病毒启动子和增强子
优选的启动子在哺乳宿主动物细胞中的载体上控制转录，这种启动子有许多来源，例如来自以下病毒的基因组：多瘤病毒、猿病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙肝病毒，最优选巨细胞病毒；或来自异源哺乳动物的启动子，如β肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子很容易以SV40限制性片段的形式获得，所述SV40限制性片段也包含SV40病毒的复制起点(Fiers等，Nature，273：113(1978))。人巨细胞病毒的即刻早期启动子很容易获得，它是一个HindIII E限制性片段(Greenway，P.J.等，Gene 18：355-360(1982))。当然，宿主细胞或相关种系的启动子也十分有用。
增强子一般指一段DNA序列，其在与转录起始位点没有固定距离的位置行使功能，其可以在转录单元的5’端(Laimins，L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.78：993(1981))，也可在3’端(Lusky，M.L.，等，Mol.Cell Bio.3：1108(1983))。此外，增强子可以位于内含子中(Banerji，J.L.等，Cell 33：729(1983))，也可以位于编码序列自身中(Osborne，T.F.，等，Mol.Cell Bio.4：1293(1984))。它们的长度通常在10～300bp，且它们的功能是顺式作用。增强子的功能是增加邻近的启动子转录。增强子还经常包含介导转录调节的效应元件。启动子也经常包含介导转录调节的效应元件。增强子经常决定基因表达的调节。已知许多哺乳动物的增强子序列(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素)，其中典型的也使用真核细胞病毒的增强子用于一般性表达。优选的例子是，在复制起点下游(late side)(100～270bp)的SV40增强子，巨细胞早期启动子的增强子，在复制起点下游的多瘤病毒增强子，腺病毒增强子。
启动子和/或增强子可以被光或能触发其功能的化学事件特异性激活。系统可被诸如四环素和地塞米松等试剂调节。暴露于射线如γ射线，或烷基化化学治疗剂，能增强病毒载体的基因表达。
在某个实施方案中，启动子和/或增强子区域作为组成性启动子和/或增强子，使被转录的转录单元的表达最大化。即使启动子和/或增强子区域仅仅在某特殊的时间在某种特殊的细胞中表达，而在某些构建体中，它们可以在所有真核细胞类型中具有活性。优选的这种类型启动子是CMV启动子(650个碱基)。其它优选的启动子是SV40启动子，巨细胞病毒(全长启动子)，和逆转录病毒载体的LTF。
可以克隆所有特异性调控元件并将其用于构建表达载体，此载体选择性地在特异的细胞如黑素瘤细胞中表达。神经胶质原纤维乙酸蛋白(GFAP)启动子已用于起源于神经胶质的细胞中的基因的选择性表达。
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人和有核的细胞)中使用的表达载体包含终止转录所必须的序列，它可以影响mRNA的表达。这些区域在编码组织因子蛋白的mRNA的非转录部分转录为多聚腺苷酸片段。3’非转录区也包含转录终止位点。优选转录单元也包含多聚腺苷酸区。这一区域的优点是增加了象mRNA一样加工和递送转录单元的可能性。已经很好地建立了在表达构建体中鉴定和使用多聚腺苷酸信号的技术。优选在转基因构建体中使用同源的多聚腺苷酸信号。在某些转录单元中，多聚腺苷酸区域由SV40早期多聚腺苷酸信号衍生而来，由约400个碱基组成。转录单元包含其它单独的标准序列或与上述序列一起提高构建体的表达或稳定性。
(2)标记
病毒载体可包含编码标记产物的核酸序列。标记产物用于判定基因是否已经被转入细胞，和转入后是否表达。优选的标记基因是大肠杆菌lacZ基因，它编码β半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白。
一些实施方案中，标记可以为选择标记。用于哺乳动物细胞的选择标记的合适标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素、嘌呤霉素。当将选择标记成功地转移到哺乳动物宿主细胞中，如果将转化后的哺乳动物宿主细胞放置在选择性压力下，则可以存活。存在两种广泛使用的不同选择的类型。第一种类型建立在细胞代谢的基础上，其应用突变细胞系，这种细胞系在无附加物的培养基中不能生长。两个例子是：CHO DHFR细胞、小鼠LTK细胞。不添加额外的营养物如胸腺嘧啶或次黄嘌呤，这些细胞不能生长。因为这些细胞缺乏完成核苷酸合成所必须的基因，所以除非在含有附加物的培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们不能生存。一种向培养基中添加附加物的替换方法是将完整的DHFR或TK基因转入缺失相应基因的细胞中，因而改变了它们的生长需求。没有转入DHFR或TK基因的个体细胞不能在没有附加物的培养基中存活。
第二种类型是优势选择，它是指在任何细胞种类中使用选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物抑制宿主细胞的生长。那些转入了新基因的细胞能够表达抗药性的蛋白，在选择压力下将会存活。优势选择使用的药物例如：新霉素，(Southern P.和Berg，P.，J.Molec.Appl.Genet.1：327(1982))、霉酚酸(Mulligan，R.C.和Berg，P.Science 209：1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.等，Mol.Cell.Biol.5：410-413(1985))。这三个例子使用在真核的控制下的细菌基因分别抵抗适当的药物：G418或新霉素(geneticin)，xgpt(霉酚酸)，或潮霉素。其它包括新霉素的类似物G418和嘌呤霉素。
f)肽
(1)蛋白突变体
本发明讨论了FPA、缓激肽和/或它们的片段的大量突变蛋白，FPA、缓激肽和/或它们片段是已知的和本发明所考虑的。除了已知功能的FPA、缓激肽和/或它们片段、种系同源物，还存在FPA、缓激肽和/或它们片段的衍生物，这些衍生物在本发明公开的方法和组合物也行使功能。蛋白突变体和衍生物为本领域技术人员所熟知，并且包含氨基酸序列的修饰。例如，典型的氨基酸修饰归为以下三种类型：取代、插入、删除突变体中的一种或一种以上类型。插入包括氨基和/或羧基端融合连接，或序列间插入单个或多个氨基酸残基。一般插入的序列比氨基或羧基端融合连接的片段小，例如1～4个氨基酸残基。例如实施例描述的免疫原性融合蛋白衍生物，由融合足够大的多肽而制备，经体外交联法或用编码融合蛋白的DNA转化重组细胞培养物证实这些多肽对靶序列有免疫原性。删除是指从蛋白序列中去除一个或一个以上的氨基酸残基。通常，在蛋白分子中任何一个位点的删除不超过约2～6个残基。这些突变体通常由以下方法制备：使编码蛋白的DNA中特异核苷酸突变而产生编码变异体的DNA，使DNA在重组细胞中表达。在具有已知序列的DNA的预定位点进行取代突变的技术为人熟知，例如M13引物突变和PCR突变。氨基酸取代一般只涉及一个残基，但可同时发生在大量不同位点；插入一般为约1～10个氨基酸；删除一般在1～30个氨基酸残基。删除和插入优选以相邻对进行，即，删除2个残基或插入2个残基。取代、删除、插入、任何它们的组合能够联合使用以得到最终的构建体。突变不能使序列溢出阅读框，不能创造互补区而产生二级mRNA结构。取代突变是将至少一个残基取出并使不同的残基插入此位置。一般根据下表1、2进行取代，这样的取代被称为保守性取代。
表4：氨基酸缩写
  氨基酸   缩写
  丙氨酸   AlaA
  allosoleucine   AIle
  精氨酸   ArgR
  天冬酰胺   AsnN
  天冬氨酸   AspD
  半胱氨酸   CysC
  谷氨酸   GluE
  谷氨酰胺   GlnQ
  甘氨酸   GlyG
  组氨酸   HisH
  异亮氨酸   IleI
  亮氨酸   LeuL
  赖氨酸   LysK
  苯丙氨酸   PheF
  脯氨酸   Prop
  焦谷氨酸(Pyroglutamic acidp)   Glu
  丝氨酸   SerS
  苏氨酸   ThrT
  酪氨酸   TyrY
  色氨酸   TrpW
  缬氨酸   ValV
                表5：氨基酸取代
  原始残基的保守取代示例，其它的为该领域所熟知
  Ala   ser
  Arg   lys、gln
  Asn   gln、his
  Asp   glu
  Cys   ser
  Gln   asn、lys
  Glu   asp
  Gly   pro
  His   asn、gln
  Ile   leu、val
  Leu   ile、val
  Lys   arg、gln
  Met   leu、ile
  Phe   met、leu、tyr
  Ser   thr
  Thr   ser
  Trp   tyr
  Tyr   trp、phe
  Val   ile、leu
一些选择性取代使功能或免疫学特性发生实质改变，这些选择性取代的保守性比表5中显示的差，即，选择在维持以下方面具有更明显差异效果的残基：(a)取代区域中多肽骨架结构，例如片层和螺旋构象，(b)靶位点分子的电荷和疏水性，或(c)大多数侧链的体积。一般认为蛋白质特性产生最大改变的取代体现以下几个方面：(a)亲水残基(例如丝氨酰、苏氨酰)与疏水残基(例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、例如缬氨酰、丙氨酰)相互取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸与其它氨基酸相互取代；(c)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰、精氨酰、组氨酸)与具有负电性侧链的残基(例如谷氨酰、天冬氨酰)相互取代；(d)具有大量侧链的残基(例如苯丙氨酸)与不具侧链的残基(例如甘氨酸)相互取代；(e)增加硫酸化和/或糖基化位点的数量。
例如，一个氨基酸由在生物学和/或化学上相似的另一个氨基酸替代，为本领域的技术人员已知的保守性取代。例如，保守性取代可以为：一个疏水残基取代另一个疏水残基，或一个极性残基取代另一个极性残基。取代包括以下组合：例如Gly、Ala；Val、Ile，、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。本发明中清楚公开的序列中的这样保守性取代突变，包含在本发明的镶嵌型多肽中。
取代或删除突变能够在N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或0-糖基化(Ser或Thr)插入位点使用。删除半胱氨酸残基或其它易变化的残基也可能是值得做的。删除或取代潜在的蛋白水解位点例如Arg，是可以实现的，例如通过删除一个基础残基(basic residue)，或用谷氨酰胺或组氨酸残基取代一个基础残基。
某些转录后衍生物是重组的宿主细胞作用于表达多肽的结果。通常谷氨酰胺和天冬酰胺残基在转录后去氨基生成相应的谷氨酸和天冬氨酸残基。这些残基选择性地在温和的酸性条件下脱氨基。其它转录后修饰包括：使脯氨酸和赖氨酸羟基化，使丝氨酸或苏氨酸残基上的羟基基团磷酸化，使赖氨酸、精氨酸、组氨酸侧链上的O-氨基基团甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco 79-86页[1983])，使N-末端氨基酸乙酰化，和在一些例子中，使C-末端羧基氨基化。
应理解，定义本发明公开的突变体和衍生物的一种方法是，根据与已知特定序列的同源性/同一性来定义突变体和衍生物。本发明明确公开的突变体和其它蛋白，与规定的序列至少有70％、75％、80％、85％、90％或95％的同源性。本领域的技术人员容易理解怎样判定两种蛋白的同源性。例如，可将两条序列比对后进行同源性计算，所述比对是为了使同源性的水平最高。
另一种同源性的计算方法可应用已公布的运算规则。用于比较的优化的比对序列可通过以下方法实现：局部同源性运算规则(Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981))，或同源比对运算规则(Needleman和Wunsch，J.MoL Biol.48：443(1970))，或寻找相似性的方法(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444(1988))，或计算机执行这些运算规则(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，位于威斯康星遗传软件包中，遗传计算机小组，575 Science Dr.，Madison，WI)，或目测。
核酸能够获得相同类型的同源性，例如，通过公布的运算规则：Zuker，M.Science 244：48-52，1989，Jaeger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710，1989，Jaeger等，Methods Enzymol.183：281-306，1989，至少作为与核酸比对相关的材料引入本发明作为参考。
可以理解关于保守性突变和同源性的描述以某种方式结合在一起。例如，在与特定的序列具有至少70％同源性的实施方案中，突变体就是保守性突变。
说明书中讨论了各种蛋白和蛋白序列，应理解，本发明还公开了编码这些蛋白序列的核酸。这些核酸包括与特异蛋白序列相关的所有简并序列，即包括具有编码一个特定蛋白序列的序列的所有核酸，以及包括简并核酸的所有核酸，和编码公开的蛋白序列的衍生物和突变体的所有核酸。因此，尽管本说明没有写出每一个特异的核酸序列，应理解实际上每条和每种序列都通过公开的蛋白序列得到了公开和描述。还应理解，虽然在生物体内，氨基酸序列并不能显示是哪一条特定特异核酸序列编码这个蛋白，但是在产生该蛋白的特定生物体中，编码该蛋白的核酸序列也是已知的并在此公开和描述。在上述生物体内，公开的蛋白的特定突变体也得到公开。
人们知道有许多的氨基酸和肽的类似物，公开的组合物也包含了它们。例如有许多D氨基酸和与表1、2中列出的氨基酸具有不同功能取代基的氨基酸。本发明公开了天然肽的相反立体异构体，同时公开了肽类似物的立体异构体。通过携带选定氨基酸的tRNA分子和基因工程构建体可以使所述氨基酸很容易整合入多肽链中，这种基因工程构建体使用，例如琥珀密码子，向肽链定点插入氨基酸类似物(Thorson等，Methodsin Molec.Biol.77：43-73(1991)，Zoller，Current Opinion inBiotechnology，3：348-354(1992)；Ibba，Biotechnology & GeneticEngineering Reviews 13：197-216(1995)，Cahill等，TIBS，14(10)：400-403(1989)；Bunner，TIB Tech，12：158-163(1994)；Ibba和Hennecke，Bio/teclmology，12：678-682(1994)，所有文献至少作为与氨基酸类似物相关的材料引入本文作为参考)。
能够合成与肽类似的分子，但它们不是通过天然肽的连接方式连接。例如，氨基酸或氨基酸的类似物的连接方式，可以包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--、和--CHH2SO-(这些基团和其它的基团能够在下列书中找到：Spatola，A.F.在Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，andProteins，B.Weinstein编辑，Marcel Dekker，纽约，267页(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(1983年3月)，卷1，期3，Peptide BackboneModifications(综述)；Morley，Trends Pharm Sci(1980)，页463-468；Hudson，D.等，hit J Pept Prot Res 14：177-185(1979)(--CH2NH--、CH2CH2--)；Spatola等，Life Sci 38：1243-1249(1986)(--CH H2--S)；Hann J.Chem.Soc Perkin Trans.1307-314(1982)(--CH--CH--，顺式和反式)；Almquist等，J.Med.Chem.23：1392-1398(1980)(--COCH2--)；Jennings-White等，Tetrahedron Lett  23：2533(1982)(--COCH2--)；Szelke等，European Appln，EP 45665CA(1982)：97：39405(1982)(--CH(OH)CH2--)；Holladay等，Tetrahedron.Lett 24：4401-4404(1983)(--C(OH)CH2--)；Hruby Life Sci 31：189-199(1982)(--CH2--S--)；将以上每篇文件引入本文作为参考。特别优选的非肽连接是--CH2NH--。应理解，肽的类似物可以在成键原子间具有多于一个的原子，例如，b-丙氨酸，g-氨基丁酸等。
氨基酸类似物和类似物和肽类似物通常具有增强的或所需的特性，如更经济、化学上更稳定、药理学特性增强(半衰期、吸收、效能、效力等)、特异性改变(例如广谱的生物学特征)、抗原性减少，等等。
因为D-氨基酸不为肽酶所识别，所以D-氨基酸能用于产生更稳定的肽。使用同种类型的D-氨基酸系统性地取代共有序列中一个或一个以上氨基酸(例如D-赖氨酸替换L-赖氨酸)，可以产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可用于环化或连接两个或两个以上的肽。这对使肽现定为特殊的构象是有利的。(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，引入该文献作为参考)。
g)药物载体/药物产物的递送
如上所述，组合物也可采用药物学可接受的载体体内给要。“药物学可接受”意指物质不产生生物学或其它方面不希望的特性，即当将这种物质与核酸或载体一起给予受试对象时，不产生任何不希望的生物学效应，或不与含有这些物质的药物组合物中的任何其它组分发生有害的相互作用。所选的药物载体使活性组分的降解最小，使受试对象的不良反应最小，对此本领域的技术人员是熟知的。
组合物可口服、胃肠道外给药(例如静脉给药)、肌内注射、腹膜内注射、皮下给药、体外给药、局部给药等，其中局部给药包括局部鼻内给药或吸入给药。本发明里的“局部鼻内给药”是指将组合物通过鼻孔分布于鼻、鼻道，分布机制包括喷雾机制或滴鼻机制或通过核酸、载体的气雾化机制。组合物吸入给药可通过鼻或嘴使用喷雾装置或悬滴装置完成。通过插管(法)，组合物能够直接到达呼吸系统(如肺)的任意区域。所需组合物的确切量依赖于种族、年龄、体重和个体一般状况、治疗的过敏病症的严重性、所使用的特定核酸和载体及给药方式等，因个体不同而异。因此，不太可能详细说明每个组合物的准确剂量。然而，本领域的普通技术人员能仅根据常规实验给出的教导决定合适的剂量。
如果采用胃肠道外给予核酸或载体，一般为注射剂型。可将注射物制成常规剂型，为液体溶液或悬液、注射前易于制成液体悬液的固体形式，或乳剂。最新改进的胃肠道外给药包括使用缓释或控释系统，以维持固定的剂量。参见美国专利3,610,795，引入作为参考。
可将所述物质制成溶液、悬液(混合入微颗粒、脂质体或细胞)。通过抗体、受体或受体配体，能够将这些物质靶向特异的细胞类型。以下参考文献是使用特异蛋白靶向肿瘤组织的技术的例子(Senter，等，Bioconjugate Chem.，2：447-451，(1991)；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60：275-281，(1989)；Bagshawe，等，Br.J.Cancer，58：700-703，(1988)；Senter，等，Bioconjugate Chem.，4：3-9，(1993)；Battelli等，Cancer Immunol.Immunother.，35：421-425，(1992)；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews，129：57-80，(1992)；Roffler等，Biochem.Pharmacol，42：2062-2065，(1991))。载体例如“秘密行动(Stealth)”和其它连接有抗体的脂质体(包括脂质介导药物靶向到结肠癌)、通过细胞特异配体由受体介导的DNA靶向、淋巴细胞指导的肿瘤靶向、小鼠神经胶质瘤细胞的体内高特异性治疗用逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用特异蛋白靶向肿瘤组织的技术的例子(Hughes等，Cancer Research，49：6214-6220，(1989)；Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104：179-187，(1992))。总的来讲，受体参与细胞内吞作用通路，所述内吞作用或者是组成性的或者是由配体引起。这些受体在由网格蛋白包被的小凹中聚集，并通过网格蛋白包被的小泡进入细胞，通过酸化的包涵体，在这里受体被分选，然后分选后的受体或者循环至细胞表面而保存在细胞内，或者被溶酶体降解。内化通路执行各种功能，如营养物的摄取、被激活的蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的分离或降解、受体水平的调节。许多受体采用一条以上的细胞内通路，这取决于细胞的类型、受体浓度、配体的类型、配体价态和配体浓度。受体介导的内吞作用的分子和细胞机制在下文中综述(Brown和Greene，DNA and Cell Biology 10：6，399-409(1991))。
(1)药物学可接受的载体
组合物包括抗体，可与药物学可接受的载体一起用于治疗。
合适的载体和它们的剂型在下书中有叙述，Remingtom：The Scienceand Practice of Pharmacy(第19版)，A.R.Gennaro编辑，Mack PublishingCompany，Easton，PA 1995。通常，合适的大量药物学可接受的盐在剂型中维持等渗作用。药物学可接受的载体的例子包括但并不仅限于，生理盐水、Ringer氏液和葡萄糖溶液。优选溶液pH值在约5至约8之间，更优选在约7至约7.5之间。进一步，载体包括控释制剂，例如，带有抗体的固体疏水聚合物半透基质，将该基质制成定型物质的形式，例如薄膜、脂质体、微颗粒。对本领域的技术人员来说，很显然根据例如给药途径、施用组合物的浓度，某些载体为更优选。
药物学载体为本领域的技术人员所熟知。对给人用药而言，最典型的是标准载体，包括溶液例如蒸馏水、生理盐水、生理pH值的缓冲液。组合物可以肌内给药或皮下给药。根据本领域技术人员使用的标准步骤施用其它化合物。
除去选定分子外，药物组合物还可以包含载体、稠化剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包含一种或一种以上的活性组分，例如抗菌剂、消炎剂、麻醉剂等等。
施用药物组合物的方式有多种，这依赖于是要求局部给药还是全身给药，还依赖于治疗的部位。可以局部给药(包括眼部给药、阴道给药、直肠给药、鼻内给药)，口服，吸入、胃肠道外给药(例如静脉点滴)、皮下给药、腹腔内给药或肌内注射。公开的抗体能够采用静脉给药、腹腔内给药、肌内给药、皮下给药、腔内给药或经皮给药。
胃肠道外给药的制剂包括无菌的水溶液或非水溶液，悬液和乳剂。非水溶剂的例子是丙烯二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，可注射的有机酯如乙基油酸酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬剂，包括生理盐水和缓冲介质。胃肠道外给药制剂的载体包含氯化钠溶液、Ringer氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、Ringer乳酸盐或不易发挥的油。静脉内给药制剂的载体包含流体和营养补充剂、电解液补充剂(例如建立在Ringer氏葡萄糖基础上的补充剂)等等。也可加入防腐剂和其它添加剂，例如抗菌素、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。
局部给药的制剂可以包括：油膏、洗剂、软膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。经典的药物学载体、水溶液、粉末、油基、稠化剂等等可以是必需的或希望的。
口服组合物包括，粉剂或粒剂、水或非水介质中的溶液或悬剂、胶囊剂、袋剂或片剂。优选可以包含稠化剂、调味品、稀释剂、乳化剂、助扩散剂、粘合剂。
可以采用药物可接受的酸或碱加成盐形式潜在施用一些组合物，所述加成盐由与无机酸反应、有机酸反应、无机碱反应或有机碱反应而制备，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸；有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸；无机碱例如氢氧化钠，氢氧化铵、氢氧化钾；有机碱例如单、二、三烷基和芳香基胺和取代的乙醇胺。
(2)治疗用途
组合物的有效剂量和给药方案凭经验决定，进行这样的决定属于本领域的技术范围之内。组合物的施用剂量范围是产生目的效应的足够大的剂量，在此剂量下症状得到改善。剂量不能大到产生不良反应，例如不期望的交叉反应、过敏反应等等、通常，剂量随着以下因素而改变：年龄、病症、性别和病人的疾病状况、给药途径、是否有其它药合用，这些因素能够为本领域的技术人员所确定。如果出现不良迹象，剂量可由私人医生做出调整。剂量可以多样化，每日可以服用一或一次以上，并持续一或数日。文献中含有对给定药物产品的合适剂量的指导。例如，文献中关于抗体的治疗用途里，有关于选择合适的抗体剂量的指导。如Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等编辑，NogesPublications，Park Ridge，N.J.，(1985)ch.22，303-357页；Smith等，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haber等编辑，RavenPress，纽约，(1977)，365-389页。抗体单独使用的每日剂量范围在1微克/千克体重-100毫克/千克体重或更多，剂量依赖于上面提到的诸因素。
施用了所公开的组合物后，可以通过多种本领域技术人员已知的方法评价这些治疗分子的效果。所述组合物例如抗体或其他分子，诸如FPA、缓激肽或它们的片段，用于构成或模拟FPA、缓激肽或它们的片段，例如与他们的同类受体之间的相互作用。例如，本领域普通技术人员已知，如果观察到组合物使本发明公开的任一模型中的梗塞范围减少，则该组合物例如本发明公开的抗体或其它分子，在构成或模拟FPA、缓激肽和/或它们片段与受体之间相互作用方面是有效的。抗梗塞活性可使用本发明公开的方法测量。任何活性的改变都已被披露，但是相对于对照组，梗塞减少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或95％已被披露。
与FPA和缓激肽受体相互作用的其它分子，能够抑制FPA、缓激肽和/或它们片段与受体的相互作用，这些分子没有特异的药物学功能，但可用于跟踪细胞内染色体改变或用于递送诊断工具，可以采用与递送本发明公开的药物产物相似的方式来递送所述分子。
公开的组合物和方法也用来作为分离和测试候选新药的工具，这些候选新药用于治疗各种缺血、中风和冠状动脉相关疾病。
h)芯片和微阵列
本发明公开了芯片，其中至少一个地址是本发明公开的任何核酸序列或序列的一部分。本发明公开了芯片，其中至少一个地址是本发明公开的肽序列或序列的一部分。
本发明公开了芯片，其中至少一个地址是本发明公开的任何核酸序列或序列一部分的突变体。本发明公开了芯片，其中至少一个地址是本发明公开的肽序列或序列一部分的突变体。
i)计算机可读的载体
应理解，可以分别用由核酸或氨基酸组成序列描述公开的核酸和蛋白。由多种方法显示这些序列，如鸟嘌呤核苷用G或g表示。同样，缬氨酸可用Val或V表示。本领域的技术人员知道如何用不同的方式展示和表现任何核酸或蛋白序列，任何一种表示法均可认为已被本发明公开了。本发明特别考虑的是采用计算机可读的载体显示上述序列，计算机可读的载体例如，市售的软盘、磁带、芯片、硬盘驱动器、压缩盘和录像带及其它计算机可读的载体。还公开了代表所述公开序列的二进制编码。本领域的技术人员知道计算机可读的载体是什么。因此，记录、储存、保存核酸和蛋白序列的计算机可读的载体也被公开。
本发明公开了计算机可读的载体，其包含序列和有关序列信息。
j)试剂盒
本发明公开了试剂盒，其中的试剂可以用于实施本发明所公开的方法。此试剂盒可以包含任何本发明讨论的试剂或试剂组合，或本领域认为在实施本发明的方法中需要或有益的物质。例如，试剂盒可以包含进行扩增反应的引物，以及缓冲液和使用引物所必需的酶，所述扩增反应在某个方法实施方案中讨论过。
D.制备组合物的方法
除非另有说明，本发明公开的组合物和实施本发明公开的方法所必须的组合物，使用本领域技术人员公知制备特定试剂或化合物的方法制备。
1.核酸的合成
例如，用作引物的核酸(例如寡核苷酸)可以使用标准化学合成法或酶学的方法或其它已知的方法来制备。这些方法可以包括标准的酶学消化，及随后的核酸片段的分离(参见，例如，Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)第5、6章)，和纯化学合成方法例如，氰乙基磷酰胺酯(cyanoethyl phosphoramidite)方法，该方法使用Milligen或Beckman系统l加上DNA合成仪(例如8700型合成仪，Milligen-Biosearch，Burlington、MA或ABI 380B型)。合成寡核苷酸有用的方法在下文中有描述，Ikuta等，Ann.Rev.Biochem.53：323-356(1984)，(磷酸盐三酯和亚磷酸盐三酯方法)，和Narang等，Methods Enzymol.，65：610-620(1980)，(磷酸盐三酯方法)。蛋白核酸分子能够通过下述已知的方法合成：Nielsen等，Bioconjug Chem.5：3-7(1994)。
2.肽的合成
本发明公开的蛋白的一种制备方法是，采用蛋白质化学技术连接两个或两个以上肽或多肽。例如，可使用化合物Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)利用目前实验室可获得的设备来化学合成肽、多肽。(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)。本领域的技术人员易于领会与蛋白质相对应的肽或多肽，可以用标准的化学反应合成。例如可以合成一条肽或多肽但不将其从合成树脂上切除，然而也可以合成肽或多肽的其它片段但随后将其从合成树脂上切除，这样，暴露出了在其它片段上被功能性封闭的末端基团。经过肽浓缩反应，两个肽片段分别在氨基端或羧基端以肽键共价连接，从而形成抗体或其片段。(Grant GA(1992)Synthetic Peptides：A User Guide，W.H.Freeman and Co.，纽约，(1992)；Bodansky M和Trost B.编辑，(1993)Principles ofPeptide Synthesis，Springer-Verlag Inc.，NY，(至少作为与肽合成相关的材料引入本文作为参考))。选择性地，如本发明所述，可以在体内独立的合成所述肽或多肽。一旦分离，这些独立的肽和多肽通过与肽浓缩反应类似的方法，可以连接成肽或其片段。
例如，克隆的或合成肽片段的酶学连接可使相对较短的片段相互连接以形成较大的片段、多肽、全部蛋白结构域(Abrahmsen L等，Biochemistry，30：4151(1991))。选择性地，可以使用合成肽的天然化学连接方法使较短的肽片段合成构建为大肽或多肽。这种方法包括两步化学反应(Dawson等，Synthesis of Proteins by Native ChemicalLigation，Science，266：776-779(1994))。第一步是未保护的合成肽硫醚与另一未保护的肽片段(包含氨基端半胱氨酸残基)的化学选择反应，以得到作为初始共价产物的由硫醚连接的中间产物。不必改变反应条件，中间产物自发发生快速的分子内反应，在连接位点形成肽键(Baggiolini M等(1992)FEBS Lett.307：97-101；Clark-Lewis I等，J.Biol.Chem.，269：16075(1994)；Clark-Lewis I等，Biochemistry，30：3128(1991)；Rajarathnam K等，Biochemistry 33：6623-30(1994))。
选择性地，可以化学连接未保护的肽段，由于化学连接，肽段间形成的键为非天然(非肽)的键(Sclulolzer，M等Science，256：221(1992))。这项技术用于合成蛋白结构域的类似物，和具有全部生物活性的大量相对纯的蛋白(deLisle Milton RC等，Techniques in ProteinChemistry IV.Academic Press，纽约，257-267页(1992))。
3.组合物的制备方法
本发明公开了组合物的制备方法及用于获得组合物的中间产物的制备方法。例如，公开了与FPA或缓激肽有关的蛋白，这些蛋白分别见表1、2。多种方法可以用于制备组合物，所述方法例如化学合成法、标准分子生物学方法。应理解，明确公开了制备这些组合物和其它公开的组合物的方法。
本发明公开了采用以下方法制备的核酸分子，该方法包括：以可操作的方式将核酸分子与控制核酸表达的序列相连，所述核酸分子包含在严格杂交条件下，与表1、2中序列的编码序列发生杂交的序列。
本发明公开采用以下方法制备的核酸分子，该方法包括：以可操作的方式将核酸分子与控制核酸分子表达的序列相连，所述核酸分子包含表1、2中肽序列的编码序列。
本发明公开了采用以下方法制备的核酸分子，该方法包括：以可操作的方式将核酸分子与控制核酸分子表达的序列相连，所述核酸分子包含与表1、2中肽序列具有80％同源性的肽的编码序列。
本发明公开了采用以下方法制备的核酸分子，该方法包括：以可操作的方式将核酸分子与控制核酸分子表达的序列相连，所述核酸分子包含与表1、2中肽序列具有80％同源性的肽的编码序列，其中与表1、2中的序列不同的任何改变为保守性的改变。
本发明公开了采用本发明公开的任何核酸转化细胞的方法制备的细胞。本发明公开了采用本发明公开的任何非天然的核酸转化细胞的方法制备的细胞。
本发明公开了利用表达本发明公开的任何核酸而制备的肽，所述核酸编码所述的肽。本发明公开了采用以下方法制备的任何非天然存在的肽，该方法包括：表达任何已公开的核酸序列。本发明公开了利用表达任何非天然存在的公开的核酸序列而制备的任何公开的肽。
本发明公开了采用以下方法制备的动物，该方法包括：采用本发明公开的任何核酸分子或任何肽转染动物细胞。本发明公开了采用以下方法制备的动物，所述方法包括：采用本发明公开的任何核酸分子或任何肽转染动物细胞，其中所述动物为哺乳动物。本发明公开了采用以下方法制备的动物，所述方法包括：采用本发明公开的任何核酸分子或任何肽转染动物细胞，其中所述动物为小鼠、大鼠、兔、牛、羊、猪或灵长类动物。
本发明公开了采用以下方法制备的动物，所述方法包括：向动物体内转入任意一种公开的细胞。
E.使用组合物的方法
1.把组合物当研究工具的方法
将公开的组合物作为研究工具可以有多种使用方式。例如，公开的组合物和方法可以用于研究缺血的梗塞模型，以及作为试剂用于分离影响梗塞的分子。
组合物可以用作例如，组合化学或其它筛选实验方案的靶点，以分离与梗塞过程有关的、具有期望功能特性的分子。
如本发明所讨论的，公开的组合物可用作微阵列的试剂，或用探针探察或分析已存在的微阵列。组合物也可用于任何已知的筛选分析方法，例如芯片/微分析。组合物也可以以任何已知方式用于使用本发明所述组合物的计算机可读实施方案中，以研究相关性或执行与所述公开的组合物相关的分子模建分析。
2.调节缺血效果的方法和治疗梗塞的方法
本发明公开了调节以下疾病的方法：中风和冠状动脉疾病及其发作的影响或其它由缺血引起组织坏死的疾病。例如，血管堵塞造成的中风、心脏病发作或任何其他状态的特征之一均可引发梗塞、组织损伤或死亡，所述其他状态以在特定组织的血流量缺失或下降为特征。梗塞由缺血事件造成，流向组织的血丢失造成氧丢失。缺血时组织和细胞的氧运输下降。公开的组合物能够应用于减少缺血造成的梗塞的方法中。施用的方法包括，给予需要的患者一种或一种以上公开的组合物。需要的患者是指将要经历，正在经历或已经经历了缺血事件的患者。应理解，如本发明所述，公开的组合物使小鼠缺血模型的组织100％恢复。
在某些实施方案中，可以给予组合物的时间为，缺血事件过程中或缺血事件后0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、12、15、20小时，或更长时间。缺血事件后当组织“昏厥”而不是“冬眠”时，可以在超过20个小时后补偿，而实际上，在缺血事件后数年仍可以发挥作用。两种没有功能的组织的主要不同在于，昏厥组织可完全恢复而冬眠组织通常在组织内仍然具有坏死小岛。此外，昏厥组织可持续数年不发挥功能，例如心脏病中缓慢关闭的冠状动脉，当给其进行手术并打开后，所述昏厥组织恢复功能。
组合物可以是有效减小缺血的任意浓度。例如，给予的组合物等价于至少0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100毫克/千克。例如，可以将异种系的比例用于选择剂量，例如通过小鼠模型推测人和其它动物的等价剂量。例如，总体表面积可以用于种系的等价剂量。例如，小鼠中10毫克/千克剂量代表30毫克/平方米的总体表面积。对于人来说，30毫克/平方米剂量等价于0.76毫克/千克(70千克的人)。
另一个参考剂量的方法是看血药浓度。例如，相对于人而言，0.76毫克/千克剂量接近7.6毫克/升(70千克×76毫克/千克＝53.2毫克；53.2毫克/7升＝7.6毫克/升＝7.6微克/毫升)。本发明公开了施用以下成分后的血浆水平：FPA或其衍生物或缓激肽和其衍生物或本发明公开的其它活性分子。给予这些成分的剂量为0.001、0.01、0.1、1.0、10、100、1000微克/毫升。假设7升的血容量，但使用本发明公开的技术可根据不同的血容量改变剂量。
剂量可根据药效团动力学分析作调整。所指的调整例如，不仅指调整活性物质的活性，也指例如，活性组分在体内的代谢速率。
应理解，可以联合使用公开的组合物，也可与其它已知治疗或预防缺血的药物合用。例如，在某种情况下使用人tPA来减少凝血。公开的组合物可与tPA联合给药。另一例子为PlavixTM和含有PlavixTM的组合物。PlavixTM是一种抗血小板的药物，其防止血液中的血小板聚集形成凝块。PlavixTM可以保护患者免受另一种心脏病和中风侵袭。
公开了减少患者梗塞的方法，该方法包括给予患者FPA。
公开了有关方法，其中FPA包含的结构与SEQ ID NO：2有至少20％或70％或这里所公开的任何其它百分比的同一性。同时也公布了其它方法，其中SEQ ID NO：2的8位、12位和13位氨基酸未改变；和同时公布了方法，其中SEQ ID NO：2的7位、9位和15位氨基酸的任何改变是保守性替代。
公开了有关方法，其中FPA包含与SEQ ID NO：2的6-16位氨基酸有至少40％或70％或这里所公开的任何其它百分比的同一性。同时也公布了方法，其中SEQ ID NO：2的8位、12位和13位氨基酸未改变；和同时公布了方法，其中SEQ ID NO：2的7位、9位和15位氨基酸的任何改变都是保守性替代。
公开了有关方法，其中FPA可减少小鼠MCAO模型的梗塞范围。同时公开的方法中，梗塞减少的百分比至少为20％、40％、60％、80％或所公开的在20％到100％之间的任何百分比。
公开了有关方法，其中小鼠MCAO模型的梗塞比例大于或等于1.1、1.5或2或所公开的任何其它比例。
公开了有关方法，其中使用平均梗塞体积计算梗塞比例。公开了有关方法，其中小鼠MCAO模型的平均梗塞体积小于或等于90％、70％、50％或30％或所公开的在20％到100％之间的任何百分比。
公开了使受试对象减少梗塞体积的方法，该方法包括给受试对象施用如下组合物，该组合物包含如下所示的肽序列：SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NOs：96-103、AVR或FVR，或者是本发明公开的任何其它的FPA功能序列。
公开了有关方法，其中FPA包含如下所示的序列：SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQID NO：51、或SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：89、或SEQ ID NOs：96-103、AVR、或FVR，或者是本发明公开的任何其它的FPA功能序列。
公开了有关方法，其中FPA包含如下所示的序列：SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：38、SEQ IDNO：40、或SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：39或者本发明公开的任何其它的FPA功能序列。
公开了有关方法，其中的梗塞是脑梗塞或心肌梗塞。也公开了一些方法，其中的梗塞是任何类型的梗塞。
公开了减少受试对象的梗塞的方法，该方法包括给予该受试对象缓激肽。
公开了有关方法，其中缓激肽包含的结构与SEQ ID NO：57有至少60％或80％或这里所公开的任何其它百分比的同一性。也公布了一些方法，其中根据SEQ ID NO：57进行的任何改变都是保守替代。
公开了有关方法，其中缓激肽在C末端没有碱性氨基酸，另外也公开了有关方法，其中碱性氨基酸是Arg、Lys或His。
公开了有关方法，其中缓激肽在N末端包含碱性氨基酸，也公布了有关方法，其中碱性氨基酸是Arg、Lys或His。
公开了有关方法，其中缓激肽包含如下所示的序列：SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ IDNO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、或SEQID NO：85，或者本发明公开的任何其它的缓激肽功能序列。
公开了有关方法，其中缓激肽包含如下所示的序列：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ IDNO：77或SEQ ID NO：81。也公开了有关方法，其中缓激肽包含如下所示的序列：SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：61或本发明公开的任何其它的缓激肽功能序列。
公开在需要减少梗塞的受试对象中减少梗塞的方法，该方法包括采用药学上可接受的形式，给受试对象施用有效量的血管紧张素II受体拮抗剂。
公开了减少受试对象梗塞的方法，其中2型血管紧张素II受体拮抗剂是缓激肽。
公开了在需要减少梗塞的受试对象中减少梗塞的方法，该方法包括采用药学上接受的形式，给受试对象施用有效量的缓激肽，其中缓激肽调节血管紧张素II受体，从而减少梗塞。
F.实施例
介绍下面的实施例，以对该领域普通技术人员完全公开和描述本发明的化合物、组合物、物质、仪器、方法是如何做的，如何评价的，除非另有说明，其仅是示例性的并不限制范围。至于一些数字(例如数量、温度等)，尽量保证其准确性，但允许有一定误差和偏离。没有特别说明，份数为重量份数，温度用℃表示或在室温，压力是常压或接近常压。
1.实施例1活性片段和分子
公开了从冬眠的美洲旱獭血浆中提取纯化的分子(白蛋白成分，亲和凝胶蓝)成分(VPF)。在特拉华峡谷科学研究所(Delaware Water GapScience Institute)，从处于冬眠早期(12月中旬，进入冬眠6周)的美洲旱獭血浆中提取特定的亚成分D1和D2。将从单只动物采集的血样集中起来。除了纯化批次不同，D1和D2是一样的。7月份夏季的时候，从活动的旱獭中提取简单的对照成分(SA)。将这一批样品进行冻干处理，冻存于-70℃。
“最接近”的对照成分是在东北野生动植物养殖场(North EasternWildlife Facility)从冬眠后期动物血浆中收集，用相同方法制备的(VPF-C1)。
刚开始就准备好采用静脉注射而不是脑内注射的生物分析模型，以省去医疗剂量的蛋白/肽穿过血脑屏障的的并发症。这样，对于15只原发性高血压大鼠(SHR)，检验D1/D2、NE1、NE2和SA等物质对血压的静脉注射效应；对25只肥胖Zucker大鼠，检验这些物质的食欲抑制作用。此外，通过观察个体解剖情况、称量单个内脏重量来评价药物的毒性。从实验数据分析，我们可以知道刺激血液中尿素(5mg/kg)循环的最有效的静脉注射剂量(50mg/kg)下没有观察到例如毒性的效应。D1和D2剂量至少高达800mg/kg时也没有毒性。在另外两只SHR动物中，分两次间隔30分钟注射较大剂量的D2(800mg/kg)，在24小时内对动物的血压，食欲没有影响，未表现出器官毒性和致死性。
然后在小鼠中脑动脉栓塞模型(MCAO)中，检测D2、NE2和SA等物质的组织挽救作用。在该模型中，小鼠用水合氯醛麻醉，进行手术，中脑动脉完全栓塞1小时。而后将栓塞解除，重新建立脑部血流，这一点用多普勒-激光测量仪证实。MCAO开始24小时后，观察动物的运动行为和脑梗塞面积(TTC染色，2％)。经过1小时MCAO后，对21只小鼠进行D2注射(尾静脉，4mg/kg)，显示在三组独立的重复性实验中，药物均在24小时后表现出明显的组织挽救作用(p＜0.01，t检验)。与此相反，当与SA的相同剂量进行比较时，NE2注射没有显示组织挽救作用(NS，t检验)。注射D2的动物中，21只里有6只的组织挽救达到90％-100％(即，最低限度是在4mg/kg时未观察到梗塞)，综合整个D2注射组而言，组织挽救达63％(表7)。
在量-效关系研究中，对于MCAO小鼠(12只)，D2的静脉注射剂量为5mg/kg时最有效。随后的注射时间研究中发现，在脑缺血(MCAO)之前2小时事先注射D2(静脉注射，剂量为5mg/kg)，在所有的研究对象中(6只小鼠)均可表现出100％的组织挽救作用。在MCAO开始后0.5小时注射，得到了同样的结果。MCAO开始后2、4、6小时注射D2，从统计学考虑均可显著地减少24小时的脑梗塞体积。而第8小时注射则没有这样的结果(表7)，这表明预防性的或缺血后的及时(MACO之后6小时内)治疗都是有意义的。
在透析研究中，使用分子筛透析膜，用水、氯化钠(2M)和尿素(8M)对D2进行透析，让3.5、7或10kD的分子透过(即，使肽从D2中进入大体积的透析液中)。结果发现，每个透析膜的截止值以上的组分对MCAO模型都是有效的。然而，这些存留的组分再次用尿素透析，所得产物更加有效，原因在于在绝大部分动物中(9只小鼠)均可达到没有梗塞体积或梗塞体积最少(下图显示，附图6)。透析实验与那些使蛋白与其载体分离，或去掉它的抑制肽等方法有相同的作用。上述任何方法都可以使D2在MCAO开始1小时后的注射，表现出更好的组织挽救作用。
在D2小鼠中进行的行为学实验也证实了动物没有梗塞或梗塞范围较小。每只小鼠在缺血1小时并恢复24小时后进行自由场地的运动。正常的小鼠会跳到场地里的小箱子上；将根据事先进行缺血处理的每只动物跳到箱子顶部的能力判断其行为能力。此外，对动物的四肢灵活性和强制运动(转圈行为)进行了观察。90％-100％的获得挽救的动物没有运动缺陷。有脑梗塞的动物都出现半身不遂。
先进行双向凝胶电泳(SDS-PAGE)比较SA和D2成分，并进一步纯化活性组分。用这种判断差异的方法，鉴别出大约40种蛋白，主要集中在32kD范围。有大约20种冬眠特异蛋白，另有20种是与SA对照组相比出现上调的蛋白。这些蛋白的点密度比SA对照组超出两倍。根据相同的等电点将SA凝胶和D2凝胶切割成条状，然后将周边对齐进行SDS分子量的分离，这种是BATS凝胶法。该方法也可以鉴别出状态依赖的双向蛋白。一旦找到BATS或传统的双向电泳中感兴趣的点，就可以通过液质联用(LC/MS/MS)和生物信息学“指纹”法判断出该蛋白的序列。
根据NE2和D2之间的差异比较，进行双向电泳，利用软件排列出不同的点，定量测定其灰度，标记出那些差异在2倍或2倍以上的点。通过这种方法只有9个纯蛋白点出现上调，和/或是冬眠特异蛋白(附图2、3、5)。这些点中有一部分在CSF差异中也有，将感兴趣的点进一步分离。这些点可以按照本文的方法进一步处理，使之纯化并鉴别出活性组分。
对于NE2和D2肽成分，通过离心过滤去除分子量小于10kD的蛋白后，进行了液质联用分析。利用传统的指纹图谱方法鉴定出其中的一种蛋白，但至少有5种其他蛋白不这么容易鉴定。只是这一肽成分意义不大，因为它并不包含预防中风的活性组分，也不是在NE2和D2的差异双向电泳中出现的9个差异蛋白之一。
可以得出结论：D2成分中的蛋白分子对于小鼠缺血的脑组织有保护作用，可以在1小时的MCAO后防止或减轻中风，而在NE2或SA中没有所述蛋白。即使使用超过小鼠所用的10倍有效剂量的D2中的分子，对大鼠也没有产生明显的中毒效应。在显著的脑缺血后，这种分子具有显著的组织保护作用，在中风模型中，出现MCAO后达6小时才注射这种相关分子，这种分子也可以有显著的组织保护作用。这种纯的分子形式实际上是9种蛋白中的一种，见附图3、5。
a)方法
(1)冬眠场所
位于东北野生动植物园的冬眠场所是一处占地1000平方英尺的温控研究所，拥有大约100只美洲旱獭。这些动物分别被独立安置在铁笼中，笼子里铺了稻草做巢穴。每隔3-4天在红光下检查一次这些动物的冬眠状态。所有血样均是在冬眠麻醉的状态下经由心内穿刺采集而得。
位于特拉华峡谷科学研究所的冬眠场所是一处占地500平方英尺的温控研究所，拥有大约20只美洲旱獭。这些动物分别被独立安置在减噪、双室、3/4英寸厚的模压木的笼中，饮食室底部是铁丝网。动物睡眠室中铺了稻草做巢穴。较大的冬眠场所保持完全避光。除了冬眠开始后第6周，其他时间采用诊听装置对动物进行监测，而不是通过密切观察进行监测。
(2)动物种类
美洲旱獭是冬眠血浆的来源。实验室大鼠用于毒性研究，因为它们是最常用的对象。原发性高血压大鼠(SHR)和肥胖大鼠(Zucker)用于高血压、食欲、毒性的研究。C57小鼠是研究中脑血管栓塞的对象，因为它们最常用于中风模型。
(3)收集血样(12月中旬和1月中旬)
可以对美洲旱獭通过心内穿刺采集10毫升血样，也可以在摘除心脏后通过心内穿刺或使血流到胸腔进行放血(即，溶血)。血样采集有两次，分别是在12月中旬(进入冬眠后6周)和1月中旬(进入冬眠后10周)。冬眠于11月1日开始，将动物安置在冬眠场所中，只提供饮水。东北野生动植物园的冬眠场所，温度恒定在35℃，而在特拉华峡谷科学研究所的冬眠场所，每天温度在35℃左右摇摆。血样收集后，低温离心(NEW，东北野生动植物园)或放在冰上以备接下来的室温分离(DWGSI，特拉华峡谷科学研究所)。分离后(5g离心10分钟)，轻轻移出血浆并冷冻保存。
(4)试验所需分子成分的制备
D1/D2是从特拉华峡谷科学研究所收集的血浆中制得，血浆于12月中旬利用心内穿刺方法采集；D2hemo是使动脉血流入胸腔中后收集的溶血制得。经亲和凝胶纯化后，将得到的物质冻干，并以毫克量(Mettler等级)溶解在生理盐水中给药。剂量为50mg/kg(大鼠毒性研究)和5mg/kg(小鼠梗塞研究)。所有注射均为尾静脉注射，给药时推注的体积为0.1ml(小鼠)和0.5ml(大鼠)。
NE1、NE2是从东北野生动植物园收集的血浆中制得，血浆于12月中旬(NE1)和1月中旬(NE2)利用心内穿刺方法采集。将注射用的冻干品称重，并按照上述方法溶解。剂量和注射方式与D1、D2相同。
SA与D2制备方法相同，但血浆是在夏天的8月份收集，对象为未处于冬眠状态的、活跃的美洲旱獭并用克他命(25mg/kg)进行麻醉。
CSF取自前庭硬脑膜脊部穿刺产物。冬季的提取物取自冬眠麻醉的美洲旱獭，而夏季的提取物来源于克他命麻醉的美洲旱獭(35mg/kg)。取100微升澄清的液体给小鼠进行尾静脉注射。脑室内注射则是移去颅盖骨后(20平方毫米)，通过暴露的硬脑膜进行侧脑室注射(100微升)。
在冬季和夏季采集的动物尿样仅用于2D PAGE(双向聚丙烯酰胺凝胶电泳)和2D BATS(双向分离的双向条带分析)。
(5)D2的分子筛过滤
将D2(30mg)溶解在600微升尿素、氯化钠或水中，浓度为50mg/ml。将溶解后的溶液密封在10或3.5Kd截止值的“蛇皮”透析管中。该密封管放在100ml适当的缓冲液中(与溶解液相同)，2-6℃透析18个小时。之后更换新的缓冲液再次透析3小时。经过缓冲液透析后的物质再在纯水中透析24小时。最终的透析产物利用常规方法(真空、脱水等)进行冻干。尾静脉注射剂量为5mg/kg，体积为0.1ml。
(6)RR-间隔的测量
ECG的记录是将低噪音放大器(UFI 2280 20,000增益，0.1到1000Hz)连接到低噪音电极上(Vermed A 10005)，电极粘贴捆绑在肢体的空掌心上。在1000Hz(国际设备)对ECG进行数字化处理，写入磁盘(康柏计算机)。通过第一个穿过向上(阳极)轨迹的0可以鉴别出R波，该轨迹线的dV/dt大于10小于15(可视调节)。连续R波之间数据点的数目就是RR间隔(毫秒)。RR间隔的直观核实是将10％的数据显示在计算机上，通过手动检查进行的。由EMG活性而产生的非自然信号，可以由无关项统计很容易分辨出来。
(7)中脑动脉梗塞模型(小鼠)
C57小鼠(Charles River)经水合氯醛麻醉(IP)后进行手术。在颈部靠近右颈动脉部位开一切口。在颈动脉插入聚乙烯闭塞物，所用聚乙烯闭塞物的直径略大于中脑动脉分支处的直径，插入闭塞物的部位在颈部内外颈动脉的分支处。插入的闭塞物就位后30分钟和60分钟后静脉注射所述物质。所有注射均采用36ga皮下注射用针，通过尾静脉注射完成。在所有情况下，都是缺血1小时后去掉插闭塞物。对暴露的脑皮层进行激光-多普勒血流测量，可以证实原先缺血的皮层区域血流是否恢复。缝合颈部和头盖骨的伤口，使动物在温暖舒适的环境中(1-2小时)得到恢复。动物完全康复后被放回它原来的笼子中。
(8)通过行为学和TTC染色评价脑梗塞
动物手术恢复24小时后，对其运动行为进行检查。以缺血脑半球同侧肢干为对照，比较缺血脑半球对侧肢干的伸展或弯曲。动物被置于一个自由的场地中，场地里放置约2英寸高的箱子。正常小鼠会在几分钟内跳到箱子上。我们记录了动物在跳跃行为上的任何异常。如果动物没有主动跳，可以轻轻从后面刺，强迫它跳。而后切下动物的脑袋，去掉头盖骨。用微型剪刀剪开脑脊膜，将全脑移出。然后将其放到金属模具中，用锋利的刀片分切成切片。将2mm的切片放到2％的三苯氯四唑溶液中，室温孵育10分钟。把切片用摄像机拍照后写到计算机磁盘中。通过NIMH的软件分析每个切片的梗塞区。由于脑水肿的影响，根据脑损伤对侧和同侧的相对关系，对梗塞体积进行标准化。计算结果就是梗塞体积的测量值，用立方毫米表示。
(9)毒性(器官总重，动脉血压，饮食行为)
将SHR(Charles River)在巴比妥酸盐(35mg/kg)麻醉的状态下进行手术。聚乙烯导管插在腹主动脉中(Weeks方法，25)。刀口缝合后，动物康复24小时。在持续监测血压的条件下，尾静脉注射待测物质。每天测量Zucker大鼠(Charles River)的体重增加情况，观察其饮食行为。尾静脉注射和体重测量连续进行3周。动物饮食饮水不受限制。血压和饮食行为研究结束后，处死动物，移出其内脏器官，检查是否有异常并称重。
(10)手术
体重在350到400克之间的雄性和雌性SD大鼠(Sprague Dawly)，用苯巴比妥钠麻醉，放在一个小的动物呼吸机(Harvard Apparatus)上，通过一条气管套管(PE 200聚乙烯管)相连。监测需求呼吸量。将左胸廓切开，暴露出心脏。将动力呼吸的速率和体积设置在与以前监测期间相同的水平。用带有26-ga锥点半圆针(26-ga taper point half-circleneedle)的4-0手术线穿过含有LAD的肌肉区。范围大约是在由心房到心尖1/3距离处。4-0缝合线末端牢固地拽在一起，打结一次，并用快释手术钳确保牢固。完全的LAD闭塞45分钟后，这一点可以通过左心室区域变成深蓝色证实，解开缝合线，按摩先前的结扎部位，以保证结扎内压力完全释放。记录动脉血的立即回心情况，如果出现再灌流心室纤颤，则用冷的棉组织棒轻轻反复摩擦心脏表面，以去心脏纤颤。所有的待测物质(D2和NE2)均在结扎松开后通过颈静脉插管立即注射。一旦心室纤颤转换成正常的窦性心律，补充注射巴比妥钠，使动物维持麻醉状态3小时。
3小时后，将围绕LAD的缝合线再次系起来，左心房注射UnisperseBlue染料，充满所有正常灌流的冠状动脉。取出心脏，用生理盐水清洗，并用一个模具和6个刀片将其切成2mm厚的切片。将切片两侧均拍照(佳能数码相机，2.1兆象素)。之后放在1％三苯氯四唑孵育液中，于38℃下孵育。在TTC中孵育30分钟后，对切片进行二次拍照。
(11)梗塞面积分析。
在第一批拍摄的照片中可以看到，蓝色染料显示的是正常区域(NZ)。危险区是留在照片上NZ区之外的部分。切片在TTC中孵育时，染料会从组织中扩散出来，在第二次拍摄的照片中，颜色要浅一些。因此，必须在第一批照片中确定NZ带。在第二组照片中，对7张组织切片的每一个表面都进行了检查，观察TTC染色(从危险区恢复的组织，TTC)和危险区中的梗塞组织(INF)。将每张切片两个表面的测量结果取平均，计算梗塞体积的百分比(TTC/TTC+INF)。数码照片中感兴趣的区域可以在计算机上通过Photoshop软件测量，并分别通过ImageJ软件(NIH免费软件)核实。
(12)质谱分析样品的制备
白蛋白成分中小分子量的肽的纯化：539μg白蛋白成分中(D2和NE2)，加入25mM Tris缓冲液，至总体积200μl，通过3kd分子量Amicon过滤装置。保存从每个样品中滤出的产物，该产物即为白蛋白的3kd肽成分。
(13)制备MALDI分析使用的未标记肽
将1μl的肽成分稀释25或50倍，通过一个C18“拉链(zip-tip)”，清除MALDI的任何干扰物。纯化后的肽在MALDI基质中洗脱，点样到MALDI列上用于随后的分析。
(14)液相色谱/质谱/质谱
将50μl 0.1％的甲酸加入到50μl ICAT溶液中，注入加速真空室中。体积减小到10ul后，注射到75μM微毫高压液相色谱柱中，流速200nl/min。这些肽用40min或70min梯度洗脱液洗脱，直接进入微量QTOF2电子发射质谱仪中。
(15)全程序列分析
下述离子依次出来：m/z 809、904、1010、1012、1621和1662。m/z809和1010是MALDI离子化过程中产生的基质离子。m/z 1012是m/z 1010的第三种同位素。m/z1662的分析最后并不确定，这里介绍了对m/z 904和m/z 1621的分析。
539μg每种白蛋白成分中(D2和NE#2)，加入25mM Tris缓冲液，至总体积200μl，通过3kd分子量Amicon过滤装置(任何基于分子量原理的过滤装置均可用)。保存从每个样品中滤出的产物，该产物即为白蛋白的3kd肽成分。产物加到反相柱中进行液相色谱/质谱/质谱分析。梯度洗脱液从MicroTech Scientific Ultra-Plus二元液相色谱泵中送出，流速200nL/min。柱子顶端使用1800V电压，使得洗脱组分可以离子化。接下来组分依次进入Q-Tof2质谱分析仪中。梯度洗脱过程中，在特异的阈值上观察到的肽离子，可以自动触发仪器在第一个质谱仪上选择目的m/z，并通过低能量碰撞诱导解离(CID)，同时在第二个质谱仪上分析所得产物离子。产物离子数据由人工阐释。
(16)动物的准备
大鼠进行手术，植入颈静脉导管进行静脉注射，同时做锁骨下动脉插管，检测平均动脉压。手术康复至少5天后，给动物服用新霉素(100mg胶囊溶在500ml饮用水中)，连续服药3天减少肠道细菌(例如一些可能循环利用尿素的微生物)。血样采集那天，将动脉插管连接到Statham张力计(校准后)上测量血压。将静脉插管连接到小的注射器上，注射器中含有1mg溶解在0.5ml生理盐水中的双标记尿素。首先通过静脉插管采集基线血样(0.5ml)，然后注入标记的尿素。之后在15分钟，1小时，2小时，3小时和6小时再次采集血样(每次0.5ml)。样品保存在冰上，直到血浆分离。通过如下方法进行血浆分离：经3次离心，每次10min，然后移液管收集。大约0.3ml的血浆样品分别贴标签，冻存，直至运送到代谢产物研究公司(Metabolic Solutions Inc.)进行分析。
(17)15N2-尿素和15N1-尿素总结
为了对稳定的同位素标记的尿素进行分析，血浆样品首先用乙腈除蛋白。离心后，尿素环化成2-hyrody嘧啶，并用BSFTA处理。采用Nelson和Ruo的方法，可以将生成的TMS衍生物转换成七氟丁基衍生物(NelsonJE，Ruo TI，Assay of stable isotope labeled urea in biological fluidsby selected ion monitoring，Clin Chim Acta.1988年6月30；175(1)：59-65)。根据制造商的说明，Hewlett-Packard 5890气相色谱-5989A质谱偶联分析仪在阳性化学产物离子化(PCI)模式下自动调节。制作并分析含有未标记尿素、15N2-尿素(剑桥同位素实验室)和15N1-尿素(CDN同位素)的标准曲线。测量了代表天然的或“未标记的”尿素离子(m/z＝293)，15N1-尿素离子(m/z＝294)，15N2-尿素离子(m/z＝295)。将总面积数与标准曲线进行比较，用以计算最后报告上的摩尔比例。
(18)尿素浓度总结
为了计算血浆中尿素的浓度(mmol/L)，使用尿素与二乙酰肟之间的颜色反应进行分光光度测定。该方法基于Crocker建立的方法(CrockerCL，Rapid determination of urea nitrogen in serum or plasma withoutdeproteinization，Am J Med Technol，1967年9月至10月；33(5)：361-5)，而且可以使用Sigma Diagnostics提供的试剂盒进行(SigmaProcedure No.535)。制作并分析浓度曲线，对照组和样品组的浓度都可以直接从校准曲线上读取。最后，将结果由血中尿素氮(mg/dl)转换成尿素浓度(mmol/L)。
(19)统计
采用常用的参数统计方法，该方法要求随机变化、平行取样以及样品为正态分布。非独立样品之间采用t检验进行比较。从目前数据来看，样品参数变化范围的β次幂大于90％，n＞8。
b)结果
(1)原发的或冬眠唤醒相关的死亡事例
表6列举了冬眠的行为阶段以及出现原发的或冬眠唤醒引发的死亡事例，每一例均是在两个不同的冬眠场所、不同的研究中分别观察到的。表6说明，死亡事件与以下情况相关：1)动物深度冬眠(D)；或2)后期观察阶段唤醒动物(d)。研究1在大型商用动物冬眠场所(东北野生动植物园)中进行，从11月到来年2月，每3-4天较小干扰地观察一次。研究2在较小的比较安静的冬眠场所(特拉华峡谷科学研究所)进行，动物完全不受干扰，仅通过内部通信联络系统进行监测。12月21日，动物进入冬眠大约6周后，研究1中有9只动物受到干扰，表现出微小的症状。同样的，研究2中所有的动物在12月18日也受到干扰。1月12日，研究2中同样的4只动物又受到同样的干扰，12小时内导致唤醒死亡和继发死亡(D)。在所有事件中，干扰时间大约进行10分钟，动物被牵拉背部拽出来(采血，ECG记录)。
在研究1中，有16只成年动物，体重在3.2到5.9千克之间，有6只幼年动物，体重不到3.2千克。幼年动物手术刀口不到2mm。在11月1日到2月20日的冬眠期内，6只幼年动物中有5只发生原发性死亡(83％)，而在这一时期，16只成年动物中只有7只死亡(44％)。这些数字不包括用于D2、NE1、NE2血浆收集的那些动物，也不包括在研究中发生唤醒死亡的动物(均附在材料中)。
在12月中旬，研究1中的9只实验动物(2只幼年，7只成年)均在其四脚朝天躺卧时通过牵拉四肢将其唤醒。同时也采集血样。有3只美洲旱獭未进入冬眠，但5只成年旱獭和1只幼年旱獭均处于深度冬眠状态。唤醒并未在24小时内造成死亡，6只冬眠动物继续冬眠。12月26日之前有9例自然苏醒至完全清醒(以下划线表示)，之后又出现7例。自然苏醒至完全清醒的事例中无一例与致死性有关。
在研究2中，每一只动物最初都是通过系缚在四肢掌心的ECG电极进行观察。实验对象是4只成年旱獭，4只幼年旱獭，在12月中旬时(12月21日)均处于深度冬眠状态。当动物四脚朝天躺卧时通过牵拉其四肢将这4只成年旱獭和4只幼年旱獭唤醒(表6)。无一例达到完全清醒，但所有案例均有部分觉醒的ECG体征，在附图1中表明了这一点(唤醒)。即在8分钟唤醒阶段，RR间隔开始系统性地下降，但是2小时内它们又恢复至原先的水平。这些动物没有出现死亡。
1月中旬，2只幼年旱獭和2只成年旱獭(研究2)又通过同样的过程被唤醒。在唤醒过程中和唤醒后，所有4只动物的RR间隔均缩短，2小时内观察到动物出现严重的心动过缓。每只动物被唤至完全清醒，慢慢能够走动，而后在6到12小时内死亡(D)。
附图1显示了在心脏数据中出现严重心动过缓的例子。RR间隔中不时会出现许多EMG伪信号(“纤颤”)，但是也出现了RR间隔平滑下降，这一点通过观察到连续的QRS复合波得到证实。在附图1中11月中旬的轨迹中，动物唤醒后，回到它的稻草巢穴中，趴下蜷成“球形”达52分钟。电极从左边连接，动物能够走动，但还不足以移动出巢穴，之后2小时开始进行记录。动物表现出一种“纤颤”，它比常规所说的纤颤肌肉收缩要慢，这一现象在所有实验动物身上都出现了。从开始唤醒动物到给它们机会选择返回冬眠状况，这之间的2到6小时未进行记录。
在1月中旬的实验中，从动物被唤醒开始之后的6到12小时，所有4只动物都被发现死在巢穴外。其中有3例动物死在饮食室，1例动物爬上1英尺的墙准备逃离关押它的笼子。
表6-冬眠致死性
  N   N   N   N   N   D   D   D   D   D   D   D   J   J   J   J   J   J   J   J   F   F
  A   W   17   21   24   27   30   5   8   11   15   18   21   26   2   5   9   12   16   19   25   29   2   14
  研究1：动物冬眠阶段监测
  J   3.6   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   d
  J   3.1   5   5   5   5   5   5   4   3   2   3   4   3   3   5   5   5   d
  J   2.7   5   5   5   5   3   4   3   3   2   2   4   3   3   2   2   2   2   2   2   4   5   3
  J   3.2   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   4   d
  J   3.1   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   -5   5   5   3   3   2   2   2   2   2   D
  J   3.1   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   4   d
  A   3.4   5   5   5   5   5   5   5   5   2   3   5   5   3   2   2   2   2   2   1   3   5   3
  A   4.1   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   2   2   2   D
  A   4.5   5   5   5   5   3   3   4   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   d
  A   5.3   5   5   5   5   5   5   5   5   2   2   2   2   3   2   4   4   3   3   3   3   3   5
  A   4.9   5   5   5   5   3   4   5   5   2   3   5   5   5   5   5   5   3   3   1   2   2   3
  A   4.4   5   5   5   4   5   4   3   3   3   3   --3   2   2   3   5   5   3   2   3   5   3
  A   3.8   5   5   5   5   5   5   4   d
  A   4.6   5   5   5   5   2   3   3   5   5   5   -5   5   5   d
  A   5.9   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   -5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   d
  A   4.2   5   5   5   5   5   5   4   3   5   3   -3   D
  A   3.2   5   5   5   5   2   2   2   2   5   3   -   2   2   2   1   2   2   D
  2
  A   4.8   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   -3   D
  A   3.3   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   3   2   2   3   2   2   2   2   3   3
  A   3.8   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   4   3   3   3   5   3   3   2   2   2   3   3
  A   4.6   5   5   5   5   3   4   5   5   5   5   4   3   3   3   3   3   3   3   2   2   2
  A   4.3   5   5   5   4   3   3   3   5   2   2   4   3   5   5   5   5   3   3   2   2   2   2
  A   4.6   5   5   5   4   5   4   2   2   1   2   *2   NEl
  A   4.3   5   5   4   3   5   4   3   3   2   2   *2
  A   3.6   5   5   5   5   5   5   5   5   3   2   *2
  A   2.7   5   5   4   4   3   3   3   3   3   3   *2
  A   4.4   5   5   5   5   5   5   5   5   5   2   --2   2   3   5   5   5   3   3   *2   NE2
  A   5.4   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5   3   3   2   *2
  A   4.6   5   5   5   5   5   5   5   5   5   3   2   2   2   2   2   2   2   1   *1
  A   4.6   5   5   5   5   5   5   5   5   5   3   2   2   2   2   2   2   1   1   *1
  J   2.8   5   5   5   5   5   5   3   2   2   2   -3   3   2   2   2   2   3   3   *2
  研究2：除ECG记录外未受干扰
  A   4.5   5   5  .  .  .  .  .  .   -1   *1   D1，D2   .
  A   3.6   5   5 . . . . . .   -1   *1
  J   2.9   5   5 . . . . . .   -1   *1
  J   2.8   5   5 . . . . . .   -1   *1
  A   3.8   5   5 . . . . . .   -1   1 . . . .   -1   D
  A   3.5   5   5 . . . . . .   -1   1 . . . .   -1   D
  J   2.4   5   5 . . . . . .   -1   1 . . . .   -1   D
  J   2.1   5   5 . . . . . .   -1   1 . . . .   -1   D
表6
年龄(A)：J＝幼年(1岁)，A＝成年。体重(W，千克，11月1日)。冬眠阶段(在上面显示的日期)：5＝清醒，4＝不活泼，3＝冬眠，但对触摸有反应，表现为由“球形”姿势伸展开，2＝冬眠，但对触摸反应慢，表现为部分伸展开，1＝深度麻醉，对触摸无反应。死亡：D(框图内)＝在所述冬眠情况下头3天内自然死亡；d＝在所述清醒状态时3天内自然死亡；D＝唤醒后6到12小时内发生唤醒死亡。唤醒：-n＝在所示阶段，动物被从“球形姿势”伸展开来。自然苏醒＝将每种唤醒的阶段5加下划线。血浆样品(框图内)：*＝在冬眠阶段采集的血浆样品，右侧格子里表示汇集的样品名缩写。
D2可以预防中风，但NE2不能
实验评价了尾静脉注射D2分子成分及其最接近的对照NE2的作用，用药剂量为5mg/kg。结果表明D2蛋白成分能够防止细胞死亡和运动功能丧失。实验对象是C57小鼠中风小鼠模型，对C57小鼠进行了中脑动脉闭塞手术，将闭塞物插入颈内动脉，位置在靠近与颈外动脉的分支处。闭塞1小时后，对D2或其最接近的对照物NE2进行静脉注射(4mg/kg，尾静脉)。而后移去闭塞物，动物复苏。正常血流的重新建立通过激光-多普勒检测确定。24小时后观察动物行为是否有运动缺陷，然后处死。迅速取出脑，切成2mm切片，在三苯氯四唑(TTC，2％)中孵育。TTC分子结合到功能正常的线粒体上，将活的神经元变成染色很深的红色组织。在出现缺血症状后1小时D2，取其断面。动物表现出正常的行为，无运动缺陷。出现缺血症状后1小时向动物注射NE，同样也取其断面。所有的注射均是在MCAO开始后1小时进行。这些结果表明，在MCAO小鼠模型中，冬眠早期分子具有组织保护效应。这种分子在冬眠后期(NE2)就不存在了，它的缺乏与自然死亡和唤醒死亡的高发情形有关。
在对D2和其对照(NE2，SA)分别进行的3个重复实验中，对梗塞体积(立方毫米)的定性测量结果列在表7中。在第四个D2实验中，中脑闭塞后30分钟，开始进行尾静脉注射，闭塞物仍在原来位置。收集这些亚组一些动物的染色切片，以及注射脑脊液的动物的染色切片，也有一些动物注射的是能够产生明显的组织保护作用的物质。对标准的脑缺血小鼠动物模型进行的三次重复实验(R1-R3)是尾静脉注射D2和NE2分子成分。每对片子来自于该组中组织保护量最大的动物。每张标签右侧的成对数目表示的是在每组中显示100％组织保护的动物的数目与组织保护较少的动物的数目。与NE2对照组的0％组织保护相比，三组注射D2的重复实验中显示的平均组织保护是77％(p＜0.001)。动物模型经历的是：1小时中脑动脉闭塞(水合氯醛麻醉)，随后恢复血流，尾静脉注射所述物质。梗塞面积通过三苯氯四唑(2％)染色和计算机体积分析软件计算。注射方案：10mg/kg(D2，NE2)，尾静脉注射；100μl(CSF，静脉注射)；2.5μl(CSF，IC)。
梗塞体积中显著的组织保护通过动物在开放场地的行为活动来证实，例如动物跳跃到场地上放置的小箱子顶端。梗塞体积的部分挽救与部分运动功能的恢复有关(四肢虚弱，跳跃不准确)。所有的对照组均表现出一些常见的偏瘫行为，以及与之相关的强制性转圈，在开放场地上通常缺乏自主行为等。
梗塞体积的量效关系(如组织保护)在表7中显示。注意较大剂量的翻转U形曲线。最有效的剂量是5mg/kg，该剂量下梗塞体积最小。
对成年大鼠(n＝25)进行了大剂量研究，没有出现明显的毒性。通过尾静脉注射50mg/kg的剂量时，对于器官的总体解剖、器官重量、动脉压、体温、饮食行为没有显著的作用。大鼠研究每天进行注射，观察了3周。高达800mg/kg的更大的剂量，在另外两只SHR大鼠身上表现出耐受性，不影响它们的血压，也不会导致24小时内死亡。
注射NE2、SA和CD分子成分的效应在统计学上相互之间没有显著不同。将它们联合在一起作为对照(n＝16)，与D2组(n＝21)相比，显示出很高的统计学差异(p＜0.001，t检验)，β值很高(β＞.90)
表7-小鼠MCAO模型中的脑梗塞体积(mm3)
  1小时后注射的不同成分
  D2   D2同源物   NE2   SA   HCF-icv   HCF-iv
  23.12   37.88   55.92   74.68   41.56   34.92
  32.41   28.36   69.41   95.41   27.21   21.61
  88.24   88.52   78.48   79.88   46.32
  59.52   77.81   100.04   91.16   43.24
  83.21   55.96   82.31   89.48
  0   8.32   62.77   89.58
  66.81   37.61   75.11   74.62
  78.32   7.24
  53.95   42.71   74.86286   84.97   39.58   28.26   均值
  0.019173   0.003136076   0.287991   0.00001   0.00008   P值
  0.5小时后注射的D2成分
  小鼠1   小鼠2   小鼠3   小鼠4   小鼠5   小鼠6   小鼠7   小鼠8
  4.49   33.62   106.57   11.62   0.00   4.22   70.93   0.00
  小鼠9   小鼠10
  8.45   29.35   26.93   均值
  0.000774   P值
  量-效，D2成分，1小时注射
  SA 5mg/kg   D21mg/kg   D25mg/kg   D210mg/kg   D220mg/kg
  89.58   18.52   10.52   15.88   47.17
  74.62   24.38   3.65   14.92   48.01
  82.11   21.45   7.09   15.41   47.59   均值
(2)对D2的分子筛处理及透析处理：增进效能
如下表8所示(分子筛实验)，将D2放在封闭的截止值为10kD或3.5kD的膜管中，然后在低温下(4℃)，用8M尿素，2M氯化钠或水透析24小时，以洗掉肽，但不除去活性分子。尿素适当处理似乎能够增加D2中活性分子的活性。透析处理通过洗掉可能存在的肽抑制剂，或者通过从载体蛋白(白蛋白)上解离活性组分，可以增强效能。结果是，分子量大于10kD的一种或一种以上的分子是携带活性组分的分子，因为它们被阻留在透析后的D2成分里，然后通过MCAO模型检测，证明其有效。
表8D2的分子筛过滤(10kD和3.5kD)，透析(尿素、盐、水)：在MCAO小鼠模型中(3只/组)对梗塞体积(mm3)的影响(4mg/kg)。
  D2处理   小鼠1   小鼠2   小鼠3   均值   标准偏差   P值
  尿素10kD   25.10   00.00   5.15   10.08   13.25   0.0026
  尿素3.5kD   02.50   32.34   11.63   15.49   15.29   0.0053
  氯化钠10kD   32.18   29.87   47.75   36.60   09.73   0.0101
  氯化钠   42.41   10.68   34.33   29.14   16.49   0.0163
  3.5kD
  水10kD   27.79   33.21   71.66   44.22   23.92   0.1229
  水3.5kD   37.25   20.73   46.81   34.93   13.19   0.0156
  D2(未处理)   38.71   32.85   16.22   29.26   11.67   0.0075
  NE2对照   82.31   62.77   75.11   73.40   09.88
(3)双向电泳和指纹鉴定
附图2(上部)显示，在2个双向聚丙烯酰胺凝胶中，SA(状态#1，NE)和D2(状态#2，D2)分别是可见的纯蛋白的圆点，有特定的等电点(x轴)和分子量(y轴)。在状态#1中很多小点是灰色的，在它的中心没有黑色集中点。因此，利用计算机模拟视觉将单一的黑色象素放在每个点的中心，这样可以制作黑色清晰的重叠点，并将其叠合到状态#2凝胶上。在状态#1叠加到状态#2的放大框中，一个附近带有状态#1单独的象素点的状态#2的灰色小点证明两个点(即，蛋白)均存在于两种状态中。因此那些附近没有状态#1单个象素点的状态#2点是状态2特异的。在放大框中(下面)，那些斜线标志表明了多个状态#2特异的蛋白。将全部的状态2特异的点进行双向电泳，总共发现20个。另外大约20个点在状态#2中被大大上调，相对于考马斯亮蓝色斑至少高出2倍的密度即为证据(即淡灰色对比于深黑色中心点)。
一旦鉴定出一个感兴趣的点，接着就将其直接注射到液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)联合分析仪上。首先切下凝胶上的点并进行蛋白洗脱，然后，将纯化的分子注射到质谱束中并测量分子量。当它们在电子束中时，被第二束电子流轰击，分子在预先的氨基酸键合部位断裂。后面的电子流产生分子特异的产物，正如指纹对于一个人来说是特异的那样。一旦该分子的“指纹”被确定，就可以在所有大的数据库中寻找它，这里可能存有它的指纹，同时还有它的结构。如果感兴趣的点是已知的蛋白，那它就很容易鉴别了。
附图3显示了已经被鉴定的不同的点在BATS凝胶上的定位，这种凝胶类似于双向凝胶，只是在BATS凝胶中，pI梯度出现后，凝胶被切割成条状，而后交替摆放，分别与其它状态下得到的条带相邻。然后将所有这些成对的条带进行质量梯度电泳。注意在BATS电泳中得到的状态#2点不像在高分辨率双向凝胶电泳中得到的那么多。即，在BATS凝胶电泳中，在pI为4至7时只发现9个状态依赖的点(蓝圈)，附图2中，双向电泳图谱上有20个点。有3个蛋白的结构可以在数据库中找到。(巨球蛋白2α，血清淀粉样蛋白A1和转甲状腺素，它们都具有夏季特异性)。
附图4显示了带有感兴趣的蛋白点(圈)的BATS凝胶，其pI范围是6-6.5。这一较小的pI范围中包括了在附图3中pI从4到7范围的大部分不同的点。作为最好的对照，NE2显示了在SA中未出现的蛋白条带。
附图5显示的是带有最好的对照的最高分辨率凝胶。结果是那些状态依赖最小的点被鉴别出来，其中一个成为MCAO模型中(D2-NE2)组织保护的基础。在图中的CSF和尿样组中，比较了冬天冬眠时的物质和它们各自在夏季的对照物。D2与其最接近的状态，即NE2相对比。在两个双向凝胶上，利用计算机软件(Genomic Solutions，Inc.)挑选每对相应的点用于定量比较。计算机在双向凝胶中利用渐变的空间梯度计算相应点的同等物，双向凝胶图谱不停地变化，直到使所有的点最优化比对。这些点先是在空间上进行比对，然后根据每个点的灰度按照整块凝胶进行标准化；这种标准化主要是为了补偿制胶所用的相等样本体积之间的浓度差异；该方法前提是假定每块胶的蛋白含量相等。而后根据两种状态中每个点标准化以后的灰度值，确定蛋白丰度的相对差异。
D2和SA之间的差异有40处，而D2和NE之间只有9处(附图5，上面左图，黑点，附图3)。此外在后者的比较中，有4个点在状态#2凝胶中减少2倍以上(冬眠，黄点)。CSF(冬眠与非冬眠的对比)显示了更大多的蛋白被上调(绿点)，其中一些是由于未进行标准化补偿而产生的浓度差异造成的(蓝点)。尿样显示被上调的蛋白和其代谢片段的数目更多。
(4)注射时间决定梗塞体积的大小
附图6说明，在小鼠MCAO模型中，用D2(5mg/kg)预处理几乎可以完全阻止脑栓塞。垂直线指的是围绕均值的正负标准偏差。很明显，MCAO梗塞1小时后，30分钟到2小时进行注射，也可以显著减少梗塞体积(p＜0.001)，尤其是用D2处理后(8M尿素透析)。MCAO开始后，超过6小时后注射，平均梗塞体积还会降低20％(p＜0.05)。
(6)D2中的肽
附图7显示了D2和NE2的LC/MS/MS结果，每种物质均进行了10kD膜的离心过滤处理。利用分子指纹图谱和生物信息学鉴定出D2中富含的肽，其中的一种是血纤肽A。因为用这种方法找到的D2和NE2之间有差异的肽太少，所以寻找另外的差异显示方法。
这种所谓的ICAT法鉴别状态依赖的肽是利用两种不同的氘同位素(氘-2和氘-8)标记不同的状态依赖的半胱氨酸。但是发现，在D2肽成分中没有足够的半胱氨酸标记的分子，也就是说，去除10kD以下的分子，使该方法更实用。
(7)数据
可能大部分与冬眠有关的死亡发生在冬眠晚期，冬眠晚期从12月26日或更晚些时候开始，持续进行到1月下旬(表6)。在冬眠期(5D)或完全唤醒后(7d)有集中的死亡事件。1月中旬唤醒动物后迅速出现唤醒死亡事件(4D)，但是这种情况在12月中旬不会发生。12月中旬动物自然苏醒或被唤醒，都不会造成象1月中旬一样多的死亡事件。
1月份发生的自然死亡或唤醒死亡可能是由于动物血液循环中缺乏一种或一种以上的分子造成的。这些分子在12月上中旬唤醒中存在于动物血液中，并具有保护作用。这种在12月份还存在的分子(D2成分)似乎参与保护缺血性损伤的机制(表7)，这种保护作用在1月份就不存在了(NE2成分)。
从冬眠开始到苏醒，这种对缺血损伤的保护作用一定也参与预防脑和心脏的组织损伤。当动物醒来开始走动时，如果没有足够的血液循环支持，就容易发生类似的损伤(附图1)。这种生理危险在1月中旬唤醒的动物都出现了，但12月中旬唤醒动物中则没有。
12月26日以后3周内，50％动物发生集中性自然死亡。到2月中旬，这种自然死亡率升高到55％(22只动物中有12只)。幼年旱獭的自然死亡率(83％，6只中有5只)高于成年旱獭(50％，16只中有8只)。
12月中旬自然苏醒的动物没有出现立即死亡(研究1，划线的，9例)，说明缺血保护分子仍大量存在，这一点可以通过给中风小鼠模型注射12月提取的血浆分子D2来证实(表7)。注射1月份提取的血浆成分NE2对中风模型无效，在集体死亡时期，正是缺乏这种保护性分子导致很高的死亡率(表7)。
12月中旬的唤醒(研究1都是在12月21日，研究2都在12月15日进行)没有引起任何的死亡事件。对于冬眠的动物，其ECG数据显示这些动物至少是部分苏醒(附图1，12月中旬)，而后全都成功返回冬眠状态(附图1，存活的)。注意在研究1中，在唤醒5天后，12月26日死亡的两例，与唤醒刺激无关。与之相反，在1月中旬的“集体死亡”时期，唤醒刺激使动物开始走动，并出现严重的心动过缓，接着100％的动物死亡。
为什么动物在1月份自然苏醒时并不总是发生死亡(表6，下划线部分)?可以这样解释，1)这些存活的动物，其代谢需求(走动行为)和血液循环供应之间有较好的匹配。2)伴随自然苏醒，缺血保护分子存在二次激活分泌，而人为唤醒则没有。第一种可能性似乎不太大，因为所有在1月份人为唤醒的动物(研究2)均在12小时内发生死亡，没有任何证据显示有支持性的生理行为出现。然而，第二种可能性，是通过观察存在于冬眠早期时期，而不是存在于冬眠晚期的分子的保护作用得出，因此可能性较大。也就是说，在冬眠过程中，缺血保护分子的分泌是短暂的，其较高的分泌水平不会在冬眠过程中一直维持到进入1月；因此，这种分子必然有二次分泌，作为自然苏醒过程的一部分发生。在1月份动物自然苏醒死亡的原因可能是，像人为唤醒的那样，醒来太快以至于存活所需的保护性分子还没有足够地分泌出来。
保护性分子可能是一种蛋白，分子量大于10kD，因此在透析去除杂肽过程中不会被洗掉(表8)。所有表现出差异上调和/或状态特异的分子都可能具有抗中风作用，见附图5。4个鉴定出的分子是巨球蛋白2α、血清淀粉样蛋白A1、转甲状腺素和血纤肽A(附图3和附图7)。
特异的抗中风分子可能是附图5中9个黑点中的一个(D2-NE2)，该图用的是“最接近”对照。由于在CSF中也找到了保护性分子，CSF是一个分子成分，具有自我神经保护作用(附图6，表7)，因此附图5中上面2张凝胶图的对比中可以找到更少的感兴趣的点。在大的白蛋白点左侧一个较大的绿点是在上面两张凝胶图中唯一一个精确叠加的点。另外一个在这一点左下方的点可能是一个重叠点。
可以从D2中分离多个分子成分，利用MCAO示踪观察哪种亚成分有效，这种方法也是另一种分离具有目的特性的分子。
同样的抗中风分子也可能有抗心脏病发作的作用，原因在于，所述分子可能是那些动物从冬眠中苏醒过来时，对缺血死亡起保护作用的分子，在所述冬眠中，发生诸如附图1中列举的心血管病症。当从血液中收集到这些分子时，没有理由相信这种抗缺血的分子只是对脑有特异作用。
(8)利用液相色谱/质谱/质谱联用方法鉴别D2和NE2肽成分中的血纤肽A(3kD截止值)。
附图7是D2和NE2过滤后物质(3kD，截止值)的光谱图。在D2和NE2洗脱产物的鉴定中均采用的是液质联用技术(LC/MS/MS)。下面的离子依次排出：m/z 809、904、1010、1012、1621和1662。m/z 809和1010离子是MALDI离子化过程中产生的基质离子。m/z 1012是m/z 1010的第三种同位素。m/z 1662的分析最后并不确定，这里介绍了对m/z 904和m/z 1621的分析。很明显，血纤肽A是m/z 1621离子峰代表的物质，m/z904峰代表的是缓激肽。其它峰为用于容纳原材料的基质片段(“星号”标记)。有6种肽在冬眠中期提取的NE2成分中更丰富(“-”标记)。
(9)美洲旱獭FPA的独特结构
表9列出了美洲旱獭FPA的序列
表9
利用液相色谱/质谱/质谱联用方法和研磨(tripsination)片段方法鉴定的美洲旱獭FPA的序列(FPA-w)
  ADTDK   GEFLAEGGGV   美洲旱獭*
*第9位的氨基酸L实际上可能是I，因为这两种氨基酸的分子量几乎相同，这个质量在片段质量中还未完全确定。小鼠在这一位置是L，表1所列大部分种系也是如此。因此本发明公开了第9位是L或I的片段。
通过对产物离子数据的进一步分析，我们也猜测了它所代表的肽序列。注意到亮氨酸和异亮氨酸是异构体，不能通过低能CID区分。加入1μl纯的乙酸酐对另外15μl等份的D2样品进行衍生化处理(N-乙酰化)。注意N-乙酰化使伯胺(N末端和赖氨酸侧链)发生衍生作用。反应进行5分钟，生成的溶液通过上述液质联用方法进行分析。
综合了两套产物的离子数据后，阐述出肽链全序列。第5位赖氨酸的存在很大程度上影响非衍生化样品的断裂模式。N-乙酰化后转化成一个次要的侧链使得再分析修饰肽时，发生更加完全的断裂。用推断的序列搜索公开的数据库，证明这种肽是血纤肽A。
m/z 904分子离子峰代表的分子序列证明是脱Arg1的缓激肽(附图10-11)
(10)在小鼠MCAO模型中，试验人FPA(FPA-h)的独特功能
下表9中列出了FPA-h在小鼠中风模型中的试验结果。FPA-h和NE2造成的平均梗塞体积之间有显著的统计学差异(p＜0.01)。每格代表一只小鼠。在附图12中有相同数据，包含平均值和标准偏差。
在显著减少梗塞体积的作用上，D2肽和NE2肽之间有显著的统计学差异(p＜0.01)。同时也说明，这些肽中的一种，即FPA-h，在10μg/kg(是D2剂量的1/1000)，还能减少小鼠MCAO模型的梗塞面积，并具有统计学显著性。
表9
  D2   NE2   SAA   FPA-h   D2-0   D2-200   D2-600   NE2-0   NE2-200   NE2-600   12月D0l   1月J02
  14.94   57.92   50.66   20.76   9.10   43.50   3.80   76.40   78.40   41.40   35.96   22.98
  34.54   60.64   47.84   53.72   13.80   7.60   4.60   50.66   41.70   69.40   3.70   13.80
  0.00   64.80   34.76   10.60   28.30   7.20   75.60   45.20   61.30   27.80   6.80
  78.42   4.20   11.50   19.60   20.50   48.60   0.00   7.90
  9.70   0.00
  0.00
表9为在小鼠MCAO模型中，冬眠相关的分子成分和合成的人血纤肽A(FPA-h)对梗塞大小(mm3)的影响。D2＝冬眠早期的白蛋白成分；NE＝冬眠中期NE2；SAA＝血清淀粉样蛋白A；D2-0、D2-200、D2-600、NE2-0、NE2-200，NE2-600＝从阴离子交换柱上洗脱分离物所使用的NaCl的浓度。所有动物服用的待测物质剂量均为10μg/ml。
表10
  梗塞   同侧   对侧   梗塞   同侧   对侧   梗塞   同侧   对侧   梗塞   同侧   对侧
  切片1   1   1   切片2   2   2   切片3   3   3   切片4   4   4
  0   5.16   4.99   0   8.77   8.63   0   10.25   10.26   0   10.94   10.13
  0   5.52   5.42   0   8.83   8.77   0   10.45   9.79   0   9.29   9.01
  0   4.98   4.98   0   8.89   8.54   0   10.2   9.84   0   10.16   9.44
  0.46   6.51   5.57   0.98   9.19   8.53   0.45   10.24   10.87   0   9.67   10.12
  0   6.52   无症状   0   8.75   9.07   0.75   10.08   9.63   0   8.87   9.7
  0   5.78   无症状   0   8.92   9.68   0   10.28   9.72   0   9.67   9.69
  1.11   6.96   无症状   1.88   10.3   8.89   0.64   10.82   10.31   0.35   10.2   9.83
  0.34   5.1   5.18   0.45   8.87   9.21   0.76   10.82   10.19   0.43   10.56   10.24
  0   5.13   4.79   0.04   8.47   8.51   1.32   10.74   9.43   4.66   11.25   9.34
  1.77   6.89   6.03   2.12   10.23   9.51   2.51   11.76   10.88   2.15   10.49   9.32
  2.12   6.43   5.71   3.29   10.15   9.14   2.17   11.32   9.94   3.37   10.78   10.38
  1.71   6.47   6.96   3.13   9.77   9.3   3.11   10.99   10.32   0.39   11.1   10.16
  1.58   7.14   无症状   2.26   10.49   9.2   2.29   11.49   10.81   2.58   10.81   10.72
  0   5.29   5.07   0   8.8   8.63   2.26   10.69   10.15   5.53   11.28   9.44
  2.33   5.36   4.03   5.39   9.25   7.48   7.51   10.4   8.39   7.24   10.48   8.88
  2.54   5.09   无症状   5.79   10.14   8.28   5.24   11.21   8.84   0   9.47   9.19
  5.34   5.92   4.13   7.8   10.18   8.45   4.83   11.29   9.62   0.31   10.83   9.22
  2.8   4.44   5.15   6.43   9.98   8.79   6.31   10.83   9.63   3.92   11.86   9.63
  3.04   6.28   4.69   5.15   8.91   7.91   5.3   10.09   9   5.29   9.59   9.02
  3.5   6.35   5.65   5.04   9.5   8.98   6.61   10.48   9.25   6.04   9.54   9.14
  2.7   4.89   4.8   4.41   9.36   7.59   4.51   9.93   9.33   5.04   9.91   8.71
  2.84   5.75   5.17   4.02   9.22   8.06   5.42   10.47   8.79   7.12   10.27   8.49
  4.09   6.81   5.14   5.87   10.47   7.98   6.64   10.27   9.66   5.02   9   9.1
表10给出了在小鼠MCAO模型中进行FPH-h(静脉)注射的原始数据。每一行列出了每只小鼠的四片相邻的2mm切片(前侧至后侧)上，每片的梗塞面积(平方毫米)和脑半球同侧、异侧的相关面积(平方毫米)。给表中底部的5个对象注射夏季所得的白蛋白作为对照(SA)。每只动物的给药剂量和总的梗塞体积在表11中显示。
表11
  分子   静脉注射剂量   组号   脑半球同侧   梗塞％
  (IV)   (微克/每只动物)   鉴定产物   体积/2   体积
  FPA   62.5   2   43.17   0
  FPA   250   2   41.51   0
  FPA   250   4   41.81   0
  FPA   62.5   3   43.71   4.9
  FPA   250   6   41.92   1.8
  FPA   250   7   42.38   0
  FPAtyr   62.5   3   46.86   10
  FPAtyr   62.5   5   43.18   5.5
  FPA   250   8   43.78   19.1
  FPA   15.625   4   48.06   21.9
  FPA   15.625   5   47.29   28.9
  FPA   62.5   1   47.12   19.9
  FPA   62.5   4   48.91   22.1
  FPA   62.5   5   44.35   23.8
  FPA   250   1   43.41   62.8
  FPA   250   3   43.19   34.4
  FPA   250   5   46.61   45.3
  FPAtyr   62.5   6   45.26   50.4
  SA   400000   1   42.05   53.6
  SA   400000   2   43.82   59.2
  SA   400000   3   42.03   48.8
  SA   400000   4   43.72   55.8
  SA   400000   5   44.46   58.9
表11显示注射(静脉注射)FPA-h对小鼠MCAO模型的梗塞体积百分比的影响。每一行是和表7一样的相同动物，显示了：注射的分子(FPA＝FPA-h，人的序列)，剂量以微克/1只动物为单位，剂量组中的鉴别数目(#)，半个同侧脑半球的体积(立方毫米)和同侧脑半球的梗塞体积百分比。下面的几栏是对照(夏季白蛋白成分，SA)。在相关的α水平的t检验中，上部分和下部分的梗塞体积百分比均值之间的差异，统计学显示p＜0.00005。
FPA的第一个被检验的亚结构是分离的C末端和N末端。合成FPA及其肽段并在小鼠MCAO模型中检验。如表10-12中所示，人源的FPA(FPA-h)是有效的抗梗塞分子，而旱獭来源的(FPA-w)则不是。FPA-w的N末端无效，但C末端有效。而且，当与缓激肽共同给药时，C末端的效能增强，缓激肽为与相对于NE2肽，其它上调的D2肽。
表12
在小鼠MCAO模型中，静脉注射(250μg/小鼠，FPA-h或其等摩尔物)以下物质的效能(同侧脑半球梗塞百分比)，所述物质包括：合成的美洲旱獭血纤肽A(FPA-w，第9位氨基酸是I或L)，它的第3位磷酸化产物(PhFPA-w)，它的亚结构片段(C末端或N末端)，缓激肽(Des-Arg-缓激肽、ad缓激肽、缓激肽、BK)，或者是ad BK与C末端合用。各组平均值用黑体表示。
  FPA(I)-w   FPA(L)-w   Ph FPA-w   N末端   C末端(I)
  21   49   25   60   44
  46   53   24   65   1
  34   48   52   64   8
  58   43   70   69   10
  47
  组
  39.7   48.2   43.6   均值   64.5   15.7
C末端(L) adBK BK   adBK与C末端 生理盐水 无
  15   17   23   7   71   34
  36   9   16   19   54   48
  34   27   27   18   60   70
  0   15   67   28   61   53
  42
  21.2   17   33.2   18   57.6   51.2
  合用   组*
  对照   FPA-w   BK   C末端-w   FPA-h
  34   49   17   44
  48   53   9   1
  70   48   27   8
  53   43   15   10
  71   21   23   15
  54   46   16   36
  60   34   27   34
  61   58   67   0
  42
  54.7   44   25.2   18.5   19.4
  0.0842   0.00300   0.00010   0.00003
  0.0421
*如果采用合理的单尾t检验，结合型的FPA-w(I，L)与结合型对照之间没有显著的统计学差异(p＜0.0421)。相反，FPA-w的C末端则有很高的统计学差异(p＜0.00010)。BK组单独用药或合用时，也有统计学差异(p＜0.00300)。前表中所述的FPA-h组在所有组中的统计学显著性最高(p＜0.00003)。adBK与C末端合用没有表现出更好的统计学显著性。
(11)另一个D2相对NE2上调的肽，缓激肽
缓激肽影响梗塞面积，并能够增强FPA的抗梗塞作用。8只生理盐水对照组小鼠梗塞面积平均百分比为52％；另外8只用FPA-w的C末端处理的小鼠，梗塞面积平均百分比为35％(p＜0.5)；当在其它8只小鼠中将11个氨基酸组成的肽和缓激肽合用时，使得梗塞百分比进一步减小到19％(p＜0.05，表12)。
(12)尿素循环-
基本原理是怀孕的和正在冬眠的北极熊必须一直进行蛋白合成，而不引发尿毒症。因此尿素循环机制就被提出来了。发生在非冬眠种系身上(实验室大鼠)的尿素循环数据表明，当将从正在冬眠的美洲旱獭血浆中提取出来的白蛋白成分施用于大鼠时(静脉给药，10mg/kg)时，这一循环速率可以达到13倍。该结果得到了重复(附图13)。根据标记，使用了D2或D01，这两种成分在抗梗塞效能和尿素循环效能上没有明显差异。
附图13中显示了D2或其等价的冬眠相关产物D01，在刺激血液尿素循环方面的影响。这里医学上的适应症是尿毒症，这是肾衰和麻醉恢复过程中容易出现的医学难题。附图13显示了与冬眠有关的白蛋白成分(D2、D01，20mg/kg)与注射纯的白蛋白(Xeno白蛋白，20mg/kg)对照组相比，所表现的作用。
数据清楚地显示(p＜0.025)，与冬眠有关的白蛋白成分能够促进单标记的尿素的产生，产生量在天然的单标记的尿素(例如一些自然界存在的N15)基线水平以上。这只能解释为，通过切除双标记的尿素氮，它们再重新加入形成单标记尿素。随着时间进展，最初注射的双标记氮(1mg)，有一些已经被排泄了。对于单标记物，有时也会发生这种情况。双标记物到6小时的时候，只剩下注射时的1/9(所有注射对象的平均值)。这样来说，在6小时时，尿素的循环率比附图13所示的循环率高9倍，与对照组相比增加5-6倍多。
2.FPA数据实例
在中脑动脉梗塞(MCAO)小鼠模型中检验血纤肽A的效能。在这项研究中，研究了血纤肽A的碳末端两种制备物的作用。一种变异体在第4位上为异亮氨酸，另一种变异体在第4位上则为亮氨酸。静脉注射FPA变异体，包括C端的11个氨基酸组成的肽，在MCAO开始后进行。取出脑组织，用TTC进行染色，通过成像分析检查梗塞体积。这些化合物与未接受注射或注射生理盐水的对照组进行比较。注射血纤肽A碳末端，剂量在10mg/kg时有保护作用，可高达66％。总的来说，FPA碳末端部分，10mg/kg，对于小鼠缺血/再灌注之后，脑部MCAO的扩展有限制作用。
在这里我们还提供了FPA的作用浓度系列。在中脑动脉梗塞小鼠模型中检验了血纤肽A的效能。MCAO开始后1小时，注射FPA。取出脑组织，用TTC进行染色，通过成像分析检查梗塞体积。注射不同剂量的FPA有不同的保护作用，2.5mg/kg保护作用最强(超过60％)，0.625mg/kg和10mg/kg剂量对脑的保护作用大于50％。所有剂量下，小鼠的脑梗塞体积均有所下降。总的来说，FPA2.5mg/kg，对于小鼠缺血/再灌注之后，脑部MCAO的扩展有最有效的限制作用。
a)方法和材料
(1)研究项目设计
小鼠中风模型，中脑动脉梗塞(MCAO)。小鼠出现MCAO后1小时，进行24小时再灌注。缺血末期，注射FPA C末端(10mg/kg)，第二天处死动物，取出脑组织，用氯化三苯基四唑(TTC)进行染色，检查梗塞体积。FPA是在缺血末期注射(0.625、2.5或10mg/kg)，第二天处死动物，取出脑组织，用TTC进行染色，检查梗塞体积。将这些切片与未接受注射或注射生理盐水的对照组动物进行比较。
(2)体内方法
体重在25克左右的雄性C57BL/6(Jackson实验室)小鼠，实验前以及过程中可自由饮食饮水。实验前，动物适应环境1周。按照注明的剂量以200μl/小鼠对动物进行注射。小鼠在缺血开始后1小时接受静脉注射。
(3)诱发缺血
每只小鼠都是在1小时脑缺血后进行24小时再灌注。缺血后期，给动物按照指明的剂量注射组合物，24小时后，检查梗塞体积。颈部沿中线切开小口，暴露出左侧颈总动脉(CCA)。将甲状腺上动脉和枕动脉电凝固并分开。将显微外科夹夹在颈内动脉(ICA)起始部附近。颈外动脉(ECA)远端用6-0线结扎后切断。6-0线松散地缠绕在ECA残端上。移去显微外科夹，将5-0尼龙缝合线(多聚左旋赖氨酸包被的)的火抛光线头轻轻插入ECA残端。将缠绕在ECA残端的6-0丝线环扎紧，在移除动脉瘤夹后将尼龙缝合线向前推进大约11mm(根据体重调整)，使之进入并通过颈内动脉(ICA)，直至到达脑前动脉(ACA)，由此阻塞了脑前部的血液交通和中脑动脉。在受试动物从麻醉中醒来后，将其放回笼中。使尼龙线维持在原位置1小时，将动物再次麻醉，拆除手术线，缝合伤口。
(4)梗塞体积的检测
为了检测梗塞体积，通过脑室内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)对动物进行麻醉。24小时后，取出脑，通过梗塞区域，切成4-2mm的切片，放到2％的氯化三苯基四唑(TTC)中染色30分钟。之后，将切片放到4％多聚甲醛中过夜。采用计算机辅助图象分析系统确定每张切片中的梗塞范围，所述图象分析系统包括装有Quick Capture帧捕获卡的PowerMacintosh计算机，还包括装在照相机架上的Hitachi(日立公司)CCD(电荷耦合装置)照相机。使用1.55版本的NIH Image Analysis Software(美国国立卫生研究院图象分析软件)。采集图象，并确定全部切片的梗塞总范围。对治疗状态一无所知的一个操作人员完成了所有检测。由全部切片梗塞体积的总和计算出总梗塞体积。
(5)统计学分析
结果以均值±标准偏差(SD)形式表示。用t检验分析梗塞体积的显著性差异。
(6)治疗组
所有组均为MCAO。MCAO后，给动物(17只)注射FPA衍生物，给23只动物注射药物用于进行浓度研究。分组：1)未注射，2)生理盐水，3)10mg/kg的FPA(I)-w的C末端部分，4)10mg/kg的FPA(L)-w的C末端部分，5)0.625mg/kg的FPA，6)2.5mg/kg的FPA，7)10mg/kg的FPA。
b)结果
(1)小鼠缺血
我们评价了在这些研究中，小鼠缺血的相对严重程度。数据来自缺血性损伤小鼠，对它们进行了腹膜内注射指定剂量的组合物。
(a)梗塞面积
与未接受注射和注射载体(生理盐水)组的动物相比，注射FPAw的C末端组的动物脑部梗塞面积明显减少。C端(I)FPAw(10mg/kg)可以使梗塞体积下降66％。C端(L)FPAw(10mg/kg)显示相似程度的降低，梗塞体积减少了67％(表16)。梗塞体积在附图14和15中显示。脑梗塞体积减少百分比列在表16中。
表16  脑梗塞体积减少百分比
  化合物   梗塞体积减少百分比
  未注射   -
  载体   -
  C端(I)FPAw(10mg/kg)   66％
  C端(L)FPAw(10mg/kg)   67％
下降百分比是与注射载体组的动物相比生成附图15的数据显示在表15中。
表17
  未注射   生理盐水   C端(I)   C端(L)
  38.250   81.730   51.330   11.360
  67.200   64.910   8.630   33.790
  82.370   72.370   12.810   39.420
  76.820   68.550   17.250   2.670
  49.680
结果的统计学分析显示在表18中。梗塞体积以mm3表示。
表18  梗塞体积的统计学分析
  未注射   生理盐水   C端(I)   C端(L)
  评价数目   4   5   4   4
  最小值25％百分点   38.25   49.68   8.630   2.670
  中间值75％百分点   72.01   68.55   15.03   22.58
  最大值   82.37   81.73   51.33   39.42
  均值   66.16   67.45   22.51   21.81
  标准偏差   19.63   11.74   19.54   17.60
  标准误差   9.817   5.251   9.768   8.800
  95％CI下限   34.92   52.87   -8.582   -6.194
  95％CI上限   97.40   82.03   53.59   49.81
该研究中有7只动物死亡。大部分死亡发生在生理盐水组和未治疗组。治疗组无一例死亡。
与注射载体组的动物相比，注射FPA组的动物，脑部梗塞面积明显减少。FPA(2.5mg/kg)比其它剂量组显示出大得多的减少梗塞体积的作用。0.625mg/kg和10mg/kg两组在减少梗塞体积的效能上相似，但不如2.5mg/kg剂量组作用强烈(表19)。在附图16中显示梗塞体积。在表19中显示脑梗塞体积减少百分比。正如在表中所列，2.5mg/kg剂量组与载体对照组相比，使脑部梗塞体积减少了66％。
表19  脑梗塞体积减少百分比
  化合物   梗塞体积减少百分比
  载体   -
  FPA 0.625mg/kg   52％
  FPA 2.5mg/kg   66％
  FPA 10mg/kg   57％
下降百分比是与注射载体组的动物相比
表20  每只动物的单独的梗塞体积。梗塞体积以mm3表示。
  FPA 0.625   FPA 2.5   FPA 10   生理盐水
  42.350   34.850   91.580   92.340
  50.620   5.180   5.220   76.450
  52.180   7.290   47.610   88.120
  23.510   25.560   10.390   69.530
  41.490   24.870   37.650   90.410
  65.190   41.730   71.030   82.430
  14.230   58.310   11.940
  29.710   6.770
附图16的统计学分析列在表21中。
表21  梗塞体积的统计学分析
  FPA 0.625   FPA 2.5   FPA 10   生理盐水
  评价数目   8   7   8   6
  最小值   14.23   5.180   5.220   69.53
  25％百分点   26.61   16.08   8.580   72.99
  中间值   41.92   25.56   24.80   85.28
  75％百分点   51.40   50.02   59.32   91.38
  最大值   65.19   58.31   91.58   92.34
  均值   39.91   28.26   35.27   83.21
  标准偏差   16.67   18.79   32.70   8.863
  标准误差   5.894   7.103   11.56   3.618
  95％CI下限   25.97   10.87   7.934   73.91
  95％CI上限   53.85   45.64   62.61   92.51
在浓度变化的相关研究中，有8例死亡。大部分死亡发生在0.625mg/kg剂量组(8只中有6只)，8只中有2只是在2.5mg/kg剂量组中死亡。10mg/kg剂量组无死亡。尚不清楚为什么在0.625mg/kg剂量组会有损伤。
3.缓激肽受体数据实例
a)实验过程
实验测量了[125I]CGP-42112A与血管紧张素AT2受体的结合反应。通过标准的实验技术在pH7.4的改进的Tris HCl中制备Hela细胞膜，Hela细胞中转染了编码人血管紧张素AT2受体的质粒。0.5μg膜用0.025nM的[125I]CGP-42112A在37℃孵育3小时。非特异结合是在10μM的[Sar1，Ile8]血管紧张素II存在的条件下测定(不同的批次间膜蛋白浓度有差异，可以根据需要进行调整)。将细胞膜抽滤，洗涤3次，滤膜进行放射活性分析(计数)以测定[125I]CGP-42112A的特异结合。在10μM浓度筛选化合物。ATII结合反应基本上按照Whitebread公开发表的文献方法进行。Whitebread，S.E.等，.Radioligand CGP42112A：a novel high affinityand high selective ligand for the characterization of angiotensinAT2receptors，Biochem.Biophys.Res.Comm.181：1365-1371，1991。(这里引用了该文章，至少参考了它所介绍的与ATII定性相关的材料)。
b)结果：
结果显示ATII与CGP-42112A结合的Kd为0.012nM，Bmax为2900fmol/mg蛋白。特异结合是90％。这是所使用的与受试分子竞争的分子中结合率最高的分子。
表21显示可以用来比较与ATII结合的不同水平的参考数据
表21
  化合物   IC50(nM)   Ki(nM)   nH
  血管紧张素II(人)   0.16   0.052   1.1
  [Sar1，Ile8]血管紧张素II   0.085   0.028   1.0
  CGP-42112A   0.024   0.0078   1.1
  *肌丙抗增压素   0.28   0.091   0.9
*表示为标准对照药品
CGP-42112A＝烟酸-Tyr-(N-苯甲酰基-Arg)Lys-His-Pro-Ile-OH
表22和2中给出了对许多缓激肽类似物进行ATII受体结合分析所得到的结果。结果用ATII与ATII受体结合的抑制百分比表示。表22将不同的缓激肽衍生物按照抑制能力的大小排列出来。例如SEQ ID NO：58对ATII与ATII受体结合的抑制率达98％。另一方面，缓激肽(SEQ ID NO：57)对ATII与ATII受体结合的抑制率为12％，这个数字要低于最有活性的化合物。SEQ ID NO：58与SEQ ID NO：12的不同之处在于：SEQ IDNO：58在肽链的N末端额外添加一个Lys，用Leu取代了缓激肽(SEQ IDNO：58)C末端的Phe-Arg。
与SEQ ID NO：58和缓激肽(SEQ ID NO：57)的说明相同，SEQ ID NO：77只是缓激肽肽链N端的前7个氨基酸，意味着C端的Phe-Arg被从缓激肽去掉了，该化合物对ATII与ATII受体结合的抑制率为55％。这些结果证明缓激肽(SEQ ID NO：57)C端的碱性电荷减弱了它与ATII竞争结合ATII受体的能力。另外，在缓激肽的N末端加上碱性电荷能够增强它与ATII竞争结合ATII受体的能力。(SEQ ID NO：58，98％；SEQ ID NO：61，92％)。SEQ ID NO：62、63、64在C末端有Arg，可能由于减弱了负电荷，仍表现出抑制作用，这可能归因于这些肽由金刚烷衍生物所形成的独特结构。
表22显示与注射载体组相比，注射缓激肽(BK)衍生物的动物脑梗塞面积。表22中列举的衍生物按照活性顺序排列。SEQ ID NO：58、61、77有显著性差异，p＜0.05。通过将表28中的全部盐水处理的动物分组并用单尾t检验的方法与表23中的实验动物进行比较，得出所述p值。任何p＜0.05的数据被认为有统计学上的显著性。
表22
  名称   ATII受体抑制％   序列   化学名称   序列号   缺血损伤％   P值
  VP041   98   Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu   Lys-(Des-Arg9，Leu8)-缓激肽   58   12.9   0.0071
  VP044   92   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe   [Des-Arg9]缓激肽   61   13.2   0.0025
  VP060   55   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro   缓激肽(1-7)   77   18.1   0.0263
  VP045   53   Arg-Pro-Pro-Gly-Thi-Ser-Dphe-Thi-Arg   [Thi5，8，Dphe7]缓激肽   62   25.7   0.4483
  VP046   61   N-金刚烷乙酰基DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Dphe-Thi-Arg   N-金刚烷乙酰基Darg0-Hyp3，Thi5，8，Dphe7]缓激肽   63   31.8   0.7653
  VP064   70   DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Igl-Ser-DIgl-Oic-Arg   B9430   81   34.2   0.5935
  VP047   63   N-金刚烷羰基DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DPhe-Thi-Arg   N-金刚烷羰基DArg0-Hyp3，Thi5，8，Dphe7]缓激肽   64   35.2   0.3779
  Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   缓激肽   57
  VP049   38   Met-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-   Met-Lys0]缓激肽   66
  Arg
  VP063   35   DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-DIgl-Oic-Arg   B9340   80
  VP051   33   Tyr-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   [Thr0]缓激肽   68
  VP042   29   DArg-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic-Arg   Hoe 140   59
  VP048   29   Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   [Lys0]缓激肽   65
  VP054   29   Ile-Ser-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   [Ile-Ser0]缓激肽   71
  VP050   18   Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   [Lys0-Ala3]缓激肽   67
  VP053   13   Arg-Pro-Pro-Gly-Tyr-Ser-Pro-Phe-Arg   [Tyr5]缓激肽   70
  VP055   13   Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   [Lys0-Hyp3]缓激肽   72
  VP040   12   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   缓激肽   57
  VP043   9   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-DPhe-Phe-Arg   [DPhe7]缓激肽   60
  VP058   1   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe   缓激肽(1-5)   75
  VP052   -1   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Tyr-Arg   [Tyr8]缓激肽   69
  VP057   -2   Arg-Pro-Pro   缓激肽(1-3)   74
  VP061   -6   Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-   缓激肽(2-7)   78
  Pro
  VP059   -12   Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser   缓激肽(1-6)   76
  VP062   -13   Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg   缓激肽(2-9)   79
如实施例本发明的所示，在MCAO小鼠模型中检测了许多缓激肽衍生物。这些试验结果列在表22中。与AT2受体结合最牢固的缓激肽衍生物也就是能够最有效防止缺血损伤的化合物。
用以生成表22的数据列在表23中。表中指定列数指的是在检测指定的衍生物的特定实验中使用的动物数。例如，在某项实验中，有9只平行动物进行栓塞手术，之后注射FPA衍生物。采用计算机辅助图象分析系统确定每张切片中的梗塞范围，所述图象分析系统包括装有QuickCapture帧捕获卡的Power Macintosh计算机，还包括装在照相机架上的Hitachi(日立公司)CCD(电荷耦合装置)照相机。使用1.55版本的NIHImage Analysis Software(美国国立卫生研究院图象分析软件)。采集图象，并确定全部切片的梗塞总范围。对治疗状态一无所知的一个操作人员完成了所有检测。由全部切片梗塞体积的总和计算出总梗塞体积。结果以均值±标准偏差(SD)形式表示。
表23
  动物编号   1   2   3   4   5   总计   平均值   标准偏差
  VP041   总损伤面积   7.1   20.4   5.3   0.0   32.9   8.2   8.7
  总面积   64.2   64.8   63.2   61.6   253.8   63.5   1.4
  缺血损   11.1   31.5   8.4   0.0   12.9   13.4
  伤％
  VP044/010   总损伤面积   12.3   4.7   11.4   11.6   3.5   43.5   8.7   4.2
  总面积   63.1   63.8   72.1   67.3   64.4   330.6   66.1   3.7
  缺血损伤％   19.5   7.3   15.9   17.2   5.5   13.2   5.3
  VP045   总损伤面积   21.3   4.5   23.1   20.3   69.2   17.3   8.6
  总面积   68.1   63.3   71.3   66.3   269.0   67.2   3.3
  缺血损伤％   31.2   7.2   32.4   30.6   25.7   12.1
  死亡
  VP046   总损伤面积   11.8   30.1   19.9   22.7   84.6   21.1   7.6
  总面积   66.7   66.4   66.3   66.7   266.1   66.5   0.2
  缺血损伤％   17.7   45.3   30.1   34.0   31.8   13.8
  死亡
  VP047   总损伤面积   27.5   23.5   20.9   19.9   91.8   23.0   3.4
  总面积   67.7   63.7   64.0   65.4   260.7   65.2   1.8
  缺血损伤％   40.6   37.0   32.6   30.5   35.2   4.0
  VP060   总损伤   12.4   14.8   6.6   14.6   18.7   67.1   13.4   4.4
  面积
  总面积   72.1   78.5   69.8   73.5   76.8   370.6   74.1   3.5
  缺血损伤％   17.2   18.9   9.4   19.8   24.3   18.1   4.8
  VP064   总损伤面积   11.7   34.6   14.6   32.9   93.8   23.4   12.0
  1   总面积   64.9   72.8   62.7   74.1   274.6   68.6   5.7
  缺血损伤％   18.0   47.5   23.2   44.4   34.2   14.8
  死亡   死亡   死亡
4.实施例4：D2成分的时间历程
实验检验了冬眠旱獭D2成分对于小鼠中脑动脉梗塞(MCAO)模型的作用。在MCAO结束之前2小时开始静脉注射(I.V.)D2，也可以在MCAO结束后达8小时内的不同时间点注射。取出脑组织，用氯化三苯基四唑(TTC)染色，并通过成像分析系统检查梗塞体积。在脑缺血和再灌注损伤之前注射D2，表现出显著的保护脑的作用。此外，在缺血损伤后达6小时内注射D2，也显示出对缺血和再灌注损伤有显著的保护作用。D2的单次静脉注射剂量为5mg/kg。总之，在小鼠出现缺血/再灌注损伤后达6小时内注射D2进行治疗，发现D2可以有效地控制脑中MCAO的范围。
a)方法和材料
(1)研究项目设计
小鼠中风模型，中脑动脉梗塞(MCAO)模型。将小鼠进行1小时MCAO后，进行24小时再灌注。缺血损伤前2小时，以及之后各时间点(再灌注开始后0.5、1、2、4、6、8小时)注射D2，第二天处死动物，用TTC进行染色以检查梗塞体积。单次静脉内推注小鼠，最终剂量为5mg/kg。
(2)体内方法
体重在25克左右的雄性C57BL/6(Jackson实验室)小鼠，实验前以及过程中可自由饮食、饮水。实验前，动物适应环境1周。按照5mg/kg剂量给动物注射VTI成分(D2)，200μl/小鼠。小鼠在缺血结束前或之后预定的时间接受静脉注射。
(3)诱发缺血
每只小鼠都是在1小时脑缺血后进行24小时再灌注。在缺血结束前或之后预定的时间点，给动物注射5mg/kg剂量的D2，24小时后，检查梗塞体积。在颈部沿中线切开小口，暴露出左侧颈总动脉(CCA)。将甲状腺上动脉和枕动脉电凝固并分开。将显微外科夹夹在颈内动脉(ICA)起始部附近。颈外动脉(ECA)远端用6-0线结扎后切断。6-0线松散地缠绕在ECA残端上。移去显微外科夹，将5-0尼龙缝合线(多聚左旋赖氨酸包被的)的火抛光线头轻轻插入ECA残端。将缠绕在ECA残端的6-0丝线环扎紧，在移除动脉瘤夹后将尼龙缝合线向前推进大约11mm(根据体重调整)，使之进入并通过颈内动脉(ICA)，直至到达脑前动脉(ACA)，由此阻塞了脑前部的血液交通和中脑动脉。在受试动物从麻醉中醒来后，将其放回笼中。使尼龙线维持在原位置1小时，将动物再次麻醉，拆除手术线，缝合伤口。
(4)梗塞体积的确定
为了确定梗塞体积，通过腹腔内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)将动物麻醉。再灌注后24小时，取出其脑组织，将梗塞区域切成厚4-2mm的切片，并在2％氯化三苯基四唑(TTC)中浸泡所述切片30分钟。然后，将所述切片在4％多聚甲醛中浸泡过夜。采用计算机辅助图象分析系统确定每张切片中的梗塞范围，所述图象分析系统包括装有Quick Capture帧捕获卡的Power Macintosh计算机，还包括装在照相机架上的Hitachi(日立公司)CCD(电荷耦合装置)照相机。使用1.55版本的NIH ImageAnalysis Software(美国国立卫生研究院图象分析软件)。采集图象，并确定全部切片的梗塞总范围。对治疗状态一无所知的一个操作人员完成了所有检测。由全部切片梗塞体积的总和计算出总梗塞体积。
(5)统计分析
实验结果表示为平均数±标准偏差(SEM)的形式。使用t检验来分析梗塞体积数据差异的显著性。在该项研究中包括了全部受试动物。
(6)治疗分组
所有组的动物均施行MCAO。27只动物在MCAO后注射FPA。分组如下：组1，无缺血/再灌注损伤的对照小鼠；组2亦为对照小鼠，对其实施1小时的缺血和24小时的再灌注，并在缺血后1小时注射载体载体；组3，对其实施1小时的缺血和24小时的再灌注，并在缺血损伤前2小时注射D2；组4，对其实施1小时的缺血和24小时的再灌注，并在缺血损伤后0.5小时注射D2；组5，对其实施1小时的缺血和24小时的再灌注，并在缺血损伤后1小时注射D2；组6，对其实施1小时的缺血和24小时的再灌注，并在缺血损伤后2小时注射D2；组7，对其实施1小时的缺血和24小时的再灌注，并在缺血损伤后4小时注射D2；组8，对其实施1小时的缺血和24小时的再灌注，并在缺血损伤后6小时注射D2；和组9，对其实施1小时的缺血和24小时的再灌注，并在缺血损伤后8小时注射D2。
b)结果
(1)小鼠的缺血程度
估计了所述研究中缺血的相对严重程度。采集了缺血损伤小鼠的数据，在所述小鼠腹腔内注射了剂量为5mg/kg的D2成分。在本研究中无小鼠死亡。
(a)梗塞范围
与注射载体的组相比，注射D2的动物脑梗塞范围显著缩小。与其他组相比，D2(缺血前2小时注射)显示出最强的缩小梗塞体积作用。再灌注后0.5小时和1小时注射D2显示出相似的缩小梗塞体积作用，然而不如在缺血前2小时注射D2明显(表24)。梗塞体积显示于附图17中。脑梗塞体积缩小的百分比见表24。如表24所显示，与注射载体相比，缺血前2小时注射D2显示出缩小梗塞体积88％的作用。
表24.脑梗塞体积缩小程度的百分比
  化合物   脑梗塞体积缩小程度的百分比
  对照   -
  对照，缺血   0％
  缺血前2小时注射D2   88％
  缺血后0.5小时注射D2   80％
  缺血后1小时注射D2   75％
  缺血后2小时注射D2   65％
  缺血后4小时注射D2   34％
  缺血后6小时注射D2   20％
  缺血后8小时注射D2   0％
缩小程度的百分比是与注射载体的对照动物比较而得出的。
此外，在更早的时间点注射D2可以对缺血和再灌注损伤的有害作用产生显著的保护作用。
(b)受试动物数据
表25
  动物编号   1   2   3   平均数   标准偏差
  Con(对照动物)   0.0   0.0   0.0   0.000   0.000
  No(未注射D2的动物)   87.960   79.550   109.780   92.430   9.008308
  缺血前2小时注射D2的动物   0.000   8.360   26.780   11.71333   7.910452
  缺血后0.5小时注射D2的动物   12.4300   5.9200   36.5100   18.28667   9.303447
  缺血后1小时注射D2的动物   23.860   4.900   41.690   23.48333   10.62203
  缺血后2小时注射D2的动物   35.780   12.940   48.560   32.42667   10.41841
  缺血后4小时注射D2的动物   58.4300   42.7900   81.2600   60.82667   11.1698
  缺血后6小时注射D2的动物   74.900   55.870   91.220   73.99667   10.21466
  缺血后8小时注射D2的动物   90.42   113.860   76.950   93.74332   10.78379
实施例5：FPA变异体
在小鼠中脑动脉梗塞(MCAO)模型中检测一系列FPA变异体的效用。所述变异体包括C末端和N末端的缺失突变体，也包括用丙氨酸每次取代一个氨基酸的突变体，所述取代从肽链的N端开始，每次取代一个氨基酸直至C端的整个序列中。在MCAO1小时后开始静脉注射FPA变异体。脑组织被切除并在氯化三苯基四唑(TTC)中染色，而后用图象分析方法检测梗塞体积。在脑缺血再灌注损伤之前注射FPA显示出显著的脑保护作用。FPA变异体以单次静脉内推注的方式施用。
a)材料和方法
(1)研究设计
本实施例中采用小鼠中风模型和小鼠中脑动脉梗塞(MCAO)模型。小鼠一次经历1小时的MCAO和24小时的再灌注。再灌注开始后1小时注射FPA变异体，第二天处死小鼠并通过TTC染色检测梗塞体积。FPA变异体以单次静脉内推注的方式施用于小鼠，所述FPA变异体的最终剂量相当于10mg/kg的母肽(美洲旱獭的C末端FPA)。
(2)体内方法
采用体重大约为25克的雄性C57BL/6(Jackson实验室)小鼠，在实验前和实验过程每只小鼠均自由进食和饮水。实验前受试动物有1周的适应期。以每只动物200μl的剂量给受试动物注射FPA变异体，该剂量相当于10mg/kg的母肽。在缺血结束前或缺血结束后的指定时间，对小鼠进行静脉注射。
(3)诱发缺血
每只小鼠依次经历了1小时的脑缺血和24小时的再灌注。在缺血期之前或缺血期结束时(指定时间)，给受试动物注射了相当于10mg/kg母肽的FPA变异体，之后24小时检测梗塞体积。通过颈正中切口暴露左侧颈总动脉(CCA)。将甲状腺上动脉和枕动脉电凝固并分开。将显微外科夹夹在颈内动脉(ICA)起始部附近。颈外动脉(ECA)远端用6-0线结扎后切断。6-0线松散地缠绕在ECA残端上。移去显微外科夹，将5-0尼龙缝合线(多聚左旋赖氨酸包被的)的火抛光线头轻轻插入ECA残端。将缠绕在ECA残端的6-0丝线环扎紧，在移除动脉瘤夹后将尼龙缝合线向前推进大约11mm(根据体重调整)，使之进入并通过颈内动脉(ICA)，直至到达脑前动脉(ACA)，由此阻塞了脑前部的血液交通和中脑动脉。在受试动物从麻醉中醒来后，将其放回笼中。使尼龙线维持在原位置1小时，将动物再次麻醉，拆除手术线，缝合伤口。
(4)梗塞体积的确定
为了确定梗塞体积，通过腹腔内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)将受试动物麻醉。再灌注后24小时，取出其脑组织，将梗塞区域切成厚4-2mm的切片，并在2％氯化三苯基四唑(TTC)中浸泡所述切片30分钟。然后，将所述切片在4％多聚甲醛中浸泡过夜。采用计算机辅助图象分析系统确定每张切片中的梗塞范围，所述图象分析系统包括装有Quick Capture帧捕获卡的Power Macintosh计算机，还包括装在照相机架上的Hitachi(日立公司)CCD(电荷耦合装置)照相机。使用1.55版本的NIH ImageAnalysis Software(美国国立卫生研究院图象分析软件)。采集图象，并确定全部切片的梗塞总范围。由一个对治疗状态一无所知的操作人员完成了所有检测。由全部切片梗塞体积的总和计算出总梗塞体积。
(5)统计分析
实验结果表示为平均数±标准偏差(SEM)的形式。使用t检验来分析梗塞体积数据差异的显著性。在该项研究中包括了全部受试动物。
b)结果
(1)小鼠的缺血程度
评估了所述研究中缺血的相对严重程度。采集了缺血损伤小鼠的数据，在所述小鼠腹腔内注射了剂量相当于10mg/kg美洲旱獭FPA全长C末端的FPA变异体。本研究中有30例死亡。表29中显示了所用的剂量。表30显示的是人和美洲旱獭FPA序列的比较结果。
表29
  分子   分子量   因子   mg/kg(毫克每千克)
  VP012   935   1.64   16.4
  VP013   835.9   1.84   18.4
  VP014   778.8   1.97   19.7
  VP015   721.8   2.13   21.3
  VP016   664.7   2.31   23.1
  VP017   535.6   2.87   28.7
  VP018   1034.1   1.49   14.9
  VP019   905   1.70   17.0
  VP020   757.8   2.03   20.3
  VP021   644.7   2.38   23.8
  VP022   573.6   2.68   26.8
  VP023   607.7   2.53   25.3
  VP024   535.6   2.87   28.7
  VP025   445.5   3.45   34.5
  VP026   389.4   3.95   39.5
  VP027   417.4   3.68   36.8
  VP028   444.5   3.46   34.6
  VP029   1105.2   1.39   13.9
  VP030   1033.2   1.49   14.9
  VP031   1015.1   1.51   15.1
  VP032   1049.1   1.46   14.6
  VP033   1077.2   1.43   14.3
  VP034   1033   1.49   14.9
  VP035   1105.2   1.39   13.9
  VP036   1105.2   1.39   13.9
  VP037   1105.2   1.39   13.9
  VP038   1063.1   1.45   14.5
  VP039   1006.1   1.53   15.3
母体化合物是VP-001，其分子量＝1536.8。在10mg/kg的剂量下检测所述化合物。
根据分子量，受试化合物VP012至VP039使用相等的剂量。
  肽  N末端片段  C末端片段
  人FPA
  位置   1   2   3   4   5   6  7  8   9   10   11   12   13   14   15   16
  SEQIDNO：2   Ala   Asp   Ser   Gly   Glu   Gly  Asp  Phe   Leu   Ala   Glu   Gly   Gly   Gly   Val   Arg
  美洲旱獭FPA
  SEQIDNO：1   Ala   Asp   Thr   Asp   Lys   Gly  Glu  Phe   Leu   Ala   Glu   Gly   Gly   Gly   Val   Arg
(a)梗塞范围
与注射载体的组相比，表26中显示了施用FPA变异体后的脑梗塞范围。表26中的FPA变异体以其活性顺序排列。SEQ ID NO：46、45、50、38、40、54、32、47和48具有显著的小于0.05的p值。通过将表28中的全部盐水处理的动物分组并用单尾t检验的方法与表27中的实验动物进行比较，得出所述p值。任何小于0.05的p值均认为具有统计学显著性。
表26
  氨基酸序列   突变或缺失   缺血损伤的百分比(％)   P值   化合物编号  SEQIDNO  评述
  Ala-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   扫描位点(scanposition)6的Ala   5.6   ＜0.0001   VP029  46  在C末端，Ala具有比Gly更强的疏水性。
  Gly-Gly-Gly-Val-Arg   C末端5个氨基酸组成(12-16)   13.9   0.0083   VP028   45   由5个氨基酸组成的活性肽。
  Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   C末端缺失Gly和Glu(8-16)   14.1   0.0048   VP019   36   去除了C末端的负电荷。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   扫描位点10的Gly   15.4   0.0101   VP033   50   与其母肽非常相似。
  Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   C末端缺失Gly、Glu、Phe和Leu(10-16)   15.6   0.0044   VP021   38   与VP028类似，含有5个氨基酸(5mer)组成的活性肽。
  Glu-Phe-Leu-Ala-Glu   C末端5个氨基酸组成(7-11)   16.4   0.0147   VP023   40
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Ala-Val-Arg   扫描位点14的Ala   16.9   0.0101   VP037   54   在这个位点上，Ala比Gly疏水性更强、体积更大。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly   N末端缺失Gly、Gly、Val和Arg(6-12)   17.5   0.0233   VP015   32
  Gly-Ala-Phe-Leu-Ala-   扫描位点   18.3   0.0154   VP030   47   失去N末端
  Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   7的Ala   近端酸性电荷。
  Gly-Glu-Ala-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   扫描位点8的Ala   18.7   0.0485   VP031   48   在这个位点上，Ala比Phe疏水性更弱、体积更小。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Ala-Gly-Gly-Val-Arg   扫描位点12的Ala   19.0   0.0732   VP035   52   在这个位点上，Ala比Gly疏水性更强、体积更大。
  Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   C末端缺失Gly、Glu、Phe、Leu和Ala(11-16)   19.9   0.0667   VP022   39   与VP028类似，含有由5个氨基酸组成的活性肽。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Ala-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   扫描位点11的Ala   21.8   0.1482   VP034   51   如果内部酸性改变，则失去活性(Lossif internalacidicchange)。
  Phe-Leu-Ala-Glu-Gly   C末端5个氨基酸组成   22.2   0.2183   VP024   4l   不含有最小活性肽。
  Gly-Glu-Phe-Ala-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-   扫描位点9的Ala   22.4   0.1002   VP032   49   在这个位点上，Ala比
  Arg   Leu疏水性更弱。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly   N末端缺失Gly、Val和Arg(6-13)   22.9   0.1098   VP014   3l   缺失了C末端的疏水性必需元件
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   扫描位点16的Ala   24.8   0.1707   VP039   56   失去了N末端碱性氨基酸的电荷。
  Leu-Ala-Glu-Gly-Gly   C末端5个氨基酸组成   25.8   0.4764   VP025   42   不含有最小活性肽。
  Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   C末端缺失Gly(7-16)   26.2   0.5248   VP018   35   缺失了C末端的疏水性残基。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly   N末端缺失Val和Arg(6-14)   27.2   0.6441   VP013   30   失去了N末端碱性氨基酸的电荷。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala   N末端缺失Glu、Gly、Gly、Gly、Val和Arg(6-10)   27.3   0.6395   VP017   34   失去了N末端碱性氨基酸的电荷。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val   N末端缺失Arg(6-15)   27.8   0.5080   VP012   29   失去了N末端碱性氨基酸的电荷。
  Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-   C末端缺   28.4   0.7229   VP020   37   缺失C末端
  Gly-Val-Arg   失Gly、Glu和Phe(9-16)   的疏水性残基。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu   N末端缺失Gly、Gly、Gly、Val和Arg(6-11)   28.7   0.8376   VP016   33   失去了N末端碱性氨基酸的电荷。
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Ala-Gly-Val-Arg   扫描位点13的Ala   28.9   0.8329   VP036   53   在这个位点上，Ala比Gly疏水性更强、体积更大。
  Glu-Gly-Gly-Gly-Val   C末端5个氨基酸组成的   31.1   0.8641   VP027   44
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Ala-Arg   扫描位点15的Ala   32.3   0.700   VP038   55   结构改变
  Ala-Glu-Gly-Gly-Gly   C末端5个氨基酸组成   36.8   0.1948   VP026   43
  ＜0.0001
  Gly-Glu-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg   母肽   13.4   VP007   89
  盐水对照   未处理   30.5
用以生成表26数据列在表27中。表中指定列数指的是在检测指定的衍生物的特定实验中使用的动物数。例如，在某项实验中，有9只平行动物进行栓塞手术，之后注射FPA衍生物。采用计算机辅助图象分析系统确定每张切片中的梗塞范围，所述图象分析系统包括装有QuickCapture帧捕获卡的Power Macintosh计算机，还包括装在照相机架上的Hitachi(日立公司)CCD(电荷耦合装置)照相机。使用1.55版本的NIHImage Analysis Software(美国国立卫生研究院图象分析软件)。采集图象，并确定全部切片的梗塞总范围。对治疗状态一无所知的一个操作人员完成了所有检测。由全部切片梗塞体积的总和计算出总梗塞体积。结果以均值±标准偏差(SD)形式表示。
表27
  动物编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 总计   平均数   标准偏差
VP001   总损伤范围 1.5 26.9 16.7 26.5 12.6 24.8 2.8 3.3 4.5 119.5 13.3 10.8
  总范围 67.2 67.5 69.2 71.0 65.6 68.1 67.6 68.8 72.0 616.8 68.5 2.0
  缺血损伤百分比(％) 2.3 39.9 24.1 37.3 19.2 36.4 4.1 4.8 6.2 19.4 15.7
  VP001   总损   23.4   20.6   5.2   11.3   7.3   12.1   8.2   7.1   95.4   11.9   6.7
  伤范围
  总范围 73.0 71.9 69.4 65.7 68.4 66.8 69.3 73.5 557.9 69.7 3.2
  缺血损伤百分比(％) 32.1 28.6 7.5 17.2 10.7 18.2 11.9 9.7 17.1 11.2
VP007   总损伤范围 0.0 0.0 15.8 14.4 2.6 0.0 28.0 12.1 72.9 9.1 10.2
  总范围 59.5 60.8 67.6 71.9 63.5 66.0 67.8 66.3 523.4 65.4 4.0
  缺血损伤百分比(％) 0.0 0.0 23.4 20.0 4.1 0.0 41.3 18.2 13.4 15.0
  死亡
VP007   总损伤范围 59.5 60.8 106.9 106.3 70.2 74.5 14.9 9.5
  总范围 119.0 121.6 197.9   198.3 137.8 335.6 67.1 1.3
  缺血   54.0   47.1   7.1   16.2   15.2   22.2   14.0
  损伤百分比(％)
VP007   总损伤范围 10.8 17.8 11.5 14.3 18.1 72.4 14.5 3.4
  总范围 63.7 63.4 62.3 67.5 62.3 319.2 63.8 2.2
  缺血损伤百分比(％) 16.9 28.0 18.4 21.2 29.0 22.7 5.5
VP007   总损伤范围 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 4.1 10.5 14.5 1.6 3.6
  总范围 71.5 70.7 70.8 71.2 69.1 69.0 68.1 70.3 68.5 629.3 69.9 1.2
  缺血损伤百分比(％) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 5.8 15.3 2.3 5.2
  VP012   总损   22.1   33.9   0.0   19.4   13.1   88.5   17.7   12.4
  伤范围
  总范围 67.0 79.2 71.5 64.2 80.2 362.0 72.4 7.1 9.8 362.0 72.4 7.1
  缺血损伤百分比(％) 33.0 42.8 0.0 30.2 16.3 24.5 16.6 68.0 24.5 16.6
  死亡
VP012   总损伤范围 15.0 22.4 22.1 59.4 19.8 4.2
  总范围 64.2 62.4 64.8 191.4 63.8 1.3
  缺血损伤百分比(％) 23.3 35.8 34.0 31.0 6.8
VP013   总损伤范围 27.0 6.8 16.9 24.6 75.3 18.8 9.1
  总范围 72.6 69.7 66.1 67.9 276.3 69.1 2.8
  缺血   37.2   9.8   25.5   36.1   27.2   12.7
  损伤百分比(％)
  死亡   死亡
VP014   总损伤范围 16.7 14.9 5.6 16.0 53.2 13.3 5.2
  总范围 68.8 66.3 63.0 67.3 265.3 66.3 2.4
  缺血损伤百分比(％) 24.2 22.4 8.9 23.8 20.0 7.3
VP014   总损伤范围 19.2 22.7 19.3 4.3 26.1 91.5 18.3 8.3
  总范围 69.2 75.8 67.2 71.9 69.6 353.7 70.7 3.3
  缺血损伤百分比(％) 27.7 29.9 28.7 5.9 37.5 25.9 11.8
VP015   总损伤范围 6.0 15.7 17.3 11.7 12.0 62.6 12.5 4.4
  总范围 72.9 73.2 69.3 70.2 71.0 356.6 71.3 1.7
  缺血损伤百分比(％) 8.2 21.4 24.9 16.7 16.8 17.6 7.2
VP016   总损伤范围 12.8 28.0 14.4 27.6 82.8 20.7 8.3
  总范围 73.2 73.2 75.0 69.1 290.5 72.6 2.5
  缺血损伤百分比(％) 17.4 38.3 19.2 40.0 28.7 12.1
  死亡   死亡   死亡
VP017   总损伤范围 32.5 18.7 11.7 15.3 78.2 19.5 9.1
  总范围 73.9 70.2 70.2 72.3 286.6 71.6 1.8
  缺血损伤百分比(％) 44.0 26.6 16.7 21.2 27.3 12.0
  死亡
VP018   总损伤范围 10.1 17.7 16.1 27.1 71.0 17.7 7.1
  总范围 58.7 67.8 67.7 72.1 266.3 66.6 5.6
  缺血损伤百分比(％) 17.1 26.2 23.8 37.6 26.2 8.5
  死亡   死亡
VP019   总损伤范围 12.4 4.9 11.8 12.2 5.2 46.3 9.3 3.9
  总范围 62.4 62.5 64.3 64.8 74.5 328.5 65.7 5.0
  缺血损伤百分比 19.8 7.8 18.3 18.8 6.9 14.1 5.6
  (％)
  死亡   死亡
VP020   总损伤范围 28.4 3.8 7.4 23.1 23.4 13.5 29.3 128.8 18.4 10.2
  总范围 65.8 64.0 63.7 61.6 63.7 63.5 70.3 452.7 64.7 2.8
  缺血损伤百分比(％) 43.1 5.9 11.5 37.4 36.7 21.2 41.7 28.4 15.2
  死亡   死亡   死亡
VP021   总损伤范围 13.0 8.3 8.4 17.0 6.8 13.7 67.1 11.2 4.0
  总范围 72.3 72.8 70.4 71.8 70.3 72.4 430.1 71.7 1.1
  缺血损伤百分比(％) 17.9 11.4 11.9 23.7 9.6 18.9 15.6 5.5
  死亡
  VP022   总损   12.4   5.5   15.6   12.2   26.7   72.4   14.5   7.8
  伤范围
  总范围 68.4 74.1 75.5 71.0 74.5 363.5 72.7 2.9
  缺血损伤百分比(％) 18.2 7.4 20.6 17.2 35.8 19.9 5.8
  死亡
VP023   总损伤范围 0.0 8.2 13.0 7.0 32.6 60.8 12.2 12.3
  总范围 73.8 69.6 75.5 70.8 81.9 371.5 74.3 4.9
  缺血损伤百分比(％) 0.0 11.8 17.2 9.9 39.8 16.4 7.2
  死亡
VP024   总损伤范围 6.2 29.8 19.9 6.9 62.8 15.7 11.3
  总范围 68.7 71.2 70.6 70.2 280.7 70.2 1.1
  缺血损伤百分比(％) 9.0 41.9 28.2 9.8 22.2 15.8
  死亡   死亡
VP025   总损伤范围 8.6 20.6 18.8 24.6 72.5 18.1 6.8
  总范围 68.8 71.6 69.5 71.0 280.9 70.2 1.3
  缺血损伤百分比(％) 12.5 28.7 27.0 34.6 25.8 9.4
VP026   总损伤范围 25.4 21.7 17.4 27.5 26.0 118.0 23.6 4.1
  总范围 62.7 65.2 64.3 61.1 67.2 320.5 64.1 2.4
  缺血损伤百分比(％) 40.5 33.3 27.0 45.1 38.7 36.8 7.9
  死亡
VP027   总损伤范围 19.2 11.4 31.3 24.9 16.4 103.3 20.7 7.7
  总范围 65.9 65.0 68.4 68.7 63.9 331.9 66.4 2.1
  缺血损伤百分比(％) 29.2 17.6 45.7 36.6 25.7 31.1 11.9
  死亡   死亡   死亡
VP028   总损伤范围 1.7 12.2 9.5 14.3 37.7 9.4 5.5
  总范围 63.9 69.2 67.5 70.7 271.3 67.8 2.9
  缺血损伤百分比(％) 2.7 17.6 14.1 20.2 13.9 7.8
VP029   总损伤范围 3.2 6.1 5.5 1.7 1.4 18.0 3.6 2.2
  总范围 66.1 67.7 64.7 60.6 60.1 319.1 63.8 3.4
  缺血损伤百分比(％) 4.9 9.1 8.6 2.8 2.3 5.6 3.0
VP030   总损伤范围 2.3 13.7 3.2 .9.0 13.5 24.7 7.0 83.3 11.9 8.3
  总范围 61.1 67.4 61.3 66.8 65.8 65.8 66.0 454.2 64.9 2.6
  缺血损伤百分比(％) 3.7 20.3 5.2 28.4 20.5 37.5 10.6 18.3 12.0
VP031   总损伤范围 13.2 17.2 3.3 27.1 5.6 66.3 13.3 9.6
  总范围 71.3 71.9 72.0 70.2 68.2 353.5 70.7 1.6
  缺血损伤百分比 18.5 23.9 4.5 38.6 8.2 18.7 13.5
  (％)
  死亡
VP032   总损伤范围 5.6 14.0 18.9 6.8 45.3 11.3 6.3
  总范围 63.3 67.6      67.6 60.5 259.0 64.8 3.5
  缺血损伤百分比(％) 8.8 20.8 28.0 11.2 17.5 8.8
VP032   总损伤范围 28.1 14.0 2.5 31.4 76.0 19.0 13.4
  总范围 70.2 69.2 66.3 70.3 276.0 69.0 1.9
  缺血损伤百分比(％) 40.0 20.3 3.7 44.7 27.2 18.9
VP033   总损伤范围 2.5 17.8 2.0 20.9 7.1 50.3 10.1 8.8
  总范围 65.4 67.8 64.9 67.5 60.1 325.6 65.1 3.1
  缺血损伤百分比(％) 3.9 26.2 3.0 31.0 11.8 15.4 14.7
VP034   总损伤范围 29.5 16.6 14.3 2.8 15.1 78.1 15.6 9.5
  总范围 72.8 69.7 69.0 75.2 73.2 359.9 72.0 2.6
  缺血损伤百分比(％) 40.5 23.8 20.7 3.7 20.6 21.8 13.1
  死亡
VP035   总损伤范围 19.2 14.5 2.0 13.2 48.9 12.2 7.3
  总范围 66.7 63.0 65.5 62.9 258.1 64.5 1.9
  缺血损伤百分 28.8 23.0 3.0 21.0 19.0 11.1
  比(％)
VP036   总损伤范围 20.8 15.5 16.8 12.5 27.0 92.5 18.5 5.6
  总范围 63.6 59.8 67.1 64.5 65.3 320.3 64.1 2.7
  缺血损伤百分比(％) 32.7 25.8 25.0 19.4 41.3 28.9 5.4
  死亡   死亡
VP037   总损伤范围 6.0 6.7 21.1 16.5 14.3 3.9 68.4 11.4 6.9
  总范围 63.1 67.9 68.7 70.0 69.1 65.2 404.1 67.4 2.7
  缺血损伤百分比(％) 9.5 9.8 30.7 23.6 20.6 6.0 16.9 10.5
VP038   总损伤范 32.1 29.5 21.3 11.7 94.6 23.7 9.2
  围
  总范阻 76.5 73.4 71.6 67.7 289.2 72.3 3.7
  缺血损伤百分比(％) 41.9 40.2 29.8 17.3 32.3 11.4
  死亡   死亡
VP039   总损伤范围 10.8 17.8 11.5 14.3 18.1 72.4 14.5 3.4
  总范围 63.7 63.4 62.3 67.5 62.3 319.2 63.8 2.2
  缺血损伤百分比(％) 16.9 28.0 18.4 21.2 29.0 22.7 4.9
VP039   总损伤范围 20.6 18.3 17.8 20.2 76.9 19.2 1.4
  总范围 75.4 70.8 68.6 72.1 286.9 71.7 2.8
  缺血损伤 27.3 25.9 25.9 28.1 26.8 1.1
  百分比(％)
表28：盐水处理的对照动物。对照组中使用42只动物。对照组持续一定时间后结束，所述时间相应于实验组的实验时间。全部盐水处理组的平均缺血损伤为30.5％，标准偏差为3.27。表22和表26中的p值由盐水处理组得出。
  动物编号   1   2   3   4   5   6   7   总计   平均数   标准偏差   变异系数
  总损伤范围   4.27   18.66   20.30   32.36   75.59   18.90   11.51   60.89
  总范围   60.73   66.32   67.19   69.73   263.97   65.99   3.79   5.75
  缺血损伤百分比(％)   7.03   28.14   30.21   46.41   28.64   16.16   56.43
  总损伤范围   13.72   20.11   29.90   63.73   21.24   8.15   38.36
  总范围   69.38   63.53   65.45   198.36   66.12   2.98   4.51
  缺血损伤百分比(％)   19.78   31.65   45.68   32.13   12.97   40.37
  总损伤范围   15.51   20.43   31.30   29.30   0.00   96.54   24.14   7.44   30.83
  总范围   70.38   66.39   70.15   66.39   68.50   273.31   68.33   2.24   3.28
  缺血损伤百分比(％)   22.04   30.77   44.62   44.13   0.00   35.32   10.97   31.07
  总损伤范围   6.31   24.09   27.49   30.65   24.44   112.98   22.60   9.48   41.97
  总范围   60.24   70.36   67.33   69.67   65.64   333.24   66.65   4.05   6.07
  缺血损伤百分比(％)   10.47   34.24   40.83   43.99   37.23   33.90   15.16   44.72
  总损伤范围   7.29   22.28   21.31   18.77   18.18   10.99   29.37   128.19   18.31   7.33   40.02
  总范围   57.30   63.10   61.66   66.36   67.65   67.82   69.02   452.91   64.70   4.21   6.51
  缺血损伤百分比(％)   12.72   35.31   34.56   28.29   26.87   16.20   42.55   28.30   10.48   37.03
  总损伤范围   7.29   22.28   21.31   18.77   18.18   87.83   17.57   5.99   34.12
  总范围   57.30   63.10   61.66   66.36   67.65   316.07   63.21   4.09   6.47
  缺血损伤百分比(％)   12.72   35.31   34.56   28.29   26.87   27.79   10.48   37.72
  总损伤范围   1.42   18.51   31.80   15.05   20.78   87.56   17.51   10.96   62.61
  总范围   67.80   69.25   71.23   67.19   69.73   345.20   69.04   1.60   2.32
  缺血损伤百分比(％)   2.09   26.73   44.64   22.40   29.80   25.13   15.36   61.10
  总损伤范围   13.72   20.11   29.90   63.73   21.24   8.15   38.36
  总范围   69.38   63.53   65.45   198.36   66.12   2.98   4.51
  缺血损伤百分比(％)   19.78   31.65   45.68   32.37   12.97   40.06
  总损伤范围   17.61   15.23   24.40   15.11   31.12   103.47   20.69   6.95   33.56
  总范围   65.48   66.91   66.73   65.94   68.56   333.62   66.72   1.18   1.77
  缺血损伤百分比(％)   26.89   22.76   36.57   22.91   45.39   30.91   9.85   31.87
  30.50   3.27   10.73
          序列表
<110>维克技术有限公司
<120>抗梗塞分子
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     合成构建体
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Arg
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     合成构建体
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Ala Thr G1y Thr Thr Ser Glu Phe Ile Glu Ala Gly Gly Asp Ile Arg
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     合成构建体
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 1               5                  10                  15
Val Arg
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     合成构建体
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Thr Asp Pro Asp Ala Asp Lys Gly Glu Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly
 1               5                  10                  15
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  1              5                  10                  15
Arg
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     合成构建体
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 1               5                  10                  15
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     合成构建体
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<400>47
Gly Ala Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg
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     合成构建体
<400>48
Gly Glu Ala Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg
1                5                  10
<210>49
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>49
Gly Glu Phe Ala Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg
1                5                  10
<210>50
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>50
Gly Glu Phe Leu Gly Glu Gly Gly Gly Val Arg
1                5                  10
<210>51
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>51
Gly Glu Phe Leu Ala Ala Gly Gly Gly Val Arg
1                5                  10
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>52
Gly Glu Phe Leu Ala Glu Ala Gly Gly Val Arg
1                5                  10
<210>53
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>53
Gly Glu Phe Leu Ala Glu Gly Ala Gly Val Arg
1               5                   10
<210>54
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>54
Gly Glu Phe Leu Ala Glu Gly Gly Ala Val Arg
1                5                  10
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>55
Gly Glu Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Ala Arg
1                5                  10
<210>56
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>56
Ala Asp Thr Asp Lys Gly Glu Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg
1                5                  10                  15
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>57
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>58
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu
 1               5
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝精氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>4
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>6
<223>Xaa＝β[2-噻吩基]丙氨酸
<221>变体
<222>8
<223>Xaa＝四氢异喹啉3’羧酸
<221>变体
<222>9
<223>Xaa＝八氢吲哚2’羧酸
<400>59
Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg
1               5                   10
<210>60
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>7
<223>Xaa＝苯丙氨酸的D型异构体
<400>60
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Xaa Phe Arg
 1               5
<210>61
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>61
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe
1                5
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝β-[2-噻吩基]丙氨酸
<221>变体
<222>7
<223>Xaa＝苯丙氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>8
<223>Xaa＝β-[2-噻吩基]丙氨酸
<400>62
Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg
1                5
<210>63
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝N-乙酰金刚烷
<221>变体
<222>2
<223>Xaa＝精氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>7
<223>Xaa＝β-[噻吩基]丙氨酸
<221>变体
<222>9
<223>Xaa＝苯丙氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>10
<223>Xaa＝β-[2-噻吩基]丙氨酸
<400>63
Xaa Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg
1                5                  10
<210>64
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝N-乙酰金刚烷
<221>变体
<222>2
<223>Xaa＝精氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>7
<223>Xaa＝四氢异喹啉3’羧酸
<221>变体
<222>9
<223>Xaa＝苯丙氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>10
<223>Xaa＝四氢异喹啉3’羧酸
<400>64
Xaa Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg
1                5                  10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>65
Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5                  10
<210>66
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>66
Met Lys Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5                  10
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>67
Lys Arg Pro Ala Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5                  10
<210>68
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>68
Tyr Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5                  10
<210>69
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>69
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Tyr Arg
1                5
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>70
Arg Pro Pro Gly Tyr Ser Pro Phe Arg
 1                5
<210>71
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>71
Ile Ser Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5                  10
<210>72
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>72
Lys Arg Pro His Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5                  10
<210>73
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝对氯苯丙氨酸
<221>变体
<222>8
<223>Xaa＝对氯苯丙氨酸
<400>73
Arg Pro Pro Gly Xaa Ser Pro Xaa Arg
1                5
<210>74
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>74
Arg Pro Pro
1
<210>75
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>75
Arg Pro Pro Gly Phe
1                 5
<210>76
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>76
Arg Pro Pro Gly Phe Ser
1                5
<210>77
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>77
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro
1                5
<210>78
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>78
Pro Pro Gly Phe Ser Pro
1                5
<210>79
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>79
Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
 1                5
<210>80
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝精氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>4
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>6
<223>Xaa＝四氢异喹啉3’羧酸
<221>变体
<222>8
<223>Xaa＝a氨基-2-茚满乙酸的D型异构体
<221>变体
<222>9
<223>Xaa＝八氢吲哚2’羧酸
<400>80
Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg
 1               5                  10
<210>81
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝精氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>4
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>6
<223>Xaa＝a氨基-2-茚满乙酸
<221>变体
<222>8
<223>Xaa＝α氨基-2-茚满乙酸的D型异构体
<221>变体
<222>9
<223>Xaa＝八氢吲哚2’羧酸
<400>81
Xaa Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg
1                5                  10
<210>82
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>82
Ile Ser Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5                  10
<210>83
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>83
Lys Arg Pro Pro Gly Trp Ser Pro Leu Arg
1                5                  10
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>84
Arg Pro Pro Gly Phe Thr Pro Phe Arg
1                5
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>85
Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Phe Arg
1                5
<210>86
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>86
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu
1                5                  10
<210>87
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>87
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe
1                 5
<210>88
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>88
Arg Val Tyr Ile His Pro Phe
1               5
<210>89
<211>360
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>89
Gly Asn Ser Thr Leu Ala Thr Thr Ser Lys Asn Ile Thr Ser Gly Leu
 1               5                  10                  15
His Phe Gly Leu Val ASn Ile Ser Gly Asn Asn Glu Ser Thr Leu Asn
            20                  25                  30
Cys Ser Gln Lys Pro Ser Asp Lys His Leu Asp Ala Ile Pro Ile Leu
         35                  40                 45
Tyr Tyr Ile Ile Phe Val Ile Gly Phe Leu Asn Ile Val Val Val Thr
    50                  55                  60
Leu Phe Cys Cys Gln Lys Gly Pro Lys Lys Val Ser Ser Ile Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Phe Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Leu Leu Ala Thr Leu Pro Leu
                85                  90                  95
Trp Ala Thr Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Asp Trp Leu Phe Gly Pro Val
            100                 105                 110
Met Cys Lys Val Phe Gly Ser Phe Leu Thr Leu Asn Met Phe Ala Ser
        115                 120                 125
Ile Phe Phe Ile Thr Cys Met Ser Val Asp Arg Tyr Gln Ser Val Ile
    130                 135                 140
Tyr Pro Phe Leu Ser Gln Arg Arg Asn Pro Trp Gln Ala Ser Tyr Ile
145                 150                 155                 160
Val Pro Leu Val Trp Cys Met Ala Cys Leu Ser Ser Leu Pro Thr Phe
                165                 170                 175
Tyr Phe Arg Asp Val Arg Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Val Asn Ala Cys
            180                 185                 190
Ile Met Ala Phe Pro Pro Glu Lys Tyr Ala Gln Trp Ser Ala Gly Ile
        195                 200                 205
Ala Leu Met Lys Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ile Pro Leu Ile Phe Ile
    210                 215                 220
Ala Thr Cys Tyr Phe Gly Ile Arg Lys His Leu Leu Lys Thr Asn Ser
225                 230                 235                 240
Tyr Gly Lys Asn Arg Ile Thr Arg Asp Gln Val Leu Lys Met Ala Ala
                245                 250                 255
Ala Val Val Leu Ala Phe Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe His Val Leu
            260                 265                 270
Thr Phe Leu Asp Ala Leu Ala Trp Met Gly Val Ile Asn Ser Cys Glu
        275                 280                 285
Val Ile Ala Val Ile Asp Leu Ala Leu Pro Phe Ala Ile Leu Leu Gly
    290                 295                 300
Phe Thr Asn Ser Cys Val Asn Pro Phe Leu Tyr Cys Phe Val Gly Asn
305                 310                 315                 320
Arg Phe Gln Gln Lys Leu Arg Ser Val Phe Arg Val Pro Ile Thr Trp
                325                 330                 335
Leu Gln Gly Lys Arg Glu Ser Met Ser Cys Arg Lys Ser Ser Ser Leu
            340                 345                 350
Arg Glu Met Glu Thr Phe Val Ser
        355                 360
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>3
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>5
<223>Xaa＝β-[2-噻吩基]丙氨酸
<221>变体
<222>8
<223>Xaa＝Tyr(Me)
<221>变体
<222>9
<223>Xaa＝ψ(CH2NH)-精氨酸
<400>90
Arg Pro Xaa Gly Xaa Ser Pro Xaa Xaa
1                5
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝7-甲氧基香豆素-4-乙酰基-精氨酸
<221>变体
<222>9
<223>Xaa＝2，4二硝基苯基赖氨酸
<400>91
Xaa Pro Pro Gly Phe Ser Ala Phe Xaa
1                5                9
<210>92
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝精氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>4
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>8
<223>Xaa＝苯丙氨酸的D型异构体
<400>92
Xaa Arg Pro Xaa Gly Phe Ser Xaa Leu Arg
 1              5                   10
<210>93
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝精氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>4
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>8
<223>Xaa＝苯丙氨酸的D型异构体
<400>93
Xaa Arg Pro Hyp Gly Phe Ser Xaa Phe Arg
1               5                   10
<210>94
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝精氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>4
<223>Xaa＝羟脯氨酸
<221>变体
<222>7
<223>Xaa＝β-[2-噻吩基]丙氨酸
<221>变体
<222>9
<223>Xaa＝苯丙氨酸的D型异构体
<221>变体
<222>10
<223>Xaa＝β-[2-噻吩基]丙氨酸
<400>94
Xaa Arg Pro Hyp Gly Xaa Ser Xaa Xaa Arg
1                5                  10
<210>95
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<221>变体
<222>1
<223>Xaa＝胰激肽H-赖氨酸
<400>95
Xaa Arg Pro Pro Gly Phe Ser Pro Leu
1                5
<210>96
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：/注释＝
     合成构建体
<400>96
Ala Glu Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Pro Arg
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1

Claims (122)

1、冬眠动物血浆的成分，其含有具有抗梗塞活性的分子，其中，所述成分由分离在冬眠开始后下列天数采集的动物血液得到：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天。
2、如权利要求1所述的成分，该成分由分离在冬眠开始后以下天数采集的动物血液得到：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。
3、如权利要求1所述的成分，该成分由分离在冬眠开始后14、15或16天采集的动物血液得到。
4、如权利要求1所述的成分，该成分由分离冬眠开始后15天采集的动物血液得到。
5、冬眠动物血浆的成分，其含有具有抗梗塞活性的分子，所述成分通过对从第一只动物中采集的血液进行分离而得到，所述第一只动物处于冬眠的早期；如果第二只动物处于冬眠中期，则所述成分不包含第二只动物的任何血液成分。
6、冬眠动物血浆的成分，其含有具有抗梗塞活性的分子，所述成分由分离末期唤醒前以下天数采集的动物血液得到：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天。
7、如权利要求6所述的成分，该成分由分离末期唤醒前以下天数的动物血液得到：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。
8、如权利要求6所述的成分，该成分由分离末期唤醒前14、15或16天采集的动物血液得到。
9、如权利要求6所述的成分，该成分由分离末期唤醒前15天采集的动物血液得到。
10、冬眠动物血浆的成分，其含有具有抗梗塞活性的分子，所述成分通过对从第一只动物采集的血液进行分离而得到，所述第一只动物处于冬眠晚期；如果第二只动物处于冬眠中期，则所述成分不包含第二只动物的任何血液成分。
11、如权利要求1所述的成分，其中，抗梗塞活性为抗脑梗塞活性。
12、如权利要求1所述的成分，其中，抗梗塞活性为抗心脏梗塞活性。
13、冬眠动物血浆的成分，其含有诱导尿素循环的分子，所述成分由分离在冬眠开始后以下天数采集的动物血液得到：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天。
14、如权利要求13所述的成分，该成分由分离在冬眠开始后以下天数采集的动物血液得到：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。
15、如权利要求13所述的成分，该成分由分离在冬眠开始后14、15或16天采集的动物血液得到。
16、如权利要求13所述的成分，该成分由分离在冬眠开始后15天采集的动物血液得到。
17、冬眠动物血浆的成分，其含有诱导尿素循环的分子，所述成分通过对第一只动物的血液进行分离而得到，所述第一只动物处于冬眠早期；如果第二只动物处于冬眠中期，则所述成分不包含第二只动物的任何血液成分。
18、冬眠动物血浆的成分，其含有诱导尿素循环的分子，所述成分由分离在末期唤醒前以下天数采集的动物血液得到：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天。
19、如权利要求18所述的成分，该成分由分离在末期唤醒前以下天数采集的动物血液得到：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。
20、如权利要求18所述的成分，该成分由分离在末期唤醒前14、15或16天采集的动物血液得到。
21、如权利要求18所述的成分，该成分由分离在末期唤醒前15天采集的动物血液得到。
22、冬眠动物血浆的成分，其含有诱导尿素循环的分子，所述成分通过对第一只动物采集的血液进行分离而得到，所述第一只动物处于冬眠晚期；如果第二只动物处于冬眠中期，则所述成分不包含第二只动物的任何血液成分。
23、纯化具有抗梗塞活性的分子的方法，该方法包括：(1)从冬眠动物中采集样品，(2)从冬眠动物中采集第二份样品，(3)和将所述样品与第二份样品进行比较。
24、纯化具有抗梗塞活性的分子的方法，该方法包括：(1)从冬眠动物中采集样品，(2)从处于不同亚状态的冬眠动物中采集第二份样品，(3)和将所述样品与第二份样品进行比较。
25、纯化具有抗梗塞活性的分子的方法，该方法包括：(1)在第一个时间点从冬眠动物中采集样品，(2)在第二个时间点从冬眠动物中采集第二份样品，其中第一个时间点和第二个时间点是不同的，(3)以及将所述样品与第二份样品进行比较。
26、纯化具有抗梗塞活性的分子的方法，该方法包括：(1)从冬眠动物中采集血液样品，(2)从冬眠动物中采集第二份血液样品，(3)和将所述血液样品与第二份血液样品进行比较。
27、如权利要求23至26任一项所述的方法，其中，将所述样品与第二份样品进行比较的步骤包括检测所述样品和第二份样品中的基因表达。
28、如权利要求23至26任一项所述的方法，其中，将所述样品与第二份样品进行比较的步骤包括检测所述样品和第二份样品中的蛋白质表达。
29、如权利要求23至25任一项所述的方法，其中，所述样品和第二份样品采集自血液、尿液、脊髓液或脑脊液、组织、器官、或细胞。
30、如权利要求26所述的方法，其中，所述样品和第二份样品采集自尿液、脊髓液或脑脊液、组织、器官、或细胞。
31、如权利要求23至26任一项所述的方法，其中，所述动物为哺乳动物。
32、如权利要求31所述的方法，其中，所述哺乳动物为黄鼠、熊、美洲旱獭、土拨鼠、臭鼬或蝙蝠。
33、如权利要求23至26任一项所述的方法，其中，所述血液样品采集自处于冬眠早期或冬眠晚期的动物。
34、如权利要求23至26任一项所述的方法，其中，所述第二份样品采集自处于冬眠中期的动物。
35、如权利要求33所述的方法，其中，所述第二份样品采集自处于冬眠中期的动物。
36、如权利要求23至26任一项所述的方法，其中，所述样品采集自冬眠开始后1至25天的动物。
37、如权利要求23至26任一项所述的方法，其中，所述第二份样品采集自冬眠开始后26至60天的动物。
38、如权利要求36所述的方法，其中，所述第二份样品采集自冬眠开始后26至60天的动物。
39、如权利要求23至26任一项所述的方法，其中，所述的比较步骤包括鉴定经差异调节的分子，其中，与第二份样品相比，在所述样品中所述经差异调节的分子的含量是不同的。
40、如权利要求39所述的方法，其中，经差异调节的分子的鉴定包括分离所述样品和第二份样品。
41、如权利要求40所述的方法，其中，通过收集小于或等于10千道尔顿的分子来进行分离。
42、如权利要求40所述的方法，其中，所述分离包括通过下列特性分离所述血液样品和第二份样品中分子的步骤：电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、迂曲度、分子量、蛋白质或肽或碳水化合物亲和层析特性、或溶解度。
43、如权利要求42所述的方法，其中，所述亲和分离包括使用亲和凝胶蓝层析。
44、如权利要求39所述的方法，其中，所述的鉴定包括使用下列方法分析样品：气相色谱质谱法、凝胶层析法、或高效液相色谱法、液相色谱/质谱/质谱法。
45、如权利要求44所述的方法，其中，高效液相色谱法包括反相色谱法。
46、如权利要求44所述的方法，其中，凝胶层析法包括双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。
47、如权利要求39所述的方法，该方法还包括纯化经差异调节的分子，以获得纯化的经差异调节的分子。
48、如权利要求47所述的方法，该方法还包括检测所述纯化的经差异调节的分子的抗梗塞活性。
49、如权利要求48所述的方法，其中，检测步骤包括使用脑缺血的小鼠MCAO模型。
50、如权利要求48所述的方法，其中，抗梗塞活性为抗脑梗塞活性。
51、如权利要求48所述的方法，其中，抗梗塞活性为抗心脏梗塞活性。
52、减小受试对象的梗塞的方法，该方法包括给受试对象施用血纤肽A。
53、如权利要求52所述的方法，其中，血纤肽A含有与SEQ ID NO：2序列具有至少20％同一性的结构，而且其中第8、12和13位氨基酸没有改变。
54、如权利要求53所述的方法，其中，第7、9和15位氨基酸的任何改变均是保守性替换。
55、如权利要求52所述的方法，其中，血纤肽A含有与SEQ ID NO：2序列具有70％同一性的结构。
56、如权利要求55所述的方法，其中，与SEQ ID NO：2不同的任何改变均为保守性替换。
57、如权利要求52所述的方法，其中，血纤肽A含有与SEQ ID NO：2序列的第6至16位氨基酸具有至少40％同一性的氨基酸，而且其中第8、12和13位氨基酸没有改变。
58、如权利要求57所述的方法，其中，第7、9和15位氨基酸的任何改变均是保守性替换。
59、如权利要求52所述的方法，其中，血纤肽A含有与SEQ ID NO：2序列的第6至16位氨基酸具有70％同一性的结构。
60、如权利要求59所述的方法，其中，SEQ ID NO：2的任何改变均为保守性替换。
61、如权利要求52至60任一项所述的方法，其中，血纤肽A减小了小鼠中脑动脉梗塞模型中的梗塞范围。
62、如权利要求61所述的方法，其中，梗塞范围减小了至少20％。
63、如权利要求61所述的方法，其中，梗塞范围减小了至少40％。
64、如权利要求61所述的方法，其中，梗塞范围减小了至少60％。
65、如权利要求61所述的方法，其中，梗塞范围减小了至少80％。
66、如权利要求52至60任一项所述的方法，其中，小鼠中脑动脉梗塞模型的梗塞比率至少是1.1。
67、如权利要求52至60任一项所述的方法，其中，小鼠中脑动脉梗塞模型的梗塞比率大于或等于1.5。
68、如权利要求52至60任一项所述的方法，其中，小鼠中脑动脉梗塞模型的梗塞比率大于或等于2。
69、如权利要求68所述的方法，其中，梗塞比率是由平均梗塞体积确定的。
70、如权利要求69所述的方法，其中，小鼠中脑动脉梗塞模型的平均梗塞体积小于或等于90％。
71、如权利要求69所述的方法，其中，小鼠中脑动脉梗塞模型的平均梗塞体积小于或等于70％。
72、如权利要求69所述的方法，其中，小鼠中脑动脉梗塞模型的平均梗塞体积小于或等于50％。
73、如权利要求69所述的方法，其中，小鼠中脑动脉梗塞模型的平均梗塞体积小于或等于30％。
74、减小受试对象梗塞的方法，该方法包括给受试对象施用包含以下肽序列的组合物：SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42、SEQID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NOs：96-103、AVR或FVR。
75、如权利要求52所述的方法，其中，血纤肽A含有以下序列：SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：89或SEQ IDNOs：96-103、AVR或FVR。
76、如权利要求52所述的方法，其中，血纤肽A含有以下序列：SEQID NO：46、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、或SEQID NO：54、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：39。
77、如权利要求52所述的方法，其中，梗塞为脑梗塞。
78、如权利要求52所述的方法，其中，梗塞为心脏梗塞。
79、减小受试对象的梗塞的方法，该方法包括给受试对象施用缓激肽。
80、如权利要求79所述的方法，其中，缓激肽含有与SEQ ID NO：57具有60％同一性的结构。
81、如权利要求80所述的方法，其中，与SEQ ID NO：57不同的任何改变均是保守性替换。
82、如权利要求79所述的方法，其中，缓激肽含有与SEQ ID NO：83具有80％同一性的结构。
83、如权利要求80所述的方法，其中，与SEQ ID NO：57不同的任何改变均是保守性替换。
84、如权利要求79所述的方法，其中，缓激肽的C末端不含有碱性氨基酸。
85、如权利要求84所述的方法，其中，碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
86、如权利要求85所述的方法，其中，缓激肽的N末端含有碱性氨基酸。
87、如权利要求86所述的方法，其中，碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
88、如权利要求79所述的方法，其中，缓激肽的N末端含有碱性氨基酸。
89、如权利要求88所述的方法，其中，碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
90、如权利要求79所述的方法，其中，缓激肽含有以下序列：SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85。
91、如权利要求79所述的方法，其中，缓激肽含有以下序列：SEQ IDNO：58、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：81。
92、如权利要求79所述的方法，其中，缓激肽含有如SEQ ID NO：58所示的序列。
93、如权利要求79所述的方法，其中，缓激肽含有如SEQ ID NO：61所示的序列。
94、如权利要求79所述的方法，其中，梗塞为脑梗塞。
95、如权利要求79所述的方法，其中，梗塞为心脏梗塞。
96、制备抗梗塞分子的方法，该方法包括合成抗梗塞分子或抗梗塞分子变异体，其中，纯化抗梗塞分子的方法包括：(1)从冬眠动物中采集血液样品，(2)从冬眠动物中采集第二份血液样品，(3)将所述血液样品与第二份血液样品进行比较，其中，在冬眠开始后小于或等于25天采集所述血液样品，在冬眠开始后大于25天采集第二份血液样品，其中，所述血液样品中抗梗塞分子的含量比第二份血液样品中的多。
97、制备抗梗塞分子的方法，该方法包括合成抗梗塞分子或抗梗塞分子变异体，其中，纯化抗梗塞分子的方法包括：(1)从冬眠动物中采集血液样品，(2)从冬眠动物中采集第二份血液样品，(3)将所述血液样品和第二份血液样品进行比较，其中，在冬眠开始后小于或等于25天采集血液样品，在冬眠开始后大于25天但在冬眠结束前大于25天采集第二份血液样品，其中，所述血液样品中抗梗塞分子的含量比第二份血液样品中的多。
98、鉴定抗梗塞分子的方法，该方法包括：给小鼠中脑动脉梗塞模型施用一种分子，在小鼠中脑动脉梗塞模型中比较所述分子的抗梗塞活性和血纤肽A的抗梗塞活性，如果所述分子的抗梗塞活性至少是血纤肽A活性的20％则选中该分子。
99、对需要减轻梗塞的受试对象减小梗塞的方法，该方法包括给受试对象施用有效量的制药学上可接受形式的2型血管紧张素II受体拮抗剂。
100、如权利要求99所述的方法，其中，梗塞与中风相关。
101、如权利要求99所述的方法，其中，梗塞与心脏缺血相关。
102、如权利要求99所述的方法，其中，2型血管紧张素II受体拮抗剂是缓激肽。
103、如权利要求102所述的方法，其中，缓激肽含有与SEQ ID NO：57具有60％同一性的结构。
104、如权利要求103所述的方法，其中，与SEQ ID NO：57不同的任何改变均是保守性替换。
105、如权利要求102所述的方法，其中，缓激肽含有与SEQ ID NO：83序列具有80％同一性的结构。
106、如权利要求105所述的方法，其中，与SEQ ID NO：57不同的任何改变均是保守性替换。
107、如权利要求102所述的方法，其中，缓激肽的C末端不含有碱性氨基酸。
108、如权利要求107所述的方法，其中，碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
109、如权利要求108所述的方法，其中，缓激肽的N末端含有碱性氨基酸。
110、如权利要求109所述的方法，其中，碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
111、如权利要求102所述的方法，其中，缓激肽的N末端含有碱性氨基酸。
112、如权利要求111所述的方法，其中，碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
113、如权利要求102所述的方法，其中，缓激肽含有以下序列：SEQID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：85。
114、如权利要求102所述的方法，其中，缓激肽含有以下序列：SEQID NO：58、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：81。
115、如权利要求102所述的方法，其中，缓激肽含有如SEQ ID NO：58所示的序列。
116、如权利要求102所述的方法，其中，缓激肽含有如SEQ ID NO：61所示的序列。
117、如权利要求102所述的方法，其中，梗塞与中风相关。
118、鉴定缓激肽与2型血管紧张素II受体相互作用的抑制物的方法，该方法包括：在缓激肽存在的情况下，将表达2型血管紧张素II受体的细胞与假定抑制物接触；检测结合在2型血管紧张素II受体上的缓激肽的量；其中，当与2型血管紧张素II受体结合的缓激肽减少时，即鉴定出一种抑制物。
119、鉴定缓激肽与2型血管紧张素II受体相互作用的抑制物的方法，该方法包括：在缓激肽存在的情况下，将表达2型血管紧张素II受体的细胞与假定抑制物接触，其中，2型血管紧张素II受体含有荧光供体，缓激肽含有荧光受体；检测荧光共振能量转移，其中，与没有接触假定抑制物的细胞的荧光共振能量转移检测结果相比，所述检测结果的降低提示抑制物的存在。
120、鉴定缓激肽与2型血管紧张素II受体相互作用的抑制物的方法，该方法包括：将细胞系统与假定抑制物接触，其中，所述细胞系统包含2型血管紧张素II受体和缓激肽，2型血管紧张素II受体含有荧光供体，缓激肽含有荧光受体；在所述细胞系统与假定抑制物接触之前和之后检测荧光共振能量转移，其中，当假定抑制物与细胞系统接触时，如果出现细胞系统荧光共振能量转移的降低，则将该假定抑制物鉴定为一种抑制物。
121、如权利要求118至120任一项所述的方法，该方法还包括以下步骤：在体内梗塞模型中对鉴定得到的抑制物进行检测；在动物模型中选择减小梗塞的分子。
122、如权利要求118至120任一项所述的方法，其中，在分子库中找到所述假定抑制物。
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