JP2005532263A - 抗梗塞分子 - Google Patents

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Abstract

虚血を処置するための組成物および方法ならびに冬眠状態に関する分子が、開示される。すなわち、冬眠期間中の種々の時点における動物の冬眠状態を評価する方法が開示される。また、冬眠中の動物は冬眠の中期より初期および後期に覚醒しながら生き延びやすいことが本明細書中で開示される。さらに、冬眠の中期ではなく初期の冬眠動物から得られる血漿画分は、ラットモデルにおける虚血に影響を及ぼし、虚血処置に用いられ得る分子を含むことが開示される。さらに本明細書中で、これらの分子がＦＰＡおよびその誘導体ならびにブラジキニンおよびその誘導体を含むことを示す。

Description

本出願は、米国仮特許出願６０／３５４，６７８号（２００２年２月６日出願）、米国
仮特許出願６０／３９２，１３３号（２００２年６月２８日出願）、および米国仮特許出願６０／４２９，２７８号（２００２年１１月２５日出願）の優先権を主張する。仮特許出願６０／３５４，６７８号、同６０／３９２，１３３号および同６０／４２９，２７８号は、全てこれらの全体が本明細書中において参考として援用される。
（Ｉ．背景）
北部温帯地方の小型および中型の哺乳動物の多くは、食物の入手が困難な冬季数ヶ月
間に休眠という長期管理状態に入る。地上性のリス、グラウンドホッグおよびマウスのような真の冬眠動物は、大量の体脂肪を蓄積することにより冬眠に備える。また、グラウンドホッグのようなある種の哺乳動物は巣穴に食物を蓄える。動物が冬眠に入ると、生理学的変化が起こる。心拍数は低下し、代謝および覚醒能力は変化する。
本明細書中で、冬眠期間中の種々の時点における動物の冬眠状態を評価する方法が開示される。また、冬眠中の動物は冬眠の中期より初期および後期に覚醒しながら生き延びやすいことが本明細書中で開示される。さらに、冬眠の中期ではなく初期の冬眠動物から得られる血漿画分は、ラットモデルにおける虚血に影響を及ぼし、虚血処置に用いられ得る分子を含むことが開示される。さらに本明細書中で、これらの分子がＦＰＡおよびその誘導体ならびにブラジキニンおよびその誘導体を含むことを示す。
（ＩＩ．要旨）
１つの局面において、目的の分子を同定するための状態依存的な方法に関連する組成物および方法が開示される。１つの局面において、抗梗塞特性および抗虚血特性を有する分子に関連する組成物および方法も開示される。
以上の概要および以下の詳細な説明の両方は、模範的かつ説明的であるだけで特許請求されるような本発明の制限ではないことが理解される。
（ＩＶ．詳細な説明）
本化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が開示および記述される前に、特に記載がなければこの化合物および方法が特定の合成方法あるいは特定の組換え生物工学方法に限定されず、特に記載がなければ特定の試薬に限定されず、そういうものとして、もちろん、変動し得ることが理解される。また、本明細書において使用する専門用語は特定の実施形態のみを記述する目的で用い、限定することは意図されていないことが理解されるべきである。
（Ａ．定義）
略語：ＭＣＡＯ、中大脳動脈閉塞；ＴＴＣ、塩化トリフェニルテトラゾリウム；Ｉ．Ｖ．、静脈内；ＦＰＡｗ、フィブリノペプチドＡウッドチャック配列；Ｃ末端（Ｉ）、ＦＰＡイソロイシン４位のＣ末端フラグメント；およびＣ末端（Ｌ）、ＦＰＡロイシン４位のＣ末端フラグメント。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特にその文脈が明確に定められていなければ、複数形の意味も含む。従って、例えば、「薬学的キャリア（ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃａｒｒｉｅｒ）」への言及は２つ以上のこのようなキャリアの混合物などを含む。
範囲は本明細書において、「約」１つの特定の値からおよび／または「約」別の特定の値までを表し得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、一つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合は、先行詞「約」を用いることにより、その特定の値が別の実施形態を形成すると理解される。その範囲の各々の終末点が、他の終末点と関連している場合および他の終末点から独立している場合の両方において、有意であるとさらに理解される。また、本明細書において多くの値が開示されており、また、各々の値が本明細書においてその値自体に加えて「およそ」その特定の値として開示されることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。また、当業者に適切に理解されるように、１つの値が開示される場合、「その値未満の値またはその値と同じ値」、「その値より大きい値またはその値と同じ値」、および値の間の可能範囲も開示されることは理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０未満の値または１０と同じ値」および「１０より大きい値または１０と同じ値」も開示される。また、本願を通して、データが多くの異なるフォーマットで提供され、このデータが終末点、開始点およびデータ点の任意の組み合わせに対する範囲を表すことが理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示される場合、１０および１５より大きい、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、１０および１５と同じ値が、１０と１５との間の値に加えて開示されると考えられることが理解される。
本願を通して、種々の文献が参照される。これらの文献の開示はその全体で、本技術状態をより詳細に記述するために本願明細書中に参考として援用される。また、この開示参考文献は、そのなかに含まれる物質について個々におよび具体的に本明細書中に参考として援用され、その物質は参考文献が依存する文章において考察される。
開示組成物を調製するために用いられる構成成分および本明細書中で開示される方法において用いられる組成物自体が開示される。これらおよび他の物質は本明細書中で開示され、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、基などが開示される場合、各々の種々の個々のおよび集団的な組み合わせおよびこれらの化合物の順列が明白に開示され得ないものの、各々は本明細書中で具体的に企図され記述されることが理解される。例えば、特定のＦＰＡが開示および考察され、ＦＰＡを含むいくつかの分子に対してなされ得るいくつかの改変が考察される場合、逆に対して具体的に示唆されなければ、可能であるＦＰＡとその修飾の各々および全ての組み合わせと順列は、具体的に企図される。従って、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスおよび組み合わせ分子Ａ〜Ｄの例が開示される場合は、各々が個々に記載されないとしても各々は個々に集団的に企図され、Ａ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜ＥおよびＣ〜Ｆの組み合わせは開示されていると考えられることを意味する。その上、これらの任意のサブセットあるいは組み合わせも開示される。従って、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、およびＣ〜Ｅのサブグループは開示されているとみなされる。この概念は、開示組成物を作製および使用する方法における工程を含むが、これらに限定しない、本願のあらゆる面に適用する。従って、実施可能な種々の追加的工程がある場合、これらのそれぞれの追加的工程が種々の特定の実施形態または開示方法の実施形態の組み合わせによって実施され得ることが理解される。
「任意の」または「必要に応じて」は、引き続いて記述される事象または状況が起こり得るまたは起こり得ないこと、ならびに、その記述にその事象あるいは状況が起こる例およびそれが起こらない例が含まれることを意味する。
「プライマー」は、ある種の酵素操作を支持でき、酵素操作が起こり得るような標的核酸とハイブリダイズできるプローブのサブセットである。プライマーは、当該分野において使用可能なヌクレオチドあるいはヌクレオチド誘導体またはアナログの任意の組み合わせから作成可能で、酵素操作を妨害しない。
「プローブ」は、一般的に配列特異の方法で、例えばハイブリダイゼーションを通して、標的核酸と相互作用できる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該分野においてよく理解されており、本明細書中で考察される。一般的にプローブは当該分野において使用可能なヌクレオチドあるいはヌクレオチド誘導体またはアナログの任意の組み合わせから作成可能である。
（Ｂ．組成物および方法）
心臓虚血および脳虚血などの虚血に関連する組成物および方法が開示される。虚血事象により起こり得る梗塞を減少させる組成物および方法が開示される。６００，０００を超える新たなあるいは再発の脳卒中が毎年起こり、１９９５年に死者は１５７，９９１を超えた（１４．６人の死者中１名）。現在までの脳卒中生存者は４，０００，０００人で、この数字は増加し続けている。脳卒中の原因の８０％は虚血で２０％は出血である。脳卒中は、米国における第３の死因であり、障害の主因である。限局性脳虚血後の転帰および梗塞サイズは、「壊死」（パラプトーシス）細胞死および虚血の境界領域における遅延性神経細胞喪失（プログラム細胞死またはアポトーシス）の両方によって判定される。最近、虚血性脳卒中を処置する療法が出てきたが、これらの結果は満足のいくものではない。
所望の化合物を単離する状態依存的な方法が開示される。また、抗梗塞特性を有する化合物の状態依存的単離法が開示される。抗梗塞分子は冬眠中の動物の血液中に確認されており、本明細書中で単離および開示されている。
本明細書中では、初年度冬眠動物の高い死亡率が抗梗塞特性を有する分子と関係があると理解されることが開示される。初年度冬眠動物にみられる高い死亡率は、ウッドチャックのフィールドスタディーにおいては７７％にまで及ぶ（Ｎｏｏｎａｎ，Ｒ．Ｇｒｏｕｎｄｈｏｇ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｗｉｌｄｌｉｆｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（Ｓｅｐｔ）：１−２、２０００。ｗｗｗ．ｗｃｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｈｂｔ．ｈｔｍ、２０００）。若年体においては７７％の死亡率にまで及び、成体においては３０％であった（野生において；マークし再捕獲したデータ）。成体における死亡率は、マークおよび再捕獲方法を用い、約３０％と報告される。動物が若年であるほど遅く巣にこもり、遅くまで覚醒し、体重の軽い若年体はあまり生き延びそうにない。褐色脂肪の不十分な貯蔵（飢餓）は、媒介因子であると考えられることが多いが、剖検は一貫してこれらの若年の犠牲において極めて十分な脂肪を示す。
（１．冬眠の下位状態）
哺乳動物が冬眠に入る場合、本明細書中で開示されるように冬眠開始時および冬眠期間中もなお継続的に、必ず起こるいくつかの生理学的変化がある。例えば、冬眠中の動物では心拍数および細胞複製を含むその他の多くの代謝機能が必ず低下する。さらに、尿素サイクルは必ず変化し、動物に対する尿素毒性を阻害する。従って、冬眠状態にある哺乳動物と冬眠状態にない哺乳動物との間には相対差がある。冬眠中の哺乳動物の冬眠状態についても差異があると本明細書中で開示される。冬眠中と非冬眠中の状態間の分子差のみならず冬眠状態間の分子差を評価する方法が開示される。例えば、冬眠後期に比べて初期にある哺乳動物間に生理学的差異および分子差異がある。冬眠の状態（あるいは下位状態）は、例えば、生理機能、内分泌あるいは行動によって特徴づけられ得る。生理機能の一例は、正常生理学的範囲を下回る心拍数の低下であり；内分泌の一例は、循環におけるフィブリノペプチドＡの相対的上昇であり；行動の一例は、不測死を伴うかまたは伴わない麻痺状態からの完全誘発覚醒である。
冬眠の開始は動物の正常心血管状態の低下があるときに起こると定義され得る。この低下は、例えば、動物の心拍数が、その正常安静時心拍数の８０％以下にとどまる時点であろう。特定の実施形態において、例えば睡眠によって起こる低下とは対照的に、安静時心拍数と低下時心拍数との間に統計的に有意な差異がある場合に冬眠は始まっている。ｐ＜０．０５は有意と考えられる。冬眠開始時に、一般的に動物の体温も低下し、動物は体をボールのように丸くする。最終覚醒は冬眠に続く状態を特徴とするが、その状態で動物は覚醒したままで後期の冬眠に戻らない。また、最終覚醒は、冬眠状態にあった後の動物について、冬眠中の動物の心拍数が正常心拍数まで上昇する時点と定義され得る。一般的に野生動物では、最終覚醒時に巣を離れて食べ物をあさり始める。
冬眠の開始はその時点から種々の動物が正常化し得る時点を定義すると理解される。冬眠中の動物の冬眠中の状態において異なる時点で採取された血漿の画分間に差異があることが開示される。冬眠開始から以下の日数後に得られる下位状態が開示される：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００。最終覚醒から以下の日数後に得られる下位状態が開示される：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００。例えば、冬眠開始１日後は冬眠開始５日後と異なる冬眠下位状態であると考えられ得、それは最終覚醒１日前と異なる冬眠下位状態であり得ることが理解される。また、冬眠開始後数日の範囲を構成する下位状態も開示されると理解される。例えば、冬眠後１〜５日の範囲は２０〜２５日の下位状態と異なる下位状態になり得る。例えば、抗梗塞分子の値の上昇を含む下位状態は冬眠開始後１〜３０日、または４〜２５日、または１０〜２０日または１３〜１８日後から作り上げられる下位状態であり、抗梗塞分子の値の低下を含む下位状態は冬眠開始後３０〜６０日、または３５〜５５日、または４０〜５０日または４３〜４８日後から作り上げられる下位状態である。また、冬眠開始後１４日間隔で起こる下位状態または最初のサンプル採取後１４日間隔で生じる下位状態が開示される。例えば、１日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、７０日目、８４日目、９８日目および／または１１２日目、あるいは１０日目、２４日目、３８日目、５２日目、６６日目、８０日目、９４日目、１０８日目および／または１２２日目。その他に開示される下位状態は冬眠開始時から冬眠開始後１秒、１分、１時間、１日、１週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月または６ヶ月後までである。
初期冬眠は、冬眠開始から中期冬眠前までの時期として定義され得る。中期冬眠は、初期冬眠後から後期冬眠前までの時期として定義され得る。後期冬眠は、中期冬眠後から最終覚醒までの時期として定義され得る。
初期冬眠は、動物が冬眠から覚醒したときに徐脈発生率の低下および死亡（一般的に死亡はない）がある状態に関連し得る。初期冬眠は、ＦＰＡおよびブラジキニン分泌の上昇（中期冬眠と比較して）に関連する。例えば、初期冬眠は一般的に、心血管動態が低点に達し（例えば、心拍数は約４秒間／拍動に低下する）、体温が約３５℃〜４０℃に低下する時期である。さらに、本明細書中に開示するように、初期冬眠期間中は循環中に分子があり、これは、とりわけ動物を虚血から保護し、尿素リサイクルを誘導する。
中期冬眠は、動物が冬眠から覚醒し、徐脈発生率の増加および死亡がある場合の状態に関連し得る。また、中期冬眠は、ＦＰＡおよびブラジキニン分泌の低下（初期冬眠と比較して）に関連する。この両下位状態は、時間的に相関し、互いに関連し合って、冬眠の開始と終了に関連して起こるため、日付も集合語である中期冬眠に関連し得る。
本明細書中で示すとおり、中期冬眠はまた、一般的に、動物を虚血から保護するものも含めた循環中の分子の数を減少させることによりエネルギーを保存する冬眠中の動物に関連する。さらに他の調節分子の分泌が停止する可能性が極めて高い。
後期冬眠は、初期冬眠と同様、中期冬眠中の抗梗塞分子量に関連するＦＰＡおよびブラジキニンを含む抗梗塞分子の増加がある状態としてみなされ得る。例えば、初期、中期、後期の種々の冬眠状態は、所定の１年あるいは所定の１動物の冬眠サイクル以内に重複しないが、年から年の基準で重複し得ることが理解される。例えば、数年間は冬眠が極めて短くあり得、初期冬眠が１２月初旬に終わることがあれば、他の数年には冬眠が長くあり得、初期冬眠が１２月下旬に終わることもある。例えば、初期冬眠は冬眠開始後１５±１５日に、中期冬眠は冬眠開始後４５±１５日に、後期冬眠は冬眠開始後６０±３０日にみられ得る。
また、異なる下位状態は冬眠開始前の日数により定義され得る。冬眠開始の１〜７５日前は開示される。例えば、食欲は、典型的には抑制され、野生動物の一部においては早くも１０月の第１週に始まるが、概して全野生動物において、冬眠が始まる前の１１月中旬〜下旬の数週間に観察される。この下位状態は、フィブリノペプチドＡの上昇または覚醒により引き起こされる徐脈に関連していると示されてはいない。同様に尿素リサイクル分子は冬眠の初期に分泌され、一般的に冬眠開始後１〜２１日にみられるが、代謝が止まり尿素が形成されない場合、この尿素リサイクル分子は分泌され得ない。従って、冬眠は、重複するおよび重複しない下位時期として時間的に表される種々の生理学的、化学的、行動的な下位状態の集合としてみられる。
概して、自然発生的に起こるかまたは実験的手段により引き起こされる生理学的および行動的な事象、ならびに、例えば覚醒により引き起こされる死亡などのような、冬眠期間の異なる時点で起こる生理学的および行動的な事象をみることによって、分泌状態などの異なる状態を血漿分子について記載され得ることが本明細書中で開示される。一旦異なる状態を記載する、すなわち、冬眠開始からの時間ごとに、または例えば表された各状態の生理学的状態を評価することによって、血漿あるいは筋肉または神経組織などのその他のタイプの組織サンプルを、例えば初期冬眠および中期冬眠といった異なる二つの状態から、取得し得る。
次いで、これらの組織サンプルは、ＧＣ質量分析、画分、またはゲルクロマトグラフィーの任意の技術を用いて比較することができる。この組織サンプルの分子構造の違いを、冬眠あるいはなにか他の生理学的特徴に関連する種々の活動について評価できる。そして、その違いを表す分子について、例えば、さらなる精製または合成的生成またはさらなる特徴づけなどを行うことができる。
ウッドチャックなどの冬眠中の動物が冬眠からの覚醒時に重度の心血管ストレスを受けるという事実が本明細書中で開示される。しかし、冬眠中の動物は、このストレスに、中期冬眠期間（例えば、冬眠開始後３１〜５９日）よりも、初期冬眠期間（例えば、冬眠開始後１〜３０日）および後期冬眠期間（例えば、冬眠開始後６０〜９０日）においてよりうまく対処することができる。本明細書中で開示される技術を用いて、ウッドチャックおよびその他の動物のような冬眠中の動物が冬眠状態から覚醒することのストレスに対処するのを助けることができる分子がウッドチャックなどの冬眠中の動物の初期および後期の血漿中に存在することが認められた。これらの分子は中期冬眠期間中に低量で存在する。そのような二つの分子は、ＦＰＡおよびその誘導体、ブラジキニンおよびその誘導体、ならびにそれぞれの機能性改変体である。
また、これらの分子を動脈閉塞を受けている動物に投与すると梗塞を減弱させることができることが開示される。従って、これらの開示組成物は「脳卒中」または「心臓発作」などの梗塞を促進する事象を受けている被験体に投与することができる。
冬眠中の動物から採取した分子の「状態依存性」画分と比較して、タンパク質およびペプチドを単離するための方法が開示される。これらの小さな生理学的状態依存性差異は、分子の分離画分を採取するために用い、プロテオミクス法（例えば、２Ｄ ＳＤＳ ＰＡＧＥ ゲル電気泳動、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ タンデム型質量分析など）による検査が、冬眠生理学およびモデルに関連し得る特定のバイオアッセイモデルの１つまたは別のものにおいて主要な効果を潜在的に呈する関連分子の単離および同定の両方に導く。
げっ歯動物モデルなどの脳卒中モデルにおいて、１時間の中脳動脈の閉塞に続いて逆流が起こり、その後、残留生存可能組織（ＴＴＣ、１％）の塩化トリフェニルテトラゾリウム染色を用いた梗塞サイズの検査を行うことが開示される。そのような脳卒中モデルの改変体には、脳動脈の一時的あるいは恒久的な閉塞が考えられ、全ての哺乳動物を含むが、げっ歯動物モデルが試験材料を保存するには一般的である。化合物の多くがこのモデルにおいて種々の理論的根拠に基づいて試験されている（例えば、種々のグルタミン酸レセプターインヒビター、腫瘍壊死因子インヒビターなどのうちの１つまたは別のもの）。
冬眠は微妙な下位状態を構成するという点で睡眠と類似することを本明細書中で開示する。例えば、睡眠は同期ＥＥＧ状態および非同期ＥＥＧ状態という２つの状態に分けることが出来る。さらに研究を進めると、これら二つの主要な下位状態に潜在する生理機能に有意な差異があることが分かる。両状態は神経分泌、筋弛緩および自律神経性緊張の喪失（交感神経枝および副交感神経枝の両方）に関連するため、冬眠は非同期脳波睡眠自体（すなわち、レム睡眠）の類似物であることを本明細書中で開示する。これは、この睡眠下位状態の下位状態がさらに存在することを意味する。急速眼球運動睡眠（レム睡眠）状態の間に、心筋虚血のブタモデルにおいて、心室の転移および致命的な不整脈に対する心臓の脆弱性に及ぼす著しい健全な効果がある。ＥＥＧ判定基準により決定するようなレム睡眠の開始とＥＣＧ判定基準により同定するような健全な心血管効果の開始との間の潜伏時間は２０〜３０秒間で、作用の神経液性機構を示した所見であった。さらに研究を進めると、不整脈原性に及ぼす健全な影響は、自律神経系を通って心臓に伝わり、ＥＥＧ同期および睡眠を開始する脳の部分である（Ｓｋｉｎｎｅｒ．Ｊ．Ｅ．，Ｄｏｕｇｌｉｓ、Ｆ．Ｍ．およびＨａｒｐｅｒ、Ｒ．Ｍ．Ｈｉｇｈｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｌｅｅｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ．Ｈ．Ｋｒｙｇｅｒ、Ｔ．ＲｏｔｈおよびＷ．Ｃ．Ｄｅｍｅｎｔ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．、２７章、ｐｐ．２７６〜２９３、（１９８９年））前頭葉での神経活性が起源であることが分かった（Ｓｋｉｎｎｅｒ．Ｊ．Ｅ．，Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ＲＥＭ ｓｌｅｅｐ ｉｎ ｔｈｅ ｐｉｇ、Ｓｌｅｅｐ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ．Ｃｈａｓｅ ａｎｄ Ｅ．Ｄ．Ｗｅｉｔｚｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８３年、ｐｐ．４９〜６３；Ｓｋｉｎｎｅｒ．Ｊ．Ｅ．，Ａｍｅｒ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、５：８８Ｂ９４Ｂ、（１９８５年））。レム時間は極めて短いので、レム中に脳の間質空間から分子をサンプリングすることは困難であった。レムは脳の高度な神経分泌状態であり、自律神経系の両枝のターンオフおよび筋弛緩が伴う。同様の脳の状態は、哺乳類の冬眠について調べられ、見出された。後者は長期状態であると仮定され、レム睡眠中の冬眠していない動物から分泌された分子の適切なサンプリングが可能である。
中期冬眠における重度の徐脈を伴う覚醒の誘発が常に死亡をもたらし、２）初期あるいは後期の冬眠期間のいずれかに誘発された覚醒およびそれに伴う徐脈が結果として成功裡の覚醒に至ったことを、本明細書中で開示する。
循環によって適切に支持されない、覚醒行動から生まれる代謝要求により引き起こされる相対的虚血（不適切な徐脈）が、抗梗塞分子の存在が不十分であるために、中期冬眠期間中は阻止され得ないことを本明細書中で開示する。初期および後期の冬眠中の動物から抽出される分子画分が、死亡を伴わない成功裡の覚醒を調節して可能とすることが出来る分子を含むが、中期冬眠中の動物における分子ではそれが出来ないことを本明細書中で開示する。げっ歯類脳卒中モデルでは、初期および後期の冬眠の画分のみが抗梗塞分子を含むことが見出された。種々のプロテオミクス技術（２Ｄゲル、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）による中期冬眠分子画分との差示的比較により、開示された抗梗塞分子を同定した。この状態依存性の精製方法により、中期冬眠に比べて初期冬眠の期間中に上方調節された９つのタンパク質および５つのペプチドを生成した。
冬眠には下位状態（ｓｕｂ−ｓｔａｔｅ）があることを本明細書中で開示する。この独立した下位状態への微妙な分割が神経分泌の異なるプロフィールに関連することも、この本明細書中で開示する。また、これらの冬眠に関連する下位状態がまた虚血に関連する場合は、代表的に冬眠前の覚醒中に起こることも本明細書中で開示する。
また、食欲不振を引き起こす神経分泌の冬眠下位状態依存性プロフィールを開示する。冬眠動物が食べるなくなる直前および直後に採取した血漿画分を比較することで、結果として覚醒中の冬眠前期間の食欲を抑制する特定の分子を単離および同定することにつながり得ることを開示する。この差示的比較を支持する入手可能なデータを表１５に示す。
（表１５）
（ウッドチャックの摂食行動）
これらの観察は、捕獲し、冬眠を通して研究した６匹のウッドチャックに関して行った。１日あたり提供される小ニンジン１本、リンゴ１／２個、キャベツの葉１枚、水の食物材料を自由に与えた。食物消費は２４時間後に記録し、食べ残しの食物は新鮮な食物を食物皿に置く前にケージから除去した。

日付 観察日について要約した動物の摂食行動
９月１日 ６匹中６匹がほとんどの食物を毎日消費した。
１０月１日 ６匹中６匹がほとんどの食物を消費した。２匹は摂食量が有意に少なかったが、リンゴは摂食した。
１１月１日 ６匹中２匹がほとんどの食物を消費した。４匹は摂食量が有意に少なかったが、リンゴは摂食した。
１１月３０日 ６匹中２匹はいくらかの食物を消費した。３匹は摂食量が極めて少なかった。１匹は摂食量が非常に僅かであった。
１２月１日 全ての食物を除去し、動物を平静の状態にした。２４時間の活動モニタリングにより決定されるように、１週間以内に全６匹が静かになった（すなわち、冬眠中）。

血漿、脳脊髄液、尿、あるいはその他の生物学的分子群の冬眠関連サンプルの状態依存的画分における分子の発見方法を、冬眠中の動物の覚醒および冬眠の両状態について開示する。
冬眠関連分子を捕捉する状態依存性方法の用途を開示する。分子、あるいは１）脳卒中における脳損傷を予防する、２）心臓発作における心筋損傷を予防する、および３）腎不全または任意の他の状態において血中尿素をリサイクルすることに関連する分子を含む、部分的または実質的に精製された分子画分を開示する。
抗梗塞効果を有する、ＦＰＡ、およびＦＰＡに対して同一性を有する分子のようなＦＰＡ関連分子を、本明細書中で開示する。抗梗塞分子を開示する。血栓症が下流管腔がインタクトな血管において（すなわち、切り傷のある血管においてではなく）「不慮に」起こる場合、血栓溶解がその閉塞を除去し始め得る前に下流組織において不慮の虚血が認められるであろう。そのような不慮の血液凝固の例は、挫傷、低い灌流圧、位置的血管梗塞などに関連する。不慮の血栓の形成により引き起こされる虚血損傷は、遊離ＦＰＡフラグメントあるいは放出される改変体または誘導体により相殺され得る。ＦＰＡが切り傷のあるまたは切断された血管が原因で体から流出すると、虚血はあまり効果的に阻害されないが、その循環がインタクトのままであれば、その循環に放り出された非リン酸化ＦＰＡがその血栓の分解中およびその循環の回復中に抗梗塞機能の選択的利点を提供し得る。
（２．虚血）
（ａ）中程度の神経保護および心臓保護の機構）
虚血についての保護分子は、ニューロンが過敏性興奮性プロセスにより自滅し得るという観察に基づいて、過去において捜し求められていた。グルタミン酸およびそのレセプターがこの過剰興奮の主因であるようだが、その一部は学習および記憶のプロセスに関与している（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ ＥＫ．Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９８、５４（４）：３６９〜１５）。Ｌ−グルタミン酸は、脊椎動物の脳における最も広範囲に及ぶ興奮性伝達システムであり、そのシナプス伝達物質としての作用に加えて、神経代謝および生存力の長期継続的変化を起こす。
これらの効果は、イオンチャネルを形成するクラスおよび代謝を制御するＧ−タンパク質に結合するクラスの二つの一般的クラスのレセプターの活性化により生じる。これらの種々の形態のレセプターを薬理学的および生理学的に特徴づけることにより、３つのイオンチャネルおよび３つ（のグループ）の代謝レセプターが定義づけられている。現在、２５を超える遺伝子がこれらのレセプターの特定のサブユニットについて同定されており、別の５つのタンパク質は、レセプターサブユニットあるいはレセプター関連タンパク質として機能していると考えられる（これらのタンパク質の配列はＧｅｎＢａｎｋにおいて見出すことができ、本明細書中にその全体において参考として援用される）。これらのタンパク質のサブユニットの発現調節、ニューロン膜および神経膠膜におけるそれらの局在、ならびにグルタミン酸レセプターの生理学的特性を同定する上でのそれらの役割は、現在研究が進められている分野である。イオンチャネル型レセプターおよび代謝調節型レセプターの双方は、Ｃａ２＋、サイクリックＡＭＰ、活性酸素種のような複数の細胞内メッセンジャーに結合し、これらの結合は、ニューロンの成長、分化および生存を決定する複数のシグナル伝達カスケードを開通する。Ａａｒｔｓらは抗梗塞活性をいくらか有する二つの小さなペプチドが（Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ 配列番号１０４）（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ 配列番号１０５）、ＮＭＤＡレセプターを介して働くことを見出した（Ａａｒｔｓら、Ｓｃｕｅｎｃｅ、２９８：８４６８５０（２００２年））。この文献は、少なくとも抗梗塞分子に関連する物質に関して、本明細書中に参考として援用される。
これらのＬ−グルタミン酸の知見により、１つ以上のグルタミン酸レセプターあるいは細胞下結合がブロックされると、おそらく虚血傷害時のグルタミン酸放出と供に生じる興奮死亡を予防され得ることが示唆される。Ｌｕｂｅｌｕｚｏｌｅは、グルタミン酸レセプターの刺激の効果を実際にブロックするこのような分子の１つである（Ｌｅｓａｇｅ ＡＳら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １９９６、２７９：７５９〜６６）。しかし、臨床試験により、これが、脳卒中の発症後８時間までの登録患者の処置に医学的に有用であると立証されないことが示された（Ｇｒｏｔｔａ Ｊ；Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ Ｄｉｓ ２００１、１２：２５８〜６３）。その他の中程度に有効な抗脳卒中介入を支持する他のいくつかの一連の証拠がある。内皮接着分子は、脳卒中およびそれが引き起こす壊死性細胞死の原因の主要な候補として提唱されている。ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子、α）は、セカンドメッセンジャーであるセラミドを介して、単球およびマクロファージを小血管の内皮内層に結合させる分子であるＩＣＡＭ−１（細胞内接着分子−１）の上方調節を引き起こす（Ｇｉｎｉｓ Ｉら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９９、２７６：Ｃ１１７１〜８３）。この機構はまた脳内の虚血「プレコンディショニング（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）」を明示し（Ｃｈｅｎ Ｙら、Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２００１年、２１：３４〜４０）、これは、梗塞の脳モデルおよび心臓モデルの双方において組織の保護（ｔｉｓｓｕｅ−ｓａｖｉｎｇ）を引き起こすので、アピールの強い現象である。しかし、ＴＮＦ−ＩＣＡＭ−単球機構におけるマウス抗ヒトＩＣＡＭ抗体（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）による介入が、ネガティブな結果を有することが、小規模臨床試験において見出された（Ｆｕｒｕｙａ Ｋら、Ｓｔｒｏｋｅ ２００１年１１月；３２（１１）：２６６５〜７４）。
プレコンディショニングは心筋で最初に研究された。虚血を伴う事前経験（すなわち、「プレコンディショニング」）が、後の回復後、動脈が結紮された時に、梗塞量の減少を引き起こすことが見出された。心筋機構が、アデノシンレセプターに結合する阻害性ｇ−タンパク質を含むことが初めに示された（Ｈａｓｈｉｍｉ ＭＷら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８６：１９〜２５）。初期のアデノシン−ｇ１−シクラーゼ仮説以来、プレコンディショニング現象はかなりより複雑であることが見出されている。
プレコンディショニングには二つの相がある（Ｂｏｌｌｉ Ｒ．Ｔｈｅ ｌａｔｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ。Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２０００年、８７（１１）：９７２〜８３）。２〜３時間続き、「気絶」に対してではなく心筋梗塞に対して保護する初期のプレコンディショニングとは異なり、３〜４日間続き、心組織の梗塞および気絶の両方に対して保護する後期のプレコンディショニングがある。この影響が長く続くほど、より大きな臨床的関連性が得られ得る。後期プレコンディショニングは、複数のストレス応答性遺伝子の同時活性化を要する多遺伝子性現象である。亜致死虚血性ストレス（例えば、ＮＯ、反応性酸素種およびアデノシン）により放出される化学的シグナルが、シグナル伝達事象の複雑なカスケードを引き起こす。これらの事象は、プロテインキナーゼＣ、Ｓｒｃタンパク質チロシンキナーゼおよび核因子κ−Ｂの活性化を含み、誘導性ＮＯシンターゼ、シクロオキシゲナーゼ−２、アルドースレダクターゼ、Ｍｎスーパーオキシドジスムターゼおよびおそらく他の心保護性タンパク質の合成の増大に至る。類似配列は、熱ストレス、運動およびサイトカインのような種々の刺激により引き起こされ得る。従って、概して後期プレコンディショニングは、ストレスに対する心臓の一般的な応答であると思われる。重要なことには、後期プレコンディショニングの心保護効果は、臨床的に関連する薬剤（例えば、ＮＯドナー、アデノシンレセプターアゴニスト、内毒素誘導体あるいはオピオイドレセプターアゴニスト）によって薬理学的に再現され得る。
しかし、脳および心臓の双方において、大脳あるいは心臓のいずれかのプレコンディショニングから生じる組織の保護が中等度でも、大きな梗塞は引き続き発現している。例えば、この組織の保護の中等量は、虚血前に処置が提供される場合は脳内のＴＮＦ−ＩＣＡＭ経路については２５〜３５％である（Ｆｕｒｕｙａ Ｋら、Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ ２００１ ３：２２６〜３２；Ｄａｗｓｏｎ ＤＡら、Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １９９９、６：６１６〜２３；およびＮａｗａｓｈｉｒｏ Ｈら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９７、７７８（２）：２６５〜７１）。
（ｂ）「気絶」組織：機能の１００％回復のための機構）
虚血性心組織の非収縮機能の回復現象は、１９８０年代、重度の虚血性心臓疾患患者の血管再生術の後に発見された（Ｃｏｏｐｅｒ ＨＡ、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ Ｅ．、Ｃｏｒｏｎ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓ ２００１ １２：３８７〜９２）。一過性亜致死傷害を有しつつも、経時的な完全回復の可能性を呈する心筋は、「気絶」心筋と呼ばれる。短時間の心筋気絶は、通常、冠状動脈バイパス術後にみられる。
「冬眠中の」心筋は、気絶と同様であるが、慢性低灌流あるいは反復性気絶のいずれかに起因し得る慢性の状態である。例えば、アンギナ患者の酸素要求量が増加する場合は、長期虚血が起こり、複数の虚血エピソードを生じ、これの系は、結果的に冬眠中の心筋をもたらす。筋細胞が慢性的に低灌流速度で供給される場合、その収縮能力を失うだけであり、死亡および壊死的分解には至らない。むしろ、ひとたびその循環が回復されると、これらの細胞は、数年の機能障害の後でさえ、その収縮特性を回復する。通常、回復は冬眠中組織より気絶組織においてより完全であり、冬眠中組織は、通常その塊の中に壊死的損傷の小さな島々を有する。
気絶心筋と冬眠中心筋とプレコンディショニングされた心筋との間の関係は、まだ明白に理解されていないが（Ｆｕｔｔｅｒｍａｎ ＬＧ、Ｌｅｍｂｅｒｇ Ｌ．、Ａｍ Ｊ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ ２０００ ９：４３０〜６）、脳内虚血経験の影響のように、イオン性および代謝性のグルタミン酸により制御される経路の双方を変え、その根底にある分子生物学は、おそらく多遺伝子性経路にならう。これらの変化される分子動態の経路は、種の違いを含む、改変時に存在する特定の状態依存性におそらく依存する（Ｋｉｍ ＳＪら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００１年１０月２６日；８９：８３１〜７）。
（ｃ）虚血モデル）
ＦＤＡ認可の血栓溶解剤が医学へ導入されてから、ｔＰＡのような組織プラスミノゲンアクチベータを使用して、脳卒中および心臓発作のモデルは、梗塞を生じる血管の長期閉塞から短期閉塞へと変化した。その閉塞の発生時と血栓溶解薬物および候補薬物の注入時との間の医学的に現実的な時間を模倣するために、ほとんどの動物モデルにおける閉塞時間は、２４時間から１〜２時間へと短縮されている（すなわち、その閉塞は、血栓溶解を模倣するために開放され、組織損傷は組織学的に２４時間でなくなる（ａｓｓ））。
虚血の心臓モデルの場合では、「プレコンディショニング」と呼ばれるコントロール群を新規薬物候補とこの非薬物保護とを比較するために参加させることが多い。「心臓プレコンディショニング」では、各動物において永久的な組織傷害を生じない短期虚血セッションの既往歴が認められる。この生理学的保護機構が、アデノシンレセプター関連およびｇ−タンパク質媒介性を呈することの証拠が認められる。
この「プレコンディショニング」による組織保護は、冠状動脈バイパスアログラフにおけるように、長期虚血の再確立後に起こる「心臓気絶」（非収縮組織の逆転）あるいは「心臓冬眠」（非収縮組織の部分的逆転）の組織保護に関連し得ると考えられる。気絶中組織と冬眠中組織との間の差異は、組織機能障害の任意の非逆転の有無である。
代表的に、プレコンディショニングコントロールは３０〜５０％の組織の保護を提供するのみであり、これは極限の梗塞サイズに影響を有する新規薬物について予測されたものよりも相当に低い。
短期閉塞であっても不可逆性傷害をいくらか引き起こすと想定される。例えば、１時間の閉塞により、組織傷害を逆転できる虚血容量で、領域外の組織がいくらか生じ得るが、このコア組織の中には、既に逆転できなくされ、最終的に壊死するものがある。
開示される分子および画分は、１時間閉塞が行われる動物（マウス−ＭＣＡＯ）の一部において、中心的コアでの逆転を含む、梗塞の１００％逆転を生じ得、従って、コア損傷 対 末梢損傷という問題が取り組まれるようである。開示される分子および画分による、１時間の閉塞の後の前処理により、１００％の組織の保護がその動物の全てにおいて２４時間観察された。関連分子の注射は、１時間の虚血の発生後８時間で注射される場合に効力を示す。マウスが要する注射物質量はラットのわずか１／２０であるため、マウスは、複数の研究についてより効率的である。
アッセイ工程が、大脳あるいは心筋の虚血のマウスＭＣＡＯモデルを用いる工程を包含する方法を開示する。また、アッセイ工程が、心筋あるいは大脳の虚血について冠動脈閉塞のラットモデルあるいはその他の動物モデル（例えば、哺乳動物モデル）を用いる工程を包含する方法を開示する。新血管形成、側副吻合がより広く開いて遮断された血管の遠位端を満たす、古い血管の再構築、虚血により蓄積した高レベルの副産物が、遠位の虚血組織および／または浸透誘導性細胞小器官に入るか、あるいは膜損傷が虚血組織において起こる、最灌流損傷の、動物モデルを利用する方法もまた開示され、そしてここで、任意の他の器官も虚血になるが、あるいは全ての器官および組織が一時的心停止（例えば、心室細動）あるいは血流閉塞（例えば、大動脈出力のクランプ）により誘導される全身虚血により虚血になる。より一般的な虚血（血管閉塞）／梗塞（壊死発生）モデルに付属的な他の種々のモデルがある。例えば、梗塞は、機械的強打による外傷、ヘビ毒による凝固障害などにより発生し得る。同様に虚血は、注入されたミクロスフィアなどにより遠位の小血管で作成されるアメロイド（ａｍｅｒｏｉｄ）収縮薬により緩徐に引き起こされ得る。さらにこれらのモデルは、遺伝子ノックアウト（例えば、心筋レセプター欠失）、生体挙動改変（例、精神的社会的ストレス）などのような全体的改変体により調節され得る。
Ｃ．組成物
抗梗塞特性を有する組成物を開示する。状態依存的方法が開示され、ここで、例えば、冬眠開始６週間後に抽出された中期冬眠画分および例えば、冬眠開始２週間後に抽出された初期冬眠画分から単離されアルブミン画分（例えば、ａｆｆｉ−ｂｌｕｅゲルカラム）が、初期と中期の冬眠状態との間に差示的に発現した９つのタンパク質および５つのペプチドを示した。この画分をタンパク質およびペプチドの亜画分にろ過（１０ｋＤａカットオフ）し、マウスＭＣＡＯモデルでの試験後にその双方が抗梗塞効果を生じることが示された。これらのペプチドの内、２つが差示的に上方調節されたことが示され、３つはＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりマトリクス人為産物として同定された。プロテオミクス「フィンガープリント」法および新規配列決定法を用いて、これらのペプチドをフィブリノペプチド−Ａ（ＦＰＡ）およびブラジキニンとして同定した。このＦＰＡ分子を、種々のＦＰＡフラグメントを合成することにより、マウスＭＣＡＯモデルで系統的に試験をした。Ｃ末端固定領域が、抗梗塞特性を有するＦＰＡの活性フラグメントであることを、当明細書中で開示する。合成したブラジキニンおよびＤｅｓ−Ａｒｇ−ブラジキニンもまた、マウスＭＣＡＯモデルにおいて抗梗塞特性を有することが示された。逆相カラムを用いて、さらなるペプチドを、Ｄ２対ＮＥ２の差示的画分で同定している（１０ｋＤａ未満のカットオフ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）。
開示される組成物は、本明細書中で開示する状態依存的方法を用いて単離され得るか、本明細書中で開示する状態依存的方法を用いて単離され得る分子に関連しているか、または本明細書中で開示する状態依存的特性を用いて単離され得る分子の機能を模倣する分子である。９つのタンパク質の差示的状態同定を生じる、初期冬眠と中期冬眠とを比較する技術方法を本明細書中で開示する。また、多くの異なる分子について、冬眠の下位状態と冬眠の下位状態前および下位状態中とを比較する状態依存的方法もまた開示する。これらの同定は、２Ｄゲル電気泳動法およびタンデムＬＣ／ＭＳ／ＭＳプロテオミク法という分子的方法を用いて達成されており、達成し得る。この状態依存的比較および分子的同定は、具体的には遺伝子アレイ比較、そして一般的には特定の状態依存性分子の同定に適したその他の比較技術のような多数の他の分子的技術を用いて成され得る。
本明細書中で開示する状態依存的方法を用いて動物から単離される分子を使用する場合に、その分子は種々の純度レベルで使用され得ることが理解される。例えば、その状態依存的方法は、サイズまたは電荷または疎水性などに基づいて画分され得る血漿を生成し得る。これらの手順またはその他の手順の１つまたは全てを、サンプルの比活性を増大させるために使用することができる。当明細書中で開示するように、ラットあるいはマウスのモデルにおける抗梗塞特性などの活性について、これら画分をモニタリングし得る。血液などの生体原材料は、初めに血漿に処理され得る。次いで血漿を種々の方法で精製できる。血漿は親和性マトリクス（例えば、青のａｆｆｉ、ゲル）を用いて精製できるが、このマトリクスは、アルブミン画分を他の血漿に基づく物質から分離する。次いで、このアルブミン画分は多数の方法を用いて精製され得るが、これらの方法では、例えば、孔径、ねじれ、電荷、分子量、疎水性および／または溶解性の違いを利用する。
次に、アルブミン画分を、例えば、カットオフ分子量が３．５ｋＤ、７ｋＤ、１０ｋＤ、１５ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、５０ｋＤ、７５ｋＤ、１００ｋＤ、１５０ｋＤあるいは２００ｋＤなどの分子ふるいあるいは膜を用いて、サイズに基づいて画分し得る。
（１．冬眠中動物の画分）
抗梗塞特性を有する、ウッドチャックなどの冬眠中の動物から単離される血漿画分を開示し、ここでこの画分は、冬眠開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０または４０日後に、あるいは冬眠からの最終覚醒の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０または４０日前に、冬眠中の動物から得る。抗梗塞特性を有するウッドチャックなどの冬眠中の動物から単離される血漿画分を開示し、ここでこの画分は、冬眠開始の１〜２５日後、５〜２０日後、１０〜１８日後または１４日後に、あるいは動物または全コロニーについて冬眠終了の２〜６週間前、３〜６週間前、４〜６週間前または５週間前に、冬眠中の動物から得る。
冬眠中の動物から単離される血漿画分を開示する。冬眠中の動物は、任意の冬眠中の動物であり得る。例えば、冬眠中の動物は、哺乳動物（例えば、地上性のリス、クマ、ウッドチャック（グラウンドホッグ）、マーモット、スカンク、コウモリ）、昆虫（例えば、蚊、ススメバチ、ミツバチ）、魚類（例えば、ゴンドウクジラ）、爬虫類（例えば、ヘビ、カメ）、両生類（例えば、カエル）あるいは鳥類（例えば、プーアウィル）であり得る。
血漿画分および虚血発生後何時間も抗梗塞効果を有する、それらの画分内で同定された分子を開示する。例えば、図６に示す結果は虚血６時間後の陽性結果と示す。透析されたＤ２画分は、虚血開始１時間後に注射される場合、ほとんどの被験体において結果としてゼロから最小の梗塞量を生じる。ウッドチャックのＦＰＡおよびヒトのＦＰＡに対して同一性を有する分子を開示する（図８）。げっ歯類（ウッドチャック、ラット、マウス）において見出された関連する状態依存性分子がヒトなどの交雑種において脳卒中予防に効果的に働くことを本明細書中で開示する。これは虚血（例、出生時虚血、亜致死運動時の相対的虚血、循環虚血、冬眠虚血など）期間中の生存に最も重要なので、この分子は進化の過程の間に哺乳動物種にわたって機能的に保存された可能性が高い。
分子を含む、冬眠中の動物の血漿の画分を開示し、ここで、この分子は抗梗塞活性を有し、そしてこの画分は冬眠開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４あるいは２５日後に動物の血液を収集することにより単離する。
また、冬眠開始の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日後に動物の血液を収集することにより単離される画分、あるいは冬眠開始の１４、１５または１６日後に動物の血液を収集することにより単離される画分、および冬眠開始の１５日後に動物の血液を収集することにより単離される画分、を開示する。
分子を含む冬眠中の動物の血漿の画分を開示するが、この分子は抗梗塞活性を有し、この画分は初期冬眠にある第一の動物の血液を収集することにより単離し、この画分は第二の動物が中期冬眠にある場合には第二の動物からの血液を含まない。
分子を含む冬眠中の動物の血漿の画分を開示するが、この分子は抗梗塞活性を有し、この画分はその動物の最終覚醒の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４あるいは２５日前に動物の血液を採取することによって単離する。
また、その動物の最終覚醒の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９あるいは２０日前に動物の血液を収集することにより単離される画分、その動物の最終覚醒の１４、１５または１６日前に動物の血液を収集することにより単離される画分、そしてその動物の最終覚醒の１５日前に動物の血液を収集することにより単離される画分を開示する。
また、分子を含む冬眠中の動物の血漿の画分を開示するが、この分子は抗梗塞活性を有し、この画分は後期冬眠にある第一の動物の血液を収集することにより単離し、第二の動物が中期冬眠にある場合には第二の動物からの血液を含まない。
抗梗塞活性が大脳の抗梗塞活性である画分、または抗梗塞活性が心臓の抗梗塞活性である、あるいは抗梗塞活性がその双方の抗梗塞活性である画分を開示する。
分子を含む冬眠中の動物の血漿の画分を開示するが、この分子は尿素リサイクル画分を誘導し、この画分は、冬眠開始の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４あるいは２５日後に動物の血液を収集することによって単離する。
また、尿素リサイクル活性を有する画分を開示するが、この画分は、冬眠開始の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９あるいは２０日後に、冬眠開始１４、１５あるいは１６日後に、および冬眠開始１５日後に、動物の血液を収集することによって単離する。
分子を含む冬眠中の動物の血漿の画分を開示するが、この分子は尿素リサイクルを誘導し、この画分は初期冬眠にある第一の動物の血液を収集することにより単離し、第二の動物が中期冬眠にある場合には第二の動物からの血液を含まない。
分子を含む冬眠中の動物の血漿の画分を開示するが、この分子は尿素リサイクルを誘導し、この画分はその動物の最終覚醒の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４あるいは２５日前に動物の血液を収集することによって単離する。
また、その動物の最終覚醒の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９あるいは２０日前に、動物の最終覚醒の１４、１５あるいは１６日前に、および動物の最終覚醒の１５日前に、動物の血液を収集することにより単離する画分を開示する。
分子を含む冬眠中の動物の血漿の画分を開示するが、この分子は尿素リサイクルを引き起こし、この画分は後期冬眠にある最初の動物の血液を収集することにより単離し、第二の動物が中期冬眠にある場合には第二の動物からの血液を含まない。
（２．抗梗塞分子の精製方法）
抗梗塞活性を有する分子の精製方法も開示し、この方法は、以下の工程を包含する：１）冬眠中の動物からサンプルを収集する工程、２）冬眠中の動物からコントロールサンプルを収集する工程、３）このサンプルとこのコントロールサンプルを比較する工程。
抗梗塞活性を有する分子の精製方法を開示し、この方法は、以下の工程を包含する：１）冬眠中の動物からサンプルを収集する工程、２）冬眠中の動物から第二サンプルを収集する工程、３）このサンプルとこの第二サンプルを比較する工程。
抗梗塞活性を有する分子の精製方法を開示し、この方法は、以下の工程を包含する：１）冬眠中の動物からサンプルを収集する工程、２）異なる下位状態にある冬眠中の動物から第二サンプルを収集する工程、３）このサンプルとこの第二サンプルを比較する工程。
抗梗塞活性を有する分子の以下の精製方法を開示し、この方法は、以下の工程を包含する：１）第一の時点で冬眠中の動物から当サンプルを収集する工程、２）第一の時点とは異なる冬眠中の動物から第二サンプルを収集する工程、３）このサンプルとこの第二サンプルを比較する工程。
抗梗塞活性を有する分子の精製方法を開示し、この方法は、以下の工程を包含する：１）冬眠中の動物から血液サンプルを収集する工程、２）冬眠中の動物から第二血液サンプルを収集する工程、３）この血液サンプルと第二血液サンプルを比較する工程。
また、サンプルと第二サンプルとを比較する工程が、このサンプルと第二サンプルにおける遺伝子発現をアッセイする工程を包含する方法、およびサンプルと第二サンプルとを比較する工程がサンプルと第二サンプルにおけるタンパク質発現をアッセイする工程を包含する方法を開示する。
上記サンプルおよび第二サンプルを血液、尿、髄液、脳脊髄液、組織、器官または細胞から得る場合の方法を開示する。
動物が地上性のリス、クマ、ウッドチャック、マーモット、スカンクまたはコウモリなどの哺乳動物である場合の方法を開示する。
上記血液サンプルを初期あるいは後期の冬眠にある動物から得た場合の方法を開示する。
第二サンプルを中期冬眠にある動物から得た場合の方法を開示する。
上記サンプルを冬眠開始１〜２５日後の動物から得た場合の方法を開示する。
第二サンプルを冬眠開始２６〜６０日後の動物から得た場合の方法を開示する。
比較工程が差示的に制御された分子を同定する工程を包含する場合およびその差示的に制御された分子が第二サンプルと比べて当サンプルにおいて異なる量で存在する場合の方法を開示する。
差示的に制御された分子の同定が当サンプルと第二サンプルを画分する工程を包含する場合の方法を開示する。
また、その画分が１０ｋＤＡ以下の分子を収集することにより起こる場合の方法を開示する。
その画分が当血液サンプルおよび第二サンプルにおける分子を、電荷、疎水性、親水性、親油性、ねじれ、分子量、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ペプチドアフィニティークロマトグラフィー、炭水化物アフィニティークロマトグラフィーまたは溶解性により分離する工程を包含する場合の方法を開示する。
そのアフィニティー分離がａｆｆｉ−ｇｅｌ ｂｌｕｅクロマトグラフィーを使用する工程を包含する場合の方法を開示する。
同定がサンプルをＧＣ質量分析、ゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーによるサンプル分析を包含する場合あるいはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ質量分析（質量分析器と並行する液体クロマトグラフィー）を標準操作を用いて行う場合の方法を開示する。
高速液体クロマトグラフィーが逆相クロマトグラフィーを含む場合およびゲルクロマトグラフィーが二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む場合の方法を開示する。
その方法がさらに、精製された差示的に制御された分子をもつその差示的に制御された分子を精製する工程を包含する場合の分子を開示する。
その方法がさらに、その精製された差示的に制御された分子の抗梗塞活性をアッセイする工程を包含する場合の方法を開示する。
そのアッセイ工程が、脳虚血のマウスＭＣＡＯモデルを使用する工程を包含する場合の方法を開示する。また、新血管形成、リモデリング、再灌流傷害および全身虚血試験のモデルを利用する方法を開示する。
抗梗塞活性が脳性抗梗塞活性である場合および抗梗塞活性が心臓性抗梗塞活性である場合の方法を開示する。
３．フィブリノゲンＡ（ＦＰＡ）
ａ）ＦＰＡ分子の構造
ＦＰＡは、トロンビンによるフィブリノゲンの開裂時に放出される可溶性フィブリノゲンの画分である。フィブリン（Ｆｂｎ）を形成するためにトロンビン（ＩＩａ）触媒の可溶性フィブリノゲン（Ｆｂｇ）の開裂は、その凝固カスケードにおける終末のタンパク質分解事象である。これらの可溶性Ｆｂｎモノマーは自発的に重合化し不溶性Ｆｂｎネットワークを形成するが、このネットワークはａ鎖およびｇ鎖のリジンおよびグルタミン酸の残基の第ＸＩＩＩａ因子触媒の架橋により安定化される。このＦｂｎネットワークは止血性プラグの主要なタンパク質構成要素である。
血漿フィブリノゲンは約３４０，０００ｋｄの糖タンパク質であり、肝臓内で合成される。これは、濃度２．６ｍｇ／ｍｌで動物において循環する。これは、３対のジスルフィド結合の非同一性ポリペプチド鎖（Ａａ、Ｂｂおよびｇ）で構成されるジスルフィド結合ダイマーから成る。
ＦＰＡはＡａ鎖のＮ末端であり、第ＸＩＩＩａ因子架橋部位および二つのリン酸化部位を含む。Ｆｂｇは一般的に合成後十分にリン酸化されるが、わずか２０〜３０％のリン酸化で循環する。Ｒ１６〜Ｇ１７での開裂によるＦＰＡの放出によりＦｂｎ Ｉが生じ、Ａａ鎖上でリン酸化部位（１７〜２０）を曝露する。これらの領域はＦｂｎのＤドメイン上の相補性領域と結合し、プロトフィブリルを形成する。Ｂｂ鎖から続くＦＰＢ（Ｒ１４〜Ｇ１５）のＩＩａ開裂はさらなるリン酸化部位を曝露し、Ｆｂｎネットワークの側方成長を促進する。従って、代表的にＦＰＡはＮ末端アミノ酸をトロンビンの開裂部位まで構成し、代表的にＲ〜Ｇ開裂部位で起こる。よって、ＦＰＡを定義づける方法の一つは、トロンビンの開裂部位により、従って、相対系である。代表的に、その開裂部位のＮ末端に１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９あるいは２０個のアミノ酸が存在する。従って、ＦＰＡの相対位置を議論する一つの方法は、開裂部位に対してＮ末端の３つのアミノ酸あるいは開裂部位に対してＮ末端の７つのアミノ酸のように、開裂部位からみた位置を議論することである。例えば、ウッドチャックのＦＰＡにおいて、配列ＡＥＧは開裂部位に対して末端のそれぞれ７、６および５つのアミノ酸であろう。
ＦＰＡを含むフィブリノゲン画分の構造は、例えばトロンビンによって解明およびモデリングされている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７ｐｐ． ７９１１（１９９２年）；Ｓｔｕｂｂｓ，Ｍ．Ｔ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０６ｐｐ．１８７（１９９２年）；Ｍａｒｔｉｎ．Ｐ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５ｐｐ．１３０３０（１９９６年）；Ｍａｌｋｏｗｓｋｉ．Ｍ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３２６ｐｐ．８１５（１９９７年））。これらの構造はＦＰＡの構造上の模倣および抗梗塞特性のようなＦＰＡの機能を保持する改変体を見出すために使用できる。例として、トロンビンのＦＰＡの小領域との接触が知られている（例えば、ＧＥＦＬＡＥＧＧＧＶ）。この小領域は抗梗塞特性を有することが知られている。従って、この小領域の模倣を、トロンビンによりモデリングし、そして既知の小領域トロンビン座標と所定の小領域との接触と比較することによって単離され得る。同様の方法でトロンビンを結合する分子が、抗梗塞特性などのヒトＦＰＡおよびヒトＦＰＡフラグメントの同じ特性を有すると予測されると思われるのは、それらが既知のＦＰＡアッセイであるトロンビン結合において等価を示すからである。本明細書中で開示するように、この情報はまた、ＦＰＡの特性を有する分子を単離するコンビナトリアル化学技術およびスクリーニング手順と関連づけられ得る。例えば、分子はある種の結合アッセイにおいてトロンビンと結合され得、次いでこれらの分子はＦＰＡまたはそのフラグメントと競い失われ得る。この競合的な結合アッセイにおいて収集される分子はＦＰＡに類似した結合特性を有する分子を産出するであろうが、これにより抗梗塞活性などの同様の機能特性が生まれる。
本明細書中で考察するように、種々のＦＰＡ配列が存在することが理解される。例えば、異なる種々の動物から得られ得るＦＰＡ配列がある。また、冬眠中の動物から得られ得る配列がある。表１に異なる種々の動物からのＦＰＡ配列を例示する。配列は比較可能で、本明細書中で考察するような同一性パーセントは標準技法を用いて、いかなる配列についても得ることができる。さらに、コンセンサス配列は本明細書中で考察される技術を用いて得られる。これらの開示配列のいかなる比較も同一性パーセントを生むために行われ得、特定の同一性とともに具体的に開示されることが理解される。例えば、ヒトとウッドチャックは１５位の４で異なる。これにより、ヒトＦＰＡとウッドチャックＦＰＡとの間に約７４％の同一性が生じる。特定のフラグメントがその同一性についても比較され得ることが理解される。例えば、開裂部位に最も近い１０個のアミノ酸を含むフラグメント（ＧＥＦＬＡＥＧＧＧＶ）においてヒトとウッドチャックとの間で異なるものは１つのアミノ酸だけであり、このフラグメントについてヒトとウッドチャックとの間の同一性が９０％であることが示される。このタイプの分析はいかなるＦＰＡ配列についても実施することができる。
本明細書中で開示するように、ヒトＦＰＡはラットモデルにおいて機能する。ヒトとラットのＦＰＡには１１／１５の差異があり、同一性が１３％であることを示す。しかし、３、４および８位が高度に保存され、ラットにおいても保存されていることが注目される。従って、開裂部位に対するＮ末端の３、４および８位にそれぞれＧ、ＧおよびＦを保持する配列が開示されるが、これにより他の変異が起こり得る。以下は本明細書中で開示する特定のＦＰＡ誘導体であり、マウスＭＣＡＯモデルにおいて試験を行うことができる。表１にＦＰＡ配列番号を示す。配列は１〜５位で変化し、６〜１０位であまり変化せず、１１〜１６位で１００％の相同性を示す。
用量は、例えば血漿の５ｍｇ／ｋｇ有効用量は血漿５ｍｇ／ｋｇの１／１０００であるような場合に、０．００５ｍｇ／ｋｇのファーモカフォア（ｐｈａｒｍｏｃａｐｈｏｒｅ）で同定し得る。０．００５ｍｇ／ｋｇのｄｅｓ−ａｒｇ−ＢＫが機能した。
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
開裂を受ける基質におけるアミノ酸残基は、開裂される結合からＮ末端方向にある指定のＰ１、Ｐ２、Ｐ３あるいはＰ４などである。開裂はＰ１とＰ１’との間で起こり、Ｐ１はＦＰＡ分子におけるアミノ酸アルギニンから成り、Ｐ１’はアミノ酸Ｃ末端を元（オリジナル）のフィブリノゲン分子におけるアルギニンに指定する。
ｂ）ＦＰＡおよび血栓症
ＦＰＡは凝固反応の副産物分子であり、トロンビンとフィブリノゲンが相互作用して不溶性フィブリン（血餅）および遊離ＦＰＡを形成する場合に生じる。通常、遊離ＦＰＡはフィブリン形成の良好なマーカーとみなされる（Ｏｔｔａｎｉ Ｆ，Ｇａｌｖａｎｉ Ｍ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２００１年９月 １５；３１１（１）：３３〜９．）。ＦＰＡはフィブリノゲン分子のＮ末端に位置し、開裂時に血餅形成を引き起こす。凝固反応が起こるのは、ＦＰＡがフィブリノゲンに付着する間にトロンビンがＦＰＡ可変領域上にドッキングする場合である。このドッキングは３位のセリンのリン酸化反応に助長されて起こる（Ｍａｕｒｅｒ ＭＣら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８年４月 ２８；３７（１７）：５８８８〜９０２）。ひとたびＦＰＡが開裂されると、残ったフィブリノゲンの結合を露出して、他のフィブリノゲン分子の他の曝露されたペプチドと架橋し長いフィブリン鎖を形成する。ＦＰＡレベルを測定し臨床的病状のマーカーとして用いることが出来る。ＦＰＡは、急性心筋梗塞患者において上昇し、血液凝固のＸＩおよびＩＸ因子の活性化によって上昇するが、当因子はフィブリノゲンのトロンビン活性化に関与する（Ｍｉｎｎｅｍａ ＭＣら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２０００年１１月；２０（１１）２４８９〜９３））。第ＸＩＩ因子はフィブリノゲンからのＦＰＡ開裂を補助することで凝固を引き起こす（Ｚｉｔｏ Ｆら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０００年１０月２４日；１０２（１７）：２０５８〜６２）。プロトロンビンフラグメント（ｆ１．２）は、心臓および脳の双方におけるＦＰＡおよび虚血事象に伴って増加する（Ｃｏｔｅ Ｒら、Ｓｔｒｏｋｅ ２０００年８月；３１（８）１８５６〜６２）。尿中ＦＰＡは胸痛をもつ緊急治療患者において上昇し、死亡率上昇の危険を伴う（Ｓｏｎｅｌ Ａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０００年９月５日；１０２（１０）１１０７〜１３）。
動物研究によりＦＰＡ相関を調べている。ウサギでは、ＦＰＡの可変領域の末端である７位（Ｔｈｒ）における進化的修正が、ヘビ毒由来のトロンビン様酵素であるＨａｂｕｔｏｂｉｎの作用がＦＰＡを開裂し致死性凝固を沈殿させるのを防ぐ（Ｎｅｊｉｍｅ Ｔら、Ｔｏｘｉｃｏｎ ２０００年８月；３８（８）：１０２９〜４１）。凝固経路全体においてプロトロンビンの上流で作用する組織因子（ＴＦ）は凝固を仲介するようであるが、この凝固は単離されたウサギの心臓における虚血／再灌流モデルにおいて生じる（Ａｒｍａｇａｎｉａｎ Ｌら、Ｃｏｒｏｎ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓ ２０００年９月；１１（６）：４８１〜７）。
ＦＰＡと血栓溶解は関連している（血餅溶解）。Ｄダイマー分子は不溶性フィブリンの血栓溶解転換（すなわち、血餅溶解作用）の結果として生成され、ＦＰＡの有意な上昇のみられない急性および慢性の脳卒中患者においてこの分子が増加することが証明されている（Ｉｎｃｅ Ｂら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ １９９９年１１月１日；９６（３）：１６９〜７４）。しかし、プラスミノーゲンを生みプラスミンに変換し、Ｄダイマーを形成する線維素溶解の発生を促す組織プラスミノーゲン活性化因子を注射することにより、血栓溶解はＦＰＡの顕著な増加を引き起こす。この増加はヘパリンによるトロンビン阻害中に起こり得る（Ｆａｓｓｂｅｎｄｅｒ Ｋら、Ｓｔｒｏｋｅ １９９９年１０月；３０（１０）：２１０１〜４）。ＦＰＡは凝固が起こらなければどうにか増加でき、血栓溶解はＦＰＡレベルが変化しなければどうにか起こり得るが、通常は組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ’ｓ）が注射されるとＦＰＡが増加し血栓溶解が起こる。
血栓溶解中のＦＰＡの上昇は、そのリン酸化の状態に関連している可能性がある。高分子量のフィブリノゲン（すなわち、３位セリンがリン酸化されているもの）はプロトロンビン的であるのは、リン酸化がトロンビンのこの分子へのドッキングを助長し、上述のように、ＦＰＡの補助的開裂を引き起こすからである（Ｍａｕｒｅｒ ＭＣら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９８年４月２８日；３７（１７）：５８８８〜９０２）。高分子量のフィブリノゲンは急性心筋梗塞患者における付加的冠動脈虚血事象に最も関連している（Ｒｅｇａｎｏｎ Ｅら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １９９９年１１月；８２（５）：１４０３〜５）。フィブリノゲンのリン酸化はプロトロンビン的状態を引き起こすため、このことは意味を成す。
血栓症は血栓溶解に相反するものであるが、双方が一緒に起こるときに予想外の結果が生じる。循環において見られるフィブリノゲンはＴＰＡ処理の２０〜３５時間後に９５％リン酸化され、これにより閉塞した冠動脈血管が開通される。しかし、リン酸化されたＦＰＡフラグメントおよびＨＭＷフィブリノゲンはどちらも血栓溶解処理後に冠動脈の開存を示さない患者において上昇する（Ｒｅｇａｎｏｎ Ｅら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １９９３年１２月２０日；７０（６）：９７８〜８３）。ここで暗示されているのは、血栓溶解がうまくいくと、遊離ＦＰＡの３位セリンのリン酸化がどうにか低下するが、これはその遊離状態においてもフィブリノゲンとの結合時においても起こる。従って、これらはＦＰＡのリン酸化を含む血栓症に対する血栓溶解の負のフィードバックであると思われる。よって、非リン酸化の遊離ＦＰＡは抗血栓性を呈すると考えられる。
４．ブラジキニン
ａ）ブラジキニン構造
ブラジキニンは、その他のＤ２対ＮＥ２特定的上方調節ペプチドである。ブラジキニンは、１９０９年に発見され、以下のような既に報告されている既知の効果を有する。１）心血管効果（すなわち、血管収縮）、２）感覚痛知覚（レセプター活性化因子）、および３）血液凝固（すなわち、プロトロンビン経路上での活性化による）。
ブラジキニンは炎症誘発性ペプチド（ＲＰＰＧＦＳＰＦＲ）であり、酵素カリクレインによりキニノゲンから放出される。また、ブラジキニンは強力な血管拡張剤であり、種々の種類の血管外平滑筋（例えば、気管支の）のコントラクターであり、血管透過性向上の誘発物質である。それはまた、炎症の主徴である疼痛を引き起こす。
本明細書中で考察されるように、ブラジキニンは種々の配列を有することが理解される。例えば、種々の動物から得られ得るブラジキニンの配列がある（例えば表２を参照）。また、冬眠中の動物から得られ得る配列がある。表２に種々の動物から得られるブラジキニンの配列および合成配列を例示する。これらの配列は比較され、本明細書中で考察するような同一性パーセントは標準技術を用いていかなる配列についても得られる。さらに、コンセンサス配列は本明細書中で考察する技術を用いて得られ得る。同一性パーセントを生み出すために行われ得るこれらの開示配列の任意の比較が、特定の同一性とともに具体的に開示されることが理解される。例えば、ニジマスＦＰＡとウッドチャックＦＰＡは１０位中４位で異なる。これによりニジマスとウッドチャックとの間に約６０％の同一性が生じる。また、特定のフラグメントがその同一性についても比較され得ることが理解される。例えば、開裂部位（ｒｐｐｇｆｓｐｆ）に最も近い１０個のアミノ酸から成るフラグメントは、ニジマスとウッドチャックとの間で２つのアミノ酸について異なるが、これはヒトとウッドチャックとの間でこのフラグメントについて８０％の同一性を呈することを示唆する。このタイプの分析はいかなるＦＰＡ配列についても行うことが出来る。
本明細書中で開示するように、例えばウッドチャックＦＰＡのＣ末端などの開示される抗梗塞分子はラットあるいはマウスのモデルにおいて機能する。
表２には多くのブラジキニン分子と改変体および表（ＢＫ）を示す。ＢＫの抗梗塞特性はＢ９３４０などのＢＫに関連する分子により機能し、アミノ酸のアナログをもつＢＫの他の誘導体あるいは他の化学的置換基がその分子に取り込む。ＢＫの抗梗塞特性は、例えば梗塞のＭＣＡＯマウスモデルを用いて、本明細書中に示されるように記載され得る。
表２ ブラジキニンおよび例示的改変体
当配列は同一性を有し、この同一性は本明細書中で記載されるように同定できる。
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン３’カルボン酸
Ｏｉｃ＝オクタヒドロインド２’カルボン酸
Ｔｈｉ＝β−［２−チエニル］アラニン
Ｈｙｐ＝ヒドロキシプロリン
ブラジキニンの抗梗塞特性は、抗梗塞活性を有するブラジキニンに関連する分子により機能し得る。例えば、ｄｅｓ−ａｒｇ−ＢＫはＢＫ自体と同様のあるいはそれより高い活性を有する。ｄｅｓは側鎖を表す。例えば、ｄｅｓ−Ａｒｇ９はＣ末端Ａｒｇのないブラジキニンを指す。
ｂ）ブラジキニンの機能的アナログ
種々のブラジキニンの改変体があり、その多くを表２に示す。これらの改変体の多くは、その中に非標準アミノ酸誘導体を有する。例えば、アナログＣｅｒｅｐｏｒｔ（ＲＭＰ−７あるいはロブラダミルとしても知られる）（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｉ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（Ｍｅ）―ｐｓｉ（ＣＨ２ＮＨ）−Ａｒｇ、配列番号９０）、リジルブラジキニン（Ｎ末端リジンが付加されたブラジキニン）、Ｃ末端リジンが付加されたブラジキニン、７−メトキシクマリン−４−アセチル［Ａｌａ７−（２，４−ジニトロフェニル）Ｌｙｓ９］−ブラジキニントリフルオロ酢酸塩（ＭＯＣＡｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＤＮＰ、配列番号９１）、Ｄ−Ａｒｇ−［Ｈｙｐ３，Ｄ−Ｐｈｅ７，Ｌｅｕ８］−ブラジキニン（Ｄ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ、配列番号９２）、Ｄ−Ａｒｇ−［Ｈｙｐ３，Ｄ−Ｐｈｅ７］−ブラジキニン（Ｄ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ヒドロキシ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ、配列番号９３）、Ｄ−Ａｒｇ−［Ｈｙｐ３，Ｔｈｉ５，８，Ｄ−Ｐｈｅ７］−ブラジキニン（Ｄ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ヒドロキシ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ｂ−（２−チエニル）Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−ｂ−（２−チエニル）Ａｌａ−Ａｒｇ、配列番号９４）、およびＬｙｓ−（ｄｅｓ−Ａｒｇ９，Ｌｅｕ８）−ブラジキニントリフルオロ酢酸塩（ｄｅｓ（Ａｒｇ１０、Ｌｅｕ９）−カリジンＨ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、配列番号９５）が存在する。
ブラジキニンの環状アナログは安定性および活性の向上などの所望の特性を有し、特定の活性を向上させる。ブラジキニンの環状アナログは、米国特許第４，１８７，２１７号で開示され、少なくともブラジキニン改変体に関連する物質について、本明細書中に参考として援用される。環状ブラジキニン改変体の一例を図１８に示す。また、多くのブラジキニン改変体があり、それらは非ペプチド性結合および非アミノ酸アナログを含む。（例えば、米国特許第５，１６２，４９７号は、少なくともブラジキニンおよびブラジキニン改変体に関連する物質について、本明細書中に参考として援用される。）
また、ブラジキニンのように機能する多様なブラジキニンの改変体および分子があり、それらはブラジキニンの機能的アナログなどであり、例えば、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．ＸＸＶ．Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ、Ｋａｌｌｉｄｉｎ ａｎｄ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ．Ｅｄ．Ｅ．Ｇ．Ｅｒｄｏｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７０年、１〜７６８ページにおいて認められ、少なくとも機能的ブラジキニンアナログに関連する物質について、本明細書中に参考として援用される。
５．抗梗塞特性
ＦＰＡやＦＰＡ関連の分子（例えば、Ｃ末端、１１マー）あるいはブラジキニンやブラジキニン関連の分子（例えば、ＤＥＳ−ａｒｇ−ブラジキニン）または本明細書中に開示する他の任意の抗梗塞分子の抗梗塞特性は、コントロールと比べて、梗塞量の減少を特徴づけることによりアッセイされ得る。マウスＭＣＡＯモデルを用いて、虚血事象後の梗塞組織量が決定され得る。梗塞量はアッセイされ得るが、虚血事象後の梗塞量が少ないほど、梗塞を防ぐあるいは取り消す時の試験分子は強力である。例えば、平均梗塞量は総組織量のパーセントとして決定され得る。１１マー ＦＰＡフラグメントについての平均梗塞量は１８．５％であったが、それはコントロールの５４．７％と比べると著しく低い（ｐ＜０．０００１）。ＦＰＡ誘導体について試験を行った多くの異なる動物の梗塞量の範囲は０〜４４％であったのに比べて、コントロールでは３４〜７１％であった。ＢＫの平均梗塞量は３３．２％であったが、ｄａＢＫで１７．０％、Ｃ末端と結合するｄａＢＫで１８．０％であった。ＢＫおよびｄａＢＫの混合群についての平均梗塞量（２５．２％）は、コントロールについての５４．７％と比べて統計的に有意である（ｐ＜０．００３）。より効果的なｄａＢＫの平均梗塞量が９〜２７％であったのに比べて、コントロールでは３４〜７１％であった。
従って、所定の分子の抗梗塞効力を決定する一つの方法は、この分子が投与される時に認められる平均梗塞量に対するコントロールの平均梗塞量（例えば、分子あるいはキャリアがない）の梗塞比を得ることである。この梗塞比での梗塞量はそれ自体、総組織量に対する梗塞組織量の比（ａ％梗塞組織）である。これらの量は本明細書中で開示するように決定され得る。従って、ＦＰＡやＢＫや誘導体などの抗梗塞分子は、その梗塞比が１より大きいあるいは１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、５００、１０００、２，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００以上になる分子になり得る。これは、所定の試験についての平均量あるいは絶対量を見ることによって決定され得る。分子が抗梗塞分子かどうかを決定する別の方法は、この分子投与後のＭＣＡＯマウスモデルに認められる梗塞量の絶対量を単に見ることである。例えば、ＦＰＡやＢＫやそれらの誘導体などの抗梗塞分子が開示されるが、それらは、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２あるいは１％以下の梗塞量を示す。これは単一試験から平均量または絶対量のいずれかとして同定され得る。
６．状態依存性を用いて同定される組成物
本明細書中で開示されるのは、特定の生理学的状態に関連する分子の同定方法である。この開示方法は、状態が極めて緊密に、例えば、時間、生理学、特性と関連している時に機能することが確認されている。本明細書中で考察されている一例は、冬眠中の動物において認められ得る抗梗塞活性に関連する分子の同定である。同定方法は、冬眠中画分と非冬眠中画分を比較するのではなく、最も近い近接する冬眠中の画分を比較して差異を確認する方法を含む。この最も近い近接する概念は多くの異なる生理現象に適用され得る。これにより、下位状態内、下位状態および最も近い近接する下位状態の所見が可能になる。例えば、冬眠、摂食行動、睡眠、催眠、ロッキング動作妊娠、重力加速度、無重力、性交、食後の多幸感、双極性などの精神病的エピソード、日光曝露と例えばそれによって生じる多幸感、暗明周期と例えばそれによって生じる憂鬱、運動、高圧状態、あるいはストレス関連状態は、全て下位状態および最も近い近接した状態である。
心拍、血圧、呼吸率、ＥＥＧあるいは眼球運動など、種々のモニターし得る生理現象がある。これらはいかなる方法を用いても測定し得る。これらのタイプの状態を採取および分析する一つの方法は、非線形の改良点相関次元（ＰＤ２ｉ）アルゴリズムを使用する方法である。長年、線形確率論的アルゴリズム（標準偏差、パワースペクトルなど）による心拍変動性（ＨＲＶ）の測定が心臓病の入院患者の不整脈性の死亡を予測するために使用できることが知られていた。しかし、予測性（すなわち、感受性、特異性あるいは相対危険性の統計値）が極めて良好ではなかったため、当アルゴリズムは臨床的に個々の患者に有用ではなかった。米国特許番号第５，７２０，９２４号および同第５，７０９，２１４号は、非線形決定論アルゴリズムＰＤ２ｉによるＨＲＶの分析が線形確率的解析より予測性が極めて高かったことを示す（少なくともＰＤ２ｉアルゴリズムの使用に関連する物質について、本明細書中に参考として援用される）。
従って、ＰＤ２ｉの分析手段は決定論的で、データにおいて生じる変動に基づく。それは定常性を要さず、実際に当データにおいて非定常性変化をたどり、無秩序および線形データの非無秩序に感受性を示す。この分析手段は、集団的な、相関次元を推定するためのアルゴリズムである以前の分析手段に基づき、データの非定常性に感受性を示さない。この特性により、このＰＤ２ｉにより臨床転帰の予測を高い感受性と特異性をもって行えるが、他の手段では不可能である。この予測性は、ノイズ考察（Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ）アルゴリズム（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｋｉｎｎｅｒ、２００３年）により向上し得る。この非線形アルゴリズムは成功的であると考えられているが、それは生物体において経時的に起こる状態の変化を追うことができるからである。ほとんどの確率論的手段はデータ定常性を要するが、それはデータの作成者が作成中に状態を変えることが出来ないことを意味する。すなわち、その確率論的特性を変えられない（平均値、標準偏差およびその他のパラメータは同値のままでなければならない）。しかし、一連の生物学的データは常に状態を変える。全てでなくてもほとんどの生物学的データに特有のデータ非定常性の問題を解決することにより、不整脈性の死亡のＰＤ２ｉ予測が現在臨床的に有用である。本明細書中において、ＰＤ２ｉアルゴリズムあるいは類似性アルゴリズムを取り込んだこのデバイスを、状態と下位状態との間の生理学的データを検出するために使用できることが開示される。これらのデバイスは生じる状態（すなわち、下位状態）のわずかな変化を確認するために使用できる。すなわち、それらを二つの下位状態を定義する状態内の生理学的差異を確認するために使用できる。これらの下位状態は標的分子の放出に関連し得る。
ａ）「最も近い近接した下位状態の方法」
最も近い近接した下位状態の方法は、二つの異なる状態、すなわち、下位状態が以前の状態内に含まれると認識されることの認識により特徴づけられる。例えば、冬眠状態において、本明細書中に開示されるのは、例えば徐脈に関連して起こる二つの異なる下位状態があり、それらが梗塞に対抗する分子を同定するために用いられていることである。突然の覚醒により結果的に死亡率が上昇する冬眠の状態中に下位状態がある。最も近い近接する下位状態は、覚醒が死亡率の上昇を引き起こさないときの冬眠における１時点である。死亡を誘発する、最も近い近接した下位状態を有する下位状態、あるいは死亡を誘発しないコントロールの比較により、極めて特定的な分子の比較が行われるが、それは生理現象に関連する。
従って、「状態」は、睡眠対覚醒、空腹対満腹、病気対健康などのような、バイナリーコンディションとして考えられ得る。一つの下位状態は、一つの状態の中の一つのコンディションとして特徴づけられ、同定され、さらに細かい状態に別けられる。その決定的な生理現象あるいは行動は、一つの下位状態をコントロールである全体的な状態の中の別の下位状態とは別個でなければならない。これらの下位状態が分子差異を同定するプロテオミクスおよびゲノミクス技術と組み合わせられる時に、生理学的に関連する分子が同定され得る。本明細書中に示すようなこのアプローチにより、多くの分子差異の確認が可能となり、特定の場合には生理現象に関連する全ての差異を確認できる。
ｂ）異なるタイプの状態
生理学的下位状態は、抗梗塞分子が存在する下位状態に加えて、冬眠などのより大きな全体的な状態を支持するために過渡的に存在する。例えば、排尿しない妊娠している冬眠中のクマは成長する胎仔のために益々多くの複合体分子を作るため、血中尿素の蓄積に対処する基礎的生理機能を有し、それによって自身の尿毒症毒性を予防しなければならない。本明細書中で開示するように、生理学的データは、正常覚醒実験ラット（１、２あるいは３ｍｇ／ラット）に注射した二重標識された尿素が冬眠に関連する分子画分（すなわち、２０ｍｇ／ｋｇでのＤ２、Ｄ０１）の静脈内注射により亢進され得、単一標識された尿素（すなわち、「リサイクル」尿素）を形成する。冬眠関連分子画分の注射後３時間で、個々の動物のバックグラウンドの超過平均は、コントロールに比べて、約５０％であり（静脈内投与、Ｘｅｎｏアルブミン、２０ｍｇ／ｋｇ）（ｐ＜０．０２５）、注射後６時間でさらに有意になる（ｐ＜０．０１）。注射後６時間で最大に亢進したリサイクル率は尿素リサイクル率の１３倍上昇を超過することが認められた。
７．開示される組成物とのスクリーニングによって同定される組成物／コンビナトリアルケミストリー
ＦＰＡおよびブラジキニンが抗梗塞特性を有する事実は、ＦＰＡとブラジキニンが相互作用するものの知識を、特定のアッセイにおいてＦＰＡおよびブラジキニンのように機能する分子を同定するのに使用できることを意味すること、よってＦＰＡとブラジキニンが開示される梗塞モデルにおいて試験され得、その活性を決定され得ることが理解される。例えば、ＦＰＡとトロンビンについて得られる結合情報は、ＦＰＡのようにトロンビンと結合する分子を単離するのに利用され得、よってこれらは開示される梗塞モデルにおいて試験され得る。例えば、ＦＰＡの拮抗インヒビターを単離する選択実験およびトロンビン結合を開示する。従って、抗梗塞分子を作る種々の方法があり、なかには合成分子によって作られ得る分子やスクリーニング方法により単離され得る分子などもある。
また、種々の分子が単離され得ることが理解されるが、いくつか名前を挙げるならば、タンパク質改変体、抗体、機能的核酸、およびペプチド擬態物質などである。これらとその他の分子の考察が続くが、後者には抗梗塞特性のようなＦＰＡおよびブラジキニンを有するものとして同定され得る小分子などがある。ＦＰＡおよびブラジキニンが全てのＦＰＡおよびブラジキニンの改変体および誘導体をそれぞれ指すことが理解される。すなわち、それらの改変体および誘導体は、ＦＰＡおよびブラジキニンに対するある程度の同一性を有する。しかし、ＦＰＡおよび／またはブラジキニンのように機能する分子は１つのアミノ酸を持たず、基礎構造はいわゆる抗梗塞分子であり、ＦＰＡ活性あるいはブラジキニン活性などの特定の特性を有する。
抗梗塞分子あるいは抗梗塞分子の改変体を合成する工程を包含する抵抗梗塞分子を作る方法が、開示される。その方法において抗梗塞分子は、１）冬眠中の動物から血液サンプルを採取する工程、２）冬眠中の動物から第二血液サンプルを採取する工程、３）血液サンプルを第二血液サンプルと比較する工程を包含する方法によって精製され得るが、ここでの血液サンプルは冬眠開始後２５日以内に、第二血液サンプルは冬眠開始後２５日より後に採取したものであり、抗梗塞分子は第二血液サンプルより血液サンプルにおいて多く存在するものである。
抗梗塞分子あるいは抗梗塞分子の改変体を合成する工程を包含する抵抗梗塞分子を作る方法が、開示される。その方法において抗梗塞分子は、１）冬眠中の動物から血液サンプルを採取する工程、２）冬眠中の動物から第二血液サンプルを採取する工程、３）血液サンプルを第二血液サンプルと比較する工程、を包含する方法によって精製され得るが、ここでの血液サンプルは冬眠終了前２５日以内に、第二血液サンプルは冬眠開始後２５日より後に、ただし冬眠終了２５日前より以前に採取したものであり、抗梗塞分子は第二血液サンプルより血液サンプルにおいて多く存在するものである。
１分子を１つのマウスＭＣＡＯモデルへ投与する工程から構成される抗梗塞分子を同定する方法、その分子の抗梗塞活性とマウスＭＣＡＯモデルにおけるＦＰＡの抗梗塞活性とを比較する工程、およびその分子の抗梗塞活性がＦＰＡ活性の少なくとも２０％である場合の分子を選択する工程がまた、開示される。
ブラジキニンとアンジオテンシンＩＩレセプターとの間の相互作用のインヒビターを同定する方法が、開示される。この方法は、以下の工程を包含する：アンジオテンシンＩＩ２型レセプターを発現する細胞をブラジキニンの存在下で推定インヒビターと接触させる工程；アンジオテンシンＩＩ２型レセプターに結合されるブラジキニン量を検出し、ここで、アンジオテンシンＩＩ２型レセプターに結合するブラジキニンの減少によりインヒビターを同定する工程。
ブラジキニンとアンジオテンシンＩＩ２型レセプターとの間の相互作用のインヒビターを同定する方法が開示される。この方法は、以下の工程を包含する：アンジオテンシンＩＩ２型レセプターを発現する細胞をブラジキニンの存在下で推定インヒビターと接触させ、ここでアンジオテンシンＩＩ２型レセプターは蛍光ドナーを含み、ブラジキニンは蛍光アクセプターを含む工程：蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定し、ここで推定インヒビターと接触しない細胞のＦＲＥＴ測定と比較した場合のＦＲＥＴの低下がインヒビターの存在を示す工程。
ブラジキニンとアンジオテンシンＩＩ２型レセプターとの間の相互作用のインヒビターを同定する方法が開示される。この方法は、以下の工程を包含する：細胞系を推定インヒビターと接触させ、ここで細胞系はアンジオテンシンＩＩ２型レセプターを含み、細胞系はブラジキニンを含み、アンジオテンシンＩＩ２型レセプターは蛍光ドナーを含み、ブラジキニンは蛍光アクセプターを含む工程：細胞系と推定インヒビターを接触させる前および細胞系と推定インヒビターを接触させる後の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定し、ここで推定インヒビターが推定インヒビターと接触するときの細胞系におけるＦＲＥＴの低下がインヒビターを同定する工程。細胞系は、本明細書中に開示するように機能化およびアッセイするために必要な構成要素を含む細胞をいう。
梗塞のインビボモデルにおける同定されたインヒビターを試験する工程、および動物モデルの梗塞を減少させる分子を選択する工程が開示される。
推定インヒビターが分子ライブラリの中で見出される方法が、開示される。
アンジオテンシンＩＩ２型レセプターを調節する抗梗塞分子についてのスクリーニング方法が開示される。この方法は、以下の工程を包含する：アンジオテンシンＩＩレセプターを発現することが公知の梗塞の動物モデルを外因性ブラジキニンの非存在下で推定抗梗塞分子と接触させる工程：梗塞をアッセイする工程；梗塞の非存在をアンジオテンシンＩＩレセプターを調節するブラジキニンの抗梗塞擬態物質の存在と関連づける工程。
アンジオテンシンＩＩ２型レセプターを調節する抗梗塞分子についてのスクリーニング方法が開示される。この方法は、以下の工程を包含する：アンジオテンシンＩＩレセプターを発現することが公知の梗塞の動物モデルをブラジキニンの非存在下で推定抗梗塞分子と接触させる工程；梗塞の非存在または存在を検出する工程；および梗塞の非存在をアンジオテンシンＩＩレセプターを調節する抗梗塞分子の存在と関連づける手段から成る。
推定抗梗塞擬態物質がアンジオテンシンＩＩレセプターのアゴニストあるいはアンタゴニストである方法が、開示される。
推定抗梗塞分子を同定する方法が開示される。この方法は、以下の工程を包含する：アンジオテンシンＩＩ２型レセプターを発現する細胞を推定抗梗塞分子とブラジキニン存在下で接触させる工程；ブラジキニンのアンジオテンシンＩＩ２型レセプターとの結合の低下を検出する工程；ブラジキニンのアンジオテンシンＩＩ２型レセプターとの結合低下を抗梗塞分子の存在と関連づける工程。
これらの方法をブラジキニンとアンジオテンシンＩＩ２型レセプターとの間の相互作用のインヒビターを見出すために使用し得ることが理解される。
推定抗梗塞分子を同定する方法が開示される。この方法は、以下の工程を包含する：蛍光ドナーと機能的に関連するアンジオテンシンＩＩ２型レセプターを発現する細胞を蛍光アクセプターおよび推定抗梗塞分子と機能的に関連するブラジキニンとを接触させる工程；蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定し、ここで推定抗梗塞分子と接触しない細胞におけるＦＲＥＴ測定と比較したＦＲＥＴの低下が抗梗塞分子の存在を示す工程。
開示される方法は、例えば虚血の動物モデルにおける単離された化合物あるいは組成物を試験する工程をさらに包含し得ることが理解される。例えば、単離された分子の存在下で起こる梗塞量は計測可能で、その分子の非存在下に存在する梗塞量と比較することができる。本明細書中に開示されるように、動物モデルはまた、本明細書中に開示されるように抗梗塞分子を新たに単離するために使用され得る。特に動物モデルは、推定抗梗塞分子を例えばブラジキニンまたはＦＰＡあるいはその改変体または誘導体と競合的に比較するために使用され得る。
開示される方法はまた、活性組成物または化合物をスクリーニングするために分子ライブラリとともに使用されえる。代表的に、この方法は、本明細書中で開示されるように、ライブラリがスクリーニングされるとき、活性分子を非活性分子から単離する工程を用いる。
梗塞を減少させる必要がある被験体を処置する方法が、開示される。この方法は、開示される方法を用いて単離された分子の有効量を投与する工程を包含する。
開示される方法が、脳梗塞、心筋梗塞または他のタイプの梗塞のために実行し得ることが理解される。
壊死組織領域である梗塞が種々の方法で発生し得るが、代表的に梗塞は虚血すなわち組織領域への酸素の減少により生じることが理解される。万が一、酸素欠乏およびその後の再灌流が起こると、壊死組織が生じ得る。開示される方法は、再灌流および／または酸素欠乏により起こる梗塞などの虚血事象の作用を低下するようにデザインされる。これらのタイプの事象は例えば、脳卒中の間に起こり、虚血を引き起こす脳組織あるいは心臓発作などの脳事象において血管閉塞が認められ、ここで冠動脈閉塞が虚血を引き起こす。
虚血治療は代表的に閉塞の減少を含む。例えば、ニトログリセリンは虚血を処置する（詰まった冠血管を正常より少し広げ、虚血による狭心症の痛みを消失させる）。血流抑制は虚血を引き起こす。マウスＭＣＡＯモデルは虚血を発生させ、代表的に２４時間後に梗塞が起こる段階を設定する。血流が注射時に再確立されているとき、梗塞が予防／処置されると、その結果、開示される組成物および組織はもはや虚血を呈さない。抗梗塞分子は「神経保護剤」と呼ばれることがある。ＦＰＡあるいはブラジキニンの抗梗塞活性を有し得る種々の異なるタイプの分子がある。例示的な化合物を本明細書中で考察する。
ａ）機能的核酸
機能的核酸は、標的分子の結合あるいは特異的な反応を触媒するといった特異的な機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は以下のカテゴリーに分けられ得、制限的であることを意味しない。例えば、機能的核酸としてアンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子および外部ガイド配列が挙げられる。機能的核酸分子は標的分子が有する特異的な活性の影響因子、インヒビター、モジュレーターおよび刺激物質として作用し得る、または機能的核酸分子は他のいかなる分子にも独立して新しい活性を所有することが出来る。
機能的核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドあるいは糖鎖などのいかなる高分子とも相互作用することが出来る。従って、機能的核酸は、ＦＰＡまたはブラジキニンあるいはそれらがトロンビンまたはそのフラグメントなどと相互作用する分子のｍＲＮＡと、あるいはＦＰＡまたはブラジキニンあるいはそれらがトロンビンまたはそのフラグメントなどと相互に作用する分子のゲノムＤＮＡと、あるいは機能的核酸は、ポリペプチドＦＰＡまたはブラジキニンあるいはそれらがトロンビンまたはそのフラグメントなどと相互作用する分子と相互作用できる。機能的核酸が、標的分子と機能的核酸分子との間の配列相同性に基づき他の核酸と相互作用するようデザインされることが多い。他の状況において、機能的核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能的核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づかないが、むしろ生じるであろう特異的認識が可能になる三次構造の形成に基づく。
アンチセンス分子は、標準的または非標準的な塩基対形成のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するようデザインされる。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えばＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解によって、標的分子の破壊を促進するようデザインされる。代わりに、アンチセンス分子は、転写または複製などの標的分子に正常に起こるプロセシング機能を妨害するようデザインされる。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいてデザインされ得る。標的分子の最もアクセス可能な領域を見つけることによってアンチセンス有効性の最適化を図る方法は多数存在する。例示的な方法は、インビトロ選択実験およびＤＭＳおよびＤＥＰＣを用いるＤＮＡ修飾研究である。アンチセンス分子が、１０−６未満の解離定数（ｋｄ）で標的分子と結合することが好ましい。アンチセンス分子が、１０−８未満のｋｄで標的分子と結合することが、より好ましい。また、アンチセンス分子が１０−１０未満のｋｄで標的分子と結合することもまた、より好ましい。アンチセンス分子が１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することもまた、好ましい。アンチセンス分子のデザインおよび使用時において役立つ方法および技術の代表的サンプルは、次の米国特許番号の非限定的な列挙において見つけることができる：第５，１３５，９１７号、第５，２９４，５３３号、第５，６２７，１５８号、第５，６４１，７５４号、第５，６９１，３１７号、第５，７８０，６０７号、第５，７８６，１３８号、第５，８４９，９０３号、第５，８５６，１０３号、第５，９１９，７７２号、第５，９５５，５９０号、第５，９９０，０８８号、第５，９９４，３２０号、第５，９９８，６０２号、第６，００５，０９５号、第６，００７，９９５号、第６，０１３，５２２号、第６，０１７，８９８号、第６，０１８，０４２号、第６，０２５，１９８号、第６，０３３，９１０号、第６，０４０，２９６号、第６，０４６，００４号、第６，０４６，３１９号および第６，０５７，４３７号。
アプタマーは、好ましくは特定の方法で、標的分子と相互作用する分子である。代表的に、アプタマーは、ステムループまたはＧ−ｑｕａｒｔｅｔｓなどの明確な二次構造および三次構造に組み込まれた長さが１５〜５０塩基にわたる小さな核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許番号第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許番号第５，５８０，７３７号）などの小分子ならびに逆転写酵素（米国特許番号第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許番号第５，５４３，２９３号）などの大分子を結合できる。アプタマーは１０−１２Ｍ未満の標的分子からのｋｄｓで非常に密接に結合できる。アプタマーが１０−６未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーが１０−８未満のｋｄで標的分子と結合することが、より好ましい。アプタマーが１０−１０未満のｋｄで標的分子と結合することもまた、より好ましい。アプタマーが１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することがまた、好ましい。アプタマーは、極めて高い特異性で標的分子と結合できる。例えば、標的分子とその分子の単一位においてのみ異なる別の分子との間の結合アフィニティーに１００００倍を超える差異を有するアプタマーが、単離されている（米国特許番号第５，５４３，２９３号）。そのアプタマーが、バックグラウンド結合分子とのｋｄの１／１０以下の標的分子とのｋｄを有することが、好ましい。そのアプタマーが、バックグラウンド結合分子とのｋｄの１／１００以下の標的分子とのｋｄを有することが、より好ましい。アプタマーが、バックグラウンド結合分子とのｋｄの１／１０００以下の標的分子とのｋｄを有することが、さらに好ましい。そのアプタマーが、バックグラウンド結合分子とのｋｄの１／１０００以下の標的分子とのｋｄを有することが、好ましい。例えばポリペプチドについて比較を行う場合、バックグラウンド分子が異なるポリペプチドであることが好ましい。例えばＦＰＡまたはブラジキニンあるいはそれらがトロンビンまたはそのフラグメントなどのアプタマーと相互作用する分子の特異性を決定する場合、そのバックグラウンドタンパク質は血清アルブミンであり得る。種々の異なる標的分子を結合するアプタマーの作製および使用の方法の代表例は、次の米国特許番号の非限定的列挙において見つけることができる：第５，４７６，７６６号、第５，５０３，９７８号、第５，６３１，１４６号、第５，７３１，４２４号、第５，７８０，２２８号、第５，７９２，６１３号、第５，７９５，７２１号、第５，８４６，７１３号、第５，８５８，６６０号、第５，８６１，２５４号、第５，８６４，０２６号、第５，８６９，６４１号、第５，９５８，６９１号、第６，００１，９８８号、第６，０１１，０２０号、第６，０１３，４４３号、第６，０２０，１３０号、第６，０２８，１８６号、第６，０３０，７７６号および第６，０５１，６９８号。
リボザイムは、分子内的にあるいは分子間的のいずれかで、化学反応を触媒することができる核酸分子である。よって、リボザイムは触媒的核酸である。リボザイムが分子間反応を触媒することが、好ましい。天然の系において見出されるリボザイムに基づく、ヌクレアーゼまたは核酸のポリメラーゼ型反応を触媒するリボザイムには多くの異なるタイプがあり、ハンマーヘッド型リボザイム（例えば、以下の米国特許：第５，３３４，７１１号、第５，４３６，３３０号、第５，６１６，４６６号、第５，６３３，１３３号、第５，６４６，０２０号、第５，６５２，０９４号、第５，７１２，３８４号、第５，７７０，７１５号、第５，８５６，４６３号、第５，８６１，２８８号、第５，８９１，６８３号、第５，８９１，６８４号、第５，９８５，６２１号、第５，９８９，９０８号、第５，９９８，１９３号、第５，９９８，２０３号、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ９８５８０５８、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ９８５８０５７ならびにＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ９７１８３１２が挙げられるが、これらに限定されない）、ヘアピン型リボザイム（例えば、以下の米国特許：第５，６３１，１１５号、第５，６４６，０３１号、第５，６８３，９０２号、第５，７１２，３８４号、第５，８５６，１８８号、第５，８６６，７０１号、第５，８６９，３３９号および第６，０２２，９６２号が挙げられるが、これらに限定されない）、およびテトラヒメナ型リボザイム（例えば、以下の米国特許：第５，５９５，８７３号および第５，６５２，１０７号が挙げられるが、これらに限定されない）などがある。また、天然の系において認められない多くのリボザイムがあるが、新たに特異的な反応を触媒するように作られている（例えば、以下の米国特許：第５，５８０，９６７号、第５，６８８，６７０号、第５，８０７，７１８号および第５，９１０，４０８号が挙げられるが、これらに限定されない）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡまたはＤＮＡの基質を開裂し、より好ましくは、ＲＮＡ基質を開裂する。代表的にリボザイムは、標的基質の認識および標的基質とその後の開裂との結合により核酸基質を開裂する。この認識のほとんどが標準的あるいは非標準的な塩基対相互作用に基づいていることが多い。この特性によりリボザイムが核酸の特異的な標的開裂の特にふさわしい候補となるのは、この標的基質の認識が標的基質配列に基づいているからである。種々の異なる反応を触媒するリボザイムの作製および使用の方法の代表例は、次の米国特許番号の非限定的な列挙において見つけることができる：第５，６４６，０４２号、第５，６９３，５３５号、第５，７３１，２９５号、第５，８１１，３００号、第５，８３７，８５５号、第５，８６９，２５３号、第５，８７７，０２１号、第５，８７７，０２２号、第５，９７２，６９９号、第５，９７２，７０４号、第５，９８９，９０６号および第６，０１７，７５６号。
三重鎖形成機能的核酸分子は、二本鎖または一本鎖の核酸のいずれかと相互作用し得る分子である。三重分子が標的領域と相互作用するとき、三重鎖と呼ばれる構造が形成されるが、ここでワトソン・クリックおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎの双方の塩基対に依存する複合体を形成するＤＮＡの３本の鎖がある。三重分子が好ましいのは、高い親和性および特異性をもって標的領域と結合できるからである。三重鎖形成分子は１０−６未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。三重鎖形成分子は１０−８未満のｋｄで標的分子と結合することが、さらに好ましい。三重鎖形成分子が１０−１０未満のｋｄで標的分子と結合することもまた、より好ましい。また、三重鎖形成分子が１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することも好ましい。種々の異なる標的分子を結合する三重鎖形成分子の作製および使用の方法の代表例は、次の米国特許番号の非限定的な列挙において見つけることができる：第５，１７６，９９６号、第５，６４５，９８５号、第５，６５０，３１６号、第５，６８３，８７４号、第５，６９３，７７３号、第５，８３４，１８５号、第５，８６９，２４６号、第５，８７４，５６６号および第５，９６２，４２６号。
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、標的核酸分子と結合して複合体を形成する分子であり、この複合体はＲＮＡｓｅ Ｐに認識され、標的分子を開裂する。ＥＧＳは選り抜きのＲＮＡ分子を特定的に標的とするようデザインされ得る。ＲＮＡｓｅ Ｐは細胞内でトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセスする手助けをする。細菌ＲＮＡｓｅ Ｐは、標的ＲＮＡを生むＥＧＳを用いることにより実質的に任意のＲＮＡ配列を開裂するために補充され得る：天然のｔＲＮＡ基質を模倣するＥＧＳ複合体。（Ｙａｌｅ，ａｎｄ Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ、ＷＯ９２／０３５６６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：４０７〜４０９（１９９０年）による。）
同様に、真核生物のＲＮＡのＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ Ｐ方向開裂は、真核細胞の中の所望の標的を開裂するために利用され得る。（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８００６〜８０１０（１９９２年）；ＹａｌｅによるＷＯ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ９５／２４４８９；Ｙｕａｎ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎ、Ｊ １４：１５９〜１６８（１９９５年）、およびＣａｒｒａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７〜２６３１（１９９５年））。種々の異なる標的分子の開裂を促進するＥＧＳ分子の作製および使用の方法の代表例は、次の米国特許番号の非限定的な列挙において見つけることができる：第５，１６８，０５３号、第５，６２４，８２４号、第５，６８３，８７３号、第５，７２８，５２１号、第５，８６９，２４８号および第５，８７７，１６２号。
（ｂ）コンビナトリアルケミストリー）
開示される組成物は、所望の方法で開示される組成物と相互作用する分子または高分子を同定する任意のコンビナトリアル技術のための標的として使用され得る。本明細書中で開示する核酸、ペプチドおよび関連分子はコンビナトリアルアプローチのために標的として使用され得る。また、コンビナトリアル技術またはスクリーニング技術により同定される組成物が開示されるが、表１または表２で開示される組成物あるいはその一部分で、コンビナトリアルプロトコルまたはスクリーニングプロトコルにおいて標的として用いられるか、表１または表２の配列と相互作用する組成物あるいはその一部分はコンビナトリアルプロトコルまたはスクリーニングプロトコルにおいて標的として用いられる。
コンビナトリアル技術またはスクリーニング法において開示される組成物を使用するときに、高分子などの分子が阻害または刺激などの特定の所望の特性あるいは標的分子の機能を有すると確認されるであろうことが理解される。表１または表２で開示される組成物あるいはその部分、あるいは表１または表２の配列と相互作用する組成物などの開示される組成物を使用するとき、同定および単離される分子がまた、開示される。従って、表１または表２で開示される組成物あるいはその一部分、あるいは表１または表２の配列と相互作用する組成物などの開示される組成物を含むコンビナトリアルアプローチまたはスクリーニングアプローチを用いて作られる生成物がまた、開示されると考えられる。
コンビナトリアルケミストリーとしては、典型的に反復プロセスにおいて、小分子またはもう一つの高分子のいずれかと結合することができる小分子あるいは高分子を単離するための全ての方法（が挙げられるが、これらに限定されない）。タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび糖は高分子の例である。例えば、触媒またはリガンド結合という既知の機能をもつオリゴヌクレオチド分子は、「インビトロ遺伝学」と呼ばれるものにおいて、ランダムオリゴヌクレオチドの複雑な混合物から単離され得る（Ｓｚｏｓｔａｋ、ＴＩＢＳ １９：８９、１９９２年）。ランダム（な配列および規定された）配列ならびに混合物、例えば、１００μｇの１００ヌクレオチドＲＮＡにおける約１０１５の個々の配列を選択および濃縮のプロセスまで複合体化する被験体を生む分子の大きなプールが合成される。カラム上のリガンドに結合する分子のアフィニティークロマトグラフィーおよびＰＣＲ増幅を繰り返し行うことによって、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０年）は、１０１０ＲＮＡ分子のうち一つは小分子色素と結合するような方法で折り重なったことを推定した。同様のリガンド結合行動をもつＤＮＡ分子も、同様に単離された（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ、１９９２年；Ｂｏｃｋら、１９９２年）。同様の目標に向けられた技術が、小有機分子、タンパク質、抗体および当業者に公知のその他の高分子についても存在する。所望の活性のための分子のスクリーニングセットは、小有機ライブラリ、オリゴヌクレオチドまたは抗体に基づき、広くコンビナトリアルケミストリーと呼ばれる。コンビナトリアル技術は、分子間の結合相互作用の定義づけ、および特異的な結合活性を有する分子の単離に特に適しており、高分子が核酸であるときにアプタマーと呼ばれることが多い。
タンパク質を単離する方法は数多くあり、新規の活性あるいは修正された活性のいずれかを有する。例えば、ファージディスプレイライブラリは特異的な標的と相互作用する数多くのペプチドを単離するのに使用されていた。（例えば、ファージディスプレイに関連する物質およびコンビナトリアルケミストリーに関連する方法について本明細書中において少なくとも参考として、本明細書中で援用される、米国特許番号第６，０３１，０７１号、同第５，８２４，５２０号、同第５，５９６，０７９号、および同第５，５６５，３３２号を参照のこと。）
既知の機能を有するタンパク質を単離するための好ましい方法は、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋが記述している（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ． ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２３）１２９９７〜３０２（１９９７年））。このコンビナトリアルケミストリー方法は、タンパク質の機能的能力と核酸の遺伝的能力を合わせる。１つのＲＮＡ分子は、ｐｕｒａｍｙｃｉｎ分子がＲＮＡ分子の３末端と共有結合するところで生成される。この修飾されたＲＮＡ分子のインビトロ翻訳により補正タンパク質が生じ、それはＲＮＡによりコードされて翻訳される。さらに、延長が不可能なペプチジルアクセプターであるｐｕｒａｍｙｃｉｎの付着により、成長するペプチド鎖はｐｕｒａｍｙｃｉｎに付着し、それはＲＮＡに付着する。従って、タンパク質分子はそれをコード化する遺伝的物質に付着する。正常なインビトロ選択手順は、現在、機能的ペプチドを単離するために行われ得る。一旦ペプチド機能についてのその選択手順が完了すると、選択された機能的ペプチドのためにコードする核酸を増幅させるために従来の核酸操作手順が行われる。遺伝的物質の増幅後、新たなＲＮＡがｐｕｒａｍｙｃｉｎで３位において転写され、新たなペプチドが翻訳され、機能についての選択がもう１回行われる。従って、タンパク質選択は、核酸選択技術と全く同じような相互作用様式で実施され得る。翻訳されるペプチドは、ｐｕｒａｍｙｃｉｎに付着しているＲＮＡの配列により制御される。この配列は、最適な翻訳のために作り上げられたランダム配列からのいかなる配列（すなわち、非終止コドン（ｎｏ ｓｔｏｐ ｃｏｎｄｏｎ）など）あるいは既知のペプチドの改良または変更された機能を探す既知のＲＮＡ分子の縮重した配列であり得る。核酸増幅およびインビトロ翻訳のための条件は当事者が周知であり、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋのように好ましく行われる（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４（２３）１２９９７〜３０２（１９９７年））。
ペプチドを単離するようデザインされたコンビナトリアル方法のもう一つの好ましい方法は、Ｃｏｈｅｎらが記述している（Ｃｏｈｅｎ Ｂ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（２４）：１４２７２〜７（１９９８年））。この方法は、二重ハイブリッド技術を利用および修正する。酵母二重ハイブリッドシステムは、タンパク質の検出および分析に有用である：タンパク質相互作用。この二重ハイブリッドシステムは酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに最初に記載されたが、目的のタンパク質に対して特異的な新たな調節分子を同定するための強力な分子的遺伝的技術である（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５〜６（１９８９年））。Ｃｏｈｅｎらがこの技術を修正したため、合成的な作り出されたペプチド配列間の新規の相互作用が選抜された分子と結合することが確認出来た。このタイプの技術の利点は、選択が細胞内環境において行われることである。この方法は、１つの酸性の活性ドメインに付着するペプチド分子のライブラリを利用する。選抜されたペプチドは、例えば、表１もしくは表２で開示する組成物またはその一部分あるいは表１や表２の配列と相互作用する組成物またはその一部分の細胞外部分が、Ｇａｌ ４などの転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに付着する。このタイプのシステムにおいて二重ハイブリッド技術を実行することによって、ＦＰＡまたはブラジキニンあるいはそれらが相互作用する例えば、分子（トロンビンまたはそのフラグメントなど）と結合する分子が同定され得る。
当業者に周知の方法論を種々のコンビナトリアルライブラリと組み合わせて使用して、所望の標的と結合または相互作用するそれらの小分子または高分子が単離されかつ特徴づけられ得る。これらの化合物の相対的な結合親和性が比較可能で、最適化合物が競合的総合研究を用いて同定され得ることは、当業者に周知である。
分子を単離するためのコンビナトリアルライブラリおよびスクリーニングコンビナトリアルライブラリを作製するための技術は、所望の標的を結合し、当業者に周知である。代表的な技術および方法は、以下の米国特許において見つけることができるが、これらに限定されない：第５，０８４，８２４号、第５，２８８，５１４号、第５，４４９，７５４号、第５，５０６，３３７号、第５，５３９，０８３号、第５，５４５，５６８号、第５，５５６，７６２号、第５，５６５，３２４号、第５，５６５，３３２号、第５，５７３，９０５号、第５，６１８，８２５号、第５，６１９，６８０号、第５，６２７，２１０号、第５，６４６，２８５号、第５，６６３，０４６号、第５，６７０，３２６号、第５，６７７，１９５号、第５，６８３，８９９号、第５，６８８，６９６号、第５，６８８，９９７号、第５，６９８，６８５号、第５，７１２，１４６号、第５，７２１，０９９号、第５，７２３，５９８号、第５，７４１，７１３号、第５，７９２，４３１号、第５，８０７，６８３号、第５，８０７，７５４号、第５，８２１，１３０号、第５，８３１，０１４号、第５，８３４，１９５号、第５，８３４，３１８号、第５，８３４，５８８号、第５，８４０，５００号、第５，８４７，１５０号、第５，８５６，１０７号、第５，８５６，４９６号、第５，８５９，１９０号、第５，８６４，０１０号、第５，８７４，４４３号、第５，８７７，２１４号、第５，８８０，９７２号、第５，８８６，１２６号、第５，８８６，１２７号、第５，８９１，７３７号、第５，９１６，８９９号、第５，９１９，９５５号、第５，９２５，５２７号、第５，９３９，２６８号、第５，９４２，３８７号、第５，９４５，０７０号、第５，９４８，６９６号、第５，９５８，７０２号、第５，９５８，７９２号、第５，９６２，３３７号、第５，９６５，７１９号、第５，９７２，７１９号、第５，９７６，８９４号、第５，９８０，７０４号、第５，９８５，３５６号、第５，９９９，０８６号、第６，００１，５７９号、第６，００４，６１７号、第６，００８，３２１号、第６，０１７，７６８号、第６，０２５，３７１号、第６，０３０，９１７号、第６，０４０，１９３号、第６，０４５，６７１号、第６，０４５，７５５号、第６，０６０，５９６号および第６，０６１，６３６号。
コンビナトリアルライブラリは、広範に並んだ分子から多くの異なる合成技術を用いて作られ得る。例えば、融合２，４−ピリミジンジオン（米国特許番号第６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピラン（米国特許番号第６，０１７，７６８号および同第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許番号第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシアミノ酸アミド（米国特許番号第５，９７２，７１９号）、炭水化物（米国特許番号第５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許番号第５，９６２，３３７号）、サイクリック（米国特許番号第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許番号第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許番号第５，９４２，３８７号）、三環式テトラヒドロキノリン（米国特許番号第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許番号第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許番号第５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントイン（米国特許番号第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許番号第５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドールおよびイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェン（米国特許番号第５，８５６，１０７号）、置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許番号第５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許番号第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許番号第５，８３１，０１４号）、タグ含有物（米国特許番号第５，７２１，０９９号）、ポリケチド（米国特許番号第５，７１２，１４６号）、モルホリン−サブユニット（米国特許番号第５，６９８，６８５号および同第５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許番号第５，６１８，８２５号）、およびベンゾジアゼピン（米国特許番号第５，２８８，５１４号）を含むライブラリ。
ＦＰＡ結合の阻害についてトロンビンに類似するスクリーニング分子は、所望の化合物を単離する方法である。
本明細書中で使用されるように、コンビナトリアル方法およびコンビナトリアルライブラリとしては、従来のスクリーニングの方法およびライブラリおよび反復プロセスにおいて使用される方法およびライブラリなどが挙げられた。
ｃ）コンピュータ補助ドラッグ・デザイン
開示される組成物は、開示される組成物の構造の同定または小分子などの潜在的または実際的な分子のいずれかの同定のための任意の分子モデリング技術についての標的として使用され得、所望の方法で開示される組成物と相互作用する。本明細書中で開示される核酸、ペプチドおよび関連分子は任意の分子モデリングのプログラムまたはアプローチにおいても標的として使用可能である。
モデリング技術において開示する組成物を使用する時に、高分子などの分子が阻害または刺激などの特定の所望の特性あるいは標的分子機能を有することが確認されると理解される。表１または表２に開示する組成物またはその一部分あるいは表１または表２の配列またはその一部分と相互作用する組成物などの開示する組成物を使用する時に同定および単離される分子も開示する。従って、表１または表２に開示する組成物またはその一部分あるいは表１または表２の配列またはその一部分と相互作用する組成物などの開示する組成物を含む、分子モデリング・アプローチを用いて作られる生成物も本明細書中で検討および開示する。
従って、目的の分子を結合する分子を単離する一つの方法は、合理的なデザインによる。これは構造的情報およびコンピュータ・モデリングにより達成される。コンピュータ・モデリング技術により選択分子の三次元原子構造および分子と相互作用する新規化合物の合理的デザインの可視化が可能になる。この三次元作成物は選択分子のＸ線結晶解析あるいはＮＭＲイメージングからのデータに一般的に依存する。分子動力学は力場データを要する。コンピュータグラフィックス・システムにより、どのように新規化合物が標的分子と結合するのかの予測および結合の特異性を完全にする化合物と標的分子の構造の実験的操作が可能になる。分子−化合物の一方あるいは双方が少し変化する時のそれらの相互作用の予測には分子力学ソフトウェアおよびコンピュータ的に集約的なコンピュータが必要であり、通常はユーザーフレンドリーな、分子デザイン・プログラムとユーザーとの間のメニュー方式のインターフェイスで連結されている。
分子モデリング・システムの例はＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡのプログラム、Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡである。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー極小化および分子動力学的機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構成、グラフィックのモデリング、および解析を行う。ＱＵＡＮＴＡは相互作用的な構成、修正、可視化および分子各々の行動分析を行う。
以下のように、多くの文献が特定のタンパク質と相互作用的な薬剤のコンピュータ・モデリングを概説している。Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８ Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｆｅｎｎｉｃａ ９７，１５９〜１６６；Ｒｉｐｋａ，Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ５４〜５７（１９８８年６月１６日）；ＭｃＫｉｎａｌｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ，１９８９ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９，１１１〜１２２；Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ．１８９〜１９３（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ． １９８９）；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｄｅａｎ， １９８９ Ｐｒｏｃ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． ２３６，１２５〜１４０および１４１〜１６２；および、核酸組成物のモデル酵素に関して、Ａｓｋｅｗら、１９８９ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１，１０８２〜１０９０。化学物質をスクリーニングし図示するその他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ．Ｉｎｃ．Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ．，Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＣａｎａｄａおよびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏなどの会社から入手できる。これらは主として特定のタンパク質に特有の薬剤に適用するようデザインされているが、ひとたびＤＮＡあるいはＲＮＡの特定の領域が同定されると、その領域と特異的に相互作用する分子のデザインに適合し得る。
結合を変化させることができる化合物のデザインおよび生成に関して上述したが、基質結合あるいは酵素活性を変化させることができる化合物について、天然産物あるいは合成化学物質などの既知の化合物およびタンパク質などの生物学的に活性な物質のライブラリのスクリーニングも可能である。
ｄ）抗体
（１）抗体の概要
本明細書中の用語「抗体」は広義で用いられており、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方を含む。インタクトの免疫グロブリン分子に加えて、用語「抗体」には、それらの免疫グロブリン分子のフラグメントあるいはポリマーおよび免疫グロブリン分子あるいはそのフラグメントのヒトまたはヒト化バージョンも含まれるが、それはＦＰＡやブラジキニンまたはそのフラグメントを模倣するそれらの能力によりそれらが選択される限りであり、例として本明細書中で開示するＦＰＡやブラジキニンまたはそれらのフラグメントの抗梗塞特性などが挙げられる。その抗体は、その所望の活性を本明細書中に記載するインビトロアッセイあるいは類似方法により試験されることが出来るが、その後にそのインビボの治療的および／または予防的な活性が既知の臨床検査方法に従って試験される。抗体の機能的等価物も開示する。
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」は、抗体の実質的に同質な集団から得た抗体を指す。すなわち、その集団内の個々の抗体は抗体分子の小サブセットに存在し得る自然に起こり得る突然変異を除いて同一である。本明細書中のモノクローナル抗体は具体的に「キメラの」抗体を含む。そこでは、それらが所望の拮抗的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種に由来するあるいは特定の抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である一方、その鎖の残りはもう一つの種に由来するあるいはもう一つの抗体のクラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、それはそのような抗体のフラグメントについても同様である（米国特許番号第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４年）を参照）。
開示するモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を作成するいかなる手順を用いても作り得る。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５年）が記述したようなハイブリドーマ方法を用いて作成できる。ハイブリドーマ方法では、一般的にマウスやその他の適切な宿主動物は、特異的に免疫剤に結合する抗体を作成するあるいは作成することが出来るリンパ球を誘発する免疫剤で免疫される。
また、モノクローナル抗体は、米国特許番号第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）に記載されているような組み換えＤＮＡ方法により作成できる。開示するモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは従来の手順を用いて容易に単離し配列決定することが出来る（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド・プローブを使用することにより）。抗体あるいは活性抗体フラグメントのライブラリも、例えばＢｕｒｔｏｎらに対する米国特許番号第５，８０４，４４０号およびＢａｒｂａｓらに対する米国特許番号第６，０９６，４４１号に記載されているように、ファージディスプレイ技術を用いて作成およびスクリーニングすることが出来る。
インビトロ方法も一価抗体を作成するのに適している。特にＦａｂフラグメントであるが、フラグメントを作成する抗体の消化は、当事者が既知の慣用技術を用いて成し遂げることが出来る。例えば、消化はパパインを用いて実施できる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８および米国特許番号第４，３４２，５６６号に記載されている。一般的に、抗体のパパイン消化は、各フラグメントが単一の抗原結合部位を有するＦａｂフラグメントおよび残留Ｆｃフラグメントと呼ばれる二つの同質の抗原結合フラグメントを作成する。ペプシン処理により、二つの抗原結合部位をもち、なお架橋抗原になり得るフラグメントが生じる。
また、そのフラグメントには、他の配列への付着の有無にかかわらず、特定の領域または特異的なアミノ酸残基の挿入、欠失、置換あるいはその他の選択された修飾が含まれ得るが、それは、その抗体あるいは抗体フラグメントの活性に、非修飾抗体あるいは抗体フラグメントに比べて、著しい変化または障害が認められない場合である。これらの修飾はさらにいくつかの特性に対して与えることができ、例えば、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸の除去／添加、そのバイオ寿命の延長、その分泌特性の変更などが挙げられる。いかなる場合も、抗体あるいは抗体フラグメントは、その同族抗原に対する特異的結合などの生理活性特性を有しなければならない。抗体あるいは抗体フラグメントの機能的あるいは活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発によって、その後のポリペプチドの発現および試験によって同定され得る。そのような方法は、当業者には容易に理解され、抗体あるいは抗体フラグメントをコード化する核酸の部位特異的変異誘発を包含し得る。（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８〜３５４、１９９２年）
本明細書中で使用する用語「抗体」は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を指示することも出来る。多くの非ヒト抗体（例、マウス、ラットまたはウサギ由来のもの）は、自然にヒトの中で抗原性を示し、よってヒトに投与される時に望ましくない免疫反応を引き起こすことが出来る。従って、その方法におけるヒト抗体あるいはヒト化抗体の使用により、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫反応を引き起こす可能性を低下させるのに役立つ。
（２）ヒト抗体
ヒト抗体は種々の技術を用いて作成できる。ヒトモノクローナル抗体作成の技術例には、Ｃｏｌｅらが記述したもの（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７ページ、１９８５年）およびＢｏｅｒｎｅｒらが記述したもの（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６〜９５、１９９１年）などがある。ヒト抗体（およびそのフラグメント）はまたファージディスプレイライブラリを使用して作成することが出来る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、１９９１；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１、１９９１年）。
また、ヒト抗体はトランスジェニック動物から得られる。例えば、免疫化に反応してフルレパートリーのヒト抗体を作成できるトランスジェニック変異マウスについての記述がある（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３（１９９３年）を参照のこと）。特に、これらのキメラの生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖接続領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失により結果的に内生的抗体作成が完全に阻害され、そのような生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列抗体遺伝子配列の転送がうまくいくことにより結果的に抗原のチャレンジによりヒト抗体が作成される。
（３）ヒト化抗体
概して、抗体ヒト化技術には、抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコード化するＤＮＡ配列を操作する組み換えＤＮＡ技術の使用が含まれる。従って、非ヒト抗体（あるいはそのフラグメント）のヒト化型はキメラの抗体あるいは抗体鎖（あるいはそのフラグメント、例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’あるいはその他の抗原結合部分など）であり、それは、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれる非ヒト（ドナー）抗体からの抗原結合部位の一部分を含む。
ヒト化抗体を作成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の抗原結合特性（例、標的抗原に対する特定のレベルの特異性および親和性）を有することが知られるドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲからの残基により置換される。ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基により置換される場合がある。ヒト化抗体も残基を含有できるが、それは、レシピエント抗体においても取り込まれたＣＤＲあるいはフレームワーク配列においても認められる。ヒト化抗体は一般に非ヒト供給源からヒト抗体に導入される１つ以上のアミノ酸残基を持つ。実際には、ヒト化抗体は一般的にヒト抗体であり、そこでいくつかのＣＤＲ残基および恐らくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類の抗体における類似部位からの残基により置換される。概して、ヒト化抗体は、一般的にヒト抗体の、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６年）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２年））。
非ヒト抗体をヒト化する方法はその技術について周知である。例えば、ヒト化された抗体はＷｉｎｔｅｒら（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６年）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８年））の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類のＣＤＲあるいはＣＤＲ配列に置換することにより作成できる。また、ヒト化抗体を作成するために使用可能な方法は、米国特許番号第４，８１６．５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙら）、米国特許番号第５，５６５，３３２号（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら）、米国特許番号第５，７２１，３６７号（Ｋａｙら）、米国特許番号第５，８３７，２４３号（Ｄｅｏら）、米国特許番号第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）、米国特許番号第６，１３０，３６４号（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら）、および米国特許番号第６，１８０，３７７号（Ｍｏｒｇａｎら）に記載されている。
（４）抗体の投与
抗体の投与は、本明細書中に開示するように実施できる。抗体送達のための核酸アプローチも存在する。また、広く作用する抗ＦＰＡあるいはブラジキニン模倣性の抗体および抗体フラグメントは、抗体または抗体フラグメントをコード化する核酸調製物（例えば、ＤＮＡあるいはＲＮＡ）として患者あるいは被験体に投与することが出来るが、それは、患者自身または被験体自体の細胞が核酸を取り入れてコード化された抗体あるいは抗体フラグメントを作成あるいは分泌するからである。この核酸の送達は、例えば本明細書中に記載された方法など、いかなる方法によっても可能である。
８．レセプター
本明細書中で開示する分子ＦＰＡとＢＫおよびこれらの改変体は、例えば大脳および心臓における、虚血事象後に抗梗塞特性をもつことが示される。これらの分子が分子相互作用を通してこれらの作用を仲介することが理解される。これらの分子がもつ抗梗塞作用を担う分子相互作用およびシグナル変換経路の単離および確認をするための、ＦＰＡとＢＫおよびその改変体を用いる方法および組成物を開示する。これらの分子は、それらが相互作用する新規のレセプターおよび分子を同定するスクリーニングアッセイにおいて用いられるように、例えば、相互作用の発生を探索するレセプターおよびその他の既知の分子をスクリーニングするために用いることができる。
例えば、ＦＰＡがどのレセプターと相互作用できるのかを確認するために、ＦＰＡを１５０個のレセプターのスクリーニングに用いた。ＦＰＡ相互作用を評価する１つの方法は、ＦＰＡがその自然リガンドに関連する任意のレセプターを修飾できる量を考察することである。表１３および表１４に開示されるのは、リガンド−レセプター結合試験であり、それにより、例えばフィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ−ｈ）のヒト型により２０％以上修飾される（阻害あるいは励起）。
（表１３ ＦＰＡｈ １０μＭ阻害）
Figure 2005532263
（表１４ ＦＰＡｈ １０μＭ刺激）
Figure 2005532263
ａ）ブラジキニンレセプター
またブラジキニンは、実施例で考察したように、上記で考察した同じ１５０個のレセプターをスクリーニングするために用いた。このアッセイは、レセプターのパネルにおけるいかなるレセプターもブラジキニンによって結合されるのかを確認するために用いた。このアッセイは、ブラジキニンがアンジオテンシン２型（ＡＴ２）と結合したことを示唆した。ブラジキニンはＡＴ２レセプターでＡＴＩＩの結合を阻害した。ブラジキニン改変体および誘導体のパネルをブラジキニンの重要な結合領域を特定するために使用した。
（１）アンジオテンシン経路
ＡＴ２レセプターはレニン−アンジオテンシンＩＩ経路の一部である。アンジオテンシンＩＩは体液の調節に重要な役割を果たし、ナトリウムはレニン・カスケードに関与する。アンジオテンシノーゲンは酵素レニンを介してアンジオテンシンＩに変換する。アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）と呼ばれる酵素があるが、これはアンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩに変換する。アンジオテンシンＩＩは、アンジオテンシンＩＩ型レセプター（ＡＴ１）を結合し、バソプレッシンおよびＡＣＴＨの分泌の制御など数ある中で、血管狭窄およびアルドステロン分泌を引き起こす。ＡＴ１／ＡＴＩＩ相互作用をブロックする分子は高血圧などの種々の心疾患を処置するための治療法として使用する。例えば、ロサルタン（Ｃｏｚａａｒ（登録商標））（１日量２５〜１００ｍｇ）、バルサルタン（Ｄｉｏｖａｎ（登録商標））（１日量８０〜１６０ｍｇ）、イルベサルタン（Ａｖａｐｒｏ（登録商標））（１日量７５〜３００ｍｇ）、カンデサルタン（Ａｔａｃａｎｄ（登録商標））（１日量４〜１６ｍｇ）は、このクラスの化合物、すなわちＡＴ１ブロッカーの仲間である。
ＡＴ１ブロッカーにはＡＣＥ阻害剤と同様の効果があり、これによりＡＴＩＩによるＡＴＩ刺激を低下させる。しかし、ＡＣＥ阻害剤はブラジキニンの分解も低下させ、この作用はこのクラスの薬剤の薬効および副作用の一部に関与する。従って、差示的な臨床効果の可能性がこれらの二つのクラスの薬剤について存在する。
アンジオテンシンＩ／ハイパーテンシンＩは配列ＤＲＶ ＹＩＨ ＰＦＨ Ｌ（配列番号８６）を有するデカペプチドである。ＡＣＥは配列ＤＲＶ ＹＩＨ ＰＦ（配列番号８７）を有するＡＴＩＩを生成するＣ末端ジペプチド（Ｈｉｓ、Ｌｅｕ）を加水分解する。ＡＴＩＩ（ＲＶＹ ＩＨＰ Ｆ、配列番号８８）から取り除かれたＮ末端ＡｓｐをもつアンジオテンシンＩＩＩはアンジオテンシンＩＩより弱い。アンジオテンシンＩＩＩはアルドステロンの放出を引き起こし、エンケファリンの分解を阻害し、Ｍｅｔエンケファリンの鎮痛活性を向上させる。
アンジオテンシンＩＩは、２つのタイプのＧタンパク質共役膜レセプターであるＡＴ１（１型）およびＡＴ２（２型）と相互作用する。ＡＴ１は３つの主要なイソ型を持つ（ラットＡＴ１Ａ ３５９ａａ；ＡＴ１Ｂ／ＡＴＩＩＩ、３５９ａａ；およびＡＴ１Ｃ、１７７ａａ、これらは他のいかなるイソ型と同様、ＧｅｎＢａｎｋで見つけられる）。構造分析によりラットＡＴ１レセプターが７つの膜貫通ドメインを含む一方、Ｎ末端は細胞外でＣ末端は細胞内である。ＡＴＩＩのＡＴ１レセプターとの結合はホスファチジルイノシトール−カルシウム・カスケードを活性化させる。ＡＴ１レセプターは少なくとも肝臓、腎臓、大動脈、肺、子宮、卵巣、脾臓、心臓、副腎および血管平滑筋において発現される。ＡＴ２遺伝子（染色体ｘ）は３６３ａａタンパク質（配列番号８９、受け入れＮＰ ０００６７７、アンジオテンシンＩＩ２型レセプター；アンジオテンシンレセプター２［ホモ・サピエンス］）をコードする。
配列番号８９
Figure 2005532263
それは子宮筋において高発現されるが、副腎においてはより低いレベルで発現される。
ＡＴ１およびＡＴ２レセプターの刺激には異なる効果がある。例えば、ＡＴ１レセプターは血管狭窄を、ＡＴ２レセプターは血管拡張を促進する。また、ＡＴ２レセプターは心保護的になり得るＮＯを促進すると考えられる。ＡＴ２レセプターのマウスでの遺伝子ノックアウト研究はＡＴ２レセプターの損失が心筋梗塞後に心臓病を再発させることを示唆している。（Ｉｃｈｉｈａｒａ Ｓ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００２年１０月 １０６：２２４４〜９）。ＡＴ１およびＡＴ２は心筋梗塞中に上方調節されるようである。ＡＴ２レセプターは腎血管拡張カスケードに関与する。このカスケードはブラジキニン、一酸化窒素およびサイクリックＧＭＰの産生を含む。この役割はＡＴ１レセプターの作用および活性を抑制する。ＡＴ１およびＡＴ２のＡＴＩＩ相互作用のブロッキングがアポトーシスを阻害するように、ＡＴ１およびＡＴ２の双方はアポトーシスに関与すると考えられるが、ＡＴ２への刺激はアポトーシスを引き起こす。Ｏｎｏ Ｈ ａｎｄ Ｉｓｈｉｍｉｔｓｕ、Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ、２００２年１０月 ６０：１９８７。
（２）ＡＴＩＩ２アンタゴニストおよびアゴニスト
アンジオテンシン２型レセプターのアンタゴニストおよびアゴニストを開示する。例えば、ＰＤ１２３１７７およびＰＤ１２３３１９（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ ＰＢら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ １９９３年６月；４５（２）：２０５−５１）、アンジオテンシンＩＩレセプターおよびアンジオテンシンＩＩレセプターアゴニスト、（少なくともＡＴ１とＡＴ２のアンタゴニストとアゴニストおよびそれらの構造に関連する物質については参考として援用される）、およびＣＰＧ４２１１２Ａ［ニコチニル−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（２−Ａｒｇ）−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−ＯＨ］は、ＡＴ２レセプターアゴニストとして機能する。ＡＴＩＩ２型レセプター抗体はアンタゴニストおよびアゴニストとしても同様に機能できる。
アンジオテンシンレセプターアンタゴニストおよびアゴニストは、例えばＷｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ１９８８０．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ． １５ Ｓｕｐｐｌ Ｄ：７９−８７、１９９４；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ １９８８０−０４００ Ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１９−３１， １９９３；およびＤｉｎｈ，Ｄ．Ｔ．ら，Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）１００，（４８１〜４９２）（英国にて出版、少なくともアンジオテンシン経路およびＡＴ２およびＡＴ１アンタゴニストおよびアゴニストの構造の操作に関連する物質について、本明細書中で参考として援用される）において、考察される。
種々のアンタゴニストおよびそれらの梗塞に対する効果はＸｕら（「ＡＴ（１） ａｎｄ ＡＴ（２） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｆｔｅｒ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｗｏｒｋｉｎｇ ｒａｔ ｈｅａｒｔｓ」Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２（４）：Ｈ２０６−１５（２００２））；Ｆｏｒｄら（「Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｈａｓ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｐｏｓｔ−ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｈｅａｒｔｓ」Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３４（１）：３８−４５（２００１））；Ｆｏｒｄら（「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｏｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＡＴ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ａｆｔｅｒ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｗｏｒｋｉｎｇ ｒａｔ ｈｅａｒｔｓ」Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５（３）：２１１−２１（２０００））；およびＦｏｒｄら（「Ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＡＴ１ ａｎｄ ＡＴ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｗｏｒｋｉｎｇ ｒａｔ ｈｅａｒｔｓ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３０８７−９（１９９６））は全てアンジオテンシンＩＩ２型レセプターの変調に関連する物質として、本明細書中にその全体において参考として援用される。これらの参考文献に含まれる物質が、これらの参考文献に含まれる物質を含まない主題に対する請求項を支持するために出願者により利用され得ることが理解される。
９．全ての適切な組成物に適用可能な局面
ａ）配列の類似性
本明細書中で考察するように、使用されている相同性と同一性という用語が類似性と同じものを意味することが理解される。従って、例えば、相同性という言葉が二つの非自然配列の間で用いられる場合は、これが必ずしもこれらの二つの配列の間の進化的関係を示唆しているのではなく、それらの核酸配列の間の類似性あるいは関連性を考察していることが理解される。二つの進化的に関連のある分子の間の相同性を特定する方法の多くは、それらの進化的関連の有無に関わらず、配列の類似性を測定する目的で、２つ以上の核酸あるいはタンパク質のいずれかに一般的に適用される。
概して、本明細書中に開示する遺伝子およびタンパク質で、既知の改変体、誘導体または生じる可能性のあるもののいずれかを定義する一つの方法は、特定の既知の配列との相同性の点で改変体および誘導体を定義することであることが理解される。また、本明細書中で開示する特定の配列のこの同一性は、本明細書中の他の箇所でも考察される。通常、本明細書中に開示する遺伝子およびタンパク質の改変体は、一般的に少なくとも約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９パーセントの規定配列または自然配列との相同性を示す。当事者は二つのタンパク質または核酸（遺伝子など）の相同性を同定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は二つの配列を整列させた後に算出することが出来るので、相同性はその最高のレベルにある。
相同性を算出する別の方法は公開されたアルゴリズムにより実施され得る。比較のための最適な配列の整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）による局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）による相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の調査、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、あるいは検査により行うことが出来る。
同じタイプの相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９において開示されたアルゴリズムによる核酸について得ることができ、少なくとも核酸アラインメントに関連する物質について本明細書中に参考として援用される。その方法のいずれも一般的に使用され、特定の場合にこれらの種々の方法の結果は異なり得るが、本明細書中に開示するように、当業者は、同一性がこれらの方法のうち少なくとも一つで認められる場合に、それらの配列が規定の同一性を有し、本明細書中に開示されていると言えることを理解する。
例えば、本明細書中で用いられるように、別の配列に対して特定のパーセントの相同性を有すると記載される配列は、１つ以上のいずれかの上述の算出法により算出された記載された相同性を有する配列を指す。例えば、Ｚｕｋｅｒ算出法により第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出される場合は、たとえその他のいずれかの算出法により第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出されなくても、本明細書中に記載するように、第１配列は第２配列に対して８０％の相同性を有する。もう一つの例として、Ｚｕｋｅｒ算出法およびＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの算出法の双方により第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出される場合は、たとえＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの算出法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの算出法、Ｊａｅｇｅｒ算出法あるいはその他のいずれかの算出法により第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出されなくても、本明細書中に記載するように、第１配列は第２配列に対して８０％の相同性を示す。さらにもう一つの例として、算出法のそれぞれを用いて第１配列が第２配列に対して８０パーセントの相同性を有すると算出される場合は、本明細書中に記載するように、第１配列は第２配列に対して８０％の相同性を示す（しかしながら、実際には、異なる算出法は結果的にしばしば異なる相同性パーセントを算出するであろう）。
ｂ）ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
一般的に、用語ハイブリダイゼーションは、プライマーまたはプローブなどの少なくとも二つの核酸分子と遺伝子との間の配列依存的相互作用（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を意味する。配列依存的相互作用は、２つのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間でヌクレオチド特異的な様式で起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧまたはＴと相互作用するＡは配列依存的相互作用である。一般的に、配列依存的相互作用は、ヌクレオチドのワトソン・クリック面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面上で起こる。二つの核酸のハイブリダイゼーションは、当事者に公知のいくつかの状態およびパラメータの影響を受ける。例えば、反応の塩濃度ｐＨおよび温度は全て、二つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響を与える。
二つの核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションについてのパラメータは当事者に周知である。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義できる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階の一方または双方の温度および塩濃度の双方により制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを実施するためのハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍ（半分の分子がそのハイブリダイゼーション・パートナーから分離する融解温度）より約１２〜２５℃下の温度で高イオン強度溶液（６Ｘ ＳＳＣまたは６Ｘ ＳＳＰＥ）におけるハイブリダイゼーション、その後の、洗浄温度がＴｍより約５〜２０℃下になるように選ばれた温度と塩濃度を組み合わせての洗浄を含む。温度および塩濃度は予備試験において容易に経験的に同定され、そこではフィルター上で固定化した基準ＤＮＡのサンプルが標識された目的の核酸にハイブリダイズされ、次いで異なるストリンジェンシーの状態下において洗浄される。一般的にハイブリダイゼーション温度はＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションについてより高い。その条件はストリンジェンシーを実施するために上述の通り使用でき、当業者に公知である。（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７， １９８７、少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連する物質について、本明細書中に参考として援用される。）ＤＮＡに対する好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ ＳＳＣまたは６Ｘ ＳＳＰＥにおいて約６８℃（水溶液）でのＤＮＡハイブリダイゼーション、その後の６８℃での洗浄であり得る。必要に応じて、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相補性の度合いの低下に従って、さらに、可変性が検索されるいずれかの領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富度の程度により、低下し得る。同様に、当業者が公知であるように、必要に応じて、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の相同性の上昇に従って、さらに、高い相同性が望まれるいずれかの領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富度の程度により、上昇し得る。
選択的ハイブリダイゼーションを同定するもう１つの方法は、その他の核酸に結合する核酸の１つの容量（パーセンテージ）を確認することによる。例えば、いくつかの実施形態において、制限的核酸の少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが非制限的核酸に結合する時が、選択的ハイブリダイゼーション条件となる。一般的に、非制限的プライマーは、例えば１０、１００または１０００倍過剰である。このタイプのアッセイは、制限的および非制限的プライマーの双方が例えばそのＫｄの１０、１００または１０００倍以下である条件下、核酸分子の１つだけが１０、１００、１０００倍以下である条件下、あるいは１つまたは双方の核酸分子がそのＫｄを超えている条件下において、実施することが出来る。
選択的ハイブリダイゼーションを特定するもう１つの方法は、ハイブリダイゼーションが所望の酵素的操作を促進する必要のある条件において、酵素的に操作されるプライマーのパーセンテージを確認することによる。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマーの少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが、例えば酵素的操作がＤＮＡ伸長である場合、酵素的操作を促進する条件下で酵素的に操作される時である場合であり、よって、選択的ハイブリダイゼーション条件は、少なくともプライマーの約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントが伸長する場合である。また、好ましい条件には、製造者に指示される条件、または操作を実施する酵素に適切であることが当該分野で示唆されている条件などがある。
相同性と同様、２つの核酸分子の間のハイブリダイゼーションのレベルを決定するために本明細書中に種々の方法が開示されることが理解される。これらの方法および状態は２つの核酸分子の間に異なるパーセンテージのハイブリダイゼーションを提供することができるが、他に示されなければ、そのいずれかの方法のパラメータの一致が十分であろうことが理解される。例えば、８０％ハイブリダイゼーションが必要とされる場合に、ハイブリダイゼーションがこれらの方法のいずれかの１つにおいて必要なパラメータ内で起こる限りは、本明細書中で開示されると考えられる。
組成物または方法がハイブリダイゼーションを集合的あるいは単独でのいずれかで決定するためのこれらの判定基準のいずれか１つに一致する場合に、それが本明細書中に開示する組成物または方法であることを当業者が理解することが理解される。
（ｃ）核酸）
本明細書中に核酸に基づく種々の分子（例えば、コード化する核酸（例えば、ＦＰＡ、ブラジキニンまたはそのフラグメント）および種々の機能的核酸を含む）を開示する。開示する核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似物またはヌクレオチド代用物から作られる。これらの分子および他の分子の非限定的例は本明細書中で考察される。例えば、ベクターが細胞内で発現する時に発現される場合、発現されたｍＲＮＡは代表的にＡ、Ｃ、ＧおよびＵから作られることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が例えば外来性送達により細胞または細胞環境に導入される場合は、アンチセンス分子が細胞環境中のアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチド類似物から作られることは有利であると理解される。
（（１）ヌクレオチドおよび関連分子）
ヌクレオチドは塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間の結合を作るそのリン酸部分および糖部分を介して結合され得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は５価リン酸である。ヌクレオチドの非限定例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
ヌクレオチド類似物は、塩基部分、糖部分またはリン酸部分いずれかへのいくつかの型の改変を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する改変としては、当該分野において周知であり、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノデニン、および糖部分またはリン酸部分での修飾が挙げられる。
ヌクレオチド代用物は、ヌクレオチドと同様の機能的特性を有する分子であるが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のようなリン酸部分を含まない。ヌクレオチド代用物は、ワトソン・クリックまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの様式で核酸を認識する分子であるが、リン酸部分以外の１つの部分により連結される。ヌクレオチド代用物は、適切な標的核酸と相互作用する場合に、二重らせん型構造に適合することができる。
また、例えば細胞取り込みを促進するために、他の型の分子（結合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物に結合させることが可能である。結合体は、化学的にヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物に結合できる。このような結合体は、脂質部分（例えば、コレステロール部分）を含むがこれらに限定されない。（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９年、８６、６５５３〜６５５６。）
ワトソン・クリック相互作用は、少なくともヌクレオチド、ヌクレオチド類似物またはヌクレオチド代用物のワトソン・クリック面との１つの相互作用である。少なくともヌクレオチド、ヌクレオチド類似物またはヌクレオチド代用物のワトソン・クリック面には、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似物またはヌクレオチド代用物のＣ２、Ｎ１およびＣ６位、ならびにピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類似物またはヌクレオチド代用物のＣ２、Ｎ３およびＣ４位が挙げられる。
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用は、ヌクレオチドあるいはヌクレオチド類似物のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面上で起こる相互作用であり、二重鎖ＤＮＡの主要な溝に曝露される。このＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面には、プリンヌクレオチドのＮ７位およびＣ６位の反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
（（２）配列）
ＦＰＡ、ブラジキニンまたはそれらのフラグメントの遺伝子に関連する種々の配列があり、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖ．で、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて見つけることが出来る。これらの配列およびその他の配列は、本明細書中に含まれる個々の部分配列に加えて、その全体において本明細書中に参考として援用される。
ヒトＦＰＡについて表１に示した１つの特定の配列は、本明細書中に用い、一例として、開示する組成物および方法を例示する。この配列に関連する記載は、ＦＰＡに関連するいかなる配列または本明細書中に開示するいかなる配列にも、特異的にその他のものが示されなければ、適切であることが理解される。当業者は、配列の矛盾および差異の解決法、および他の関連する配列に対する特定の配列（すなわち、ＦＰＡまたはブラジキニンの配列）に関連する組成物および方法の調整法を理解する。プライマーおよび／またはプローブは、情報が本明細書中で開示し、当該分野で既知である場合、ＦＰＡまたはブラジキニンのいずれかの配列のために設計され得る。
（（３）プライマーおよびプローブ）
プライマーおよびプローブを含む組成物が開示されるが、これらは、本明細書中に開示するように、ＦＰＡ、ブラジキニンまたはそれらのフラグメントと相互作用することが出来る。特定の実施形態において、プライマーはＤＮＡ増幅反応を支持するために用いられる。代表的に、プライマーは１つの配列の特定の様式で伸長されることが可能である。１つの配列の特定の様式におけるプライマーの伸長は任意の方法を含み、その方法において、プライマーがハイブリダイズされる、あるいはそうでなければ関連する核酸分子の配列および／または組成物が、プライマーの伸長により生成される生成物の組成物または配列を指向またはそれに影響する。従って、１つの配列の特定の様式におけるプライマーの伸長としては、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写あるいは逆転写が挙げられるが、これらに限定されない。１つの配列の特定の様式においてプライマーを増幅させる技術および状態が、好ましい。特定の実施形態において、プライマーはＰＣＲまたは直接配列決定のようなＤＮＡ増幅反応のために用いられる。特定の実施形態において、プライマーは非酵素的技術を用いて伸長され得ることが理解され、ここで、例えば、プライマーを伸長させるために用いられるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが改変され、化学的に反応し１つの配列の特定の様式においてプライマーを伸長させる。代表的に、開示されるプライマーは、ＦＰＡ核酸、ブラジキニン核酸および／またはそれらのフラグメントと、あるいはＦＰＡ核酸、ブラジキニン核酸および／またはそれらのフラグメントの相補物とハイブリダイズする。
（ｄ）組成物の細胞への送達）
（（１）核酸送達）
核酸を細胞にインビトロまたはインビボのいずれかで送達するために使用され得る多くの組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系という２つのクラスに大きく分類することが出来る。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、または細胞またはカチオン性リポソームのようなキャリア中の遺伝性物質の移送のような多くの直接的送達系により送達され得る。ウイルスベクター、化学トランスフェクト体、またはＤＮＡのエレクトロポレーションおよび直接拡散のような物理機械的な方法を含むトランスフェクションに適切な方法は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、１４６５〜１４６８、（１９９０年）：およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ、３５２、８１５〜８１８、（１９９１年）により記述されている。このような方法は、当該分野において周知であり、容易に本明細書中に記載する組成物および方法との使用に適合性され得る。特定の場合において、その方法は、大きなＤＮＡ分子を用いて特異的に機能するように修飾される。さらに、これらの方法は、キャリアの標的化特性を用いることにより特定の疾患および細胞集団を標的とするために用いられ得る。
外因性ＤＮＡの被験体の細胞への投与および取り込み（すなわち、遺伝子の形質導入またはトランスフェクション）を含む、本明細書中に記載する方法において、核酸は、裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形態にかあるいは、核酸は、核酸を細胞に送達するためのベクターの形態になり得る。そうすることによって、コードＤＮＡ、ＤＮＡまたはフラグメントは、エンハンサと同様に当業者が周知であるようにプロモーターの転写制御下にある。そのベクターは、アデノウイルスベクターのような市販の調製物であり得る（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ））。
一例として、ベクター送達は、レトロウイルスのベクター系のようなウイルス系を介してであり得、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることが出来る（例、Ｐａｓｔａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５、１９８６を参照のこと）。次いで、この組み換え型レトロウイルスは、感染させるために用いられ、その結果、広い中和化抗体（またはその活性フラグメント）をコードする核酸を感染した細胞に送達し得る。変更された核酸を哺乳動物細胞内に導入する正確な方法は、もちろん、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。他の技術は、アデノウイルスベクター（Ｍｉｔａｎｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９４１〜９４８、１９９４年）、アデノ関連ウイルス性（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｌｏｏｄ ８４：１４９２〜１５００、１９９４年）、レンチウイルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３〜２６７、１９９６年）、または偽型レトロウイルス性ベクター（Ａｇｒａｗａｌら、Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ、２４：７３８〜７４７、１９９６年）の使用を含むこの手順のために広く利用可能である。物理的形質導入技術も使用可能であり得、例えば、リポソーム送達、並びにレセプター媒介性機構および他のエンドサイトーシス機構などが挙げられる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８７：４７２〜４７８、１９９６年を参照のこと）。開示される組成物は、これらの方法または他の通常使用される遺伝子送達方法のいずれかと共に使用することが出来る。
一例として、開示される方法に用いられる、抗体コード核酸あるいはＦＰＡもしくはブラジキニンまたはそれらのフラグメントの模倣物をコードするいくつかの他の核酸、あるいはＦＰＡもしくはブラジキニンまたはそれらのフラグメントの特定の改変体をコード化するいくつかのその他の核酸が、１つのアデノウイルスベクターにおける被験体の細胞に送達される場合、アデノウイルスのヒトへの投与のための投薬量は、注射１回あたり約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲であり得るが、注射１回あたり１０１２ｐｆｕの程度の高さにもなり得る（Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：９８５〜１００１、１９９７年；Ａｌｖａｒｅｚ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：５９７〜６１３、１９９７年）。被験体は単回注射を受けることができるか、追加注射が必要な場合は、無期限でおよび／またはその処置の効力が確立されるまで、６ヶ月間隔で反復することができる（または、熟練者が決定するような他の適切な時間間隔で）。
核酸またはベクターの非経口投与には、使用時に概して注射によるという特徴がある。注射可能物質は、液体溶液または懸濁物、注射前の懸濁液の溶液に適した固形物、あるいは乳濁液のいずれかのような、慣習的な形態で調製され得る。非経口投与用により最近改良されたアプローチとしては、一定投薬量が維持されるような、緩効系または徐放系の使用が挙げられる。本明細書中に参考として援用される例えば米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。治療用化合物の適切な処方または種々の投与経路をさらに考察するには、例、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９版）Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５を参照のこと。
宿主細胞ゲノムに組み込まれる細胞に送達される核酸は、代表的に組み込み配列を含む。これらの配列は、特にウイルスに基づく系が用いられる場合にしばしばウイルス関連配列である。また、これらのウイルス組み込み系は核酸に組み込まれることが可能であり、リポソームのような送達の非核酸ベースの系を用いて送達され、送達系に含まれる核酸は組み込まれて宿主ゲノムに組み込まれ得る。
他の一般的な宿主ゲノムへの組み込み技術としては、例えば、その宿主ゲノムとの相同的組み換えを促進するよう設計されている系が挙げられる。代表的にこれらの系は、ベクター核酸と標的核酸との間の組換えが起こる宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有することが示される核酸に隣接する配列に依存し、送達される核酸が宿主ゲノムに組み込まれるようにする。相同的組み換えを促進するのに必要なこれらの系および方法は当業者に公知である。
（（２）非核酸ベースの系）
開示される組成物は種々の経路で標的細胞に送達され得る。例えば、その組成物はエレクトロポレーションまたはリポフェクションまたはリン酸カルシウム沈殿によって送達され得る。選択される送達機構は、部分的に標的とされる細胞の型およびその送達が例えばインビボまたはインビトロで起こるのかということに依存する。
従って、その組成物は、例えば開示される組成物またはベクターに加えて、リポソームのような脂質（カチオン性リポソーム（例、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソームのような）から構成され得る。リポソームはさらに、所望の場合、特定の細胞の標的化を容易にするタンパク質を含み得る。１つの化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に対して求心性を呈する血液への投与あるいは気道の標的細胞に対する気道内吸入され得る。リポソームに関しては、例、Ｂｒｉｇｈａｍら Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５〜１００（１９８９年）；Ｆｅｌｇｎｅｒら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３〜７４１７（１９８７年）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。さらに、その化合物はマクロファージのような特定の細胞型に対して標的化され得るマクロカプセルの構成要素として投与され得る、またはそこで化合物の拡散またはミクロカプセルからの化合物の送達が特定の割合または投与量について設計されるマクロカプセルの構成要素として投与され得る。
外因性ＤＮＡの被験体の細胞内への投与および取り込みを含む上述の方法において（すなわち、遺伝子の形質導入またはトランスフェクション）、組成物の細胞への送達は種々の機構を介し得る。一例として、送達はリポソームを介して可能であり、これは、ＬＩＰＯＦＥＣＴｌＮ，ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ．ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ．Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩ）のような市販のリポソーム調製物、並びに当該分野において標準の手順に従って開発される他のリポソームを用いる。さらに、核酸またはベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能な技術であるエレクトロポレーションおよびＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ ｍａｃｈｉｎｅ（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）の手段により、インビボで送達され得る。
その物質は溶液または懸濁液（例えば、マクロ粒子、リポソームまたは細胞の中に取り込まれる）であり得る。これらは抗体、レセプターまたはレセプターリガンドを介して特定の細胞型に対して標的化され得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へ標的化するこの技術の使用例である（Ｓｅｎｔｅｒら Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２：４４７〜４５１、（１９９１年）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６０：２７５〜２８１、（１９８９年）；Ｂａｇｓｈａｗｅら Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００〜７０３、（１９８８年）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４：３〜９、（１９９３年）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５：４２１〜４２５、（１９９２年）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７〜８０，（１９９２年）；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：２０６２〜２０６５、（１９９１年））。これらの技術は他の種々の特定の細胞型に使用できる。「ステルス」および他の抗体結合体化リポソームのようなビヒクル（結腸癌への脂質媒介性薬物標的化を含む）、細胞特異性リガンドを介するＤＮＡのレセプター媒介性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、およびインビボにおけるマウス神経膠腫細胞の特異性の高い治療的レトロウイルス標的化である。以下の参考文献は特定のタンパク質を腫瘍組織に向けて標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：６２１４〜６２２０、（１９８９年）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１１０４：１７９〜１８７、（１９９２年））。概して、レセプターは、構成性またはリガンド誘導性のいずれかのエンドサイトーシスの経路に含まれる。これらのレセプターは、クラスリン被覆小窩にクラスター化し、クラスリン被覆小胞を介してその細胞に入り、そのレセプターが区分される酸性化エンドソームを通り抜けた後、細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に貯蔵されるか、あるいはリソソームにおいて分解される。その内在化経路は、栄養摂取、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性侵入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプターレベルの調節のような種々の機能を供する。多くのレセプターは、複数の細胞内経路に従い、その細胞型、レセプター濃度、リガンド型、リガンド価数およびリガンド濃度に依存する。レセプター媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞の機構が概説されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９−４０９（１９９１年））。
（（３）インビボ／エキソビボ）
上述のとおり、この組成物を薬学的に受容可能なキャリアに投与し得、当該分野で周知の種々の機構によりインビボおよび／またはエキソビボで被験体細胞に送達することができる（例、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介したＤＮＡの筋注、エンドサイトーシスなど）。
エキソビボ方法が採用される場合、細胞または組織を除去し、当該分野で周知の標準プロトコルに従い体外に保持することが可能である。この組成物は、例えば、リン酸カルシウム媒介性遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソームのような、いずれかの遺伝子送達機構を介して細胞内に導入することができる。次いで、形質導入された細胞の注入し得るか（例、薬学的に受容可能なキャリアに）あるいはその細胞型または組織型向けの標準方法による被験体内への同位置への戻し移植し得る。種々の細胞の被験体内への移植または注入の標準方法は公知である。
（ｅ）発現系）
細胞に送達される核酸は代表的に発現制御システムを含む。例えば、ウイルス系およびレトロウイルス系に挿入される遺伝子は、通常、プロモーターおよび／または所望の遺伝子産物の発現制御に役立つエンハンサーを含む。概して、プロモーターは、転写開始部位に関して比較的一定の位置にある場合に機能するＤＮＡの１つの配列または複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
（（１）ウイルスのプロモーターおよびエンハンサー）
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源（例えば、ポリオーマ、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいサイトメガロウイルスのようなウイルスのゲノムから、あるいは、異種哺乳動物プロモーター（例えばβアクチンプロモーター）から得ることが出来る。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして都合良く得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８年））。ヒトサイトメガロウイルスの即時型初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして都合良く得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ、Ｐ．Ｊ．ら Ｇｅｎｅ １８：３５５〜３６０（１９８２年））。もちろん、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
概して、エンハンサーは転写開始部位から固定距離をもたずに機能するＤＮＡの配列をいい、転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ， Ｌ．ら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１年））あるいは３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３年））のいずれかであり得る。さらに、エンハンサーはイントロン（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３年））およびコード配列自体（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：ｌ２９３（１９８４年））の中に存在し得る。通常、それらは１０〜３００ｂｐの間の長さであり、シスにおいて機能する。エンハンサーは近隣のプロモーターからの転写を増加させるために機能する。また、エンハンサーは転写制御を媒介する応答エレメントをしばしば含む。プロモーターも転写制御を媒介する応答エレメントをまた含み得る。エンハンサーは遺伝子発現の制御をしばしば決定する。現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、−フェトプロテインおよびインシュリン）から多くのエンハンサー配列が公知である一方で、代表的に、一般的発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。好ましい例として、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の遅側面上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の遅側面上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、機能を誘発する光的または特定的な化学事象により特異的に活性化され得る。系はテトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬により制御され得る。ガンマ照射などの照射またはアルキル化の化学療法の薬剤への曝露によるウイルス性ベクター遺伝子発現を亢進させる方法もある。
特定の実施形態において、プロモーターおよび／またはエンハンサーの領域は、転写される転写単位の領域の発現を最大化するための構成プロモーターおよび／または構成エンハンサーとして働くことが出来る。特定の構成において、プロモーターおよび／またはエンハンサーの領域は、特定時に特定型の細胞に発現するのみであっても、あらゆる真核細胞型において活性を示す。このタイプの好ましいプロモーターはＣＭＶプロモーター（６５０個の塩基）である。その他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
あらゆる特定の調節エレメントがクローン化され、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現する発現ベクターを構成するために用いられることが示されている。神経膠の線維性酢酸タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは神経膠起源の細胞において選択的に遺伝子を発現させるために用いられている。
真核生物の宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写の終了に必要な配列を含み得る。これらの領域は、ｍＲＮＡコード組織因子タンパク質の非翻訳部分においてポリアデニル化されるセグメントとして転写される。また、３’非翻訳領域は転写終了部位を含む。転写単位がまた、ポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写される単位がプロセッシングされ、ｍＲＮＡのように輸送される可能性を高めることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。相同性ポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物において用いられることが好ましい。特定の転写単位において、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００個の塩基から成る。転写される単位が他の標準配列のみを含むか、あるいは上記配列と組み合わせてその構築物からの発現またはその構築物の安定性を改善することもまた、好ましい。
（（２）マーカー）
ウイルスベクターはマーカー生成物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達されるかどうか、そして、一旦送達された場合に発現するかどうかを判定するために用いられる。好ましいマーカー遺伝子はβガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードするＥ．Ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子である。
いくつかの実施形態において、マーカーは選択可能マーカーであり得る。哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの例は、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ヒドロマイシンおよびプラマイシンである。このような選択可能マーカーが首尾良く哺乳動物宿主細胞に輸送される場合、形質変換された哺乳動物宿主細胞は選択圧下に置かれる場合に生存し得る。選択的レジム（ｒｅｇｉｍｅ）の２つの広範に使用される異なるカテゴリーが存在する。第一のカテゴリーは、細胞代謝および変異細胞株の使用に基づき、これは、補充された培地と関係なく増殖能力を欠損する。二つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどのこのような栄養物の添加なしで増殖能力を欠損する。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子が欠損するので、補充された培地に不足のヌクレオチドが提供されなければ、それらは生存し得ない。培地を補充するための代替法は、インタクトなＤＨＦＲまたはＴＫの遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠いている細胞に導入し、従って、その増殖要求を改変することである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で形質変換されない個々の細胞は、補充されていない培地において、生存し得ない。
第二のカテゴリーは優性選択であり、これは、どの細胞型においても用いられる選択スキームを指し、変異体細胞株の使用を必要としない。代表的にこれらのスキームは、宿主細胞の増殖を阻止する薬物を使用する。それらの細胞は新規遺伝子を有し、薬物耐性を伝えるタンパク質を発現しその選択を切り抜けて生存するであろう。そのような優性選択の例は、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２年））、マイコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０年））、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０〜４１３（１９８５年））を用いる。この３つの例は、適切な薬物Ｇ４１８あるいはネオマイシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐性をそれぞれ伝えるために、真核生物の制御下で細菌遺伝子を使用する。その他には、ネオマイシンアナログＧ４１８およびプロマイシン（ｐｕｒａｍｙｃｉｎ）などがある。
（ｆ）ペプチド）
（（１）タンパク質改変体）
本明細書中で考察するように、ＦＰＡ、ブラジキニン、および／またはそれらのフラグメントの改変体は多数存在し、これらは既知で本明細書中で企図される。さらに、既知の機能的なＦＰＡ、ブラジキニン、および／またはそれらのフラグメント、種ホモログに対して、ＦＰＡ、ブラジキニン、および／またはそれらのフラグメントの誘導体が存在し、それらもまた開示される方法および組成物において機能する。タンパク質の改変体および誘導体は当事者に周知であり、アミノ酸配列の改変に関与し得る。例えば、アミノ酸配列の改変は一般的に、以下の３つのクラスのうちの１つ以上のクラスに分類される：置換改変体、挿入改変体、欠失改変体。挿入にはアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入などがある。通常、挿入は、例えば１〜４個の残基のようなアミノまたはカルボキシルの末端融合の挿入よりも小さな挿入である。実施例に記載したような免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロの架橋結合あるいはその融合をコードするＤＮＡで形質変換される組み換え細胞培養により、免疫原性を与えるのに十分大きなポリペプチドを標的配列に融合する。欠失は、１つ以上のアミノ酸残基のタンパク質配列からの除去を特徴とする。一般的に、タンパク質分子内のどの１つの部位でも、約２〜６個の残基しか除去されない。通常、これらの改変体は、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異原性により調製され、それによってその改変体をコードするＤＮＡを生成し、その後組み替え細胞培養物においてＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡにおける所定の部位で置換変異を起こす技術は周知で、例えばＭ１３プライマー変異原性およびＰＣＲ変異原性などがある。一般的に、アミノ酸置換は単一残基の置換であるが、いくつかの異なる部位で同時に起こり得る。通常、挿入は約１〜１０個のアミノ酸残基、欠失は約１〜３０個のアミノ酸残基について起こる。欠失または挿入は隣接ペアにおいて起こることが望ましい。すなわち、２つの残基の欠失または２つの残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせは、最終構成に達するために併用することが出来る。この変異はリーディングフレームの外に配列を置いてはならず、好ましくは、第二のｍＲＮＡ構造を作り得る相補的領域を作成しないであろう。置換改変体は、少なくとも１つの残基が除去され、１つの異なる残基がその場所に挿入される改変体である。一般的に、この種の置換は次の表１および表２に従って作成され、保存的置換として示される。
（表４：アミノ酸略語）
Figure 2005532263
Figure 2005532263
機能的同一性または免疫学的同一性の実質的変化は、表５の置換より保存性が低い置換を選択することにより、すなわち、（ａ）例えばシートコンフォメーションまたは螺旋コンフォメーションのような、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のバルク、の維持に及ぼす影響が著しく異なる残基を選択することにより生じる。概して、タンパク質の特性に最大の変化をもたらすと予測される置換は、（ａ）セリルまたはスレオニルなどの親水性残基が、レウシル、イソレウシル、フェニルアラニル、バリル、アラニルなどの疎水性残基に（により）置換される置換；（ｂ）システインまたはプロリンが他のいずれかの残基に（により）置換される置換；（ｃ）リシル、アルギニル、ヒスチジルなどの陽性側鎖を有する残基が、グルタミルまたはアスパルチルなどの陰性残基に（により）置換される置換；あるいは（ｄ）フェニルアラニンなどの大きな側鎖を有する残鎖が、グリシンなどの側鎖をもたない残基に（により）置換される置換；そしてこの場合は、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位の数が増加することにより置換が引き起こされる置換である。
例えば、１つのアミノ酸残基を生物学的および／または化学的に同様であるもう１つのアミノ酸残基へ置換することは、保存的置換として当事者に公知である。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基をもう１つの疎水性残基に、または１つの極性残基をもう１つの極性残基に置き換えることである。この置換基には、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｈｒなどの組み合わせが挙げられる。明示的に開示される各配列のこのような保存的な置換変動は、本明細書中に供されるモザイクポリペプチドの中に含まれる。
置換変異誘発または欠失変異誘発を使用して、Ｎ−グリコシル化のための部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化のための部位（ＳｅｒまたはＴｈｒ）を挿入し得る。システインまたは他の不安定な残基の欠失もまた、望ましくあり得る。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換は、例えば、塩基性残基の１つを欠失すること、またはグルタミニル残基もしくはヒスチジル残基によって置換することによって、達成される。
特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドに対する、組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、頻繁に、翻訳後に、対応するグルタミニル残基およびアスパリル残基に脱アミドされる。あるいは、これらの残基は、穏やかに酸性の条件下で脱アミドされる。他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン側鎖の、アルギニン側鎖の、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ７９−８６頁［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにいくつかの例において、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
本明細書中に開示されるタンパク質の改変体および誘導体を規定するための１つの方法は、これらの改変体および誘導体を、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の観点で規定することを介することが理解される。特に開示されるものは、言及される配列に対して少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、本明細書中に開示されるこれらおよび他のタンパク質の改変体である。当業者は、２つのタンパク質の相同性をどのように決定するかを、容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルになるように２つの配列を並置させた後に、計算され得る。
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実行され得る。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによってか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによってか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性の検索の方法によってか、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によってか、または調査によって、計算され得る。
同じ型の相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（これらは、少なくとも、核酸整列に関する題材について、本明細書中に参考として援用される）に開示されるアルゴリズムによって、核酸について得られ得る。
保存的変異および相同性の記載は、任意の組み合わせ（例えば、改変体が保存的変異である、特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態）で一緒に組み合わせられ得ることが理解される。
本明細書は、種々のタンパク質およびタンパク質配列を議論するので、これらのタンパク質配列をコードし得る核酸もまた開示されることが理解される。これには、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列（すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸）ならびにタンパク質配列の開示される改変体および誘導体をコードする全ての核酸（縮重核酸を含む）が含まれる。従って、特定の核酸配列の各々が、本明細書中に詳しく記載され得ないが、各々および全ての配列は、開示されるタンパク質配列を介して、事実上、本明細書中に開示および記載されていることが理解される。開示されるタンパク質の特定の改変体が本明細書中に開示される場合、アミノ酸配列はいずれも、どの特定のＤＮＡ配列が、生物においてそのタンパク質をコードするかを示さないが、特定の生物（この生物から、このタンパク質が生じる）においてそのタンパク質をコードする既知の核酸配列もまた既知であり、そして本明細書中に開示および記載されることもまた、理解される。
多数のアミノ酸およびペプチドアナログが存在し、これらは、開示される組成物に組み込まれ得ることが理解される。例えば、多数のＤアミノ酸、または異なる官能置換基を有するアミノ酸が存在し、従って、これらのアミノ酸は、表１および表２に示される。天然に存在するペプチドの逆の立体異性体、およびペプチドアナログの立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に選択されたアミノ酸を挿入し、そして例えば、アンバーコドンを利用する遺伝構築物を操作して、アナログアミノ酸をペプチド鎖に部位特異的な様式で挿入することによって、ポリペプチド鎖に容易に組み込まれ得る（Ｔｈｏｒｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１），Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５），Ｃａｈｉｌｌら，ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｌｉｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）、これらの全ては、少なくともアミノ酸アナログに関する題材について、本明細書中に参考として援用される）。
ペプチドに類似するが天然のペプチド結合を介して接続されない分子が生成され得る。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログのための結合としては、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨＨ２ＳＯ−が挙げられ得る（これらおよび他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｉｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６７頁（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（１９８３年３月），第１巻，第３号，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般的概説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）４６３−４６８頁；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨＨ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ ３０７−３１４（１９８２）（−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、欧州出願ＥＰ ４５６６５ ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；ならびにＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）に見出され得る；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、−−ＣＨ２ＮＨ−−である。ペプチドアナログは、結合原子の間に１つより多い原子を有し得ることが理解される（例えば、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸など）。
アミノ酸アナログおよびアナログおよびペプチドアナログは、しばしば、増強された特性または望ましい特性（例えば、より経済的な生成、より大きい化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効能、効力など）、変更された特性（例えば、生物学的活性の広いスペクトル）、減少した抗原性など）を有する。
Ｄアミノ酸を使用して、より安定なペプチドを産生し得る。なぜなら、Ｄアミノ酸は、ペプチダーゼによって認識されないからである。そしてコンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の、同じ型のＤアミノ酸でのこのような系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を使用して、より安定なペプチドを産生し得る。システイン残基を使用して、環化させ得るか、２つ以上のペプチドを一緒に付着させ得る。このことは、ペプチドを特定のコンホメーションに制約するために有利であり得る（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ６１：３８７（１９９２）、本明細書中に参考として援用される）。
（ｇ）薬学的キャリア／薬学的製品の送達）
上記のように、組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリア中でインビボで投与され得る。「薬学的に受容可能」とは、生物学的にかまたはその他の様式で望ましくなくはない材料、すなわち、いかなる望ましくない生物学的影響も起こさず、そしてその材料が含有される薬学的組成物の他の成分のいずれとも、有害な様式で相互作用せずに、核酸またはベクターと共に被験体に投与され得る材料を意味する。キャリアは、当業者に周知であるように、当然、活性成分の任意の分解を最小にするように、そして被験体において任意の有害な副作用を最小にするように選択される。
組成物は、経口的にか、非経口的に（例えば、静脈内で）か、筋肉内注射によってか、腹腔内注射によってか、経皮的にか、体外的にか、局所的にかなどで投与され得、局所鼻腔内投与または吸入による投与を含む。本明細書中において使用される場合、「局所鼻腔内投与」とは、一方または両方の外鼻腔を介しての、鼻および鼻腔内への組成物の送達を意味し、そして噴霧機構または液滴機構、によってか、あるいは核酸またはベクターのエアロゾル化を介しての送達を包含し得る。吸入による組成物の投与は、噴霧機構または液滴機構による送達によって、鼻または口を介し得る。送達はまた、挿管法を介して、呼吸器系（例えば、肺）の任意の領域に直接なされ得る。必要とされる組成物の正確な量は、被験体ごとに、被験体の種、年齢、体重および一般的状態、処置されるアレルギー性障害の重篤度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与様式などに依存して、変動する。従って、全ての組成物についての正確な量を特定することは、不可能である。しかし、本明細書中の教示を考慮して、慣用的にすぎない実験を使用して、およその量が、当業者によって投与され得る。
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に、注射によって特徴付けられる。注射は、従来の形態で（液体の溶液または懸濁液、注射前の、液体中溶液または懸濁液に適切な固体形態、あるいはエマルジョンのいずれかとして）調製され得る。より最近修正された、非経口投与のためのアプローチは、ゆっくりした放出系または持続された放出系の使用を包含し、その結果、一定の投薬量が維持される。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
材料は、溶液、懸濁液であり得る（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）。これらは、抗体、レセプター、またはレセプターリガンドを介して、特定の細胞型を標的にし得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的付けるための、この技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ら，Ｂｉｏｃｏｎｉｕａａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｉｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｒｎｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏａ．Ｒｅｖｉｅｗｓ．１２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。「ステルス」および他の抗体結合体化リポソーム（結腸癌腫を標的とする、脂質により媒介される薬物を含む）、細胞特異的リガンドを介する、ＤＮＡのレセプターにより媒介される標的化、リンパ球に指向される腫瘍標的化、およびインビボでのマウス神経膠腫細胞の、非常に特異的な治療レトロウイルス標的化のようなビヒクル。以下の参考文献は、腫瘍組織に対して特定のタンパク質を標的化するための、この技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、レセプターは、構成的かまたはリガンドに誘導されるかのいずれかの、エンドサイトーシスの経路に含まれる。これらのレセプターは、クラスリンをコーティングされたピット内でクラスター化し、クラスリンをコーティングされた小胞を介して細胞に入り、酸性化されたエンドソーム（ここで、レセプターが選別される）を通過し、次いで、細胞表面に再生するか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームに分解されるかのいずれかである。内在化経路は、様々な機能（例えば、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子の排出、ウイルスおよび毒素の日和見性の侵入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプターレベルでの調節）を提示する。多くのレセプターは、細胞型、レセプター濃度、リガンドの型、リガンドの原子価、およびリガンド濃度に依存して、１つ以上の細胞内経路を辿る。レセプターにより媒介されるエンドサイトーシスの分子機構および細胞機構は、総説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
（（１）薬学的に受容可能なキャリア）
組成物（抗体を含む）は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、治療的に使用され得る。
適切なキャリアおよびそれらの処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）、編者Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。代表的に、適切な量の薬学的に受容可能な塩が、処方物を等張性にするために、処方物中で使用される。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水、リンガー溶液、およびブドウ糖溶液が挙げられるが、これらに限定されない。この溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８であり、そしてより好ましくは、約７〜約７．５である。さらなるキャリアとして、徐放性調製物（例えば、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであり、このマトリックスは、成型品（例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子）の形態である）が挙げられる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に依存して、特定のキャリアがより好ましくあり得ることが、当業者に明らかである。
薬学的キャリアは、当業者に公知である。これらは、最も代表的に、ヒトへの薬物投与のための標準的なキャリアであり、溶液（例えば、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝溶液）が挙げられる。この組成物は、筋肉内にかまたは皮下に投与され得る。他の化合物が、当業者によって使用される標準的な手順に従って、投与される。
薬学的組成物は、キャリア、シックナー、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、表面活性剤などを、選択された分子に加えて含有し得る。薬学的組成物はまた、一種以上の活性成分（例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬など）を含有し得る。
薬学的組成物は、局所処置が望ましいか全身処置が望ましいか、および処置される領域に依存して、多数の様式で投与され得る。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻孔内が挙げられる）であるか、経口的であるか、吸入によるか、または非経口的（例えば、静脈内点滴、皮下注射、腹腔内注射もしくは筋肉内注射による）であり得る。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、空洞内、または経皮的に投与され得る。
非経口投与のための調製物としては、滅菌された、水性または非水性の、溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油（例えば、オリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エステル）である。水性キャリアとしては、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体が挙げられる）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養素補充物質、電解質補充物質（例えば、リンがーブドウ糖に基づくもの）などが挙げられる。防腐剤および他の添加剤（例えば、抗生物質、抗酸化剤、キレート剤、および不揮発性気体など）もまた、存在し得る。
局所投与のための処方物としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、スプレー、液剤および散剤が挙げられる。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、シックナーなどは、必要または所望であり得る。
経口投与のための組成物としては、散剤または顆粒剤、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、あるいは錠剤が挙げられる。シックナー、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が、望ましくあり得る。
いくつかの組成物は、潜在的に、薬学的に受容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与され得る。これらの塩は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸）、ならびに有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応によって、あるいは無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）、ならびに有機塩基（例えば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、モノアリールアミン、ジアリールアミン、およびトリアルキルアミン、ならびに置換エタノールアミン）との反応によって、形成される。
（（２）治療的用途）
有効投薬量および組成物を投与するためのスケジュールは、実験的に決定され得、そしてこのような決定を行うことは、当該分野の技術範囲内である。組成物の投与のための投薬範囲は、症状が影響を受ける所望の効果を生じるために十分に大きい範囲である。投薬量は、有害な副作用（例えば、望ましくない交差反応、アナフィラキシーショックなど）を引き起こすほど大きいべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるか否かに依存して変動し、そして当業者によって決定され得る。投薬量は、任意の反対適応症（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の場合に、個々の医師によって調節され得る。投薬量は変動し得、そして１日に１以上の容量投与で、１日または数日にわたって投与され得る。所定のクラスの薬学的製品についての適切な投薬量についての指針は、文献に見出され得る。例えば、抗体についての適切な容量を選択する際の指針は、抗体の治療的用途に関する文献（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅら編，Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｊ．，（１９８５）第２２章および３０３−３５７頁；Ｓｍｉｔｈら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒら編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）３６５−３８９頁）に見出され得る。単独で使用される抗体の１日の代表的な投薬量は、上記要因に依存して、約１μｇ／体重ｋｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇまでの範囲であり得る。
開示される組成物（例えば、抗体または他の分子（例えば、ＦＰＡのフラグメント、ブラジキニン、またはそのフラグメント））の投与に続いて、例えば、ＦＰＡ、ブラジキニン、またはそのフラグメントとこれらの同族レセプターとの間の相互作用を形成または模倣するために、治療分子の効力が、当業者に周知の種々の様式で評価され得る。例えば、当業者は、例えば、組成物が、本明細書中に開示されるモデルのいずれかにおいて見られる梗塞形成の量を減少させることを観察することによって、本明細書中に開示される組成物（例えば、抗体またはフラグメント）が、ＦＰＡ、ブラジキニン、またはそのフラグメント、被験体におけるレセプター相互作用を形成または模倣する際に有効であることを理解する。抗梗塞形成活性は、本明細書中に開示されるようなアッセイを使用して測定され得る。活性の任意の変化が開示されるが、コントロールに対して５％、１０％、１５％、２０％、５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の梗塞形成の減少が開示される。
ＦＰＡ、ブラジキニンおよび／またはそのフラグメントとの相互作用を阻害する、ＦＰＡおよびブラジキニンのレセプターと相互作用する他の分子（この分子は、特異的な薬学的機能を有さないが、例えば、細胞染色体内の変化または診断器具の送達を追跡するために使用され得る）が、薬学的製品に関して記載された様式と類似の様式で、送達され得る。
開示される組成物および方法はまた、例えば、種々の虚血、発作、および冠状血管関連疾患のための新たな薬物候補を単離および試験するためのツールとして、使用され得る。
（ｈ）チップおよびマイクロアレイ）
少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示される核酸配列のいずれかに見出される配列または配列の一部である、チップが開示される。少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示されるペプチド配列のいずれかに記載される配列または配列の一部であるチップもまた、開示される。
少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示される核酸配列のいずれかに記載される配列または配列の一部の改変体である、チップが開示される。少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示されるペプチドのいずれかに記載される配列または配列の一部の改変体であるチップもまた、開示される。
（ｉ）コンピュータ読み取り可能媒体）
開示される核酸およびタンパク質は、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸からなる配列によって表現され得ることが理解される。これらの配列を表示するための種々の方法が存在し、例えば、ヌクレオチドのグアニンは、Ｇまたはｇによって表現され得る。同様に、アミノ酸であるバリンは、ＶａｌまたはＶによって表現され得る。当業者は、存在する種々の方法のうち任意のもので任意の核酸配列またはタンパク質配列を、表示かつ表現する方法を理解し、これらの方法の各々は、本明細書で開示されているとみなされる。コンピュータ読み取り可能媒体（例えば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスクまたは他のコンピュータ読み取り可能媒体）におけるこれらの配列の表示が、本明細書において具体的に企図される。また、開示される配列のバイナリコードによる表現も開示される。当業者は、コンピュータ読取り可能媒体が何であるかを理解する。従って、核酸配列またはタンパク質配列が、記録されるか、記憶されるか、または保存されるコンピュータ読み取り可能媒体が、開示される。
本明細書中に開示される配列および配列に係る情報を含むコンピュータ読み取り可能媒体が、開示される。
（ｊ）キット）
本明細書中に開示される方法を実施する際に使用され得る試薬を得るためのキットが、本明細書中に開示される。これらのキットは、本明細書中に記載されるか、または開示される方法の実施において必要とされるかもしくは有用であることが理解される、任意の試薬または試薬の組み合わせを備え得る。例えば、これらのキットは、この方法の特定の実施形態において議論される増幅反応を実施するためのプライマー、ならびに意図されるようにプライマーを使用するために必要とされる緩衝液および酵素を備え得る。
（Ｄ．組成物を作製する方法）
本明細書中に開示される組成物、および開示される方法を実施するために必要な組成物は、他に特に言及されない限り、その特定の試薬または化合物についての分野の当業者に公知である任意の方法を使用して、作製され得る。
（１．核酸合成）
例えば、核酸（例えば、プライマーとして使用されるべきオリゴヌクレオチド）は、標準的な化学合成方法を使用して作製され得るか、または酵素的方法もしくは任意の他の公知の方法を使用して産生され得る。このような方法は、標準的な酵素消化および引き続くヌクレオチドフラグメント単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）第５章、第６章を参照のこと）から、例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ １Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＭｏｄｅｌ ８７００自動化合成機またはＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ）を使用するシアノエチルホスホルアミダイト法による単なる合成方法までにわたり得る。オリゴヌクレオチドを作製するために有用な合成方法はまた、Ｉｋｕｔａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｌｍｅｉｎ．５３：３２３−３５６（１９８４）、（ホスホトリエステル法およびホスファイト−トリエステル法）、ならびにＮａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０），（ホスホトリエステル法）に記載されている。タンパク質核酸分子は、公知の方法（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって記載される方法）を使用して作製され得る。
（２．ペプチド合成）
開示されるタンパク質を産生する１つの方法は、２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを、タンパク質化学技術によって一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、現在利用可能な実験室設備を使用して、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）化学またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学を使用して、化学的に合成され得る。（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、例えば、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、標準的な化学反応によって合成され得ることを、容易に理解し得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成され得、そしてジその合成樹脂から切断され得ず、一方で、ペプチドまたはタンパク質の他のフラグメントは、合成され得、引き続いてその樹脂から切断され得、これによって、末端基を露出し、この末端基が、他のフラグメント上に機能的にブロックされる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントは、それらのそれぞれのカルボキシル末端およびアミノ末端におけるペプチド結合を介して共有結合され、抗体またはそのフラグメントを形成し得る（Ｇｒａｎｔ ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ ＭおよびＴｒｏｓｔ Ｂ．編、（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ（これは、少なくともペプチド合成に関する題材について、本明細書中に参考として援用される））。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、インビボで独立して合成される。一旦単離されると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、類似のペプチド縮合反応を介して連結されて、ペプチドまたはそのフラグメントを形成し得る。
例えば、クローニングまたは合成されたペプチドセグメントの酵素的連結は、比較的短いペプチドフラグメントが連結されて、より大きいペプチドフラグメント、ポリペプチド、またはタンパク質ドメイン全体を生じることを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドのネイティブの化学的連結を利用して、大きいペプチドまたはポリペプチドを、より短いペプチドフラグメントから合成的に構築し得る。この方法は、２工程の化学反応から構成される（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。第一工程は、保護されていない合成ペプチド（チオエステル）を、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の保護されていないペプチドセグメントと化学選択的に反応させて、最初の共有結合生成物としてチオエステルに結合した中間体を得ることである。反応条件を変化させずに、この中間体は、自発的な迅速な分子内反応を起こして、ネイティブのペプチド結合を、連結部位において形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍら、（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；ＲａｊａｒａｔｈｎａｍＫら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：６６２３−３０（１９９４））。
あるいは、保護されていないペプチドセグメントは、化学的に連結され、ここで、化学的連結の結果としてペプチドセグメント間で形成される結合は、非天然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｂｎｏｌｚｅｒ，Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメイン、および全生物学的活性を有する比較的純粋な多量のタンパク質の合成のために使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ ＲＣら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２５７−２６７頁（１９９２））。
（３．組成物を作製するためのプロセス）
組成物を作製するためのプロセス、および組成物を導く中間体を作製するためのプロセスが、開示される。例えば、ＦＰＡまたはブラジキニンに関するタンパク質（例えば、それぞれ表１および表２に記載されるタンパク質）が開示される。これらの組成物を作製するために使用され得る、種々の方法が存在する。例えば、合成化学的方法および標準的な分子生物学方法である）。これらおよび他の開示される組成物を作製する方法が、特に開示されることが理解される。
表１および表２における配列をコードする配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸分子と、この核酸の発現を制御する配列とを、作動的な様式で連結する工程を包含するプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
表１および表２における配列をコードする配列に記載されるペプチドをコードする配列を含む核酸分子と、この核酸の発現を制御する配列とを、作動的な様式で連結する工程を包含するプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
表１および表２における配列に対して８０％の同一性を有するペプチドをコードする配列を含む核酸分子と、この核酸の発現を制御する配列とを、作動的な様式で連結する工程を包含するプロセスによって産生される核酸分子が開示される。
表１および表２における配列に対して８０％の同一性を有し、ここで、表１および表２における配列からの任意の変化が保存的変化であるペプチドをコードする配列を含む核酸分子と、この核酸の発現を制御する配列とを、作動的な様式で連結する工程を包含するプロセスによって産生される核酸が開示される。
開示される核酸のいずれかで細胞を形質転換するプロセスによって産生される細胞が開示される。天然には存在しない開示される核酸のいずれかで細胞を形質転換するプロセスによって産生される細胞が開示される。
開示される核酸をコードする核酸から、開示される核酸のいずれかを発現させるプロセスによって産生される、開示されるペプチドのいずれかが開示される。開示される核酸のいずれかを発現するプロセスによって産生される、天然には存在しない開示されるペプチドのいずれかが開示される。天然には存在しない開示される核酸のいずれかを発現するプロセスによって産生される、開示されるペプチドのいずれかが開示される。
動物中の細胞を、本明細書中に開示される核酸分子のいずれか、または開示されるペプチドのいずれかでトランスフェクトするプロセスによって産生される動物が開示される。動物中の細胞を、本明細書中に開示される核酸分子のいずれかでトランスフェクトするプロセスであって、この動物が哺乳動物であるプロセスによって産生される動物が開示される。動物中の細胞を、本明細書中に開示される核酸分子のいずれかでトランスフェクトするプロセスであって、この動物が、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、または霊長類であるプロセスによって産生される動物が開示される。
また、開示されるのは、本明細書中に開示される任意の細胞を動物に付加するプロセスによって作出される動物である。
（Ｅ．組成物を使用する方法）
（１．研究ツールとして組成物を使用する方法）
開示される組成物は、研究ツールとして種々の様式において使用され得る。例えば、開示される組成物および方法は、虚血の研究における梗塞のモデルならびに梗塞に影響を及ぼす分子を単離するための試薬において使用され得る。
この組成物は、梗塞に関連する所望の機能的特性を有する分子を単離するために、例えば、コンビナトリアルケミストリープロトコルまたは他のスクリーニングプロトコルにおける標的として使用され得る。
この開示される組成物は、マイクロアレイにおける試薬または既存のマイクロアレイをプローブするかまたは分析するための試薬のいずれかとして、本明細書中で議論されるように、使用され得る。この組成物はまた、チップ／マイクロアレイに関する、スクリーニングアッセイの任意の公知の方法において使用され得る。この組成物はまた、例えば、関連性を研究するため、または開示される組成物に関する分子モデリング分析を行うために、開示される組成物のコンピューター読み取り可能な実施形態を使用する任意の公知の様式において使用され得る。
（２．虚血の効果を調節する方法および梗塞を処置する方法）
開示されるのは、発作および冠状動脈疾患および発病、または虚血が壊死組織の発生を引き起こしている任意の疾患の影響を調節するための方法である。例えば、脈管閉塞によって引き起こされる発作もしくは心臓発作の特徴、または特定の組織への血流の喪失または減少によって特徴づけられる任意の他の状態の特徴のうちの１つは、梗塞、または損傷組織もしくは死んだ組織の発生である。梗塞は、組織への血流の喪失が原因で、虚血事象、酸素の喪失によって引き起こされる。虚血事象は、組織または細胞への酸素送達が減少する任意の事象である。開示される組成物は、虚血によって引き起こされる梗塞を減少するための方法において使用され得る。開示される方法は、１種以上の開示される組成物を、これらを必要とする被験体に投与することを包含する。必要とする被験体は、虚血事象を経験し得るか、経験しているか、または経験したものである。開示される組成物が、本明細書中に開示されるように、虚血のマウスモデルにおいて１００％の組織回復を可能にすることが理解される。
特定の実施形態において、この組成物は、虚血事象の間、または虚血事象後０．２時間以内、０．４時間以内、０．６時間以内、０．８時間以内、１時間以内、１．５時間以内、２時間以内、２．５時間以内、３時間以内、３．５時間以内、４時間以内、４．５時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１５時間以内、２０時間以内、またはそれ以上の時間以内に投与され得る。組織が、真の「気絶」組織であって、「冬眠」組織でない場合、救済は、２０時間を超えて起こり得、実際に、虚血事象後数年まで機能し得る。２つの型の非機能組織の間の主要な差異は、気絶組織は、代表的には、完全に回復し、冬眠組織は、代表的には、その組織内に残る、壊死の島を有することである。また、気絶組織は、数年の間、心臓疾患における冠動脈をゆっくりと閉鎖する際のように、非機能的であり得る。このことは、操作され、開放された場合に、機能の回復を示す。
虚血の影響を減少するために有効な、任意の濃度において、組成物が与えられ得る。例えば、この組成物は、少なくとも０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの等量において与えられ得る。例えば、相対成長計測は、例えば、マウスモデルにおいて使用される用量を調べて、ヒトまたは他の動物において等価な用量に達するために使用され得る。例えば、総体表面積は、種等価物を得るために使用され得る。例えば、マウスにおける１０ｍｇ／ｋｇ用量は、３０ｍｇ／ｍ２の総体表面積に相当する。ヒトにおけるその用量、すなわち、ヒトにおける３０ｍｇ／ｍ２用量は、７０ｋｇのヒトに対して、０．７６ｍｇ／ｋｇに等しい。
この用量に言及する別の様式は、血液中の濃度を調べることである。例えば、ヒトにおける０．７６ｍｇ／ｋｇ用量は、約７．６ｍｇ／リットル（７０ｋｇ×０．７６ｍｇ／ｋｇ＝５３．２ｍｇ、５３．２ｍｇ／７リットル＝７．６ｍｇ／リットル＝７．６μｇ／ｍｌ）になる。従って、開示されるのは、投与後の、ＦＰＡもしくはその等価物またはブラジキニンもしくはその等価物または本明細書中で開示される任意の他の活性分子の血漿レベルである。そのレベルは、例えば、少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、または１０００μｇ／ｍｌである。これらの計算は、７リットルの血液容量で仮定したが、本明細書中に開示される技術を用いて異なる血液容量に対して変更され得る。
投薬はまた、ファルマコフォア動力学（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｄｙｎａｍｉｃｓ）およびファルマコフォア速度論（これらは、例えば、活性物質の活性について調節するのみならず、例えば、この活性物質が被験体内で代謝される速度についても調節される）を分析することによって調節され得る。
開示される組成物は、互いと組み合わせて使用されてもよく、同様に、虚血の影響の処置または予防のための他の公知の治療と組み合わせて使用されてもよいことが理解される。例えば、ヒトｔＰＡは、凝塊を減少させるために特定の環境において適用され得る。開示される組成物は、ｔＰＡと組み合わせて投与され得る。別の例は、ＰｌａｖｉｘＴＭであり、ＰｌａｖｉｘＴＭを構成する組成物である。ＰｌａｖｉｘＴＭは、血中の血小板が、凝塊を形成するために協働しないようにする抗血小板物質薬物である。ＰｌａｖｉｘＴＭは、もう１回の心臓発作または発作からの患者の保護に役立ち得る。
開示されるのは、ＦＰＡを被験体に投与する工程を包含する、被験体における梗塞を減少する方法である。
開示されるのは、ＦＰＡが配列番号２に対して、少なくとも２０％もしくは７０％、または本明細書中で開示されるように、任意の他の百分率の同一性を有する構造を含む、方法である。また開示されるのは、配列番号２のアミノ酸８、１２および１３が、変化していない方法、ならびに配列番号２のアミノ酸７、９および１５の任意のバリエーションが保存的置換である方法である。
開示されるのは、ＦＰＡが配列番号２のアミノ酸６〜１６に対して、少なくとも４０％もしくは７０％、または本明細書中で開示されるように任意の他の百分率の同一性を有するアミノ酸を含む方法、およびアミノ酸８、１２および１３が変化していない方法、ならびにアミノ酸７、９および１５の任意のバリエーションが、保存的置換である方法である。
開示されるのは、ＦＰＡがマウスＭＣＡＯモデルに存在する梗塞の量を減少する方法である。また開示されるのは、その梗塞が少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または本明細書中で開示されるように、２０％と１００％との間の任意の百分率で減少される方法である。
開示されるのは、マウスＭＣＡＯモデルにおける梗塞比が１．１、１．５、もしくは２以上、または本明細書中で開示されるように任意の他の比である方法である。
また開示されるのは、その比が平均梗塞容量を使用して決定される方法である。開示されるのは、マウスＭＣＡＯモデルにおけるその平均梗塞容量が９０％、７０％、５０％、もしくは３０％以下、または本明細書中で開示されるように２０％と１００％との間の任意の百分率である方法である。
開示されるのは、被験体における梗塞を減少する方法であり、この方法は、組成物（ここでこの組成物は、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号９６〜１０３に示されるペプチド配列を含む）、ＡＶＲ、またはＦＶＲ、または本明細書中に開示される他の機能的ＦＰＡ配列のいずれかを被験体に投与する工程を包含する。
開示されるのは、そのＦＰＡが配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、または配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号８９、または配列番号９６〜１０３に示される配列、ＡＶＲ、またはＦＶＲ、または本明細書中に開示される他の機能的ＦＰＡ配列のいずれかを有する方法である。
開示されるのは、ＦＰＡが配列番号４６、配列番号４５、配列番号３６、配列番号５０、配列番号３８、配列番号４０、または配列番号５４、配列番号３２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５２、または配列番号３９に示される配列、または本明細書中に開示される他の機能的ＦＰＡ配列のいずれかを有する方法である。
開示されるのは、その梗塞が脳梗塞である方法、およびその梗塞が心筋梗塞である方法である。また開示されるのは、その梗塞が任意の型の梗塞である方法である。
開示されるのは、ブラジキニンを被験体に投与する工程を包含する、被験体における梗塞を減少する方法である。
開示されるのは、そのブラジキニンが配列番号５７に対して、６０％もしくは８０％または本明細書中に開示される任意の他の百分率の同一性を有する構造を含む方法である。また開示されるのは、配列番号５７から離れる任意のバリエーションが保存的置換である方法である。
開示されるのは、そのブラジキニンがＣ末端において塩基性アミノ酸を有さない方法、およびその塩基性アミノ酸がＡｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓである方法である。
開示されるのは、そのブラジキニンがＮ末端において塩基性アミノ酸を含む方法であり、その塩基性アミノ酸がＡｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓである方法である。
開示されるのは、そのブラジキニンが配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、もしくは配列番号８５または本明細書中に開示される任意の他の機能的ブラジキニン配列を有する方法である。
開示されるのは、そのブラジキニンが配列番号５８、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号７７、または配列番号８１に示される配列を有する方法である。また開示されるのは、そのブラジキニンが配列番号５８もしくは配列番号６１に示される配列または本明細書中で開示される任意の他の機能的ブラジキニン配列を有する方法である。
また開示されるのは、梗塞を減少する必要性がある被験体において梗塞を減少する方法であり、この方法は、薬学的に受容可能な形態で有効量のアンジオテンシンＩＩレセプターアンタゴニストを被験体に投与する工程を包含する。
開示されるのは、被験体における梗塞を減少する方法であって、ここでそのアンジオテンシンＩＩ２型レセプターアンタゴニストは、ブラジキニンである。
開示されるのは、梗塞を減少する必要性のある被験体を処置する方法であり、この方法は、薬学的に受容可能な形態で有効量のブラジキニンを被験体に投与する工程を包含する。ここでブラジキニンは、アンジオテンシンＩＩレセプターを調節し、従って梗塞を減少する。
（Ｆ．実施例）
以下の実施例は、どのように本願発明の化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が作製され、そして評価されるかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために提供され、純粋に例示であることが意図されるのであって、特定されない限り、限定することを意図するのではない。数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするための試みがなされたが、いくらかの誤差および偏差は、考慮されるべきである。別段示されなければ、部は、重量部であり、温度は、℃であり、周囲温度であり、そして圧力は、大気圧またはほぼ大気圧である。
（１．実施例１：活性な画分および分子）
開示されるのは、冬眠ウッドチャックの血漿から抽出された分子の精製画分（アルブミン画分、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ−ｂｌｕｅ）（ＶＰＦ）である。特異的細画分Ｄ１およびＤ２を、Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｗａｔｅｒ Ｇａｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいてウッドチャックの初期の冬眠の間に回収した（１２月中旬、冬眠に入って６週間）。個々の動物からの血漿サンプルを、プールした。Ｄ１およびＤ２は、これらの画分が異なるバッチ精製実行の間に作製されたことを除いて、同一であった。単一のコントロール画分を、７月の間に、夏期の活動中ウッドチャックから抽出した（ＳＡ）。バッチ物質を凍結乾燥し、−７０℃で保存した。
「最も近い」コントロール画分を、Ｎｏｒｔｈ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて後期の冬眠の間の血漿の回収後に同様に調製した（ＶＰＦ−Ｃ１）。このＮＥ血漿を、２回の異なる時間に回収し、プールしなかった。ＮＥ１を、１２月中旬に回収し、ＮＥ２を１月中旬に回収した。
脳内（ＩＣ）注入とは対照的に、物質の静脈内（ＩＶ）注射と協働するバイオアッセイモデルを、「血液脳関門」を横切るタンパク質分子および／またはペプチド分子の医療用量を得る複雑性を排除するために、始めに模索した。従って、このＤ１／Ｄ２、ＮＥ１、ＮＥ２、およびＳＡ物質を、１５匹の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）における血圧に対するそれらのＩＶ影響および２５匹の肥満Ｚｕｃｋｅｒラットにおける食欲抑制について試験した。さらなる毒性効果を、肉眼的解剖の観察および個々の内部器官の重量によって評価した。毒性のような効果は、血液尿素（５ｍｇ／ｋｇ）の再循環を刺激する際に最大限有効であることが予備データから分かっているＩＶ用量（５０−ｍｇ／ｋｇ）では認められなかった。Ｄ１およびＤ２の少なくとも８００ｍｇ／ｋｇまでの用量は、毒性ではないようである。２匹のさらなるＳＨＲ動物において、Ｄ２の大きな用量（８００−ｍｇ／ｋｇ）を２部に分けて、３０分離して注射した。ここでも、２４時間以内に、血圧、食欲、器官毒性または死亡率に対する影響は認められなかった。
Ｄ２、ＮＥ２およびＳＡ物質を、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のマウスモデルにおいて、組織救済に対するそれらの効果についてその後試験した。このモデルにおいて、このマウスを、抱水クロラール麻酔下で手術し、中大脳動脈を１時間の間完全に閉塞する。次いで、この閉塞を開放し、脳血流を再確立し、Ｄｏｐｐｌｅｒ−レーザー測定によって確認する。ＭＣＡＯの開始の２４時間後、その動物を、運動行動および脳梗塞サイズ（ＴＴＣ染色，２％）について観察する。１時間のＭＣＡＯを開始してから１時間後の２１匹のマウスにおけるＤ２注射（尾静脈、４−ｍｇ／ｋｇ）は、３回の別個の複製実験（ｐ＜０．０１、ｔ検定）において、２４時間で顕著な組織救済を示した。対照的に、ＮＥ２注射は、ＳＡの類似の用量と比較した場合、何の組織救済も示さなかった（ＮＳ、ｔ検定）。２１匹のＤ２動物のうちの６匹において、９０〜１００％の救済（すなわち、４−ｍｇ／ｋｇで最小限〜検出可能でない梗塞）があり、Ｄ２群については、全体として、組織救済が６３％であった（表７）。
用量応答研究において、Ｄ２の５−ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量は、ＭＣＡＯモデル（１２匹のマウス）において最適であることが分かった。その後の注入時間研究によって、脳虚血（ＭＣＡＯ）の２時間前に注射したＤ２（５−ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）での予備処置が、全ての被験体（６匹のマウス）において１００％の組織救済を生じることが明らかになった。注射がＭＣＡＯの開始から０．５時間後と同様であった場合、同じ結果が生じた。２４時間での梗塞容量の統計的に有意な減少は、ＭＣＡＯの開始から２、４、および６時間後の注射に対して認められたが、８時間後には認められなかった（表７）。これは、予防処置および虚血後処置（ＭＡＣＯの６時間後）が有益であることを示す。
透析研究において、Ｄ２物質を、３．５、７、または１０ｋＤａ（すなわち、Ｄ２から大容量の透析溶液へ通過するペプチド）の分子を通過させる分子ふるい膜を使用して、水、塩化ナトリウム（２Ｍ）、および尿素（８Ｍ）に対して２４時間透析した。膜カットオフを超える分子を有する保持された画分の各々は、ＭＣＡＯモデルの組織救済において有用であることが分かった。しかし、尿素に対して透析された、保持される分子は、ここで、大部分の動物（９匹のマウス）が、全くまたは最小の梗塞容量を示したという点で、なおより有効であった（以下に示される、図６）。この透析実験は、タンパク質が、除去されるそのキャリアまたはインヒビターペプチドから除かれ、次いで、これらのいずれかが、Ｄ２がＭＣＡＯの開始の１時間後に注射される場合に、より一致した組織救済を生じることと一致する。
行動研究により、Ｄ２注射マウスにおける梗塞がないこと、またはその小さなサイズを確認した。自由な場での運動を、１時間の虚血から回復して２４時間後に各動物に与えた。通常のマウスは、その場にある小さなボックスを飛び越える；虚血前の各動物を、そのボックスの頂部に飛びかかる能力を判断した。さらに、足の屈曲および矯正された動き（旋回行動）を書き留めた。９０％〜１００％の救済を有するその動物は、運動血管を何ら示さなかった。脳梗塞を有するコントロールは全て、片麻痺を示した。
最初に、２Ｄゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行って、活性成分をさらに精製するために、ＳＡおよびＤ２画分を比較した。約４０のタンパク質（大部分は、３２−ｋＤａ範囲にある）は、この差示的方法により同定された。ＳＡコントロールの密度より約２倍大きいスポット密度を有する約２０の冬眠特異的タンパク質および２０のアップレギュレートされたタンパク質が存在した。ＳＡゲルおよびＤ２ゲルを、類似のｐＩのストリップに切断し、ＳＤＳ分子量分離のためにこれらのストリップを並んで泳動させることによって作製したＢＡＴＳゲルは、状態依存性２Ｄタンパク質を同定するために使用した別の方法であった。一旦ＢＡＴＳゲルまたは従来の２Ｄスポットが、目的のものであることを決定すると、次いでそれらを、その配列を決定するために、直列質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）およびバイオインフォマティクス「フィンガープリンティング」を使用して、同定した。
ＮＥ２ 対 Ｄ２の差示的比較を使用して、定量的２Ｄゲルを作製し、そのゲルにおいて、ソフトウェアにより、その差示的スポットを整列させ、それらの密度を提供的に測定し、次いで、２倍以上の差を示すスポットに印を付ける。このようにして、わずか９つの純粋なタンパク質スポットが、アップレギュレートされ、そして／または冬眠特異的であると示された（図２、３、５）。これらのスポットのいくつかはまた、ＣＳＦ差異において見出され、目的のものをさらに単離した。これらのスポットを、本明細書中に記載されるように処理して、活性成分をさらに精製および同定し得る。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを、１０ｋＤａ未満の分子の遠心分離フィルタリングを使用して、Ｄ２およびＮＥ２のペプチド画分に対して行った。これらの差示的分子のうちの１つは、従来のフィンガープリンティングにより同定されたが、少なくとも５つの他の分子は、容易には同定することができなかった。しかし、このペプチド画分は、ほとんど目的のものではなかった。なぜなら、それは、発作予防のための活性成分を含まず、かつＤ２ 対 ＮＥ２差示的２Ｄゲルにおいて観察された９つのタンパク質のうちの１つでもないからである。
Ｄ２画分（しかしＮＥ２でもＳＡでもない）におけるタンパク質分子が、マウスの虚血脳組織に対する影響を生じ、１時間のＭＣＡＯ後の発作を予防または最小にすることが結論づけられる。このＤ２分子は、ラットにおける毒性効果は、マウスにおいて観察された有効中心用量より１０倍高いという公にない徴候を生じる。有意な脳虚血後の関連する分子は、ＭＣＡＯから６時間後までに注射すると、発作モデルにおいて顕著な組織救済をもたらしうる。純粋な分子形態は、実際に、図３、５において認められる９つのタンパク質のうちの１つについて可視化されている。
ａ）方法
（１）冬眠場所
Ｎｏｒｔｈ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｗｉｌｄｌｉｆｅの冬眠場所は、約１００匹のウッドチャックを収容する１，０００平方フィートの、温度調節された施設である。動物を、わらの巣を備えた、それら自身のワイヤケージに個々に収容する。各動物を、赤色条件下で３〜４日ごとにチェックして、冬眠の段階を決定する。冬眠の間に採取した全ての血液サンプルを、麻酔として冬眠を使用して、心臓穿刺を介する。
Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｗａｔｅｒ Ｇａｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅでの冬眠は、２０匹のウッドチャックを収容する、５００平方フィートの温度調節された施設である。動物を、食餌室中にワイヤボタンを供える、音響減衰した、２区画の、３／４インチ圧縮木材ケージ中に個々に収容する。睡眠室には、わらの巣がある。より大きな冬眠場所は、完全に遮光したままにする。その動物を、リスニングデバイスによりモニターし、冬眠を開始して６週間後を除いて、すぐ近くでの観察によってはチェックしない。
（２）動物種
ウッドチャックは、冬眠血漿の供給源である。実験用ラットは、最も一般的に用いられる被験体であるので、これらを毒性研究のために使用した。高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）および肥満ラット（Ｚｕｃｋｅｒ）を、高血圧および食欲の研究のため、ならびに毒性の評価のために使用した。Ｃ５７マウスは、発作モデルにおいて最も一般的に使用されるので、これらは中大脳動脈閉塞研究のための被験体であった。
（３）血漿収集（１２月中旬および１月中旬）
ウッドチャックから、心臓穿刺によって１０ｍｌの血液をサンプリングするか、または心臓穿刺もしくは心臓を取り出した後に胸腔に出血する（すなわち、溶血血漿）ことによって放血したかのいずれかであった。収集を２回行った（１２月中旬（冬眠に入って６週間）および１月中旬（冬眠に入って１０週間）。動物を冬眠場所に入らせ、水飲みを与えることによって、冬眠を１１月１日に開始した。Ｎｏｒｔｈ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ ｆａｃｉｌｉｔｙの温度は、３５℃で一定であり、Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｗａｔｅｒ Ｇａｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの温度は、３５℃前後で揺れ動いた。収集した後、その血液を、冷却中で遠心分離する（ＮＥＷ）か、または後に室温で分離するために、氷上に置いた（ＤＷＧＳＩ）。分離（１０分間５ｇ）の後、デカントした血漿を、保存のために凍結した。
（４）試験のための分子画分の調製
Ｄ１／Ｄ２を、１２月中旬に心臓穿刺によって回収したＤＷＧＳＩ血漿から調製した；Ｄ２血（ｈｅｍｏ）を、胸腔への大動脈放血によって回収した溶血血液から作製した。Ａｆｆｉ−ｇｅｌ精製の後、物質を凍結乾燥し、生理食塩水中に溶解したミリグラム量で（Ｍｅｔｔｌｅｒスケール）で投与した。投薬量は、５０−ｍｇ／ｋｇ（ラットにおける毒性研究）および５−ｍｇ／ｋｇ（マウスにおける梗塞研究）であった。全ての注射は、尾静脈において行い、０．１ｍｌ（マウス）および０．５ｍｌ（ラット）のボーラス容量として投与した。
１２月中旬（ＮＥ１）および１月中旬（ＮＥ２）に、心臓内穿刺により回収したＮＥＷ血漿からＮＥ１、ＮＥ２を調製した。注入した凍結乾燥材料を秤量し、そして上記のように溶解させた。ここでの用量および注入は、Ｄ１およびＤ２と同じであった。
夏季である８月に、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）により鎮静された覚醒している生きたままのウッドチャックから血漿を回収したことを除いて、ＳＡをＤ２と同様に調製した。
後頭孔において、ＣＳＦを硬膜の背側穿刺から取った。冬の抽出物は麻酔したウッドチャック由来であり、夏の抽出物は、ケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔したウッドチャック由来であった。透明な流体を１００マイクロリットル容量としてマウスの尾静脈に注入した。重なった骨を取り除いて（２０ｍｍ四方の領域）露出した硬膜を通して、脳内注入を側脳室に行った（１００マイクロリットル容量）。
尿を夏の動物および冬の動物から回収し、そして２Ｄ ＰＡＧＥ（２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルおよび２Ｄ ＢＡＴＳ（２次元分離の２次元バンド分析）の同定のみに使用した。
（（５）Ｄ２の分子ふるい）
Ｄ２物質（３０ｍｇ）を６００マイクロリットルの尿、ＮａＣｌ、または水に５０ｍｇ／ｋｇで溶解した。溶解した物質を、１０Ｋｄまたは３．５Ｋｄ断面の「蛇皮」透析チューブ内にシールした。次いで、シールしたチューブを１００ｍｌの適切な緩衝液中に置き（溶解するために使用する場合と同様に）そして、２〜６℃で１８時間透析した。次いで、透析緩衝液を新鮮な緩衝液と交換し、さらに３時間後、再び交換した。次いで、緩衝液−透析物質を２４時間純水に対して徹底的に透析した。次いで、最終透析物質を従来の手段（真空、水トラップなど）によって凍結乾燥した。尾静脈注入は０．１ｍｌ容量で５ｍｇ／ｋｇの用量であった。
（（６）ＲＲ間隔の測定）
低ノイズ電極（Ｖｅｒｍｅｄ Ａ１０００５）に接続された低ノイズ増幅器（ＵＦＩ ２２８０ ２０，０００ゲイン、０．１〜１０００Ｈｚ）により、ＥＣＧを記録した。この低ノイズ電極を四肢の裸の手のひらに貼り付け、そしてテーピングした。ＥＣＧを１０００Ｈｚでデジタル化し（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、そしてディスクに書き込んだ（Ｃｏｍｐａｑ ｃｏｍｐｕｔｅｒ）。上方（正の極性）トレース（これは、視覚的に調整された１０より大きく１５未満の整数のｄＶ／ｄｔを有した）の第１のゼロ交差によって、Ｒ波を同定した。連続的Ｒ波間のデータ点の数は、ＲＲ間隔（ミリ秒）の測定値であった。ＲＲ間隔の視覚的な確認を、データの１０％において、コンピュータースクリーン上のディスプレイによって手で検査した。ＥＭＧ作動に起因するアーチファクトを、域外値統計量によって容易に同定した。
（（７）中脳動脈閉塞のモデル（マウス））
Ｃ５７マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を抱水クロラール麻酔下（腹腔内）で手術した。右内頚動脈に近接する頸部に、切開を作製した。直径が、内頚動脈のその分岐部における中脳動脈の直径よりわずかに大きいことが既知のポリエチレンオクルダーを、内頚動脈および外頚動脈の分枝における頸部位置から挿入した。オクルダーが適所にある間に、３０分間の注入時間または６０分後の注入時間の両方でＩＶ物質を注入した。尾静脈に挿入された３６ｇａの皮下針を介して、全ての注入を行った。全ての症例において、虚血の１時間後にオクルダーを取り除いた。それまで虚血性であった皮質領域を通じた脳血流の再開を、露出した硬膜表面のレーザーＤｏｐｐｌｅｒ流速測定により検証した。次いで、頚部損傷および頭蓋損傷を閉鎖し、動物を暖かい静かな環境において回復させた（１〜２時間）。完全な回復の後、動物をその個々の飼育かごに戻した。
（（８）挙動による脳梗塞の評価およびＴＴＣ染色による脳梗塞の評価）
手術の回復から２４時間後、動物を運動性挙動について試験する。虚血した半球と対側の四肢の伸長または屈曲を、コントロールとしての同側の四肢と比較した。箱を含む約２インチの高さの自由な環境に動物を置いた。正常なマウスは、数分以内に箱の頂部まで跳躍する。跳躍挙動におけるいかなる異常をも記録した。動物が自発的に動かない場合、背後からの弱い刺激により強制させる。次いで、動物を断頭し、頭蓋骨を取り除く。硬膜を微小なハサミで切断し、全脳を取り除く。次いで、これをカミソリ刃による迅速な脳の切断に使用される金属鋳型に置く。次いで、２ｍｍの脳の薄片を２％の塩化トリフェニルテトラゾリウム（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｅｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液に置き、そして室温で１０分間インキュベートする。次いで、これらの薄片をビデオカメラで撮影し、そしてＰＣ上のディスクに書き込む。次いで、ＮＩＭＨ製のソフトウェアを使用して、各脳切片について梗塞領域を決定する。梗塞容量を脳浮腫の影響についてのコントロールに対する対側に対して正規化する。較正された結果は、立方ｍｍで表現された梗塞容積の測定値である。
（（９）毒性（全器官、動脈圧、摂食挙動））
ＳＨＲ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、バルビツレート麻酔下（３５ｍｇ／ｋｇ）において手術した。ポリエチレンカテーテルを腹大動脈に置いた（週方法、２５）。切開を閉鎖し、動物を２４時間回復させた。試験物質の尾静脈注入は、持続的な血圧モニタリングの間に行った。摂食挙動を、Ｚｕｃｋｅｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）において、体重増加により毎日観察した。試験物質を動物に、尾静脈において注入し、３週間毎日体重測定した。それらを飼育し、自由に摂水させた。血圧研究または摂食挙動研究の完了後、動物を屠殺し、そして、内臓を取り除き、異常を検査し、そして体重測定した。
（（１０）外科手術）
約３５０〜４５０グラムの両方の性別のラット（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｙ）を、ペントバルビタールナトリウムによって麻酔し、気管カニューレ（ＰＥ ２００ ポリエチレンチューブ）を介して接続された小さな動物呼吸器上に置いた。需要換気をモニタリングした。左開胸術を行い、心臓を露出した。次いで、強制換気を、それまでのモニタリング期間の間と同じ速度および容量で設定した。２６ゲージのテーパー点半円針を有する４−０外科用絹糸を、ＬＡＤを含む筋肉領域を通して挿入した。このレベルは、心房から尖までの距離の約１／３であった。４−０縫合糸の端をしっかりと一緒に引き、一度結び、そして迅速解放クランプの使用を介して固定した。ＬＡＤ閉塞の完了の４５分後、濃青色の左心室野によって検証されるように、縫合糸を解放し、それまで結紮されていた部位の組織をマッサージして、結紮内圧の完全な解放を確認した。動脈血の即時の回復が示され、再灌流細動が生じた場合、冷却した組織綿棒により心臓の表面上を穏やかに摩擦することで、除細動した。結紮を解放した直後に、全ての試験物質（Ｄ２およびＮＥ２）を頚静脈カテーテル中に注入した。一旦、細動が、正常な洞調律に転換されると、３時間バルビツレート注入の補給により、動物を麻酔したままにした。
３時間の終りに、ＬＡＤ周囲の縫合糸を再び結び、Ｕｎｉｓｐｅｒｓｅ Ｂｌｕｅ色素を左心房に注入して、全ての正常に灌流する冠動脈を充填した。心臓を取り出し、生理食塩水中で洗浄し、そして鋳型および６カミソリ刃の使用により２ｍｍ厚の薄片にスライスした。スライスした薄片の両側の写真を撮った（各々、Ｃａｎｎｏｎデジタルカメラ、２．１メガピクセル）。次いで、スライスした薄片を、１％の塩化トリフェニルテトラゾリウムを含む、３８℃のインキュベーター浴槽に置いた。ＴＴＣ中でのインキュベーションの３０分後、これらの切片を２度撮影した。
（（１１）梗塞サイズの分析）
第１の系列の写真において観察されるように、青い染色は、正常領域（ＮＺ）を示した。危険性の領域は、ＮＺの外側に存在する写真に残ったままの領域である。この色素は、ＴＴＣ中でのインキュベーションの間、組織から拡散し、第２の系列の写真においてより低い強度であるので、ＮＺは、第１の系列において決定されなければならない。第２の系列において、７片のスライスした組織の各表面を、ＴＴＣ染色（危険性、ＴＴＣの領域における回復した組織）および危険性の領域における梗塞した組織（ＩＮＦ）について試験した。各切片は、平均化された２つの表面測定値を有し、これらの測定値から、％梗塞サイズの容積測定を、各被験体について実施する（ＴＴＣ／ＴＴＣ＋ＩＮＦ）。デジタル写真における目的の領域を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアによりピクセルで測定し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ製のフリーウェア）により独立して確認した。
（（１２）質量分析のためのサンプル調製）
アルブミン画分：５３９μｇの各アルブミン画分（Ｄ２およびＮＥ２）由来の低分子量ペプチドの精製物を、全容量２００μｌまで２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に加え、そして、３ｋｄ ＭＷ Ａｍｉｃｏｎ濾過デバイスを通した。各サンプルからの流れをアルブミンの３ｋｄペプチド画分として保存した。
（（１３）ＭＡＬＤＩ分析のための未標識ペプチドの調製）
１μｌの各ペプチド画分を２５倍または５０倍に希釈し、Ｃ１８「Ｚｉｐ−チップ」を通して処理し、全てのＭＡＬＤＩ干渉物質を排除した。精製したペプチドをＭＡＬＤＩマトリクス中で溶出し、続く分析のためのＭＡＬＤＩ標的上にスポットした。
（（１４）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
５０μｌの０．１％ギ酸を５０μｌのＩＣＡＴに加え、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ中に置いた。この容量を１０μｌまで減少させ、これを２００ｎｌ／分の流速で７５μＭ ＮａｎｏＨＰＬＣカラムに注入した。４０分または７０分勾配のいずれかを使用し、これらのペプチドをＭｉｃｒｏｍａｓｓ ＱＴＯＦ２電子スプレー質量分析計に直接溶出させた。
（（１５）デノボ配列分析）
以下のイオンを配列決定した：ｍ／ｚ ８０９、９０４、１０１０、１０１２、１６２１および１６６２。ｍ／ｚ ８０９、１０１０のイオンは、ＭＡＬＤＩイオン化プロセスからのマトリクスイオンであり、ｍ／ｚ １０１２は、ｍ／ｚ １０１０の第３の同位体である。ｍ／ｚ １６６２の分析は、結論が得られなかったが、ｍ／ｚ ９０４および１６２１は本明細書に記載する。
５３９μｇの各アルブミン画分（Ｄ２およびＮＥ＃２）を全容量２００μｌまで２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液に加え、３ｋｄ ＭＷ Ａｍｉｃｏｎ濾過デバイスに通した（濾過デバイスに基づく任意の分子量を使用し得る）。各サンプルからの流れをアルブミンの３ｋｄペプチド画分として保存した。この物質をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために、逆相カラム上に充填した。勾配流を、ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｕｌｔｒａ−Ｐｌｕｓ ＩＩ二連ＬＣポンプから送達し、そして２００ｎＬ／分まで分割した。カラムのヘッド上に適用された１８００Ｖの電位により、溶出物の電子スプレーイオン化が可能になり、続いて、これをＱ−Ｔｏｆ２タンデム質量分析に導入した。勾配溶出の間に特定の閾値より上に観察されたペプチドイオンにより、機器は自動的に、第１の質量分析器において所望のｍ／ｚを選択し、そして低エネルギー衝突誘導型解離（ＣＩＤ）を実行して、第２の質量分析器において生じた生成物イオンを分析した。生成物イオンデータを手動で解析した。
（（１６）動物の調製）
ラットを手術して、ＩＶ注入のための頚静脈カテーテル、および平均動脈圧の測定のための鎖骨下動脈カテーテルを移植した。手術から少なくとも５日間回復させた後、これらの動物にネオマイシン（５００ｍｌの飲料水に１００ｍｇのカプセル）を３日間与え、腸管細菌（すなわち、幾らかの尿素を可能な限り再利用しうる生物）を減少させた。血液サンプルを採取した日に、血圧測定のために、動脈カテーテルをＳｔａｔｈａｍ歪みゲージ（校正された）に装着した。頚静脈カテーテルを小型の注入用注射器に装着した。この注入器には、０．５ｍｌの生理食塩水に溶解された１ｍｇの二重標識された尿を含んでいた。ベースラインの血液サンプルを頚静脈カテーテルを介して抜き（０．５ｍｌ）、次いで、標識された尿素を注入した。次いで、１５分、１時間、２時間、３時間、および６時間において、血液サンプルをさらに抜いた（各０．５ｍｌずつ）。これらのサンプルを血漿が分離されるまで氷上に置いた。後者を３倍の重力で１０分間回転させることにより得、次いで、ピペッティングした。次いで、約０．３ｍｌの血漿のサンプルを個々に標識し、分析のためのＭｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．への輸送まで凍結し、そして保存した。
（（１７）１５Ｎ２尿素および１５Ｎ１尿素のまとめ）
安定に同位体標識された尿素分析について、まず、アセトニトリルを用いて、血漿サンプルを除タンパク質した。遠心分離後、尿素を２−ヒドロピリミジン（ｈｙｒｏｄｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）に環化し、そしてＢＳＦＴＡで処理した。生じたＴＭＳ誘導体をＮｅｌｓｏｎおよびＲｕｏらの方法（Ｎｅｌｓｏｎ ＪＥ，Ｒｕｏ ＴＩ．Ａｓｓａｙ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｔｏｐｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｕｒｅａ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ． Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．１９８８年１月３０日；１７５（１）：５９〜６５）に従ってヘプタフルオロブチル誘導体に転換した。５９８９Ａ質量分析器に接続されたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ５８９０ガスクロマトグラフィーを、製造者の説明に従って、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＰＣＩ）モードに自動的に切り換えた。未標識の１５Ｎ２尿素（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）および１５Ｎ１尿素（ＣＤＮ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）を含む標準曲線を調製し、分析した。イオンを表示する天然または「未標識」の尿素（ｍ／ｚ＝２９３）、１５Ｎ１尿素（ｍ／ｚ＝２９４）、１５Ｎ２尿素（ｍ／ｚ＝２９５）をモニタリングした。全面積係数を標準曲線と比較し、最終報告に対するモル分率を計算するために使用した。
（（１８）尿素濃度概略）
血漿中での尿素濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）決定のために、尿素とジアセチルモノキシムとの間の色反応の分光光度的分析を使用した。これは、Ｃｒｏｃｋｅｒ（Ｃｒｏｃｋｅｒ ＣＬ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｒ ｐｌａｓｍａ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９６７ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；３３（５）：３６１−５）の方法に基づき、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｉｇｍａ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ｎｏ．５３５）によって提供されるキットにおいて入手可能である。濃度曲線を、準備および分析した。コントロールおよびサンプルの両方の濃度を、較正曲線から直接決定した。最後に、結果を、血液尿素窒素（ｍｇ／ｄｌ）から尿素濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）へと変換した。
（（１９）統計）
サンプルのランダム変動、不偏のサンプリング、および単位正常分布を必要とする有用なパラメーター統計を使用した。独立したサンプル間のスチューデントｔ−試験サンプルを、全ての比較に対して使用した。存在するデータにおいて観察されるサンプル変動に対するβ力は、８より大きなｎに対して９０％より大きかった。
（ｂ）結果）
（（１）自発的死亡および誘発冬眠関連死）
表６は、冬眠の挙動の段階付けならびに自発的死亡および覚醒誘発死の発生を示し、これらの各々を、別々の冬眠設備を使用する２つの研究において独立に観察した。表６は、以下に関連した死を示す：１）深い冬眠にある動物（Ｄ）または２）最後の観察期の間の覚醒（ｄ）。研究１を、大きな市販の施設（Ｎｏｒｔｈ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ）で実施し、動物を、１１月から２月の間で、３〜４日毎にわずかに撹乱して観察した。研究２を、短い静かな冬眠（Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｗａｔｅｒ Ｇａｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において実施し、動物を、完全には撹乱しないようにし、インターコムシステムによってのみ観察した。研究１において約６週で冬眠に入る９匹の動物を、−印で示されるように、１２月２１日に撹乱した。同様に、研究２における全ての動物を１２月１８日に撹乱した。４匹の同じ研究２の動物の同じ撹乱を、１月１２日に再度起こし、誘起覚醒を生じ、続いて、１２時間以内に死ぬ（Ｄ）。全ての場合において、撹乱は、動物を、仰向けにする約１０分の手順である（血液サンプリング、ＥＣＧ記録）。
研究１において、体重が３．２〜５．９ｋｇの１６匹の成体および３．２ｋｇ未満の６匹の幼体が存在した。幼体は、２ｍｍ未満幅の切歯を有した。６匹の幼体のうち５匹（８３％）が、１１月１日から２月２０日の冬眠期間の間に、自発的に死亡したのに対して、１６匹の成体のうち７匹だけ（４４％）が、この期間の間に死亡した。これらの計数は、Ｄ２、ＮＥ１、およびＮＥ２血漿抽出のために、または研究（全て囲われる）における誘発死のために使用される動物を含まない。
１２月中旬において、研究１における９匹の被験体（２幼体、７成体）の各々は、それらの肢で立たせることによって覚醒する一方で、これは、仰向けにされた；血液サンプルをまた、採取した。３匹のウッドチャックは、冬眠中であったが、５匹の成体および１匹の幼体は、深い冬眠中であった。覚醒手順は、２４時間以内に死を生じず、６匹の冬眠体全てにおいて、冬眠が継続された。目覚めを十分にするための９の場合の自発的覚醒（下線を引かれる）が１２月２６日より前に存在し、この日の後に７の場合存在し、致死に関連する目覚めへの正常な自発的移行はなかった。
研究２において、各動物を、その肢の掌につながれたＥＣＧ電極を用いて最初に観測した。被験体は、４匹の成体および４匹の幼体ウッドチャックであり、全ては、１２月中旬（１２月２１日）に深い冬眠にあった。４匹の幼体および４匹の成体を、これらの肢を伸ばすことによって覚醒したが、動物は、仰向けであった（表６）。図１に示されるのとは（覚醒）違い、目覚めという結果まで十分に覚醒した場合はなかったが、全ての場合において、部分的覚醒のＥＣＧ徴候が存在した。すなわち、ＲＲ−間隔は、８分覚醒期間の間全身的に減少するが、これらは、２時間以内にこれらの前のレベルに戻った。これらの動物は死ななかった。
１月中旬において、２匹の幼体および２匹の成体（研究２）を、同じ手順によって覚醒した。４匹の被験体全てにおいて、ＲＲ間隔は、覚醒手順の間および覚醒手順の後、短くされ、重篤な徐脈の挿話を、２時間以内に観察した。各動物は、続いて、十分な目覚めまで覚醒され、移動性になり、次いで、６〜１２時間の期間（Ｄ）内に死んだ。
図１は、心臓データにおける重篤な徐脈の実施例を示す。ＲＲ間隔は、時々、かなりのＥＭＧアーティファクト（シバリング（ｓｈｉｖｅｒｉｎｇ））が含んだが、ＲＲ間隔の平坦な体系的減少が生じ、連続的なＱＲＳ複合体の観察によって確認された。図１における１月中旬において、覚醒後、動物を、そのわらの巣に戻し、５２分間その「球状にされた」位置に置かれる。電極を、接触させたままにし、動物を、移動性になった後、２時間後に記録するが、その巣の外に移動するほど、なお十分移動性ではなかった。「シバリング」の型は、共通のシバリングにおいてより遅い筋収縮の間、現れ、これは、全ての被験体において明らかであった。動物を、覚醒の開始の後、２時間〜６時間の間モニターせず、冬眠条件に戻る機会を可能にした。
覚醒手順の開始の６〜１２時間以内に、４匹の１月中旬被験体の各々は、その巣の区画の外での死を見出された。３つの場合において、動物は、食餌区画において死が見出され、１つの場合において、動物は、１フィートの壁をよじ登り、開放されたホームケージを脱出した。
（表６−冬眠死亡数）
Figure 2005532263
Figure 2005532263
［表６続き］
表６
年齢（Ａ）：Ｊ＝幼体（１年）、Ａ＝成体。体重（Ｗ（ｋｇ）、１１月１日）。冬眠の段階（上に示される日付で）：５＝覚醒、４＝活動停止、３＝冬眠しているが、「ボール位置」から伸びることによって接触に対して反応する、２＝冬眠しているが、部分的に伸びることによってゆっくりと反応する、１＝深く睡眠しており、接触に反応性ではない。
死（囲われた）：Ｄ＝３日前以内の記載された冬眠の後の自発的死亡；ｄ＝３日前以内の記載された目覚めの後の自発的死亡；Ｄ＝誘発覚醒の後６〜１２時間以内の誘発死。誘発覚醒：−ｎ＝動物が、「ボール位置」から伸ばされ、その一方で、示された段階にある。自発的覚醒：各覚醒の段階５は、下線を付される。血漿サンプル（囲われた）：＊＝冬眠期間に取られた血漿サンプルが示される；プールされたサンプルの名前が右に省略される。
（（２）Ｄ２は、発作を防止するが、ＮＥ２は防止しない）
５ｍｇ／ｋｇの分子画分Ｄ２の尾静脈注射の効果およびその最も近いコントロールＮＥ２を、測定した。これらの結果は、タンパク質／ペプチド画分（Ｄ２）が、外枝との二又の近くの内部頸動脈へ挿入されたオクルダーによって、中大脳動脈の閉塞を受容した発作Ｃ５７マウスのマウスモデルにおける細胞死および運動機能の喪失を防止し得ることを示す。１時間の閉塞後、Ｄ２にまたはその最も近いコントロールＮＥ２に、ＩＶ（４ｍｇ／ｋｇ、尾静脈）を注射した。次いで、オクルダーを、除去し、動物を回復させた。正常な血流の再確立を、レーザー−ドプラー測定によって確認した。２４時間後、動物を、運動欠損について行動的に観察し、そして屠殺した。各脳を、迅速に取り出し、２ｍｍ切片に切断し、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ、２％）中でインキュベートした。ＴＴＣ分子は、正常に機能するミトコンドリアに結合し、可視のニューロンを、暗く染められた赤色組織に変える。切片を、虚血の開始１時間後にＤ２注射を受けた動物から取った。動物は、続いて、正常な挙動を示したが、運動欠損を示さなかった。切片をまた、虚血の開始１時間後にＮＥ注射を受けた動物から取った。全ての注射を、ＭＣＡＯの開始の１時間後に送達した。これらの結果は、初期冬眠分子が、マウスＭＣＡＯモデルにおいて組織保存効果を有することを示す。このような分子は、後期冬眠（ＮＥ２）の間存在せず、その欠損は、自発的死亡および誘発死の高い発生率に関連する。
梗塞容積（ｍｍ３）の定量化された測定を、Ｄ２およびそのコントロール（ＮＥ２、ＳＡ）を用いる３の応答実験の各々について、表７にまとめられる。第４のＤ２実験において、尾静脈注射は、オクルダーを適所に静置して、中大脳動脈閉塞の開始の３０分後に起こった。これらのサブグループのいくつかのメンバーからの染色された切片および髄液を注射した動物からの染色された切片を回収し、物質はまた、有意な組織保存を生じた。脳虚血の標準マウスモデルにおける応答実験（Ｒ１−Ｒ３）は、Ｄ２およびＮＥ２状態依存性分子画分の尾静脈注射を使用した。各対の切片は、この群において最大の組織保存量を有する単一の動物からのものである。各標識の右の対にされた数は、１００％保存を示す各群における動物の数 対 保存がより少ない各群における動物の数を示す。３つのＤ２応答実験に対する平均保存は、０％保存を定義するＮＥ２コントロールに比べて７７％である（ｐ＜０．００１）。このモデルは、１時間閉塞の中大脳動脈（抱水クロラール感覚脱失）を使用し、その後、血流の回復および物質の尾静脈注射を使用した。梗塞サイズを、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（２％）染色およびコンピューター化された容量ソフトウェアを使用して決定した。注射は、尾静脈に１０ｍｇ／ｋｇ（Ｄ２、ＮＥ２）ＩＶおよび１００μｌ（ＣＳＦ．ＩＶ）および２．５μｌ（ＣＳＦ．ＩＣ）であった。
梗塞された容積の顕著な保存を、正常なオープンフィールド挙動（フィールドに配置された小さな箱の上での跳躍を含む）によって確認した。梗塞容積の全ての部分的な保存は、運動挙動の部分的な回復（肢の弱さおよび跳躍の不正確さ）のみに関係した。全てのコントロールは、オープンフィールドにおける強制的旋回挙動および自発的挙動の一般的非存在と関連する通常の挙動的半側麻痺を示した。
梗塞容積に対する用量応答（すなわち、保存）を、表７に示す。より大きな用量に対する逆向きＵ型曲線に留意のこと。最も有効な用量は、これが、最小の梗塞容積に関連する場合、５ｍｇ／ｋｇである。
明らかな毒性を有さない、かなりより大きな用量を、成体ラット（ｎ＝２５）において研究した。尾静脈注射によって投与された５０ｍｇ／ｋｇの用量は、器官または器官重量の肉眼解剖学、動脈血圧、温度あるいは食餌挙動に対して有意な影響を有さなかった。後者を、毎日注射した３週間にわたって研究した。８００ｍｇ／ｋｇまでの大量の用量は、血圧または２４時間以内の死のいずれかに対して影響せず、２匹のさらなるＳＨＲラットにおいて耐性があった。
分子のＮＥ２画分、ＳＡ画分およびＣＤ画分は全て、互いに統計的に異なった。コントロールとしてこれら（ｎ＝１６）を全部一緒に組み合わせることおよびこれらをＤ２群（ｎ＝２１）と比較することは、高いβの冪（β＞．９０）を有する高度に統計的に有意な差異（ｐ＜０．００１、ｔ−試験）を生じた。
（表７−マウスＭＣＡＯモデルにおける大脳梗塞容積（ｍｍ３）
Figure 2005532263
（（３）Ｄ２の分子ふるいおよび透析処理：効力の増大）
以下の表８（分子ふるい実験）に示すように、１０−ｋＤａのフィルタ画分および３−ｋＤａのフィルタ画分を備える閉じた膜管内にＤ２物質を入れ、次いで、このＤ２物質を、８Ｍ尿素、２Ｍ ＮａＣｌ、または水で、２４時間にわたって低温（４℃）で透析してペプチドを洗い流したところ、活性分子は除去されなかった。むしろ、尿素処理により、Ｄ２中の活性分子の活性が増大するようであった。透析が、潜在的なペプチドインヒビターを洗い流すことによってか、または活性成分の担体タンパク質（アルブミン）から活性成分を遊離させることによって、効力を増大させた可能性がある。この結果は、１０−ｋＤａの質量を超える１つ以上の分子が、活性成分を輸送する分子であるということだった。なぜなら、１０−ｋＤａの質量を超える１つ以上の分子が、透析されたＤ２物質（次いで、ＭＣＡＯマウスモデルにおいて試験され、そして有効であると見出される）中に保持されるためである。
（表８ Ｄ２の分子ふるい濾過（１０−ｋＤａおよび３．５−ｋＤａ）ならびに透析（尿素、塩、水）：ＭＣＡＯマウスモデル（３匹／群）における梗塞容積（Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ）（ｍｍ３）に対する効果（４ｍｇ／ｋｇ））
Figure 2005532263
（（４）２Ｄゲル同定およびフィンガープリント同定）
図２（上側）は、２つの二次元、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、このゲルにおいて、ＳＡ（状態＃１、ＮＥ）物質およびＤ２（状態＃２、Ｄ２）物質は、固有のｐＩ（ｘ軸）および質量（ｙ軸）の純粋なタンパク質のスポットとして視覚化される。状態＃１中の多数の小さなスポットは、灰色であり、中心点に黒色密集がない。従って、単一の黒色画素が、各々の中心点中に、コンピュータ視覚化によって配置され、その結果、黒色の透明なオーバーレイが作製され得、状態＃２ゲル上に重ね合わせ得た。状態＃１画素を有する状態＃２の拡大されたボックスにおいて、両方のスポット（すなわち、タンパク質）を隣接して示す状態＃１単一画素を有する小さな灰色の状態＃２スポットが、両方の状態に存在する。従って、隣接した状態＃１単一画素のないこれらの状態＃２灰色スポットは、状態＃２に固有である。拡大したボックス（下側）において、斜位の標識は、いくつかの状態＃２に固有のタンパク質を示す。２Ｄゲル全体にわたる全ての状態＃２に固有のスポットの数が、２０個見出された。別のさらに２０個のスポット（おおよそ）が、ｃｏｍａｓｓｉｅ−ブルー染色に対する少なくとも２倍より大きい密度によって証明されたように（すなわち、暗黒色の中心点に対する明灰色）、状態＃２においてアップレギュレートされた。
一旦、目的のスポットが同定されると、次いで、タンデム質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に供される。まず、ゲル上のスポットを切り取り、タンパク質を溶出する。次いで、純粋な分子を質量分析ビームに注入し、それらの分子の質量を測定する。ビームの間、分子は、第二のビーム（分子を所定のアミノ酸結合で分解する）に衝突される。フラグメントの後者のビームは、指紋が人に対して固有であるのと同様に、分子に固有である出力を生成する。一旦、この分子の「指紋」が作製されると、次いで、その「指紋」が、分子構造によって正確に置かれた、全ての大きなデータベースにおいて検索される。目的のスポットが既に既知のタンパク質であるならば、それは、容易に同定される。
図３は、ＢＡＴＳゲル上におけるこれらの同定された差次的なスポットの位置を示し、このＢＡＴＳゲルは、ｐＩ勾配が作製された後に、細片に切断され、他の状態で作製された細片に隣接して交互に配置されること以外は、２Ｄゲルに類似している。次いで、質量勾配が、全ての交互の細片の対について実行される。ここで留意すべきは、状態＃２スポットは、より大きく高い解像度の２Ｄ−ＳＤＳゲルで同定されるほど多くは、ＢＡＴＳゲル上では同定されないことである。つまり、図２に示すように、より高い解像度の２Ｄゲル上で見出された２０個のスポットと比較して、ＢＡＴＳゲル上で、４〜７のｐＩで、わずか９個の状態依存性スポット（青色の円）が、見出された。同定された３つのタンパク質は、データベース（マクログロブリン２α、血清アミロイドＡ１、および夏季特異的な（ｓｕｍｍｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）トランスサイレチン）において構造化されることが見出される。
図４は、６〜６．５のｐＩ範囲の目的のスポット（円で囲まれた）を有するＢＡＴＳゲルを示す。このさらに小さいｐｌ範囲は、４〜７の範囲の図３において同じく見られた大多数の差次的スポットを示した。ＮＥ２は、最良のコントロールとして、ＳＡ中に見出されなかったタンパク質バンドを示す。
図５は、最良且つ最も近いコントロールを有する、最良且つ最高の解像度ゲルを示す。それゆえ、最も少数の状態依存性スポットが同定され、そのスポットの１つは、ＭＣＡＯモデルにおける組織貯蓄効果の基礎をなす（Ｄ２−ＮＥ２）。この図のＣＳＦおよび尿パネルは、冬の冬眠物質を、それぞれの夏のコントロールと比較した。Ｄ２を、その最隣接であるＮＥ２と比較した。これらの２つの２Ｄゲルにおいて、各一対の一致するスポットが、コンピュータソフトウェア（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）による定量的な比較で選択され、その中で、コンピュータが、全てのスポットのアラインメントを最大にするまで変化し続ける１つの２Ｄゲル中で滑らかに変化した空間的勾配を用いて、一致するスポット中心点の座標を計算する。これらのスポットを、まず空間的に並べ、次いで、各スポットについてのグレースケール密度を、その全ゲルに対して標準化し；この標準化により、ゲルを作るために使われる同じサンプル容積間の濃度差を補正し；この方法により、各ゲルについて同じタンパク質を推定する。次いで、２つの状態の間のタンパク質存在量における相対的な差異が、標準化されたグレースケール密度から、各スポットについて決定された。
Ｄ２ 対 ＳＡについて見出された４０個の状態依存性の増加の代わりに、わずか９個の状態依存性の増加が、Ｄ２ 対 ＮＥについて見出された（図５、上段左側パネル、暗色スポット、図３）。さらに、後者の比較において、状態＃２（冬眠、黄色スポット）の間、２倍を超える減少を示す４つのスポットが存在することが見出された。ＣＳＦ（冬眠 対 非冬眠）は、さらに多数のアップレギュレートされたタンパク質（緑色スポット）を示し、これらのいくつかは、標準化によって補正されなかった濃度差に起因した（青色スポット）。尿は、さらに多数のアップレギュレートされたタンパク質およびそれらの代謝フラグメントを示した。
（（５）注入の時間は、梗塞サイズを決定する）
図６は、Ｄ２（５ｍｇ／ｋｇ）を用いた前処理が、ＭＣＡＯのマウスモデルにおける脳梗塞をほぼ完全に予防し得ることを示す。垂直のバーは、平均値付近の＋／−標準偏差を示す。ＭＣＡＯの開始の１時間後の３０分から２時間での注射はまた、特に、８Ｍ尿素を用いたＤ２処置（ＵＲＥＡ透析）後の梗塞形成容積（ｐ＜０．００１）の減少に主要な影響を及ぼし得ることが、明らかである。また、梗塞形成サイズの平均値の２０％の減少は、ＭＣＡＯの開始後６時間までの注射によってもなお発生し得る（Ｐ＜０．０５）。
（（６）Ｄ２中のペプチド）
図７は、各物質が遠心性運動によって１０−ｋＤａ膜を通過して濾過される場合、Ｄ２およびＮＥ２についてのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ結果を示す。これらのＤ２に富むペプチドのうちの１つは、フィブリノペプチドＡであることが、分子フィンガープリント法および生命情報科学によって同定された。この方法を用いた差次的Ｄ２ 対 ＮＥ２比較におけるペプチドがほとんどなかったので、別の差次的アプローチが求められた。
状態依存性のペプチドを同定するためのいわゆるＩＣＡＴアプローチは、重水素（重水素２および重水素８）の２つの異なるアイソトープによるシステインの差別的な状態依存性の標識化を用いる。しかし、この方法を実用的にするために、Ｄ２ペプチド画分、すなわち１０ｋＤａ画分未満において、十分にシステイン標識された分子が存在しなかったことが分かった。
（（７）データ）
大多数の冬眠−関連死が、１２月２６日に、または１２月２６日以降に開始し、そして１月下旬に及ぶ、冬眠の後期に起こるようである（表６）。これらの集中した死亡率は、冬眠（５Ｄ）または覚醒（７ｄ）の期間に従う。１月中旬に誘発された覚醒の直後に誘発される死は、１月中旬に起こる（４Ｄ）が、１２月中旬には起こらない。１２月中旬の自発的な覚醒も誘発された覚醒もどちらも、１月中旬における死亡数のような死亡数をもたらさない。
１月における自発的な死および誘発された死は、血中に循環する１つ以上の分子（覚醒が、１２月初期から中旬に起こる場合、これらの分子が存在し、そして保護する）の損失に関連するようである。この循環する１２月−分子（Ｄ２画分）は、虚血傷害に対する保護のためのメカニズムに関連するようであり（表７）、そしてこの保護は、１月には存在しない（ＮＥ２画分）。
虚血傷害に対する保護は、冬眠の開始および冬眠からの覚醒の間の脳および心臓に対する組織損傷を妨げるために発達したにちがいない。このような傷害の１例は、覚醒状態に関連する歩行行動（ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ ｂｅｈａｖｉｏｒ）が、循環によって十分に支持されていない場合に生じる（図１）。この生理学的危機は、１２月中旬ではなく、１月中旬に誘発された覚醒の全ての場合に観察される。
１２月２６日以降（すなわち、表６の中心の縦軸の右側）の自発的な死の集積性は、死亡する動物の５０％が、この日付後の３週間以内に死亡する集積性である。２月中旬までの全体の自発的な死亡率は、５５％（２２匹の動物のうちの１２匹）である。自発的な死の発生率は、成熟マーモット（５０％、１６匹のうちの８匹）よりも幼若なマーモット（８３％、６匹のうちの５匹）に関して、より高い。
１２月中旬の間の自発的な覚醒（研究１、下線を引いた、９つの場合）は、切迫した死を伴わず、虚血−保護分子が豊富に存在することを示唆する知見およびこの仮説は、発作マウスモデルへの１２月の血漿画分の分子（Ｄ２）の注射によって確認される（表７）。１月中旬の血漿画分（ＮＥ２）の注射は、発作モデルに影響を及ぼさず、この保護分子の欠如が、この集中した死亡期間の間の高い死亡率に関連している（表７）。
１２月中旬期間（研究１における１２月２１日の全て、および研究２における１２月１５日の全て）の間の誘発された覚醒は、全く死をもたらさない。むしろ、ＥＣＧデータによって少なくとも部分的に覚醒されたことが示唆された冬眠動物（図１、１２月中旬）は、全て、冬眠に首尾よく戻る（図１、生存）。研究１における１２月２６日の２つの死が、誘発された覚醒の５日後に発生し、従って、この刺激と関連していないことに留意すべきである。対照的に、１月中旬の「集団−死」期間の間の誘発された覚醒は、１００％のこれらの動物のその後に続く死を伴う歩行行動および重篤な徐脈をもたらした。
死が、１月の自発的な覚醒（表６、下線）の間に常に発生するとは限らない理由は、以下のいずれかによって説明され得る：
１）これらの生存動物における、代謝の要求（歩行行動）と循環支持との間のより良い適合；または、
２）自発的な覚醒に伴うが、誘発された覚醒には伴わない、虚血−保護分子の第２の活性な分泌。
第一の可能性は有り得ない。なぜなら、支持する生理学の現象に関する証拠が全く無しに、１月に誘発された覚醒を経た全ての動物（研究２）が、１２時間以内に死亡したためである。しかし、第二の可能性は、冬眠初期に存在するが、冬眠後期には存在しない分子の保護効果の知見から解釈されたように、より有り得るように思われる。つまり、虚血保護分子の分泌は、冬眠の開始時に一時的であり、そして高レベルは、１月に入った冬眠の間中は維持されない；従って、この分子は、自然な覚醒プロセスの一環として、２度目に分泌されなければならない。死をもたらす１月の自発的な覚醒は、誘発された覚醒のように、あまりに急速すぎて、保護分子の不十分な分泌（つまり、生存に必要な程度には不十分な分泌）が生じている可能性がある。
保護分子は、１０ｋＤａを超える質量のタンパク質のようであり、従って、ペプチドを除去する透析の間に洗い流されない（表８）。抗発作効果についての候補である、差次的なアップレギュレートされた分子および／または状態特有の分子の全てを、図５に示す。４つの同定された分子は、マクログロブリン２α、血清アミロイドＡ１、トランスサイレチン、およびフィブリノペプチドＡである（図３および図７）。
特定の抗発作分子は、図５（Ｄ２−ＮＥ２）において同定された９つの暗色スポットのうちの１つであり得、それは、「最も近い」コントロールを使用する。有効分子はまた、それ自体が神経保護作用を有するＣＳＦ（分子の画分）中に見出されるので（図６、表７）、従って、図５の２つの上側パネルの比較により、なおさらに少数の目的のスポットをもたらし得る。大きいアルブミンスポットの左側の大きい緑色スポットは、２つの上側のパネルによって示された単一の正確にオーバーラップしているスポットである。このスポットの左下方向の別のスポットは、オーバーラップしているスポットであり得る。
効力を有するサブ画分を追跡するためのＭＣＡＯ−バイオアッセイを用いたＤ２物質の数回の分子カットの試験が実施され得、そしてこの試験は、所望の特性を有する分子を単離する別の方法である。
まさにこの抗発作分子はまた、図１に示されるような心臓血管性の原因が存在する場合、冬眠からの回復において虚血性の死をもまた回避する分子のようであるので、抗心臓発作効果を有する可能性がある。この抗虚血分子が、血液から収集される場合、脳に特異的であると考える理由はない。
（（８）Ｄ２およびＮＥ２ペプチド画分（３ｋＤａ．画分）におけるフィブリノペプチドＡのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ同定）
図７は、Ｄ２−濾過物質（３ｋＤａ．画分）とＮＥ２濾過物質（３ｋＤａ．画分）との両方についてのスペクトルを示す。いずれの場合にも、Ｄ２またはＮＥ２フロースルーを、ＬＣタンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。以下のイオンが配列決定された：ｍ／ｚ ８０９、９０４、１０１０、１０１２、１６２１および１６６２。イオンｍ／ｚ ８０９およびイオンｍ／ｚ １０１０は、ＭＡＬＤＩイオン化プロセス由来のマトリックスイオンであり、ｍ／ｚ １０１２は、ｍ／ｚ １０１０の第３のアイソトープである。ｍ／ｚ １６６２の分析は、決定的ではないことが判明し、ｍ／ｚ ９０４およびｍ／ｚ １６２１の分析が、本明細書中に記載される。フィブリノペプチドＡがｍ／ｚ １６２１で表されたイオンであり、そしてブラジキニンがｍ／ｚ ９０４で表されたピークであることは、明瞭である。他のスパイクは、原料物質を保持するマトリックスのフラグメントとして同定された（アスタリスク）。６つのペプチドは、ＮＥ２冬眠中期の画分中において、より豊富であった（マイナス記号）。
（（９）ウッドチャックＦＰＡの固有の構造）
表９は、ウッドチャックＦＰＡの配列を示す。
（表９）
ウッドチャックフィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ−ｗ）の配列は、トリプシン処理フラグメントと組み合わせたＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって決定した。
Figure 2005532263
＊位置９のアミノ酸（Ｌ）は、実際はＩであり得る。なぜなら、両方のアミノ酸はおよそ同じ分子量であり、そしてこの質量は、フラグメント質量に十分に分解されなかったからである。上記の表１に示された大多数の他の種と同様に、マウスは、この位置にＬを有する。従って、９番目の位置のＬとＩの両方を有するフラグメントが開示される。
産物イオンデータの広範な分析に続いて、指示された部分的なペプチド配列が提案された。ロイシン／イソロイシンは、異性体であり、低いエネルギーＣＩＤによって区別され得ないことに留意すべきである。Ｄ２サンプルの第２の１５μＬアリコートは、１μＬの純無水酢酸の添加によって誘導（Ｎ−アセチル化）された。Ｎ−アセチル化が、１級アミン基（Ｎ−末端およびリジン側鎖）を誘導することに留意すべきである。この反応を５分間進行させ、そして、上記のように、結果として生じる溶液を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。
示された完全なペプチド配列は、産物イオンデータの両方のセットの考察に続いて解明された。位置５のリジンの存在は、誘導化されないサンプルにおける断片化パターンに、大いに影響を及ぼした。Ｎ−アセチル化の後に続くより低い塩基性側鎖への変換により、改変されたペプチドの再分析の際に、より完全な断片化が起こることが可能になった。推定の配列を有する公開データベースの検索によって、このペプチドがフィブリノペプチドＡであることを示した。
ｍ／ｚ ９０４ピークで表された分子の配列は、脱アルギニン１（ｄｅｓ−ａｒｇ１）ブラジキニンであることが決定された（図１０〜１１を参照のこと）。
（１０）マウス−ＭＣＡＯモデルにおいて試験されたヒトＦＰＡ（ＦＰＡ−ｈ）の独特の機能
以下の表９は、脳卒中のマウスモデルにおけるＦＰＡ−ｈの試験の結果を示す。ＦＰＡ−ｈとＮＥ２に対する平均梗塞容積の間に統計的有意差が見られる（ｐ＜０．０１）。各セルは１匹のマウスを示す。平均および標準偏差を付けた同じデータを図１２に示す。
これらの結果は、梗塞サイズの顕著な減少を生じる、Ｄ２ペプチド 対 ＮＥ２ペプチドの統計的に有意な差異を示す（Ｐ＜０．０１）。これらはまた、これらのペプチドのうちの１つ（ＦＰＡ−ｈ）が、１０μｇ／ｋｇ（すなわち、Ｄ２の用量の１／１０００倍）で、マウス−ＭＣＡＯモデルにおける梗塞サイズの統計的に有意な減少を生じ得ることを示す。
（表９）
Figure 2005532263
表９。分子の冬眠関連画分および合成ヒトフィブリノペプチド−Ａ（ＦＰＡ−ｈ）の、マウス−ＭＣＡＯモデルの梗塞サイズ（ｍｍ３）に対する作用。Ｄ２＝初期−冬眠アルブミン画分；ＮＥ＝ＮＥ２ 中期−冬眠；ＳＡＡ＝血清アミロイドＡ；Ｄ２−０，Ｄ２−２００，Ｄ２−６００，ＮＥ２−０，ＮＥ２−２００，ＮＥ２−６００＝アニオン交換カラムから物質を溶出するために用いられたＮａＣｌ濃度。全ての動物を、投与された全ての試験物質について１０μｇ／ｍｌの用量で処理した。
（表１０）
Figure 2005532263
表１０は、マウス−ＭＣＡＯモデルにおけるＦＰＨ−ｈ注射（ＩＶ）についての生データを示す。各列は、各マウスについての、４つの各々の近接する２ｍｍスライス（頭側から尾側）の梗塞領域（ｍｍ２）ならびに同側および対側半球の関連領域（ｍｍ２）を示す。下のパネルに示す５つの対象は、コントロールとしてサマーアルブミン画分を注射した（ＳＡ）。各動物に対する投薬量および総梗塞容積を表１１に示す。
（表１１）
Figure 2005532263
表１１は、マウス−ＭＣＡＯモデルにおける％梗塞容積に対するＦＰＡ−ｈ注射（ＩＶ）の効果を示す。各列は、表７の同じ動物に関し、以下を示す：注射した分子（ＦＰＡ＝ＦＰＡ−ｈ、ヒト配列）、投薬量群同定番号（＃）内の投薬量（μｇ／動物）、同側半球の半分の容積（ｍｍ３）および同側半球の％梗塞容積。下の方のパネルは、コントロール（サマーアルブミン画分、ＳＡ）を示す。上の方のパネルと下の方のパネルとの間の％梗塞容積の平均差異のｔ−検定は、ｐ≦０．００００５の関連したαレベルを有する。
試験されたＦＰＡの最初の下位列は、分離されたＣ末端およびＮ末端であった。ＦＰＡおよびそのペプチドフラグメントを合成し、そして、マウス−ＭＣＡＯモデルにおいて試験した。ＦＰＡのヒト形態（ＦＰＡ−ｈ）（マーモット形態（ＦＰＡ−ｗ）ではない）は、表１０〜１２に示すように抗梗塞分子として有効である。ＦＰＡ−ｗのＮ末端は有効でない。しかし、Ｃ末端は有効である。さらに、Ｃ末端の有効性は、他のアップレギュレートされたＤ２ 対 ＮＥ２ペプチド、ブラジキニンの同時投与によって増強される。
（表１２）
合成されたマーモットフィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ−ｗ、９位にＩまたはＬのいずれかを有する）またはその３位のリン酸化形態（Ｐｈ ＦＰＡ−ｗ）またはその下位列フラグメント（Ｎ末端またはＣ末端）もしくはブラジキニン（Ｄｅｓ−Ａｒｇ−ＢＫ、ａｄＢＫ；ブラジキニン、ＢＫ）または（Ｃ末端と結合したａｄＢＫのＩＶ注射（ＦＰＡ−ｈまたはその分子等価物の２５０μｇ／マウス）のマウス−ＭＣＡＯモデルにおける効果（同側半球における％梗塞）。群平均を太字で示す。
Figure 2005532263
Figure 2005532263
＊正規片側ｔ−検定が用いられる場合、結合し、結合コントロールと比較したＦＰＡ−ｗ（Ｉ，Ｌ）は、統計的に有意でなかった（ｐ＜０．０４２１）。対照的に、ＦＰＡ−ｗのＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍ−ｗ）は、非常に統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１０）。ＢＫ群もまた、個別にまたは混合して、非常に優位であった（ｐ＜０．００３００）。前の表からのＦＰＡ−ｈ群（ＦＰＡ−ｈ）は、全ての中で最も高く有意な群であった（ｐ＜０．００００３）。ｄａＢＫとＣ末端フラグメントの組み合せは、統計的にはよりよくないようであった。
（１１）別のＤ２ 対 ＮＥ２がアップレギュレートしたペプチド，ブラジキニン
ブラジキニンは、梗塞サイズに影響を及ぼし、そして、ＦＰＡ梗塞効果を増強するように作用し得る。８匹の生理食塩水コントロールマウスにおけるデータは、５２％の平均塞栓サイズ（％）を示す；ＦＰＡ−ｗのＣ末端で処理した８匹のさらなるマウスからのデータは、３５％の平均梗塞サイズ（％）を示した（Ｐ＜０．５）。１１マーがブラジキニンに加わる場合、梗塞サイズは、８匹の他のマウスにおいてさらに１９％へと減少した（Ｐ＜０．０５、表１２）。
（１２）尿素の再利用
理論的根拠は以下である：妊娠中および冬眠中のシロクマは、タンパク質を合成していなければならないが、尿毒症毒性は被らない。従って、尿素サイクルの機構が仮定される。ラットにおけるデータは、尿素サイクルが非冬眠種（実験用ラット）において生じ、そして、冬眠中のマーモットの血漿から抽出したアルブミン画分が静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ）される場合、速度が１３倍まで刺激されることを示す。これらの結果は反復する（図１３）。ラベルに従ってＤ２またはＤ０１が使用され、抗梗塞効果または尿素再利用効果における差異は、これらの２つの画分の間で見出されない。
Ｄ２またはその等価な冬眠関連物質Ｄ０１の、ラットにおける血中尿素の再利用の刺激への効果を図１３に示す。ここでの医療適用は、尿毒症毒素であり、これは、腎不全および麻酔からの回復において生じる有害な病状である。図１３は、純粋なアルブミン（Ｘｅｎｏアルブミン（２０ｍｇ／ｋｇ））を注射したコントロール群と比較した冬眠関連アルブミン画分（Ｄ２，Ｄ０１（２０ｍｇ／ｋｇ））の効果を示す。
データは、冬眠関連のアルブミン配分が、天然の一重標識の尿素（すなわち、いくつかのＮ１５は天然に存在する）の存在のベースラインより上の一重標識した尿素の産生を刺激することを明白に示す（Ｐ＜０．０２５）。このことは、二重標識した尿素の窒素の切断およびその一重標識した尿素への再取り込みによってのみ説明され得る。二重標識した尿素の最初の注射（１ｍｇ）の後、時間が経過するにつれ、二重標識した尿素のいくらかが排泄される。これはまた、一重標識した物質のいくらかについても起こる。６時間までの二重標識したプールは注射時、の１／９のみである（全ての被験体にわたる平均）。従って、再利用率は、６時間で、図１３に示すものよりも正確に９倍より高く、コントロールを上回って５〜６倍増加する。
（２． ＦＰＡデータの例）
フィブリノペプチドＡをマウスの中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルにおける効果について試験した。この研究において、ＭＣＡＯモデルにおけるフィブリノペプチドＡのカルボキシル末端の２つの調製物を試験した。一方の改変体が４位にイソロイシンを含み、他方の改変体は４位にロイシンを含んだ。ＦＰＡ Ｃ末端の１１マーを含むフィブリノペプチドＡの改変体の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を、ＭＣＡＯの開始後１時間で開始した。脳を摘出し、塩化トリフェニルエトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色し、そして画像解析により梗塞容積について試験した。これらの化合物を、注射なしおよびコントロール動物への生理食塩水の注射と比較した。ＦＰＡのＣ末端フラグメントの注射は、１０ｍｇ／ｋｇの用量で保護効果を示し、これは、６６％より大きい保護を示した。全体的に、ＦＰＡのＣ末端部分（１０ｍｇ／ｋｇ）は、マウスの虚血／再潅流の導入後の脳においてＭＣＡＯの程度の制限で有効であった。
ＦＰＡについての濃度系もまた提供する。フィブリノペプチドＡを、マウスの中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルにおける効果にいて試験した。ＶＴＩ化合物（フィブリノペプチドＡ、ＦＰＡ）の静脈内（ｉ．ｖ．）注射を、ＭＣＡＯの開始後１時間で開始した。脳を摘出し、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色し、そして、画像解析により梗塞容積について試験した。ＦＰＡの注射は、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で可変の効果を示し、これは最大の保護作用（６０％より大きい）を示した。０．６２５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでのＦＰＡは、脳に対して５０％を超える保護作用を示した。全ての用量がマウスの脳において梗塞容積の減少を示した。全体的に、ＦＰＡ（２．５ｍｇ／ｋｇ）は、マウスの虚血／再潅流の導入後の脳におけるＭＣＡＯの程度限定において最も有効である。
ａ）方法および材料
（１）研究設計
脳卒中、中大脳動脈塞栓（ＭＣＡＯ）のマウスモデル。マウスをＭＣＡＯに１時間供し、その後、２４時間の再潅流を行った。ＦＰＡのＣ末端フラグメント（１０ｍｇ／ｋｇ）を虚血の最後に注射し、２日目にマウスを屠殺してＴＴＣ染色によって梗塞容積について試験した。ＦＰＡ（０．６２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）を虚血の最後に注射し、２日目にマウスを屠殺し、ＴＴＣ染色によって梗塞容積について試験した。これらの切片をコントロールおよび生理食塩水を注射した動物と比較した。
（２）インビボの方法
実験前および実験中に、各約２５ｇの体重の雄性Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスに各々飼料および水に自由にアクセスさせた。動物を実験の１週間前に順化させた。動物に、示した用量の２００μｌ／マウスで組成物を注射した。マウスを虚血開始の１時間後に静脈内注射した。
（３）虚血の誘導
各マウスを１時間の大脳虚血に供し、その後、２４時間の再潅流を行った。虚血期間の最後に、動物に示された用量で組成物を注射し、２４時間で梗塞容積について試験した。左総頚動脈（ＣＣＡ）を頚部の正中切開により曝露した。上甲状腺および後頭部動脈を電気凝固させ、分割した。顕微手術のクリップを内頚動脈（ＩＣＡ）の起点に配置した。ＥＣＡの遠位端を６−０シルクで結紮し、切開した。６−０シルクをＥＣＡスタンプの周囲でゆるく結ぶ。クリップを取り除き、５−０ナイロン縫合糸（ポリ−Ｌ−リジンコーティング）の先端熱加工端をていねいにＥＣＡスタンプ内に挿入した。６−０シルクのループをスタンプの周囲で結び、顕微手術のクリップを取り除いた後、ナイロン縫合糸を、内頚動脈（ＩＣＡ）を通して、前大脳動脈（ＡＣＡ）に到達するまで、約１１ｍｍ（体重で調節する）進めた。それによって前交通動脈および中大脳動脈を閉塞した。麻酔から回復した後、動物をホームケージに戻した。ナイロン縫合糸をその場所に１時間配置した後、動物を再び麻酔して、縫合糸を取り除き、切開を閉じた。
（４）梗塞容積の決定
塞栓容積の決定のために、動物をペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔した。２４時間で脳を取り出し、梗塞領域を通して４つの２ｍｍ切片に薄切し、２％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）中に３０分置いた。その後、切片を４％パラホルムアルデヒド中に一晩置いた。各切片における梗塞領域を、Ｑｕｉｃｋ Ｃａｐｔｕｒｅフレームグラバーカード（ｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ ｃａｒｄ）を備えたＰｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ、カメラスタンドに設置されたＨｉｔａｃｈｉ ＣＣＤカメラから構成される、コンピュータ補助型画像解析システムを用いて決定した。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖ．１．５５を使用した。画像を取り込み、梗塞の全領域を切片全体で決定した。処理状態に対して盲目な１人の操作者が全ての計測を行った。切片の梗塞容積を加算して、総梗塞容積を計算した。
（５）統計分析
これらの結果を、平均標準偏差（ＳＤ）として表す。梗塞容積データの差異の有意差をｔ−検定を用いて分析した。
（６）処置群
全ての群をＭＣＡＯに供した。動物（１７匹の動物）をＦＰＡ誘導体注射に供し、２３匹の動物をＭＣＡＯ後に濃度研究のための注射に供した。
群：１）なし、２）生理食塩水、３）マーモットＦＰＡのＣ末端部分（Ｉ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、４）マーモットＦＰＡのＣ末端部分（Ｌ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、５）ＦＰＡ（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）、６）ＦＰＡ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、７）ＦＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）。
ｂ）結果
（１）マウスにおける虚血
これらの研究において、虚血の相対的な重篤度を評価した。腹腔内に所定の用量の組成物を注射した虚血外傷を有するマウスからのデータ。
（ａ）梗塞領域
注射をしなかった群およびビヒクル（生理食塩水）を注入した群と比較して、Ｃ末端ＦＰＡｗで処置した動物で、脳の梗塞領域が有意に減少した。Ｃ末端（Ｉ）ＦＰＡｗ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、梗塞容積の６６％減少を示した。Ｃ末端（Ｌ）ＦＰＡｗ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、梗塞容積の６７％減少という同様の変化を示した（表１６）。梗塞容積を図１４および１５にプロットする。脳に存在する梗塞容積の％減少を表１６に示す。
（表１６．脳の梗塞における％減少）
Figure 2005532263
％減少をビヒクルコントロール動物と比較する。
図１５を作成するために使用したデータを表１５に示す。
（表１７）
なし 生理食塩水 Ｃ末端（Ｉ） Ｃ末端（Ｌ）
３８．２５０ ８１．７３０ ５１．３３０ １１．３６０
６７．２００ ６４．９１０ ８．６３０ ３３．７９０
８２．３７０ ７２．３７０ １２．８１０ ３９．４２０
７６．８２０ ６８．５５０ １７．２５０ ２．６７０
４９．６８０
この結果についての統計学的データが、表１８に示される。梗塞容積は、ｍｍ３として列記される。
Figure 2005532263
本研究において、７体が死んだ。ほとんどの死は、食塩水で処置されたグループおよび全く処置されないグループで起きた。処置した各グループで、１体が死んだ。
ビヒクルを注射したグループと比較して、ＦＰＡで処置した動物で、脳内の梗塞領域が、有意に減少した。ＦＰＡ（２．５ｍｇ／ｋｇ）では、他の投薬量と比べて、梗塞容積に非常に大きな減少が見られた。ＦＰＡ（０．６２５ｍｇ／ｋｇ）およびＦＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）では、梗塞容積の減少において、同様の変化が見られた。しかし、ＦＰＡ（２．５ｍｇ／ｋｇ）ほど大きくはなかった（表１９）。梗塞容積は、図１６にプロットされる。脳に存在する梗塞容積の減少％を表１９に示す。表に示すように、ＦＰＡ（２．５ｍｇ／ｋｇ）では、ビヒクルと比較して、梗塞容積に６６％の減少が見られた。
Figure 2005532263
Figure 2005532263
図１６の統計は、表２１に示される。
Figure 2005532263
本研究において、濃度範囲に相関して、８体の死があった。ほとんどの死は、０．６２５ｍｇ／ｋｇのグループで起きたが（６／８）、一方で、２／８は、２．５ｍｇ／ｋｇのグループで起きた。１０ｍｇ／ｋｇでは、全く死ななかった。０．６２５ｍｇ／ｋｇのグループで死があった理由については、不明である。
（３．実施例 ブラジキニンレセプターのデータ）
（ａ）手順：）
このアッセイは、ヒトアンギオテンシンＡＴ２レセプターに対する［１２５Ｉ］ＣＧＰ−４２１１２Ａの結合を測定する。ヒトアンギオテンシンＡＴ２レセプターをコードするプラスミドによって、安定的にトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞を、標準的な技術により、改変Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で膜を調製するために使用した。０．５μｇの膜のアリコートを、０．０２５ｎＭの［１２５Ｉ］ＣＧＰ−４２１１２Ａと共に、３７℃で３時間、インキュベートした。非特異的な結合を１０μＭの［Ｓａｒ１、Ｉｌｅ８］アンギオテンシンＩＩ（膜タンパク質は、ロット間で変化し得、必要であれば、使用される濃度が、調節され得る）の存在下で、概算した。膜を濾過し、３回洗浄した。そのフィルターを、放射能についてアッセイし（計測し）、特異的に結合した［１２５Ｉ］ＣＧＰ−４２１１２Ａを測定した。化合物を１０μＭでスクリーニングした。ＡＴＩＩの結合について研究は、本質的にＷｈｉｔｅｂｒｅａｄ，Ｓ．Ｅ．ら、Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ ＣＧＰ４２１１２Ａ：ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＡＴ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８１：１３６５〜１３７１、１９９１（少なくとも、ＡＴＩＩレセプターの特徴づけに関する材料について、本明細書中で参考として援用される）の開示のように実行した。
（ｂ）結果：）
結果により、ＡＴＩＩのＣＧＰ−４２１１２Ａに対するＫｄは、０．０１２ｎＭであり、２，９００ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質のＢｍａｘを有することが示される。特異的な結合は９０％であった。これが、試験分子との競合して使用される最も高い結合分子であった。
表２１は、ＡＴＩＩレセプターへの異なる結合レベルを比較するために使用され得る、参考データを示す。
Figure 2005532263
表２２および表２は、多くのブラジキニン類似物に対するＡＴＩＩレセプター結合アッセイにおいて得られた結果を示す。この結果は、ＡＴＩＩレセプターでのＡＴＩＩの結合の阻害の％として、示される。表２２は、阻害活性に基づく順位で、種々のブラジキニン改変体を示す。例えば、配列番号５８は、ＡＴＩＩの９８％が、ＡＴＩＩレセプターに結合するのを阻害した。他方、ブラジキニン（配列番号５７）は、ＡＴＩＩの１２％が、ＡＴＩＩレセプターに結合するのを阻害し、これは、最も活性の化合物よりも低い。配列番号５８は、ペプチドのＮ末端に付加的Ｌｙｓを有し、ブラジキニンのＣ末端のＰｈｅ−ＡｒｇがＬｅｕで置換されている（配列番号５８）点で、配列番号１２とは異なる。
配列番号５８およびブラジキニン（配列番号５７）で示されることと一致して、配列番号７７（単に、ブラジキニン（配列番号５７）のＮ末端の最初の７アミノ酸（ブラジキニンからＣ末端のＰｈｅ−Ａｒｇが取り除かれていることを意味する））は、ＡＴＩＩ／ＡＴＩＩレセプターの結合を５５％阻害する。これらの結果から、塩基性電荷は、ブラジキニン（配列番号５７）のＣ末端にあり、ＡＴＩＩレセプターでの結合において、ＡＴＩＩと競合するブラジキニンの能力を減少させていることを示す。また、ブラジキニンのＮ末端への塩基性電荷の付加が、ＡＴＩＩレセプターのＡＴＩＩとの結合に競合する能力の増加に関連する（配列番号５８、９８％、配列番号６１、９２％）。配列番号６２、６３および６４は、Ｃ末端ＡＲＧを有するが、まだ阻害を示す。これはおそらく、アダマンタン誘導体によって生じる、これらのペプチドの独特の構造に起因する陰性電荷の減衰に起因する。
表２２。ビヒクルを注射したグループと比較して、ＢＫ改変体の脳の梗塞領域が、表２２に示される。表２２に示されるＢＫ改変体は、活性の順に示される。配列番号５８、６１および７７は、有意に０．０５未満のｐ値であった。ｐ値は、表２８で示す全ての食塩水で処置された動物をグループ化し、片側ｔ検定を使用して、表２３に示される実験動物と比較することにより得た。０．０５未満であることが見出される任意のｐ値は、統計的に有意であると考えられる。
Figure 2005532263
Figure 2005532263
多くのブラジキニン改変体が、本明細書中の実施例で開示するように、ＭＣＡＯマウスモデルにおいて試験された。これらの実験の結果が、表２２に開示される。ＡＴ２レセプターと最も強い結合を有するブラジキニン改変体はまた、虚血傷害の予防においても、最も効果的であった。
表２２に示されるデータを生成するために使用されたデータは、表２３に示される。欄を示す数は、示される計変体のための特定の実験に使用された動物を参照する。例えば、特定の実験において、９体の平行する動物が、閉塞およびその後のＦＰＡ改変体の注射を経験した。各セクションの梗塞領域は、コンピューター補助画像分析システムによって測定された。このシステムは、Ｑｕｉｃｋ Ｃａｐｔｕｒｅ ｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ ｃａｒｄ、カメラスタンドに乗せられたＨｉｔａｃｈｉ ＣＣＤ ｃａｍｅｒａを装備したＰｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈで構成される。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖ．１．５５を使用した。画像を取り込み、梗塞の総領域をセクション中で計測した。処置状態を知らない単一のオペレータが、全ての測定を実施した。セクションの梗塞容積を合計することにより、総梗塞容積を計算した。その結果は、平均±標準偏差（ＳＤ）として示される。
Figure 2005532263
（４．実施例４ Ｄ２画分の時間経過）
冬眠ウッドチャック（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ）画分であるＤ２を、マウスの中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデル中での効果について試験した。ＭＣＡＯの２時間前にＤ２の静脈（ｉ．ｖ．）注射を始めるか、ＭＣＡＯが終わった後、種々の時間（８時間まで）に、Ｄ２の静脈（ｉ．ｖ．）注射を始めた。脳を切り出し、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色し、画像分析によって、梗塞容積について調べた。Ｄ２の注射は、大脳の虚血傷害および再灌流障害に先立つ、有意な脳の防護を実証した。さらに、Ｄ２は、虚血傷害の６時間後までに注射された場合に、虚血傷害および再灌流障害からの有意な防護を示した。Ｄ２を、単一のボーラス静脈注射において、５ｍｇ／ｋｇで投与した。総じて、マウスにおいて、虚血／再灌流の誘導の６時間後までに処置された場合に、Ｄ２は、脳でのＭＣＡＯの程度を制限する点で効果的であった。
（ａ）材料と方法）
（（１）研究設計）
脳卒中、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のマウスモデル。マウスを１時間のＭＣＡＯに供し、その後、２４時間の再灌流させた。虚血傷害の２時間前または虚血の終了時（再灌流の開始から、０．５、１、２、４、６、または８時間後）に、Ｄ２を注射した。そして、第２日に、マウスを屠殺し、ＴＴＣ染色で梗塞容積を調べた。マウスは、５ｍｇ／ｋｇの最終投与量で、Ｄ２の単一のボーラス静脈注射を受けた。
（（２）インビボ方法）
体重が約２５ｇの雄のＣ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスそれぞれに、実験の前および実験の間、食料および水が自由に与えられた。実験の前に１週間の間、動物を順化させた。ＶＴＩ画分（Ｄ２）２００μｌ／マウス、投薬量５ｍｇ／ｋｇを、動物に注射した。虚血の終了前または虚血の終了後の示された時間に、マウスに静脈注射した。
（（３）虚血の誘導）
各マウスを１時間の大脳虚血に供し、その後、２４時間の再灌流に供した。虚血期間（示された時間）の終了前または虚血期間（示された時間）の終了後に、動物に５ｍｇ／ｋｇでＤ２を注射し、２４時間の時点で、梗塞容積を調べた。首の正中切開を介して、左総頸動脈（ＣＣＡ）を曝した。上甲状腺および後頭動脈を電気凝固し、分割した。顕微外科的クリップを内頸動脈（ＩＣＡ）の基点付近に配置した。ＥＣＡの遠位端を６−０シルクで結紮し、切断した。ＥＣＡ断端付近で、６−０シルクをゆるく締めた。クリップを取り外し、５−０ナイロン縫合糸（ポリ−Ｌ−リジンで覆われている）の火で研磨された先端を、穏やかにＥＣＡ断端に挿入した。６−０シルクの輪を断端付近で締め付け、そして、動脈瘤クリップを除去した後で、ナイロン縫合糸を前大脳動脈（ＡＣＡ）に入るまで、約１１ｍｍ（体重によって調節される）内頸動脈（ＩＣＡ）の中へと通過させて進めた。これによって、前交通動脈および中大脳動脈を閉塞させた。麻酔を解除した後で、動物をホームケージに戻した。ナイロン縫合糸を１時間その場に置いた後、動物を再度麻酔し、縫合糸を除去し、切開部を閉じた。
（（４）梗塞容積の測定）
梗塞容積を測定するために、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により、動物を麻酔した。再灌流の２４時間後に、脳を切り出し、梗塞領域を通る４ ２ｍｍの切片に切断し、そして、２％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）中に、３０分間、入れた。その後、切片を４％パラホルムアルデヒド中に、一晩、置いた。各切片中の梗塞領域を、コンピューター補助画像分析システムによって測定した。このシステムは、Ｑｕｉｃｋ Ｃａｐｔｕｒｅ ｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ ｃａｒｄ、カメラスタンドに取り付けたＨｉｔａｃｈｉ ＣＣＤ カメラを装備したＰｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターから構成される。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖ．１．５５を使用した。画像を取り込み、梗塞の総領域を切片一面で計測した。処置状態を知らない一人のオペレータが、全ての測定を実施した。切片の梗塞容積を合計することにより、総梗塞容積を計算した。
（（５）統計分析）
結果を、平均±標準偏差（ＳＥＭ）として示す。梗塞容積データの相違の有意性は、ｔ−検定を用いて分析した。全ての動物を本研究に含めた。
（（６）処置群）
全ての群をＭＣＡＯに供した。動物（２７動物）を、ＭＣＡＯ後のＦＰＡ注射に供した。群は以下の通りである。群１、コントロールマウス、虚血傷害／再灌流傷害なし；群２、コントロールマウス、虚血１時間および再灌流２４時間、虚血の１時間後にビヒクルを注射；群３、虚血１時間および再灌流２４時間、傷害の２時間前にＤ２を投与；群４、虚血１時間および再灌流２４時間、傷害の０．５時間後にＤ２を投与；群５、虚血１時間および再灌流２４時間、傷害の１時間後にＤ２を投与；群６、虚血１時間および再灌流２４時間、傷害の２時間後にＤ２を投与；群７、虚血１時間および再灌流２４時間、傷害の４時間後にＤ２を投与；群８、虚血１時間および再灌流２４時間、傷害の６時間後にＤ２を投与；ならびに群９、虚血１時間および再灌流２４時間、傷害の８時間後にＤ２を投与。
（ｂ）結果）
（（１）マウスの虚血）
これらの研究における虚血の相対的重症度を、評価した。Ｄ２画分が、５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射した虚血傷害を有するマウス由来のデータ。この研究において、１匹も死ななかった。
（（ａ）梗塞領域）
ビヒクルを注射した群と比較して、Ｄ２で処置した動物において、脳の梗塞領域は有意に減少した。Ｄ２（虚血の２時間前）において、他の時間よりも梗塞容積の最も大きい減少を示した。再灌流後０．５時間および１時間においても、Ｄ２は、梗塞容積の減少において同様の変化を示したが、虚血の２時間前のＤ２ほど大きくはなかった（表２４）。梗塞容積を、図１７にプロットした。脳に存在する梗塞容積の減少％を、表２４に示す。表２４に示すように、虚血の２時間前のＤ２において、ビヒクルと比較して、梗塞容積に８８％の減少を示した。
Figure 2005532263
さらに、より早い時点では、虚血傷害および再灌流傷害の有害な効果が、有意に防護された。
（（ｂ）動物データ）
Figure 2005532263
（５．実施例５ ＦＰＡ改変体）
マウスの中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルにおける効果について、一連のＦＰＡ改変体を試験した。これらの改変体としては、Ｃ末端およびＮ末端の両方が欠失した変異体ならびに、Ｎ末端の開始時点での１つのアミノ酸のアラニン残基への置換を有し、Ｃ末端の全配列と続いている変異体が挙げられる。ＭＣＡＯ後１時間で、ＦＰＡの静脈（ｉ．ｖ．）注射を始めた。脳を摘出し、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色し、画像分析によって梗塞容積について調べた。ＦＰＡの注射は、大脳の虚血傷害および再灌流障害に先立つ、有意な脳の防護を実証した。ＦＰＡ改変体に、単一のボーラス静脈注射を投与した。
（ａ）材料および方法）
（（１）研究設計）
発作、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のマウスモデル。マウスを１時間のＭＣＡＯの後に、２４時間の再灌流に供した。再灌流の開始後１時間で、ＦＰＡ改変体を注射した。そして、第２日に、マウスを屠殺し、ＴＴＣ染色で梗塞容積を調べた。マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの親ペプチド（ウッドチャックＣ末端ＦＰＡ）と同等の最終用量で、ＦＰＡ改変体の単一ボーラス静脈注射を与えた。
（（２）インビボ方法）
体重が約２５ｇの雄性のＣ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）マウスそれぞれに、実験の前および実験の間、飼料および水を自由に与えた。実験の前に１週間の間、動物を順応させた。ＦＰＡ改変体（２００μｌ／マウス）（１０ｍｇ／ｋｇと同等の用量）を、動物に注射した。虚血の終了前または虚血の終了後の示した時間に、マウスに静脈注射した。
（（３）虚血の誘導）
各マウスを１時間の大脳虚血の後に、２４時間の再灌流に供した。虚血期間（示した時間）の終了前または虚血期間（示した時間）の終了後に、動物に、ＦＰＡ改変体を１０ｍｇ／ｋｇと同等の用量で注射し、２４時間で、梗塞容積を調べた。首の正中切開によって、左総頸動脈（ＣＣＡ）を露出させた。上甲状腺および後頭動脈を電気凝固し、分割した。顕微外科的クリップを内頸動脈（ＩＣＡ）の基点のまわりに配置した。ＥＣＡの遠位端を６−０シルクで結紮し、切断した。ＥＣＡ断端のまわりで、６−０シルクをゆるく締めた。クリップを取り外し、５−０ナイロン縫合糸（ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされている）の火で研磨された先端を、穏やかにＥＣＡ断端に挿入した。６−０シルクの輪を断端のまわりで締め付け、そして、動脈瘤クリップを除去した後で、ナイロン縫合糸を前大脳動脈（ＡＣＡ）に残るまで、約１１ｍｍ（体重によって調節される）内頸動脈（ＩＣＡ）の中に進めて、それを通過させた。これによって、前交通動脈および中大脳動脈を閉塞させた。麻酔がさめた後で、動物をホームケージに戻した。ナイロン縫合糸を１時間その位置に置いた後、動物を再び麻酔し、縫合糸を除去し、切開部を閉じた。
（（４）梗塞容積の測定）
梗塞容積を測定するために、動物を、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。再灌流の２４時間後に、脳を取り出し、梗塞領域を通る４ ２ｍｍの切片に切断した。そして、２％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）中に、３０分間、置いた。その後、切片を４％パラホルムアルデヒド中に、一晩、置いた。各切片中の梗塞領域を、コンピューター補助画像分析システムによって測定した。このシステムは、Ｑｕｉｃｋ Ｃａｐｔｕｒｅ ｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ ｃａｒｄ、カメラスタンドに取り付けたＨｉｔａｃｈｉ ＣＣＤ カメラを装備したＰｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターで構成される。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖ．１．５５を使用した。画像を取り込み、梗塞の総領域を切片一面で計測した。処置状態を知らない一人のオペレータが、全ての測定を実施した。切片の梗塞容積を合計することにより、総梗塞容積を計算した。
（（５）統計分析）
結果を、平均±標準偏差（ＳＥＭ）として示す。梗塞容積データの相違の有意性は、ｔ−検定を用いて分析した。全ての動物が本研究に含められる。
（ｂ）結果）
（（１）マウスの虚血）
これらの研究における虚血の相対的重症度を、評価した。ＦＰＡ改変体に、全長のＣ末端ＷＣ ＦＰＡの１０ｍｇ／ｋｇの用量と同等の用量で、腹腔内注射した虚血傷害を有するマウス由来のデータ。この研究において、３０匹が死んだ。使用した用量を、表２９に示す。表３０は、ヒトＦＰＡ配列のウッドチャックＦＰＡ配列との比較を示す。
表２９
Figure 2005532263
親化合物は、ＶＰ−００１ ＭＷ＝１５３６．８。この化合物を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で試験した。
試験化合物 ＶＰ−０１２〜ＶＰ０３９は、ＭＷに基づいて、同等の用量である。
Figure 2005532263
（（ａ）梗塞領域）
ビヒクルを注射した群と比較して、ＦＰＡ改変体の脳における梗塞領域を表２６に示す。表２６に示されるＦＰＡ改変体は、活性の順に示される。配列番号４６、４５、３５、５０、３８、４０、５４、３２、４７および４８は、有意に＜０．０５であった。ｐ値は、表２８で示す食塩水で処置した動物全てをグループ化し、片側（ｔａｉｌｅｄ）ｔ検定を使用して、表２７に示される実験動物と比較することにより得た。０．０５未満であることが見出される任意のｐ値は、統計的に有意であると考えられる。
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
表２６に示されるデータを生成するために使用したデータを、表２７に示す。欄を示す数は、示される改変体についての特定の実験において使用した動物をいう。例えば、特定の実験において、９匹の類似した動物が、閉塞およびその後のＦＰＡ改変体の注射をうけた。各切片の梗塞領域を、コンピューター補助画像分析システムによって測定した。このシステムは、Ｑｕｉｃｋ Ｃａｐｔｕｒｅ ｆｒａｍｅ ｇｒａｂｂｅｒ ｃａｒｄ、カメラスタンドに取り付けたＨｉｔａｃｈｉ ＣＣＤ カメラを装備したＰｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターで構成される。ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖ．１．５５を使用した。画像を取り込み、梗塞の総領域を切片一面で計測した。処置状態を知らない一人のオペレータが、全ての測定を実施した。切片の梗塞容積を合計することにより、総梗塞容積を計算した。その結果を、平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
表２８。食塩水で処置したコントロール動物。コントロール群として、４２匹の動物を使用した。コントロールは、処置群を試験する期間に対応する期間を過ごした。総じて、食塩水で処置した群は、平均虚血傷害％が３０．５、標準偏差は３．２７を示した。この群を、表２２および表２６に示すｐ値を生成するために、使用した。
Figure 2005532263
Figure 2005532263
Figure 2005532263
添付の図面は、本明細書に援用され、その一部を成し、種々の実施形態を示し、説明とともにこの原理の説明に役立つ。
図１は成体および若年のウッドチャックにおける心拍動態および死亡率に関する初期および後期の冬眠期間中における覚醒効果を示す。この動物は、１２月中旬および１月中旬に仰向けになりながら８分間手足を伸ばすことにより覚醒した。この１月中旬の刺激は、重度の徐脈および完全覚醒を引き起こし、４被験体中４例において６〜１２時間以内に死亡を伴った。１２月中旬の刺激は覚醒も、徐脈も死亡を引き起こさなかった。 図２は、２次元ＳＤＳゲルに示されるように、Ｄ２およびＮＥ２画分における状態依存性タンパク質の同定を示す。上部２枚のパネルは、状態＃１（ＮＥ２）におけるタンパク質および状態＃２（Ｄ２、０２）と状態＃１オーバーレイにおけるタンパク質（上部右）を示す。このオーバーレイでは、各状態＃１スポットに大変明るい中心点のみを示し、その周囲は灰色から明白な白色に残す。下部左の拡大は３２ｋＤａ領域（囲み）における状態＃２と状態＃１との比較を示し、下部右の拡大は６６ｋＤａ領域（囲み）における同じ比較を示す。従って、関連オーバーレイスポットのないそれらの状態＃２スポットは状態＃２依存性を呈す（斜方点線マーカー）。これらの状態依存性純粋タンパク質の効果の一つは図１の脳卒中モデルにおいて見られる。ｐＩ範囲は４〜７であった。 図３はスポットのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ同定を示し、このスポット（丸で囲んだ）は状態＃１ ＮＥ２あるいは状態＃２ Ｄ２の物質のいずれかに特異的である。この目的のスポットは２次元ＢＡＴＳゲル上に位置する。このＢＡＴＳゲルは２Ｄ ＳＤＳゲル（図２）より感受性および定量性が低く、９つの状態依存性スポットのみがこの４〜７ｐＩ範囲で（左側ペアは４、右側ペアは７）認められる。 図４はＤ２特異的分子が脳卒中を予防することを示す。Ｄ２バンドとＳＡ（コントロール）およびＮＥ２（最も近いコントロール）とのＢＡＴＳ比較は３つのＤ２特異的分子（丸で囲んだ）を示す。上部の３片は、マウスのＭＣＡＯモデルにおける梗塞量を示す。機能するミトコンドリアを含む組織のみが（暗）赤色のＴＴＣ（２％）染色を取り込む。 図５は状態依存性２Ｄゲルのコンピュータ化された比較を示す。Ｄ２ゲルはその最も近いコントロールであるＮＥ２と比較した。ＣＳＦおよび尿ゲル（冬眠）は夏コントロールと比較する。各３ゲル・ペアでスポットのコンピュータ化された空間アラインメントを行った。各スポットの銀粒子密度をそれ自体のゲルに標準化させ、液量における濃度差の補正を行う（すなわち、各ゲルにおける総タンパク質は定常であると推定される）。次いで、各スポット・ペア間の差を算出した。状態２（冬眠）の２倍以上の上昇を含むスポットは緑色を緑色で示す。状態２スポット密度のそれらのわずかな上昇は、この標準化手順により補正されない濃度差によると考えられ、濃く暗い色で示す。状態２の２分の１あるいはそれより大きな低下を示したそれらのスポットは明るい色で示す。２つの状態間で無変化のものは白抜きの暗い色の外形線で示す。 図６は、Ｄ２注射時間の中大脳動脈閉塞のマウスにおける脳梗塞サイズに及ぼす効果を示す。１時間の中大脳閉塞の２時間前にＤ２で前処置を行うと、無梗塞〜最小梗塞という結果になった（垂直バー−ＳＤ）。進行的な注射時間の延長は進行的な梗塞サイズの拡大を引き起こしたが、その効果は非直線性であった。このタンパク質をアルブミン・キャリアから除去するための８Ｍ−尿素での透析およびペプチドを除去するための１０ｋＤａの膜カットオフを用いたＤ２の処理は、１時間の注射の梗塞サイズに及ぼす有意な改善効果を結果として引き起こした。 図７はＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる１０ｋＤａ以下のポリペプチドのフィンガープリント法を示す。ペプチド範囲における８つの分子は、後期冬眠（ＮＥ）に比べて初期冬眠（Ｄ２）期間中に変わることが確認される。これらのうちの１つは、フィブリノペプチドＡとして同定された。この８つのうち２つは後期冬眠においてより豊富である（１３１０および２０１１）。 図８はペプチド：質量１６２０．９Ｄａの結果を示す。 図９はペプチド：質量９０４．４Ｄａの結果を示す。 図１０はペプチド：質量９０４．４Ｄａの結果を示す。 図１１はペプチド：質量９０４．４Ｄａ―＊ＲＰＰＧＦＳＰＦの結果を示す。 図１２はＦＰＡ−ｈおよび他の分子画分の処理群の平均と標準偏差を示す。 図１３は、Ｄ２またはＤ０１（２０ｍｇ／ｋｇ）あるいはアルブミンコントロール（Ｘｅｎｏ、２０ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ注射によって作製されるラットにおける血中尿素のリサイクル率に及ぼす効果を示す。各動物に時間ゼロで二重標識された尿素１ｍｇ（総尿素の１％未満）を注射した。自然バックグラウンドレベルを超える単一標識尿素の存在は、二つの標識された窒素の分割およびさらなる単一標識尿素を形成するそれらのリサイクルによって説明され得るのみである。ｙ軸は、非標識尿素に対する単一標識尿素（％モル分数）がどれだけ自然単一標識尿素のベースラインより上に存在するのか（過剰）について、ラットごとに経時的に表す。注射後３〜６時間のＤ２群およびＤ０１群とアルブミン群との間の平均差は統計的に有意である（Ｐ＜０．０２５）。いずれの注射後の平均動脈血圧にも変化はなかった。 図１４は、ＦＰＡｗのＣ末端フラグメントの一過性虚血後マウスにおける梗塞量に及ぼす効果を示す。全マウスは、１時間の脳虚血の後、２４時間の再灌流を受けた。動物は、無投与あるいは虚血終了時にビヒクル（生理食塩水）またはＦＰＡｗのＣ末端フラグメント（１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。動物を２日目に屠殺し、処理して梗塞量を決定した。無投与と比較してＣ末端（Ｉ）およびＣ末端（Ｌ）でｐ＜０．０２、生理食塩水投与と比較してＣ末端（Ｉ）でｐ＜０．００４、生理食塩水投与と比較してＣ末端（Ｌ）でｐ＜０．００３。 図１５は、ＦＰＡｗのＣ末端フラグメントの一過性虚血後マウスにおける梗塞量に及ぼす効果を示す。全マウスは、１時間の脳虚血の後、２４時間の再灌流を受けた。動物は、無投与あるいは虚血終了時にビヒクル（生理食塩水）またはＦＰＡｗのＣ末端フラグメント（１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。動物を２日目に屠殺し、処理して梗塞量を決定した。梗塞量はｍｍ３で記載する。 図１６は、ＦＰＡの一過性虚血後マウスにおける梗塞量に及ぼす効果を示す。全マウスは、１時間の脳虚血の後、２４時間の再灌流を受けた。動物は、虚血終了時にビヒクル（生理食塩水）またはＦＰＡ（０．６２５ｍｇ／ｋｇ；２．５ｍｇ／ｋｇ；および１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。動物を２日目に屠殺し、処理して梗塞量を同定した。ＦＰＡ１０のｐ＜０．００４７を除き、コントロールと比較して全値でｐ＜０．０００１。 図１７は、Ｄ２の一過性虚血の前あるいは後のマウスにおける梗塞量に及ぼす効果を示す。全マウスは、１時間の脳虚血の後、２４時間の再灌流を受けた。動物は、虚血前あるいは虚血終了時にビヒクル（生理食塩水）またはＤ２（５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。動物を２日目に屠殺し、処理して梗塞量を決定した。マウスごとの個々の梗塞量を同定した。梗塞量はｍｍ３で記載する。 図１８は、環状ブラジキニン改変体であるシクロ［（Ｎ−ε−１−Ｌ−リジン、６−グリシン）−ブラジキニン］の式を示す。この式においてＮ末端ブラジキニンアルギニンはＬ−リジンにより置換され、ブラジキニンの６位にあるセリンはグリシンにより置換されている。この環はアルギニンカルボニル基とリジンのε−アミノ基で形成されるペプチド結合で閉じる。
【配列表】
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Claims (122)

  1. 分子を含む冬眠している動物の血漿の画分であって、該分子が抗梗塞活性を有し、該画分が該冬眠の開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  2. 請求項１に記載の画分であって、該画分が、前記冬眠の開始後１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  3. 請求項１に記載の画分であって、該画分が、前記冬眠の開始後１４、１５または１６日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  4. 請求項１に記載の画分であって、該画分が、前記冬眠の開始後１５日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  5. 分子を含む冬眠している動物の血漿の画分であって、該分子が抗梗塞活性を有し、該画分が第１の動物の血液を収集することによって単離され、該第１の動物が初期の冬眠中であり、該画分が、第２の動物が中期の冬眠中にある場合、該第２の動物由来の血液を全く含まない、画分。
  6. 分子を含む冬眠している動物の血漿の画分であって、該分子が抗梗塞活性を有し、該画分が動物の最後の目覚め前１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５日の該動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  7. 請求項６に記載の画分であって、該画分が、前記動物の前記最後の目覚め前１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日の該動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  8. 請求項６に記載の画分であって、該画分が、前記動物の前記最後の目覚め前１４、１５または１６日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  9. 請求項６に記載の画分であって、該画分が、前記動物の前記最後の目覚め前１５日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  10. 分子を含む冬眠している動物の血漿の画分であって、該分子が抗梗塞活性を有し、該画分が第１の動物の血液を収集することによって単離され、該第１の動物が後期の冬眠中であり、該画分が、第２の動物が中期の冬眠中にある場合、該第２の動物由来の血液を全く含まない、画分。
  11. 請求項１に記載の方法であって、前記抗梗塞活性が、大脳の抗梗塞活性である、方法。
  12. 請求項１に記載の方法であって、前記抗梗塞活性が、心臓の抗梗塞活性である、方法。
  13. 分子を含む冬眠している動物の血漿の画分であって、該分子が尿素の再生利用を誘導し、該画分が該冬眠の開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  14. 請求項１３に記載の画分であって、該画分が、前記冬眠の開始後１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日の前記動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  15. 請求項１３に記載の画分であって、該画分が、前記冬眠の開始後１４、１５または１６日の前記動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  16. 請求項１３に記載の画分であって、該画分が、前記冬眠の開始後１５日の前記動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  17. 分子を含む冬眠している動物の血漿の画分であって、該分子が尿素の再生利用を誘導し、該画分が第１の動物の血液を収集することによって単離され、該第１の動物が初期の冬眠中であり、該画分が、第２の動物が中期の冬眠中にある場合、該第２の動物由来の血液を全く含まない、画分。
  18. 分子を含む冬眠している動物の血漿の画分であって、該分子が尿素の再生利用を誘導し、該画分が該動物の最後の目覚め前１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  19. 請求項１８に記載の画分であって、該画分が、前記動物の前記最後の目覚め前１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  20. 請求項１８に記載の画分であって、該画分が、前記動物の前記最後の目覚め前１４、１５または１６日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  21. 請求項１８に記載の画分であって、該画分が、前記動物の前記最後の目覚め前１５日の動物の血液を収集することによって単離される、画分。
  22. 分子を含む冬眠している動物の血漿の画分であって、該分子が尿素の再生利用を誘導し、該画分が第１の動物の血液を収集することによって単離され、該第１の動物が後期の冬眠中であり、該画分が、第２の動物が中期の冬眠中にある場合、該第２の動物由来の血液を全く含まない、画分。
  23. 抗梗塞活性を有する分子を精製する方法であって、該方法が、以下：１）サンプルを冬眠している動物から収集する工程、２）第２のサンプルを冬眠している動物から収集する工程、３）および該サンプルを該第２のサンプルと比較する工程を包含する、方法。
  24. 抗梗塞活性を有する分子を精製する方法であって、該方法が、以下：１）サンプルを冬眠している動物から収集する工程、２）第２のサンプルを異なる下位状態において冬眠している動物から収集する工程、３）および該サンプルを該第２のサンプルと比較する工程を包含する、方法。
  25. 抗梗塞活性を有する分子を精製する方法であって、該方法が、以下：１）１番目にサンプルを冬眠している動物から収集する工程、２）２番目に第２のサンプルを冬眠している動物から収集する工程であって、ここで該１番目および該２番目は異なる、工程、３）および該サンプルを該第２のサンプルと比較する工程を包含する、方法。
  26. 抗梗塞活性を有する分子を精製する方法であって、該方法が、以下：１）血液サンプルを冬眠している動物から収集する工程、２）第２の血液サンプルを冬眠している動物から収集する工程、３）該血液サンプルを該第２の血液サンプルと比較する工程を包含する、方法。
  27. 請求項２３〜２６に記載の方法であって、前記サンプルおよび前記第２のサンプルを比較する前記工程が、該サンプルおよび該第２のサンプル中の遺伝子発現をアッセイする工程を包含する、方法。
  28. 請求項２３〜２６に記載の方法であって、前記サンプルおよび前記第２のサンプルを比較する前記工程が、該サンプルおよび該第２のサンプル中のタンパク質発現をアッセイする工程を包含する、方法。
  29. 請求項２３〜２５に記載の方法であって、前記サンプルおよび第２のサンプルが、血液、尿、髄液もしくは脳脊髄液、組織、器官、細胞から得られる、方法。
  30. 請求項２６に記載の方法であって、前記サンプルおよび第２のサンプルが、尿、髄液もしくは脳脊髄液、組織、器官、細胞から得られる、方法。
  31. 請求項２３〜２６に記載の方法であって、前記動物が、哺乳動物である、方法。
  32. 請求項３１に記載の方法であって、前記哺乳類が、ジリス、クマ、ウッドチャック、マーモット、スカンクまたはバットである、方法。
  33. 請求項２３〜２６に記載の方法であって、前記血液サンプルが、初期冬眠または後期冬眠における動物から得られた、方法。
  34. 請求項２３〜２６に記載の方法であって、前記第２のサンプルが、中期冬眠における動物から得られた、方法。
  35. 請求項３３に記載の方法であって、前記第２のサンプルが、中期冬眠における動物から得られた、方法。
  36. 請求項２３〜２６に記載の方法であって、前記サンプルが、前記冬眠の開始後１〜２５日の動物から得られた、方法。
  37. 請求項２３〜２６に記載の方法であって、前記第２のサンプルが、前記冬眠の開始後２６〜６０日の動物から得られた、方法。
  38. 請求項３６に記載の方法であって、前記第２のサンプルが、前記冬眠の開始後２６〜６０日の動物から得られた、方法。
  39. 請求項２３〜２６に記載の方法であって、前記比較する工程が、区別をして調節された分子を同定する工程を包含し、該区別をして調節された分子が、前記第２のサンプルと比較して前記サンプルにおいて異なる量で存在している、方法。
  40. 請求項３９に記載の方法であって、区別をして調節された分子を同定する工程が、前記サンプルおよび前記第２のサンプルを分別する工程を包含する、方法。
  41. 請求項４０に記載の方法であって、前記分別する工程が、１０ｋＤＡ以下の分子を収集することによって行われる、方法。
  42. 請求項４０に記載の方法であって、前記分別する工程が、前記血液サンプルおよび前記第２のサンプル中の前記分子を、電荷、疎水性、親水性、親油性、ねじれ、分子量、タンパク質、ペプチドもしくは炭水化物親和クロマトグラフィーまたは溶解度によって分離する工程を包含する、方法。
  43. 請求項４２に記載の方法であって、前記親和分離が、親和ゲル青色クロマトグラフィーを使用する工程を包含する、方法。
  44. 請求項３９に記載の方法であって、同定する工程が、ＧＣ−マススペクトロスコピー、ゲルクロマトグラフィーもしくは高速液体クロマトグラフィー、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳマススペクトロスコピーを用いて前記サンプルを分析する工程を包含する、方法。
  45. 請求項４４に記載の方法であって、前記高速液体クロマトグラフィーが、逆相クロマトグラフィーを備える、方法。
  46. 請求項４４に記載の方法であって、前記ゲルクロマトグラフィーが、２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を備える、方法。
  47. 請求項３９に記載の方法であって、前記方法が、前記区別をして調節された分子を精製する工程および精製された区別をして調節された分子を得る工程をさらに包含する、方法。
  48. 請求項４７に記載の方法であって、前記方法が、前記精製された区別をして調節された分子の前記抗梗塞活性をアッセイする工程をさらに包含する、方法。
  49. 請求項４８に記載の方法であって、前記アッセイする工程が、大脳虚血のマウスＭＣＡＯモデルを用いる工程を包含する、方法。
  50. 請求項４８に記載の方法であって、前記抗梗塞活性が、大脳抗梗塞活性である、方法。
  51. 請求項４８に記載の方法であって、前記抗梗塞活性が、心臓抗梗塞活性である、方法。
  52. 被験体において梗塞を減少させる方法であって、該方法が、ＦＰＡを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
  53. 請求項５２に記載の方法であって、前記ＦＰＡが、配列番号２に対して少なくとも２０％同一性を有する構造を含み、アミノ酸８、１２および１３が、変化されない、方法。
  54. 請求項５３に記載の方法であって、アミノ酸７、９および１５での任意のバリエーションが、保存的な置換である、方法。
  55. 請求項５２に記載の方法であって、前記ＦＰＡが、配列番号２に対して７０％同一性を有する構造を含む、方法。
  56. 請求項５５に記載の方法であって、配列番号２からの任意のバリエーションが、保存的な置換である、方法。
  57. 請求項５２に記載の方法であって、前記ＦＰＡが、配列番号２のアミノ酸６〜１６に対して少なくとも４０％同一性を有するアミノ酸を含み、アミノ酸８、１２および１３が、変化されない、方法。
  58. 請求項５７に記載の方法であって、アミノ酸７、９および１５での任意のバリエーションが、保存的な置換である、方法。
  59. 請求項５２に記載の方法であって、前記ＦＰＡが、配列番号２のアミノ酸６〜１６に対して７０％同一性を有する構造を含む、方法。
  60. 請求項５９に記載の方法であって、配列番号２からの任意のバリエーションが、保存的な置換である、方法。
  61. 請求項５２〜６０に記載の方法であって、前記ＦＰＡが、マウスＭＣＡＯモデルにおいて存在している梗塞の量を減少させる、方法。
  62. 請求項６１に記載の方法であって、前記梗塞が、少なくとも２０％だけ減少される、方法。
  63. 請求項６１に記載の方法であって、前記梗塞が、少なくとも４０％だけ減少される、方法。
  64. 請求項６１に記載の方法であって、前記梗塞が、少なくとも６０％だけ減少される、方法。
  65. 請求項６１に記載の方法であって、前記梗塞が、少なくとも８０％だけ減少される、方法。
  66. 請求項５２〜６０に記載の方法であって、マウスＭＣＡＯモデルにおける梗塞比が少なくとも１．１である、方法。
  67. 請求項５２〜６０に記載の方法であって、マウスＭＣＡＯモデルにおける梗塞比が１．５以上である、方法。
  68. 請求項５２〜６０に記載の方法であって、マウスＭＣＡＯモデルにおける梗塞比が２以上である、方法。
  69. 請求項６８に記載の方法であって、前記比が、平均梗塞容積を用いて決定される、方法。
  70. 請求項６９に記載の方法であって、前記マウスＭＣＡＯモデルにおける平均梗塞容積が、９０％以下である、方法。
  71. 請求項６９に記載の方法であって、前記マウスＭＣＡＯモデルにおける平均梗塞容積が、７０％以下である、方法。
  72. 請求項６９に記載の方法であって、前記マウスＭＣＡＯモデルにおける平均梗塞容積が、５０％以下である、方法。
  73. 請求項６９に記載の方法であって、前記マウスＭＣＡＯモデルにおける平均梗塞容積が、３０％以下である、方法。
  74. 被験体において梗塞を減少させる方法であって、該方法が、組成物を投与する工程を包含し、該組成物が、該被験体に対する配列番号３４、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号９６〜１０３、ＡＶＲまたはＦＶＲに示されるペプチド配列を含む、方法。
  75. 請求項５２に記載の方法であって、前記ＦＰＡが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１または配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号８９、配列番号９６〜１０３、ＡＶＲまたはＦＶＲに示される配列を有する、方法。
  76. 請求項５２に記載の方法であって、前記ＦＰＡが、配列番号４６、配列番号４５、配列番号３６、配列番号５０、配列番号３８、配列番号４０または配列番号５４、配列番号３２、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５２または配列番号３９に示される配列を有する、方法。
  77. 請求項５２に記載の方法であって、前記梗塞が、大脳梗塞である、方法。
  78. 請求項５２に記載の方法であって、前記梗塞が、心臓梗塞である、方法。
  79. 被験体において梗塞を減少させる方法であって、該方法が、該被験体にブラジキニンを投与する工程を包含する、方法。
  80. 請求項７９に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号５７に対して６０％同一性を有する構造を含む、方法。
  81. 請求項８０に記載の方法であって、配列番号５７から離れた任意のバリエーションが、保存的な置換である、方法。
  82. 請求項７９に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号８３に対して８０％同一性を有する構造を含む、方法。
  83. 請求項８０に記載の方法であって、配列番号５７から離れた任意のバリエーションが、保存的な置換である、方法。
  84. 請求項７９に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、Ｃ末端にて塩基性アミノ酸を有さない、方法。
  85. 請求項８４に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである、方法。
  86. 請求項８５に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、Ｎ末端にて塩基性アミノ酸を含む、方法。
  87. 請求項８６に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである、方法。
  88. 請求項７９に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、Ｎ末端にて塩基性アミノ酸を含む、方法。
  89. 請求項８８に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである、方法。
  90. 請求項７９に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４または配列番号８５に示される配列を有する、方法。
  91. 請求項７９に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号７７または配列番号８１に示される配列を有する、方法。
  92. 請求項７９に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号５８に示される配列を有する、方法。
  93. 請求項７９に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号６１に示される配列を有する、方法。
  94. 請求項７９に記載の方法であって、前記梗塞が、大脳梗塞である、方法。
  95. 請求項７９に記載の方法であって、前記梗塞が、心臓梗塞である、方法。
  96. 抗梗塞分子を作製する方法であって、該方法が、該抗梗塞分子または該抗梗塞分子の改変体を合成する工程を包含し、該抗梗塞分子が、以下：１）血液サンプルを冬眠している動物から収集する工程、２）第２の血液サンプルを冬眠している動物から収集する工程、３）該血液サンプルを該第２の血液サンプルと比較する工程を包含する方法によって精製され得、該血液サンプルが、冬眠の開始後２５日以内に収集され、該第２の血液サンプルが、該冬眠の開始後２５日より後で収集され、該抗梗塞分子が、該第２の血液サンプル中よりも該血液サンプル中においてより多い量で存在している、方法。
  97. 抗梗塞分子を作製する方法であって、該方法が、該抗梗塞分子または該抗梗塞分子の改変体を合成する工程を包含し、該抗梗塞分子が、以下：１）血液サンプルを冬眠している動物から収集する工程、２）第２の血液サンプルを冬眠している動物から収集する工程、３）該血液サンプルを該第２の血液サンプルと比較する工程を包含する方法によって精製され得、該血液サンプルが、冬眠の終了前２５日以降に収集され、該第２の血液サンプルが、冬眠の開始後２５日より後で、しかし該冬眠の終了後２５日より前で収集され、該抗梗塞分子が、該第２の血液サンプル中よりも該血液サンプル中においてより多い量で存在している、方法。
  98. 抗梗塞分子を同定する方法であって、該方法が、分子をマウスＭＣＡＯモデルに投与する工程、該分子の該抗梗塞活性をマウスＭＣＡＯモデルにおけるＦＰＡの該抗梗塞活性と比較する工程、および該分子の該抗梗塞活性がＦＰＡの該活性の少なくとも２０％である場合、該分子を選択する工程を包含する、方法。
  99. 梗塞を減少させる必要のある被験体中の梗塞を減少させる方法であって、該方法が、該被験体に対する薬学的に受容可能な形態において、有効量のアンジオテンシンＩＩ２型レセプターアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
  100. 請求項９９に記載の方法であって、前記梗塞が、発作と関連している、方法。
  101. 請求項９９に記載の方法であって、前記梗塞が、心臓虚血と関連している、方法。
  102. 請求項９９に記載の方法であって、前記アンジオテンシンＩＩ２型レセプターアンタゴニストが、ブラジキニンである、方法。
  103. 請求項１０２に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号５７に対して６０％同一性を有する構造を含む、方法。
  104. 請求項１０３に記載の方法であって、配列番号５７から離れた任意のバリエーションが、保存的な置換である、方法。
  105. 請求項１０２に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号８３に対して８０％同一性を有する構造を含む、方法。
  106. 請求項１０５に記載の方法であって、配列番号５７から離れた任意のバリエーションが、保存的な置換である、方法。
  107. 請求項１０２に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、Ｃ末端にて塩基性アミノ酸を有さない、方法。
  108. 請求項１０７に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである、方法。
  109. 請求項１０８に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、Ｎ末端にて塩基性アミノ酸を含む、方法。
  110. 請求項１０９に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである、方法。
  111. 請求項１０２に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、Ｎ末端にて塩基性アミノ酸を含む、方法。
  112. 請求項１１１に記載の方法であって、前記塩基性アミノ酸が、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓである、方法。
  113. 請求項１０２に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４または配列番号８５に示される配列を有する、方法。
  114. 請求項１０２に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号７７または配列番号８１に示される配列を有する、方法。
  115. 請求項１０２に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号５８に示される配列を有する、方法。
  116. 請求項１０２に記載の方法であって、前記ブラジキニンが、配列番号６１に示される配列を有する、方法。
  117. 請求項１０２に記載の方法であって、前記梗塞が、発作と関連している、方法。
  118. ブラジキニンとアンジオテンシンＩＩ２型レセプターとの間の相互作用のインヒビターを同定する方法であって、該方法が、以下：該アンギオテンシンＩＩレセプター２型を発現している細胞をブラジキニンの存在下で推定インヒビターと接触させる工程；アンジオテンシンＩＩ２型レセプターに結合しているブラジキニンの量を検出する工程；を包含し、アンジオテンシンＩＩ２型レセプターに結合しているブラジキニンにおける減少が、インヒビターを同定する、方法。
  119. ブラジキニンとアンジオテンシンＩＩ２型レセプターとの間の相互作用のインヒビターを同定する方法であって、該方法が、以下：該アンギオテンシンＩＩレセプター２型を発現している細胞をブラジキニンの存在下で推定インヒビターと接触させる工程であって、該アンジオテンシンＩＩ２型レセプターが、蛍光ドナーを含み、ブラジキニンが蛍光アクセプターを含む工程；および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定する工程であって、推定インヒビターと接触されていない細胞において、ＦＲＥＴ測定と比較してＦＲＥＴにおける減少が、インヒビターの存在を示す工程を包含する、方法。
  120. ブラジキニンとアンジオテンシンＩＩ２型レセプターとの間の相互作用のインヒビターを同定する方法であって、該方法が、以下：細胞系を推定インヒビターと接触させる工程であって、該細胞系が、アンギオテンシンＩＩレセプター２型を含み、該細胞系がブラジキニンを含み、該アンギオテンシンＩＩレセプター２型が蛍光ドナーを含み、該ブラジキニンが蛍光アクセプターを含む工程；および該細胞系を該推定インヒビターと接触させる前の、かつ該細胞系を該推定インヒビターと接触させる後の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定する工程であって、該推定インヒビターが該推定インヒビターと接触する場合、該細胞系におけるＦＲＥＴにおける減少が、インヒビターを同定する工程を包含する、方法。
  121. 請求項１１８〜１２０に記載の方法であって、該方法が、梗塞のインビボモデルにおいて前記同定されたインヒビターを試験する工程、および前記動物モデルにおける梗塞を減少させる分子を選択する工程をさらに包含する、方法。
  122. 請求項１１８〜１２０に記載の方法であって、前記推定インヒビターが、分子のライブラリ中で見出される、方法。
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