JP2003530125A - 生物学的物質およびその使用方法 - Google Patents

生物学的物質およびその使用方法

Info

Publication number
JP2003530125A
JP2003530125A JP2001575640A JP2001575640A JP2003530125A JP 2003530125 A JP2003530125 A JP 2003530125A JP 2001575640 A JP2001575640 A JP 2001575640A JP 2001575640 A JP2001575640 A JP 2001575640A JP 2003530125 A JP2003530125 A JP 2003530125A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
complex
nervous system
central nervous
nucleic acid
components
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001575640A
Other languages
English (en)
Inventor
セス ガラン ニールス グラント，
ホルガー ハッシ，
Original Assignee
ザ ユニバーシティ コート オブ ザ ユニバーシティ オブ エディンバラ インコーポレイティッド アンダー ザ ユニバーシティズ （スコットランド） アクツ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9889219&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2003530125(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ザ ユニバーシティ コート オブ ザ ユニバーシティ オブ エディンバラ インコーポレイティッド アンダー ザ ユニバーシティズ （スコットランド） アクツ filed Critical ザ ユニバーシティ コート オブ ザ ユニバーシティ オブ エディンバラ インコーポレイティッド アンダー ザ ユニバーシティズ （スコットランド） アクツ
Publication of JP2003530125A publication Critical patent/JP2003530125A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明では、多タンパク質の複合体と、そのサブ複合体と、それらを生成する方法とが提供される。好ましくは、複合体はＮＭＤＡ受容体を含有している。さらに本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態を処置するための化合物を同定する方法が提供される。さらに、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態を診断し、または、診断を補助する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、多タンパク質複合体に関し、特に、ＮＭＤＡ受容体を含有する複合
体、および、このような複合体と相互作用する化合物に関する。さらに本発明は
、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体（および、このような受容体を含む複合体
）の機能障害に関連付けられる異常および状態を処置するための化合物を同定す
る方法、ならびに、このような化合物の使用方法に関する。
【０００２】 （背景技術） アミノ酸Ｌ-グルタミン酸は主要な興奮性神経伝達物質であり、グルタミン酸
作動性のニューロンが哺乳動物の中枢神経系全体に延びている。解剖学的、生化
学的および電気生理学的な分析によれば、グルタミン酸作動性系が、シナプス可
塑性（すなわち、シナプスの再組織化およびデノボでのシナプス増殖）、神経伝
達因子放出の調節、長期増強（ＬＴＰ）、学習、記憶、低酸素性/虚血性のニュ
ーロン障害および細胞死を含む広範なニューロンプロセスに関係している旨、示
唆される(BlissおよびCollingridge, 1993, Nature, 261:31〜39; BearおよびMa
lenka, 1994, Curr. Opin. Neurobiol. 4:389-399)。更に、グルタミン酸は、精
神分裂病(Carlssonら, 1999, Br. J. Psychiatry Supple. 37:2〜6; Tamminga,
1999, Br. J. Psychiatry Supple. 37:12〜15)、重篤な鬱病(Skolnick, 1999, E
ur. J. Pharmacol. 375:31〜40)、癲癇(Chapman, 1998, Prog. Brain Res. 116:
371〜383)、パーキンソン病(LoopuijtおよびSchmidt, 1998, Amino Acids 14:17
〜23)、低酸素性脳傷害(MishraおよびDelivoria-Papadopoulos, 1999, Brain, R
es, Bull. 48:233〜238)、学習的欠陥(Tangら, 1999, Nature 40:63〜69)、およ
び、脳卒中(SunおよびChen, 1999, Clin. Neuropharmacol. 22:164〜171)を含む
、いくつかの精神医学的および神経学的な異常の病原性に関係するとされている
。
【０００３】 グルタミン酸は、受容体を介してその神経伝達物質機能を媒介する。これらの
受容体は、２つの主要な群、すなわち、イオンチャネル型受容体および代謝調節
型受容体に分類される(概説について、HollmanおよびHeinemann, 1994, Ann. Rev
. Neurosci. 17:31〜108を参照のこと)。代謝調節型グルタミン酸受容体は、細
胞内の第２のメッセンジャー系を介して細胞外シグナルを伝達するＧタンパク質
共役型受容体であるのもかかわらず、イオンチャネル型グルタミン酸受容体は、
内在性カチオン特異的リガンド依存性イオンチャネルを含む。
【０００４】 イオンチャネル型グルタミン酸受容体はさらに、それらのリガンド優先度を基
準として、カイニン酸、α-アミノ-３-ヒドロキシ-５-メチル-４-イソキサゾー
ル-プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、およびＮ-メチル-Ｄ-アスパラギン酸（ＮＭＤＡ
）受容体に細分化される。これらのうち、ＮＭＤＡ受容体は間違いなく最も広く
特徴づけされる。ＮＭＤＡ受容体は、活性化のためにコアゴニストのＬ-グルタ
ミン酸およびグリシンを必要とし、ならびにポリアミン、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、
ｐＨ、および酸化還元ポテンシャルによる複雑なアロステリック調節に供される
ヘテロマーのタンパク質である。ＮＭＤＡ受容体のイオンチャネルを形成するた
めに、６つの異なるサブユニット、すなわち、ＮＲ１、ＮＲ２Ａ〜ＮＲ２Ｄ、お
よびＮＲ３（これらのそれぞれは異なる遺伝子によってコードされる）が合わさ
る。これらのうちで、ＮＲ１サブユニットは、これが、それ自身で機能的なイオ
ンチャネルを形成し得る唯一のものであるので、重要であると考えられる(Schoe
pferら, 1994, Prog. Neurobiol. 42:353〜357; Sucherら, 1996, Trends Pharm
acol. Sci. 17:348〜355を参照のこと)。残りのサブユニット（すなわち、ＮＲ
２Ａ〜ＤおよびＮＲ３）は、得られるＮＭＤＡ受容体の動力学的および薬理学的
特徴を改変する補助サブユニットを構成する。しかしネイティブなＮＭＤＡ受容
体の正確な化学量論は解明されてないままである。
【０００５】 ＮＭＤＡ受容体組成物に関する遺伝子レベルでの理解、特に、種々のＮＭＤＡ
受容体サブユニットをコードする遺伝子のクローニングが進歩することにより、
組換えＮＭＤＡ受容体の生成および研究が可能となった。このような研究により
、ＮＭＤＡ受容体の機能および調節に関する理解が促進されたが、組換え受容体
の薬理学的特性はインビボで発現されるネイティブな受容体の特性とは異なるこ
とが示された(例えば、Sucherら, 1996, Trends Pharmacol. Sci. 17:348〜355を
参照)。本発明者らの考えでは、このような不同性の効果は、今までＮＭＤＡ受
容体と会合されると認知されていないような多数の他の分子と、ネイティブなＮ
ＭＤＡ受容体との会合に少なくとも起因していると考えられ、これにより、ＮＭ
ＤＡ受容体の、認知されている種々の機能を媒介することを担う精巧な多成分複
合体が形成されると考えられる。ＮＭＤＡ受容体と、或る他の成分とを含んだ複
合体の単離および部分精製は、ＷＯ９７／４６８７７に記載されている。
【０００６】 ここで、インビボで存在するような受容体に更に類似しているＮＭＤＡ受容体
を含有する大きな多タンパク質複合体（本発明者らはこれを「ヘボソーム(Hebbo
some)」と称する）の精製について述べる。これによって、ＮＭＤＡ受容体機能
を妨げる候補薬物、つまり、ＮＭＤＡ受容体機能障害に関連付けられる精神医学
的および神経学的な種々の異常および状態を処置するのに利用し得る候補薬物を
同定する新規な方法が開発され得る。例えば、多タンパク質複合体を介したシグ
ナル伝達が阻害されるか、または増強されるような方法で多タンパク質複合体の
組み立て(assembly)および組成を妨げる化合物を同定することが可能となり得る
。
【０００７】 （発明の開示） 従って、本発明の目的は、機能的ＮＭＤＡ受容体のコアサブユニットを含有す
るのみならず、このような受容体にインビボで会合し、かつ、少なくとも、イン
ビボで観測される幾つかの不同性効果を媒介する点で重要である多数の補助タン
パク質も含有するような多タンパク質複合体を提供することである。
【０００８】 本発明の第１の態様では、ポリペプチドサブユニットＮＲ１と、表１に列挙さ
れた成分の群から選択される少なくとも１つの成分とを含有する多タンパク質複
合体が提供される。
【０００９】 好ましくは、複合体は、ＮＭＤＡ受容体、すなわち、機能的なＮＭＤＡ受容体
イオンチャネルを含有している。
【００１０】 従って、本発明では、ポリペプチドサブユニットＮＲ１と、表１に列挙された
成分の群から選択される少なくとも１つの成分とを含有するＮＭＤＡ受容体複合
体が提供される。
【００１１】 好ましくは、複合体は、１０００ｋＤａよりも大きい分子量、例えば、１１０
０、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００
、１９００、２０００、２５００、３０００、または４０００ｋＤａよりも大き
い分子量を有する。より好ましくは、複合体は、１８００と２２００ｋＤａとの
間の範囲の分子量を有する。最も好ましくは、複合体は約２０００ｋＤａの分子
量を有する。
【００１２】 表１では、多タンパク質複合体の成分のリストが与えられる。これらの成分ｂ
は、本発明者らが知る限りにおいて、ＮＲ1サブユニットに、直接的または間接
的に、物理的に連結されることが以前には示されておらず、従ってＮＭＤＡ受容
体と会合されることが以前には示されていなかった。推定分子量（ＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥを使用して得られた）は、列挙された成分のそれぞれのマウス相同体につい
て含めて考えられる。
【００１３】
【表１−１】
【００１４】
【表１−２】
【００１５】
【表１−３】
【００１６】 表１に対する要所 １ ｍＧｌｕＲ１αは、代謝調節型グルタミン酸受容体のＲ１サブユニットの
スプライス改変体である。 ２ Ｎ-エチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ）は、真核生物ベシクル形成に
必要不可欠な６量体ＡＴＰアーゼである。 ３ Ｈｏｍｅｒ（ＶＥＳＬ−１）は、代謝調節型グルタミン酸受容体と相互作
用するＨｏｍｅｒ関連性タンパク質のファミリーの１つである。 ４ Ｓｈａｎｋは、シナプス後肥厚における分子足場に関与されるタンパク質
のファミリーである。 ５ ＡＫＡＰ−１５０／７９は、シナプス後肥厚にＩＩ型ＰＫＡを固着するこ
とに関係されるＡ-キナーゼアンカータンパク質である。
【００１７】 ６ ＳＡＰ９７は、シナプス関連性タンパク質である。 ７ ＰＫＡ−Ｒ２βは、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を作
製する調節サブユニットの４つのタイプのうちの１つである。 ８〜１０ ＰＫＣβ、γおよびεは、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のアイ
ソザイムである。
【００１８】 １１ ＰＰ２Ａは、普遍的に発現されるセリン／スレオニンホスファターゼで
ある。 １２ ＰＰ５は、Ｎ末端でのタンパク質分解性切断により刺激され得る低活性
のセリン／スレオニンホスファターゼである。 １３ ＰＴＰ１Ｄは、細胞質ゾルタンパク質のチロシンホスファターゼであり
、またＳＨＰ２としても知られている。 １４、１５ ＰＰ１およびＰＰ２Ｂ（カルシニューリン）は、シグナル伝達に
関係する細胞質ゾルタンパク質ホスファターゼである。
【００１９】 １６ ＰＹＫ２は、多様なＧタンパク質共役型受容体によって、かつ、細胞内
Ｃａ２＋濃度を増大させる細胞外シグナルによって活性化されるタンパク質チロ
シンキナーゼである。 １7、１８ ＥＲＫ１およびＥＲＫ２は、マイトジェン活性化タンパク質（Ｍ
ＡＰ）キナーゼシグナル伝達カスケードに関係する細胞外シグナル調節性キナー
ゼである。 １９、２０ ＭＥＫ１およびＭＥＫ２は、ＭＡＰキナーゼキナーゼである。
【００２０】 ２１ ＭＫＰ２は、ＭＡＰキナーゼホスファターゼのイソ型である。 ２２ リボゾームＳ６キナーゼＰｓＫは、ＥＲＫの基質である。 ２３ ｃ−Ｒａｆ１は、ＭＥＫ１をリン酸化し、かつ、ＰＫＣにより刺激され
るキナーゼである。 ２４ Ｒａｃ１は、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのメンバーであり、アク
チン細胞骨格の調節に関係する。 ２５ Ｒａｐ２は、細胞骨格と会合される低分子量のＧＴＰ結合タンパク質で
ある。
【００２１】 ２６ Ｒａｓは、刺激性細胞表面受容体に対する非常に多様なリガンドの結合
によって活性化される小さなＧＴＰアーゼである。 ２７ 核因子１（ＮＦ１ＧＲＰ）は核転写因子である。 ２８ ＲａｌＡはＲａｓ関連性タンパク質である。 ２９ ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）−３キナーゼは、ＰＩシグナル伝
達経路内のキー酵素である。 ３０ ホスホリパーゼＣも、ＰＩシグナル伝達経路内のキー酵素であり、ＰＩ
-４，５-Ｐ２からのＩＰ３およびＤＡＧの形成を触媒する。
【００２２】 ３１ 細胞質ゾルホスホリパーゼＡ２は、グルタミン酸刺激によって活性化さ
れる。 ３２ Ａｒｇ３.１は即時型初期遺伝子産物である。 ３３ Ｎ-カドヘリンは、Ｃａ２＋依存性細胞内接着分子のファミリーのメン
バーである。 ３４ β-カテニンは、細胞間相互作用およびシグナル伝達に関係する細胞質
ゾルタンパク質である。 ３５ デスモグレイン(Desmoglein)は、細胞間接着に関与されるデスモソーム
会合性糖タンパク質である。
【００２３】 ３６ Ｌ１は神経細胞接着分子（Ｎ-ＣＡＭ）である。 ３７ ｐｐ１２０ＣＡＳは、カドヘリン-カテニン複合体の成分と相互作用す
ることが知られている細胞接着タンパク質である。 ３８ ミオシンは細胞骨格タンパク質である。 ３９ ダイナミン(Dynamin)は、受容体エンドサイトーシスに関係する調節性
タンパク質である。 ４０ クラスリン(Clathrin)重鎖は、クラスリンのサブユニットであり、受容
体の小胞輸送および内部移行に関係する。
【００２４】 ４１ ＨＳＰ７０は、主要な組織適合性複合体クラスＩＩＩに位置付けられる
熱ショック誘導性タンパク質である。 ４２ チューブリンは、細胞骨格の微小管の主成分である。 ４３ コルタクチン(Cortactin)は、糸状アクチン結合タンパク質であり、Ｓ
ｒｃチロシンキナーゼについての基質である。 ４４ コルタクチン結合タンパク質（ＣｏｒｔＢＰ）‐１は、プロリン-リッ
チシナプス会合性タンパク質である。 ４５ バスーン(Bassoon)は、シナプス前神経伝達分子放出部位での細胞骨格
の成分である。
【００２５】 ４６ ミオシンＢ重鎖は、ミオシンのサブユニットである（上述「３２」を参
照のこと）。 ４７ Ｐ５３結合タンパク質１は、腫瘍抑制タンパク質Ｐ５３の調節因子であ
る。 ４８ ＺＯ−１は、Ｃａ２＋、リン脂質および細胞骨格の組成の変化に対する
密着帯の応答を調節することに関係している密着帯タンパク質である。 ４９ Ｅｓｔ５２５．７は、脳に由来する、未知機能の発現性配列タグである
。 ５０ 筋肉細胞膜関連性タンパク質-３は、酸性の、両親媒性の膜タンパク質
である。
【００２６】 ５１ ＨＳ７１は分子シャペロンタンパク質である。 ５２ キネシン軽鎖２は、微小管ベースの運動タンパク質キネシンのサブユニ
ットである。 ５３ α-インテルネキシンは、ニューロン中間体フィラメントタンパク質で
ある。 ５４ ＦＵＳ/ＴＬＳは、ＲＮＡ結合タンパク質である。 ５５ ホスホフルクトキナーゼは糖溶解性酵素である。 ５６〜６１ 未知の機能的相同性または機能を有する発現性配列タグ。
【００２７】 表２では、ＮＭＤＡ受容体複合体と会合されると以前に判定された化合物のリ
ストが与えられる。
【００２８】
【表２−１】
【００２９】
【表２−２】
【００３０】 表２に対する要所 １〜６ ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ、ＮＲ２ＤおよびＮＲ３は、
ＮＭＤＡ受容体のサブユニットである。 ７,８ ＧｌｕＲ６および７は、代謝調節型グルタミン酸受容体のサブユニッ
トである。 ９〜１１ シナプス後肥厚（ＰＳＤ）-９５タンパク質、カプシン１１０（Ｐ
ＳＤ-９３）およびＳａｐ１０２はＰＤＺ-ドメインタンパク質の膜会合性グアニ
ル酸キナーゼ（ＭＡＧＵＫ）ファミリーのメンバーであり、ＮＲ２ＡおよびＮＲ
２Ｂサブユニットと相互作用する。
【００３１】 １２ グアニル酸キナーゼ会合性タンパク質（ＧＫＡＰ／ＳＡＰＡＰ）は、Ｐ
ＳＤ-９５を介してＮＭＤＡ受容体のイオンチャネル特性を調節する。 １３ Ｙｏｔｉａｏは、ＮＭＤＡ受容体の細胞骨格付着に関わるＮＲ１結合タ
ンパク質である。 １４ ＰＫＡ触媒サブユニットは、調節性サブユニットと組み合わされて、活
性プロテインキナーゼＡを形成する。 １５ カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナー
ゼ）ＩＩβは、ＬＴＰおよび記憶に関わるシナップス会合性タンパク質である。
【００３２】 １６、１７ ＳｒｃおよびＦｙｎは、チロシンキナーゼのＳｒｃファミリーの
メンバーであり、ＮＭＤＡ受容体媒介性シグナル伝達経路に関係する。 １８ ＳｙｎＧＡＰは、ＰＳＤ−９５およびＳａｐ１０２のＰＤＺドメインと
相互作用するＲａｓ−ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質である。 １９ カルモジュリンは、多数のタンパク質に結合し、かつ、その活性を調節
することにより、多くの細胞事象に対する細胞内Ｃａ２＋濃度の変化のカップリ
ングに関係するＣａ２＋結合タンパク質である。 ２０ ｎＮＯＳは一酸化窒素合成酵素のイソ型である。
【００３３】 ２１ シトロンは、Ｒｈｏシグナル伝達経路のエフェクターであり、グルタミ
ン作動性シナプスにてＰＳＤ−９５と相互作用する。 ２２ 微小管会合性タンパク質（ＭＡＰ）２Ｂは、Ａキナーゼアンカータンパ
ク質である。 ２３ アクチンは細胞骨格タンパク質である。 ２４ α-アクチン２は、ジストロフィン-糖タンパク質複合体の一成分である
。 ２５ スペクトリンは細胞骨格タンパク質である。
【００３４】 好ましくは複合体は、表１および／または表２に列挙された成分の群から選択
される３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の異なる成分を含有している。
【００３５】 より好ましくは、複合体は、サブユニットＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＰＳ
Ｄ−９５と、表１に列挙された成分の群から選択される少なくとも１つの成分と
を含有している。
【００３６】 最も好ましくは、複合体は、表１および表２に列挙された成分のすべてを含有
している。
【００３７】 従って、好ましい実施例において、複合体は、５つのカテゴリー、すなわち、
神経伝達物質受容体タンパク質（例えば、ＮＲ１、ＮＲ２、ｍＧｌｕＲ１）、細
胞接着タンパク質（例えば、Ｎ−カドヘリン、Ｌ１）、アダプタータンパク質（
例えば、ＰＳＤ−９５）、シグナル伝達ペプチド（例えば、ＰＫＣ、ＰＫＡ、Ｃ
ａＭキナーゼ、リン酸、チロシンキナーゼ）、および、細胞骨格タンパク質（例
えば、アクチン）に分類され得る成分タンパク質を含有している。有利には、複
合体は、これら５つのカテゴリーのそれぞれからの少なくとも１つの成分タンパ
ク質を含有している。
【００３８】 本発明に係る第１の態様の好ましい実施例において、複合体は、下記のステッ
プを含むペプチド親和性クロマトグラフィー法により得ることができる。 （ｉ）動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集するステップ。
【００３９】 ＰＳＤ−９５に結合するペプチドと、サンプルとを接触させることにより複
合体を単離するステップ。
【００４０】 組織のサンプルは、その中枢神経系（ＣＮＳ）においてＮＭＤＡ受容体を発現
する任意の動物から採取され得る。簡便には、組織のサンプルは、本発明の第１
の態様に従って多タンパク質複合体を発現する動物から採取される。
【００４１】 好ましくは、組織のサンプルは哺乳動物から採取される。より好ましくは、組
織のサンプルはヒト起源である。
【００４２】 代替の実施例において、組織のサンプルはナマコ、Aplysia californicaであ
る。 有利には、組織サンプルは脳から採取される。 簡便には、組織サンプルは、脳内の解剖学的に慎重な領域またはサブ領域、例
えば、規定皮質、海馬領域またはサブ領域から採取される。
【００４３】 好ましくは、ＰＳＤ−９５に結合するペプチドは、ＳＩＥＳＤＶまたはＫＰＬ
ＬＤＡＱＲＧＳＦＰＰＷＶＱＱＴＲＶである。
【００４４】 適切には、複合体はペプチド親和性クロマトグラフィーによって単離される。
【００４５】 本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様に係る複合体のサブ複合体が提
供される。このサブ複合体は、表１および表２で同定される成分から選択される
２つ以上のポリぺプチド成分を含有し、少なくとも１つのポリぺプチド成分は、
表１に列挙された群から選択される。
【００４６】 従って、本発明では、本発明の第１の態様に係るＮＭＤＡ受容体複合体のサブ
複合体が提供される。
【００４７】 下記のサブ複合体は、本発明の範囲から除外される： （ｉ）成分Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＲＳＫ、ＰＩ３Ｋ、Ｒａｌ、およ
びｃＰＬＡ２のうちの２つ以上からのみ構成されるサブ複合体。 （ｉｉ）成分Ｎ−カドヘリン、β-カテニン、ＨＳＰ７０、およびＺ0−１のうち
の２つ以上からのみ構成されるサブ複合体。
【００４８】 好ましくは、サブ複合体は、表１からの少なくとも１つの成分と、表２からの
少なくとも１つの成分とを含有している。
【００４９】 簡便には、サブ複合体は、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の成分を含
有している。
【００５０】 本発明のサブ複合体は、ＮＭＤＡ受容体を含有しなくてもよいことが理解され
よう。従って、１つの実施例では、サブ複合体はＮＲ１成分を含有していない。
【００５１】 本発明の第３の態様では、本発明の第１の態様に係る多タンパク質成分を生成
する方法が提供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集するステップ。 （ｉｉ）表１および表２で同定される成分の任意の１つ以上に結合するペプチド
と、サンプルとを接触させることにより複合体を単離するステップ。ここでペプ
チドは、抗体、またはその抗原結合フラグメントの何れでもない。
【００５２】 従って、本発明では、ＮＭＤＡ受容体複合体を生成する方法が提供され、この
方法は下記のステップを含む。 （ｉ）動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集するステップ。 （ｉｉ）表１および表２で同定される成分の任意の１つ以上に結合するペプチド
と、サンプルとを接触させることにより複合体を単離するステップ。ここでペプ
チドは、抗体、またはその抗原結合フラグメントの何れでもない。
【００５３】 複合体は、ペプチドが結合する成分を含有していることが理解されよう。
【００５４】 好ましくは、複合体を単離するために使用されるペプチドは、複合体の１つ以
上の成分（ＰＤＺドメインを含む）に、前記成分のＰＤＺドメインを介して結合
する。ＰＤＺドメインを含有する代表的成分は、ＰＳＤ−９５、ｎＮＯＳ、ＳＨ
ＡＮＫ、ＳＡＰ−１０２、Ｃｈａｐｓｙｎ−１１０/ＰＳＤ−９３、Ｈｏｍｅｒ
／Ｖｅｓｌ-1およびＣｏｒｔ-ＢＰ１、Ｚ0−１を含む。
【００５５】 「ＰＤＺドメイン」とは、多くのタンパク質で見出される約９０残基の反復を
含有するペプチドドメイン（ＤＨＲドメインまたはＧＬＧＦ反復としても知られ
る）を意味するものとする。このようなドメインは、イオンチャネル、受容体ク
ラスター化および、エフェクター因子に対する受容体の連結に関係している。Ｐ
ＤＺドメインは、タンパク質認識モジュールであり、ＰＤＺドメインのいくつか
は、周知のカルボキシ末端トリぺプチドモチーフＳ／ＴＸＶを非常に高い特異性
で含有するタンパク質である。他のＰＤＺドメインは同型２量体を構成し、ニュ
ーロン酵素一酸化窒素合成酵素のＰＤＺドメインは、ＰＳＤ−９５のＰＤＺドメ
インに結合し、相互作用はそのシナプス会合に関係している(Morais, Cabralら,
1996, Nature 382(6592); 649〜52)。
【００５６】 本発明に係る第３の態様の好ましい実施例において、複合体はペプチド親和性
クロマトグラフィーを用いて単離される。この方法において、目的のタンパク質
／複合体は、ペプチドリガンドについてその親和性を探索することにより回収さ
れる。典型的には、前記ペプチドは樹脂に固定化され、次に洗浄され、そしてク
ロマトグラフィーカラムに移される。目的のタンパク質／複合体を含有するサン
プルはカラムにより洗浄されるので、タンパク質／複合体はペプチドに結合し、
このように単離される。結合された目的のタンパク質／複合体は、次に、樹脂か
ら取り出せばよい。取り出すには、例えば、遊離ペプチドで溶出させるか、また
は、固相の組成を変化（例えば、ｐＨまたはイオン強度を変化することにより）
させればよい。
【００５７】 ペプチド親和性クロマトグラフィーによる組織サンプルからのタンパク質の単
離および精製の例は、Murrayら(1998), J. Pept. Res. 52, 375〜83およびNecin
aら(1998), J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 715, 191〜201に記載されて
いる。
【００５８】 好ましい実施態様において、ＰＳＤ−９５に結合する複合体はペプチドを用い
て単離される。
【００５９】 有利には、ペプチドはヒトＮＭＤＡ−Ｒ２Ｂサブユニット（Swiss Protエント
リーアクセス番号Ｑ１３２２４を参照のこと）のＣ末端の領域のアミノ酸配列と
同一であるアミノ酸配列を含有している。
【００６０】 ヒトＮＭＤＡ−Ｒ２ＢサブユニットのＣ末端における最後の１００アミノ酸の
配列は、次の通りである。 ＮＰＦＩＰＴＦＧＤＤＱＣＬＬＨＧＳＫＳＹＦＦＲＱＰＴＶＡＧＡＳＫＡＲＰＤ
ＦＲＡＬＶＴＮＫＰＶＶＳＡＬＨＧＡＶＰＡＲＦＱＫＤＩＣＩＧＮＱＳＮＰＣＶ
ＰＮＮＫＮＰＲＡＦＮＧＳＳＮＧＨＶＹＥＫＬＳＳＩＥＳＤＶ。
【００６１】 好ましくは、ペプチドは、アミノ酸配列ＳＩＥＳＤＶ、例えば、アミノ酸配列
ＫＬＳＳＩＥＳＤＶを含有している。
【００６２】 最も好ましくは、ペプチドはＳＩＥＳＤＶである。
【００６３】 あるいは、ペプチドは、ＳｙｎＧＡＰサブユニットのＣ末端の領域のアミノ酸
配列（配列アクセス番号について表２を参照のこと）と同一であるアミノ酸配列
を含有していてもよい。ＳｙｎＧＡＰの領域は、ＰＳＤ−９５の第３のＰＤＺド
メインに結合すると考えられる。
【００６４】 ヒトＳｙｎＧＡＰサブユニットのＣ末端残基の配列は、-ＲＧＳＦＰＰＷＶＱ
ＱＴＲＶであり、そのうちの少なくとも４アミノ酸（すなわち、ＱＴＲＶ）はＰ
ＳＤ−９５への結合に関与することが考えられる。
【００６５】 好ましくは、ペプチドはＱＴＲＶであるか、またはそれを含有している。
【００６６】 より好ましくは、ペプチドは、ＲＧＳＦＰＰＷＶＱＱＴＲＶであるか、または
それを含有している。
【００６７】 有利には、ペプチドは、ラットＳｙｎＧＡＰサブユニットのＣ末端の配列、従
ってＫＲＬＬＤＡＱＲＧＳＦＰＰＷＶＱＱＴＲＶであるか、またはそれを含有し
ている。
【００６８】 本発明の第４の態様では、本発明の第１の態様に係る多タンパク質複合体、ま
たは、本発明の第２の態様に係るサブ複合体を生成する別の方法が提供され、前
記方法は下記のステップを含む。 （ｉ）動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集するステップ。 （ｉｉ）多タンパク質複合体中の成分を保持する条件下で、表１に列挙された成
分から選択される成分に結合する分子と、サンプルとを接触させることにより複
合体を単離するステップ。
【００６９】 従って、本発明では、ＮＭＤＡ受容体複合体を生成する方法が提供され、この
方法は、下記のステップを含む。 （ｉ）動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集するステップ。 （ｉｉ）ＮＭＤＡ受容体を保持する条件下で、表１に列挙された成分から選択さ
れる成分に結合する分子と、サンプルとを接触させることにより複合体を単離す
るステップ。
【００７０】 複合体は、分子が結合する成分を含有していることが理解されよう。
【００７１】 本発明の第５の態様では、本発明の第１の態様に係る多タンパク質複合体、ま
たは、本発明の第２の態様に係るサブ複合体を生成する方法が提供され、前記方
法は下記のステップを含む。 （ｉ）本発明の第１の態様に係る多タンパク質複合体を発現する動物の中枢神経
系から組織のサンプルを収集するステップ。ここで、表１に示された成分のうち
、少なくとも１つの成分の発現が、野生型多タンパク質複合体を発現する動物と
の比較において改変される。 （ｉｉ）（異常な）複合体の成分に結合する分子と、サンプルとを接触させるこ
とにより複合体を単離するステップ。
【００７２】 従って、本発明では、ポリペプチドサブユニットＮＲ１と、表１に列挙された
成分の群から選択される少なくとも１つの成分とを含有するＮＭＤＡ受容体複合
体を作製する方法が提供され、前記方法は下記のステップを含む。 （ｉ）ＮＭＤＡ受容体複合体を発現する動物の中枢神経系から組織のサンプルを
収集するステップ。ここで、表１に示された成分のうち、少なくとも１つの成分
の発現が改変される。 （ｉｉ）複合体の成分に結合する分子と、サンプルとを接触させることにより複
合体を単離するステップ。
【００７３】 好ましくは、組織サンプルは、下記の動物の中枢神経系から採取することがで
きる。 （ｉ）表１に示された１つ以上の成分を発現しないような遺伝子「ノックアウト
」動物； （ｉｉ）表１に示された１つ以上の成分の変異体形態を発現するような動物；ま
たは （ｉｉｉ）表１に示された１つ以上の成分を過剰発現するような動物（例えば、
トランスジェニック動物）。
【００７４】 従って、多タンパク質複合体の異常体は、正常な動物（例えば、遺伝子改変さ
れていない非ヒト動物）から得られる複合体との比較において、成分を欠損する
か、変異体成分を含むか、または、過剰な成分を含有するような複合体を含む。
【００７５】 簡便には、動物は、トランスジェニック非ヒト動物であり、例えば、遺伝子改
変された非ヒト動物である。この遺伝子改変非ヒト動物は、多タンパク質複合体
に含まれる１つ以上の成分の変異体形態を発現するように、または、多タンパク
質複合体に含まれる１つ以上の成分を過剰発現するように遺伝子改変されたもの
である。有利には、トランスジェニック動物は、げっ歯類、例えばマウスまたは
ラットである。
【００７６】 トランスジェニック動物の生成および使用は今や当該分野において広く知られ
ている(例えば、Cameron, 1997, Mol. Biotechnol. 7:253〜65, およびCampbell
ら, 1996, Mol. Psychiatry. 1:105〜20を参照のこと)。実際、いくつかのグル
ープが、変異体、または、過剰発現されるＮＲ２サブユニットを含む異常なＮＭ
ＤＡ受容体を発現するトランスジェニックマウスを生成した旨、報告している(S
uchanekら, 1997, Biol. Chem. 378:929〜934; Okabeら, 1998, J. Neurosci. 1
8:4177〜88; Tangら, 1999, Nature 401:63〜60; Sprengelら, 1998, Cell 92:2
79〜289)。
【００７７】 本発明に係る第４および第５の態様の好ましい実施例において、多タンパク質
複合体の成分に結合する分子は、抗体、またはその抗原結合フラグメントである
。
【００７８】 本発明の第５の態様に係る方法において、複合体の成分に結合する分子は、ペ
プチドでもよいし（例えば、ペプチド親和性クロマトグラフィーにおける使用の
ために）、または、抗体もしくはその抗原結合フラグメントでもよい（例えば、
免疫親和性および／もしくは免疫沈降技術のために）ことが理解されよう。
【００７９】 抗体の「抗原結合フラグメント」とは、Ｆａｂ様分子(Betterら(1988)Science
240, 1041)、Ｆｖ分子(Skerraら(1988)Science 240, 1038)、１本鎖Ｆｖ（Ｓｃ
ＦＶ）分子（（ここではＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプ
チドを介して連結される(Birdら(1988)Science 242, 423; Hustonら(1988)Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879)）、および、単離されたＶドメイン(Wardら(1
989)Nature 341, 544)を含有する単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）を含むものとす
る。特定の結合部位を保持した抗体フラグメントの合成に関する技術の一般的な
概説は、Winter & Milstein(1991)Nature 349, 293〜299に見出される。
【００８０】 本発明の多タンパク質複合体を単離できる代表的な方法は、免疫沈降および免
疫親和性クロマトグラフィーを含む。このような技術は、当該分野において広く
知られている(例えば、Scopes, 1994, タンハ゜ク質精製:原理および実施, 第3版, Spr inger-Verlag, New York; HarlowおよびLane(編)抗体:実験室マニュアル, Cold Sprin g Habor Pressを参照のこと)。
【００８１】 多タンパク質複合体を生成するための本発明の方法において、多タンパク質複
合体が単離される組織のサンプルは、脳および脊髄を含む中枢神経系の任意の部
分から得ることができる。
【００８２】 好ましくは、組織は、脳から得られる。
【００８３】 より好ましくは、組織は前脳を含むか、または前脳から（例えば海馬もしくは
皮質から）得られる。
【００８４】 当業者によれば、本発明の第１の態様に係る多タンパク質複合体、または、本
発明の第２の態様に係るそのサブ複合体は、ＮＭＤＡ受容体を発現する任意のド
ナー動物から得られる成分を含んでいてもよいことが理解されよう。簡便には、
ＮＭＤＡ受容体は、多タンパク質複合体の成分として発現される。
【００８５】 好ましくは、複合体もしくはサブ複合体の成分は、ヒトから得られる。
【００８６】 さらに当業者によれば、多タンパク質複合体が得られる組織のサンプルは、成
体、若体、または新生仔の動物から採取できることが理解されよう。
【００８７】 さらに、異なる年齢の動物から得られる多タンパク質複合体の組成には、差異
が存在し得ることが理解されよう(例えば、Sansら, 2000, J. Neuroscience 20:1
260〜71を参照のこと)。
【００８８】 本発明の第３、第４および第５の態様の好ましい実施例において、多タンパク
質複合体を生成する方法は、さらに、組織が採取される動物の年齢を選択するス
テップを（ステップ１の前に）含む。
【００８９】 本発明の第６の態様では、本発明の第１の態様に係る多タンパク質複合体のサ
ブ複合体を作製する方法が提供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）表１および表２で同定される成分から選択される第１の成分をコードする
遺伝子構築物を、宿主細胞において発現させるステップ。 （ｉｉ）表１および表２で同定される成分から選択される第２の成分をコードす
る遺伝子構築物を、宿主細胞において発現させるステップ。 （ｉｉｉ）宿主細胞培養物から成分を単離するステップ。 （ｉｖ）成分を互いに接触させるステップ。 ここで、第１の成分と第２の成分とは異なり、少なくとも一方の成分が表１に示
された成分から選択される。
【００９０】 従って、本発明では、ＮＭＤＡ受容体のサブ複合体を作製する方法であって、
上記ステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を含む方法が提供される。
【００９１】 このような方法は、さらに、成分を互いに接触させるステップの前に、表１お
よび表２で同定される成分から選択される少なくとも１つのさらなる成分をコー
ドする遺伝子構築物を、宿主細胞において発現させるステップを含んでいてもよ
い。このようにして、３つ、４つ、５つまたは６つ以上の異なる成分を含有する
サブ複合体を生成することができる。
【００９２】 当業者によれば、遺伝子成分は、多タンパク質複合体に含まれる１つ以上の成
分をコードしてもよいことが理解されよう（すなわち、複合体の各成分は、別々
の遺伝子構築物によってコードされなくてもよい）。
【００９３】 ステップ（ｉ）における宿主細胞は、ステップ（ｉｉ）における宿主細胞と同
じであってもよく、ステップ（ｉｖ）は、少なくとも２つの成分が同じ宿主細胞
において発現されるときに生じ得る。従って、この場合、ステップ（ｉｖ）はス
テップ（ｉｉｉ）よりも前に行うことができる。
【００９４】 宿主細胞において遺伝子成分を発現させる方法は、当該分野において広く知ら
れている。従って、多タンパク質複合体の成分をコードするＤＮＡは、公知の技
術に従って使用され、本明細書中に含まれる技術を考慮して適切に改変され、発
現ベクターを構築し、これは次に、本発明のポリペプチドの発現および生成のた
めに適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。このような技術は、Rutt
erらに対して1984年4月3日に発行された米国特許第4,440,859号、Weissmanに対し
て1985年7月23日に発行された同第4,530,901号、Crowlに対して1986年4月15日に
発行された同第4,582,800号、Markらに対して1987年6月30日に発行された同第4,6
77,063号、Goeddelらに対して1987年7月7日に発行された同第4,678,751号、Itakur
aらに対して1987年11月3日に発行された同第4,704,362号、Murrayに対して1987年
12月1日に発行された同第4,710,463号、Toole,Jr.らに対して1988年7月12日に発
行された同第4,757,006号、Goeddelらに対して1988年8月23日に発行された同第4,
766,075号、Stalkerに対して1989年3月7日に発行された同第4,810,648号で開示さ
れた技術を含んでおり、これらの全ては本明細書の内容をなすものとして援用さ
れる。
【００９５】 多タンパク質複合体の成分をコードするＤＮＡは、適切な宿主に導入させるた
めに広範に多様な他のＤＮＡ配列に結合していてもよい。同伴のＤＮＡは、宿主
の性質、宿主へのＤＮＡの導入の様式、および、エピソーム維持かまたは取り込
みの何れが所望されるのかに拠るであろう。
【００９６】 一般に、ＤＮＡは、発現させるため、適切な方向で、かつ、正確なリーディン
グフレームでプラスミドのような発現ベクターに挿入される。必要であれば、Ｄ
ＮＡは、所望の宿主により認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチ
ド配列に連結されてもよく、このような制御は一般に発現ベクター中で利用でき
る。次に、ベクターは標準的な技術により宿主に導入される。一般には、宿主の
全てがベクターにより形質転換されるのではないであろう。従って、形質転換さ
れる宿主細胞を選択することが必要であろう。一つの選択技術としては、任意の
必要な制御エレメントを伴って、抗体耐性のような形質転換細胞における選択可
能な耐性をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターに導入することが含まれる。
あるいは、このような選択可能な耐性についての遺伝子は別のベクター上に存在
し得、これは所望の宿主細胞を同時形質転換するために使用される。
【００９７】 成分をコードする組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞は、次に、本
明細書で開示される技術を考慮し、当業者に知られている十分な時間および適切
な条件下で培養され、ポリペプチドを発現させてやり、次に、ポリペプチドは回
収される。
【００９８】 多くの発現系が知られており、細菌(例えば、E.coliおよびBacillus subtilis)
、酵母(例えば、Saccharomyces cereviciae)、糸状真菌(例えばAspergillus)、植
物細胞、動物細胞、昆虫細胞が含まれる。
【００９９】 ベクターは、他の細胞型、例えば、非原核生物細胞型での発現のために用いら
れる場合でも、ベクターは、原核生物を増殖させるために、ColEl oriのような
原核生物レプリコンを含んでいる。また、ベクターは、それで形質転換されたE.
coliのような細菌宿主細胞において遺伝子の発現（転写または翻訳）を指令する
能力のある原核生物プロモータのような、適切なプロモーターを含んでいてもよ
い。
【０１００】 プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こることを許容する
ＤＮＡ配列により構成される発現制御要素である。代表的な細菌宿主と共存し得
るプロモータ配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に便利であ
る制限部位を含んでいるプラスミドベクターに備えられる。
【０１０１】 典型的な原核生物ベクタープラスミドは、Biorad Laboratories(Richmond, CA
, USA)から入手できるpUC18, pUC19, pBR322もしくはpBR329、または、Pharmacia,
Piscataway, NJ USAから入手できるpTrc99AもしくはpKK223〜3である。
【０１０２】 典型的な哺乳動物細胞ベクタープラスミドは、Pharmacia, Piscataway, NJ, U
SAから入手できるｐＳＶＬである。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を
生じさせるためにＳＶ４０後期プロモーターを用いており、最も高いレベルの発
現が、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原生成細胞において見出される。
【０１０３】 誘導性の哺乳動物発現ベクターの例はｐＭＳＧであり、Pharmaciaからまた入
手できる。このベクターは、クローン化遺伝子の発現を生じさせるためにマウス
乳腫瘍ウイルス長期反復のグルココルチコイド誘導性プロモーターを用いている
。
【０１０４】 有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３〜４０６およびｐＲＳ４１３
〜４１６であり、一般に、Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037,
USAから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５お
よびｐＲＳ４０６は、酵母取り込みプラスミド(Yeast Integrating plasmid)（
ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーのＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵ
ＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１６は、酵母セントロメアプラ
スミド（ＹＣｐ）である。
【０１０５】 相補的な突出末端を介してベクターに作動可能にＤＮＡを連結する方法として
、多様な方法が開発されている。例えば、相補的なホモポリマートラクトが、Ｄ
ＮＡセグメントに付加され、ベクターＤＮＡに挿入され得る。次に、ベクターと
ＤＮＡセグメントとは、相補的なホモポリマーテイル間の水素結合を介して結合
されて、組換えＤＮＡ分子を構成する。
【０１０６】 １つ以上の制限部位を含んでいる合成リンカーによれば、ベクターにＤＮＡセ
グメントを結合する別の方法が提供される。先に述べたようにエンドヌクレアー
ゼ制限消化により作製されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージのＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ、または、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、突出する３
’-単-鎖の末端をそれらの３’-５’−エンドヌクレアーゼ活性で除去し、それ
らのポリメラーゼ活性で陥凹された３’末端を充填する酵素で処理される。
【０１０７】 従って、これらの活性の組み合わせによって、平滑末端化されたＤＮＡセグメ
ントが生成される。平滑末端化されたセグメントは、次に、バクテリオファージ
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのような平滑末端化ＤＮＡ分子のライゲーションに触媒作
用を及ぼすことができる酵素の存在下で、モル大過剰のリンカー分子とともに温
置(incubate)される。従って、反応の生成物は、末端にポリマーリンカー配列を
備えるＤＮＡセグメントである。次に、これらのＤＮＡセグメントは、適切な制
限酵素で切断され、そして発現ベクターに連結される。発現ベクターは、ＤＮＡ
セグメントの末端に適合する末端を生成する酵素で切断されている。
【０１０８】 多様な制限エンドヌクレオチドを含有する合成リンカーは、International Bi
otechnologies Inc. New Haven, CN, USAを含む多くの供給源から市販されてい
る。
【０１０９】 多タンパク質複合体の成分をコードするＤＮＡを改変するための望ましい方法
は、Saikiら(1988)Science 239, 487〜491において開示されるようにポリメラー
ゼ連鎖反応を利用することである。
【０１１０】 この方法において、酵素的に増殖されるＤＮＡは、２つの特定のオリゴヌクレ
オチドプライマーで挟まれる。これら特定のオリゴヌクレオチドプライマーは、
増殖されたＤＮＡにそれ自身取り込まれる。この特定プライマーは、当該分野で
知られた方法を用いて発現ベクターにクローニングするために使用され得る制限
エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。
【０１１１】 サブ複合体の成分は、当該分野で知られた方法(例えば、Scopes, 1994, タンハ゜ク 質精製:原理および実施、第3版、Springer-Verlag, New Yorkを参照のこと)によっ
て、宿主細胞培養物から単離することができる。例えば、サブ複合体の成分は、
イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作
用または親和性方法を利用することにより宿主細胞培養物から単離できる。
【０１１２】 望むなら、サブ複合体は、公知の方法を用いることにより脂質２重層で再構成
してもよい。
【０１１３】 本発明の第７の態様では、本発明に係る第５の態様の方法で用いるための宿主
細胞が提供され、この宿主細胞は、表１に列挙された成分の群から選択される成
分をコードする１つ以上の遺伝子構築物を含んでいる。
【０１１４】 さらに本発明では、表１および表２に列挙された成分の群から選択される２つ
以上の成分をコードする１つ以上の遺伝子構築物を含む宿主細胞が提供される。
【０１１５】 好ましくは、宿主細胞は、さらに、表２に列挙された成分の群から選択される
成分をコードする１つ以上の遺伝子構築物を含んでいる。
【０１１６】 例えば、宿主細胞は、表１および表２に列挙された２つ、３つ、４つ、５つ、
６つまたはそれ以上の成分をコードする遺伝子構築物を含んでいてもよい。
【０１１７】 代表的な宿主細胞としては、原核生物細胞株（例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ発現系）
のほかに、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母および他の真核生物細胞株からな
る群より選択される細胞が挙げられる。
【０１１８】 好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞であるか、または、このような細胞、例
えばヒト細胞から得られるものである。
【０１１９】 より好ましくは、宿主細胞は、ニューロンであるか、または、ニューロンから
得られる細胞（例えば、一次ニューロン培養物や、幹細胞から得られるニューロ
ン（幹細胞は、ニューロスフェアにおいて見出される細胞のように、ニューロン
幹細胞であるのみならず、多様性胚細胞でもある））であり、かつ、ＰＣ１２細
胞のような一般に使用されている細胞株である。
【０１２０】 本発明の第８の態様では、本発明の宿主細胞から単離される亜細胞画分が提供
され、この亜細胞画分はその中に、本発明の第１の態様に係る多タンパク質複合
体、または、本発明の第２の態様に係るサブ複合体を含有している。
【０１２１】 従って、本発明では、本発明の宿主細胞から単離される亜細胞画分が提供され
、この亜細胞画分はその中に、ＮＭＤＡ受容体複合体またはそのサブ複合体を含
有している。 典型的には、亜細胞画分は原形質膜であるか、またはそれを含んでいる。
【０１２２】 簡便には、亜細胞画分は、シナプトソーム、シナプス前および／もしくはシナ
プス後の末端、または、ソーマ(soma)を含有するか、またはそれを含んでいる。
【０１２３】 あるいは、亜細胞画分は細胞質ゾル画分を含有するか、またはそれを含んでい
る。
【０１２４】 原形質膜は、当該分野で知られた方法により形質転換された宿主細胞から精製
することができる。
【０１２５】 本発明の第９の態様では、本発明の第２の態様に係る多タンパク質複合体のサ
ブ複合体を作製する方法が提供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）タンパク質−タンパク質間相互作用を妨げる薬剤と、本発明の第１の態様
に係る複合体とを接触させるステップ。 （ｉｉ）それにより形成されるサブ複合体を単離するステップ。
【０１２６】 従って、本発明では、本発明の第２の態様に係るＮＭＤＡ受容体複合体のサブ
複合体を作製する方法が提供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）タンパク質−タンパク質間相互作用を妨げる薬剤と、本発明の第１の態様
に係る複合体とを接触させるステップ。 （ｉｉ）それにより形成されるサブ複合体を単離するステップ。
【０１２７】 本発明に係る第９の態様の好ましい実施例において、多タンパク質複合体が、
上述の方法を用いることにより単離される。サブ複合体が、複合体に含まれる２
つの成分の規定相互作用について競合する競合ペプチドを、複合体に添加するこ
とによって構成され、それにより、元来の複合体から１つ以上の成分が放出され
、１つ以上のサブ複合体が構成される。
【０１２８】 本発明の第１０の態様では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に
関連付けられる異常または状態を処置するための候補化合物を同定する方法が提
供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）試験される化合物を選択するステップ。 （ｉｉ）本発明の第１の態様に係る多タンパク質複合体、または、本発明の第２
の態様に係るサブ複合体の何れかと、試験化合物とを接触させるステップ。 （ｉｉｉ）試験される化合物が、複合体またはサブ複合体と相互作用するか否か
を判定するステップ。
【０１２９】 ここで、複合体またはサブ複合体と相互作用する試験化合物は、中枢神経系に
おけるＮＭＤＡ受容体の機能障害の徴候を軽減する、中枢神経系におけるＮＭＤ
Ａ受容体の機能障害の発病を防止もしくは遅延する、ならびに／または、中枢神
経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる欠損を修正するための
候補化合物として同定される。
【０１３０】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を処置するための候補化合物を同定する方法が提
供され、前記方法は、上記ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含み、ここで、複合体
またはサブ複合体と相互作用する試験化合物は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受
容体複合体の機能障害の徴候を軽減する、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複
合体の機能障害の発病を防止もしくは遅延する、ならびに／または、中枢神経系
におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に関連付けられる欠損を修正するため
の候補化合物として同定される。
【０１３１】 例えば、本発明の多タンパク質複合体は、薬物スクリーニングのための９６ウ
ェルプレートまたは他の適切な容器に固定化される複合体を与えるように適合さ
せてもよい。従って、抗体またはペプチドが（直接的または間接的に）プレート
に連結されるようにペプチド親和性法または抗体親和性法を適合させることがで
きる。次に、脳抽出物、または複合体の他の供給源を、プレート中で温置(incub
ate)することができ、その結果、多タンパク質複合体が固定化される。そして、
このような複合体と会合されない分子は、例えば、洗浄により除去される。多タ
ンパク質複合体における特定の成分の存在は、ＥＬＩＳＡ技術（標的に抗体を結
合し、酵素結合２次抗体を用いて、結合された抗体を観察する）によって検定す
ることができる。あるいは、特定の基質を用いて酵素試験法を行ってもよい。（
例えば、適切な反応成分を伴って９６ウェルプレート中の多タンパク質複合体に
、ＰＫＡについてのペプチド基質を適用すると、ペプチドのリン酸化が標準的な
方法（例えば、加水分解化ＡＴＰの比色試験法）を用いて観測されるであろう。
複合体に含まれる特定成分の解離（固定化多タンパク質複合体に試験化合物を適
用して生じる）は、同じ方法を用いて観測され得る。） 上述の方法は、高処理量分析のための一次スクリーニングの代表例である。二
次スクリーニングは、クロマトグラフィー、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ法（例えば、ウェ
スタンブロット検出）および酵素試験法のような相補的な試験法を含んでいても
よい。
【０１３２】 スクリーニングの後の段階は、本発明の多タンパク質複合体、サブ複合体また
はそれらの成分を発現する細胞（トランスジェニックマウスから単離されるニュ
ーロンを含む）の使用を含んでいてもよい。
【０１３３】 「中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および
状態」とは、ＮＭＤＡ受容体を含有する多タンパク質複合体の機能障害に関連付
けられる異常および状態を含むものとする。代表的な異常および状態としては、
学習的欠陥、ならびに、ＮＭＤＡ受容体に関わる多数の精神医学的および神経学
的な異常（例えば、精神分裂病、鬱病、脳卒中、癲癇および神経変性異常）が含
まれる。さらに、学習挙動、集団内の自然変分に関わる注意および記憶獲得にお
ける異常を含めて考えることにする。また、直接的な頭部外傷、脳手術、脳卒中
から生じるような傷害後の異常な脳機能を含めて考えることにする。
【０１３４】 多タンパク質複合体またはそのサブ複合体と「相互作用する」とは、多タンパ
ク質複合体、サブ複合体もしくはそれらの成分の特性を、ポジティブもしくはネ
ガティブの何れかに調節すること、ならびに／または、多タンパク質複合体、サ
ブ複合体もしくはそれらの成分の解離を誘導することを含むことにする。
【０１３５】 本発明に係る第１０の態様の好ましい実施例において、試験される化合物は、
多タンパク質複合体またはそのサブ複合体と接触され、そして、多タンパク質複
合体またはサブ複合体の酵素成分の活性が測定される。例えば、試験される化合
物が多タンパク質複合体またはサブ複合体のプロテインキナーゼ成分またはホス
ファターゼ成分の活性を、ポジティブまたはネガティブの何れかに調節する能力
を判定することによって、候補化合物を同定することができる。このような酵素
の活性を測定するための方法は当該分野において公知である（上述を参照のこと
）。
【０１３６】 あるいは、試験される化合物が多タンパク質複合体またはそのサブ複合体の解
離を誘導する能力を判定することによって、候補化合物を同定することができる
。複合体またはサブ複合体の解離は、幾つかの方法を用いて評価することができ
る。例えば、解離される特定の成分に対する抗体、または、放射標識されたタン
パク質および他の方法を用いることができる。
【０１３７】 本発明の第１１の態様では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を処置するための候補化合物を同定する方法が提
供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）試験される化合物を選択するステップ。 （ｉｉ）表１に列挙された群から選択される成分と、試験化合物とを接触させる
ステップ。 （ｉｉｉ）試験される化合物が、前記成分の特性を調節するか否かを判定するス
テップ。
【０１３８】 ここで、成分の特性を調節する試験化合物は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受
容体の機能障害に関連付けられる異常および状態の徴候を軽減する、中枢神経系
におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態の発病を防
止もしくは遅延する、ならびに／または、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の
機能障害に関連付けられる異常および状態に関連付けられる欠損を修正するため
の候補化合物として同定される。
【０１３９】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を処置するための候補化合物を同定する方法が提
供され、この方法は上述のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む。ここで、成分の
特性を調節する試験化合物は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の複合体機能
障害に関連付けられる異常および状態の症状を軽減する、中枢神経系におけるＮ
ＭＤＡ受容体複合体の機能障害に関連付けられる異常および状態の発病を防止も
しくは遅延する、ならびに／または、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体
の機能障害に関連付けられる異常および状態に関連付けられる欠損を修正するた
めの候補化合物として同定される。
【０１４０】 例えば、表１からの下記の成分の活性／機能は、活性を測定するための一般的
な方法を用いて試験することができる。 ＊１ Gille & Downward (1999) J. Biological Chemistry 274(31):22033〜2204
0を参照のこと。 ＊２ Heinzら (1998) J. Mol. Biol. 275:635〜650 および Othmanら (1996) Bi
ochim. Biophys. Acta. 1303:92〜102 を参照のこと。
【０１４１】 「成分の特性を調節する」とは、酵素成分の触媒活性を（ポジティブまたはネ
ガティブの何れかに）調節すること、および、酵素成分が多タンパク質複合体ま
たはサブ複合体に含まれる１つ以上の他の成分と相互作用する能力を（ポジティ
ブまたはネガティブの何れかに）調節することを含むことにする。１つ以上の他
の成分は、表１または表２に列挙された成分の何れかであり得ることが理解され
よう。
【０１４２】 本発明に係る第１１の態様の好ましい実施例において、ステップ（ｉｉｉ）は
、試験化合物が、多タンパク質複合体またはそのサブ複合体に含まれる１つ以上
の他の成分と相互作用する成分の能力を（ポジティブまたはネガティブの何れか
に）調節するか否かを判定するステップを含む。
【０１４３】 有利には、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異
常および状態を処置するための化合物を同定するための本発明の方法は、学習的
欠陥、精神医学的異常および／または神経学的異常に対する処置の効能について
の１つ以上のスクリーニングにおいて、試験化合物を試験するステップを含む。
【０１４４】 例えば、試験化合物は、さらに、下記のタイプのスクリーニング試験を用いて
評価することができる。
【０１４５】 １．培養されたニューロン、組織切片または外殖片を使用する神経機能のインビ
トロ分析。
【０１４６】 化合物は、ニューロン膜特性、遺伝子発現および神経伝達因子放出に対する効
果について公知の方法（例えば、神経伝達因子の電気生理学、インサイチュハイ
ブリダイゼーション、ＨＰＬＣ測定）を用いて試験することができる。
【０１４７】 １次スクリーニング試験において、本発明の多タンパク質複合体を調節する化
合物の効果は、ニューロン細胞に対して試験されるであろう。但し、試験法は、
ＮＭＤＡ受容体に関わる生物学的機構を反映させる。また、ＮＭＤＡ受容体機能
に依存していない生理学的機構を観測することにより、化合物作用の特異性につ
いて行う制御試験法もあるであろう。ＮＭＤＡ受容体機能依存性の試験法の例と
しては、下記の測定が含まれるであろう。
【０１４８】 本発明の多タンパク質複合体の発現成分を測定すること。 パッチクランピングおよび他の電気生理学的方法を用いてＮＭＤＡ受容体チャネ
ル特性を測定すること。 ＮＭＤＡ受容体または他の神経伝達因子受容体に結合する化合物（アゴニストお
よびアンタゴニスト）を適用したときにおける、細胞および多タンパク質複合体
成分の応答を測定すること（これらの応答としては、神経伝達因子により誘導さ
れる細胞死、ならびに、シナプス、軸索、および樹状細胞における構造変化が含
まれ得るであろう）。 シナプス伝達における変化を測定すること。 そして、ＮＭＤＡ受容体依存性生理学を調節する化合物は、無傷の動物における
スクリーニングに用いられるであろう。
【０１４９】 ２．動物モデルにおけるニューロン機能のインビボ分析 化合物は、公知の方法（例えば、電気生理学、微小透析、迷路における学習お
よび記憶）を用いることにより、ニューロン膜特性、神経伝達因子放出、および
挙動に関する効果について試験することができる。例えば、げっ歯類および霊長
類について、認知機能に及ぼす候補化合物の効果を試験できるであろう。このよ
うな試験では、注意が、多タンパク質複合体においてＮＭＤＡ受容体および他の
成分を含むことが知られている表現型に集中されるであろう。例えば、学習試験
、慢性的な痛みに対する応答、および、薬物習慣性試験が採用できるであろう。
【０１５０】 ３．変異体／トランスジェニックげっ歯類を用いた研究 動物におけるスクリーニングとしては、変異体マウスにおけるスクリーニング
が含まれるであろう。例えば、薬物が、ＰＳＤ−９５に結合するタンパク質を調
節することが知られている場合、この薬物により、ＰＳＤ−９５変異体マウスが
得られるであろう。薬物が単一のタンパク質に特異的に結合する場合、インビボ
での薬物特異性に関する有用な制御は、そのタンパク質についての遺伝子変異を
保有するマウスに及ぼされる薬物の効果を試験することであろう。試験法は、細
胞の供給源が変異体マウスにより得られる点を除き、上述の試験法と同一であろ
う。具体的には、本発明者らは、ＰＳＤ−９５変異体マウスの例において、ＰＳ
Ｄ−９５結合タンパク質を妨げる化合物により生理学的な変化が生じるか否かを
試験するであろう。
【０１５１】 ４．ＣＮＳに対する障害を有する動物における回復のインビボ解析 また、スクリーニングは、（例えば、脳卒中、薬物、脳腫瘍または手術損傷に
より）神経系に対する障害または損傷を受けた動物について行うことができるで
あろう。このタイプのスクリーニングにおいては、未処置とされた動物が、脳機
能の回復（学習塑性の態様）について観察され、試験化合物が、回復または学習
を増強する能力について評価されるであろう。
【０１５２】 本発明のもう一つの態様では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害
に関連付けられる異常および状態を処置するための候補化合物を同定する方法が
提供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）表１に列挙された成分の特性を調節すると知られている化合物を、選択す
るステップ。 （ｉｉ）中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常お
よび状態に対する処置の効力に関するスクリーニングにおいて、前記化合物を試
験するステップ。
【０１５３】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を処置するための候補化合物を同定する方法であ
って、上記ステップ（ｉ）、（ｉｉ）を含む方法が提供される。
【０１５４】 表１に列挙された成分の特性を調節すると知られている代表的な化合物を、次
の通り列挙する。
【０１５５】 本発明の別の態様では、上記方法の使用方法が提供され、この使用方法では、
本発明の多タンパク質複合体またはサブ複合体と相互作用する化合物を同定する
ことにより、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異
常および状態に対する処置において有用であり得る薬剤を選択する。
【０１５６】 従って、本発明では、上記方法の使用方法が提供され、この使用方法では、本
発明のＮＭＤＡ受容体複合体またはサブ複合体と相互作用する化合物を同定する
ことにより、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に関連付けら
れる異常および状態に対する処置において有用であり得る薬剤を選択する。
【０１５７】 当業者によれば、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けら
れる異常および状態を処置するための候補化合物を同定するための本発明の上記
方法において、上記方法において用いられる多タンパク質複合体、そのサブ複合
体およびそれらの成分は、動物組織サンプルから得られるか、または、組換え技
術を用いることにより宿主細胞において発現され得ることが理解されよう。さら
に、多タンパク質複合体、そのサブ複合体およびそれらの成分は、単離された様
態（すなわち、組織サンプルもしくは宿主細胞からの分離）であってもよいし、
再構成された様態、例えば、脂質２重層の様態であってもよい。
【０１５８】 さらに本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
られる異常および状態を処置するための候補化合物を同定するためのスクリーニ
ング試験において、本発明の第７の態様に係る宿主細胞、または、本発明の第８
の態様に係る亜細胞画分を用いる方法が提供される。
【０１５９】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を処置するための候補化合物を同定するためのス
クリーニング試験において、本発明の第７の態様に係る宿主細胞、または、本発
明の第８の態様に係る亜細胞画分を用いる方法が提供される。
【０１６０】 さらに本発明では、変異体またはトランスジェニック動物の使用方法が提供さ
れ、この使用方法は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
られる異常および状態を処置するための候補化合物を同定するためのスクリーニ
ング試験において、本発明に係る第５の態様の方法に用いられる。
【０１６１】 従って、本発明では、変異体またはトランスジェニック動物の使用方法が提供
され、この使用方法は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を処置するための候補化合物を同定するためのス
クリーニング試験において、本発明に係る第５の態様の方法に用いられる。
【０１６２】 本発明の多タンパク質複合体に含まれる成分の変異または欠失を伴っているト
ランスジェニックマウスは、表現型を有してもよく、これにより、その変異と同
様な方法で正常な複合体の生物学的機能を妨げる薬物が、医学的に有用であろう
と示唆される。事実、ＰＳＤ−９５変異体マウスは、増強されたシナプス可塑性
を示し、この効果を生じる薬物は有用であろう（実施例４を参照のこと）。この
実施例において、ＮＭＤＡ受容体を含有する多タンパク質複合体は、本明細書に
開示された方法、および、研究された組成物を用いることにより、ＰＳＤ−９５
変異体マウスから単離された。予期されなかったことには、他の成分の多くが依
然として存在するにもかかわらず、特定の成分（Ａｒｇ３．１／Ａｒｃ）は多タ
ンパク質複合体中に存在しないことがわかった。従って、Ａｒｇ３．１／ＰＳＤ
−９５相互作用を妨げる薬物を同定することは有用であろう。このようにして、
組成物に関する知識が、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付
けられる異常および状態を処置するための候補化合物を同定するために利用され
得る。
【０１６３】 単離された多タンパク質複合体は、別々のステップとして、次のような少なく
とも２つの方法で使用でき、これにより、Ａｒｇ３．１相互作用について競合す
る薬物をスクリーニングできるであろう。 （ｉ）正常なマウスからの多タンパク質複合体を単離（本明細書に記述されるよ
うに）し、そして候補薬物とともに温置(incubate)し、その後、Ａｒｇ３．１会
合を測定する。 （ｉｉ）さらに、ＰＳＤ−９５変異体マウスからの多タンパク質受容体複合体に
ついて、変化された結合があるか否かを確認するためにこの薬物の結合を試験す
る。
【０１６４】 最後に、選択された薬物はＰＳＤ−９５変異体マウスに対して試験でき、これ
により、選択薬物が、多タンパク質複合体の外側における細胞事象により変化す
る任意の「付加的な」または「副次的な」効果を有するか否かを確認できるであ
ろう。
【０１６５】 本発明の第１２の態様では、化合物を同定するための本発明の方法により得る
ことができるか、または得られる化合物が提供される。
【０１６６】 当業者によれば、このような化合物が、薬物様化合物であるか、または薬物様
化合物の開発のためのリード化合物であり得ることが理解されよう。
【０１６７】 用語「薬物様化合物」は、当業者に周知であり、例えば、薬剤に含まれる有効
成分のように、医学的使用に適合させ得る特性を有する化合物を含むものとして
考えられる。
【０１６８】 従って、例えば、薬物様化合物は、有機化学、分子生物学または生化学の技術
により合成され得る分子であってもよい。好ましくは、薬物様化合物は小分子で
あり、５０００ダルトン未満でもよく、水溶性であってもよい。さらに薬物様化
合物は、特定のタンパク質との選択的な相互作用の特性を示し、かつ、生体利用
可能であり、かつ/または標的細胞膜に浸透してもよいが、これらの特徴は必要
不可欠ではないことが理解されよう。
【０１６９】 用語「リード化合物」は、同様にして当業者に周知であり、薬物としての使用
にはそれ自身適していない化合物ではあるが（例えば、意図される標的に対する
効果が弱いか、作用が非選択的であるか、不安定であるか、可溶性が不十分であ
るか、合成が困難であるか、または、生体利用可能性が不十分であるだけの理由
で）、より所望される特性を有し得る他の成分の設計のための開始点を提供する
ような化合物を含んでいてもよい。
【０１７０】 ＮＭＤＡ受容体（および、このような受容体を含有している本発明の多タンパ
ク質複合体）の活性をインビボで調節し得る化合物を同定することが望ましいと
理解されるよう。従って、候補化合物を同定する上記方法で用いられる試薬また
は条件は、化合物と、多タンパク質複合体（またはサブ複合体またはそれらの成
分）との間の相互作用が実質的にインビボと同じであるように選択できることが
理解されよう。
【０１７１】 さらに本発明では、本発明の化合物もしくはその塩と、薬学的に受容される賦
形剤もしくはキャリアとを含有する薬学的組成物が提供される。
【０１７２】 本発明の薬学的組成物は簡便には、単位剤形として与えることができ、薬学分
野で周知である方法の何れかにより調製することができる。このような方法は、
１つ以上の附属成分を構成するキャリアと、有効成分（本発明の化合物）とを会
合させるステップを含む。一般に、薬学的組成物／処方物は、液体キャリアまた
は微細に分割された固体キャリアまたはその両方と、有効成分とを、均一にかつ
親密に会合させることによって調製され、次に、必要であれば産物を成型する。
【０１７３】 薬学的組成物は、当該分野で公知な投与経路を介して、例えば経口または非経
口投与を介して送達され得る。
【０１７４】 経口投与に適した本発明の処方物は、カプセル、カシェ、錠剤のような分散単
位として、または、水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として
、または水中油液体乳濁液もしくは油中水乳濁液として与えられ得る。また、有
効成分は、ボーラス、舐剤、またはペーストとして与えられ得る。。
【０１７５】 錠剤は、必要に応じて１つ以上の補助成分とともに、加圧または成型により作
製され得る。加圧された錠剤は、必要に応じて結合剤（例えば、ポビドン、ゼラ
チン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性な希釈剤、保存
剤、分解剤（例えば、ナトリウムスターチグリコレート、架橋されたポビドン、
架橋されたナトリウムカルボキシメチルセルロース）、界面活性または分散剤と
混合された、粉末または顆粒のような自由流動形態における有効成分を、適切な
機械において加圧することによって調製され得る。成型された錠剤は、不活性な
液体希釈剤で湿潤化された粉末化化合物の混合物を、適切な機械において成型す
ることによって作製され得る。錠剤は、必要に応じてコートされ得るか、または
スコアされ得る。そして、錠剤は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
スを用い、所望の放出プロフィールを実現するようにヒドロキシプロピルメチル
セルロースの比率を変化させることにより、錠剤における有効成分の放出を遅延
させるか、または制御するように処方され得る。
【０１７６】 非経口投与に適した処方物は、対象となるレシピエントの血液と等浸透圧であ
る処方物をもたらす溶質、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤を含み得る水性および
非水性の滅菌注射溶液、ならびに、懸濁化剤および濃縮剤を包含し得る水性およ
び非水性滅菌懸濁液を含む。処方物は、単位用量または多用量容器、例えば密封
されたアンプルおよびバイアルとして与えられ得、そして使用の直前に滅菌液体
キャリア、例えば注射用の水を加えさえすればよい凍結-乾燥（凍結乾燥）状態
において保存され得る。間に合わせの注射溶液および懸濁液は、前述された種類
の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【０１７７】 好ましい単位投薬処方物は、有効成分の、毎日の用量または単位、毎日のその
副用量または適切な画分を含有する単位投薬処方物である。
【０１７８】 本発明の第１３の態様では、医学的使用のための本発明の化合物が提供される
。
【０１７９】 本発明の化合物（およびその薬学的組成物）は、ＮＭＤＡ受容体が関わる多数
の異常を、治療的および／または予防的に処置するときに使用され得る。
【０１８０】 好ましくは、本発明の化合物は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障
害に関連付けられる異常および状態を処置するために使用される。
【０１８１】 より好ましくは、本発明の化合物は、学習的欠陥、精神医学的異常および／ま
たは神経学的異常を処置するときに使用される。従って、本発明では、学習的欠
陥、精神医学的異常および／または神経学的異常を呈する患者を処置する方法で
あって、前記患者に本発明の化合物を投与するステップを含む方法が提供される
。
【０１８２】 「学習的欠陥」とは、情報の獲得または回顧において異常性がある異常または
状態を含むことにする。最も簡単な症例は、正常な子供の速度で学習できないか
もしれない子供における。学習的欠陥は、数学的技能を学習することから区別さ
れるように、ある様相、例えば言語の学習、に特異的であり得る。通読に対する
学習における障害は、失読症のサブセットとして記載され得る。また、学習的欠
陥は「脳障害後の学習における障害」を含み得る。例えば、脳卒中を罹患し、明
らかに脳組織の破壊がある患者は、しばしば、経時的に低減する深在性の障害を
示すであろう。この回復は、脳の他の部分が機能を引き継ぐように「学習」する
からである。しかし、このような回復は、或る人々においては不十分なものとな
るかもしれず、障害された学習として考慮されるであろう。従って、本発明の化
合物は、外科的処置、脳卒中、または他のＣＮＳに対する外傷の結果として、そ
れらの中枢神経系（例えば、脳/脊柱）に対する障害を呈する患者の処置に有用
であり得る。
【０１８３】 また、学習的欠陥は、進行中の疾患プロセスにも関連付けられ得る。例えば、
脳における（アルツハイマー病における）変性は、上述のように、残りの脳領域
の「学習」に対してバランスを保たれる。従って、学習障害を呈する患者は、神
経変性疾患においてより漸進性の悪化を示し得る。
【０１８４】 「精神医学的異常」とは、精神分裂病、アルツハイマー病、慢性疼痛症候群、
癲癇、パーキンソン病、ハンチントン病、習慣性異常（アルコール依存症を含む
）、主要な鬱病異常、不安異常を含むものとする。
【０１８５】 「神経学的異常」とは、虚血性脳傷害（例えば、脳卒中）、慢性疼痛症候群、
癲癇、神経変性異常（ＣＪＤ）、脳腫瘍からの障害、および、免疫学的起源を有
する病変（例えば、ＡＩＤＳ関連性疾病における）を含むものとする。
【０１８６】 患者は、任意の種の動物からであり得ることが理解されよう。好ましくは患者
はヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシのような哺乳動物である。
【０１８７】 より好ましくは患者はヒトである。
【０１８８】 さらに、化合物は、単回の処置（すなわち、急性）、または、長期間にわたる
反復性処置（すなわち、慢性的）の何れかとして患者に投与され得ることが理解
されよう。
【０１８９】 さらに本発明では、本発明の化合物の使用方法であって、中枢神経系における
ＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態に対する処置のため
の薬物を調製する使用方法が提供される。
【０１９０】 従って、本発明では、本発明の化合物の使用方法であって、中枢神経系におけ
るＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に関連付けられる異常および状態に対する処
置のための薬物を調製する使用方法が提供される。
【０１９１】 さらに本発明では、表１に列挙された１つ以上の成分の特性（例えば、触媒活
性）を調節する化合物を使用する方法であって、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受
容体の機能障害に関連付けられる異常および状態に対する処置のための薬物を調
製する使用方法が提供される。従って、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機
能障害に関連付けられる異常および状態を処置する方法であって、表１に列挙さ
れた１つ以上の成分の特性を調節する化合物を、患者に投与するステップを含む
使用方法が提供される。
【０１９２】 従って、本発明では、表１に列挙された１つ以上の成分の特性（例えば、触媒
活性）を調節する化合物を使用する方法であって、中枢神経系におけるＮＭＤＡ
受容体複合体の機能障害に関連付けられる異常および状態に対する処置のための
薬物を調製する使用方法、ならびに、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体
の機能障害に関連付けられる異常および状態を処置する方法であって、表１に列
挙された１つ以上の成分の特性を調節する化合物を患者に投与するステップを含
む使用方法が提供される。
【０１９３】 表１に列挙された１つ以上の成分の特性を調節する化合物の例は、上記で列挙
されている。 好ましくは、薬物は、学習的欠陥を処置するためのものである。 簡便には、薬物は、精神医学的異常を処置するためのものである。例えば、本
発明の化合物は、精神分裂病を処置するために使用することができる。 あるいは、薬物は、脳卒中、癲癇、神経変性異常のような神経学的異常を処置
するためのものである。
【０１９４】 ＮＭＤＡ受容体を含有する多タンパク質複合体の成分の（および、これゆえ、
前記成分をコードする核酸の）改変体と、学習的欠陥、精神医学的異常および／
または神経学的異常の罹患性との間には関係があると考えられる。従って、多タ
ンパク質複合体の成分をコードする核酸の特定の配列改変体（被験体の保有する
遺伝子多型）を検出することは、診断および／または予後診断の目的のために有
用であり得る。
【０１９５】 「配列改変体」とは、本発明の多タンパク質複合体の成分をコードする遺伝子
のような、別形態の核酸の集合（例えば、対立遺伝子）のような配列改変体を含
むものとする。
【０１９６】 「関連付けられる」とは、対象となる成分の改変体を表現する（すなわち、前
記改変体をコードする核酸の対立遺伝子を保有している）被験体について、ＣＮ
ＳにおけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常または状態（例えば
、学習的欠陥、精神医学的異常および／または神経学的異常）を発症または被る
尤度が、一般的な母集団についての平均尤度と比較して大きいことを意味するも
のとする。
【０１９７】 ＮＭＤＡ受容体を含む多タンパク質複合体の成分をコードするような核酸の特
定の配列改変体は、ＮＭＤＡ受容体の機能が異常である特定の異常および状態に
関連付けられ得る。このような異常および状態が、ＮＭＤＡ受容体を含有する多
タンパク質複合体の成分をコードするような複数の核酸の特定の配列改変体に関
連付けられ得ることが理解されよう（例えば、異常は、このような複数の遺伝子
における複数の多型体に関連付けられ得る）。
【０１９８】 本発明のもう一つの態様では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害
に関連付けられる異常および状態を診断するか、または診断を補助する方法が提
供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）診断される被験体から、核酸を含有するサンプルを得るステップ。 （ｉｉ）被験体からの当該核酸と、表１に列挙された成分の群から選択される成
分をコードする核酸に選択的にハイブリダイズする第２の核酸、またはその変異
体対立遺伝子、またはそれらの成分とを接触するステップ。
【０１９９】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を診断するか、または、診断することを補助する
方法であって、上記のステップ（ｉ）、（ｉｉ）を含む方法が提供される。
【０２００】 好ましくは、表１に列挙された核酸をコードする核酸は、遺伝子（例えば、ゲ
ノムＤＮＡの１部分）であるが、あるいは、このような成分をコードするＲＮＡ
またはｃＤＮＡであってもよい。
【０２０１】 例えば、表１からの成分をコードする遺伝子における特定の多型体の存在は、
学習的障害などの指標であり得る。従って、このような多型体の存在について試
験することにより、診断試験が提供され得る。
【０２０２】 当業者によれば、試験対象の被験体からの核酸サンプル内に含まれるものは、
ＮＭＤＡ受容体を含有する天然存在の多タンパク質複合体の成分をコードするよ
うな核酸であることが理解されよう。これらの核酸の塩基配列は、天然に存在す
る多タンパク質複合体の成分をコードする核酸に選択的にハイブリダイズする第
２の核酸（標的核酸）で、被験体からの核酸サンプルをプローブすることにより
分析することができる。標的核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを含み得
る。
【０２０３】 診断される被験体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどのような任意の種の
動物からであり得る。 好ましくは、被験体はヒトである。
【０２０４】 また、ハイブリダイゼーション実験によれば、ＮＭＤＡ受容体を含有する天然
存在の多タンパク質複合体の成分をコードする遺伝子が発現するパターンについ
ての情報が得られる。
【０２０５】 「選択的にハイブリダイズする核酸」とは、中程度にまたは高度に限定された
条件下でハイブリダイズできる上記標的核酸に対して十分なヌクレオチド配列類
似性を有するような核酸を意味する。当該分野において周知であるように、核酸
ハイブリダイゼーションの限定性(stringency)は、ハイブリダイゼーションが生
じる核酸の長さ、ハイブリダイズする配列の同一性の程度のような因子、ならび
に、温度、イオン強度および配列のＣＧもしくはＡＴ含量のような因子に依存す
る。従って、選択的にハイブリダイズできるような任意の核酸が、本発明の実施
において有用である。
【０２０６】 上記標的核酸に選択的にハイブリダイズし得る核酸は、当該核酸の少なくとも
一部分にわたり、上記標的核酸に対して＞９５％の配列同一性、好ましくは＞９
８％の配列同一性、より好ましくは＞９９％の配列同一性を有するような核酸を
含む。周知であるように、ヒト遺伝子は、通常、上記標的核酸内の遺伝子に由来
するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが、その全長にわたり完全には上記標的核酸に対し
適合しないようなイントロンを含んでいるが、それにもかかわらず、ヒト遺伝子
は、標的核酸に選択的にハイブリダイズできる核酸であるであろう。
【０２０７】 選択的なハイブリダイゼーションを導くような、中程度にまたは高度に限定さ
れたハイブリダイゼーション条件の典型例は、当該分野において公知であり、例
えばこれらはMolecular Cloning, a laboratory manual, 第2版, Sambrookら(編
), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記
載されている。この文献は本明細書の内容をなすものとして援用される。
【０２０８】 核酸がナイロンメンブレン上に固定化され、プローブ核酸が＞５００塩基もし
くは塩基対である場合の典型的なハイブリダイゼーション溶液の例は、下記の通
りである。
【０２０９】 ６×ＳＳＣ（生理食塩水クエン酸ナトリウム） ０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） １００μｇ／ｍｌ 変性化、フラグメント化サケ精子ＤＮＡ ハイブリダイゼーションは、６８℃で実施される。核酸が固定化されたナイロ
ンメンブレンは、６８℃にて、１×ＳＳＣ中で、または高限定(high stringency
)では０．１×ＳＳＣ中で洗浄され得る。
【０２１０】 ２０×ＳＳＣは、次のような方法で調製され得る。８００ｍｌのＨ２Ｏ中に１
７５．３ｇのＮａＣｌおよび８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを溶解する。数滴
のＮａＯＨの１０Ｎ溶液により、ｐＨをｐＨ７．０に調節する。水で容量を１リ
ットルに調節する。アリコートに取り分ける。オートクレーブを用いて滅菌する
。
【０２１１】 核酸がナイロンメンブレン上に固定化され、プローブが１５〜５０塩基のオリ
ゴヌクレオチドである場合の典型的なハイブリダイゼーション溶液の例は次の通
りである。
【０２１２】 ３.０Ｍ 塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡＣＩ） ０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８） １ｍｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６） ０．５％ ＳＤＳ １００μｇ／ｍｌ 変性化、フラグメント化サケ精子ＤＮＡ ０．１％ 脱脂粉乳。
【０２１３】 ハイブリダイゼーションに最適な温度は、通常、与えられた鎖長についてのＴ
ｉよりも５℃低くなるように選択される。Ｔｉは、プローブとその標的配列との
間で形成されるハイブリッドの不可逆性融解温度である。Jacobsら(1988) Nucl.
Acids Res. 16:4637 はＴｉの決定について論じている。３Ｍ ＴＭＡＣｌ中の
１７マーについての推奨ハイブリダイゼーション温度は４８〜５０℃であり、１
９マーについての推奨ハイブリダイゼーション温度は５５〜５７℃であり、２０
マーについての推奨ハイブリダイゼーション温度は５８〜６６℃である。
【０２１４】 「選択的にハイブリダイズする核酸」は、標的核酸の当該領域からＤＮＡを増
幅する核酸も含むものとする。このＤＮＡ増幅は、詳細に後述される増幅系のよ
うな周知の増幅系の何れかにより、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）下で行
われる。ＰＣＲ増幅のための適切な条件は、適切な１×増幅緩衝液における増幅
を含む： １０×増幅緩衝液は、５００ｍＭ ＫＣｌ；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ（室
温でｐＨ８．３）；１５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．１％ゼラチンである。
【０２１５】 適切な変性剤または手順（例えば９５℃に加熱する）が２本鎖ＤＮＡの鎖を分
離するために使用される。
【０２１６】 適切には、増幅のアニール部分は、３７℃と６０℃との間にあり、好ましくは
３７℃と５０℃との間にある。
【０２１７】 本発明の方法で有用な核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得るが、ＤＮＡが好
ましい。本発明の方法で有用な核酸は、２本鎖または１本鎖であり得るが、１本
鎖核酸が、核酸増幅反応におけるような幾つかの基準下で好ましい。
【０２１８】 本発明の方法で有用な核酸は、これが２本鎖である場合、１００ｋｂのように
非常に大きいものであり得る。例えば、このような大きな核酸は、ＦＩＳＨ（蛍
光インサイチュハイブリダイゼーション）分析で用いられるプローブを作製する
ための鋳型として有用である。典型的には、ＦＩＳＨで用いられるような、標識
されたプローブは、一般的に、ゲノムクローン（例えば、適切なＰＡＣクローン
中に挿入される）からのニック-翻訳またはランダムプライミングによって作製
される。一旦作製されると、これらのプローブは約５０〜１０００ヌクレオチド
長である。しかし、診断するか、プローブするか、または増幅する目的のために
は、核酸は、１００００未満の塩基対（核酸が２本鎖である場合）もしくは塩基
（核酸が１本鎖である場合）を有する場合が好ましく、より好ましくは１０００
未満の塩基対もしくは塩基、より一層好ましくは、１０〜１００の塩基対もしく
は塩基、さらにより一層好ましくは、１５〜３０の塩基対もしくは塩基を有する
。１本鎖ＤＮＡプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応で使用するために適切であ
り、特に好ましい。
【０２１９】 上記標的核酸が、本発明の多タンパク質複合体の成分をコードする遺伝子（ま
たはそのフラグメント）であり得ることが理解されるよう。「遺伝子」とは、イ
ントロンおよびエクソンを含むのみならず、イントロンおよびエクソンに関連付
けられ、かつ、イントロンおよびエクソンに物理的に密接する調節領域、特に、
最も５’のエクソンに対して５’である調節領域も含むものとする。「物理的に
密接する」とは、５０ｋｂ以内、好ましくは１０ｋｂ以内、より好ましくは５ｋ
ｂ以内、より一層好ましくは２ｋｂ以内である旨の意味である。さらに、調節領
域を同定するために、連続欠失およびフットプリンティング技術を利用できる。
【０２２０】 特に好ましくは、本発明の方法で使用するための核酸は、標的核酸の一部分を
増幅するために使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーである。一旦増幅さ
れると標的核酸の部分は、当該分野で公知な方法(Molecular Cloning, a labora
tory manual, 第2版, Sambrookら(編), Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, USAを参照のこと)によって、例えばゲル電気泳動、
ブロッティングおよびハイブリダイゼーション技術によって検出できる。
【０２２１】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状
態を診断するか、または診断を補助する方法が、別に提供され、この方法は下記
のステップを含む。 （ｉ）診断される被験体から、タンパク質を含有するサンプルを得るステップ。 （ｉｉ）前記サンプルから、本発明の第１の態様に係る多タンパク質複合体を単
離するステップ。 （ｉｉｉ）前記複合体の組成、および／または、前記複合体の１つ以上の成分の
活性を判定するステップ。
【０２２２】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を診断するか、または診断を補助する方法であっ
て、上記ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む方法が提供される。
【０２２３】 さらに本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
られる異常および状態を予後診断するか、または予後診断を補助する方法が提供
され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）予後診断の対象となる被験体から、核酸を含有するサンプルを得るステッ
プ。 （ｉｉ）表１に列挙された成分の群から選択される成分をコードする核酸、その
変異体対立遺伝子またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする第２の核
酸と、被験体からの前記核酸とを接触させるステップ。
【０２２４】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態を予後診断するか、または予後診断を補助する方
法であって、上記ステップ（ｉ）、（ｉｉ）を含む方法が提供される。
【０２２５】 さらに本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
られる異常および状態に対する患者の罹患性を判定する方法が提供され、この方
法は下記のステップを含む。 （ｉ）試験の対象となる患者から、核酸を含有するサンプルを得るステップ。 （ｉｉ）表１に列挙された成分の群から選択される成分をコードする核酸、その
変異体対立遺伝子またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする第２の核
酸と、被験体からの前記核酸とを接触させるステップ。
【０２２６】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態に対する患者の罹患性を判定する方法であって、
上記ステップ（ｉ）、（ｉｉ）を含む方法が提供される。
【０２２７】 当業者によれば、診断し、予後診断し、および罹患性を判定する上記方法は、
さらに下記のステップを含み得ることが理解されよう。
【０２２８】 表１および表２に列挙された群から選択される成分をコードする核酸、その変
異体対立遺伝子またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする少なくとも
１つのさらなる核酸と、被験体からの核酸とを接触させるステップ。但し、被験
体からの核酸にハイブリダイズする各核酸が、異なる成分をコードする。
【０２２９】 上述の場合、さらなるステップで用いられる被験体からの核酸は、必ずしも、
元来使用されたサンプルと同じサンプルから得られたものでなくてもよいが、同
じ被験体から採取されなくてはならないことがさらに理解されよう。
【０２３０】 従って、本発明の方法によれば、１つ以上の遺伝子における異常に起因する異
常を診断することができる。
【０２３１】 好ましい実施態様において、本発明の多タンパク質複合体もしくはサブ複合体
の成分をコードする核酸、その変異体対立遺伝子またはそれらの相補体に選択的
にハイブリダイズする１つ以上の核酸は、さらに、検出可能な部分を含む。適切
な検出可能部分は、放射性ヌクレオチド、蛍光標識、金粒子を含む。
【０２３２】 本発明の多タンパク質複合体もしくはサブ複合体の成分をコードする遺伝子も
しくはｃＤＮＡ、またはその変異体対立遺伝子、またはそれらの相補体に選択的
にハイブリダイズする１つ以上の核酸は、２本鎖または１本鎖であり得ることが
理解されよう。
【０２３３】 好ましくは、本発明の多タンパク質複合体もしくはサブ複合体の成分をコード
する核酸、その変異体対立遺伝子、またはそれらの相補体に選択的にハイブリダ
イズする１つ以上の核酸は、１０００未満の塩基対（当該核酸が２本鎖である場
合）または塩基（当該核酸が１本鎖である場合）、例えば、１００未満の塩基対
または塩基である。
【０２３４】 ハイブリダイゼーション研究で核酸を用いることは、当該分野で公知であり、
例えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloning, a laboratory manual, 第2版, C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照す
ればよい。
【０２３５】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状
態を診断するか、予後診断するか、または、それに対する被験体の罹患性を判定
する上記方法の好ましい実施態様において、方法は、さらに下記のステップを含
む。
【０２３６】 多タンパク質複合体の成分をコードする核酸の配列改変体の存在を、患者から
の核酸で同定し、１つ以上の試験母集団からの等価な核酸における配列に対して
この配列改変体を比較するステップ。
【０２３７】 例えば、上記比較は、次のように見出される等価な核酸における配列に対して
行えばよい。 （ｉ）中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常およ
び状態を被らず、かつ、以前に被らなかった個体の集団； （ｉｉ）精神分裂病、脳卒中または癲癇などを被らないか、または以前に被らな
かった患者の集団； （ｉｉｉ）精神分裂病、脳卒中または癲癇の家族病歴を呈する個体の集団；また
は （ｉｖ）患者の家族と同じ家族からの個体の集団（例えば双子）。
【０２３８】 このようなタイプの典型的な多遺伝子解析研究は、Human Molecular Genetics
(第2版), Strachan & Read(編), Bios Scientific Publishers Ltd, Oxford, UK
および Principles of Medical Genetics(第2版), Gelehrter, Collins & Gins
burg(編), Williams & Wilkins, USA に記載されている。
【０２３９】 本発明のもう一つの態様では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害
に関連付けられる異常および状態に対して診断し、予後診断し、および/または
被験体の罹患性を判定する方法が提供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）試験対象の被験体から、抗体を含有するサンプルを得るステップ。 （ｉｉ）前記サンプルが、本発明の多タンパク質複合体、サブ複合体、またはそ
れらの成分に反応するような抗体を含有しているか否かを判定するステップ。
【０２４０】 従って、本発明では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に
関連付けられる異常および状態に対して診断し、予後診断し、および/または被
験体の罹患性を判定する方法が提供され、この方法は下記のステップを含む。 （ｉ）試験対象の被験体から、抗体を含有するサンプルを得るステップ。 （ｉｉ）前記サンプルが、本発明のＮＭＤＡ受容体複合体、サブ複合体、または
それらの成分に反応するような抗体を含有しているか否かを判定するステップ。
【０２４１】 従って、本発明に係る多タンパク質複合体、サブ複合体、またはそれらの成分
に反応するような抗体の存在は、ＮＭＤＡ受容体に関連付けられる異常の指標と
なるであろう。 好ましくは、抗体のサンプルは、被験体からの血清のサンプルを含む。
【０２４２】 上記方法の好ましい実施態様において、本発明の多タンパク質複合体、サブ複
合体、またはそれらの成分は、プラスチックのディッシュ(dish)（例えば、９６
ウェルプレート）上に固定化され、次いで血清が添加される。固定化された複合
体、サブ複合体または成分に対する、血清中の抗体の結合は、標準的なＥＬＩＳ
Ａ法を用いることにより判定される（例えば、Reen, 1994, Methods Mol. Biol.
32:461〜466 を参照のこと）。
【０２４３】 本発明の更にもう一つの態様では、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能
障害に関連付けられる学習異常および状態に対して診断し、予後診断し、または
患者の罹患性を判定するのに有用なパーツ一式が提供される。従って、本発明で
は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体複合体の機能障害に関連付けられる学習
異常および状態に対して診断し、予後診断し、または患者の罹患性を判定するの
に有用なパーツ一式が提供される。
【０２４４】 簡便には、パーツ一式は、核酸間ハイブリダイゼーションを促進するための、
かつ、それにより形成されたハイブリッドを検出するための酵素および試薬とと
もに、表１に列挙された成分をコードする核酸に選択的にハイブリダイズする核
酸を含んでいる。
【０２４５】 好ましい実施態様において、パーツ一式は、さらに、表１および表２に列挙さ
れた群から選択される成分をコードするような１つ以上のさらなる核酸を含んで
おり、各核酸は異なる成分をコードする。このようなパーツ一式によれば、中枢
神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態と関
連付けられ得る複数の遺伝子多型を検出することができる。
【０２４６】 次に、以下の図および実施例を参照し、本発明をより詳細に説明する。
【０２４７】
【実施例】
実施例１：マウス脳からのＮＭＤＡ受容体を含有する多タンパク質複合体の単 離 ＜実験手順＞ 材料 本研究において使用された樹脂は、BioRad (Hemel Hempstead, UK)からのＡｆ
ｆｉｇｅｌ−１０樹脂、Pierce (Chester, UK)からのＰｈａｒｍａＬｉｎｋ樹脂
およびアビジンアガロース、Pharmacia (Little Chalfont, UK)からのＰｒｏｔ
ｅｉｎ Ｇ−Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅ、ならびに、Qiagen (Crawley, UK)からのＮ
ｉ-ＮＴＡアガロースであった。複数の抗原ペプチド（ＭＡＰ）ＭＡＰ-ＮＲ１ペ
プチドは、ＮＲ１（（Ｈ−ＲＲＡＩＥＲＥＥＧＱＬＱＬＣＳＲＨＲＥＳ）８-Ｍ
ＡＰ）アミノ酸部位９１９〜９３８、ＮＲ１直鎖状ペプチド（ＲＲＡＩＥＲＥＥ
ＧＱＬＱＬＣＳＲＨＲＥＳ）９１９〜９３８，ＮＲ２Ａ（ＥＨＬＦＹＷＫＬＲ）
８３７〜８４６，ＮＲ２Ａ、Ｂ、Ｃ、（ＳＲＧＩＹＳＣ）ＮＲ２Ａの８６４〜８
７０もしくはＮＲ２Ｂの９２５〜９３１、ＮＲ２Ｂ-Ｃ末端（ＫＬＳＳＩＥＳＤ
Ｖ）１４７４〜１４８２、ＮＲ２Ｂ-Ｃ末端（ＳＩＥＳＤＶ）１４７７〜１４８
２、およびＮＲ２Ｂ（ＫＡＧＮＬＹＤＩＳＥＤ）１２４７〜１２５７の最後の２
０個のアミノ酸からなった。ペプチドは全て、Research Genetics (Huntsville,
U.S.A.)からであった。
【０２４８】 ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、およびＮＲ２Ｂについての残余の部分は、それぞれ、アク
セス番号Ｐ３５４３８、Ｐ３５４３６、およびＱ０１０９７において使用される
番号付け系に従って番号付けされる。
【０２４９】 ウェスタンブロッティングについての使用される抗体は、J.H.Morrison博士 (
Mt. Sinai School of Medicine, New York, U.S.A.)からのマウスモノクローナ
ル５４．１抗ＮＲ１であり、抗ＰＳＤ−９５、抗ＮＲ２Ｂ、抗ｎＮＯＳ、抗ｅＮ
ＯＳは、全てTransduction Laboratories (Lexington, U.S.A.)からであり、抗
アクチンはRoche Molecular Biochemicals (Lewes, UK)からであり、ウサギポリ
クローナル抗ＮＲ２ＡはUpstate Biotechnology (Lake Placid, U.S.A.)からで
あり、抗ＣｈａｐＳｙｎはM. Watanabe博士(Hokkaido University School of Me
dicine, Sapporo, Japan)からの贈与であり、および抗ＳｙｎＧＡＰはR.L.Hugan
ir博士(John Hopkins School of Medicine, Boston, U.S.A.)からであった。
【０２５０】 ペルオキシダーゼ結合２次抗体はAmersham(Little Chalfont, UK)からであっ
た。Ｌ-アスパラギン、Ｌ-グルタミン、およびＤ−ＡＰ５は、Fluka (Gillingha
m, UK)からであり、ならびにアルカイン、イフェンプロジル、ＮＭＤＡ、デキス
トロメトファン、グリシン、（＋）−ＨＡ９６６（３-アミノ-1-ヒドロキシ-２-
ピロリドン）、およびコナントキンＧは全て、Sigma(Poole, UK)からであった。
酵素結合ビオチンヒドラジドはPierce (Chester, UK)からであった。他の化学薬
品は全て、入手できる最高の等級のものとした。
【０２５１】 抗体産生および精製 ＮＲ１サブユニットについて特異的な抗体は、ＭＡＰ-ＮＲ１ポリクローナル
ＩｇＧを生じるヒツジへのＭＡＰ-ＮＲ１ペプチドの注入によって(Scottish Ant
ibody Production Unit, Carluke, UK)、または、抗体３５６を作製するために
ウサギへの注射によって（内部で産生された）で産生された。ＰＳＤ-９５に対
する抗体１３８は、より以前に記載された(Migaud, M.ら、1998, Nature, 396, 4
33〜9)ようにウサギから得られた。ＭＡＰ-ＮＲ１抗体は、上述で概説されるよ
うなアミノ酸配列を伴う、直鎖状ＮＲ１がＮ末端に結合されるペプチドを含有す
る樹脂を使用するペプチド親和性クロマトグラフィーによって血清から精製され
、そして抗ＮＲ１ ３５６および抗ＰＳＤ-９５ ＩｇＧ１３８は、Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｇ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ洗浄工程によって富化された。
【０２５２】 ＭＡＰ-ＮＲ１ ＩｇＧのビオチン化 ２０ｍｇの親和精製されたＭＡＰ-ＮＲ１ ＩｇＧを、ＰＢＳ中に写し、そし
てＰＢＳ中の２０ｍＭ 冷却メタ-過ヨウ素酸ナトリウムとともに混合した。暗
所下、氷上で３０分間温置した後にグリセロール（２３μｌ）を添加した。サン
プルを、氷上でのさらなる５分間の温置後にＰＢＳ中に移し、そしてＥＺ結合ビ
オチンヒドラジドを、５ｍＭの最終濃度に添加し、続いて室温で２時間温置した
。ビオチン化材料は次いで、ＰＢＳ中で透析され、濃縮され、そして-２０℃に
て保存された。
【０２５３】 リガンド親和性樹脂の合成 アルカイン（８ｍｇ）、Ｌ-アスパラギン（１ｍｇ）、Ｌ-グルタミン（２ｍｇ
）、ＮＭＤＡ（２ｍｇ）、Ｄ-ＡＰ５（２ｍｇ）、グリシン（２ｍｇ）、および
（+）-ＨＡ９６６（１ｍｇ）を溶解し、そしてメタノール中で室温にて２４時間
、０．５ｍｌ ａｆｆｉｇｅｌ-１０に結合し、続いて１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．８を添加し、そしてさらに室温で２４時間温置して、任意の残余の活性
側鎖をブロックした。コナントキンＧ（０．１ｍｇ）を同一の条件であるが、メ
タノールをＰＢＳで置き換えて、同じ樹脂に結合した。イフェンプロジル（５ｍ
ｇ）、Ｄ-ＡＰ５（２ｍｇ）、デキストロメトロファン（１０ｍｇ）、および（+
）-ＨＡ９６６（２ｍｇ）を、製造業者の指示に従って０．５ｍｌ Ｐｈａｒｍ
ａＬｉｎｋ樹脂上に固定化した。
【０２５４】 免疫親和性樹脂の合成 精製された３５６、１３８、およびＭＡＰ-ＮＲ１抗体を透析によってＰＢＳ
中に移し、そして２日間、４℃にて、連続的な混合を伴って、１ｍｌの樹脂当た
り２ｍｇ（３５６および１３８）または５ｍｇ（ＭＡＰ-ＮＲ１）ＩｇＧの濃度
にてＰＢＳ中のａｆｆｉｇｅｌ-１０に結合した。未反応の側鎖は、４℃にて一
晩、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５とともに樹脂を温置することによってブロ
ックされた。
【０２５５】 ペプチド樹脂の合成 ペプチドを可溶化し、そして３日間、４℃にて、連続的な振盪を伴って、５ｍ
ｇ/ｍｌ樹脂にてメタノール中のａｆｆｉｇｅｌ-１０に結合し、および残りの活
性な側鎖を、１日間、４℃にて０．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８でブロックし、
続いてＰＢＳに樹脂を移した。
【０２５６】 タンパク質抽出 全野生型マウス前脳を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０、１％ デオキシコ
ール酸ナトリウム、５０ｍＭ フッ化ナトリウム、２０μＭ 塩化亜鉛、１ｍＭ
オルトバナジン酸ナトリウム、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ/ｍｌ アプロチ
ニン、および２μｇ／ｍｌ ロイペプチンからなる１％デオキシコール酸緩衝液
（ＤＯＣ緩衝液）、または５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ オルト-
バナジン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｎｔ Ｐ−
４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリ
ウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌ アプロチニン
、および２μｇ／ｍｌ ロイペプチンからなるＳＤＳ含有緩衝液（ＳＤＳ緩衝液
）のいずれか中で、７ｍｌ冷却緩衝液当たり０．３８ｇ湿潤重量で氷上において
ホモジナイズした。抽出物を、４℃にて３０分間の１３．０００×ｇでの遠心分
離による氷上で１時間の温置後に清澄化し、続いて小規模の調製物について５μ
ｍ濾過工程を、または大規模抽出物について４℃で３０分間の５０．００００×
ｇでの遠心分離を行った。
【０２５７】 免疫沈降 小規模の実験を、０．２ｍｌ抽出物と、当量の同じ抽出物緩衝液とを混合し、
そして図において概説されるように抗体を添加することによって行った。２０μ
ｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、２時間４℃での温置後に添加
し、続いてさらに２時間〜一晩、４℃にて、一定の振盪を伴って温置した。次い
で、樹脂を４サイクルの各０．５ｍｌ抽出緩衝液で洗浄し、そしてＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥ分析に供した。大規模実験を、５０ｍｌマウス脳ＤＯＣ抽出物を、２時間４
℃にて、一定の振盪を伴って０．５ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ-Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅで予め洗浄することによって行った。次いで樹脂を除去し、そして０．５ｍ
ｇの親和精製されたＭＡＰ−ＮＲ１ ＩｇＧを上清に添加した。０．５ｍｌ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｇ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、４時間４℃での、一定の振盪をとも
なった温置後に添加し、続いて、一晩、４℃にて、一定の振盪を伴ってさらに温
置した。次いで樹脂をクロマトグラフィーカラムに移し、そして１００ｍｌ Ｄ
ＯＣ緩衝液でベースラインに洗浄した。タンパク質を、０．７５ｍｌ ４％ＳＤ
Ｓ-ゲルサンプル緩衝液中で３０分間煮沸することによって樹脂から分離し、そ
して２０μｌアリコートをゲル分析およびウェスタンブロッティングのために使
用した。
【０２５８】 免疫親和性クロマトグラフィー 大規模実験を、５０ｍｌ 脳ＤＯＣ抽出物および０．５ｍｌのａｆｆｉｇｅｌ
−１０に固定化された抗ＮＲ１ ３５６ ＩｇＧ、ＭＡＰ−ＮＲ１ ＩｇＧ、ま
たは抗ＰＳＤ−９５ １３８抗体を使用して行った。未結合の材料を、一定の振
盪を伴った４℃での一晩の温置後に、安定なベースラインが得られるまで、約１
００ｍｌ ＤＯＣ緩衝液を使用するカラムクロマトグラフィーによって除去した
。次いで、樹脂を０．７５ｍｌの４％ ＳＤＳ-ゲルサンプル緩衝液中で３０分
間煮沸し、そして上清の２０μｌのアリコートをＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびウェス
タンブロッティング分析のために使用した。あるいは、タンパク質を６Ｍ 尿素
または５０％ ＤＯＣ緩衝液を用いるｐＨ１２へのｐＨ移行で、樹脂から溶出し
た。
【０２５９】 リガンド親和性クロマトグラフィー 上記のように、２５μｌの誘導体化されたリガンド親和性樹脂を、０．２ｍｌ
マウス脳ＤＯＣ抽出物に添加し、そして一定の振盪を伴って、４℃にて２時間温
置した。次いで樹脂を、各０．５ｍｌ ＤＯＣ緩衝液で５回洗浄し、そして２５
μｌのＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析およびウェスタンブロッティングを行った。
【０２６０】 ペプチド親和性クロマトグラフィー 最初の小規模実験を、０．５ｍｌ脳ＤＯＣ抽出物および２５μｌ ａｆｆｉｇ
ｅｌ−１０固定化ペプチドを使用して行った。樹脂を、一定の振盪を伴って４℃
にて４時間の温置期間後、０．５ｍｌの冷却ＤＯＣ緩衝液で４回洗浄し、続いて
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。大規模のサンプルを、５０ｍｌ ＤＯＣ抽出物に０
．５ｍｌ ＮＲ2Ｂ １４７７〜１４８２ペプチド誘導体化ａｆｆｉｇｅｌ−１
０を添加し、続いて一定の振盪を伴って４℃で一晩温置することによって調製し
た。次いで樹脂をクロマトグラフィーカラムに移し、そして約１００ｍｌの冷却
ＤＯＣ緩衝液でベースラインに洗浄した。結合されたタンパク質を、４％ ＳＤ
Ｓ含有緩衝液中で３０分間煮沸することによって樹脂から放出し、そして２０μ
ｌのアリコートを続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェスタンブロッティン
グのために使用した（実施例２を参照のこと）。
【０２６１】 ウェスタンブロッティング タンパク質サンプルを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして１０％（ｖ/ｖ
）メタノール、１０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１．０中７５Ｖにて、４℃にて９０
分間、ＰＶＤＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ）にトランスファーした。１次抗体の
希釈は、１：１００と１：１０００との間であり、ＩｇＧの質に依存した。シグ
ナルの検出は、ペルオキシダーゼ結合二次ＩｇＧ、および増強された化学発光を
使用して行った。
【０２６２】 ＜結果＞ 可溶化 シナプス後肥厚の部分としてのＮＭＤＡ受容体はその抽出困難性が周知であり
、これは必須条件として高量の洗浄剤を包含しなくてはならない。最初の研究は
、図１において示されるように２つの緩衝液系におけるＮＭＤＡ受容体および付
着される分子の挙動を判定するために行われた。ＤＯＣまたはＳＤＳ緩衝液を使
用するマウス脳の抽出は、ＳＤＳを含有する緩衝液を使用する抽出物においてわ
ずかにより高い量のＮＲ１免疫反応性を生じ、これはまた免疫沈降された材料に
おいて明らかである。しかし、全抽出物において類似であったＮＲ２ＡおよびＰ
ＳＤ−９５の量にもかかわらず（結果は示さず）、ＤＯＣ抽出物に比較してＳＤ
Ｓ緩衝液ベースのアプローチにおいて、このＮＲ１−沈降される材料に付着され
るＮＲ２ＡおよびＰＳＤ−９５の明らかな減少があった。単一の洗浄剤として１
．５％（ｗ/ｖ）ＣＨＡＰＳに基づく代替の方法は、ラット脳シナプトソームか
らＮＭＤＡ親和性を有するグルタミン酸受容体が可溶化されたことが報告された
が(Kumarら, 1991, Nature 354, 70〜73)、ＮＭＤＡ受容体を含有する多タンパ
ク質複合体の定量的な抽出を生じなかった（結果は示さず）。開始材料としてマ
ウス脳の膜調製物が異なるＮＲ１親和性パターンを生じるか否かがまた試験され
、およびこれらは全脳抽出物を使用して得られるのと非常に類似の結果を生じた
（データは示さず）。
【０２６３】 免疫沈降 多タンパク質複合体の首尾よい単離は全て、チャネルの種々のエピトープに対
する特異的な抗体の使用を包含したが、これらの研究は、低いレベルのタンパク
質量に対して行われ、およびウェスタンブロッティングのみによって分析された
。それゆえ、本発明者らは、このように抽出された材料の複雑性の指標を与え得
るゲル染色によって分析のために単離された材料を付加することを試みた。この
アプローチのために選択されたＩｇＧは、図２において示されるようにＮＲ１の
Ｃ末端に対して（抗体３５６およびＭＡＰ−ＮＲ１）およびＰＳＤ−９５（１３
８）に対して試行された。全てのＩｇＧは、ウェスタンブロッティングによって
可視化されるようにＮＭＤＡ受容体およびＰＳＤ−９５を結合および単離し得た
が、ゲル解析は精製された材料のレベルが低すぎたことを示した。図２における
ゲルは、抗体３５６を使用することによって、ＩｇＧ重鎖以外はなんらハンドは
可視できないが、ＭＡＰ−ＮＲ１抗体は９０および１４０ｋＤａにていくつかの
散在性のバンド、ならびに４２ｋＤａの領域においていくらかより強いバンドを
示した。約９０〜１００ｋＤａでの２つのバンドは、抗ＰＳＤ−９５ ＩｇＧ１
３８を使用して明らかに可視でき、そのうちの１つはおそらくＰＳＤ−９５であ
る、同じレーンはまた、ＩｇＧ重鎖と２００ｋＤａとの間にいくらかのより弱い
バンドを示し、これはＮＭＤＡ受容体および付随される分子で非常にあり得る。
【０２６４】 ウェスタンブロッティング結果に基づいて、最も見込みのあるＩｇＧはＭＡＰ
−ＮＲ１であり、それゆえこれは精製され、および図３、パネルＡにおいて示さ
れるように力価試験のために使用された。小規模免疫沈降が、ＭＡＰ−ＮＲ１
ＩｇＧの不在下（０μｇ）および存在下（０．１〜３０μｇ）で行われた。これ
により、本研究者らは、混入物と、単離された多タンパク質複合体とを区別する
ことができた。なぜなら、後者はより高量のＭＡＰ−ＮＲ１が使用された際にバ
ンド強度を増加したからである。さらに、後のスケールアップ調製物についての
抽出物対抗体の至適な比率を見出すことが重要であった。コントロールレーンは
、ＩｇＧ調製物または樹脂に由来する任意のバンドを可視化するために添加され
る抽出物を伴わないＩｇＧ単独の実験を示す。３０μｇ ＩｇＧを伴うレーンを
、１μｇ未満の抗体を使用するレーンと比較することは、多くのタンパク質バン
ドが富化され、ゲルの底部にて４５ｋＤａ〜２００ｋＤａにわたることを示した
。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅについての親和性を有する開始材料
に存在する抗体および他の分子がバックグラウンドバンドを生じる（レーン０μ
ｇ ＭＡＰ−ＮＲ１ ＩｇＧ）ことはアクリルアミドゲル分析において明らかに
可視でき、これは特異的な多タンパク質複合体成分と非特異的なタンパク質との
間の区別を困難にし得る。それゆえ、改変されたＩｇＧを使用する別のアプロー
チが、図３Ｂにおいて示されるように試みられた。ＭＡＰ−ＮＲ１ ＩｇＧをビ
オチン化し、そして多タンパク質複合体をアビジン-アガロースで単離した。再
度、いくつかの非特異的バンド、すなわち約７５ｋＤａでの二重バンドおよび１
２０ｋＤａでの強力なバンドが全てのレーンにおいて観察され得た。コントロー
ルレーンは、これらの分子のいずれも、ＩｇＧ調製物に存在せず、およびアビジ
ン-アガロースからもなかったことを示す。しかし、ビオチン化されたＭＡＰ−
ＮＲ１は、未改変のＩｇＧに比較して非常に少ない複合体タンパク質プールを結
合したことは明白である。この段階で、これがＮＭＤＡ受容体の亜集団の単離に
起因するのか、またはビオチン化様立体阻害に基づく立体束縛の導入に起因する
のかは明らかではない。後者は、ビオチンタグがグリコシル化されたＦｃ領域に
付着されたので問題でないべきであり、これはＰｒｏｔｅｉｎ-Ｇ結合ＭＡＰ-Ｎ
Ｒ１のような類似の遊離分子の移動を許容するべきである。しかし、ＩｇＧ重鎖
の全体の量は、未改変のＩｇＧに比較して、ビオチン標識されたＭＡＰ−ＮＲ１
について減少されることがクマシー染色ゲルにおいて明らかに可視できる。材料
のいくつかは煮沸工程後であってもアビジンアガロースから放出されず、および
おそらくいくつかの多タンパク質複合体成分はまた放出されなかったことは排除
され得ない。
【０２６５】 免疫親和性 次の段階として、上記の抗体を、固体支持体にこれらを直接的に固定化するこ
とによって使用すること、および図４において示されるように、サンプルのｐＨ
９．０〜ｐＨ１２へのｐＨ移行によるか、または６Ｍ 尿素を使用する変性化条
件下のいずれかで、単離された材料を溶出することを試みることが可能である。
抗ＮＲ１ ａｆｆｉｇｅｌからの尿素による結合化タンパク質の溶出は（３５６
−尿素）、非常に複雑な複合体タンパク質バンドパターンを示し、これはウェス
タンブロッティングによって分析され、ＮＲ１およびＮＲ２Ａの両方およびＰＳ
Ｄ−９５の存在を実証する。類似の結果が、結合化抗ＰＳＤ−９５ ＩｇＧ（１
３８-尿素）を使用して得られるが、ここではＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドパターン
はほとんど明白ではなかった。驚くべくことではないが、より高量のＰＳＤ−９
５が、３５６-樹脂に比較してこの調製物に存在したが、ＮＲ２Ａの量は僅かに
減少された。１３８−尿素サンプルにおいて約９０ｋＤａで可視できるバンドは
ＰＳＤ−９５である可能性がある。さらに、ＩｇＧのかなりの量がまた、樹脂か
ら放出され、これは５０ｋＤａでの主要なバンドによって見られ得ることがゲル
から明白である。この抗体の破断は、ｐＨ１２溶出によって減少されるが、ゲル
におけるタンパク質バンドパターンはまた、３５６-ａｆｆｉｇｅｌについて変
化されるが、１３８-樹脂について僅かに損なった。ウェスタンブロッティング
シグナルはまた、ほとんど同一であったが、抗ＰＳＤ-ａｆｆｉｇｅｌについて
僅かに減少された。ｐＨ１２によって溶出された３５６-樹脂はＰＳＤ−９５に
関して完全に変化され、これはこのタンパク質サンプルに不在であった。しかし
、ＮＲ１およびＮＲ２Ｂの両方はこの様式において溶出され得た。
【０２６６】 リガンド親和性 リガンド親和性ベースの方法が元来、クローニングストラテジーの前にＮＭＤ
Ａ受容体を単離するために使用され、クローニングストラテジーは単離されたタ
ンパク質がグルタミン酸受容体の異なるクラスに属したことを示したが、ＮＭＤ
Ａ受容体(E. K. Michaelis, 1994: Cirrhosis, Hyperammonemia and Hepatic En
cephalopathy, S. GrisoliaおよびV. Felipo(編), Plenum Press, New York, 11
9〜128)と、薬物について類似の親和性を示した。しかし、その時のサブユニッ
ト特異的抗体の欠損に起因して、ＮＭＤＡ受容体がそれらの調製物中で同時精製
された場合は実験されなかった。本発明者らは、図５において示されるようにチ
ャネルの異なる公知の相互作用部位で指向される種々の固定化リガンドを使用し
て、ＮＭＤＡ受容体および付着される分子を単離することが可能か否かを調査し
た。
【０２６７】 ＮＭＤＡ受容体のポリアミン部位と相互作用することが知られる、この研究に
おいて試験された薬物は、アルカイン、イフェンプロジル、およびペプチドコナ
ントキンＧであった。ＮＲ１、ＮＲ２Ｂ、およびＰＳＤ−９５を含む、実質的な
量のタンパク質が、固定化されたアルカインと相互作用し、ならびにゲル上で可
視できる最も強力なバンドは、３５、４０、および５０ｋＤａの大きさであり、
これは全て現在のところ知られていない。ＰｈａｒｍａＬｉｎｋに結合されたイ
フェンプロジルはまた、多タンパク質複合体および多くの他の分子を結合し得た
が、アルカイン樹脂よりも僅かに低い程度にであった。これはまた、これらの２
つの実験のウェスタンブロッティング結果のシグナル強度において反映される。
しかし、コナントキンＧ樹脂は、ゲル上で可視できるバンドを全く生じず、およ
びウェスタン分析は、微量のＮＲ１およびＮＲ２Ｂをのみを示し、およびＰＳＤ
−９５を示さなかった。
【０２６８】 本発明者らはまた、グルタミン結合部位に対して検出されるリガンドが多タン
パク質複合体の単離のために使用され得たか否かを試験した。Ｌ-グルタミンお
よびＮＭＤＡ樹脂は、４０および５０ｋＤａでの２つのみの分子に対する弱い結
合を示し、およびウェスタンブロッティング結果は、多タンパク質複合体の最小
限の量のみがこれらの樹脂に保持されたことを示した。Ｌ-アスパラギン ａｆ
ｆｉｇｅｌ−１０支持体、およびＰｈａｒｍａＬｉｎｋ結合Ｄ−ＡＰ５は両方と
もにタンパク質種の配列に結合し、再度、４０および５０ｋＤａでの主要なバン
ドを伴った。ＮＲ１およびＰＳＤ−９５のウェスタンブロット分析はシグナル強
度において非常に類似したが、ＮＲ２Ｂシグナルは、Ｄ−ＡＰ５についての僅か
なシグナルに比較して、Ｌ-アスパラギンで単離されたサンプルについて非常に
強力であった。ａｆｆｉｇｅｌ−１０に結合された薬物Ｄ−ＡＰ５は、任意のタ
ンパク質の単離において無効であった。
【０２６９】 オープンチャネルブロッカーのデキストロメトルファンは、クマシー染色ゲル
において見られるようにいくつかのタンパク質を結合するにおいて効果的であっ
た。このサンプルのウェスタンブロッティングは、ＮＲ１およびＮＲ２Ｂの両方
の僅かな量のみが存在したが、驚くべきことにＰＳＤ−９５の比較的大きな量が
存在したことを示した。
【０２７０】 グリシンは正確なＮＭＤＡ受容体チャネル機能について必要である必須アミノ
酸である。しかし、固定化グリシンは５０ｋＤａタンパク質のみに非常に弱く結
合し、およびウェスタン分析においてプローブされた３つの分子は全て不在であ
った。これは、ＰｈａｒｍａＬｉｎｋまたはａｆｆｉｇｅｌ−１０樹脂のいずれ
かに結合されたグリシン部位調節因子ＨＡ−９６６と対照的であった。両方の例
において結果は同一であり、両方ともＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて僅かにより複雑
なパターンを示し、およびＮＭＤＡ受容体チャネル成分および付着されるＰＳＤ
−９５についてポジティブであることが見出された。ＮＲ１が他のリガンドベー
スの方法に比較して特異的に富化されたことに注意することは注目に値する。
【０２７１】 ＮＭＤＡ受容体機能は、Ｚｎ２＋によって調節されることが知られ、および公
知の多タンパク質複合体成分の配列解析はヒスチジン反復の存在を示した。それ
ゆえ、本発明者らは、本発明者らがキレート化Ｎｉ２＋を使用することによって
チャネルを保持し得るか否かを調査した（レーンＮｉ-ＮＴＡ）。クマシー染色
されたゲルは、本質的に４０および５０ｋＤａにて２つのバンドのみを示したが
、驚くべきことにウェスタンブロット分析は、ＮＲ１、ＮＲ２Ｂ、およびＰＳＤ
−９５の存在を示し、完全なＮＭＤＡ受容体チャネルの存在について議論する。
【０２７２】 しかし、これらのリガンドベースの精製法から、大部分の樹脂において保持さ
れた主なタンパク質は、４０および５０ｋＤａタンパク質種であったことが明白
であり、この両方とも現在のところ知られていない。これらのタンパク質がまた
ＮＭＤＡ受容体を結合および調節する薬物に対して親和性を保有することが知ら
れるので(Kumar, K. N., Tilakaratne, N., Johnson, P. S., Allen, A. E. & M
ichaelis E. K., 1991, Nature 354, 70〜73; Ikin, A. F., Kloog, Y. & Sokol
ovsky, M., 1990, Biochemistry 29, 2290〜2295)、これらのタンパク質は同定
されたおよび特徴づけされたグルタミン酸受容体の成分である可能性がある。
【０２７３】 ペプチド親和性 抗体ベースの単離ストラテジーは、最終サンプル中に通常高量の添加されたＩ
ｇＧを含有する不利益を有し、これは多く方法において分析を妨害し得る。それ
ゆえ、本発明者らは多タンパク質複合体またはそのサブ成分を単離および富化す
るための他の方法について探索した。１つの方法は、ＮＲ２−ＰＳＤ−９５相互
作用の場合におけるようなＣ末端配列に結合し得るＰＤＺ−ドメインのようなタ
ンパク質の部分またはドメインを使用するか、または標的ドメインに結合し得る
かもしくは基質として使用され得るペプチドを使用した。図６は、ＮＭＤＡ受容
体チャネルサブユニットのいくつかのペプチドが、結合対についての基質として
作用する能力を示す。本発明者らは、本発明者らがＭＡＰ−ＮＲ１ ＩｇＧを作
製および精製するために以前に使用したＮＲ１ Ｃ末端ペプチドを選択した。な
ぜならこの領域がまた、ＩｇＧベースの多タンパク質複合体精製プロトコルにお
いて妨害し得る他の分子の結合部位について使用されるか否かが明らかでなかっ
たからである。他のペプチドＮＲ２Ａ（８３７〜８４６）、ＮＲ２Ａ、Ｂ、Ｃ、
およびＮＲ2Ｂ（１２４７〜１２５７）が、チロシンキナーゼについてのつなぎ
合わせ点として作用し得るチロシン残基に起因して選択された。ＮＲ２Ｂ Ｃ末
端ペプチドＮＲ２Ｂ（１４７４〜１４８２）および（１４７７〜１４８２）は、
ＰＳＤ−９５のようなタンパク質を含有するＰＤＺ−ドメインについての公知の
結合配列を含む。全てのペプチド樹脂は４５および５５ｋＤａのタンパク質＋い
くつかのさらなる６０ｋＤａを超える少数のバンドとの相互作用を示した。この
パターンは、Ｔｒｉｓブロックされたａｆｆｉｇｅｌ−１０を使用して観察され
ず、これは、これらの分子が、ペプチド樹脂と、選択されたペプチドに起因して
特異的に、またはＴｒｉｓブロックされたａｆｆｉｇｅｌによって得られない樹
脂の荷電関係に起因して非特異的な方法においてのいずれかで、相互作用するこ
とを意味する。ＮＲ２Ｂ（１４７７〜１４８２）ペプチド-ａｆｆｉｇｅｌ（こ
れは７５および１００ｋＤａでいくつかのバンドを示した）以外のいづれのペプ
チド樹脂も、任意の特定の富化を示さなかった。驚くべきことに、固定化された
ＮＲ２Ｂ Ｃ末端ペプチドＮＲ２Ｂ（１４７４〜１４８２）は、僅かにより短い
ペプチド（ＮＲ２Ｂ １４７７〜１４８２）に類似する任意の結合パターンを示
さなかったが、理由は未だ知られていない。この富化された１００ｋＤａバンド
は、シナプス関連性タンパク質（ＳＡＰ）分子のＰＳＤ−９５、ＣｈａｐＳｙｎ
１１０、ＳＡＰ９７、およびＳＡＰ１０２（これらの全てはＮＲ２のＣ末端に結
合することが十分に記載され、およびこれらの全ては非常に類似の分子量を有し
、それゆえＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で非常に密接してともに移動する）の結合につい
て考慮され得る。しかし、７５ｋＤａで観察されるバンドは、この段階で任意の
タンパク質に割り当てられ得ず、およびこれは同定されていないままである。そ
れにもかかわらず、本発明者らは、ＮＭＤＡ受容体チャネルおよび他の生体分子
を含有するより大きな網の部分であり得るタンパク質を、固体支持体上に固定化
されるＮＲ２Ｂ Ｃ末端ペプチドを使用して単離する別の方法を同定し得た。
【０２７４】 ３つの単離法の比較分析 図７は、マウス脳抽出物のＭＡＰ−ＮＲ１抗体を使用する免疫沈降、ａｆｆｉ
ｇｅｌ−１０に固定化されたＭＡＰ−ＮＲ１ ＩｇＧでの免疫親和性クロマトグ
ラフィー、およびＮＲ２Ｂ（１４７７〜１８２）ペプチド親和性クロマトグラフ
ィーによる多タンパク質複合体の大規模単離を示し、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびウェスタンブロッティングの両方によって分析された。両方のＩｇＧ
アプローチは、染色されたゲルにおいて莫大な量のＩｇＧ重鎖（５０ｋＤａ）お
よび軽鎖（２５ｋＤａ）を示し、これはそれらの領域におけるタンパク質移行の
解釈を妨げる。これは、ペプチドベースのストラテジーにおける５５ｋＤａでの
結合の不在によって実証され、これは存在しないか、または他の２つの方法にお
いて抗体の重鎖によって不明瞭であるかのいずれかである。さらに、固定化され
たＩｇＧマトリクスはまた、８０ｋＤａで強力なバンドを示し、これは免疫沈降
されたサンプルにおいて僅かにより弱く、およびペプチドベースの方法において
さらに弱かった。このバンド、またはこの画分は、両方の抗体ベースのストラテ
ジーにおいてウェスタンブロット分析によって免疫グロブリン、ＩｇＨ、または
架橋されたＩｇＧとして割り当てられ得たが、ペプチド樹脂についての場合にお
いて割り当てられ得なかった。
【０２７５】 選択された分子がこれらの３つのサンプルに存在するか否かを同定するために
、本発明者らは、図７の下節において示され、および実施例２において詳細に記
載されるようなウェスタンブロッティングを使用して、それらの分析を進めた。
【０２７６】 ＜考察＞ ＮＭＤＡの単離は、免疫沈降法を使用して過去に達成されたが、さらなる特徴
づけおよび詳細な分析を妨げる低いレベルにおいてのみであった。イオン交換ク
ロマトグラフィーのような標準的な精製アプローチは、これは多タンパク質複合
体の定量的な可溶化についての絶対必要要件である１％デオキシコール酸のよう
な荷電された洗浄剤の取り込みに起因して実現可能性がない。ＳＤＳによるデオ
キシコール酸の部分的な置き換えは、より高い可溶化の程度を達成するが、ＮＭ
ＤＡ受容体結合対の付着を部分的に破壊し、およびＮＲ１／ＮＲ２複合体につい
ての異なる可溶化パターンを少なくともある程度生じる。主な洗浄剤としての１
％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の代替の選択は、クロマトグラフィー手段につい
て適切であったが、この方法がＮＲ２を含有する受容体を可溶化しないことが報
告された(Chazot, P. L. & Stephenson, F. A., 1997, J. Neurochem. 68, 507
〜516)。これはまた、単離された成分が、ＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０を含有する緩衝液中で凝集する傾向があり、それゆえ多タンパク質複合体の部
分の抗体認識または沈降についていずれのエピトープも接近可能ではなく、全多
タンパク質複合体プールの偶然に枯渇されたサブ画分が生じたという可能性があ
る。これは実際に、カラムからの溶出によって単離された材料の可溶性を分析す
ることによって支持される。明らかに、少なくともＰＳＤ−９５は、ｐＨ移行に
基づく興味深い挙動を示し、ここではこの分子集団の部分が、ｐＨ１２にて樹脂
上に保持される。亜集団がこのような疎水性シフトを受けることは知られていな
いが、これはＮＭＤＡ受容体の存在が重要な要素でなければならないことを結論
づけ得る。しかし、本研究における全ての実験が４℃で行われたので、上昇され
た温度に基づいて洗浄剤の選択がどのように多タンパク質複合体の抽出可能性お
よび可溶性を影響し得るのかは知られていない。
【０２７７】 固定化された薬物またはアミノ酸のようなリガンド親和性ベースの方法は、Ｎ
ＭＤＡ様受容体を含むグルタミン酸結合タンパク質の単離について過去に使用さ
れ(Kumar, K. N., Tilakaratne, N., Johonson, P. S., Allen, A. E. & Michae
lis E. K., 1991, Nature 354, 71〜73)、また本研究において、多タンパク質複
合体を結合し得ることが示され得た。驚くべきことに、固定化グルタミン酸のよ
うな、他の研究者らによって過去に使用された樹脂は、多タンパク質複合体につ
いて低い親和性を示した。残念なことに、Ａｒｃａｉｎｅ-ａｆｆｉｇｅｌおよ
びＨＡ−９６６ ＰｈａｒｍａＬｉｎｋまたはＨＡ−９６６ ａｆｆｉｇｅｌの
ような単離目的のために適切な確実な薬物-基質のほとんどは、他のイオンチャ
ネル型のグルタミン酸受容体および他のタンパク質に結合することが予測され得
る。なぜならこれらの薬物はＮＭＤＡチャネルについてより高い親和性を有する
が、ＫａｉｎａｔｅおよびＡＭＰＡ受容体のようなチャネルをまた結合および調
節し得るからである。
【０２７８】 本発明者らは、ペプチドが多タンパク質複合体の単離に使用され得るか否かを
調査した。ＮＲ１ Ｃ末端ペプチドは、明白な結合パターンを示さず、それゆえ
、この部位が、他のタンパク質についての結合ドメインとして使用されず、およ
びＭＡＰ−ＮＲ１ ＩｇＧ法による多タンパク質複合体の単離はＮＲ１が付着さ
れる分子を混乱しないことが推定され得る。ＮＲ２Ａ、Ｂ、およびＣの内部配列
からの他のペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて任意の観察可能な富化
されたタンパク質パターンを生じなかった。これはまた、おそらく、低い豊富さ
において存在する分子のみがこれらのペプチドに対して親和性を示し、それゆえ
可視化され得なかったことを説明し得た。しかし、ＮＲ２Ｂ（１４７７〜１４８
２）ペプチド樹脂が、ＰＳＤ−９５およびこのファミリーの他のメンバーのみで
なく、ＮＭＤＡ受容体自身もまた精製し得たことはいくらか驚きである。これは
、シナプス後肥厚内で受容体によって実際に使用されるよりも利用可能なより多
くのＮＲ２付着点が存在すること、およびＳＡＰ分子間で結合が存在するかもし
れないことを説明し得た。この見解は、ＰＳＤ−９５およびＣｈａｐＳｙｎ１１
０を含むを含有するＳＡＰタンパク質が、Ｎ末端ジスルフィド架橋を介して互い
に多重化され得るという知見によって支持される。本発明者らが驚いたことに、
本発明者らは、首尾よいＮＲ２Ｂ（１４７７〜１４８２）ペプチドの３アミノ酸
が伸長されたバージョンを使用して脳タンパク質の任意の富化を検出し得なかっ
た。これは、より長いペプチドが、ＰＤＺドメインに結合し得ない配座を適合し
、および接近可能になるための修飾工程を受けなくてはならないことを示し得た
。このような修飾は、配列内の２つのセリン残基のうちの１つにおけるリン酸化
であり得た。現在、ＰＤＺドメインタンパク質に接近可能になるために、インビ
ボでＮＲ２Ｂがこの領域においてリン酸化されるか否かは知られていない。
【０２７９】 本研究において示される免疫沈降、免疫親和性、およびペプチド親和性ストラ
テジーの最も首尾よい方法の比較分析は、多タンパク質複合体が多数のタンパク
質から構成されることを示した。全ての３つの方法は、ウェスタンブロッティン
グによって類似の結果を与えたことは顕著であるが、ゲルバンドパターンは異な
り、主に、２つのストラテジーが、ゲル分析およびバンド認識を妨げるＩｇＧを
含んだからである。Ｐｒｏｔｅｉｎ-Ｇベースの免疫沈降を使用する代替は、ビ
オチン化抗体およびアビジンアガロース沈降を使用して、本研究において実証さ
れ得た。
【０２８０】 実施例２：多タンパク質複合体の特徴づけ ＜材料および方法＞ 抗体 親和精製されたＮＲ１特異的ヒツジポリクローナル抗体（ＭＡＰ−ＮＲ１）を
、ＮＲ１の最後の２０アミノ酸の多抗原ペプチド（ＭＡＰ）（（Ｈ-ＲＲＡＩＥ
ＲＥＥＧＱＬＱＬＣＳＲＨＲＥＳ）８-ＭＡＰ）(Scottish Antibody Production
Unit, Carluke, UK)を使用して作製した。他の抗体は表３において記載される
供給源から得られた。
【０２８１】 ＮＭＤＡ受容体複合体の精製 受容体複合体を、共有結合的に結合されたＭＡＰ−ＮＲ１免疫親和性樹脂、同
じ抗体での免疫沈降、またはＮＭＤＡ−Ｒ２Ｂ Ｃ末端の６ペプチド（ＳＩＥＳ
ＤＶ）でのペプチド親和性クロマトグラフィーマウスのいずれかを使用して、実
施例１において記載されるように前脳抽出物から単離した。簡潔には、サンプル
をｐＨ９．０にて１％（ｗ/ｖ）デオキシコール酸を含有する緩衝液中にホモジ
ナイズし、３０分間、５０．０００×ｇで４℃にてスピンし、続いてＭＡＰ−Ｎ
Ｒ１抗体とともに温置し、その後にＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ沈
降するか、またはＭＡＰ−ＮＲ１抗体置換化ａｆｆｉｇｅｌ−１０（ＢｉｏＲａ
ｄ）（５ｍｇ抗体／ｍｌ樹脂）、もしくはＮＲ２Ｂペプチド樹脂（５ｍｇペプチ
ド／ｍｌ ａｆｆｉｇｅｌ−１０樹脂）を使用する免疫親和性クロマトグラフィ
ーのいずれかを行った。４℃にて一晩の温置後、樹脂を１００〜１０００カラム
容量の抽出緩衝液で４℃にて洗浄し、そしてタンパク質を４％ ＳＤＳ中で３０
分間煮沸することによって樹脂から分離した。
【０２８２】 ウェスタンブロッティング （ｉ）タンパク質のトランスファー 緩衝液組成：１０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１．０＠４℃ １０％（ｖ／ｖ）メタノール −メタノール中にＰＶＤＦメンブレンを１分浸漬し、次いで緩衝液に移す −２つのフィルター紙、メンブレン、および２つのフォームパッドを１０分間
、緩衝液中で温置する。 −約５分間緩衝液中でゲルを温置する
【０２８３】 −ゲルサンドイッチを、以下の順（下から上）： カセットの黒色側 フォームパッド フィルター紙 ゲル ＰＶＤＦメンブレン フィルター紙 フォームパッド カセットの透明側 においてアセンブリされたサンドイッチを覆うのに充分な緩衝液を含有するトレ
イ中のカセットにアセンブリする。
【０２８４】 −サンドイッチの層間にトラップされた空気泡が無いことを確実にする −サンドイッチを固定し、そして緩衝液で充填されたゲルトランスファー装置
に挿入する −泡のトラップを回避するための穏やかな攪拌を伴って、タンパク質を９０分
間４℃にて７５Ｖでトランスファーする −サンドイッチを取り外し、そしてタンパク質を表面上に有するＰＶＤＦメン
ブレンをＰＢＳを含有する容器中に移す。
【０２８５】 （ｉｉ）ウェスタンブロッティング検出 緩衝液 ０．０５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ −ＰＶＤＦメンブレンを、５％脱脂粉乳を含有する緩衝液で一晩、４℃にて、
一定の振盪下でブロックする −メンブレンを３回、緩衝液で、各５分間洗浄する −メンブレンを希釈された１次抗体（１：１００〜１：５０００、各抗体につ
いて別々に評価されることを必要とする）を含有する緩衝液とともに、２時間、
室温で、一定の振盪を伴って温置する。 −メンブレンを３回、緩衝液で、各５〜１０分間洗浄する。
【０２８６】 −メンブレンを希釈された２次抗体（１：１０００〜１：５０００、各抗体に
ついて別々に評価されることを必要とする）を含有する緩衝液とともに、２時間
、室温で、一定の振盪を伴って温置する。
【０２８７】 −メンブレンを緩衝液で、５、５、および３０分間洗浄する −メンブレンをＥＣＬ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と
ともに温置し、そして１秒間〜５分間、Ｘ線フィルムに露光する。
【０２８８】 サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして１０％（ｖ/ｖ）メタノール、１
０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１．０中ＰＶＤＦメンブレンに４℃にて９０分間、７
５Ｖにてトランスファーした。１次抗体の希釈は、１：１００と１：１０００と
の間であり、ＩｇＧの質に依存した。シグナルを、ペルオキシダーゼ結合２次抗
体ＩｇＧおよび増強された化学発光を使用して検出した。
【０２８９】 質量分析サンプル調製 多タンパク質複合体サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシー
ブルーまたは銀染色(Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. & Mann, M. 1996, A
nal Chem 68, 850〜8)によって染色し、および６０〜３００ｋＤ間の個々のタン
パク質バンドを切り出し、還元し、アルキル化し、そしてトリプシン(Wilm, M.
ら, 1996, Nature 379, 466〜9)で消化した。得られるペプチド混合物を、先ず
、Delayed Extraction Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (DE-MAL
DI) Time of Flight (TOF)質量分析によって分析し、ペプチド質量フィンガープ
リント(Jensen, O. N. , Podtelejnikov, A. V. & Mann, M. 1997, Anal Chem 6
9, 4741〜50)を生成し、そして続いてオンライン液体クロマトグラフィータンデ
ム質量分析（ＬＣ/ＭＳ/ＭＳ）によってペプチド配列情報(Link, A. J.ら, 1999
, Nat Biotechnol 17, 676〜82)を作製した。
【０２９０】 ＤＥ-ＭＡＬＤＩによる分析 ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを、３３７ｎｍ窒素レーザーと適合されたＴｏｆＳ
ｐｅｃ ＳＥ機器(Micromass, Manchester, UK)を使用して得た。個々の質量ス
ペクトルを、ｍ／ｚ ２１６３．０５７０にてトリプシン自己融解ペプチドを使
用し、ロック質量ルーチンを介して検量した。モノ等張性ペプチド質量が割り当
てられ、そしてＰｅｐＳｅａプログラム(Protana, Denmark)を使用する内部の非
重複性タンパク質配列データベース（ｎｒｐｅｐ）をサーチするために使用した
。タンパク質起源の種に対して、およびその等電点に対して、何の制限も置かれ
ず、および０〜３００ｋＤａのタンパク質質量範囲が許容された。タンパク質が
曖昧でないように同定されるために、最小の１５％配列適用範囲を示す、少なく
とも５ペプチドを、５０ｐｐｍの質量精度内に適合した(Jensen, O. N., Podtel
ejnikov, A. V. & Mann, M. 1997, Anal Chem 69, 4741〜50)。
【０２９１】 オンラインＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析 ペプチド混合物のクロマトグラフィー分離を、ギ酸（０．０５％）およびアセ
トニトリルに勾配を送達するＵｌｔｉｍａｔｅ ＬＣ系(LC Packings, The Neth
erlands)を使用する１８０μｍ ＰｅｐＭａｐカラムに対して行った。溶出ペプ
チドを、Ｚスプレイ供給源と適合されたＱ-ＴＯＦハイブリッド質量分析器(Micr
omass, U.K.)上でのエレクトロスプレイ電離によって電離した。機器を、自動化
機能切り替え態様において操作するようにセットし、それによって前駆体イオン
は、フラグメント化タンデムＭＳを誘導する衝突によるペプチド配列決定につい
ての強度に基づいて選択される。ＭＳ/ＭＳ分析は、分析下での前駆体のｍ／ｚ
に基づいて選択された衝突エネルギープロフィールを使用して行われた。合計９
個のＭＳ／ＭＳスキャンが、各前駆体について獲得された。数百のＭＳ/ＭＳス
ペクトルが、操作当たり作製され、任意の以前の解釈を伴わずに複合体混合物の
解析を許容する。質量分析データは、Ｍａｓｃｏｔソフトウェア(Matrix Scienc
e, UK)を使用する、ｍ/ｚ価、親イオンの荷電状態、フラグメントイオン質量お
よび強度、ならびにタンパク質および核酸配列データベースとの相関を含むピー
クリストにプロセスされた。タンパク質は、ペプチドの選択されるイオン総数に
ついて算定される質量値とＭＳ/ＭＳデータとの適合に基づいて同定された。非
重複性タンパク質データベース、およびｄｂＥＳＴ、ＮＣＢＩ／ＥＢＩ(Nationa
l Centre for Biotechnology Information/European Bioinformatics Institute
, UK)によって編集される多数の生物からの発現される配列タグを含有するヌク
レオチドデータベースに対するサーチが、分子量および起源の種に対する任意の
制限を適用しないで行われた。大部分のタンパク質は、いくつかのペプチド適合
を伴って同定されたが、いくつかのタンパク質は、ほとんど完全なペプチド配列
が得られたとすると単一ペプチドに基づいて割り当てられた。
【０２９２】 ＜結果および考察＞ 表３．多タンパク質複合体の分子組成のまとめ。
【０２９３】 多タンパク質複合体および多タンパク質複合体内の公知の結合対の免疫ブロッ
ティングスクリーニング。
【０２９４】 欄：タンパク質、タンパク質のクラスが四角で囲まれ、および特定の分子名が
示され、番号を同定する（１〜１０６）；Ｍｒ［ＫＤａ］、相対的な分子量；Ｅ
ｘ、マウス脳抽出物；ＩＡ、ＭＡＰ−ＮＲ１免疫親和性によって単離される複合
体；ＩＰ、ＭＡＰ−ＮＲ１免疫沈降によって単離される複合体；Ｐｅｐ、ＮＲ２
Ｂペプチド親和性によって単離される複合体；Ａｂ、抗体供給源；結合対、発表
されたインビトロ研究からの同定された相互作用。
【０２９５】 特定の脳タンパク質が、免疫ブロッティングを使用して複合体の３つの調製物
（ＩＡ、ＩＰ、Ｐｅｐ）において試験され、そして検出可能なシグナルが強力（
＋＋＋）、中程度（＋＋）、および弱い（+）シグナル、ならびに検出できない
シグナル（-）としてスコアされた。いくつかのタンパク質は、Ｉｇの共遊走（
ｃｈ、共遊走重鎖Ｉｇ；ｃｌ、共遊走軽鎖Ｉｇ）のために、ＩＡまたはＩＰにお
いて分析され得なかった。
【０２９６】 複合体において見出される各タンパク質について、報告される関連性タンパク
質が、第１のカラムにおける番号付けスキームを参照して示される（結合対）。
【０２９７】 抗体供給源（欄Ａｂ）：a, J. H. Morrison; b, Upstate Biotech; c, Chemic
on; d, Pharmingen; e, R. Huganir; f, Transduction Labs; g, M. Watanabe;
h, Alomone Labs; i, H. Kreienkamp; j, K. Inokuchi; k, E. Ziff; l, J. Sco
tt; m, J. Henley; n, Promega, o, P. Chohen; p, Oncogene Sci; q, New Engl
and Biolabs; r, Santa Cruz, s, Calbiochem; t, D. Kuhl; u, D. Coleman; v,
Sigma; w, Roche Molecular Biochemicals; x, J. Parsons
【０２９８】 表４．多タンパク質複合体タンパク質の質量分析のまとめ ６０〜３００ｋＤの間の可視化されたタンパク質バンドが、記載されるように
調製および分析された（上述および図９を参照のこと）。欄：タンパク質名；Ｍ
ｒ［ｋＤａ］、相対的な分子量；アクセス番号；ＭＳ事象、ＭＳ/ＭＳによって
配列決定される適合するペプチド。
【０２９９】
【表３−１】
【０３００】
【表３−２】
【０３０１】
【表４】
【０３０２】 学習の普及する細胞モデルは、訓練の間のニューロン活性のパターンによって
誘導されるシナプス強度の改変を包含し、これは神経網における情報をコードす
る(Bliss, T. V. & Collingridge, G. L., 1993, Nature 361, 31〜9; Bear, M.
F. & Malenka, R . C., 1994, Curr Opin Neurobiol 4, 389〜99)。発火の変化
されたパーターンを検出するためにシナプターゼによって使用される分子機構を
理解すること、および次いでどのようにシグナル伝達事象が、シナプス伝達の強
度を変化するかは、このモデルに基本的な洞察を与え、およびヒト学習的欠陥に
おいて生じる病理学的機構を解明する。かなりの注目が、グルタミン酸受容体の
ＮＭＤＡサブタイプに集中された(Hollmann, M. & Heinemann, S., 1994 Annu R
ev Neurosci 17, 31〜108)。なぜなら海馬におけるその遮断が、シナプス可塑性
および学習の両方を障害したからである(Bliss, T. V. & Collingridge, G. L.,
1993, Nature 361, 31〜9)。この受容体チャネルは、シナプス後脊椎へのカル
シウム流入を許容し、キナーゼ、ホスファターゼ、および他の酵素を調節し、こ
れらは次いでＡＭＰＡ（α-アミノ-３-ヒドロキシ-５-メチル-４-イソキサゾー
ル-４-プロピオン酸）受容体、脊椎細胞骨格変化、翻訳、転写、および他の事象
を調節することが示された。さらに、生理学的設定において、これらのシグナル
は海馬のＣＡ３-ＣＡ１シナプスにおける電気生理学的研究によって示されるよ
うに巧妙に取り込まれなくてはならず、ここでは低頻度のシナプス刺激がＮＭＤ
Ａ受容体依存性の長期抑制（ＬＴＤ）およびシナプス強度における増強のより高
い頻度（ＬＴＰ）を生じる(Bear, M. F. & Malenka, R. C., 1994, Curr Opin N
eurobiol 4, 389〜99)。ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達の役割の明白な多様性に加
えて、接着タンパク質を、複数の第２のメッセンジャー、および構造タンパク質
を含む多くの分子が、シナプス可塑性において関与されるという観察が考え出さ
れた(Sanes, J. R. & Lichtman, J. W., 1999, Nat Neurosci 2, 597〜604)。
【０３０３】 大きな多タンパク質複合体へのシグナル伝達タンパク質との受容体のアセンブ
リが、細胞シグナル伝達の一般的な機構として明らかになった(Pawson, T. & Sc
ott, J. D., 1997, Science 278, 2075〜80)。ＮＭＤＡ受容体はシナプス後タン
パク質(Kim, J. H. & Hunganir, R. L., 1999, Curr Opin Cell Biol 11, 248〜
54)を結合し、シナプス後肥厚９５（ＰＳＤ-９５）を包含し、これは変異体にお
けるシナプス可塑性に必要であることが示された(Migaud, M.ら, 1998, Nature
396, 433〜9)。このモデルをさらに探索するために、本発明者らはＮＭＤＡ受容
体ＰＳＤ-９５複合体を、マウス脳から単離し、そして免疫ブロッティング、質
量分析、および大きなタンパク質複合体の解析についての強力な道具であるプロ
テオミック技術を使用してそれらの特性を分析した(Jensen, O. N., Larsen, M.
R. & Roepstorff, P., 1998, Proteins 増刊, 74〜89; Mendelsohn, A. R. & B
rent, R., 1999, Science 284, 1948〜50; Neubauer, G.ら, 1998, Nat Genet 2
0, 46〜50)。この生化学的なアプローチは、ＰＳＤ-９５におけるように、リン
酸化および脂質修飾のような翻訳後修飾を必要とするタンパク質相互作用(Crave
n, S. E., El-Husseini, A. E. & Bredt, D. S., 1999, Neuron 22, 497〜509)
、および２-ハイブリッドスクリーニングによって検出されない三元のまたは弱
い相互作用(Mendelsohn, A. R. & Brent, R., 1999, Science 284, 1948〜50)の
検出を可能とし、これは、ＮＭＤＡ受容体およびＰＳＤ-９５結合対を同定する
ために広範囲に使用された(Kim, J. H. & Huganir, R. L. 1999, Curr Opin Cel
l Biol 11, 248〜54; Hsueh, Y. P. & Sheng, M., 1998, Prog Brain Res 116,
123〜31)。さらに、脳からの生化学的分析ならびに他のインビボ解析は、複合体
を影響する変異を保有するマウスを解析するために必要とされる。
【０３０４】 ＮＭＤＡ Ｒ１サブユニットに対して指向される抗体での免疫親和性クロマト
グラフィーおよび免疫沈降、ならびにＮＭＤＡ受容体結合タンパク質ＰＳＤ-９
５に結合するＮＭＤＡ Ｒ２ＢサブユニットＣ末端の構造に基づくペプチド親和
性を含む３つの方法が、図８において示されるような最も明らかな結果を生成し
た。個々の画分のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析は、精製された材料が、免疫沈降におい
て使用されたＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（レーンＷＴ／Ｇ）また
は抗体およびペプチド親和性精製において使用されたａｆｆｉｇｅｌ−１０との
、抽出されたタンパク質の非特異的な相互作用に比較して非常に複雑であること
を示した（図８Ａ、およびＢ、レーンＩＡ、 ＩＰ、およびＰｅｐ）。複合体の
完全性およびタンパク質相互作用の特異性が試験された。ＮＲサブユニット（Ｎ
Ｒ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ）およびそれらの報告される相互作用タンパク質(KIm
, J. H. & Huganir, R. L., 1999, Curr Opin Cell Biol 11, 248〜54; Hsueh,
Y. P. & Sheng, M. 1998, Prog Brain Res 116, 123〜31)（ＰＳＤ−９５、カプ
シン-１１０/ＰＳＤ−９３、カルモジュリン、α-アクチニン、カルシウム／カ
ルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）、ホスホリパーゼＣγ）が容易に検
出され（図８Ｃおよび表３）、ならびにｎＮＯＳ、ＳｙｎＧＡＰ、ＳＡＰＡＰ/
ＧＫＡＰ、およびシトロンを含むＰＳＤ-９５結合タンパク質がまた見出された
（図８Ｄ）。本発明者らは次に、ＡＭＰＡサブユニット（ＧｌｕＲ１〜４）およ
びそれらの同族のアダプタータンパク質ＧＲＩＰを試験し、これらは抽出物中の
それらの豊富さにもかかわらず、多タンパク質複合体中で検出されなかった（図
８Ｅ）。Ｋａｉｎａｔｅ受容体サブユニット（ＧｌｕＲ６／７）が検出され、Ｐ
ＳＤ−９５がこれらのサブユニットを結合するという以前の報告(Garcia, E. P.
ら, 1998, Neuron 21, 727〜39)と一致する。代謝調節型（ｍＧｌｕＲ１α）受
容体およびそれらの同族結合対Ｈｏｍｅｒ／Ｖｅｓｌ−１が、多タンパク質複合
体において見出され（図８Ｆ）、Ｈｏｍｅｒが、ＰＳＤ−９５に対してＧＫＡＰ
を結合し得るＳＨＡＮＫを結合することを示す２−ハイブリッドスクリーニング
を使用する最近の報告(Tu, J. C.ら, 1999, Neuron 23, 583〜92)と一致する。
それゆえ、ＮＲおよびｍＧｌｕＲ受容体は、ＡＭＰＡ受容体に異なる複合体にお
いて会合される。
【０３０５】 本発明者らは次に、２つのストラテジー：ＮＲシグナル伝達および足場と関係
される候補タンパク質（表３）についてのウェスタンブロッティングスクリーニ
ング、および質量分析を使用するタンパク質同定（図９および表４）を使用して
多タンパク質複合体の新規な成分を同定した。図８Ｇにおいて示されるタンパク
質は、ＭＡＬＤＩ-ペプチド質量フィンガープリンティングおよびオンラインＬ
Ｃ-ＭＳ/ＭＳ（図９）によって分析された。
【０３０６】 ＮＲおよびｍＧｌｕＲ受容体は、第２のメッセンジャー経路の活性化を介して
シナプス可塑性の誘導において関係された（図１０）。本発明者らは、多タンパ
ク質複合体における広範囲の異なるキナーゼおよびホスファターゼを試験し、そ
していくつかの特異的なセリン-スレオニンキナーゼおよびホスファターゼファ
ミリーメンバーを見出した。プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）触媒サブユニット
および調節サブユニットＲ２β（Ｒ１、Ｒ１α、およびＲ２αは検出されなかっ
た）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）イソ型のβ、γ、εが見出されたが、α
、δ、η、θ、ι、λイソ型は検出可能ではなかった。以前に報告されたように
(Leonard, A. S., Lim, I. A., Hemsworth, D. E. Horne, M. C. & Hell, J. W.
, 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96, 3239〜44)、（ＣａｍＫＩＩ）のαおよび
βサブユニットが会合され、およびまた、リン酸化された活性な形態にあること
が見出された。これらのキナーゼの存在は、シナプス可塑性の誘導と関与される
ことが示され、対応するホスファターゼがまた、多タンパク質複合体に存在し得
ることを示唆する。本発明者らは、ＰＰ１およびＰＰ２Ａが強力に会合され、な
らびにＰＰ２Ｂ（カルシニューリン）およびＰＰ５がまた会合されることを見出
した。ＰＫＡおよびＰＰＩは、アダプタータンパク質（Ｙｏｔｉａｏ）を介して
ＮＲ１サブユニットに連結され、およびＮＲ電流をインビトロで調節し得ること
が近年見出された(Westphal, R. S.ら, 1999, Science 285, 93〜6)。本発明者
らは、Ｙｏｔｉａｏおよび別のＰＫＡアダプターＡＫＡＰ１５０を見出し、ＰＫ
Ａが複数の位置で多タンパク質複合体に連結され得、おそらく異なる経路を作用
することを示唆する。
【０３０７】 チロシンリン酸化はまた、ＮＭＤＡ受容体(Wang, Y. T. & Salter, M. W., 19
94, Nature 369, 233〜5)およびシナプス可塑性(O’Dell, T. J., Kandel, E. R
. & Grant, S. G., 1991, Nature 353, 558〜60)と関与される。原形質チロシン
キナーゼの調査は、多タンパク質複合体と会合されるＳｒｃ（しかしＦｙｎでは
ない）およびカルシウム活性化キナーゼＰｙｋ２（しかしＰｙｋ２ホモログのＦ
ｏｃａｌ接着キナーゼ、ＦＡＫではない）を示した。チロシンホスファターゼイ
ンヒビターはＮＲチャネルを影響する(Wang, Y. T. & Salter, M. W., 1994, Na
ture 369, 233〜5)、関連のチロシンホスファターゼの同一性は未だ明らかでな
いままである。本発明者らはＰＴＰ１Ｄを検出し、これはＮＲ２Ｂと会合するが
、多タンパク質複合体における関連されるＰＴＰ１ＢおよびＰＴＰ１Ｃのいずれ
とも会合しないことが近年記載され(Lin, S. Y.ら, 1999, Brain Res Mol Brain
Res 70, 18〜25)、この多タンパク質複合体調節にチロシンホスファターゼを関
連づける。
【０３０８】 ＮＲ媒介性キナーゼおよびホスファターゼシグナル取り込みがどのように生じ
るのかは明らかでない。本研究において、本発明者らは、多タンパク質複合体に
おいてＨ−ＲａｓおよびＲａｐ２小Ｇタンパク質の両方、ならびにそれらのＧＴ
Ｐアーゼ活性化タンパク質ＮＦ１およびＳｙｎＧＡＰ（これはＰＳＤ−９５を結
合する）を見出したが、ｐ１２０ＧＡＰは見出さなかった。Ｒａｐ１は、ＰＫＡ
をｃ−Ｒａｆ１に結合し得、多タンパク質複合体において検出可能ではなかった
。Ｒａｓは、ｃ-Ｒａｆ１-ＭＥＫ-ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路、ＰＩ３キナーゼおよ
びＲａｌＡを含むいくつかの下流エフェクター経路の異なる活性化によってこの
効果を媒介する(Gille, H. & Downward, J. 1999, J Biol Chem 274, 22033〜40
)。異なるＭＡＰＫ経路が、そのカスケードを生成する重要な酵素から構成され
るモジュールに組織化され、シグナル特異性を生成するように細胞内でつなぎ合
わされることが今や認識されている(Schaeffer, H. J. & Weber, M. J., 1999,
Mol Cell Biol 19, 2435〜44)。これはまた、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２ならびに
それらの上流の活性化キナーゼＭＥＫ１、ＭＥＫ２、およびｃ-Ｒａｆ１が、Ｊ
ＮＫＫ１／ＭＫＫ４およびＥＲＫ３に対照的に見出されたので、多タンパク質複
合体についての場合であり得る。さらに、ＥＲＫを不活性化するＥＲＫホスファ
ターゼ（ＭＫＰ２）がまた同定された。他のＲａｓエフェクター、ＰＩ３Ｋおよ
びＲａｌが検出された観察とあわせて、これらのデータは、多タンパク質複合体
内の異なる下流経路に結合するＲａｓを駆動するグルタミン酸受容体シグナルと
一致する。
【０３０９】 シナプス可塑性および学習におけるＥＲＫ/ＭＡＰＫ経路の役割は、かなりの
注目を受けた。なぜならＥＲＫのリン酸化がＭＥＫのインヒビターによってまた
破壊されるこれらのプロセスを付随するからである(Impey, S., Obrietan, K. &
Storm, D. R., 1999, Neuron 23, 11〜4)。ＥＲＫのリン酸化は主に、転写因子
ＣＲＥＢおよびＣＲＥＭをリン酸化するために核に転位されるＲＳＫ２のリン酸
化を介して、転写を調節するにおいて関係された。興味深いことに、ホスホＥＲ
Ｋは多タンパク質複合体に存在しないが、抽出物中に容易に検出され、リン酸化
の際に多タンパク質複合体から転位するその能力と一致する。さらに、ＲＳＫ２
が多タンパク質複合体内で見出されたが、転写因子ＣＲＥＢおよびＣＲＥＭは多
タンパク質複合体中に検出可能ではなかった。本発明者らは、多タンパク質複合
体タンパク質のいくつか（Ｈｏｍｅｒ、ＮＲ１、ＮＲ２Ｂ、ＰＫＣガンマ、ＥＲ
Ｋ２、ｃ-Ｒａｆ１、ＨＳＰ７０）が活性依存性遺伝子によってコードされるこ
とに気付き、および本発明者らはそれゆえ、Ａｒｇ３．１／Ａｒｃ(Link, W.ら,
1995, Proc, Natl Acad Sci USA 92, 5734〜8)、ＬＴＰによってまた迅速に調
節される未知の機能のシナプス後タンパク質を試験した。Ａｒｇ３．１は、多タ
ンパク質複合体中で容易に検出され、これが多タンパク質複合体のシグナル伝達
および動力学的組織化に関係され得ることを示唆する。従って、多タンパク質複
合体が、シナプス活性化後の転写活性化に寄与し得、次いで変化された遺伝子発
現への二次的な構造変化にそれ自身が供され得るシグナル伝達機構を含む。ｃＰ
ＬＡ２は、ＰＳＤ−９５を結合するシトロンによってまた調節された別の潜在的
なＥＲＫエフェクターであった(Lin, L. L.ら, 1993, Cell 72, 269〜78)。ｃＰ
ＬＡ２変異体マウスは、虚血性ニューロン障害に対する耐性を示し(Bonventre,
J. V.ら, 1997, Nature 390, 622〜5)、およびｃＰＬＡ２はアラキドン酸、候補
トランス-シナプス逆行シグナル伝達分子を作製した。
【０３１０】 シナプス構造における変化は、長期間の記憶の保存に重要であり得、ならびに
細胞接着分子および細胞骨格構造タンパク質についての役割が示される(Murase,
S. & Schuman, E. M., 1999, Curr Opin Cell Biol 11, 549〜53)。上記のシグ
ナル伝達タンパク質の多くは、細胞骨格および細胞接着の公知の調節因子である
。アクチン細胞骨格は以前に、ＮＲチャネル特性(Rosenmund, C. & Westbrook,
G. L., 1993, Neuron 10, 805〜14)、ＮＲ媒介性ＬＴＰ(Kim, C. H. & Lisman,
J. E., 1999, J Neurosci 19, 4314〜24)、およびＮＲ局在性(Allison, D. W.,
Gelfand, V. I. Spector, I. & Craig, A. M., 1998, J Neurosci 18, 2423〜36
)における機能を有することが示され、および神経活性を伴って脊椎中で動力学
的に調節される(Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D. & Matus, A., 1998, Neu
ron 20, 847〜54)。本発明者らは、多タンパク質複合体において以前に受容体サ
ブユニットに結合することが見いだされた(Wechsler, A. & Teichberg, V. I.,
1998, Embo J 17, 3931〜9)α-アクチニン２およびスペクチン（Ｆｏｄｒｉｎ）
、ならびにアクチン結合タンパク質（コルタクチン、コルタクチン結合タンパク
質（ＣｏｒｔＢＰ１およびＳＨＡＮＫ）およびＭＡＰ２を含むが、エズリン、テ
ンシン、またはビンクリンを含まない）を見出した。細胞接着タンパク質のＮ-
カドヘリンおよびデスモグレインの２つのカドヘリンファミリーメンバーおよび
それらの原形質相互作用タンパク質のβ-カテニン、ＺＯ−１およびｐ１２０ｃ
ａｓが検出されたが、Ｅ-カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、カドヘリン−５、α-カ
テニン、γ-カテニンはネガティブであった。Ｌ１接着タンパク質は、学習およ
びシナプス可塑性に必要であり(Luthl, A., Laurent, J. P., Figurov, A., Mul
ler, D. & Schachner, M., 1994, Nature 372, 777〜9)、これはまた多タンパク
質複合体中で検出された。これらの接着タンパク質は、シナプスでの多タンパク
質複合体の構造的組織化において役割を果たし得るが、シナプス可塑性における
カドヘリン(Tang, L., Hung, C. P. & Schuman, E. M., 1998, Neuron 20, 1165
〜75)およびＬ１(Luthl, A., Laurent, J. P., Figurov, A., Muller, D. & Sch
achner, M. 1994, Nature 372, 777〜9)の関与は、このグルタミン酸受容体細胞
接着タンパク質複合体が複数のトランスシナプスシグナル伝達経路を提供し得る
という推測にこれを誘惑し、ここで接着媒介性のシグナル伝達は、伝達因子シグ
ナル伝達機構に合わされる。
【０３１１】 大規模に単離された多タンパク質複合体の質量分析（ＭＳ）は、酵母２ハイブ
リッド試験および免疫ブロッティングよりも多タンパク質複合体成分の同定を確
認および拡張した（表３および表４）。いくつかの多タンパク質複合体成分は、
ＭＳによって検出されず、およびこれは選択されたゲルフラグメントにおけるタ
ンパク質の低いレベルに考慮され得る。以前に予測されなかった公知のタンパク
質の同定に加えて、ＭＳアプローチはまた、ｄｂＥＳＴデータベースにおいて示
される７個のペプチドを同定した。これらのＥＳＴクローンのうちの２つは、マ
ウス海馬から起源した（ＡＵ０５０９６４およびＡＶ１５３７３１）、一方その
他のうちの１つは９７ｋＤａ仮説タンパク質（ＣＡＢ４３６７５）に対応した。
いくつかのタンパク質複合体が数ダースのタンパク質を含むことが明らかである
が（例えば、Jensen, O. N., Larsen, M. R. & Roepstorff, P., 1998, Protein
s増刊, 74〜89; Mendelsohn, A. R. & Brent, R. 1999, Science 284, 1948〜50
; Neubauer, G. ら, 1998, Nat Genet 20, 46〜50）、本研究において同定され
た多数の多タンパク質複合体タンパク質は単一の同種複合体に存在する全てのタ
ンパク質を示さなかった。異型遺伝子性が、異なったシナプスで見出され得るよ
うに、開始材料における異なる複合体から生じ得た。さらに大きなサイズの複合
体は、シグナル伝達する複合体の動力学的アセンブリまたは一過性のタンパク質
間相互作用を反映し得、これは多タンパク質複合体におけるタンパク質を含む多
くのシグナル経路の特徴である(Pawson, T. & Scott, J. D., 1997, Science 27
8, 2075〜80)。
【０３１２】 マウス脳から単離された多タンパク質複合体の構造は、神経伝達因子受容体、
細胞接着タンパク質、アダプター、２次メッセンジャー、および細胞骨格のサブ
セットがともに、シグナル伝達経路を含む物理学的単位に組織化されることを意
味する（図１０）。多タンパク質複合体についての最も単純な一般的な機能は、
電気生理学的実験において記載されるように「発現期」に対照的に、シナプス可
塑性の「誘導期」においてであり得る。誘導は、ＮＭＤＡ受容体、ｍＧｌｕＲ、
Ｃａ２＋流入、および第２のメッセンジャーシグナル伝達の活性化を包含し、そ
して１時間未満続き、この際のＮＭＤＡ受容体または第２のメッセンジャーの阻
害はシナプス強度の新規なレベルを変化せず、これはＡＭＰＡ受容体によって媒
介または発現される。誘導装置としての多タンパク質複合体のこのモデルは、標
的化マウス変異、トランスジェニック発現、およびシナプス可塑性の誘導を変化
する多タンパク質複合体タンパク質の薬理学的阻害：標的化マウス変異；ＮＲ１
、ＮＲ２Ａ、ｍＧｌｕＲ１、ＰＳＤ−９５、ＰＫＡ触媒および調節サブユニット
、ＰＫＣγ、ＣａｍＫＩＩ、ｎＮＯＳ、ＮＦ１、Ｈ-Ｒａｓ；ＮＲ２Ｂ、Ｃａｍ
ＫＩＩ、カルシニューリン、ＰＫＡインヒビター、Ｌ１を発現するトランスジェ
ニックマウス；ならびにＮＲ、ｍＧｌｕＲ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＣａｍＫＩＩ、Ｍ
ＥＫ、チロシンキナーゼ、ＰＰ１、ＰＰ２Ａ、ＰＰ２Ｂ、カドヘリン、Ｌ１、ア
クチンポリマー化、カルモジュリン、ｎＮＯＳ、ＰＩ３Ｋ、およびｃＰＬＡ２の
薬理学的インヒビターによって強力に支持される。多タンパク質複合体はまた、
キナーゼおよびホスファターゼを伴う多くのカルシウム感受性タンパク質が、微
小ドメインにおいてＮＭＤＡ受容体カルシウム孔の下にあるので、双方向性（Ｌ
ＴＰおよびＬＴＤ）のシナプス可塑性を誘導するために十分に適切にされる。キ
ナーゼおよびホスファターゼ活性化、およびＲａｓ調節のような、複合体内への
シグナル伝達事象の取り込みは、ＬＴＰおよびＬＴＤについての閾値を設定する
ために、ならびに翻訳および転写活性化を包含するＬａｔｅ-ＬＴＰの活性化を
調節するために必要な等級付けされた出力を提供し得た。
【０３１３】 実施例３：サイズ排除クロマトグラフィーによる多タンパク質複合体のサイズ の決定 ＜材料および方法＞ 多タンパク質複合体の精製 多タンパク質複合体を、実施例１において記載されるように免疫親和性クロマ
トグラフィーによってマウス前脳から精製した。
【０３１４】 サイズ排除クロマトグラフィー ５０ｍｌマウス脳抽出物および０．５ｍｇのＭＡＰ−ＮＲ１ヒツジ ＩｇＧを
使用する大規模な抗ＮＲ１ ＩＰサンプルを、樹脂からの結合された材料を競合
するために、１．５ｍＬの全容量中、４℃にて１時間、１０ｍｇ ＭＡＰ−ＮＲ
１ペプチドとともに温置した。次いで上清を取り出し、そして樹脂をさらに１ｍ
ｌのＤＯＣ緩衝液で洗浄した。両方の上清を合わせ、そしてＤＯＣ緩衝液中４℃
にて１ｍｌ／分での、ＦＰＬＣに連結されるＸＫ１６／７０カラム中の１２０ｍ
ｌ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ−６５Ｆ樹脂を介するゲル濾過に供した(両方と
もにAmershamPharmacia, Amersham, UK)。サンプルを１．５分間の間隔で採取し
、そして溶出物の吸光度を２８０ｎｍでモニターした。サンプルを、ＮＲ１に対
するウェスタンブロッティングによる分析に供した。カラムをＨＭＷゲル濾過キ
ットからの標準を使用して検量した。
【０３１５】 ＜結果＞ マウス前脳から抽出された多タンパク質複合体のゲル濾過解析の結果は、図１
１において示される。
【０３１６】 ＮＭＤＡ受容体が位置される多タンパク質複合体の絶対的なサイズは、シナプ
スでの受容体の機能を理解するために重要な意味を有する。実施例１において記
載される単離方法を使用して、本発明者らはＮＭＤＡＲ受容体を含有する多タン
パク質複合体の組成が、約７５タンパク質を含むことを決定した。成分のこの大
きな数は、大きな「超複合体」または複数のより小さな異種複合体のいずれかと
一致する。本発明者らは、この問題に取り組むためにゲル濾過を使用し、そして
複合体のサイズの見積もりを得ることを選択した。複合体は、ＮＲ１親和性手順
を使用して単離され、ペプチド競合を使用して溶出され、次いでゲル濾過に供さ
れ、ここでは回収された画分は、ＮＲ１に対する抗体を使用してウェスタンブロ
ットされた。結果は、凝集が生じなかったことを、これがＮＲ１免疫反応性材料
を、空隙容量（ｖ０）で生じるので、示した。さらに、全カラム容量（ｖｔ）の
直前の領域におけるモノマーＮＲ１サブユニットの不在が、複合体が回収された
という見解を支持する。２０００ｋＤａマークを横切るサンプルを含有するＮＲ
１のガウス分布は、多タンパク質複合体が類似のサイズからなるというさらなる
指標である。
【０３１７】 ＜考察＞ ＮＭＤＡ受容体チャネルの化学量論は明らかでないが、これがＮＲ１およびＮ
Ｒ２サブユニットの４量体または５量体であるという可能性は、６００〜９００
ｋＤａの範囲のチャネルのサイズを予測する。対照的に、実施例１において単離
された多タンパク質複合体は、約２０００ｋＤａの分子量を有することが決定さ
れた。従って複合体は、ＮＭＤＡ受容体が亜成分である大きなシグナル伝達実体
であるようである。
【０３１８】 ＮＭＤＡ受容体および関連のタンパク質、および神経伝達因子受容体、細胞接
着タンパク質、アダプター分子、シグナル伝達タンパク質、および細胞骨格タン
パク質への複合体の詳述される組成物を含む、２０００ｋＤａ複合体の実証は、
どのようにシナプス後末端が機能するかを決定するために重要である。特定の神
経伝達因子受容体が特異的なシグナル伝達事象、それによって細胞機能を媒介す
ることが知られるが、より伝統的なＰＳＤタンパク質同定研究とともに、２ハイ
ブリッド相互作用データの増加する実体は、ＰＳＤが相互作用するタンパク質の
大きな足場または網から構成されるという見解を導く。本研究は、シナプス後神
経伝達因子が、物理的に単離可能な複合体にあることを示し、ＮＭＤＡ受容体は
、ＡＭＰＡ複合体のような、他の重要なＰＳＤ神経伝達因子受容体の複合体に対
して区別される、非常に大きな多タンパク質複合体内に位置される。従って、シ
ナプス後構築は、電子顕微鏡を使用して観察されるより非特異的な実体またはオ
ルガネラであるＰＳＤの異なる亜成分である大きな多タンパク質複合体から構成
されなくてはならない。
【０３１９】 ＰＳＤ−９５がシナプス可塑性および学習におけるＮＭＤＡ受容体の機能に必
須であるという実証は(Migaudら, 1998, Nature 396:433〜439)、生理学的設定
において特定の複合体が機能的な実体であることを示す。これらの多タンパク質
複合体は非常に多数の分子を含み、薬理学的にまたは遺伝子的に摂動される場合
、シナプス強度における長期変化への、または動物における学習のための点火の
パターンを検出および変換するシナプスの能力における障害を導く。シナプスの
強化を導くパターンの検出のこれらの特性は、Ｈｅｂｂ（１９４９）によって記
載され、本発明者らが「Ｈｅｂｂｏｓｏｍｅ」と呼ぶこれらの２０００ｋＤａ複
合体の生理学的役割によって十分に説明される。
【０３２０】 実施例４：シグナル伝達、シナプス可塑性、および学習における多タンパク質 複合体の役割の調査 ＜材料および方法＞ 遺伝子標的化 β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の上流の内部リボゾーム実体部位が、
細胞発現パターンをモニターするために導入された（Ｍｉｇａｕｄら、前出）。
標的化構築物は、胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションされ、そしてサ
ザンブロット解析は、相同組換えがＳｙｎＧＡＰについて１８０個のクローンの
うちの１８個（１０％）、およびＨ−Ｒａｓについて７２個のうちの５８個（８
１％）で生じ、および生殖系列伝達が確立されたことを示した（図１ａ、ｂ）。
ＳｙｎＧＡＰ ＰＨおよびＣ２ドメインの部分をコードする５６５塩基対ｃＤＮ
Ａフラグメントが、ＲＴ-ＰＣＲによってマウス脳ＲＮＡ抽出物から作製された
。このｃＤＮＡは、１２９／Ｏｌａマウスゲノムライブラリーをスクリーニング
するためのプローブとして使用され、そして２２ｋｂのＳｙｎＧＡＰ遺伝子座を
覆う重複するλクローンが単離された。ＳｙｎＧＡＰ標的化ベクターを構築する
ために、８．１ｋｂ ＳｍａＩ-ＸｈｏＩフラグメントおよび３．８ｋｂ Ｓｐ
ｅＩ-ＳｐｅＩフラグメントが、５’および３’ホモロジーアームとしてそれぞ
れ使用された。ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグについてのコード配列が
、５’ホモロジーアームの３’末端にてＣ２ドメイン(Kim, J. H.ら, Neuron 20
, 683〜91(1998), Chen, H. J.ら, Neuron 20, 895〜904(1998))のＸｈｏＩ部位
にインフレームで挿入され、続いて停止コドンおよびＩＲＥＳ-ｌａｃＺ−ｐｏ
ｌｙＡ ＭＣ１ｎｅｏ-ｐｏｌｙＡカセット(Morris, R. G.ら, Nature 319, 774
〜6, 1986)が続いた。得られたベクターは、Ｃ２およびＧＡＰドメインをコード
するエクソンを欠失する。ジフテリアトキシンＡ遺伝子（ＭＣ１-ＤＴ-Ａ）が、
ネガティブな選択マーカーとして使用された。標的化ベクターを直鎖化し、そし
てＥ１４ＴＧ２ａ ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。ネオマイシン（ｎ
ｅｏ）耐性クローンを、７００ｂｐ ３’隣接プローブ（ＥｃｏＲＩまたはＸｂ
ａＩ消化）および３５４ｂｐ ｃＤＮＡ内部５’プローブ（ＢｇｌＩＩ消化）を
使用するサザンブロット解析によって相同組換えについてスクリーニングした。
Ｈ-ＲａｓＩ遺伝子座についての標的化ベクターは、ポジティブな選択マーカー
ｎｅｏを含有するカセット（ＴＡＧ３-ＩＲＥＳ-βｇｅｏ-ｐｏｌｙＡ）を隣接
する５’および３’ＤＮＡの１．９ｋｂおよび５．５ｋｂバンドから構成された
。このカセットの５’末端は、エクソン４におけるＳｐｅＩ部位にてＨ−Ｒａｓ
の翻訳を終結するための全てのリーディングフレームにおける停止コドン、続い
てβ-ｇｅｏレポーター遺伝子がＨ-Ｒａｓ１プロモーターの制御下で発現される
ことを許容するリボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含んだ。標的化構築物は線状
化され、そしてＨＭ１ ＥＳ細胞にエレクトロポレーションされた。ネオマイシ
ン耐性クローンが、相同な領域を隣接する１．１ｋｂフラグメント（５’プロー
ブ）、および１．２ｋｂゲノムＤＮＡ（３’プローブ）を使用するサザンブロッ
ト分析によって相同組換えについてスクリーニングされた。キメラマウスが、標
的化ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入することにって生成され、および異
種接合体変異体は、以前に記載されるように(Papaioannou V.およびJonson R.,
1999, 標的化ES細胞の胚盤胞および桑実胚注入によるキメラの生成, Gene Targetin g A Practical Approach 第2版(Joyner A. L.編)4, 第133〜175頁, Oxford Univ
ersity Press, IRL Press, New York)。ＳｙｎＧＡＰ−／＋および野生型マウス
の全ての比較が、Ｆ２ ＭＦ１遺伝子背景おける同腹仔を使用して行われた。動
物は、UK Animal Scientific Procedures Act(1986)およびＮＩＨガイドライン
に従って試験された。
【０３２１】 生化学 海馬を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１％ デオキシコール酸ナトリウム、
５０ｍＭ ＮａＦ、２０ｍＭ ＺｎＣｌ２、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウ
ム、０．５ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）(Roche Molecular Biochemicals)中でホモジナイズし
た。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２５μｇ／レーン）によって分離し、そし
て標準的な手順をウェスタンブロッティングについて使用した。抗体：ＳｙｎＧ
ＡＰ、ＮＲ２Ａ(Upstate Biotechnology)；ＮＦ１、ＳｙｎＧＡＰ、ＨＡ(Santa
Cruz Biotechnology)；ｐ１２０ＲａｓＧＡＰ、Ｈ-Ｒａｓ、ＮＲ１、ＮＲ２Ｂ、
ＰＳＤ−９５、ＥＲＫ、ＭＥＫ(Transduction Laboratories)；ｐａｎＲａｓ(On
cogene)；ｐｈｏｓｐｈｏＭＡＰＫ、ｐｈｏｓｐｈｏＭＥＫ(New England BioLab
s)。
【０３２２】 形態学 マウスを心臓を介して固定されたマウスを、ヘパリン処置した生理食塩水、続
いて０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の２％パラホルムアル
デヒド、２．５％グルタルアルデヒドで灌流した。脳を取り出し、そしてさらに
２時間固定液中に置いた。７０μｍ冠状切片を振動するミクロトーム(Vibratome
, Lancer)を使用して海馬の前側部分を介して採取した。３連続の切片ごとに、
１つをＥＭプロセシングのために、そして残りをゴルジ含浸のために採取した。
切片を脱水し、そして樹脂中にマウントし、その後光学顕微鏡において観察した
。背側ＣＡ１の一貫した領域を再切片化し、そして電子顕微鏡(Philips CM12)に
おいて観察した(Morrison, B. M.ら, J Comp Neurol 395, 523〜34, 1998; Bola
m J. P., 1992, 光学および電子顕微鏡についての中枢神経系組織の調製。 Exper
imental Neuroanatomy A Practical Approach(Rickwood D., Hames B. D.編), 1
, 第1〜29頁, Oxford University Press, IRL Press, New York)。放射状層を試
験し、および最初の２０個の明らかに規定される非対称性の軸索脊椎シナプスが
撮影された。Ｘ-ｇａｌ染色：新鮮な脳を、５ｍｍの矢状切片に切開し、１時間
４℃にて０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の１％ ホルムア
ルデヒド、０．０１％ グルタルアルデヒドに固定化し、次いでＸ-ｇａｌ（５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル-β―ガラクトシダーゼ）（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）（Ｍｉｇａｕｄら、前出）について一晩染色した。免疫蛍光染色：脳
組織を、６時間、１０％緩衝化ホルマリン中で固定化し、脱水し、次いでワック
ス包埋した。８μｍ冠状切片をミクロトーム上で切断した。免疫蛍光染色、マウ
ントおよびカバースリップ（Morrisonら、前出）について標準的な手順に従った
。１次抗体は以下のようであった：抗シナプトフィシン ｍＡｂ（１／１００；
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）；ＭＡＰ２Ｂ 、ｍＡｂ（１／１００；Ｔｒａｎｓｄｕ
ｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ）。２次抗体は以下のようであった：Ｃｙ３結合抗体（１
／２００；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）。
【０３２３】 電気生理学 海馬切片（４００μｍの厚さ）を、標準的な方法を使用して調製し、そして１
２４ｍＭ ＮａＣｌ、４．４ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ Ｎａ２ＨＣＯ３、１ｍＭ
ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ ＣａＣｌ２、および１０
ｍＭ グルコースからなる加温された（３０℃）、酸化された（９５％Ｏ２／５
％ＣＯ２）人工的な脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で、一定速度（１〜３ｍＬ／分）にて
灌流された接触面型記録チャンバー中に維持した。ＡＣＳＦで充填された低い抵
抗性のガラス微小電極を、海馬ＣＡ１領域の放射状層中に配置して、双極性のニ
クロムワイア刺激電極を介して５０秒毎に１回、Ｓｃｈａｆｆｅｒ 側枝／交連
線維に送達されるシナプス前刺激パルスによって誘起される場興奮性シナプス後
ポテンシャル（ｆＥＰＳＰ）を記録した。各実験の開始時に、シナプス前繊維刺
激の強度を強力な強度刺激によって誘起され得る最大ｆＥＰＳＰ増幅の約半分で
あったｆＥＰＳＰを誘起するように調節した。高頻度刺激で誘導されるＬＴＰは
、１０秒の連続内間隔を伴って送達される２連続の１００Ｈｚ刺激（１秒の持続
時間）を使用して誘発された。ＬＴＰの飽和レベルを誘発するために、本発明者
らは６の1秒長連続の１００Ｈｚ刺激を、５分間の連続間隔で送達した。静電的
な比較（非対合性ｔ検定、２試行、Ｎ＝動物の数）について、本発明者らは、第
１の高頻度の刺激の連続の５５〜６０分後、または低頻度の刺激の連続の４０〜
４５分後に存在する電位の平均量を比較した。全細胞電流クランプ記録を、シナ
プス後脱分極化と対にされる、低い頻度のシナプス前線維刺激によるＬＴＰの誘
導を研究するために使用した。これらの実験において、ＣＡ３領域が除去された
スライスを、上昇されたレベルのＣａＣｌ２、およびＭｇＳＯ４（各４ｍＭ）、
低レベルのＫＣｌ（２．２ｍＭ）、および１００μＭ ピクロトキシンを含有す
る改変されたＡＣＳＦ中に浴した。０．０５Ｈｚシナプス前線維刺激によって誘
起されるＥＰＳＰを、１２２．５ｍＭ Ｃｓ-グルコン酸、１７．５ｍＭ Ｃｓ
Ｃｌ、１０ｍＭ ＴＥＡ-Ｃｌ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、２ｍＭ Ｍｇ-ＡＴＰ、および０．３ｍＭ ＧＴＰ（ｐＨ７．２）を含有する
溶液で充填された低い抵抗性（２〜５Ｍｏｈｍ）のパッチ−クランプ電極を使用
して、個々のＣＡ１錐体細胞から記録した。定電流注入を使用して、細胞を−８
０と−８５ｍＶとの間に過分極し、そして５０ミリ秒長の０．１ｎＡパルスの過
分極化電流を、ＥＰＳＰの各誘起の１５０ミリ秒後に注入され、実験を通じてイ
ンプットおよび接触抵抗性をモニターした。シナプス前線維刺激の強度は、５と
１０ｍＶ増幅との間でＥＰＳＰを誘起するように設定された。ベースラインを記
録する１０分間の期間後、ＬＴＰを、シナプス後細胞を、記録電極を介して注入
される電流を使用して、およびこの脱分極化を０ｍＶ近くに脱分極化し、そして
２Ｈｚにて送達される１００シナプス前線維刺激パルスと対にすることによって
誘導した。不対のｔ検定（２試行）を、野生型および変異体動物からの細胞にお
いて対合後２５〜３０分間誘導されるＬＴＰの平均量を比較するために使用した
。全細胞電圧クランプ記録を、シナプス後膜電位の範囲を横切る興奮性シナプス
後電位（ＥＰＳＣ）のＮＭＤＡ受容体媒介性成分を試験するために使用した。こ
れらの実験において、切片は上記の改変されたＡＣＳＦ中で浴され、ＣＡ１錐体
細胞が、Ｃｓグルコール酸ベースの電極充填液、または１２０ｍＭ ＣｓＭｅＳ
Ｏ３、20ｍＭ ＣｓＣｌ、８ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ Ｍｇ-ＡＴＰ、および０．３ｍＭ ＧＴＰ（ｐＨ＝７．
２）を含有する溶液のいずれかで充填されたパッチ-クランプ電極（２〜４Ｍｏ
ｈｍ、１４〜２２Ｍｏｈｍの範囲の接近抵抗性）を使用して電圧をクランプ化さ
れた。類似の結果が、両方の内部溶液で得られ、および結果が合わされた。ＥＰ
ＳＣのＡＭＰＡおよびＮＭＤＡ受容体媒介性成分を、ＥＰＳＣの開始後それぞれ
、５および５０ミリ秒後に測定されたＥＰＳＣの増幅から見積もった、全ての実
験および初期のデータ解析は、３Ｈ-Ｒａｓ−／−変異体マウスに対して行われ
た以外は盲目的に行われた。これらの実験からの結果は、盲目的な様式でこれら
の動物に対して行われたさらなる実験から異ならず、それゆえ結果が合わされた
。全ての値は、平均±ＳＥＭとして報告される。
【０３２４】 挙動 本発明者らは、オープンフィールド水迷路（直径２ｍ、不透明な水、２５±１
℃、自動化泳路モニター）を使用した。合図課題において、マウスを円筒系合図
でマークされたランダムに配置した台座位置に対して訓練した（３日間、１日当
たり４試行；３０ｃｍ台座直径；余分な迷路合図を排除するためにプールの周り
にカーテンが引かれた；最大試行持続時間は９０秒であった；試行間の間隔（Ｉ
ＴＩ）、１０分間）。空間的訓練について、本発明者らは、余分な迷路合図が可
視できる隠された台座を使用した（５日間、１日当たり４試行、３０ｃｍ台座直
径；台座／プール面積は１／４４であった；３０秒が各試行の終わりに台座に対
して費やされた；最大試行持続時間９０秒、ＩＴＩ １０分間）。移動試験１を
、以前の訓練試行の１０分後に行い、マウスを６０秒間プールに配置した（台座
なし；開始部位は各個々の動物について使用された試行区画がなんであれ反対で
あった）。移動試験試行の２つの測定が算定された：１）プールの標的区画にお
いて費やされた時間のパーセント、および２）台座なしの面積（半径＝１５ｃｍ
）に対応する地帯において費やされた時間、全ての４つの可能な地帯において費
やされた全時間のパーセントとして表される（図１６ｄ、ｆを参照のこと）。よ
り小さな隠された台座（２０ｃｍ直径；台座面積／プール面積は１／１００であ
った）を使用して、再度余分な迷路合図を可視化して、動物が２０秒未満で各試
行を行う２連続日を完了するまで、または３２試行が完了するまで、基準に対す
る試行が包含された。基準に達した際、および以前の訓練試行から１０分後、個
々のマウスを６０秒間プールに配置した（台座なし、移動試験２）。この訓練プ
ロトコルは、ＰＳＤ−９５−／−マウスについて使用されたプロトコル（Ｍｉｇ
ａｕｄら、前出）と同一であり、従ってＰＳＤ−９５−／−およびＳｙｎＧＡＰ−／＋ 変異体マウスの行動の比較を可能にする。２つの複製が、この点を試験す
ることを完了した（ＳｙｎＧＡＰ−／＋全ｎ＝２１；野生型全ｎ＝２１）。最初
の複製のみが、以下のような保持試験を受けた（ＳｙｎＧＡＰ−／＋ｎ＝１２；
野生型ｎ＝１２）。２つのさらなる移動試験、または保持試験が、マウスが基準
を達した７日間、および４５日間後に行われ、第２の移動試験を完了した。再度
、マウスは６０秒間プール中に配置された（台座なし、それぞれ移動試験３およ
び４）。
【０３２５】 ＜結果＞ ＳｙｎＧＡＰおよびＨ−Ｒａｓをコードするマウス遺伝子が、クローン化され
、特徴づけされ、ノックアウト標的化ベクターが構築され（図１２ａ、ｂ）、そ
して変異体マウスが作製された。雄性および雌性ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスは、
正常であるようであり、発作、振戦、運動失調、または他の神経学的異常の徴候
を何ら示さず、およびこれらは繁殖性であった。ＳｙｎＧＡＰ−／＋交雑からの
３週齢の仔の遺伝子型は、生存するホモ接合体ＳｙｎＧＡＰ−／−動物を示さな
かった。生まれた５４３匹の仔のうち、３２５匹が離乳され、そのうちの１２８
匹が野生型であり、および１９７匹がＳｙｎＧＡＰ−／＋であった（χ２＝８．
４１７、Ｐ＜０．００１）。８０匹の新生仔が、遺伝子型を決定され、そして変
異の正常なメンデル伝達を示し（２３野生型、３９ＳｙｎＧＡＰ−／＋、１８Ｓ
ｙｎＧＡＰ−／−；χ２＝０．７１４、Ｐ＞０．０５）、ＳｙｎＧＡＰが出世以
後の生存能に必要不可欠であることを示す。全てのＳｙｎＧＡＰ−／−仔は、誕
生し、および食餌し、そして全体的な解剖学的異常性を何も示さなかったが、４
８時間以内にそれらは死亡した。対照的に、Ｈ−Ｒａｓ−／＋交雑は、予期され
るメンデル比率にてＨ−Ｒａｓ−／−子孫を生成した（離乳時に３２３匹の仔、
９３匹の野生型、１５２匹のＨ−Ｒａｓ−／＋、７９匹のＨ−Ｒａｓ−／−、χ２ ＝０．２９３、Ｐ＜0.０５）。これらの子孫は繁殖性であり、および神経学的
異常の徴候を何ら示さなかった。
【０３２６】 ＳｙｎＧＡＰのニューロン発現パターンは知られておらず、およびＰＳＤ−９
５に類似して（Ｍｉｇａｕｄら、前出）、ＳｙｎＧＡＰ−／＋脳のＸ-ｇａｌ染
色は、海馬ＣＡ１のニューロン、および歯状回および皮質において最も高い発現
を示し、そして線状体において最も低い発現を示した（図１２ｃ）。対照的に、
Ｈ−Ｒａｓはほとんどの脳領域において広範に発現された（図１２ｃ）。タンパ
ク質発現の破壊は、海馬抽出物の免疫ブロッティングを使用して確認された（図
１２ｄ）。ＳｙｎＧＡＰレベルは、両方のアミノ及びカルボキシル末端抗体を使
用して野生型抗体と比較して、ＳｙｎＧＡＰ−／＋において減少された。短縮タ
ンパク質は、これらの抗体を使用して、または遺伝子座に挿入されたＨＡタグに
対する抗体を用いてなんら検出されなかった。Ｈ−Ｒａｓの免疫ブロッティング
は、Ｈ−Ｒａｓ-/-マウスからの海馬抽出物において検出可能なＨ−Ｒａｓをな
んら示さなかった。本発明者らは、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスの海馬抽出物にお
ける２つの他の哺乳動物のＧＡＰタンパク質 ニューロフィブロミン（Ｎｅｕｒ
ｏｆｉｂｒｏｍｉｎ）−１（ＮＦ１）およびｐ１２０ＲａｓＧＡＰによる補完に
ついて試験し、そして野生型レベルを超える増加は何らないことを観察した（図
１２ｄ）。本発明者は全てのＲａｓ情報を検出するＰａｎ-Ｒａｓ抗体を使用し
、およびＨ-Ｒａｓ変異体マウスにおける全Ｒａｓレベルの減少を観察した。最
後に、本発明者らは、ＳｙｎＧＡＰ−／＋およびＨ-Ｒａｓ−／−変異体マウス
におけるＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＰＳＤ−９５の発現のレベルを試験し、
そして野生型レベルからの変化がなんらないことを観察した（図１２ｄ）。
【０３２７】 脳におけるＳｙｎＧＡＰおよびＨ−Ｒａｓの役割を探索するために、本発明者
らは、成熟（６〜８週齢）ＳｙｎＧＡＰ−／＋およびＨ-Ｒａｓ−／−マウスに
おいて、光学および電子顕微鏡レベルにて神経解剖学を試験した（図１３）。Ｓ
ｙｎＧＡＰ−／＋およびＨ-Ｒａｓ−／−マウスの脳においてＮｉｓｓｌ染色を
使用して見出される全体的な検出可能な異常はなんらなかった。ＳｙｎＧＡＰお
よびＨ−ＲＡＳはともに海馬のＣＡ１領域において高度に発現された（図１２ｃ
）。この領域において、Ｎｉｓｓｌ染色の強度および分布、ならびにシナプス末
端マーカーのシナプトフィシンの分布、および樹状突起マーカーのＭＡＰ２の分
布が、ＳｙｎＧＡＰ−／＋およびＨ-Ｒａｓ−／−、および野生型マウスにおい
て同じであった。樹状突起構造はさらに、ゴルジ染色および電子顕微鏡を使用し
て観察され、樹状突起分岐、スピン分布、および非対称性シナプス形態学を示し
、これらは全て正常であった。本発明者らは、個々のＥ１８．５胚から１次ニュ
ーロン培養物を調製し、そしてシナプスベシクルタンパク質のシナプトフィシン
および樹状突起タンパク質のＭＡＰ２での免疫ブロッティングによって示される
ように、神経突起を伸長され、および形態学的シナプスを形成されたＳｙｎＧＡ
Ｐ−／−マウスからのニューロンが見出され、これは野生型培養物から区別でき
なかった。ＳｙｎＧＡＰ−／−マウス間のシナプス伝達についての電気生理学的
な証拠が、ミニチュアシナプス電流を記録するための全細胞パッチクランピング
（ｍＥＰＳＣ）を使用して得られ、そしてグルタミン酸作動性応答の典型的な動
力学を示した（データ示されず）。これらのデータは、インビトロでＳｙｎＧＡ
Ｐがシナプス形成およびシナプス伝達に必須ではないこと示す。これらのデータ
を合わせて、ＳｙｎＧＡＰがおよびＨ−Ｒａｓがシナプス形成に必須ではないこ
とを示す。
【０３２８】 ＳｙｎＧＡＰ変異体マウスにおけるシナプス可塑性 本発明者らは次に、海馬のＣＡ１領域におけるシナプス伝達および可塑性にお
けるＳｙｎＧＡＰの役割を試験した。通常の実験条件下で、電気的に記録された
場興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）は、ＡＭＰＡ型グルタミン受容体によっ
て優先的に媒介され、本発明者らは、強い強度のシナプス前繊維刺激を使用して
記録され得る最大ｆＥＰＳＰ増幅における差異をなんら検出しなかった（最大ｆ
ＥＰＳＰは、野生型切片において８．４±０．７ｍＶ、およびＳｙｎＧＡＰ−／ ＋ マウスにおいて０．３±０．５ｍＶであった、それぞれについてＮ＝２３動物
）。さらに、最大増幅の２分の１であったｆＥＰＳＰを誘起したシナプス前繊維
刺激強度を使用して測定されたｆＥＰＳＰ勾配に対する線維連発増幅の比率が、
ＳｙｎＧＡＰ−／＋および野生型マウスからの切片において類似であった（比率
は野生型について０．２±０．０２、およびＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスについて
０．２±０．０３、それぞれについてＮ＝１５動物）。これは、等価なシナプス
後応答を誘起するために必要とされるシナプス前線維の数が、野生型とＳｙｎＧ
ＡＰ−／＋マウスとの間で類似であることを示唆する。本発明者らはまた、野生
型およびＳｙｎＧＡＰ−／＋切片において錐体細胞から記録された興奮性シナプ
ス後電流（ＥＰＳＣ）のＮＭＤＡ受容体成分における差異をなんら観察しなかっ
た（図１４ａ）。最後に、２５、５０、１００、および２００ミリ秒のパルス間
間隔で送達されたシナプス前線維刺激の対は、野生型およびＳｙｎＧＡＰ−／＋ マウスからの切片において対にされたパルス促進のほとんど同一の量を誘起した
（データ示さず）。従って本発明者らは、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスにおいて、
ＮＭＤＡ受容体チャネル機能を含む正常なシナプス生理学のいくつかの局面にお
ける変化についての証拠をなんら見出さなかった。
【０３２９】 シナプス可塑性のＮＭＤＡ受容体依存性形態がＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスにお
いて変化され得るか否かを試験するために、本発明者らは先ず、海馬ＣＡ１領域
の錐体細胞上でのＳｃｈａｆｆｅｒ側枝／交連線維シナプスでのシナプス強度に
対する短い連続の非常に高頻度のシナプス刺激の効果を調査した。図１４ｂにお
いて示されるように、１００Ｈｚ刺激の２回の１秒長の連続の６０分間後、シナ
プス伝達が、野生型マウスからの切片（Ｎ＝７）において８０％を超えて増強さ
れたが、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスからの切片において僅か５０％であった（Ｎ
＝７、野生型に比較してｐ＜０．０１）。非常に高頻度の刺激によって誘導され
るＬＴＰの量はまた、飽和レベルのＬＴＰを誘導するために６連続の非常に高頻
度の刺激が５分間ごとに１回送達された実験において、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウ
スからの切片において有意に減少された（ｐ＜０．００５）（図１４ｃ）。従っ
て、高頻度シナプス刺激は、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスからの切片において有意
に増強を誘導し、および１００Ｈｚ刺激によって誘導される増強の量は、野生型
切片において見られる増強に比較して非常に減少された。
【０３３０】 ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体切片におけるＬＴＰについて減少された容量を探索
するために、さらに本発明者らは、より低頻度の連続のシナプス刺激が、シナプ
ス強度における持続性の変化を誘導する能力を試験した（図１４ｄ）。野生型マ
ウスからの切片においてＬＴＰ誘導についての閾値を下回った１Ｈｚ刺激の９０
０パルス連続（ｆＥＰＳＰは９８±３％のベースラインであった、１Ｈｚ刺激の
４５分間後、Ｎ＝５）はまた、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスからの切片におけるシ
ナプス強度に対してほとんど持続する効果を有しなかった（ｆＥＰＳＰはベース
ラインの９４±３％であった、Ｎ＝９）、同様に、５Ｈｚで送達されたシナプス
刺激の９００パルスは、野生型マウスから（ｆＥＰＳＰはベースラインの１３５
±９％に増強された、Ｎ＝５）、およびＳｙｎＧＡＰ−／＋マウス（ｆＥＰＳＰ
はベースラインの１１７±５％であった、Ｎ＝９、野生型から有意に異ならない
、ｐ＝０．０７）の切片において少量の増強のみを誘導した。より高い頻度（１
０および２０Ｈｚ）にて送達された場合、シナプス刺激の９００パルスの連続は
、野生型マウスからの切片においてより大きなＬＴＰを誘導した（それぞれ、ｆ
ＥＰＳＰはベースラインの、１５３±５％、Ｎ＝５、および１４１±４％、Ｎ＝
７に増強された）。対照的に、これらの刺激プロトコルは、ＳｙｎＧＡＰ−／＋ マウスからの切片におけるシナプス伝達に対して相対的にほとんど効果を有しな
かった（１０Ｈｚ刺激後、ｆＥＰＳＰはベースラインの１１６±２％に増強され
た、Ｎ＝７、野生型に比較してｐ＜０．００１、および２０Ｈｚ刺激後、ベース
ラインの１２３±７％であり、Ｎ＝７、野生型に比較してｐ＜０．０５であった
）。これらの実験においてＬＴＰを誘導するために使用されたシナプス刺激の連
続の間に誘起されたシナプス後応答は、野生型およびＳｙｎＧＡＰ−／＋切片に
おいて類似であり、ＳｙｎＧＡＰ−／＋において観察されるＬＴＰ欠損が、シナ
プス前機能における変化に起因しないことを示す（データ示されず）ことを示唆
する。シナプス後興奮性および／または阻害性シナプス伝達における変化が、Ｓ
ｙｎＧＡＰ−／＋変異体マウスにおいて観察されるＬＴＰにおける減少に寄与す
るか否かを調査するために、本発明者らは、細胞外溶液中にピクロトキシン（１
００μＭ）を含むことによって阻害性シナプス伝達をブロックし、そして低頻度
（２Ｈｚ）シナプス前線維刺激と、細胞内記録電極を介して注入される電流によ
って生成されるシナプス後細胞の脱分極化とを対にすることによってＬＴＰの誘
導を試験した（図１４ｅ）。
【０３３１】 この対合プロトコルは、野生型およびＳｙｎＧＡＰ−／＋細胞の両方において
ＬＴＰを誘導したが、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスからの錐体細胞において誘導さ
れる増強の平均量は、野生型動物からの細胞において観察される量よりも有意に
少なかった（ｐ＜０．００１）（図１４ｅ、ｆ）。これは、ＳｙｎＧＡＰ−／＋ マウスにおいて観察されたＬＴＰ欠損が、シナプス後ＣＡ１錐体細胞の阻害性シ
ナプス伝達または興奮性における変化に起因しないことを示す。さらに、ＬＴＰ
は実験的に課されるシナプス後脱分極化と対にされて低頻度シナプス刺激による
これらの実験において誘導されたので、これらの知見は、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マ
ウスにおいて観察されたＬＴＰ欠損が、ＬＴＰを誘導する連続のシナプス刺激の
間に伝達因子放出を変化し得る、ＳｙｎＧＡＰ−／＋切片におけるシナプス伝達
のシナプス前変化から生じる減少されたシナプス後脱分極化に起因しないことを
示す。合わせてこれらのデータは、ＳｙｎＧＡＰの生理学的機能は、ＬＴＰを増
強するために必要であるＮＭＤＡＲに対する経路を結びつけることであることを
示す（図１７）。
【０３３２】 ＳｙｎＧＡＰおよびＰＳＤ−９５経路の遺伝子調査 ＳｙｎＧＡＰおよびＰＳＤ−９５はともにＮＭＤＡ依存性可塑性について必要
とされるので、本発明者らは、経路内におけるそれらの関係を試験するために遺
伝道具を使用した。１つの可能性は、ＮＭＤＡ受容体からＰＳＤ−９５からＳｙ
ｎＧＡＰに導くシグナル伝達経路である。第２の可能性は、第１の筋書きにおけ
るように、ＳｙｎＧＡＰがＰＳＤ−９５の下流ではないが、ＮＭＤＡＲの別々の
平行な経路の下流にあることである。これらの可能性を区別し得る遺伝子試験は
、ＳｙｎＧＡＰ−／＋／ＰＳＤ−９５−／−二重変異体において、ＬＴＰを試験
することである。これらが平行な経路において区別される場合、ＬＴＰの予測さ
れるマグニチュードは、ＰＳＤ−９５−／−における増強されたＬＴＰと、Ｓｙ
ｎＧＡＰ−／＋変異体における減少されたＬＴＰとの間の中間である。あるいは
、ＰＳＤ−９５がＳｙｎＧＡＰの上流である場合、二重変異体におけるＬＴＰの
マグニチュードは、ＰＳＤ−９５−／−変異体において見られるものと類似する
べきである。これらの実験において、本発明者らは、野生型切片において強いが
、非飽和であるレベルのＬＴＰを誘導する短い連続の５Ｈｚ刺激（１５０パルス
）を使用して、ＬＴＰを誘導した。図１５ａにおいて見られるように、ＳｙｎＧ
ＡＰ−／＋／ＰＳＤ−９５−／−変異体からの切片において５Ｈｚ刺激によって
誘導される増強の量は、ＰＳＤ−９５−／−マウスにおいて見られる量と同一で
あり、ＮＭＤＡからＰＳＤ−９５からＳｙｎＧＡＰへのシグナル伝達経路が存在
するモデルを示唆する。
【０３３３】 ＳｙｎＧＡＰ−／＋／ＰＳＤ−９５−／−におけるＬＴＰ表現型は、ＮＭＤＡ
ＲからＰＳＤ−９５からＳｙｎＧＡＰへの経路から導かれる経路を結びつけるが
、これはまた興味深い逆説を生じる。単一の連続経路は単一変異体のそれぞれに
ついて類似の表現型を有するが、ＰＳＤ−９５−／−およびＳｙｎＧＡＰ−／＋ マウスは反対のＬＴＰ表現型を有する。これは、別のシグナル伝達経路の存在を
示す。ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスにおける減少されたＬＴＰは、ＰＳＤ−９５関
連性タンパク質ＳｙｎＧＡＰが通常はＬＴＰを増強する経路にあることを示すが
、ＰＳＤ−９５−／−変異体において観察された増強されたＬＴＰはまた、ＰＳ
Ｄ−９５は通常はＬＴＰを抑制する経路にあることを示す。これらの経路の両方
がＰＳＤ−９５の遺伝的に下流にあるので、最も簡単な説明は、ＳｙｎＧＡＰが
１つの異なる経路を調節するか否か、およびＰＳＤ−９５によってまた調節され
るいくつかの他の経路があるか否かであった（図１７）。これらの可能性を取り
組むために、ＳｙｎＧＡＰの下流の分子事象をさらに特徴づけする必要がある。
【０３３４】 ＳｙｎＧＡＰはＭＡＰＫに対して経路を調節する ＳｙｎＧＡＰのＧＴＰアーゼ機能は、不活性なＧＤＰ結合形態へのＲａｓの活
性化ＧＴＰ結合形態の変換を触媒することがインビトロで示された（Ｋｉｍら、
前出；Ｃｈｅｎら、前出）。Ｒａｓの活性化ＧＴＰ結合形態はＲａｆを含むエフ
ェクタータンパク質を結合し、これは次いでＭＥＫをリン酸化および活性化し、
これは次いでＭＡＰＫをリン酸化および活性化するので(Impeyら, Neuron 24, 1
1〜14, 1999)、ＳｙｎＧＡＰはこのＭＡＰＫ経路の調節因子であり得ることが予
測された。このモデルは、減少されたレベルのＳｙｎＧＡＰを示す（図１２ｄ）
ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体において、Ｒａｓ活性が増強され、そしてｒａｆ、Ｍ
ＥＫ、およびＭＡＰが活性化されることを予測した。この仮説を試験するために
、本発明者らは海馬抽出物を、ＭＥＫおよびＭＡＰＫのリン酸化された活性化形
態に対する抗体で免疫ブロットした（図１５ｂ）。ＳｙｎＧＡＰ−／＋抽出物に
おいて、ＭＥＫおよびＭＡＰＫのリン酸化された活性化形態のレベルが明らかに
増加されたが、これらのタンパク質の全レベルは変化しなかった。ｃＲａｆタン
パク質のより高いレベルがまた、その活性な補充を伴って観察された（データ示
されず）。これらのデータは、ＳｙｎＧＡＰが、多タンパク質複合体の成分であ
るＲａｓ-ＭＡＰＫ経路活性を調節するという証拠を提供する。本発明者らはこ
こで、ＳｙｎＧＡＰからＭＡＰＫへの回路が、ＰＳＤ−９５の下流であることを
結論することに、上記のモデルを拡張し得る（図１７）。
【０３３５】 ＰＳＤ−９５はＳｙｎＧＡＰ-ＭＡＰＫ経路およびＭＡＰＫ非依存性経路をＮ
ＭＤＡＲに結びつける ＬＴＰにおけるＭＡＰＫ経路の役割は、ＭＥＫのインヒビターがＬＴＰ誘導を
抑制する(Selcher, J.C.ら, Learn Mem 6, 478〜90 1999;Impley, S.ら, Neuron
23, 11〜4 1999; Brenner, S., 1973, Br Med Bull 29, 269〜71)が、ＮＭＤＡ
Ｒ活性化がＭＡＰＫリン酸化を増強する(Bading, H. & Greenberg, M. E. Scien
ce 253, 912〜4, 1991)ので、かなり興味深い。本発明者らのデータは、Ｓｙｎ
ＧＡＰからＭＡＰＫ経路がＰＳＤ−９５の下流であり、およびＰＳＤ−９５の下
流に第２の経路があるというモデルを支持する。これらの２つの経路の役割は異
なるようである（ＬＴＰを増強するか、または抑制するかのいずれか）ので、こ
れはＰＳＤ−９５からの第２の経路がＭＡＰＫ非依存性である可能性を生じる。
より具体的には、本発明者らは、ＰＳＤ９５−／−変異体において見られたＬＴ
Ｐの増強は、ＭＥＫインヒビターに感受性でないこと、ＭＥＫおよびＭＡＰＫリ
ン酸化が増加されないかもしれないことを予測し得た。以前に報告されるように
(Winder, D. G.ら, Neuron 24, 715〜216, 1999; Moser, E.ら, J Neurosci 13,
3916〜25, 1993)、ＭＥＫインヒビターＵ０１２６（２０μＭ）は、野生型切片
において短い連続の５Ｈｚ刺激によってＬＴＰ誘導を強力に抑制し（図１５ｃ）
、ＭＡＰＫ活性化が通常はシナプス刺激のこのパターンによるＬＴＰの誘導のた
めに必要とされることを示す。対照的に、Ｕ０１２６は、ＰＳＤ−９５変異体マ
ウス切片における５Ｈｚ刺激によるＬＴＰ誘導に対してなんの効果も示さず（図
１５ｄ）、ＰＳＤ−９５変異体切片におけるＬＴＰの誘導がＭＡＰＫ非依存性で
あることを示唆する。さらに、リン酸化されたＭＥＫおよびＭＡＰＫのレベルは
、ＰＳＤ−９５変異体マウスにおいて野生型のレベルを上回って上昇されなかっ
た（図１５ｆ）。これらのデータは、ＰＳＤ−９５がＭＡＰＫ非依存性経路およ
びＳｙｎＧＡＰ-ＭＡＰＫ経路の上流であるというモデルを支持する（図１７）
。
【０３３６】 ＳｙｎＧＡＰシグナル伝達におけるＨ−Ｒａｓのインビボでの役割 Ｈ−ＲａｓおよびＳｙｎＧＡＰ変異体マウスの利用可能性は、本発明者らがＨ
-ＲａｓがインビボでＳｙｎＧＡＰシグナル伝達に関与されるか否か試験するこ
とを可能にする。ＳｙｎＧＡＰがＨ-ＲａｓのＧＴＰ加水分解を加速したことを
示すインビトロ実験(Kimら、前出; Chenら、前出)に基づいて、ＳｙｎＧＡＰ−／
＋マウスにおける減少されたＬＴＰが、増加されたＨ−Ｒａｓ活性から生じ得た
。同様に、増加されたＨ−Ｒａｓ活性は、ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体マウスにお
いて観察されるｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ活性化を駆動することが予測され得た
。これらの予測を試験するために、本発明者らはＳｙｎＧＡＰ−／＋／Ｈ−Ｒａ
ｓ−／−二重変異体を作製し、そしてＬＴＰまたはＭＥＫおよびＭＡＰＫ活性が
野生型レベルに回復されるか否かを調べた。高頻度のシナプス刺激によるＬＴＰ
の誘導は、Ｈ−Ｒａｓ−／−マウスにおいて増強されたことが報告されるが(Man
abe, T.ら, J Neurosci 20, 2504〜11, 2000)、本発明者らは、低頻度刺激プロ
トコルによって誘導されるＬＴＰの量が、Ｈ−Ｒａｓ−／−および野生型マウス
からの切片において類似したことを見出した（図１５ｅ）。野生型マウスに比較
して、有意に少ないＬＴＰが、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスにおいてこの５Ｈｚ刺
激プロトコルによって誘導された（ｐ＜０．０２、図１５ｅ）。さらに、５Ｈｚ
刺激誘導性ＬＴＰがまた、Ｈ−Ｒａｓ−／−変異体マウスにおいて見られるもの
に比較して、ＳｙｎＧＡＰ−／＋／Ｈ−Ｒａｓ−／−二重変異体において有意に
減少された（ｐ＜０．０５）（図１５ｅ）。これは、Ｈ−Ｒａｓがこれらの条件
下でＳｙｎＧＡＰの生理学的に重要なエフェクターではないことを示す。本発明
者らはまた、Ｈ−Ｒａｓ−／−およびＳｙｎＧＡＰ−／＋／Ｈ−Ｒａｓ−／−二
重変異体マウスからの抽出物を免疫ブロッティングすることによって、Ｈ−Ｒａ
ｓがＳｙｎＧＡＰ媒介性のＭＡＰ経路活性化に必要とされたか否かを試験した（
図１５ｂ）。Ｈ−Ｒａｓ−／−マウスにおけるＭＥＫおよびＭＡＰＫリン酸化の
レベルは、野生型と同じであった。対照的に、リン酸化されたＭＥＫおよびＭＡ
ＰＫレベルにおける明らかな増加が、ＳｙｎＧＡＰ−／＋／Ｈ−Ｒａｓ−／−二
重変異体マウスにおいてあり、ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体において観察されたレ
ベルに一致した。従って、Ｈ−ＲａｓがＬＴＰのＳｙｎＧＡＰ調節に必要とされ
ないことを示す本発明者らの結果のように、これらの結果はＨ−ＲａｓがＭＡＰ
Ｋ経路活性化のＳｙｎＧＡＰ調節における必須のエフェクターでないことを示す
。
【０３３７】 ＳｙｎＧＡＰは学習の速度を調節する ＮＭＤＡ受容体関連性タンパク質の複合体内のシナプス可塑性を制御する複数
のシグナル伝達経路の遺伝子欠損は、学習における受容体の関与の再試験を許容
する。ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体は、ＰＳＤ−９５−／−変異体マウス(Migaud
ら、前出)のように、ＮＭＤＡ受容体媒介性のシナプス可塑性における逆の変化に
もかかわらず、シナプスＮＭＤＡ受容体電流における検出可能な異常性をなんら
示さなかった。ＰＳＤ−９５−／−変異体マウスは、空間的学習課題の成績にお
いて重篤な障害を示す(Migaudら、前出)。ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体マウスは、
本発明者らがＰＳＤ−９５関連性のシグナル経路の１つに対するこのタンパク質
の寄与を調査することを可能にする。比較を与えるために、本発明者らは、ＰＳ
Ｄ−９５−／−変異体マウスの研究において使用されたプロトコルと同一の水迷
路訓練プロトコルを意図的に選択した。野生型（ｎ＝２１）およびヘテロ接合体
ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体（ｎ＝２１）の両方が、水迷路の合図および空間的バ
ージョンにおいて訓練され、実験者は遺伝子型について全く盲目であった。
【０３３８】 ＮＭＤＡ受容体非依存性合図試験において、野生型およびＳｙｎＧＡＰ−／＋ 変異体マウスの両方は可視できる合図によってマークされるランダムに配置され
台座に接近することを学習し、首尾よい試行を通じて経路長の等価な（Ｆ＜１）
および前進的な減少を伴った（図１６ａ）。ＮＭＤＡ受容体依存性の空間的課題
において、両方の群は、２０の試行の過程を通じて、経路長における減少を示し
（変異体Ｆ（１９、３８０）＝１．９１；ｐ＜０.０５；野生型：Ｆ（１９、３
８０）＝２．７４；ｐ＜０．００１）、ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体の泳路は野生
型の泳路（Ｆ（１、４０）＝６．７５；ｐ＜０．０５）よりも全体的に僅かに長
かった。次いで、全てのマウスは第１の移動試験に供された（台座が除去された
）。ＰＳＤ−９５−／−変異体における顕著な障害を示した四分円を学習するに
おける時間の従来の測定において（Migaudら、前出における図５ｄ）、ＳｙｎＧ
ＡＰ−／＋変異体と野生型との間の差異は接近したが、有意性に到達しなかった
（ｔ（４０）＝１．９８；０．１０＞ｐ＞０．０５）。しかし、全ての４つの可
能な台座配置における時間に比較した標的台座の周囲に集中された地帯において
費やされた時間の割合のより感度の高い測定を使用して(Moserら、前出)、Ｓｙｎ
ＧＡＰ−／＋変異体は、有意に少ない集中された泳ぎを示した（図１６ｃ；ｔ（
４０）＝３．０８；ｐ＜０．０５）ＰＳＤ−９５−／＋変異体が厳密な成績基準
に達するために空間的課題に対する過度の練習を与えられた場合、２／１２変異
体マウスのみが、９／９野生型に比較して成功した（番号１０；χ２＝１４．３
；ｐ＜０．００１）。対照的に、１１／２１ ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウス（２０
／２１野生型マウスと比較して）が、この基準を達成した。野生型よりも劣った
が（χ２＝９．９８；ｐ＜０．００５）、ＰＳＤ−９５−／−マウス（χ２＝５
．２２；ｐ＜０．０５）よりも有意により多くのＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスが基
準を達成した。この結果と一致して、基準を達成した後、即座に第２の移動試験
において試験された場合、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスは標的地帯において中程度
に集中された探索を示した（図１６ｃ）。この結果は、両方の移動試験において
偶然のままであったＰＳＤ−９５−／−変異体の成績と一致した（図１６ｅ）。
２つの変異体系統の比較は、、ＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスが、ＰＳＤ−９５−／ − マウスよりも有意に少なく障害され（Ｆ（１、３１）＝５．３１；ｐ＜０．０
５）、そして群Ｘ移動試験相互作用が得られ（Ｆ（１、３１）＝５．１０；ｐ＜
０．０５）：ＳｙｎＧＡＰ−／＋およびＰＳＤ−９５−／−マウスが移動試験１
において等しく悪く行ったが、移動試験２においてＳｙｎＧＡＰマウスは、ＰＳ
Ｄ−９５−／−マウスよりも有意に良好に行った（ｐ＜０．０５）ことを示した
。
【０３３９】 従って、代表的な泳路において定性的に示されたように（図１６ｄ）、Ｓｙｎ
ＧＡＰ−／＋マウスは、訓練において初期により拡散された探索によって特徴づ
けられた空間的学習のより遅延された速度を示した（移動試験１）が、これらは
、さらなる訓練後に台座に位置し得た（移動試験２）；ＰＳＤ−９５−／−マウ
スは、空間的訓練の全ての相を解して異常に探索した（図１６ｅ、ｆ；Ｍｉｇａ
ｕｄらからのデータの再分析）。これらの変異体について考察するための枠組み
が、図１６ｇにおいて示され、ここではＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスがコントロー
ル動物によって達成された学習の等価な漸近線を徐々に接近するが、ＰＳＤ−９
５−／−マウスは接近しなかった。
【０３４０】 それらの減少された学習の速度とは対照的に、試験されたＳｙｎＧＡＰ−／＋ 変異体のサブセット（ｎ＝１２）は、野生型（ｎ＝１２）に比較して忘却の正常
な速度を示した。標的地帯において費やされた時間（方法を参照のこと）は、移
動試験３（７日間の保持試験；変異体：５２．１０±８．１５％；野生型：６０
．６６±７．４３％）および移動試験４（４５日間の保持試験；変異体：３５．
３４±５．２１％；野生型：３６．７０±４．２１％）に対して両方の群におい
て類似であった。移動試験２、３、および４（すなわち、即時および長期間の両
方の保持試験）に対する成績のＡＮＯＶＡは、変異体と野生型との間で全体的な
群差異をなんら示さず（Ｆ＜１）、および群ｘ移動試験相互作用を示さず（Ｆ＜
１）、ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体が、最初は学習することが遅いが、障害されな
い長期間の記憶を有することを示す。予測されるように、有意な忘却が経時的に
観察されたが（Ｆ（２、４４）＝１２．４６；ｐ＜０．００１）、成績は、４５
日間の保持試験においてさえ偶然を上回ったままであった（ｔ（２３）＝３．３
６；ｐ＜０．００５）。この知見は、ＳｙｎＧＡＰが記憶をコードするための誘
導機構に寄与するが、経時的な記憶追跡の持続に寄与しないという意見と一致す
る。
【０３４１】 ＜考察＞ 本研究において、本発明者らは、実施例１において単離されたＮＭＤＡ受容体
に連結される２０００ｋＤａの細胞内シグナル伝達複合体の成分であるＳｙｎＧ
ＡＰ、Ｈ−Ｒａｓ、およびＰＳＤ−９５における変異を保有するマウスを試験し
た（図１７）。本発明者らは、ＳｙｎＧＡＰがＮＭＤＡＲ媒介性のシナプス可塑
性および学習に必須であるが、シナプスＮＡＤＡＲ機能に必要とされなかったこ
とを見出した。ＳｙｎＧＡＰは、また複合体の成分であるｒａｆから、ＭＥＫ、
ＭＡＰＫへの経路の重要なネガティブな調節因子であった。ＰＳＤ−９５は、Ｎ
ＭＤＡＲを直接的に結合し、２つの経路（第１はＳｙｎＧＡＰ-ＭＡＰＫ経路で
あり、第２はＭＡＰＫ非依存性経路である）に、ＮＭＤＡＲを連結することによ
って２方向性の可塑性誘導における重要な役割を果たす（図１７）。ＳｙｎＧＡ
Ｐ変異体マウスは学習のより遅延された獲得を示したが、これらは正常な記憶保
持および忘却の速度を示した。
【０３４２】 複合体内シグナル伝達経路によって制御されるＬＴＰ誘導 ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体および野生型マウスにおける興奮性シナプスは、ＬＴ
Ｐ誘導についての閾値を下回ったシナプス活性化のパターンに対して類似の応答
を示したが、有意に低い電位が、野生型切片におけるＬＴＰ誘導についての閾値
を超えるシナプス刺激の全てのパターンによって、ＳｙｎＧＡＰ−／＋変異体切
片において誘導された。このＳｙｎＧＡＰ−／＋マウスにおけるＬＴＰ欠損は、
基本のシナプス伝達およびＮＭＤＡ受容体機能における任意の明白な変化の不在
下で生じ、および阻害性シナプス伝達および／またはシナプス後興奮性における
電位の変化が、ＬＴＰ誘導に対してほとんど効果を有しないべきである実験条件
下で存在した。合わせて、これらの結果は、ＳｙｎＧＡＰがＬＴＰに関与される
下流のシグナル伝達経路にＮＭＤＡ受容体活性化を結びつける重要な役割を有す
ることを示唆する。
【０３４３】 以前の研究は、ＳｙｎＧＡＰがＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路、ＬＴＰおよび学習の両
方において重要な役割を有することが知られる経路(Impey, S.ら, Neuron 23, 1
1〜4, 1999において概説される)の活性化に細胞内カルシウムの増加を結びつけ
るように作用し得ることを示唆した（Kimら、前出; Chemら、前出）。従って、
ＰＳＤ−９５とのその関連性、および細胞内カルシウムにおける増加によるその
電位調節によって（そのＮ末端Ｃ２ドメインを介するか、またはカルシウム／カ
ルモジュリン依存性キナーゼＣａｍＫＩＩによるリン酸化後の活性における変化
のいずれか）、ＳｙｎＧＡＰは必須の関連性を提供し得、それによってＮＭＤＡ
受容体活性化は、ＭＡＰＫ経路の活性化を導く。単一および二重変異体マウスの
遺伝子解析は、ＰＳＤ−９５がＳｙｎＧＡＰの上流であるという見解を支持し、
これは生化学的および薬理学的研究と合わせて、経路：ＮＭＤＡＲ→ＰＳＤ−９
５→ＳｙｎＧＡＰ→ｒａｆ→ＭＥＫ→ＭＡＰＫを作成する。
【０３４４】 本発明者らは、この経路からＨ−Ｒａｓを排除した。なぜなら、Ｈ−Ｒａｓは
ＬＴＰまたはＭＥＫ／ＭＡＰＫ活性化におけるＳｙｎＧＡＰ媒介性の変化に必要
とされなかったからである。ＳｙｎＧＡＰからｒａｆ、ＭＥＫ、およびＭＡＰＫ
へのリンクは現在知られていないが、これは海馬において発現されることが知ら
れる別のＲａｓファミリーメンバー（(Manabeら、前出)および図１２）であるよ
うである。興味深いことに、高頻度刺激（１００Ｈｚ）によるＬＴＰの誘導はＨ
−Ｒａｓ変異体マウスにおいて増強される(Manabeら、前出)が本発明者らは低頻
度（５Ｈｚ）刺激誘導性のＬＴＰがこれらのマウスにおいて通常であることが見
出した。これは、ＬＴＰにおけるＨ−Ｒａｓ依存性シグナル伝達経路の関与が、
ＬＴＰを誘導するために使用されるシナプス刺激のパターン、海馬ＣＡ1領域に
おける興奮性シナプスにおけるプロテインキナーゼＡの役割を思い出させる現象
に非常に依存し得ることを示唆する(Thomas, M. J.ら, Neuron 17, 475〜82, 19
96); Blitzer, R. D.ら, Neuron 15, 1403〜14, 1995; Abel, T.ら, Cell 88, 6
15〜26, 1997)。
【０３４５】 ＳｙｎＧＡＰ-ＭＡＰＫ経路の正常な生理学的役割は、ＳｙｎＧＡＰ変異およ
びＭＥＫインヒビターでの研究によって示されるように、シナプス可塑性および
学習を調節することにあるようである。しかし、薬理学的アプローチを使用する
研究は、ＭＥＫを阻害することが、野生型切片においてＬＴＰを抑制することを
見出し、一方本発明者らはＳｙｎＧＡＰ変異体における活性化ＭＥＫおよびＭＡ
ＰＫの基本レベルの増加がまた、減少されたＬＴＰと関連されることを見出した
。１つの可能性は、ＭＡＰＫ経路活性化の基本レベルがＳｙｎＧＡＰ−／＋マウ
スにおいて増加されるが、ＬＴＰは損なわれないかもしれないということである
。なぜならＭＡＰＫ経路の活性化はＮＭＤＡ受容体活性化後もはや正確には調節
されないからである。あるいは、変異体におけるＭＡＰＫ経路の慢性的なアップ
レギュレーションは、ＬＴＰの誘導および／または発現において関与される下流
の標的のダウンレギュレーションを導き得る。明らかに、この逆説の解明はＬＴ
Ｐ誘導におけるＭＡＰＫシグナル伝達の役割を、特にＬＴＰに関与される下流標
的の同定に関してより良好に理解すること、ならびに変異体および野生型海馬に
おけるＮＭＤＡＲ活性化後のＭＡＰＫ活性化の定量的比較を必要とする。
【０３４６】 ＰＳＤ−９５は、ＳｙｎＧＡＰをＮＭＤＡＲに結びつける重要なアダプタータ
ンパク質として同定されたが、本発明者らの実験において見られたＰＳＤ−９５
およびＳｙｎＧＡＰ変異体マウスの劇的に異なる表現型は、ＰＳＤ−９５は、複
数のシグナル経路をＮＭＤＡＲに結びつける多機能性のアダプタータンパク質と
して最も作用するようであることを示す（図１７）。これらの経路は、ＭＡＰＫ
依存性成分（ここではＳｙｎＧＡＰ／ＰＳＤ−９５相互作用がＮＭＤＡＲをＭＡ
ＰＫ経路の活性化に結びつける）、および第２にＳｙｎＧＡＰ／ＭＡＰＫ非依存
性経路（ＰＳＤ−９５変異体において破壊される場合、ＬＴＰの劇的な促進を生
じる）に分けられ得る。この第２の経路を含むシグナル伝達因子は未だ同定され
ていないが、ＰＳＤ−９５変異体におけるＬＴＰの増強は、この経路が正常には
ＬＴＰの誘導を阻害または抑制するように作用することを示唆する。ＰＳＤ−９
５変異体において観察された増強されたＬＴＰがＭＥＫインヒビターによって抑
制されないという本発明者らの知見に基づいて、ＰＳＤ−９５における変異は、
これらの経路の両方を結び付けないようであり、増強されたＭＡＰＫ非依存性Ｌ
ＴＰを生じる。これはさらにＭＡＰＫ経路がそれ自身ＬＴＰの誘導に必要とされ
ないが、その代わりにＬＴＰ誘導におけるより調節性の役割を作用し得ることを
示唆する（またWatabe, A. M.ら, J Neurosci 20, 5924〜31, 2000およびWinder
, D. G.ら, Neuron 24, 715〜26, 1999を参照のこと）。
【０３４７】 ＬＴＰを増強するおよびＬＴＰを抑制する経路を相互作用する生理学的重要性
は、単一のシグナル伝達複合体内に同時に局在化されるのか。１つの考えられ得
る可能性は、これが、細胞内カルシウムにおける非常に局在化されたＮＭＤＡＲ
依存性増加の迅速な検出を許容し、そしてカルシウムのマグニチュードおよび／
または持続時間が、シナプス強度および神経可塑性の他の兆候における長期間の
変化を誘導することを可能にするシグナル伝達機構を提供することである。事実
、ＳｙｎＧＡＰおよびＰＳＤ−９５変異体マウスの本発明者らの研究からの結果
は、シナプスＮＭＤＡＲ電流に対してなんら効果を有しないＮＭＤＡ受容体シグ
ナル伝達複合体の組成の遺伝子操作が、それにもかかわらず、シナプスが特定の
頻度のシナプス活性化にどのように応答するかを強力に変化することを示してい
る。このことは、ＬＴＰの頻度依存性の特徴のいくつかの局面が、多タンパク質
複合体内に生じるシグナル伝達経路の作用および相互作用から生じることを示す
。
【０３４８】 複数のシグナル伝達機構が受容体に連結されるタンパク質複合体内で生じると
いう意見は、細胞生物学において十分に受容され、および大部分の受容体に拡張
される。これらとしては、増殖因子（チロシンキナーゼ）受容体、Ｔ細胞受容体
、およびより最近では、ショウジョウバエ光伝達に関与されるＴＲＰカルシウム
チャネルが挙げられる。ＴＲＰとアセンブリされた複合体は、「シグナルプレッ
クス(signalplex)」(Montell, C. Annu Rev Cell Dev Biol 15, 231〜68, 1999)
または「トランスジューシソーム(transducisome)」(Tsunoda, S.ら, J Nature
388, 243〜9, 1997)として知られ、複数のシグナル伝達酵素（ＰＫＣおよびホス
ホリパーゼＣ）および光活性化ＴＲＰチャネルを組織化するためにＰＤＺ含有タ
ンパク質ＩＮＡＤを必要とする。これらの成分の破壊は、多タンパク質複合体の
本発明者らの研究において観察された様式と類似の様式において変化された生理
学的応答を導く。シグナル伝達複合体の細胞質成分がイオンチャネルとの相互作
用の前にアセンブリされ得るという最近の証拠は(Tsunoda, S.ら, Neurosci 21,
150〜158, 2001)は、細胞内複合体が受容体ではなく重要なシグナル伝達機構で
あり得、および外部環境からのシグナルに対するその特異性は、特異的な受容体
の挿入によって得られるという可能性を生じる。この種類のモデルは、異なる神
経伝達因子受容体が、ＰＳＤ−９５および他の多タンパク質複合体アダプタータ
ンパク質を結合し得、そして異なる神経伝達物質によって駆動される異なるシナ
プスに対する可塑性応答を付与する異なる複合体の寄せ集めを生成するという見
解を伴う。シグナル伝達における役割に加えて、受容体複合体は、リガンド依存
性イオンチャネルの転換およびそれらの特性を調節するにおいて関与する。例え
ば、ＰＫＡはチャネル特性を調節するためにＮＭＤＡＲに補充され(Westphal, R
. S.ら, Science 285 93〜6, 1999)およびＡＭＰＡ受容体とのＮＳＦ相互作用の
破壊は、それらの表面発現を変化する(Nishimune, A.ら, Neuron 21, 87〜97, 1
998; Song, I.ら, Neuron 21, 393〜400, 1998)。
【０３４９】 学習およびＨｅｂｂ可塑性 別のニューロンによるあるニューロンの反復される点火がニューロン間の活性
化の効力において安定な増加を導き、およびこのプロセスは学習を強調するとい
うＨｅｂｂの仮説(Hebb, D. O. 挙動の組織化; 神経生理学的理論, Wiley, New
York, 1949)は、無脊椎動物および脊椎動物における多くの電気生理学的および
生理学的研究によって支持された(Bailey, C. H.ら, Adv Second Messenger Pho
sphoprotein Res 29, 529〜44, 1944; Martin, S. J.ら, Annu Rev Neurosci 23
, 649〜711, 2000において概説される)。哺乳動物の海馬、げっ歯類およびヒト
における空間的学習に必要とされる構造において、ＮＭＤＡＲチャネルの薬理学
的遮断は学習およびＬＴＰの両方を妨げる(Collingridge, G. L.ら, J Physiol(
Lond)334, 33〜46, 1983; Morris, R. G.ら, Nature 319, 774〜6, 1986)。正常
な学習およびシナプス可塑性に必要とされる複合体におけるより大きな数のタン
パク質は、複合体が、これらのシナプスにおけるＨｅｂｂ特性についての分子基
準を提供することを示す。しかし、ＳｙｎＧＡＰおよびＰＳＤ−９５変異体のＬ
ＴＰおよび空間的学習の表現型の比較は、Ｈｅｂｂモデルのいくつかの局面から
の離脱を示す。ＳｙｎＧＡＰ変異体マウスは、空間的学習の速度に対する効果を
伴って減少されたＬＴＰを示したが、最終的な漸近線に到達せず、一方、ＰＳＤ
−９５変異体はいくつかの障害された空間的学習を伴って、増強されたＬＴＰを
示した。従って、ＮＭＤＡＲに結合される２つの相互作用するタンパク質は、海
馬および中枢神経系における発現の類似のパターンを伴って、ＬＴＰと学習との
間の単純な相関を分離するようである。
【０３５０】 一方で、これは、複合体内のいくつかの経路が可塑性におけるより重要な役割
を果たすが、他の経路は主に、学習に関与するという可能性を生じ、または他方
で、複合体はＬＴＰの全体のマグニチュードよりも、空間的学習に関連されるシ
ナプス可塑性および／または異形成の他の特徴を制御し得る。例えば、複合体に
よって制御されるシグナル伝達事象は、シナプス活性の特異的なパターンがどの
ようにシナプス強度における持続的な変化に変換されるのかを支配するシナプス
の「役割」を生成するにおいて重要な役割（例えば、頻度感受性、ＥＰＳＰ／ス
パイクタイミングなど）を有し得、およびこれらのパラメータにおける変化は、
どのように十分な情報が学習の間に保存されるのかにより関連し得る。
【０３５１】 ＳｙｎＧＡＰおよびＰＳＤ−９５変異体マウスの両方は、空間的学習における
欠損を示す。この観察は、また学習障害を生じる多タンパク質複合体の成分にお
ける少なくとも１６個の他の遺伝子および薬理学的動揺で保持される。しかし、
この複合体が空間的記憶のコードに重要に関与されるという事実は、回顧のよう
なさらなる記憶プロセスにおける関与を必ずしも意味しない。ＰＳＤ−９５変異
体マウスにおいて観察される挙動障害の重篤性に起因して、別々の記憶プロセス
におけるこのタンパク質の役割を評価することが不可能であった。ＳｙｎＧＡＰ
マウスは、他方、野生型よりも学習することが遅かったが、最終的に台座配置を
コードし得た。それらの獲得欠損と対照的に、ＳｙｎＧＡＰマウスは、空間的情
報の正常な長期間の保持を示し、両方の変異体および野生型において等価な忘却
速度を伴った。それゆえ、ＳｙｎＧＡＰが空間的記憶の回顧において任意の重要
な役割を果たすことはなさそうである。この知見は、ＮＭＤＡ受容体の薬理学的
ブロックを含む以前の研究と一致する。ラットにおけるＡＰ５の投与は、以前に
学習された嗅覚区別の保持(Staubli, U.ら, Behav Neurosci 103, 54〜60, 1989
)、または水迷路試験(Morris, R. G., J Neurosci 9, 3040〜57, 1989; Steele,
R. J. & Morris, R. G., Hippocampus 9, 118〜36, 1999)に対して何の効果も
有しないが、新規な学習が、両方のタイプの課題において重篤に障害される。こ
れらようなデータは、ＮＭＤＡ受容体を含有する多タンパク質複合体が学習につ
いてサイレントである神経活性のパターンを検出し、次いでニューロンおよび回
路の状態をともに変化する細胞性変化（ＬＴＰ、ＬＴＤ、遺伝子転写など）を引
き起こすことを主に担うことを示す。情報のその後の読み出し−記憶の回顧-は
、複合体のさらなる活性を通常必要としないが、記憶再活性化は時折新規な学習
を含み得る(Nader, K.ら, Nature 406, 722〜6(2000))。
【０３５２】 ヒトおよびマウスにおいて、ニューロフィブロミン（ＮＦ−１）遺伝子の破壊
は、学習的欠陥を生じる(Ozonoff, S., Am J Med Genet 89, 45〜52, 1999; Sil
va, A. J.ら, Nat Genet 15, 281〜4, 1997)。ＮＦ−１はまた、ＧＡＰタンパク
質であり、およびＳｙｎＧＡＰに対して構造的類似性を共有する。本発明者らは
以前に、ＮＦ−１およびＳｙｎＧＡＰの両方が、多タンパク質複合体の成分であ
ることを報告し、およびＮＦ−１変異体が、この複合体におけるその機能を介し
て学習欠損を生じ得ることを示唆した。ＮＦ−１およびＳｙｎＧＡＰ変異体マウ
スの生理学的および生化学的特性の比較は、これらの２つのＧＡＰタンパク質の
機能における潜在的な重複を取り組むために必要である。
【０３５３】 結論すると、本研究は、ＰＳＤ−９５を介してＮＭＤＡＲに結び付けられる異
なるシグナル伝達経路が、シナプス可塑性および学習の生理学的特性を制御する
ことを示す。重要なことに、これらの経路はタンパク質の２０００ｋＤ複合体内
に含まれる。本発明者らのデータは、この複合体が、シグナル取り込み装置とし
て作用し、および学習の細胞性基準の基礎となるシグナルを保持することを示す
。
【０３５４】 実施例５：慢性疼痛挙動における多タンパク質複合体の役割の調査 ＜序論＞ 脊髄におけるグルタミン酸受容体は、体性感覚インプットのプロセスにおいて
重要な役割を果たす(L. Urban, S. W. Thompson, A. Dray, Trends Neurosci. 1
7, 432〜438, 1994)。特に、ＮＭＤＡ受容体は、反復性の急進性刺激または抹消
組織もしくは神経に対する傷害によって引き起こされる中心的な感作および疼痛
において関係される(T. J. Coderre, R. Melzack, Journal of Neuroscience 12
, 3665〜3670, 1992; S. R. Chaplan, A. B. Malmberg, T. L. Yaksh, Journal
of Pharmacology and Experimental Therapeutics 280, 829〜838, 1997; J. E.
Haley, A. Sullivan, A. Dickenson, Brain Research 518, 218〜226, 1990; C
. J. Woolf, M. Costigan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7723〜7730, 1
999)。神経障害性疼痛は、現在の鎮痛剤によって不十分に処置され(S. Arner, B
. A. Meyerson, Pain 33, 11〜23, 1988)、および求心および中枢神経の表現型
および機能における複数の変化を包含し(T. Hokfelt, X. Zhang, Z. Wiesenfeld
-Hallin, Trends Neurosci. 17, 22〜30, 1994; T. Dickinson, S. M. Fleetwoo
d-Walker, Trends Pharmacol. Sci. 20, 324〜329, 1999; D. J. Mayer, J. Mao
, J. Holt, D. D. Price, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7731〜7736, 19
99)、さらに他の慢性疼痛の状態におけるように、ＮＭＤＡ受容体は重要である
ようである(S. R. Chaplan, A. B. Malmberg, T. L. Yaksh, Journal of Pharma
cology and Experimental Therapeutics 280, 829〜838, 1997; M. Tal, G. J.
Bennett, Neuroscience Letters 151, 107〜110, 1993; J. Maoら, Brain Res.
605, 164〜168, 1993; T. R. Tolle, A. Berthele, W. Zieglgansberger, P. H.
Seeburg, W. Wisden, Journal of Neuroscience 13, 5009〜5028, 1993)。ＮＭ
ＤＡ受容体は２つの主なサブユニット、ＮＲ１およびＮＲ２から構成され、これ
は脊髄の後角を介して発現される(T. R. Tolle, A. Berthele, W. Zieglgansber
ger, P. H. Seeburg, W. Wisden, Journal of Neuroscience 13, 5009〜5028, 1
993; J. M. Luque, Z. Bleuel, P. Malherbe, J. G. Richards, Neuroscience 6
3, 629〜635, 1994)。ＮＲ１サブユニットは重要な機能的サブユニットであるが
、ＮＲ２サブユニットは細胞内アダプターおよび調節性タンパク質についてのド
ッキング部位を提供する(H. C. Kornau, L. T. Shenker, M. B. Kennedy, H. Se
eburg, Science 269, 1737〜1740, 1995; M. Niethammer, E. Kim, M. Sheng, J
ournal of Neuroscience 16, 2157〜2163, 1996)。
【０３５５】 ＮＲ２ Ｃ末端モチーフは、ＭＡＧＵＫファミリーのＰＤＺドメインアダプタ
ータンパク質によって標的化され（H. C. Kornau, L. T. Shenker, M. B. Kenne
dy, H. Seeburg, Science 269, 1737〜1740, 1995; M. Niethammer, E. Kim, M.
Sheng, Journal of Neuroscience 16; 2157〜2163, 1996；実施例１）、その最
も良好な特徴づけはＰＳＤ−９５である。具体的には、ＰＳＤ−９５の最初の２
つのＰＤＺドメインは、ＮＲ２サブユニットＣ末端の最後の４〜６アミノ酸残基
と相互作用することが示された。ＭＡＧＵＫタンパク質は、シナプス膜で受容体
をクラスター化し、そして下流経路に対するシグナル伝達のための橋として作用
することが考えられる(実施例1を参照のこと; M. Niethammer, E. Kim, M. Shen
g, Journal of Neuroscience 16, 2157〜2163, 1996; S. E. Craven & D. S. Br
edt, Cell 93, 495〜498, 1998)。ここで本発明者らは、神経障害性感作が、Ｎ
ＭＤＡ受容体機能のアダプター媒介性の機構に依存し得るという可能性を取り組
んだ。
【０３５６】 第２のＰＤＺドメイン以外を短縮された変異体ＰＳＤ−９５遺伝子を発現する
トランスジェニックマウス(M. Migaudら, Nature 396, 433〜439, 1998)を使用
して、本発明者らは、ＰＳＤ−９５が脊髄後角において発現されること、および
ＰＳＤ−９５変異体が、野生型コントロールにおいて見られるＮＭＤＡ受容体依
存性神経障害性疼痛挙動のほとんど完全な不在を示すことを示す。後角における
Ｃａ２＋上昇応答をモニターするためにＣａＭキナーゼＩＩの構成的活性を利用
して、本発明者らは、ＰＳＤ−９５変異体マウスがＮＭＤＡに対する正常な急性
応答を示すが、神経を傷害された野生型マウスにおいて通常見られるＮＭＤＡ依
存性応答の増強は、変異体動物において廃止されることを示す。対応して、脊髄
ＮＲ１サブユニットの傷害誘導性のリン酸化はＰＳＤ−９５変異体において強力
に低減された。リン酸化によるＮＭＤＡ受容体機能の調節を導くＭＡＧＵＫ媒介
性相互作用は、神経障害性疼痛の基礎となる機構に重要であるようである。
【０３５７】 材料および方法 脊髄におけるＮＭＤＡ受容体複合体の分子組成 野生型マウスからの脊髄を、１％ デオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭ
ＮａＦ、２０μＭ ＺｎＣｌ２、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、０．５
ｍＭ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、および２μｇ／ｍｌロイペプチン
を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０中４℃にてホモジナイズした。抽出
物（０．５ｍｌ）を、１時間氷上で温置し、そして１３，０００×ｇにて１時間
４℃での遠心分離によって澄明化した。以前に記載されるように[H. Husiら, Na
ture Neuroscience 3, 661(2000)]、ＭＡＰ ＮＲ１ ＩｇＧ、ＰＳＤ−９５
ＩｇＧ、ＮＲ２Ａ、およびＮＲ２Ｂ、またはＮＲ２Ｂ ６アミノ酸Ｃ末端を、４
時間４℃にて、抽出物とともに温置した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ（１５μｌ）を続いて添加し、そしてサンプルを一晩４℃にて一定の振盪下
で保持した。サンプルを０．５ｍｌ冷却抽出緩衝液で５回洗浄し、その後Ｌａｅ
ｍｍｌｉ緩衝液中に可溶化した。タンパク質サンプルを、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に供し、そして４℃で９０分間、７５Ｖにて１０％（ｖ/ｖ）メタノール、１０
ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１１．０中、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーした。
ブロットをプローブするために使用された１次抗体は、以前に記載されるようで
あり（実施例１を参照のこと）、およびシグナル検出は、化学発光を増強された
ペルオキシダーゼ結合２次抗体を使用して行われた。１００μｇ脊髄および５０
μｇ前脳抽出物の直接的な免疫ブロットが比較のために示される。
【０３５８】 エクスビボＣａＭキナーゼＩＩ活性試験 麻酔下での腰部Ｌ３〜６の椎弓切除後、マウスは、いくつかの場合において以
前に慢性的な狭窄傷害を受け、脊髄の背側表面に対する薬剤の局所的な適用によ
って処置された。コアゴニストのグリシン（１００μＭ）、イオノマイシン（１
０μＭ）、または生理食塩水ベシクルとともにＮＭＤＡ（５００μＭ）を、５０
０μｌの容量中で１５分間適用した後、氷上の冷却緩衝液に迅速に取り出した。
ＣａＭＩＩキナーゼの構成的な（自己リン酸化）およびＣａ２＋／ＣＭ誘発性活
性[P. I. Hansonら, Neuron 3, 59(1989); P. M. JonesおよびS. J. Persaud, A
m. J. Physiol. 274, E708(1998)]を、以下の手順によって測定した。サンプル
を、５％グリセロール、１ｍＭ ＥＧＴＡ、1ｍＭ ジチオトレイトール、１ｍ
Ｍ ＡＥＢＳＦ、２μｇｍｌ−１アプロチニン、１０μｇｍｌ−１ロイペプチン
、２μｇｍｌ−１ペプスタチン、５０μｇｍｌ−１ダイズトリプシンインヒビタ
ー、２５ｍＭ Ｎａ β-グリセロリン酸、１ｍＭ Ｎａ オルトバナジン酸、1
ｍＭ Ｎａ Ｆ、１μＭ カリクリンＡ、１μＭシペロメトリンを含有する２０
ｍＭ Ｎａ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中氷上で迅速にホモジナイズした。０．２
５％ ＣＨＡＰＳとの氷上における３０分間の温置および澄明化後、サンプルを
４℃にて２時間、３μｇｍｌ−１マウス抗α-ＣａＭキナーゼＩＩ ＩｇＧ（ク
ローンＣＢα−２；Ｚｙｍｅｄ）とともに、次いで１時間、過剰のＰｒｏｔｅｉ
ｎ Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとともに温置した。洗浄された免疫沈降物のアリコ
ートを、５０μＭオートカムチド−２、５０μＭ ＡＴＰ（０．２５μＣｉ／チ
ューブに対して［３３Ｐ］γ-ＡＴＰで）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および８μ
ｇ.ｍｌ−１精製ウシカルモジュリン（Ｓｉｇｍａ）とともに、０．５μＭ Ｐ
ＫＣ-α１９〜３１および０．５μＭ ＰＫＩ６〜２２アミドの存在下（それぞ
れ、任意のＰＫＣおよびＰＫＡ媒介性の活性を抑制するために）で、２０分間３
０℃にて（線形範囲の試験）温置し、その後冷却ＴＣＡ（１０％に）で終結し、
遠心分離し、そしてＰ８１ホスホ-セルロース濾紙上に上清をスポットした。サ
ンプルを、７５ｍＭ Ｈ３ＰＯ４中で徹底的に洗浄し、乾燥した後、超音波計測
した。構成的なおよび最大のＣａ２＋で誘起される活性を、それぞれ２ｍＭ Ｃ
ａＣｌ２の不在下および存在下で測定した。ゼロ時間および基質非含有ブランク
は、最大活性の２％未満であった。平行な免疫ブロッティング実験が、Ｔｈｒ２ ８６ -ＣａＭキナーゼＩＩ（重要な自己リン酸化部位）についてのリン酸特異的
抗血清を用いて試みられたが、さらなる使用について不十分なシグナル：ノイズ
比であった。
【０３５９】 ホスホ-ＮＲ１についての免疫ブロッティング 脊髄サンプルを最初に、ＣａＭキナーゼＩＩ試験（ＣＨＡＰＳを伴わない）に
ついてのように、緩衝液中にホモジナイズし、メンブレン画分を調製した。これ
は１％デオキシコール酸含有緩衝液中に、１時間４℃にて可溶化され、次いで澄
明化された上清を、４時間４℃にて、３．５μｇ/ｍｌのヤギ抗ＮＲ１ ＩｇＧ(
SC-1467, Santa Cruz)とともに温置し、その後Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂで、１時間４℃にて沈降した。洗浄後、ビーズに付着され
たタンパク質をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中に可溶化し、その後Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ
Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）メンブレン上にＳＤＳ−ＰＡＧＥし、そしてペルオ
キシダーゼ結合２次抗体の増強される化学発光によって検出した。ブロットを、
ｐａｎ-ＮＲ１でプローブし（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：１００）、ホスホ-Ｓｅｒ８９７ -ＮＲ１（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１：１００）でプローブし
た。ホスホ-Ｓｅｒ８９７は、ＰＫＡによって標的化されることが示される部位
でのＮＲ１の転写後修飾を特異的に検出するが、これはＳｅｒ８９７-ＮＲ１を
リン酸化し得る唯一のキナーゼであることを明白には示さなかった[W. G. Tingl
eyら, J. Biol. Chem., 272, 5157(1997); X. Zhouら, J. Neurosci., 20, 6989
(2000)]。
【０３６０】 末梢神経形態学 有髄線維 トルイジンブルーで染色された坐骨神経（脛骨分岐）の１μｍ横断切片を、「
Ｉｍａｇｅ１．４４ソフトウェア（ＮＩＨ）」を使用して試験した。脛骨神経の
横断切片領域を×１００の倍率で測定し、各神経切片における５つのランダムに
作製された領域を４×４格子を使用して選択した。分析のために、スクリーンの
中央に最も近い３０個の有髄化線維を選択し、軸索面積、外部面積、およびＧ領
域（軸索直径／外部直径）を、髄厚を定量するために測定した。
【０３６１】 無髄化線維 坐骨神経（脛骨分岐）の８０ｎｍ横断切片を、銅スロット格子上にマウントし
、そして透過型電子顕微鏡において試験した。２５個のランダムな領域を、２３
００×の倍率で写真撮影し、次いで×５７５０の最終倍率で印刷した、これを、
全ての有髄化および無髄化線維を計数するために使用した。試験のために、５つ
のネガティブをランダムに選択し、そして「Ｉｍａｇｅ１．４４」を使用するコ
ンピューター解析についての平床スキャナーを使用してスキャンした。３０個の
無髄化線維の軸索の直径／面積を、それぞれのマイクログラフから測定し、線維
は、無髄化線維からのみなるクラスターから選択された。有髄化線維の頻度を１
μｍ間隔で１〜１０μｍまでスコアし、そして無髄化線維の頻度を０．１μｍの
間隔で０．１〜２．７μｍまでスコアした。合計８２７個および７５９個の有髄
化線維を、野生型およびＰＳＤ−９５変異体マウスの脛骨神経からスコアし、そ
れぞれ２．４±１．３および３．５±１．９の中央値直径を与えた（中央値±Ｓ
．Ｄ．）。対応して、合計４３６個の野生型および４７９個のＰＳＤ無髄化線維
をスコアし、それぞれ０．５６±０．３および０．４７±０．５μｍを与えた（
中央値±Ｓ．Ｄ．）。間隔の分布は、野生型とＰＳＤ−９５変異体との間で有意
には異ならず（χ２検定）、および全てのプロフィールが、以前に発表された知
見[G. Guilbaudら, Pain 53, 147(1993); C. Sommerら, J. Neuropath. Exp. Ne
urol. 54, 635(1995)]に従って野生型と変異体マウスとの間で類似した。
【０３６２】 神経障害性疼痛の挙動の評価 マウスにおける坐骨神経に対する慢性狭窄傷害（ＣＣＩ）モデル 動物を最初に、ペントバルビタルナトリウム（Ｓａｇａｔａｌ；０．０１ｍｌ
／ｋｇ（生理食塩水中の１：４、腹腔内；Rhone Merieux, UK）で麻酔し、次い
でこれにハロタンＯ２を補充した(Zeneca, UK)。無菌条件下、ラットについての
ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅの多様な方法[G. J. BennettおよびY. K. Xie, Pai
n 33, 87(1988)]を使用して、坐骨三叉に近位の中大腿レベルで坐骨神経を曝露
した。１ｍｍ分離される３つのクロムカットグット結紮糸(5.0; Ethicon, Edinb
urgh)を、緩く結び、４０×倍率下で見られるように脛骨枝を狭窄した。血管供
給は損なわれなかった。重層する筋肉および皮膚を縫合し、そして動物を回復ケ
ージにおいた。
【０３６３】 挙動試験 動物を各試験についての安定なベースラインレベルを確立するために、手術の
６日前に、次いで術後（ＰＯ）の１日または２日毎に試験した。応答を、術前値
および対側コントロールの平均に比較した。動物を毎日、自体損傷がなんら存在
しないことを確実にするために試験した。
【０３６４】 熱痛覚過敏 熱痛覚過敏を、Hargreaves’ Thermal Stimulator (Linton Instruments, USA
)を使用してモニターした。刺激を、後足の中足底表面に適用した。撤退応答を
短い足の弾きとして特徴づけした。撤退の潜伏を、同側（傷害された）および対
側後足について記録した。５と１０との間の読み取りの平均を３〜５分間の間隔
で記録して、試験に対する過感受性が何ら確立されないことを確実にした。術前
足撤退潜伏についての平均基底値は典型的に約５秒間であった。
【０３６５】 機械的異痛 機械的異痛を、０．２２〜８４．９６ｇの屈曲力を伴って、検量されたSemmes
-Weinstein von Freyフィラメントに対する撤退閾値として測定した(Stoeling,
Wood Dale, IL)。マウスを、小さな長方形のケージに置いた。フィラメントが屈
曲し始めるまで、フィラメントを、下から後足の中足底表面に適用した、この刺
激は、傷害されたおよび傷害されていない後足の両方について１〜２秒の間隔で
８〜１０回反復された。撤退応答を誘起するために必要とされる平均閾値を記録
した。フィラメントを上向順に適用し、そして応答を短い足の蹴りとして特徴づ
けした。撤退閾値は、応答を誘発する２つの保存的なｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメ
ントの低下から規定された。データは、閾値圧入圧として表され得た（すなわち
、フィラメントの先端での屈曲力／横断面積）。術前足撤退閾値に対する平均基
底値は典型的に約６００ｍＮ.ｍｍ−２であった。
【０３６６】 寒冷異痛 寒冷異痛の存在を試験するために、マウスを、上昇されたメタル金属格子床を
備える環状のガラスタンク中においた。これは、氷および水の混合物（3〜４℃
）で覆われ（約１ｃｍ）、足の無毛のおよび有毛の皮膚の両方が水で覆われるこ
とを確実にした。マウスを、３０秒間タンク中に置き、その最初の１０秒間は動
物を気候順化させた。残りの２０秒間の間、測定は、水レベルを超えて上昇され
および処理された動物の足の時間の量から作製された。挙動試験は、試験者が被
験体の遺伝子型に対して盲目であることを確実にするプロトコルを使用して行わ
れた。
【０３６７】 くも膜下腔内の薬物処理 ベースライン測定を、慢性的な狭窄傷害を受けたおよび神経障害のピークにあ
るマウスにおいて熱痛覚過敏（Ｈａｒｇｒｅａｖｅ試験）および機械的異痛（ｖ
ｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験）について記録した。マウスをハロタンおよび
０２で麻酔した。薬物を、２５μｌのマイクロシリンジを使用してＬ４レベルの
脊髄で、１０μｌ生理食塩水中、くも膜下腔内に注射した[J. L. HyldenおよびG
. L. Wilcox, Eur. J. Pharmacol., 67, 313(1980)]。実験者は、偏見を排除す
るように注射の内容物に対して盲目であり、および染料注射(Pontamine Sky Blu
e)を、注射の部位を決定するために行った。注射の１５分間後、マウスを同じ手
順を使用して再試験し、そして測定を痛覚過敏および異痛に対する薬物の効果を
決定するために行った。動物を、読み取り値がベースラインレベルに戻るまで５
分毎に試験した。
【０３６８】 ＜結果＞ ヘテロ接合体変異体マウスにおいて、βガラクトシダーゼ（変異体ＰＳＤ−９
５構築物に挿入されたレポーター遺伝子）についての組織化学的染色は、表在性
の脊髄後角の薄板ＩおよびＩＩ。に特異的に制限された（図１８ａ〜ｃ）。この
発現は、足および胸髄を介して拡張されたが、後根侵入部位（図１８ｄ）、ＤＲ
Ｇ、後根または坐骨神経（データ示さず）において検出され得なかった。野生型
脊髄においてＮＭＤＡ受容体を含有する脊髄多タンパク質複合体の免疫親和性分
離（前脳について以前に記載されるように（実施例１））は、脊髄ＮＲ１、ＮＲ
２Ａ、ＮＲ２Ｂ、およびＰＳＤ−９５に指向される免疫沈降がそれぞれ、会合さ
れるＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、およびＰＳＤ−９５を含んだことを確認した
（図１８ｅ）。
【０３６９】 坐骨神経切片の以前の報告に従った未処置の野生型および変異体マウスとの間
の有髄化（ＡδおよびＡβ）ならびに無髄化（Ｃ）線維についての軸索直径およ
び髄厚の類似のプロフィールを示した。変異体マウスにおける求心性の任意の検
出可能な欠損の不在にもかかわらず、これらは坐骨神経の慢性狭窄傷害（ＣＣＩ
）に対して同側に通常発生する侵害性の挙動の発生のほとんど完全な欠損を示し
た（図１９）。変異体および野生型マウスの両方について、熱機械的傷害性足撤
退試験におけるベースライン値は、マウスについて以前に報告された値に一致し
た(C. S. Gillespieら, Neuron(2000)26, 523〜531)。歩行運動および基本的条
件下で灌流モーター応答を生成する能力は正常であるようであった。ＣＣＩ後の
数日間にわたって、野生型マウスは顕著な対側、熱痛覚過敏、機械的異痛（低い
強度の刺激に対する疼痛様応答）および寒冷異痛を発症した（図１９ａ〜ｃ）。
対側後足からの全ての応答は、基底値から変化されないままであった（寒冷異痛
試験における不変のゼロ応答を伴った）。熱痛覚過敏も機械的異痛も、ＰＳＤ−
９５変異体マウスにおいて全く検出され得なかったが（図１９ａ、ｂ）、寒冷異
痛は、激しく減弱されて、１時間点のみで統計的有意性を達成した（図１９ｃ）
。全てのＣＣＩで誘起される変化が、２２〜２３日以内で自発的に回復された。
【０３７０】 選択的ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、（Ｒ）-ＣＰＰの急性のくも膜下腔内
注射は、野生型マウスにおけるＣＣＩに対して同側で発症された熱痛覚過敏およ
び機械的異痛を逆転し、対側応答に対して何の効果も伴わなかった（図２０ａ、
ｂ）。対応して、挙動変化は、くも膜下腔内ＮＭＤＡによって未処置の野生型マ
ウスにおいて両側的に模倣された（図２０ｃ、ｄ）。顕著に対象的に、ＰＳＤ−
９５変異体マウスの挙動応答は、（Ｒ）-ＣＰＰおよびＮＭＤＡのいずれによっ
ても影響されなかった（図２０）。脊髄感覚性灌流の神経障害性感作を担うＮＭ
ＤＡ受容体媒介性の事象はそれゆえ、無傷のＰＳＤ−９５タンパク質の存在に非
常に依存する。
【０３７１】 これらのモデルにおける脊髄ＮＭＤＡ受容体の細胞性機能を評価するために、
本発明者らはＣａＭキナーゼＩＩの活性化部位をモニターした。この酵素は、シ
ナプス後肥厚複合体と会合され(M. B. Kennedy, Trends In Neurosciences 20,
264〜268, 1997)、ＮＲ２サブユニットにドッキングし(F. Gardoniら, J. Neuro
chem. 71, 1733〜1741, 1998)、そしてＮＭＤＡ受容体活性化において生じるよ
うな細胞性Ｃａ２＋の上昇後、構成的に活性な、自己リン酸化される形態に変換
される。神経障害性感作におけるＣａＭキナーゼＩＩについての必要な役割は、
選択的ＣａＭキナーゼＩＩインヒビター、ミリストイル-オートカミド２関連性
阻害性タンパク質、およびＫＮ９３によるが、ほとんど活性のないアナログ、Ｋ
Ｎ９２によるより小さな程度への、野生型マウスにおける熱痛覚過敏および機械
的異痛の逆転によって示される（図２２）。構成的に活性である免疫沈降された
ＣａＭキナーゼＩＩの割合は、野生型またはＰＳＤ−９５変異体マウスの背側脊
髄への薬剤の局所的な適用後に測定された（図２３）。ＮＭＤＡ（コアゴニスト
のグリシンを伴う）またはイオノマイシン（Ｃａ２＋イオン通過孔）の適用によ
る活性化は、未処置の野生型マウスおよび変異体マウスにおいて等価であり、急
性のＮＭＤＡ受容体媒介性のＣａ２＋流入が変異体において動揺されていないこ
とを示した。それにもかかわらず、野生型マウスにおいてＣＣＩに同側で見られ
た（対側ではみられなかった）構成的なＣａＭキナーゼＩＩ活性の上昇された割
合は、ＰＳＤ−９５変異体において不在であった。この増加は（Ｒ）-ＣＰＰの
適用によって完全に防止された。これらの知見は、ＰＳＤ−９５はＣＣＩ後のＮ
ＭＤＡ受容体媒介性のＣａ２＋流入の促進に必要不可欠であるが、ＮＭＤＡに対
する急性Ｃａ２＋流入応答に必要でないことを示す。従って、さらなるアダプタ
ータンパク質媒介性プロセスが、ＮＭＤＡ受容体媒介性の神経障害感作の挙動徴
候に必要不可欠であるようであり、Ｃａ２＋流入（ＣａＭキナーゼＩＩインヒビ
ターによる遮断に反映される）はまた必要であるようである。しかし、ＣａＭキ
ナーゼＩＩはＣＣＩに応答するが、急性ＮＭＤＡに応答せず、ＰＳＤ−９５変異
体において損なうので、ＣＣＩ誘導性の神経障害性疼痛における重要な因子は、
ＮＭＤＡ受容体Ｃａ２＋流入機能の促進性調節であるようである。このような調
節についての根拠は、キナーゼによるＮＭＤＡ受容体リン酸化で有り得(Tingley
ら, J. Biol. Chem. 272, 5157〜5166, 1997; Westphalら, Science 285, 93〜9
6, 1999)、および脊髄ニューロンのＮＭＤＡ応答はＰＫＣおよびＰＫＡによって
促進されることが知られる（K. I. Rusin, P. D. Ryu, M. Randic, J. Neurophy
siol, 68, 265〜286, 1992)。図２１は、脊髄ＮＲ１免疫沈降における野生型マ
ウスからのホスホ−ＮＲ１の免疫反応性が、ＣＣＩに対して同側で特異的に増加
されたこと、およびこの応答がＰＳＤ−９５変異体マウスにおいて非常に弱めら
れたことを示す。同じサンプルにおいて、ｐａｎ−ＮＲ１免疫反応性は、野生型
およびＰＳＤ−９５変異体マウスの両方において、ＣＣＩに対して同側で比較的
減少された。現在の証拠は、ＰＳＤ−９５のようなＭＡＧＵＫタンパク質が、Ｎ
ＭＤＡ受容体のような細胞表面標的タンパク質の近位においてキナーゼを配置し
得るＡＫＡＰ足場タンパク質に対するリンカーとして作用し得ることを示唆する
(Colledgeら, Neuron 27, 107〜119, 2000)。ＰＳＤ−９５変異体マウスについ
ての本発明者らのここでの知見は、ＰＳＤ−９５のアダプター役割が、ＮＭＤＡ
受容体リン酸化およびその増強されたＣａ２＋流入機能の機構を可能にすること
により、神経障害性疼痛の状態の発症において重要な部分を果たすことを示す。
【０３７２】 実施例６：脳卒中における多タンパク質複合体の役割の調査 ＜序論＞ 脳卒中は、成体の能力傷害の主要な原因であり、およびほとんどの先進国の健
康部門予算の約５％を費やす。虚血性障害から脳組織を保護する治療法は現在な
にも利用可能ではない。英国における全死亡の３分の１を生じる脳卒中にもかか
わらず、予防および処置についての意見がほとんどない。大脳虚血は、興奮性神
経伝達因子のグルタミン酸の大量の放出を生じるので、製薬会社によるかなりの
興味が、グルタミン酸受容体をブロックする薬物にある。グルタミン酸受容体の
Ｎ−メチル-Ｄ-アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）サブタイプの活性化は、大脳虚血の
病理学的変化を誘起することが知られる。ＮＭＤＡ受容体またはＮＭＤＡ依存性
イオンチャネルは、処置についての魅力的な標的であるようであるが、臨床治験
は、受容体アンタゴニストの精神医学的副作用のためのみでなく、患者が受容体
活性化後のある時点で、および疾患の進行の間に病院に診察を受けにいくので失
望されている。
【０３７３】 ＮＭＤＡ受容体が活性化された後に作用する細胞内シグナル伝達経路はより有
理な標的を示し得る。シナプス可塑性および学習におけるＮＭＤＡ受容体シグナ
ル伝達の研究は、ＮＭＤＡ受容体の下流のシグナル伝達経路が、ＰＳＤ−９５、
ＮＭＤＡ受容体サブユニットを結合するタンパク質によって調節されることを示
す。これらの可塑性経路は、ＮＭＤＡ受容体刺激後の１時間の間に作用し、これ
は薬物が脳卒中患者に投与され得る時間枠である。ＰＳＤ−９５が動物において
虚血性脳障害発作を改変するという証拠はなにもなかった。
【０３７４】 ＜方法および結果＞ この問題を取り組むために、本発明者らはＰＳＤ−９５変異体マウスにおいて
一過性の包括的な虚血を誘導し、そして脳障害の程度を試験した。２重盲目研究
において、両側性の頚動脈閉塞が、ハロタンで麻酔されたＰＳＤ−９５−／−変
異体（ｎ＝９）および野生型同腹仔コントロール（ｎ＝１１）マウスに適用され
、これは７２時間後に屠殺され、そして正常なおよび虚血障害されたニューロン
を、１０ｍｍ２格子を使用して計数した（図２４）。ＰＳＤ−９５−／−変異体
マウスは、顕著に少ないニューロン障害を示した。野生型マウスにおいて、ニュ
ーロン障害は、尾状核ニューロンの４７±９％において観察されたが、ＰＳＤ−
９５−／−変異体マウスの僅か１７±７％であった（Ｐ＜０．０２）。海馬にお
いて見られるＰＳＤ−９５変異による強力な保護が存在し、ここではコントロー
ルマウスは１１±４％のニューロンに障害を示し、およびＰＳＤ−９５−／−マ
ウスは２±１％の障害を示した（Ｐ＝０．０８）（図２５）。
【０３７５】 ＜考察＞ ＰＳＤ−９５変異体による脳卒中脳障害に対する保護は、薬物処置についての
新規な道を開く。ＰＳＤ−９５およびＮＭＤＡ受容体は、多くの潜在的な薬物標
的を含む２０００ｋＤａ多タンパク質複合体シグナル伝達複合体の成分である。
この複合体に対する薬物を使用するＰＳＤ−９５変異体表現型の薬理学的模倣は
、脳卒中または頭部障害後の脳傷害において劇的な減少を同様に生じ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウス脳から抽出された多タンパク質複合体の組成物に対する洗浄剤抽出物の
効果。 ＮＭＤＡ受容体を含有するマウス脳多タンパク質複合体を、ＭＡＰ-ＮＲ1ヒツ
ジ血清（４μｌ）での小規模免疫沈降を使用して単離し、続いて左側に示される
ような種々の抗体でのウェスタンブロッティングによって分析した。「抽出物」
と記される上部２つのパネルは、抗体５４．１を用いてＮＲ１についてプローブ
された全脳抽出物のウェスタンブロッティングコントロールである。唯一の洗浄
剤として１％デオキシコール酸（ＤＯＣ）を使用して、左側パネルにおいて示さ
れるような多タンパク質複合体組成物を生じたのに対し、右側において示される
結果は、ＳＤＳを含有する緩衝液系を使用することによって得られた。Ｘ線フィ
ルムに対するブロットの露光時間は１０秒間であった。
【図２】 ３つの異なるＩｇＧでの小規模免疫沈降。 マウス脳抽出物（０．２ｍｌ）を等量のＤＯＣ緩衝液で希釈し、そしてウサギ
（３５６、１μｌ）もしくはヒツジ（ＭＡＰ-ＮＲ１、４μｌ）からのＮＲ１に
対する全血清ＩｇＧとともに、またはＰＳＤ-９５（１３８、１μｌ）に対する
全血清とともに１時間４℃にて温置した。続いて、１５μｌＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ
-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを添加し、そしてさらに１時間４℃にて温置した。樹脂を
０．５ｍｌ ＤＯＣ緩衝液で４回洗浄し、そして８％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび
クマシー染色（上部パネル）によって分析した。分子量マーカーは左側に示され
る。ＮＲ１に対するモノクローナル抗体５４．１および抗ＰＳＤ-９５、ならび
にポリクローナルＩｇＧ抗ＮＲ２Ａを使用するこれらのサンプルのウェスタンブ
ロッティングは、下部パネルにおいて示される。
【図３】 ＭＡＰ-ＮＲ１抗体の力価測定。 小規模の実験を、０．２ｍｌのマウス脳ＤＯＣ抽出物および０．２ｍｌ ＤＯ
Ｃ緩衝液と混合された０〜３０μｇの精製された（パネルＡ）またはビオチン化
された（パネルＢ）ＭＡＰ-ＮＲ１ ＩｇＧを使用して行った。２０μｌＰｒｏ
ｔｅｉｎ Ｇ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを４℃で２時間の温置後に添加し、続いてさ
らに一晩４℃で温置した。サンプルを０．５ｍｌ ＤＯＣ緩衝液で４回洗浄し、
そして７．５％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル、その後のクマシー染色に対して分析し
た。コントロールは、上記のサンプルのようにプロセスされた０．４ｍｌ ＤＯ
Ｃ緩衝液中の３μｇ抗体であった。矢印は、ＩｇＧ重鎖の位置を示し、およびｋ
Ｄａにおける分子量は、各パネルの左側に示される。
【図４】 固定化抗体を使用する親和性クロマトグラフィー。 多タンパク質複合体を、ＮＲ１（３５６）またはＰＳＤ-９５（１３８）に対
する固定化抗体を使用して単離し、そして６Ｍ尿素またはｐＨ１２へのｐＨ移行
のいずれかで樹脂から溶出した。サンプルを７．５％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよび
クマシー染色によって（上部パネル）、ならびにＮＲ１、ＮＲ２Ａ、およびＰＳ
Ｄ-９５に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングによって（下部パネ
ル）分析した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥのｋＤａにおける分子量マーカーは、左側に示
される。
【図５】 マウス脳抽出物のリガンド親和性精製。 脳ＤＯＣ抽出物を、ａｆｆｉｇｅｌ-１０-またはＰｈａｒｍａＬｉｎｋ結合リ
ガンドとともに温置し、そして保持されたタンパク質を、１２％ＳＤＳ-ＰＡＧ
Ｅおよびクマシー染色（上部パネル）によって分離した。ｋＤａにおける分子量
マーカーは左側に示される。下部パネルは、ＮＲ１、ＮＲ２Ｂ、およびＰＳＤ-
９５に対する抗体を使用した種々のサンプルのウェスタンブロッティング分析を
示す。全抽出物（１０μｌ）はコントロールとして使用され、そして最も左側の
パネルにおいて示される。
【図６】 マウス脳抽出物のペプチド親和性精製。 小規模実験を、ａｆｆｉｇｅｌ-１０またはＴｒｉｓでブロックされたａｆｆ
ｉｇｅｌ-１０のネガティブコントロールに共有結合的に連結された種々のペプ
チド、ならびに０．５ｍｌマウス脳ＤＯＣ抽出物を使用して行い、そして１０％
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、続いてクマシー染色によって分析した。ｋＤａにおける分
子量マーカーは左側に示される。
【図７】 ３つの異なるストラテジーを使用する精製された多タンパク質複合体の比較分
析。 マウス脳抽出物（５０ｍｌ）を、０．５ｍｇの親和性精製されたＭＡＰ-ＮＲ
１ ＩｇＧでの大規模免疫沈降（レーンＭＡＰ-ＮＲ１）、０．５ｍｌ ＭＡＰ-
ＮＲ１ ａｆｆｉｇｅｌ（レーンＭＡＰ-ＮＲ１ ａｆｆｉｇｅｌ）、および０
．５ｍｌ ＮＲ２Ｂ Ｃ末端ペプチド樹脂（レーンＮＲ２Ｂ １４７７-１４８
２）でのスケールアップされた免疫親和性クロマトグラフィーのそれぞれについ
て使用した。１０μｌの抽出物を、コントロールとしてレーンにつき使用した（
レーン抽出物）。サンプルを１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびクマシー染色によっ
て分析するか（上部パネル）、示されるような抗体でプローブされたウェスタン
ブロッティングについて使用した（下部パネル）。ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルのｋＤ
ａにおける分子量マーカーは左側に示される。
【図８】 マウス脳から単離された多タンパク質複合体の基本的な組成。 Ａ、Ｂ：マウス脳抽出物（レーンＥｘ）からの多タンパク質複合体の免疫親和
性（レーンＩＡ）、免疫沈降（レーンＩＰ）、およびＮＲ２Ｂペプチド親和性（
レーンＰｅｐ）単離からのＳＤＳ-ＰＡＧＥ（Ａ、１２％、Ｂ、6％）のタンパク
質染色。示されるネガティブコントロールは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ-Ｓｈｅｐｈ
ａｒｏｓｅに結合されたＭＡＰ-ＮＲ１ Ｉｇ（レーンＩｇ+Ｇ）、およびＰｒｏ
ｔｅｉｎ Ｇ-Ｓｈｅｐｈａｒｏｓｅに結合された抽出物（レーンＥｘ+Ｇ）であ
る。矢頭は、タンパク質Ｉｇ種を示す。特異的結合タンパク質の複合体混合物は
、７０ｋＤａを上回る範囲において主に観察され、そして質量分析に供された（
図１Ｇ、表２）。 Ｃ．多タンパク質複合体中のＮＭＤＡ受容体サブユニットおよびＭＡＧＵＫタ
ンパク質の免疫ブロット分析。ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＰＳＤ-９５、お
よびＣｈａｐｓｙｎ-１１０が検出された。 Ｄ．多タンパク質複合体におけるＰＳＤ-９５結合タンパク質の免疫ブロット
分析。ｎＮＯＳ、ＳｙｎＧＡＰ、ＧＫＡＰ、およびＣｉｔｒｏｎが検出された。 Ｅ．多タンパク質複合体におけるＡＭＰＡ受容体サブユニットおよびＧＲＩＰ
の免疫ブロット分析。ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ２/３、ＧｌｕＲ４、
およびＧＲＩＰが、開始材料（Ｅｘ）中で容易に検出されたが、３つの多タンパ
ク質複合体調製物中で検出されなかった。 Ｆ．多タンパク質複合体中のｍＧｌｕＲ１受容体およびＨｏｍｅｒタンパク質
の免疫ブロット分析。ｍＧｌｕＲ１およびＨｏｍｅｒが検出され、多タンパク質
が代謝調節型グルタミン酸受容体を含むが、ＡＭＰＡ受容体を含まないことを示
す。 Ｇ．質量分析について励起されたバンドの位置（矢頭）を示す多タンパク質複
合体のタンパク質染色（６％ ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）。
【図９Ａ】 （多タンパク質複合体の質量分析における）タンパク質同定ストラテジー。 ＳＤＳ-ＰＡＧＥからの染色バンド（図１Ｇ）を切り出し、そしてトリプシン
で消化し、そしてＱ-ＴＯＦ（図９Ｂ）、ＬＣ-ＭＳ/ＭＳ（図９Ｃ、Ｄ、Ｅ）を
使用して分析し、続いてオンラインコンピューター解析を行った。
【図９Ｂ】 （多タンパク質複合体の質量分析における）Total Ion Survey Baseピークク
ロマトグラム（９０ｋＤａでのタンパク質バンドからの例）。 各ＭＳスキャンにおける２つの最も強烈なイオンを、衝突誘導性フラグメント
化およびＭＳ/ＭＳ態様（ＬＣ-ＭＳ/ＭＳ）における分析について自動的に選択
した（図９Ｃ）。
【図９Ｃ】 （多タンパク質複合体の質量分析における）LC-MS/MS Baseピーククロマトグ
ラム。 ３８．２分および４２．６分での標識は、ペプチド配列情報を作成するために
使用された選択されたペプチドを示し、２つのこのような例が示される（図９Ｄ
、Ｅ）。
【図９Ｄ】 （多タンパク質複合体の質量分析において、）図９Ｃの４２．６分にて溶出す
るピークから得られる平均されるＭＳ/ＭＳスペクトル。 質量対電荷比（ｍ/ｚ）８９０．７２（１６１７．４４Ｄａのペプチドに対応
する）での２重に荷電されたイオンが、衝突誘導性解離によるフラグメント化に
ついて選択された。Ｎ末端（ｂ型イオン）またはＣ末端（ｙ”型イオン）のいず
れかから起源するフラグメントイオンは、Ｍａｓｃｏｔデータベースサーチプロ
グラムを使用して同定されたアミノ酸配列に対応した。この例において、ＭＳ/
ＭＳスペクトルは、ＰＳＤ-９５残基１１３〜１２６（アクセス番号Ｑ６２１０
８）からのペプチド配列ＶＮＤＳＩＬＦＶＮＥＶＤＶＲに適合した。
【図９Ｅ】 （多タンパク質複合体の質量分析において、）図９Ｃの３８．２分にて溶出す
るピークから得られた平均化ＭＳ/ＭＳスペクトルから同定された多タンパク質
複合体の新規な成分の例。 ｍ／ｚ５３８．６８（１０７１．６５Ｄａのペプチドに関連する）にて観察さ
れた２重に荷電された前駆体イオンが、Ｍａｓｃｏｔサーチプログラムによって
、ｄｂＥＳＴクローンＡＶ１５３７３１を適合する配列ＤＬＫＥＩＬＴＬＫとし
て同定された。
【図１０】 多タンパク質複合体の成分を包含する推定のシグナル伝達経路。 多タンパク質複合体成分の多くは、公知の生化学経路の部分である。経路のい
くつかの成分はＡＭＰＡ受容体、シナプス構造変化（アクチン再構成および細胞
接着）、神経生存、および転写を調節する説明されるおよび示唆される経路であ
り、示される。アダプターおよびＰＳＤ−９５、Ｙｏｔｉａｏ、およびＡＫＡＰ
を含む他の構造分子は示されていない。シナプス後膜が、黒線で示され、および
灰色の囲みは、多タンパク質複合体を包含する。
【図１１】 可溶性多タンパク質複合体のゲル濾過分析。 複合体を、大規模ＩＰによって単離し、そして材料および方法の節において記
載されるようにペプチド競合によって樹脂から競合し、続いてサイズ排除クロマ
トグラフィーによって分画化した。グラフは、標準としてＢｌｕｅ Ｄｅｘｔｒ
ａｎ２０００（破線）およびチオグロブリン（点線）を使用した２つの検量線、
ならびにＮＭＤＡＲサンプルの分離（直線）を示す。画分は、溶出容量（ｖ０）
と全カラム容量（ｖｔ）との間で取られ、そしてＮＲ１に対するウェスタンブロ
ッティングによって分析された（挿入図）。
【図１２】 ＳｙｎＧＡＰおよびＨ-Ｒａｓ変異体マウス。 図１２ａは、ＳｙｎＧＡＰ遺伝子の標的化破壊を示している。上部：制限酵素
部位(B, BglII; E, EcoRI; Sm, SmaI; Sp, SpeI; X, XhoI; Xb, XbaI)を伴うＳ
ｙｎＧＡＰ遺伝子；黒い囲み、エクソン；太線、標的化ベクターにおいて使用さ
れた相同な領域；サザンブロットプローブが示される（３’）。下部；ＳｙｎＧ
ＡＰ標的化ベクター。ＨＡ、ヘマグルチニン配列；ＩＲＥＳ、内部リボゾーム侵
入部位；ＬａｃＺ、β-ガラクトシダーゼ遺伝子；ｎｅｏ、ネオマイシン耐性遺
伝子。ＳｙｎＧＡＰ遺伝子の下部の矢印はアルギニン３１２（または４７０）を
示し（以下の実施例４を参照のこと）、これはＲａｓＧＡＰタンパク質において
高度に保存され、およびＧＡＰ活性に必要であり、および標的化ベクターにおい
て欠失された。図の右側：ヘテロ接合体交雑の同腹仔からのＥｃｏＲＩ消化され
、および３’プローブでプローブされたＤＮＡのゲノムサザンブロット。野生型
（＋／＋）、ヘテロ接合体（−／＋）、ホモ接合体（−／−）が示される。 図１２ｂは、Ｈ-Ｒａｓ遺伝子の標的化破壊を示している。上部：制限酵素部
位（上述のようであり、以下の付加を伴う：Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ；Ｓ、ＳｐｈＩ；
Ｆ、ＦｓｐＩ）を伴うＨ−Ｒａｓ遺伝子、全ての他の詳細は図１ａにおけるよう
である。底部：標的化ベクター。β-ｇｅｏ、β-ガラクトシダーゼ遺伝子および
ネオマイシン耐性遺伝子融合遺伝子からなる。図の右側：ヘテロ接合体交雑の同
腹仔からのＥｃｏＲＩ消化され、および５’プローブでプローブされたＤＮＡの
ゲノムサザンブロット。野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（−／＋）、ホモ接合
体（−／−）が示される。 図１２ｃは、全マウントシグナル脳切片のＸ−ｇａｌ染色を使用するＳｙｎＧ
ＡＰおよびＨ-Ｒａｓの発現パターンを示している。ＢＳ、脳幹；Ｃ、皮質；Ｃ
Ｂ、小脳、Ｈ、海馬。典型的なＳｙｎＧＡＰ−／＋およびＨ-Ｒａｓ-／-切片が
示される。 図１２ｄは、海馬抽出物における野生型マウス、ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体、お
よびＨ-Ｒａｓ-/-変異体の異なるタンパク質レベルを比較する免疫ブロットを示
している。 左側パネル：ＧＡＰタンパク質の免疫ブロット分析。ＳｙｎＧＡＰ、ＮＦ-１
、およびＲａｓ-ＧＡＰが、野生型（ｗｔ）、ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体、およびＨ
-Ｒａｓ-/-変異体において検出された。野生型と比較して減少された量のＳｙｎ
ＧＡＰタンパク質が、ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体において観察された。 中央パネル：Ｒａｓタンパク質の免疫ブロット解析。Ｈ-Ｒａｓが、野生型マ
ウスにおいて検出され、およびＳｙｎＧＡＰ-/+変異体において正常であった。
Ｐａｎ-Ｒａｓ抗体は、全てのＲａｓイソ型を認識し、Ｈ-Ｒａｓ-/-変異体にお
いてより低い全Ｒａｓレベルを、およびＳｙｎＧＡＰ-/+変異体において正常な
レベルを示した。 右側パネル：ＮＭＤＡＲサブユニット（ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ）および
ＰＳＤ-９５の免疫ブロット解析。等価なレベルが、野生型（ｗｔ）、ＳｙｎＧ
ＡＰ-/+、Ｈ-Ｒａｓ-/-抽出物において観察された。
【図１３】 ＳｙｎＧＡＰ-/+およびＨ-Ｒａｓ-/-変異体マウスにおける海馬ＣＡ１領域の
神経解剖。 Ｎｉｓｓｌ；ＣＡ１錐体細胞のクレシルバイオレット染色。 シナプトフィシン：シナプスベシクルマーカータンパク質についての免疫組織
化学。 ＭＡＰ２；樹状突起マーカータンパク質についての免疫組織化学 Ｇｏｌｇｉ；放射状層の遠位領域におけるゴルジ浸透性の錐体ニューロンから
のＣＡ１尖端樹状細胞のモンタージュ画像。 ＥＭ；ＣＡ１領域の放射状層における非対称性の軸索とげ状のシナプスの電子
顕微鏡画像。 スケールバー；Ｎｉｓｓｌ、シナプトフィシン、ＭＡＰ２ ５０μｍ；ゴルジ
、１０μｍ；ＥＭ、０．５μｍ。 ＳＲ、放射状層；Ｓｐ．錐体細胞体層；ｗｔ、野生型；ＳｙｎＧＡＰ-/+およ
びＨ-Ｒａｓ-/-変異体が示される。
【図１４】 ＳｙｎＧＡＰ変異体マウスにおけるＮＭＤＡＲ依存性海馬ＬＴＰ。 ＬＴＰは、ＮＭＤＡ受容体媒介性シナプス電流における変化の不在下、Ｓｙｎ
ＧＡＰ-/+変異体において減少された。 （図１４ａ） ＥＰＳＣのＮＭＤＡ受容体媒介性成分のマグニチュードが、ＥＰＳＣの開始の
５０ミリ秒後で測定されたシナプス電流の振幅によって見積もられ、およびＥＰ
ＳＣの開始の５ミリ秒後のＥＰＳＣ測定の大きさによって見積もられるＡＭＰＡ
受容体成分のサイズに相対して表される。ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体マウス錐体細
胞におけるＥＰＳＣのＮＭＤＡ受容体媒介性成分の大きさ（黒棒、Ｎ＝５匹のマ
ウス、１５細胞）は、-８０ｍＶ（ここでＮＭＤＡ成分は細胞外Ｍｇ２+によって
大きくブロックされる）および+４０ｍＶの保持ポテンシャルにて野生型錐体細
胞において観察された大きさ（白棒、Ｎ＝５匹のマウス、１６細胞）から異なら
なかった。挿入図は、ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体（底部）および野生型マウス（上
部）からの細胞において、-８０および+４０ｍＶにて記録された例ＥＰＳＣ（３
応答の平均）を示す。検量線棒は、５０ｐＡおよび２５ミリ秒である。 （図１４ｂ） ベースライン記録の２０分間後、２連続の１００Ｈｚ刺激が、０時間にて１０
秒間の連続内間隔にて送達された。このプロトコルは、野生型動物から切片にお
いて強固なＬＴＰを誘導したが（白丸、ｆＥＰＳＰはベースラインの１８８±９
％に増強された、Ｎ＝７動物からの１１切片）、これはＳｙｎＧＡＰ-/+変異体
マウスからの切片において有意に少ないＬＴＰを誘導した（黒丸、ｆＥＰＳＰは
ベースラインの１５０±１０％に増強された、Ｎ＝７動物からの１１切片、ｔ（
１２）=３．１４、野生型ＬＴＰに比較してｐ＜０．０１）。 （図１４ｃ） ６連続の１００Ｈｚ刺激（それぞれ１秒間の持続時間）が、ＬＴＰの飽和化レ
ベルを誘導するために時間＝0で開始される５分間の連続内間隔で送達された。
野生型切片において、ｆＥＰＳＰはベースラインの２５７±２５％に増強された
が（白丸、Ｎ＝４動物からの７切片）、ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体からの切片にお
いてベースラインのわずか１５４±３％に増強された（黒丸、Ｎ＝５動物からの
１１切片、ｔ（７）=４．７１、野生型ＬＴＰに比較してｐ＜０．００５）。 （図１４ｄ） １、５、１０、または２０Ｈｚ刺激のいずれかの９００パルス連続の４０〜４
５分間後で存在する、野生型（白丸、各頻度についてそれぞれＮ＝５、５、５、
および７動物）およびＳｙｎＧＡＰ-/+変異体マウス（黒丸、各頻度についてそ
れぞれＮ＝９、７、７、および７動物）からのスライスにおける、ＬＴＰの量を
示すまとめのグラフ。１Ｈｚおよび５Ｈｚ連続のシナプス刺激はＳｙｎＧＡＰ-/
+および野生型マウスからの切片におけるシナプス伝達に対して類似の効果を示
したが、１０Ｈｚおよび２０Ｈｚ連続の刺激はＳｙｎＧＡＰ-/+マウスからの切
片において有意に小さなＬＴＰを誘導した（**ｐ＜０．００１、*ｐ＜０．０５
）。 （図１４ｅ） シナプス後脱分極化と対にされる低頻度（２Ｈｚ）シナプス前線維刺激によっ
て誘導されるＬＴＰは、ＳｙｎＧＡＰ-/+マウスからのＣＡ１錐体細胞において
減少された。ＥＰＳＰは、時間＝０にてシナプス後脱分極と対にされた。対合後
２５〜３０分間の間で記録されたＥＰＳＰは、野生型切片からの細胞においてベ
ースラインの２６２±１５％に増強され（白丸、Ｎ＝７動物からの１３切片）、
およびＳｙｎＧＡＰ-/+マウスからの細胞においてベースラインの１８５±９％
に増強された（黒丸、Ｎ＝８動物からの１２切片、ｔ（１３）=４．３５、野生
型に比較してｐ＜０．００１）。挿入図は、野生型マウス（トレースの左セット
）およびＳｙｎＧＡＰ-/+変異体動物（トレースの右セット）からの細胞におい
て、ベースラインと対合後３０分間との間に記録されたＥＰＳＣ（３応答の平均
）を示す。検量線棒は、５ｍＶおよび２５ミリ秒である。 （図１４ｆ） 図１４ｅにおいて示される平均結果によって表される全ての細胞（白丸は、野
生型動物からの細胞であり、黒丸はＳｙｎＧＡＰ-/+マウスからの細胞である）
中で見られた対合誘導性ＬＴＰの量を示す累積確立分布。
【図１５】 ＰＳＤ-９５がＳｙｎＧＡＰ-ＭＡＰＫ経路およびＭＡＰＫ-非依存性経路を結
びつける。 （図１５ａ） 短い連続の５Ｈｚ刺激（１５０パルス、時間＝０で送達される）の後、シナプ
ス伝達は、ＰＳＤ-９５（白三角、ｆＥＰＳＰは、ベースラインの２５８±３３
％に増強される、Ｎ＝４動物からの６切片）およびＳｙｎＧＡＰ-/+/ＰＳＤ-９
５ 二重変異体動物（黒三角、ｆＥＰＳＰはベースラインの２４４±７％に増強
される、Ｎ＝４動物からの９切片）からの切片において２倍を超えるＬＴＰに増
強された。ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体切片におけるシナプス強度に対する５Ｈｚ刺
激の効果を調査する実験からの結果が比較のために示される（白丸、ｅ部におい
てまとめられた実験からのデータ）。 （図１５ｂ） ＳｙｎＧＡＰ、Ｈ-Ｒａｓ、ＳｙｎＧＡＰ/Ｒａｓ変異体海馬抽出物におけるＭ
ＡＰＫ経路リン酸化。ＭＥＫおよびＭＡＰＫリン酸化（ｐＭＥＫ、ｐＭＡＰＫ）
を測定する免疫ブロットおよびタンパク質レベル（ＭＥＫ、ＭＡＰＫ）が、野生
型マウス（ｗｔ）、ＳｙｎＧＡＰ-/+、ＳｙｎＧＡＰ-/+/Ｈ−Ｒａｓ-/-、および
Ｈ−Ｒａｓ-/-変異体において示された。ＭＥＫおよびＭＡＰＫのリン酸化形態
が、ＳｙｎＧＡＰ-/+、ＳｙｎＧＡＰ-/+/Ｈ−Ｒａｓ-/-変異体において増加され
た。 （図１５ｃ） ＭＥＫインヒビターＵ０１２６（２０*Ｍ）は、野生型切片において５Ｈｚ刺
激誘導性ＬＴＰを阻害する。切片を５Ｈｚ刺激（時間＝０で送達される）の前の
少なくとも６０分間、Ｕ０１２６を含有するＡＣＳＦ中に連続的に浴した。強い
ＬＴＰが、ベヒクルコントロール実験において誘導された（０．２％ ＤＭＳＯ
、白丸、ｆＥＰＳＰはベースラインの２０９±７％に増強された、Ｎ＝６切片）
が、有意に少ないＬＴＰが、Ｕ０１２６処理された切片において誘導された（黒
丸、ｆＥＰＳＰはベースラインの１３７±９％であった、Ｎ＝１１切片、ｔ（１
５）＝５．４、コントロールに比較してｐ＜０．００１）。 （図１５ｄ） ＰＳＤ−９５変異体マウスからの切片において、Ｕ０１２６は５Ｈｚ刺激誘導
性ＬＴＰに対してほとんど効果を有しなかった。ｆＥＰＳＰはベヒクルコントロ
ール実験において、ベースラインの２６２±１４％（Ｎ＝８切片）に、およびＵ
０１２６に連続的に曝露された切片においてベースラインの２７０±１２％（Ｎ
＝１４切片）に増強された（ｔ（２０）＝０．４５、ベヒクルコントロール実験
から有意な差異はなかった）。 （図１５ｅ） 野生型、ＳｙｎＧＡＰ−／＋、Ｈ−Ｒａｓ-/-、およびＳｙｎＧＡＰ−/＋/Ｈ
−Ｒａｓ-/-二重変異体における１５０パルス連続の５Ｈｚ刺激の４５分後に見
られる電位の量のまとめ。短い連続の５Ｈｚ刺激（１５０パルス）後、野生型動
物からの切片においてベースラインの１７８±１４％（Ｎ＝６動物からの１２切
片）に増強されたが、ＳｙｎＧＡＰ-/+マウスからの切片においてベースライン
のわずか１２９±５％に増強された（Ｎ＝５動物からの１０切片、ｔ（9）＝３
．０３、野生型に比較してｐ＜０．０２**）。このプロトコルによって誘導され
るＬＴＰの量はまた、Ｈ-Ｒａｓ-/-変異体マウス（ｆＥＰＳＰはベースラインの
１５７±６％に増強された、Ｎ＝６動物からの１２切片）において観察された量
に比較してＳｙｎＧＡＰ-/+/Ｈ−Ｒａｓ-/-二重変異体（ｆＥＰＳＰはベースラ
インの１２０±４％であった、Ｎ＝５動物からの９切片、ｔ（9）＝２．３６、
ｐ＜０．０５*）において有意に減少された。 （図１５ｆ） ＳｙｎＧＡＰおよびＰＳＤ-９５変異体におけるＭＡＰＫ経路リン酸化。ＭＥ
ＫおよびＭＡＰＫリン酸化（ｐＭＥＫ、ｐＭＡＰＫ）を測定する免疫ブロットお
よびタンパク質レベル（ＭＥＫ、ＭＡＰＫ）が、野生型マウス（ｗｔ）、Ｓｙｎ
ＧＡＰ-/+、およびＰＳＤ-９５-/-変異体において示される。ＰＳＤ-９５-/-マ
ウスにおけるＭＥＫおよびＭＡＰＫのリン酸化形態は、ＳｙｎＧＡＰ-/+変異体
における増加されたレベルに比較して、野生型レベルに等価であった。
【図１６】 ＳｙｎＧＡＰ変異体マウスにおける学習および記憶。 （図１６ａ） ＳｙｎＧＡＰ-/+（ｎ＝２１）および野生型（ｎ＝２１）マウスにおける可視
合図（１日当たり４試行）に対する訓練の３日間にわたる経路長（平均±標準偏
差）。両群は十分に等しく行われた。 （図１６ｂ） 隠された台座に対する空間的な訓練の５日間にわたる経路長。ＳｙｎＧＡＰ変
異体は野生型に比較して僅かに悪化した。 （図１６ｃ） 移動試験１および２に対する標的地帯における時間浪費、全ての４つの地帯に
おける全時間浪費のパーセントとして示される。移動試験１において、ＳｙｎＧ
ＡＰ変異体は野生型に比較して僅かに悪化したが、訓練後変異体は移動試験２に
おいて野生型とほとんど同じくらい正確に探索した。 （図１６ｄ） 移動試験１および２における個々のＳｙｎＧＡＰ-/+および野生型マウスの代
表的な泳ぐ経路。破線の丸は、４つの地帯を示し、標的地帯は灰色で塗りつぶさ
れる。台座の位置は平衡されるが、泳ぐ経路は標的地帯がプールのＮＥ４分円に
おいて常に現れるような表示目的のために回転された。両方の移動試験において
、野生型マウスは正確な位置に探索したのに対し、変異体は移動試験１に対して
偶然に行ったが、移動試験２において野生型とほとんど同じ正確さで探索した。 （図１６ｅ） ＰＳＤ-９５-/-変異体（ｎ=１２）および野生型（ｎ＝９）についての移動試
験１および２における標的地帯中での時間浪費。野生型は両方の移動試験におい
て十分に行ったが、ＰＳＤ-/-変異体は全体を通じて偶然に行った。 （図１６ｆ） ＰＳＤ-９５-/-変異体および野生型マウスの代表的な泳ぐ経路。変異体が、長
期間の訓練後であっても標的位置において探索できない（移動試験２）ことに留
意のこと。 （図１６ｇ） 移動試験データを解釈するための考えられ得るフレームワーク。野生型マウス
は迅速に学習し、すぐに漸近線に達する。ＳｙｎＧＡＰ変異体はゆっくりと学習
するが、野生型によって到達されるのに等価な漸近線に徐々に接近し始める。Ｐ
ＳＤ-９５変異体は、対照的に、それらが受ける訓練の量にかかわらずほとんど
学習しない。
【図１７】 ＮＭＤＡＲ、ＰＳＤ-９５、ＳｙｎＧＡＰ、およびＭＡＰＫを連結する経路の
概要。 多タンパク質複合体（大きな点線円）の経路間の機能的な関係が記載される。
ＮＭＤＡＲは、それ自身２つの経路（四角で囲まれる）の上流であるＰＳＤ-９
５の上流である。ＳｙｎＧＡＰからＭＡＰＫ経路は、ＬＴＰを増強することを伴
い、およびＭＡＰＫ依存性経路はＬＰＴを抑制する。これらの経路の協調作用は
、シナプス可塑性についての誘導閾値を、従ってさらに下流にあるＡＭＰＡ受容
体の調節のようなＬＴＰの発現機構を制御し得る。
【図１８】 脊髄におけるＰＳＤ−９５およびＮＭＤＡ受容体複合体の成分の発現。 図１８（ａ〜ｄ）は、ヘテロ接合体ＰＳＤ-９５変異体マウスの腰部脊髄（Ｌ
３〜Ｌ６）におけるβ-ガラクトシダーゼ発現を示している。動物（Ｎ＝５）を
０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドで灌流した。１０μｍ切片
を氷上でＰＢＳ/ＭｇＣｌ２、次いで（０．１Ｍ ＰＢＳ中の、０．０４１％
ＭｇＣｌ２、０．０１％デオキシコール酸ナトリウム、０．０２％ Ｎｏｎｉｄ
ｅｎｔ-ＮＰ４０）で洗浄した。切片を（１μｇ/ｍｌの５-ブロモ-４-クロロ-３
-インドリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼを含有する洗浄剤緩衝液中の０．０４２％
フェロシアン化カリウム、０．０３３％フェリシアン化カリウム）中２２℃で染
色し、そして暗所にて３７℃で４〜６時間温置した。（ａ）、横切片、後角薄板
ＩＩにおけるポジティブ細胞の特異的な分布を示す。（ｂ）（ａ）の挿入図、よ
り高い倍率でのポジティブ細胞を示す（ｃ）、後角を通る縦方向切片、背表面に
対して平行に切断、β-ガラクトシダーゼポジティブ細胞を示す。（ｄ）縦方向
切片、後角において染色するが、後根入口の部位では染色しないことを示す（矢
印）。スケールバー＝１０μｍ。（ｅ）は野生型マウスからのＬ３〜Ｌ６脊髄の
親和性免疫沈降におけるＮＭＤＡ受容体複合体タンパク質の存在についての免疫
ブロットを示す。脊髄および前脳に対する直接的な免疫ブロットが比較のために
示される。
【図１９ａ】 （坐骨神経に対する慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）を受けた野生型およびＰＳＤ-９５
変異体マウスの挙動分析） 野生型マウス（白丸）において、野生型マウスについての坐骨神経に対して行
われたＣＣＩに対して同側の障害性熱刺激からの足撤退は、同側における術後に
比較した術前値間で（†ｐ≦０．０５；Ｋｒｕｓｋａｌ-Ｗａｌｌｉｓ 一方向
ＡＮＯＶＡ）、および術後の、対側値（*ｐ≦０．０５、**ｐ≦０．００１、Ｓ
ｔｕｄｅｎｔのｔ検定による）から有意な差異を示した。データは、対側に対す
る同側の足撤退潜在性（ＰＷＬ）の比率として示される。熱痛覚過敏を反映する
対応する差異は、全ての変異体マウス（黒四角）または野生型マウスの対側にお
いて全く見られなかった。
【図１９ｂ】 （坐骨神経に対する慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）を受けた野生型およびＰＳＤ-９５
変異体マウスの挙動分析） 野生型マウスについての機械的刺激に対する足撤退（白丸）は、ＣＣＩに対し
て同側において、術前と術後の間（†ｐ≦０．０１；ランクにおけるＤｕｎｎ法
ＡＮＯＶＡ）、および術後の同側値と対側値との間（**ｐ≦０．００１、Mann
-Whitney Rank Sum検定）で有意な差異を示した。データは、対側に対する同側
の足撤退閾値（ＰＷＴ）の比率としてプロットされる。有意な差異は、ＰＳＤ−
９５変異体（黒四角）において（または野生型の対側において）試験のいずれの
日においても見られず、機械的異痛の発症のないことを示す。
【図１９ｃ】 （坐骨神経に対する慢性狭窄損傷（ＣＣＩ）を受けた野生型およびＰＳＤ-９５
変異体マウスの挙動分析） 冷却（４℃）刺激に応答するSuspended Paw Elevation Time（ＳＰＥＴ）が、
野生型マウス（白丸）およびＰＳＤ−９５変異体マウス（黒四角）において同側
について示される。ＳＰＥＴスコアは、野生型および変異体マウスの両方につい
て対側に対して常にゼロを分析された。有意な差異が、術前値と術後値との間（
†ｐ＜０．０１；ランクにおけるＤｕｎｎ法 ＡＮＯＶＡ）、および同側応答と
対側応答との間（**、ｐ＜０．０１、Mann-Whitney Rank Sum検定）で示された
。８匹の野生型マウスおよび９匹のＰＳＤ−９５変異体マウスが、各場合におい
て試験された。平均±ＳＥＭ値が示される。
【図２０ａ】 （未処置マウスにおけるＮＭＤＡ髄腔内注射の効果、および、ＣＣＩマウスにお
けるＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（Ｒ）-ＣＰＰの効果） 図２０ａにおいて、足撤退潜在性（ＰＷＬ）が、未処置の野生型マウス（白菱
形；ｎ＝６）およびＰＳＤ−９５変異体マウス（黒菱形；ｎ＝７）へのＮＭＤＡ
の同側投与（１０μｌ中の０．２５ｎｍｏｌ、矢印）の前および後で、障害性熱
刺激に応答して測定された。統計学的有意性（*Ｐ≦０．０１）が、ＰＷＬ生デ
ータに対するＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって決定された。図２０ａのデータは
、平均±ＳＥＭとしてプロットされた注入前ベースライン応答の平均のパーセン
トである。
【図２０ｂ】 （未処置マウスにおけるＮＭＤＡ髄腔内注射の効果、および、ＣＣＩマウスにお
けるＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（Ｒ）-ＣＰＰの効果） 図２０ｂにおいて、足撤退潜在性（ＰＷＴ）が、野生型マウス（白菱形）およ
びＰＳＤ−９５変異体マウス（黒菱形）へのＮＭＤＡ（矢印）の同側投与の前お
よび後で、機械的熱刺激に応答して測定された。統計学的有意性が、Ｍａｎｎ-
Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ検定によって決定された（*Ｐ≦０．０１）
。図２０ｂのデータは、平均±ＳＥＭとしてプロットされた注入前ベースライン
応答の平均のパーセントである。
【図２０ｃ】 （未処置マウスにおけるＮＭＤＡ髄腔内注射の効果、および、ＣＣＩマウスにお
けるＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（Ｒ）-ＣＰＰの効果） 図２０ｃにおいて、熱痛覚過敏のピーク（ＣＣＩに対して同側、以前１２日間
に誘導された）での野生型マウスは、感作の逆転を評価するために（Ｒ）-ＣＰ
Ｐ（矢印）を１０μｌ中の１００ｐｍｏｌの用量でくも膜下腔内に注入された（
白丸；ｎ＝６）。（Ｒ）-ＣＰＰは、同様に調製されたＰＳＤ−９５変異体（黒
四角；ｎ＝７）に対して投与された場合、何の効果も有しなかった。データは、
同側：対側足撤退潜在性（ＰＷＬ）の平均（±ＳＥＭ）比率としてプロットされ
、および切片間のＰＷＬにおいて統計学的に有意な差異が、*として示される（
ＰＷＬ生データに対するＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によりＰ≦０．０１）。
【図２０ｄ】 （未処置マウスにおけるＮＭＤＡ髄腔内注射の効果、および、ＣＣＩマウスにお
けるＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト（Ｒ）-ＣＰＰの効果） 図２０ｄにおいて、ＰＳＤ−９５マウス変異体（黒四角）に比較される野生型
マウス（白丸）においてＣＣＩに対して同側に発症する機械的無痛に対する（Ｒ
）-ＣＰＰの効果が示される。データは同側：対側足撤退閾値（ＰＷＴ）の平均
（±ＳＥＭ）比率としてプロットされ、および切片間のＰＷＴにおける統計学的
に有意な差異が、*として示される（Ｍａｎｎ-Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によりＰ
≦０．０１）。いずれの場合においても、術前値に比較される対側応答に対する
（Ｒ）-ＣＰＰの任意の有意な効果はなかった。（Ｒ）-ＣＰＰは、未処理または
偽手術された野生型またはＰＳＤ−９５変異体マウスに対して投与された場合、
なんの効果も有しなかった（データ示されず）。
【図２１】 ＣＣＩ手術後の野生型マウスおよびＰＳＤ−９５変異体マウスからのＮＲ１免
疫沈降におけるホスホ-Ｓｅｒ８９７−ＮＲ１およびｐａｎ-ＮＲ１についての免
疫ブロット。 予め１２日間誘導された坐骨ＣＣＩ後の半切片化された脊髄のウェスタンブロ
ット解析。２匹の野生型または２匹のＰＳＤ−９５変異体マウスのいずれかから
の、損傷に対して同側または対側のマウス脊髄組織からのブロットは、ｐａｎ−
ＮＲ１またはホスホ-Ｓｅｒ８９７-ＮＲ１についての抗体でプローブされた。 レーンＡ、野生型における損傷に対して同側、レーンＢ、野生型における損傷
に対して対側。レーンＣ、ＰＳＤ−９５変異体における損傷に対して同側、およ
びレーンＤ、ＰＳＤ−９５変異体における損傷に対して対側。
【図２２】 ＣＣＩ後の野生型マウスにおける灌流神経障害性疼痛挙動に対する選択的なＣ
ａＭキナーゼＩＩインヒビターの効果。 ＣＣＩ後の神経感作のピークで、マウスは、ミリストイル-オートカミド２関
連性阻害ペプチド（１０μｌ中の１ｎｍｏｌ）、Ｋ−９３（１０μｌ中の１２０
ｐｍｏｌ）またはほとんど活性でないコントロールアナログ、ＫＮ−９２（１０
μｌ中の１２０ｐｍｏｌ）をくも膜下腔内に注入された。各場合においてｎ値は
７〜９であった。熱痛覚過敏および機械的無痛試験の両方についてのデータを、
注入後の２つの時間ウインドウ（１０〜３０分間、および６０〜８０分間）応答
における同側：対側差異の逆転の平均パーセントとしてプロットした。各場合に
おいて、薬剤は同側に見られた感作の減少を引き起こし、注入前レベルに比較し
ていずれの対側応答においても有意な変化はなかった。各場合において、１０〜
３０分間にて見られた同側感作の減少（すなわち、同側：対側差異の減少）は、
６０〜８０分間までに部分的な回復を示した。注入前および注入後応答値を比較
するＷｉｌｃｏｘａｎ検定によって*ｐ≦０.０５。
【図２３】 野生型およびＰＳＤ−９５変異体マウスの腰部脊髄におけるＣａＭキナーゼＩ
Ｉの構成的な活性に対するＮＭＤＡ／グリシンおよびＣＣＩの効果。 ＣａＭキナーゼＩＩ免疫沈降およびキナーゼ活性試験に先立ち、組織の迅速な
除去および均一化の前にＬ３〜Ｌ６脊髄の背側表面に薬剤を１５分間、局所的に
適用した。未処理のＰＳＤ−９５変異体マウスの脊髄からの免疫沈降における平
均最大ＣａＭキナーゼＩＩ活性は、野生型マウスにおける活性と変化されなかっ
た（それぞれ、１０８.３±１３.７および９７.８±１３.１ｐｍｏｌ ３３Ｐ／
分／μｇの元来の抽出物タンパク質）。データは、最大ＣａＭキナーゼＩＩ活性
のパーセントとして表され、平均±ＳＥＭ、ｎ=４である。（ｂ）における対応
する対側値に比較して、統計学的有意差が*として示される、Mann Whitney U検
定によってｐ≦０.０５。
【図２４】 野生型マウスおよびＰＳＤ−９５変異体マウスの両側頚動脈閉塞後の尾状核に
おける虚血性神経障害（％）を示す図である。
【図２５】 野生型マウスおよびＰＳＤ−９５変異体マウスの両側頚動脈閉塞後の海馬のＣ
Ａ１錘体細胞層における虚血性神経障害（％）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/20 Ａ６１Ｐ 25/28 ４Ｈ０４５ 25/28 Ｃ０７Ｋ 1/00 Ｃ０７Ｋ 1/00 1/22 1/22 14/47 14/47 14/705 14/705 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ Ｃ１２Ｑ 1/68 30/88 Ｊ Ｇ０１Ｎ 30/48 33/15 Ｚ 30/88 33/50 Ｚ 33/15 33/53 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/566 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＣＯＵＲ Ｔ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＥＤＩＮＢＵＲＧＨ ＩＮＣＯＲ ＰＯＲＡＴＥＤ ＵＮＤＥＲ ＴＨＥ Ｕ ＮＩＶＥＲＳＩＴＩＥＳ （ＳＣＯＴＬＡ ＮＤ） ＡＣＴＳ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅ ｄｉｎｂｕｒｇｈ， Ｏｌｄ Ｃｏｌｌｅ ｇｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｂｒｉｄｇｅ， Ｅ ｄｉｎｂｕｒｇｈ， ＥＨ８ ９ＹＬ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ (72)発明者 グラント， セス ガラン ニールス イギリス， ＥＨ８ ９ＪＺ， エディン バラ， ジョージ スクウェア １， ユ ニバーシティ オブ エディンバラ， デ パートメント オブ ニューロサイエンス (72)発明者 ハッシ， ホルガー イギリス， ＥＨ８ ９ＪＺ， エディン バラ， ジョージ スクウェア １， ユ ニバーシティ オブ エディンバラ， デ パートメント オブ ニューロサイエンス Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA40 BB03 BB20 CB01 CB17 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB05 FB06 4B024 AA01 AA11 AA20 BA63 BA80 CA02 CA09 DA02 GA11 HA01 HA14 HA20 4B063 QA13 QA19 QQ02 QQ43 QQ53 QR32 QR35 QR40 QR55 QS31 4B065 AA91X AA91Y AB01 AC14 AC20 BA16 CA24 CA46 4C084 AA17 NA14 ZA022 ZA052 ZA152 ZA182 ZA362 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA05 BA10 CA40 DA50 DA75 EA50 FA74 FA82 GA26

Claims (77)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 多タンパク質の複合体であって、 ポリぺプチドサブユニットＮＲ１と、表１に列挙された成分の群から選択され
    る少なくとも１つの成分とを含有する 複合体。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載された複合体であって、 表１および/または表２に列挙された成分の群から選択される３つ、４つ、５
    つ、６つまたはそれ以上の異なる成分を含有する 複合体。
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載された複合体であって、 ポリぺプチドサブユニットＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＰＳＤ−９５と、表
    １に列挙された成分の群から選択される少なくとも１つの成分とを含有する 複合体。
  4. 【請求項４】 請求項１乃至３の何れかに記載された複合体であって、 表１および表２に列挙された成分のすべてを含有する 複合体。
  5. 【請求項５】 請求項１乃至４の何れかに記載され、ペプチド親和性クロマ
    トグラフィー法により得ることができる複合体であって、 前記ペプチド親和性クロマトグラフィー法は、 （ｉ）動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集し、 （ｉｉ）ＰＳＤ−９５に結合するペプチドと、前記サンプルとを接触させること
    により前記複合体を単離する ステップを含む 複合体。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載された複合体であって、 ＰＳＤ−９５に結合するペプチドが、ＳＩＥＳＤＶまたはＫＲＬＬＤＡＱＲＧ
    ＳＦＰＰＷＶＱＱＴＲＶである 複合体。
  7. 【請求項７】 請求項１乃至６の何れかに記載された複合体のサブ複合体で
    あって、 表１および表２に列挙された成分から選択される２つ以上のポリぺプチド成分
    を含有しており、 前記ポリぺプチド成分の少なくとも１つが、表１に列挙された群から選択され
    る サブ複合体。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載されたサブ複合体であって、 ３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の成分を含有する サブ複合体。
  9. 【請求項９】 請求項１乃至６の何れかに記載された多タンパク質複合体、
    または、請求項７もしくは８に記載されたサブ複合体を生成する方法であって、 （ｉ）動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集し、 （ｉｉ）表１および表２で同定される任意の１つ以上の成分に結合するペプチ
    ドと、前記サンプルとを接触させることにより複合体を単離する ステップを含んでおり、 前記ペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントの何れでもない 方法。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載された方法であって、 前記ペプチドは、ＰＤＺドメインを含む１つ以上の成分に結合し、かつ、前記
    成分のＰＤＺドメインを介して結合する 方法。
  11. 【請求項１１】 請求項９または１０に記載された方法であって、 前記複合体は、ペプチド親和性クロマトグラフィーを用いて単離される 方法。
  12. 【請求項１２】 請求項９乃至１１の何れかに記載された方法であって、 前記ペプチドは、ＰＳＤ−９５に結合する 方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載された方法であって、 前記ペプチドは、ヒトＮＭＤＡ-Ｒ２ＢサブユニットのＣ末端の領域のアミノ
    酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む 方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載された方法であって、 前記ペプチドは、アミノ酸配列ＳＩＥＳＤＶを含む 方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１２に記載された方法であって、 前記ペプチドは、ＫＬＳＳＩＥＳＤＶである 方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１４に記載された方法であって、 前記ペプチドは、ＳＩＥＳＤＶである 方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１２に記載された方法であって、 前記ペプチドは、ＳｙｎＧＡＰサブユニットのＣ末端の領域のアミノ酸配列と
    同一であるアミノ酸配列を含む 方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載された方法であって、 前記ペプチドは、アミノ酸配列ＱＴＲＶであるか、またはそれを含む 方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載された方法であって、 前記ペプチドは、ＫＲＬＬＤＡＱＲＧＳＦＰＰＷＶＱＱＴＲＶであるか、また
    はそれを含む 方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１乃至６の何れかに記載された多タンパク質複合体
    、または、請求項７もしくは８に記載されたサブ複合体を生成する方法であって
    、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）を含み、 ステップ（ｉ）は、動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集するステップ
    であり、 ステップ（ｉｉ）は、表１に列挙された成分から選択される成分に結合する分
    子と、前記サンプルとを接触させることにより複合体を単離するステップである
    方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１乃至６の何れかに記載された多タンパク質複合体
    、または、請求項７もしくは８に記載されたサブ複合体を生成する方法であって
    、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）を含み、 ステップ（ｉ）は、請求項１乃至６の何れかに記載された多タンパク質複合体
    を発現する動物の中枢神経系から組織のサンプルを収集するステップであり、表
    １に示された成分のうち、少なくとも１つの成分の発現が、野生型多タンパク質
    複合体を発現する動物との比較において改変され、 ステップ（ｉｉ）は、異常な複合体の成分に結合する分子と、前記サンプルと
    を接触させることにより複合体を単離するステップである 方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載された方法であって、 前記動物は、トランスジェニック非ヒト動物である 方法。
  23. 【請求項２３】 請求項２０乃至２２の何れかに記載された方法であって、 前記分子は、抗体、またはその抗原結合フラグメントである 方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載された方法であって、 前記複合体は、免疫沈降により単離される 方法。
  25. 【請求項２５】 請求項２３に記載された方法であって、 前記複合体は、免疫親和性クロマトグラフィーを用いて単離される 方法。
  26. 【請求項２６】 請求項２０乃至２２の何れかに記載された方法であって、 前記複合体は、ペプチド親和性クロマトグラフィーにより単離される 方法。
  27. 【請求項２７】 請求項５もしくは６に記載された複合体、または、請求項
    ９乃至２６の何れかに記載された方法であって、 組織のサンプルは、脳から得られる 複合体または方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２７に記載された複合体または方法であって、 組織のサンプルは、前脳から得られる 複合体または方法。
  29. 【請求項２９】 請求項５、６、２７もしくは２８の何れかに記載された複
    合体、または、請求項９乃至２８の何れかに記載された方法であって、 組織のサンプルは、成体、若年体または新生仔の哺乳動物における中枢神経系
    から得られる 複合体または方法。
  30. 【請求項３０】 請求項９乃至２９の何れかに記載された方法であって、 （ステップ（ｉ）の前に）組織が採取される哺乳動物の年齢を選択する ステップを含む 方法。
  31. 【請求項３１】 請求項７または８に記載されたサブ複合体を作製する方法
    であって、 （ｉ）表１および表２で同定される成分から選択される第１の成分をコードする
    遺伝子構築物を、宿主細胞において発現させ、 （ｉｉ）表１および表２で同定される成分から選択される第２の成分をコードす
    る遺伝子構築物を、宿主細胞において発現させ、 （ｉｉｉ）宿主細胞培養物から成分を単離し、 （ｉｖ）前記成分を互いに接触させる ステップを含んでおり、 前記第１の成分と、前記第２の成分とは異なり、少なくとも一方の成分が表１
    に示された成分から選択される 方法。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載された方法であって、 成分を互いに接触させるステップの前に、表１および表２で同定される成分か
    ら選択される成分をコードする少なくとも１つのさらなる遺伝子構築物を、宿主
    細胞において発現させる ステップを含む 方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３１または３２に記載された方法であって、 それぞれの成分が、異なる宿主細胞において発現される 方法。
  34. 【請求項３４】 請求項３１または３２に記載された方法であって、 １つ以上の成分が、同じ宿主細胞において発現される 方法。
  35. 【請求項３５】 請求項８乃至３４の何れかに記載された方法で用いるため
    の宿主細胞であって、 表１に列挙された成分の群から選択される成分をコードするような１つ以上の
    遺伝子構築物を含む 宿主細胞。
  36. 【請求項３６】 請求項３５に記載された宿主細胞であって、 表１および表２に列挙された成分の群から選択される２つ以上の成分をコード
    するような１つ以上の遺伝子構築物を含む 宿主細胞。
  37. 【請求項３７】 請求項３５または３６に記載された宿主細胞であって、 表１および表２に列挙された２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の
    成分をコードするような遺伝子構築物を含む 宿主細胞。
  38. 【請求項３８】 請求項３５乃至３７の何れかに記載された宿主細胞であっ
    て、哺乳動物細胞である宿主細胞。
  39. 【請求項３９】 請求項３５乃至３８の何れかに記載された宿主細胞であっ
    て、ニューロンであるか、またはニューロンから得られる細胞である 宿主細胞。
  40. 【請求項４０】 請求項３５乃至３９の何れかに記載された宿主細胞から単
    離される亜細胞画分であって、 請求項１乃至６の何れかに記載された多タンパク質複合体、または、請求項７
    もしくは８に記載されたサブ複合体を、その中に含む 亜細胞画分。
  41. 【請求項４１】 請求項４０に記載された亜細胞画分であって、原形質膜で
    あるか、または、それを含む亜細胞画分。
  42. 【請求項４２】 請求項７または８に記載されたサブ複合体を作製する方法
    であって、 （ｉ）請求項１乃至６の何れかに記載された複合体と、タンパク質-タンパク質
    間相互作用を妨げる薬剤とを接触させ、 （ｉｉ）それにより形成されるサブ複合体を単離する ステップを含む 方法。
  43. 【請求項４３】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態を処置するための候補化合物を同定する方法であって、 （ｉ）試験される化合物を選択し、 （ｉｉ）請求項１乃至６の何れかに記載された多タンパク質複合体、または、請
    求項７もしくは８に記載されたサブ複合体の何れかと、試験化合物とを接触させ
    、 （ｉｉｉ）試験される化合物が複合体またはサブ複合体と相互作用するか否かを
    判定する ステップを含んでおり、 複合体またはサブ複合体と相互作用する試験化合物は、中枢神経系におけるＮ
    ＭＤＡ受容体の機能障害の徴候を軽減し、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の
    機能障害の発病を防止もしくは遅延し、ならびに／または、中枢神経系における
    ＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態に関連付けられる欠
    損を修正するための候補化合物として同定される 方法。
  44. 【請求項４４】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態を処置するための候補化合物を同定する方法であって、 （ｉ）試験される化合物を選択し、 （ｉｉ）表１に列挙された成分から選択される成分と、試験化合物とを接触させ
    、 （ｉｉｉ）試験される化合物が成分の特性を調節するか否かを判定する ステップを含んでおり、 成分の特性を調節する試験化合物は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機
    能障害の徴候を軽減し、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害の発病を
    防止もしくは遅延し、ならびに／または、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の
    機能障害に関連付けられる異常および状態に関連付けられる欠損を修正するため
    の候補化合物として同定される 方法。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載された方法であって、 ステップ（ｉｉｉ）は、 化合物が、表１もしくは表２に列挙された１つ以上の他の成分、または、その
    サブ複合体と相互作用する成分の能力を調節するか否かを判定するステップを含
    む 方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４３乃至４５の何れかに記載された方法であって、 学習的欠陥、精神医学的異常および／または神経学的異常に対する処置の効能
    に関する１つ以上のスクリーニングにおいて、試験化合物を試験するステップを
    含む 方法。
  47. 【請求項４７】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態を処置するための候補化合物を同定する方法であって、 （ｉ）表１に列挙された成分の特性を調節すると知られている化合物を、選択し
    、 （ｉｉ）中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常お
    よび状態に対する処置の効能に関するスクリーニングにおいて、前記化合物を試
    験する ステップを含む 方法。
  48. 【請求項４８】 化合物であって、 請求項４３乃至４７の何れかに記載された方法により得ることができるか、ま
    たは得られる 化合物。
  49. 【請求項４９】 薬学的組成物であって、 請求項４８に記載された化合物もしくはその塩と、薬学的に受容される腑形剤
    もしくはキャリアとを含む 薬学的組成物。
  50. 【請求項５０】請求項４８に記載された化合物であって、医学的使用のため
    の化合物。
  51. 【請求項５１】 請求項４８に記載された化合物の使用方法であって、 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状
    態を処置するための薬物を調製する 使用方法。
  52. 【請求項５２】 請求項５１に記載された使用方法であって、 異常または状態は、学習的欠陥、精神医学的異常および／または神経学的異常
    から選択される 使用方法。
  53. 【請求項５３】 学習的欠陥、精神医学的異常および／または神経学的異常
    を呈する患者を処置する方法であって、 請求項４５に記載された化合物を、前記患者に投与するステップを含む 方法。
  54. 【請求項５４】 表１に列挙された１つ以上の成分の特性を調節する化合物
    の使用方法であって、 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状
    態を処置するための薬物を調製する 使用方法。
  55. 【請求項５５】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態を呈する患者を処置する方法であって、 表１に列挙された１つ以上の成分の特性を調節する化合物を、前記患者に投与
    するステップを含む 方法。
  56. 【請求項５６】 請求項５１、５２または５４の何れかに記載された使用方
    法であって、 前記薬物は、学習的欠陥を処置するためのものである 使用方法。
  57. 【請求項５７】 請求項５１、５２または５４の何れかに記載された使用方
    法であって、 前記薬物は、精神医学的異常を処置するためのものである 使用方法。
  58. 【請求項５８】 請求項５７に記載された使用方法であって、 前記薬物は、精神分裂病を処置するためのものである 使用方法。
  59. 【請求項５９】 請求項５１、５２または５４の何れかに記載された使用方
    法であって、 前記薬物は、神経学的異常を処置するためのものである 使用方法。
  60. 【請求項６０】 請求項５９に記載された使用方法であって、 前記薬物は、脳卒中または癲癇を処置するためのものである 使用方法。
  61. 【請求項６１】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態を診断するか、または、診断を補助する方法であって、 （ｉ）診断される被験体から、核酸を含有するサンプルを得、 （ｉｉ）表１に列挙された成分をコードする核酸、その変異体対立遺伝子または
    それらの相補体に選択的にハイブリダイズする核酸と、被験体からの前記核酸と
    を接触させる ステップを含む 方法。
  62. 【請求項６２】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態を予後診断するか、または予後診断を補助する方法であっ
    て、 （ｉ）診断される被験体から、核酸を含有するサンプルを得、 （ｉｉ）表１に列挙された成分をコードする核酸、その変異体対立遺伝子または
    それらの相補体に選択的にハイブリダイズする核酸と、被験体からの前記核酸と
    を接触させる ステップを含む 方法。
  63. 【請求項６３】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態に対する患者の罹患性を判定する方法であって、 （ｉ）診断される患者から、核酸を含有するサンプルを得、 （ｉｉ）表１に列挙された成分をコードする核酸、その変異体対立遺伝子または
    それらの相補体に選択的にハイブリダイズする核酸と、患者からの前記核酸とを
    接触させる ステップを含む 方法。
  64. 【請求項６４】 請求項６１乃至６３の何れかに記載された方法であって、 異常または状態は、学習的欠陥、精神医学的異常および／または神経学的異常
    から選択される 方法。
  65. 【請求項６５】 請求項６１乃至６３の何れかに記載された方法であって、 表１に列挙された成分をコードする核酸は、遺伝子である 方法。
  66. 【請求項６６】 請求項６１乃至６５の何れかに記載された方法であって、 表１および表２に列挙された成分の群から選択される成分をコードする核酸、
    その変異体対立遺伝子またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする少な
    くとも１つのさらなる核酸と、被験体からの核酸とを接触させるステップを含ん
    でおり、 被験体からの核酸にハイブリダイズする各核酸は、異なる成分をコードする 方法。
  67. 【請求項６７】 請求項６１乃至６６の何れかに記載された方法であって、 表１に列挙された成分の群から選択される成分をコードする核酸、その変異体
    対立遺伝子またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸
    は、検出可能な部分を含む 方法。
  68. 【請求項６８】 請求項６１乃至６７の何れかに記載された方法であって、 表１に列挙された成分の群から選択される成分をコードする核酸、その変異体
    対立遺伝子またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸
    は、１本鎖化される 方法。
  69. 【請求項６９】 請求項６１乃至６８の何れかに記載された方法であって、 表１に列挙された成分の群から選択される成分をコードする核酸、その変異体
    対立遺伝子またはそれらの相補体に選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸
    は、１０００未満の塩基対（当該核酸が２本鎖である場合）もしくは塩基（当該
    核酸が１本鎖である場合）、例えば、１００未満の塩基対もしくは塩基である 方法。
  70. 【請求項７０】 請求項６１乃至６９の何れかに記載された方法であって、 患者からの核酸において、表１に列挙された成分をコードする核酸の配列改変
    体の存在を同定し、 １つ以上の試験母集団からの個体における等価な核酸の配列に対して前記配列
    改変体を比較する ステップを含む 方法。
  71. 【請求項７１】 請求項７０に記載された方法であって、 １つ以上の試験母集団は、中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関
    連付けられる異常および状態を被らず、かつ、以前に被らなかった個体の集団を
    含む 方法。
  72. 【請求項７２】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態に対する被験体の罹患性を診断し、予後診断し、および／
    または判定する方法であって、 （ｉ）試験対象の被験体から、抗体を含むサンプルを得、 （ｉｉ）前記サンプルが、請求項１乃至６の何れかに記載された多タンパク質複
    合体、または、請求項７もしくは８に記載されたサブ複合体に反応するような抗
    体を含有しているか否かを判定する ステップを含む 方法。
  73. 【請求項７３】 中枢神経系におけるＮＭＤＡ受容体の機能障害に関連付け
    られる異常および状態に対する患者の罹患性を診断し、予後診断し、または判定
    するのに有用なパーツ一式であって、 核酸間ハイブリダイゼーションを促進するための、かつ、それにより形成され
    たハイブリッドを検出するための酵素および試薬とともに、表１に列挙された成
    分をコードする核酸に選択的にハイブリダイズする核酸を含む パーツ一式。
  74. 【請求項７４】 本明細書に記載された任意の新規な多タンパク質複合体。
  75. 【請求項７５】 本明細書に記載されたように、中枢神経系におけるＮＭＤ
    Ａ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態を処置するための候補化合
    物を同定する新規な方法。
  76. 【請求項７６】 本明細書に記載されたように、中枢神経系におけるＮＭＤ
    Ａ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態を呈する患者を処置するた
    めの新規な方法。
  77. 【請求項７７】 本明細書に記載されたように、中枢神経系におけるＮＭＤ
    Ａ受容体の機能障害に関連付けられる異常および状態に対して診断し、予後診断
    し、または患者の罹患性を判定する新規な方法。
JP2001575640A 2000-04-06 2001-04-06 生物学的物質およびその使用方法 Withdrawn JP2003530125A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0008321.2A GB0008321D0 (en) 2000-04-06 2000-04-06 Biological material and uses thereof
GB0008321.2 2000-04-06
PCT/GB2001/001570 WO2001077170A2 (en) 2000-04-06 2001-04-06 Multiprotein-complexes comprising a nmda receptor and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003530125A true JP2003530125A (ja) 2003-10-14

Family

ID=9889219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001575640A Withdrawn JP2003530125A (ja) 2000-04-06 2001-04-06 生物学的物質およびその使用方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20030176651A1 (ja)
EP (1) EP1272517B1 (ja)
JP (1) JP2003530125A (ja)
AT (1) ATE411341T1 (ja)
AU (1) AU4441101A (ja)
CA (1) CA2405311A1 (ja)
DE (1) DE60136170D1 (ja)
GB (1) GB0008321D0 (ja)
WO (1) WO2001077170A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008511004A (ja) * 2004-08-23 2008-04-10 エモリー・ユニバーシテイ インビボ治療のためのｐＨ依存性化合物の改良選択法
JP2009532680A (ja) * 2006-03-31 2009-09-10 フェラーニ−カイル，カリマ 生物活性多タンパク質複合体を得て、かつ使用するための方法および組成物

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7879621B2 (en) * 2003-05-08 2011-02-01 Phynexus, Inc. Open channel solid phase extraction systems and methods
US20100113563A1 (en) * 2004-01-30 2010-05-06 Zaijie Wang Method for Treating Pain with a Calmodulin Inhibitor
JP2009503520A (ja) * 2005-07-29 2009-01-29 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ベータアミロイド受容体及びその使用
WO2014210538A1 (en) * 2013-06-28 2014-12-31 The Regents Of The University Of California Treating cognitive deficits associated with noonan syndrome
CN113354714B (zh) * 2021-07-28 2023-04-28 宋云强 一种广谱抗炎多肽化合物、其制备方法及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997033173A1 (en) * 1996-03-08 1997-09-12 The Regents Of The University Of California Muscular dystrophy, stroke, and neurodegenerative disease diagnosis and treatment
GB9611584D0 (en) * 1996-06-04 1996-08-07 Univ Edinburgh Neurotransmitters

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008511004A (ja) * 2004-08-23 2008-04-10 エモリー・ユニバーシテイ インビボ治療のためのｐＨ依存性化合物の改良選択法
JP2009532680A (ja) * 2006-03-31 2009-09-10 フェラーニ−カイル，カリマ 生物活性多タンパク質複合体を得て、かつ使用するための方法および組成物

Also Published As

Publication number Publication date
DE60136170D1 (de) 2008-11-27
EP1272517B1 (en) 2008-10-15
GB0008321D0 (en) 2000-05-24
ATE411341T1 (de) 2008-10-15
CA2405311A1 (en) 2001-10-18
WO2001077170A3 (en) 2002-03-28
AU4441101A (en) 2001-10-23
EP1272517A2 (en) 2003-01-08
WO2001077170A2 (en) 2001-10-18
US20030176651A1 (en) 2003-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Albertinazzi et al. ADP-ribosylation factor 6 and a functional PIX/p95-APP1 complex are required for Rac1B-mediated neurite outgrowth
Liu et al. PRG-1 regulates synaptic plasticity via intracellular PP2A/β1-integrin signaling
US8889639B2 (en) Compositions and methods for modulating PGC-1β to treat lipid-related diseases and disorders
Rogers et al. An IQSEC2 mutation associated with intellectual disability and autism results in decreased surface AMPA receptors
JPH09505735A (ja) ｐ５３−結合性ポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
JP4685767B2 (ja) Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の新規リガンドとその用途
WO2012065182A2 (en) Modulation of ubiquitination of synaptic proteins for the treatment of neurodegenerative and psychiatric disorders
JP2003530125A (ja) 生物学的物質およびその使用方法
JPWO2006068326A1 (ja) 新規ポリペプチドおよびその用途
JP2004033211A (ja) 神経ペプチド受容体およびその使用
US20230181691A1 (en) Platelet factors and cognitive improvement
JP2002523056A (ja) Ｈｏｍｅｒ相互作用タンパク質
KR100971270B1 (ko) 이피에프 수용체 에세이, 화합물 및 치료학적 조성물
US7935349B2 (en) CRMP4b inhibitory peptide
US7943137B2 (en) FPRL1 ligands and use thereof
KR20060036466A (ko) 수용체
JP4542810B2 (ja) 新規スクリーニング方法
JPWO2005103283A1 (ja) 新規スクリーニング方法
US7115381B1 (en) Methods for treating cardiovascular disorders
JP4445291B2 (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
US20030171293A1 (en) Neuropeptide receptor and uses thereof
US20090227501A1 (en) Agents for preventing and/or treating upper digestive tract disorders
US20100040621A1 (en) Novel polpeptide and use thereof
JP2009046459A (ja) Ａｄｎｆ受容体
JP4533655B2 (ja) 新規スクリーニング方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080229

A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20091029

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20091029