CN1744910A - 含有半乳凝素9的医药 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有半乳凝素9的医药。半乳凝素9一方面由于其定域不同，其生物学功能也各不相同，另一方面预测半乳凝素9与各种各样的生物学功能有关，因此对其详细的生物学活性进行阐明之后，寻求进行包括医药品开发在内的半乳凝素9相关技术的开发。人半乳凝素9对肿瘤细胞表现出毒害细胞活性或凋亡诱导活性，但由于对正常细胞没有表现出伤害活性，也不诱导凋亡，所以可将半乳凝素9蛋白质、半乳凝素9激动剂、半乳凝素9拮抗剂拮抗物质、抗半乳凝素9结合蛋白抗体、抗半乳凝素9结合糖链抗体、半乳凝素产生·游离诱导物质等作为抗肿瘤剂、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素替代用活性成分剂开发。

Description

含有半乳凝素9的医药
技术领域
本发明涉及到利用半乳凝素(galectin)9、特别是人半乳凝素9(Gal-9)对恶性肿瘤细胞的毒害细胞活性、对恶性肿瘤细胞的凋亡诱导活性、对恶性肿瘤细胞的抗肿瘤活性(抗癌活性)、活化T细胞的凋亡诱导活性、特别是CD4阳性T细胞的凋亡诱导活性、免疫抑制活性、抗炎症作用、抗过敏作用的技术。本发明涉及到利用半乳凝素9及其相关技术的抗肿瘤剂(抗癌剂)、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素代用剂。
背景技术
据报道，半乳凝素9在小鼠中惹起胸腺细胞的凋亡，一方面诱导大鼠脾细胞中的T细胞的凋亡，另一方面半乳凝素9虽然特异性地诱导CD8阳性T细胞的凋亡，但不诱导CD4阳性T细胞的凋亡。另外，其他的半乳凝素、例如半乳凝素1诱导活化T细胞的凋亡也有报道。另外，已知半乳凝素3通过将它进行基因导入，可看到凋亡的抑制(以上，非专利文献1～4)。
本发明人等研究组成功地进行了来自人T细胞嗜酸性细胞游走因子的克隆，通过该研究工作发现该因子正是Tureci等报告的半乳凝素9(非专利文献5)的变种、ecalectin(非专利文献6)。本发明人等研究组进一步阐明了ecalectin与半乳凝素9是同一物质，另外还阐明了人的半乳凝素9由于其连接肽的长度不同而分为短型、中型和长型3种(非专利文献7)。
过敏和自身免疫疾病是由于CD4阳性T淋巴细胞的过剩免疫反应引起的。对于难治性过敏或自身免疫疾病的治疗使用类固醇激素或免疫抑制剂。然而，由于类固醇副作用强，所以存在很多问题，另外，到目前为止，存在着在已知的免疫抑制剂从副作用方面它是最强的问题。
非专利文献1
Wada J.et al.，J Clin Invest.，1997，99：2452-61
非专利文献2
Tsuchiyama Y.et al.，Kidney Int.，2000，58：1941-52
非专利文献3
Perillo NL et al.，Nature，Dec.14，1995，378(6558)：736-9
非专利文献4
Matarrese P.et al.，Int J Cancer.，Feb.15，2000，85(4)：545-54
非专利文献5
Tureci O.et al.，J Biol Chem.，Mar.7，1997，272(10)：6416-22
非专利文献6
Matsumoto R.et al.，J Biol Chem.，1998，273：16976-84
非专利文献7
Matsushita N.et al.，J Biol Chem.，2000，275：8355-60
生物体内的生理活性物质到目前为止虽然发现了很多，但其中很多，例如由于与作用于肿瘤细胞等同样也作用于正常细胞，只阐明了其中一部分活性，就未必能简单地谋求用于医药等。
半乳凝素9是β-半乳糖苷结合凝集素同类中的一员。半乳凝素表现出生物的发生·分化、细胞增殖、凋亡、细胞间粘附、细胞和细胞外基质的粘附、以及游走活性等多种多样的生物活性。半乳凝素9在半乳凝素之中也是由于各种各样的刺激一方面是诱导其产生·释放的物质，另一方面，其产生和释放在解离。另外，半乳凝素9由于其定域、即细胞质、细胞膜以及细胞外的其存在场所不同，预测其功能也各不相同。
因此，期盼对半乳凝素9的更详细的生物活性进行阐明，并且根据其阐明进行以医药品的开发为首的半乳凝素相关技术开发。
发明内容
半乳凝素9诱导活化T淋巴细胞的凋亡。另外半乳凝素9还诱导活化CD4阳性以及CD8阳性T淋巴细胞的凋亡，然而半乳凝素9并不诱导没有活化的T淋巴细胞的凋亡。对于由该半乳凝素9引起的凋亡，CD4阳性淋巴细胞易感性更高。另外成功地发现了由半乳凝素9引起的凋亡可以经由钙、calpain、钙蛋白酶1、半胱天冬酶3或7途径被诱导。由于可以通过与作为抗炎症剂、抗过敏剂、免疫抑制剂广泛使用的肾上腺皮质类固醇激素(糖皮质激素)同样的途径诱起凋亡，直至认识到半乳凝素9活性的表达预期具有与肾上腺皮质类固醇激素同样的生物活性，进而完成本发明。
另外，本发明人等发现半乳凝素9虽然对肿瘤细胞表现出细胞损伤活性，但对于正常细胞没有表现出细胞损伤活性、或对于肿瘤细胞、特别是对于恶性肿瘤细胞或转移性肿瘤细胞表现出特征的作用(例如转移抑制活性)，诱导更好的结果，或对肿瘤细胞诱导凋亡，但对正常细胞不诱导凋亡的现象，直至完成本发明。
本发明提供：
[1]医药或动物药，其特征在于，(i)含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分，
(ii)所述药物选自抗肿瘤剂、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素替代用活性成分剂。
[2]以含有半乳凝素9或其类似物作为有效成分为特征的抗肿瘤剂。
[3]以含有半乳凝素9或其类似物作为有效成分为特征的抗过敏剂。
[4]以含有半乳凝素9或其类似物作为有效成分为特征的免疫抑制剂。
[5]以含有半乳凝素9或其类似物作为有效成分为特征的自身免疫疾病用剂。
[6]以含有半乳凝素9或其类似物作为有效成分为特征的抗炎症剂。
[7]以含有半乳凝素9或其类似物作为有效成分为特征的肾上腺皮质类固醇激素替代剂。
[8]以含有从(a)半乳凝素9及其类似物，以及(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸选出来的成分作为有效成分为特征的恶性细胞毒害剂。
[9]以含有从(a)半乳凝素9及其类似物，以及(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸选出来的成分作为有效成分为特征的癌转移抑制剂。
[10]以含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分为特征的对肿瘤细胞表现出毒害细胞活性的药剂。
[11]以含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分为特征的对肿瘤细胞诱导凋亡的药剂。
[12]以含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分为特征的对免疫细胞、例如活化T细胞诱导凋亡的药剂。
[13]以含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分为特征的对起因于活化T细胞的疾病或病态症状的预防和/或治疗剂。
[14]上述[13]所述的预防和/或治疗剂，其特征是：起因于活化T细胞的疾病选自过敏、自身免疫疾病、对移植片的排斥反应以及炎症。
[15]以从下面各成分中选出来的成分为特征的半乳凝素9结合因子[括弧内的数字指的是可以通过在NCBI的网页(http：//www.ncbi.nih.gor/)输入该数字获得蛋白质信息以及编码他们的DNA等核酸序列的信息的数据库上识别号]：
4F2重链抗原(177216)；ATPase，Na+/K+转运，α1多肽(21361181)；钠依赖中性氨基酸转运体类型2截短的异构体(15004317)；基质细胞衍生因子受体1异构体a(9257240)；基质细胞衍生因子受体1异构体b；热休克90kDa蛋白1，β(20149594)；热休克90kDa蛋白1，α；热休克70kDa蛋白5(葡萄糖调节蛋白，78kDa)(16507237)，热休克70kDa蛋白8异构体2(24234686)；热休克70kDa蛋白9B前体(2423688)；脂肪酸辅酶A连接酶，长链3(27469830)；NADH脱氢酶(泛醌)Fe-S蛋白1，75kDa(NADH-辅酶Q还原酶)(4826856)；S-腺苷高半胱氨酸水解酶-like 1(21361647)；程序性细胞死亡8异构体1(4757732)；60kDa热休克蛋白，线粒体前体(129379)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基，异构体 1，心肌(4757810)；[内质网]核酮糖结合糖蛋白(ribophorin)II前体(88567)；法尼基-二磷酸法尼基转移酶1(4758350)；泛醇-细胞色素C还原酶复合物核心蛋白2，线粒体前体(21903482)；长醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基转移酶(21104416)；钙结合转运蛋白(6841066)；NADH脱氢酶-泛醌Fe-S蛋白2前体(3540239)；肌动蛋白，β(14250401)；翻译延伸因子EF-Tu-类蛋白P43前体，线粒体(7443384)；metaxin 1(4505281)；sideroflexin1(23618867)；TCR β链(2982508)；Hnrnp A1(2194069)；磷酸盐载体前体异构体1b(4505775)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，γ多肽1(4885079)；电压依赖性阴离子通道1(4507879)；透明质酸结合蛋白前体(8699626)；雄激素调节的短链脱氢酶/还原酶1(20070798)；溶质载体家族25(线粒体载体；酮戊二酸载体)，member 11(21361114)；3-羟基丁酸脱氢酶前体(17738292)；B-细胞受体相关蛋白(1673514)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，O亚基(4502303)；ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合物，亚基d(5453559)；ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合物，亚基b，异构体1(21361565)；小的GTP结合蛋白(13569962)；NADH脱氢酶(泛醌)Fe-S蛋白8，23kDa(NADH-辅酶Q还原酶)(4505371)；小泡运输蛋白sec22b(4759086)；线粒体输入受体Tom22(9910382)；信号序列受体，δ(5454090)；ATP合酶，α链(114517或P25705)；ATP合酶，β链(114549或P06576)；钠/钾-转运ATPase β-3链(1703470或P54709)；ADP，ATP载体蛋白(113463，P12236，113459，P05141，113455，或P12235)；泛醇-细胞色素C还原酶复合物核心蛋白1(731047或P31930)以及细胞色素c氧化酶多肽II(117020或P00403)。以及
[16]提供上述[15]所述的半乳凝素9结合因子与半乳凝素9之间的相互作用的半乳凝素9活性控制技术。
本发明的其他目的、特征、优点及其他观点对于同行人来说由以下所述应当明白。然而，以下所述以及包括具体的实施例等所述的本说明书所述是本发明的优选方式，但希望理解为只是为了说明而给出的叙述。在本说明书公布的本发明的意图以及范围内，进行种种变化和/或改变(或修饰)通过以下所述以及本说明书的其他部分的知识对于同行人应当很容易明白的。在本说明书被引用的所有专利文献以及参考文献是为了说明的目的而引用的，这些作为本说明书的一部分其内容应当解释为也包括在内。
附图的简单说明
图1(A)表示对于rGal-9的凋亡诱导活性用PI法进行流式细胞仪测定的结果。(B)表示对于rGal-9的凋亡诱导活性用AnnexinV法进行流式细胞仪测定的结果。数据表示4次实验中的代表例。
图2表示对于rGal-9的凋亡诱导活性在乳糖或蔗糖存在下或不存在下测定的结果。数据表示4次实验结果的平均值±SEM。
图3表示在各种细胞株中对于rGal-9的凋亡诱导活性用PI法进行流式细胞仪测定的结果。数据表示3次实验结果的平均值±SEM。
图4表示对于来自末梢血的T细胞的rGal-9的凋亡诱导活性用PI法进行流式细胞仪测定的结果。数据表示3次实验结果的平均值±SEM。
图5表示在各种半胱天冬酶抑制剂存在下对于Gal-9诱起凋亡的抑制效果的实验结果。数据表示3次实验结果的平均值±SEM。
图6表示在浓度不同的泛半胱天冬酶抑制剂或半胱天冬酶抑制剂1存在下对于Gal-9诱起凋亡的抑制效果的实验结果。数据表示3次实验结果的平均值±SEM。
图7表示在浓度不同的钙蛋白酶抑制剂存在下对于Gal-9诱起凋亡的抑制效果的实验结果。数据表示3次实验结果的平均值±SEM。
图8表示对Gal-9对使用受到Gal-9诱起凋亡的细胞后的钙流入的影响进行实验结果。数据表示3次实验结果的平均值±SEM。
图9表示对于Gal-9对通过DEX、抗Fas抗体以及依托泊甙诱导的凋亡的作用效果进行研究的实验的结果。数据表示4次实验结果的平均值±SEM。
图10表示对于半乳凝素9对恶性骨髓瘤细胞MM-RU的凋亡诱导活性用PI法进行流式细胞仪测定的结果。
图11表示从人骨髓瘤细胞株中的MM-BP和MM-RU採取mRNA，用RT-PCR法对半乳凝素的DNA量进行解析的结果的电泳照片。
图12是表示作为胞巢形成性的细胞的乳腺癌细胞株MCF-7和由该细胞新建立的没有表现出明显的胞巢形成性的MCF-7K-10株的细胞形态的照片。
图13是表示对于作为胞巢形成性的细胞的MCF-7K-4和新建立的没有表现出明显的胞巢形成性的MCF-7K-10株，通过Western blot法对半乳凝素9进行研究的结果的电泳照片。
图14是表示对于从外边向骨髓瘤细胞株MM-RU添加重组半乳凝素9，对于半乳凝素9的作用效果进行研究的结果的细胞形态照片。
图15表示对于将半乳凝素9基因导入由乳腺癌细胞株建立的MCF-7K-10株时的作用效果进行研究的结果的细胞形态照片。
图16表示来自MOLT4的蛋白质中吸附于半乳凝素9CT柱的蛋白质的电泳照片。
具体实施方式
本发明是发现半乳凝素9对肿瘤细胞表现出毒害细胞活性，而对正常细胞不表现出毒害活性，另外对肿瘤细胞表现出诱导凋亡，而对正常细胞不诱导凋亡后做成的发明。由此，表示可将半乳凝素9蛋白质、半乳凝素9激动剂、半乳凝素9拮抗剂拮抗物质、抗半乳凝素9结合蛋白抗体、抗半乳凝素9结合糖链抗体、半乳凝素9产生·释放诱导物质等作为对正常细胞没有作用，而对肿瘤细胞表现出毒害活性、诱导凋亡的抗肿瘤剂(抗癌剂)利用的途径。另外，本发明提供通过利用半乳凝素9对转移性恶性细胞有凝集诱导作用，具有对癌等恶性肿瘤的转移抑制活性的癌转移抑制技术、例如半乳凝素9蛋白质或其衍生物、或通过半乳凝素9基因导入或对半乳凝素9的产生·释放进行诱导获得癌转移抑制作用的方法、以及方法中使用的试剂、或试剂盒、系统(包括检测·测定系统)等。
本发明是根据人半乳凝素9一方面对非活化(静止)T细胞、特别是CD4阳性T细胞(协助者T细胞)的凋亡诱导不进行凋亡诱导，对于静止CD8阳性T细胞(抑制者T细胞或毒害细胞性T细胞)的凋亡进行轻度诱导，另一方面人半乳凝素9对被CD3活化的CD4阳性T细胞(协助者T细胞)的凋亡诱导显著诱导，活化CD8阳性T细胞(抑制者T细胞或毒害细胞性T细胞)的凋亡与半乳凝素1或半乳凝素3相比，进行强烈诱导的现象做成的。
人半乳凝素3由外面加入时，诱导活化的CD4阳性T细胞(协助者T细胞)以及CD8阳性T细胞(抑制者T细胞或毒害细胞性T细胞)的凋亡。另外发现由半乳凝素9引起的凋亡诱导与浓度有关、与时间有关。已知CD4阳性T细胞对于惹起免疫反应表现出非常重要的作用，人们认为由于CD4阳性T细胞的过剩反应会惹起各种自身免疫疾病或过敏。
由以上现象，特别是半乳凝素9对于活化的CD4阳性T细胞显著诱导凋亡现象，可以认为通过半乳凝素、特别是半乳凝素9蛋白质、或通过半乳凝素9基因导入或诱导半乳凝素9的产生·释放，诱导CD4阳性T细胞的凋亡，结果可以表现出免疫抑制效果或抗炎症效果。利用这些技术，可以做成自身免疫疾病或过敏疾病、甚至抗炎症药使用。另外，由于上述T细胞等是免疫细胞，半乳凝素9正是对免疫细胞表现出诱导凋亡的活性的物质。
[半乳凝素9引起的凋亡诱导途径的阐明]
凋亡是由作为种种物质例如免疫抑制剂使用的糖皮质激素、Fas配体或抗Fas抗体等惹起的。在本发明中，成功地阐明了由半乳凝素9引起的凋亡是通过什么样的途径被诱导的。即，首先阐明了取代人末梢血T细胞使用T细胞株Jurkat细胞或MOLT4细胞，通过碘化丙锭(PI)法和AnnexinV法半乳凝素9诱导这些细胞凋亡。接着，阐明了由半乳凝素9引起的凋亡的诱导被乳糖抑制，但由于不被蔗糖抑制，所以半乳凝素9的β半乳糖苷结合活性对于凋亡的诱导是必要的。
另外，根据本发明，对于半胱天冬酶是否参与了半乳凝素9诱导凋亡进行了研究，结果表明泛半胱天冬酶抑制剂在抑制由地塞米松、抗Fas抗体、TNF-α、C2神经酰胺引起的凋亡的同时，也抑制由半乳凝素9引起的凋亡，并且与浓度、时间有关。另外，对处于其上游的半胱天冬酶1、8、9、10的抑制剂也进行了研究。可以使用半胱天冬酶1抑制剂、半胱天冬酶8抑制剂、半胱天冬酶9抑制剂、半胱天冬酶10抑制剂。其结果由半乳凝素9引起的凋亡虽然被半胱天冬酶1特异的抑制剂抑制，但没有被其他的半胱天冬酶抑制剂抑制。另外，地塞米松诱导凋亡同样被半胱天冬酶1抑制剂抑制，另一方面抗Fas抗体和TNF-α引起的凋亡可被半胱天冬酶8以及10抑制剂抑制，C2神经酰胺引起的凋亡被半胱天冬酶9的抑制剂抑制。由此可以认为半乳凝素9经由与地塞米松同样的途径诱导凋亡。
另外，已知对于半胱天冬酶1的活化，钙蛋白酶的活化先行。因此，对于钙蛋白酶抑制剂对半乳凝素9诱导凋亡的影响进行了研究。其结果表明钙蛋白酶抑制剂依赖于浓度抑制半乳凝素9诱导凋亡。另外，由于在钙蛋白酶的活化之前发现钙向细胞内流入，所以当对由于半乳凝素9刺激惹起钙流入进行研究时，发现半乳凝素9明显诱导钙向细胞内流入。而且其流入被乳糖抑制，而不被蔗糖抑制。这些结果表明对于由半乳凝素9引起的钙流入，β半乳糖苷结合活性是必需的。由到目前为止的结果可以认为半乳凝素9通过与糖皮质激素(地塞米松)同样的途径，即受体→钙流入→钙蛋白酶→半胱天冬酶1→半胱天冬酶3以及7这一途径诱导凋亡。
另外，对半乳凝素9对由地塞米松、抗Fas抗体、依托泊甙(etoposide)引起的凋亡的效果进行了研究，结果表明半乳凝素9对于由抗Fas抗体或依托泊甙引起的凋亡表现出相加的效果，而在由地塞米松引起的凋亡中没有看到由半乳凝素产生的相加效果。在嗜酸性细胞的凋亡中，半乳凝素9反而抑制由地塞米松引起的凋亡也被阐明。因此强烈暗示半乳凝素9和糖皮质激素通过同样的途径诱导凋亡。以上事实表明在本发明中，半乳凝素9可以作为抗炎症药、抗过敏剂或免疫抑制剂使用的可能性很高。由于对半乳凝素9蛋白质、半乳凝素9基因导入或半乳凝素9进行诱导，做成副作用少的免疫抑制剂使用，或通过并用该抑制剂，也可以将糖皮质激素等的用量减少，结果也可以使副作用减少。
现在，糖皮质激素作为抗炎症药、抗过敏剂或免疫抑制剂被广泛运用，对于难治性过敏反应可以使用FK506等免疫抑制剂。作为缺点已知这些药剂存在很多严重的副作用。但是，到目前为止的结果表明，可以用半乳凝素9作为取代上述糖皮质激素承担的生物活性的物质，或作为承担与糖皮质激素同等以上的优越的生物活性的物质利用。通过对半乳凝素9、其类似物等的利用、半乳凝素9的生物体内浓度、或表达进行控制，可以提供抗肿瘤剂、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素替代用活性成分剂。另外，利用半乳凝素9，可以应用于糖皮质激素表现出药理作用·生物活性的领域。
过敏或自身免疫疾病是由于CD4阳性T淋巴细胞的过剩免疫反应引起的，对于难治性过敏或自身免疫疾病的治疗由于可以使用类固醇或免疫抑制剂，上述实验表明半乳凝素9表现出免疫抑制作用、抗炎症作用、抗过敏作用，所以给出了可以取代类固醇或免疫抑制剂，用半乳凝素9蛋白质、半乳凝素9基因导入、半乳凝素9产生或释放诱导因子、抗半乳凝素9受体抗体、抗半乳凝素9结合糖链的抗体等作为抗肿瘤剂、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素替代剂利用的途径。
在本发明中，利用“基因重组技术”可对所定的核酸进行分离.序列决定，或制作重组体，获得所定的肽。作为本说明书中能够使用的基因重组技术(包括重组DNA技术)，如该领域都知道的技术，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2nd edition)”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York(1989)；D.M.Glover et al.ed，“DNA Cloning”，2nd ed.，Vol.1to4，(The Practical ApproachSeries)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；日本生化学会编、“续生化学实验讲座1、基因研究法II”、东京化学同人(1986)；日本生化学会编、“新生化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)”、东京化学同人(1992)；R.Wu ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)&101(Recombinant DNA，Part C)，AcademicPress，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(Recombinant DNA，Part E)&155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，New York(1987)；J.H.Miller ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.204，Academic Press，New York(1991)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.218，Academic Press，New York(1993)；S.Weissman(ed)，“Methods inEnzymology”，Vol.303，Academic Press，New York(1999)；J.C.Glorioso et al.(ed)，“Methods in Enzymology”，Vol.306，AcademicPress，New York(1999)等所述的方法或其中引用的文献所述的方法或实质上与上述方法同样的方法或改变法进行(其中的某些记载由于参照也包括在本说明书的内容中)[以下将这些方法都称为“基因重组技术”]。
本说明书中，所谓“相同性”意味着在多肽序列(或氨基酸序列)或多核苷酸序列(或碱基序列)中的2条链之间，构成该链的各个氨基酸残基之间或各碱基之间的相互适合关系中能够决定是同一那样的单位的量(数)，指的是两个多核苷酸或两个多肽序列之间的序列相关性的程度。相同性可以很容易算出。测定两个多核苷酸或多肽序列之间的相同性的方法已知有很多种，“相同性”(也称为“同一性”)的用语对于同行人众所周知(例如、Lesk，A.M.(Ed.)，ComputationalMolecular Biology，Oxford University Press，New York，(1988)；Smith，D.W.(Ed.)，Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Academic Press，New York(1993)；Grifin，A.M.& Grifin，H.G.(Ed.)Computer Analysis of Sequence Data：Part I，Human Press，NewJersey，(1994)；von Heinje，G.，Sequence Analysis in MolecularBiology，Academic Press，New York，(1987)；Gribskov，M.& Devereux，J.(Ed.)，Sequence Analysis Primer，M-Stockton Press，New York，(1991)等)。测定两个序列的相同性使用的一般方法如Martin，J.Bishop(Ed.)，Guide to Huge Computers，Academic Press，San Diego，(1994)；Carillo，H.& Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)等公布的方法，但并不限定于这些方法。作为用于测定相同性的理想方法，如像为了获得进行试验的两个序列间的最大适合关系部分那样进行设计的方法。这样的方法如作为计算机程序建立的方法。作为测定两个序列间相同性的理想的计算机程序法如GCG程序包(Devereux，J.et al.，Nucleic Acids Research，12(1)：387(1984)).BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol，215：403(1990))等，但并不限定于这些方法，可以使用该领域中众所周知的方法。
作为本说明书中使用的用语“多肽”可以是以下所述的那样的多肽。多肽的基本结构众所周知，在该技术领域中非常多的参考书以及其他刊物中都有记载。有鉴于此，在本说明书中使用的用语“多肽”指的是通过肽键或修饰的肽键相互结合的那样的含有2个或2个以上的氨基酸的任意肽或任意的蛋白质。作为本说明书中使用的用语“多肽”，在该领域中例如一般称为肽、寡肽或肽聚物的短链的肽、以及蛋白质，通常也可以指很多形态本身已知的长链的肽两方。多肽通常往往也包括称为天然型氨基酸(天然存在的氨基酸：或被基因编码的氨基酸)的氨基酸以外的氨基酸。多肽另外含有末端氨基酸残基，很多这样的氨基酸残基在翻译后不仅可以通过加工和其他改变(或修饰)的天然工程，也可以通过同行都众所周知的化学改变技术进行加工，所以上述多肽要理解为可以改变(修饰)的多肽。对于加到该多肽的改变(修饰)已知有很多方式，这些方式在该领域的基础参考书以及更详细的论文和很多研究文献中都有详细记载，这些对于同行众所周知。作为几个所谓的常用的改变·修饰，例如烷基化、酰化、酯化、酰胺化、糖基化、脂质结合、硫酸化、磷酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟化以及ADP-核糖基化等，参照例如T.E.Creighton，Proteins-Structure and Molecular Properties，Second Edition，W.H.Freeman and Company，New York，(1993)；B.C.Johnson(Ed.)，Posttranslational Covalent Modification of Proteins，AcademicPress，New York，(1983)(Wold，F.，“Posttranslational ProteinModifications“Perspective and Prospects”，pp.1-12)；Seifteret al.，“Analysis for Protein Modifications and nonproteincofactors”，Methods in Enzymology，182：626-646(1990)；Rattan etal.，“Protein Synthesis：Posttranslational Modification andAging”，Ann.N.Y.Acad.Sci.，663：p.48-62(1992)等记载。
本说明书中，作为半乳凝素9，典型的如天然型半乳凝素9。作为天然型半乳凝素9报道了长型(L型)半乳凝素9、中型(M型)半乳凝素9以及短型(S型)半乳凝素9，L型半乳凝素9被认为是通过WO 02/37114 A1公布的序列4的推定连接肽区域连接N端结构域和C端结构域形成的，M型半乳凝素9被认为是通过WO 02/37114 A1公布的序列5的推定连接肽区域连接N端结构域和C端结构域形成的，S型半乳凝素9被认为是通过WO 02/37114 A1公布的序列6的推定连接肽区域连接N端结构域和C端结构域形成的，在M型半乳凝素9中，在由L型半乳凝素9的该连接肽区域缺失该WO 02/37114 A1的序列7的序列的氨基酸残基方面与L型半乳凝素9不同，而在S型半乳凝素9中，在由M型半乳凝素9的该连接肽区域缺失该WO 02/37114 A1的序列8的序列的氨基酸残基方面与M型半乳凝素9不同，即在S型半乳凝素9中，在由L型半乳凝素9推定的该连接肽区域缺失该WO02/37114 A1的序列9的序列的氨基酸残基方面与L型半乳凝素9不同。
在本说明书中，作为半乳凝素9可以指的是含有上述L型半乳凝素9、M型半乳凝素9和S型半乳凝素9、此外，这些天然半乳凝素9家族的天然产生的变异体、以及对于上述半乳凝素实施了人工变异(即、缺失、附加、修饰、插入一个以上的氨基酸残基等)的变异体和含有其中一部分结构域或一部分肽片段的变异体。
作为本发明的代表性半乳凝素9蛋白质，如WO 02/37114 A1的序列表中的序列编号：1～3(SEQ ID NO：1～3)中的任一个氨基酸序列或实质上含有与该序列同等的氨基酸序列的多肽，例如，含有SEQ IDNO：1，2或3的氨基酸序列中的至少5～311，5～323或5～355个连续的氨基酸残基，而且具有同等的抗原性等的实质上同等的生物学活性的蛋白质、或具有它们的特征，而且与序列表的SEQ ID NO：1，2或3中任一个的各结构域中任一个至少50％以上高的相同性，或至少60％以上高的相同性，或至少70％以上高的相同性，或至少80％以上高的相同性，或至少90％以上高的相同性，或至少95％以上高的相同性，或至少98％以上高的相同性的蛋白质等。
作为本发明的人半乳凝素9多肽，如含有WO 02/37114 A1的序列表中的SEQ ID NO：1～3中的任一个氨基酸序列的全部或一部分的连续的氨基酸残基，或含有SEQ ID NO：1～3中的连续的氨基酸残基5个以上，优选10个以上、更优选20个以上、更优选30个以上、更优选40个以上、更优选50个以上、更优选60个以上、更优选70个以上、更优选80个以上、更优选90个以上、更优选100个以上、更优选110个以上的多肽。作为本发明的人半乳凝素9相关多肽，也可以含有该SEQ ID NO：1，2和3选择的氨基酸序列的一部分或全部(也可以缺失对应于起始密码子的Met)。含有这样的序列的多肽都包含在内。
作为编码半乳凝素9或其构成结构域、该片段的核酸只要是所谓的与编码与半乳凝素9具有同等抗原性等的实质上具有同等生物学活性的肽的同效的碱基序列的核酸，无论什么样都可以。编码该半乳凝素9的核酸可以是单链DNA、双链DNA、RNA、DNA:RNA杂交体、合成DNA等核酸，也可以是人基因组DNA、人基因组DNA文库、来自人组织·细胞的cDNA、合成DNA中的任一个。编码该半乳凝素9的核酸的碱基序列也可以被修饰(例如附加、除去、置换等)，也包含这样修饰后的多肽。另外也可以是天然产生的变异体。这些核酸如可以是编码L型、M型或S型半乳凝素9肽或其一部分的核酸，优选的核酸如DNA。另外上述所谓的“同效的碱基序列”，如在严格条件下，与编码WO 02/37114A1公布的序列表中的序列编号：1的氨基酸序列的碱基序列中的连续的5个碱基以上的碱基序列、优选10个以上的碱基序列、更优选15个以上的碱基序列、更优选20个以上的碱基序列杂交，编码与该半乳凝素9实质上同等的氨基酸序列的核酸或其互补链等。
编码该半乳凝素9的核酸，代表性的如编码WO 02/37114 A1的序列表中的SEQ ID NO：1～3中的任一个表示的肽和其一部分连续的氨基酸序列的碱基序列的核酸(也包含只编码各特征结构域的核酸)、在编码序列中附加起始密码子(编码Met的密码子)和终止密码子的核酸、或编码与该碱基序列编码的蛋白质至少有50％相同性的氨基酸序列，而且含有该SEQ ID NO：1～3的氨基酸序列中的至少特征的连续的氨基酸残基、而且具有与同等的抗原性等肽实质上同等的生物学活性的肽的核酸同效的碱基序列的核酸，无论什么样都可以。
在本说明书中，所谓“聚合酶链式反应(polymerase chainreaction)”或“PCR”一般指的是美国专利第4,683,195号说明书等所述的那样方法，例如指用于在体外通过酶对所期望的核苷酸序列进行扩增的方法。一般来说，PCR法是包括使用能够优先与模板核酸进行杂交的2个寡核苷酸引物，反复进行引物延伸合成那样的循环的方法。对于典型的PCR法中使用的引物可以使用对于模板内部应当可扩增的核苷酸序列互补的引物，例如，优选使用在与应当扩增的核苷酸序列的两端互补、或与应当被扩增的核苷酸序列邻接的引物。作为5’端的引物至少含有起始密码子、或包含该起始密码子可以扩增那样地选择，而作为3’端侧的引物最好是能够至少含有终止密码子、或含有该终止密码子能够扩增那样地进行选择。引物优选由5个以上的碱基，更优选10个以上碱基构成的寡核苷酸、更优选由18～25个碱基构成的寡核苷酸。
PCR反应可以按照该领域众所周知的方法或与这些方法实质上同样的方法或改变法进行，例如可以根据R.Saiki，etal.，Science，230：1350，1985；R.Saiki，et al.，Science，239：487，1988；H.A.Erlich ed.，PCR Technology，Stockton Press，1989；D.M.Glover et al.ed.，“DNA Cloning”，2nd ed.，Vol.1，(The PracticalApproach Series)，IRL Press，Oxford University Press(1995)；M.A.Innis et al.ed.，“PCR Protocols：a guide to methods andapplications”，Academic Press，New York(1990)；M.J.McPherson，P.Quirke and G.R.Taylor(Ed.)，PCR：a practical approach，IRLPress，Oxford(1991)；M.A.Frohman et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002(1988)等所述的方法或对这些方法进行修饰、改变的方法进行。另外，PCR法也可以使用适用的市售试剂盒进行，根据试剂盒制造者或试剂盒销售者指明的程序实施。
PCR反应在代表性的场合，是将例如模板(例如，以mRNA为模板合成的DNA；1st strand DNA)和根据该基因设计的引物与10×反应缓冲液(Taq DNA聚合酶附带的)、dNTPs(脱氧核苷三磷酸dATP，dGTP，dCTP和dTTP的混合物)、Taq DNA聚合酶以及去离子蒸馏水混合。对于该混合物使用例如GeneAmp 2400 PCR system，Perkin-Elmer/Cetus公司等自动热循环仪在一般的PCR循环条件下反复该循环25～60次，用于扩增的循环数可以根据相应目的设为合适的次数。作为PCR循环条件，例如90～95℃变性5～100秒、40～60℃退火5～150秒、65～75℃延伸30～300秒的循环，优选94℃变性15秒、58℃退火15秒、72℃延伸45秒的循环，退火的反应温度以及时间可以根据相应实验选择适当的值，变性反应和延伸反应的时间也可以根据预想的PCR产物的链长选择适当的值。退火的反应温度最好是根据通常引物与模板DNA的杂交的Tm值改变。延伸反应的时间通常大约每1000bp的链长1分钟程度那样的大概尺度，根据场合不同也可以选择更短的时间。
在本说明书中，所谓“寡核苷酸”可以是比较短的单链或双链的多核苷酸，优选聚脱氧核苷酸，可以通过Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，Vol.28，pp.716-734(1989)所述的那样已知方法、例如磷酸三酯法、磷酸二酯法、磷酸盐法、磷酸酰胺法、膦酸酯法等方法化学合成。已知通常合成可以很便利地在被修饰的固体支持体上合成，例如可以使用自动化的合成仪器，该仪器有销售。该核苷酸可以含有一个或一个以上的修饰碱基，例如可以含有次黄苷等天然而不是普通的碱基或三甲基化的碱基等，根据场合不同也可以含有带有标记的碱基。
在对所定核酸进行鉴定时，可以利用杂交技术。该杂交可以根据上述公布的“基因重组技术”文献所述的方法或实质上与它同样的方法或改变法进行。例如，杂交可以使含有DNA等核酸的样品转移到含有尼龙膜等膜的载体，根据需要实施变成处理、固定化处理、清洗处理等后，使转移到上述载体(例如膜等)的核酸根据需要与使其变成的标记探针DNA片段在杂交用缓冲液中进行反应。
杂交处理普通于约35～约80℃、于约50～约65℃下更合适，进行约15分钟～约36小时，进行约1～约24小时更合适，可以选择最适合条件进行。例如，杂交处理在约55℃下进行约18小时。作为杂交用缓冲液，可以使用选自该领域中普通使用的缓冲液，例如可以使用Rapid hybridization buffer(Amersham公司)等。作为转移的载体(例如，膜等)的变成处理，可举出使用碱性变性液的方法，优选用其处理后中和液或缓冲液处理。另外，作为载体(例如，膜等的固定化处理，)普通通过于约40～约100℃、于约70～约90℃下更合适，进行约15分钟～约24小时焙烤，进行约1～约4小时焙烤更合适，可以选择最适合条件进行。例如，对膜等载体通过约80℃下进行约2小时焙烤进行固定化。作为转移的载体(例如膜等)的清洗处理，可以通过用在该领域中普通使用的清洗液、例如含有1M NaCl、1mMEDTA和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0等清洗进行。作为含有尼龙等膜的载体，可以使用从该领域普通使用的载体中选择出来的载体。
作为上述碱性变性液、中和液、缓冲液，可以使用从该领域中普通使用的缓冲液中选出来的缓冲液，作为碱性变性液，例如可以使用含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的液体，作为中和液，例如可使用含1.5MNaCl的0.5M Tris-HCl缓冲液，pH8.0等，作为缓冲液，例如可使用2×SSPE(0.36M NaCl、20Mm NaH2PO4和2mM EDTA)等。另外在杂交处理之前，为了防止非特异性杂交反应，根据需要，进行转移的载体(例如膜等)最好是进行预杂交处理。该预杂交处理可以通过例如浸入到预杂交溶液[50％甲酰胺、5×Denhardt′s溶液(0.2％牛血清白蛋白、0.2％聚乙烯吡咯烷酮)、5×SSPE、0.1％SDS、100μg/ml热变性鲑精子DNA]等中，于约35～约50℃，优选42℃下进行约4～约24小时，优选约6～约8小时反应，这样的条件对从业者反复适宜实验，可以决定更优选的条件。在杂交中使用的标记探针DNA片段的变性可以于约70～约100℃下、优选约100℃下，进行约1～约60分钟、优选约5分钟加热等进行。而杂交可以利用其众所周知的方法或根据这些的方法进行，在本说明书中，所谓严格的条件指的是例如，钠浓度约15～约50mM、优选约19～约40mM、更优选约19～约20mM，温度约35～约85℃、优选约50～约70℃、更优选约60～约65℃的条件。
杂交完了后，对膜等载体进行充分清洗处理，在除去进行特异的杂交反应的标记探针DNA片段以外的标记探针等之后，可以进行检测处理。膜等载体的清洗处理可以使用从该领域普通使用的方法选出来的方法进行，例如可以通过用含有0.1％SDS 0.5×SSC(XSSC＝0.15MNaCl、15mM柠檬酸)溶液等进行清洗实施。
进行杂交的核酸可以通过代表性的自动放射自显影进行检测，也可以从该领域中使用的方法中适当选择之后，在检测中使用。将进行检测的相当于信号的核酸带悬浮于适当的缓冲液、例如SM溶液(含有100mM NaCl和10mM MgSO4的50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.5)等，然后对该悬浮液进行适度稀释，对所定核酸进行分离·纯化，然后再进行扩增处理。在本说明书中，所谓“高相同性”因该对象序列的长度不同而不同，例如可以是50％以上、进一步60％以上、优选70％以上、更优选80％以上，而对于特定场合也可以为95％以上，97％以上特别好。所谓“同效的碱基序列”，例如对于在严格条件下可与含有问题序列的核酸进行杂交的碱基序列，例如与该碱基序列中连续的5个以上的碱基序列、优选10个以上的碱基序列、更优选15个以上的碱基序列、更优选20个以上的碱基序列进行杂交，编码与该多肽实质上同等的氨基酸序列的碱基序列等。核酸也可以通过化学合成获得。此时化学合成片段，也可以通过酶进行结合。
通过杂交处理对从含有基因文库或cDNA文库等的核酸样品中筛选目的核酸的处理可以反复进行。可以使用被克隆的来自人的cDNA文库、例如各种来自人的组织或培养细胞(特别是人的肾脏、脑、松果体、下垂体后叶、神经细胞、网膜、网膜血管细胞、网膜神经细胞、胸腺、血管、内皮细胞、血管平滑肌细胞、血液细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、精巢、卵巢、子宫、肠、心脏、肝脏、胰脏、小肠、大肠、龈关连细胞、皮肤关连细胞、线球体细胞、尿细管细胞、结合组织细胞等组织·细胞、以及各种肿瘤组织、癌细胞等)cDNA文库。另外用作模板等的cDNA文库也可以直接使用市售的来自各种组织的cDNA文库，例如可以使用由Stratagene公司、Invitrogen公司、Clontech公司等销售的cDNA文库。作为典型的例子，可以使用由人组织·细胞制备的基因文库、例如人P1 artificial chromosome基因组文库(Human Genome Mapping Resource Center)、人组织cDNA文库(例如，可从Clontech公司等获得)。使用探针可以对由各种人组织或培养细胞等构建的人基因组DNA文库或来自人cDNA文库进行筛选。对于通过用放射性同位素等对探针等进行标记，可以使用市售的标记试剂盒、例如随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司)等进行。例如使用random-priming试剂盒(Pharmacia LKB公司，Uppsala)等，用[α-32P]dCTP(Amersham公司)等对探针用DNA进行标记，可以获得带有放射活性的探针。
保有所定核酸的噬菌体粒子、重组质粒、重组载体等可以通过该领域中普通使用的方法对所定核酸进行纯化分离，例如可以通过甘油梯度超离心分离法(Molecular Cloning，a Laboratory manual，ed.T.Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd ed.78，1989)、电泳法等进行纯化。使用在该领域中普通使用的方法可以从噬菌体粒子中纯化分离DNA，例如，将得到的噬菌体等悬浮于TM溶液(含有10mMMgSO4的50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.8)等，用DNase I和RNase A等处理后，加20mM EDTA、50μg/ml蛋白酶K以及0.5％SDS混合液等，于约65℃，保温约1小时后，对该溶液进行酚提取、二乙基醚提取后，通过乙醇沉淀使DNA沉淀，然后将得到的DNA用70％乙醇洗净后干燥，溶解于TE溶液(含有10mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)等后得到。另外作为目的DNA通过亚克隆等大量获得也是可能的，例如亚克隆，作为宿主可以使用大肠杆菌，用质粒载体等进行。通过这样亚克隆得到的DNA也与上述同样，通过离心分离、酚提取、乙醇沉淀等方法纯化分离。
在本说明书中，得到的PCR产物等核酸(含有DNA)通常进行1～2％琼脂糖凝胶电泳，作为特异的带从凝胶中切出，例如，使用Gene cleankit(Bio 101)等市场销售的提取试剂盒进行提取。提取的DNA用适当的限制酶切，根据需要进行纯化处理，或根据需要，对5’末端用T4多核苷酸激酶等进行磷酸化后，与pUC18等pUC系载体等适当的质粒载体连接，转化适当的感受态细胞。被克隆的PCR产物可以解析其碱基序列。对于PCR产物的克隆，可以使用例如p-Direct(Clontech)，pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene公司)、pGEM-T(Promega公司)，pAmpTM(Gibco-BRL公司)等市场销售的质粒载体。为了进行宿主细胞的转化，例如可以使用噬菌体载体，使用钙法、铷/钙法、钙/锰法、TFB高效率法、FSB冷冻感受态细胞法、迅速菌落法、电穿孔等该领域已知的方法或实质上与该方法同样的方法进行(D.Hanahan，J.Mol.Biol.，166：557，1983等)。为了分离目的DNA，可以运用逆转录PCR(polymerase chain reaction coupledreverse transcription；RT-PCR)、RACE(rapid amplification of cDNAends)。RACE可以根据例如M.A.Innis et al.ed.，“PCR Protocols”(M.A.Frohman，“a guide to methods and applications”)，pp.28-38，Academic Press，New York(1990)等所述的方法进行。
DNA，可以根据需要克隆，例如可以利用质粒、λ噬菌体、粘粒、P1噬菌体、F因子、YAC等。理想的是来自λ噬菌体的载体，例如可以利用Charon 4A、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIXII、λEMBL3、λZAPIITM(Stratagene公司)等。将得到的DNA整合到下面详细说明那样的适当载体、例如质粒pEX、pMAMneo、pKG5等载体，用下面详细说明那样的适当的宿主细胞、例如大肠杆菌、酵母、CHO细胞、COS细胞等表达。另外该DNA片段直接或作为附加了适当调控序列的DNA片段整合到适当的载体、然后导入动物后，可以做成表达所定基因的转基因动物。作为动物如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、牛等。最好是将该DNA片段导入小鼠等动物的受精卵，可以做成转基因动物。对于所定基因产物的确认可以使用转化该外源基因的293T细胞、COS-1细胞等适于该基因的动物细胞等进行。
作为将外源基因导入哺乳动物等动物细胞的方法，可以通过该领域已知的方法或实质上与该方法同样的方法进行，例如磷酸钙法(例如，F.L.Graham et al.，Virology，52：456，1973等)、DEAE-葡聚糖法(例如，D.Warden et al.，J.Gen.Virol.，3：371，1968等)、电穿孔法(例如，E.Neumann et al.，EMBO J 1：841，1982等)、微注射法、脂质体法、病毒感染法、噬菌体粒子法等。这样一来，转染了所定基因的动物细胞产生的基因产物也可以对其进行解析。
作为整合所定基因等(本发明中得到的DNA等)的质粒，只要是在基因工程中常用的宿主细胞(例如，大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞宿主，酵母、CHO细胞、COS细胞等真核细胞宿主，Sf21等昆虫细胞宿主)中该DNA能够表达的质粒，什么样的质粒都可以。当然也可以选用市售的试剂盒或试剂附带的质粒。在这样的序列内，也可以含有例如为了在选择的宿主中表达而进行适当修饰的密码子，或设计限制酶部位，也可以含有为了使目的基因表达容易的调控序列、促进序列等、在结合目的基因中起作用的接头、适配器等、以及调控抗生素抗性等、调控代谢、对筛选等有用的序列(也可以含有编码杂化蛋白或融合蛋白质的序列)等。最好是使用适当的启动子、例如在以大肠杆菌作为宿主的质粒中，如使用色氨酸启动子(trp)、乳糖启动子(lac)、色氨酸-乳糖启动子(tac)、脂蛋白启动子(lpp)、λ噬菌体PL启动子等，在以动物细胞作为宿主的质粒中，可以使用SV40late启动子、MMTV LTR启动子、RSV LTR启动子、CMV启动子、SRα启动子等，在以酵母作为宿主的质粒中可以使用GAL1、GAL10启动子等。另外也可以使用CYC1、HIS3、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、EN0、TP1、AOX1等调控系。
为了促进编码所期望的多肽的DNA的转录，可以在载体中插入增强子，作为这样的增强子，如作用于启动子，具有促进转录的作用，通常约10～100bp的具有cis作用的序列(元件)。很多增强子是从珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-转铁蛋白、胰岛素等哺乳动物基因了解的。作为代表性的，使用从真核细胞感染性病毒得到的增强子合适，例如位于复制起点的late区域的SV40增强子(100-270bp)、巨细胞病毒的初期启动子的增强子、位于多糖类的复制起点的late区域的增强子、腺病毒的增强子等。另外根据需要，也可以附加宿主中存在的信号序列，这些对于同行都是非常了解的增强子。
作为以大肠杆菌作为宿主的质粒，例如pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、DGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)、pBluescript KSTM(Stratagene公司)等。作为适于在大肠杆菌中表达的质粒载体，如pAS、pKK223(Pharmacia公司)、pMC1403、pMC931、pKC30、pRSET-B(Invitrogen公司)等。作为以动物细胞为宿主的质粒，例如SV40载体、多糖类·病毒载体、牛痘病毒载体、逆转录病毒载体等，具体来说，如pcD、pcD-SRα、CDM8、pCEV4、pME18S、pBC12BI、pSG5(Stratagene公司)等。作为以酵母为宿主的质粒，如YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体等，例如pGPD-2等。作为宿主细胞，当宿主细胞为大肠杆菌时，如来自大肠杆菌K12株的，例如作为来自NM533、XL1-Blue、C600、DH1、DH5、DH11S、DH12S、DH5α、DH10B、HB101、MC1061、JM109、STBL2、B834株的，如BL21(DE3)pLYsS等。宿主细胞为酵母时，例如Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces prombe，Pichia pastoris，Kluyveromyces株，Candida，Trichoderma reesia，以及其他酵母株等。
宿主细胞为动物细胞时，如来自非洲黑长尾猴纤维芽细胞的COS-7细胞、COS-1细胞、CV-1细胞、来自人肾细胞的293细胞、来自人表皮细胞的A431细胞、来自人结肠的205细胞、来自小鼠纤维芽细胞的COP细胞、MOP细胞、WOP细胞、来自中国仓鼠细胞的CHO细胞、CHO DHFR-细胞、人HeLa细胞、来自小鼠细胞的C127细胞、来自小鼠细胞的NIH 3T3细胞、小鼠L细胞、9BHK、HL60、U937、HaK、Jurkat细胞、其他被转化后得到的细胞系、通常的二倍体、由体外一次培养组织诱导的细胞株等。作为昆虫细胞，如以蚕核多角体病毒(Bombyxmori nuclear polyhedrosis virus)、来自它的病毒或其它合适的病毒作为载体，可以使用Spodoptera frugiperda(caterpillar)，Aedes aegypti(mosquito)，Aedes albopictus(mosquito)，Drosophila melanogaster(fruitfly)，蚕幼虫或蚕培养细胞、例如BM-N细胞等(例如，Luckow et al.，Bio/Technology，6，47-55(1988)；Setlow，J.K.et al.(eds.)，GeneticEngineering，Vol.8，pp.277-279，Plenum Publishing，1986；Maedaet al.，Nature，315，pp.592-594(1985))。利用Agrobacteriumtumefaciens等，可以将植物细胞作为宿主细胞使用，与适合它的载体一起，在该领域已被广泛了解。在本发明的基因工程手法中，可以使用在该领域已知或广泛运用的限制酶、逆转录酶、用于对适于将DNA片段克隆化的结构进行修饰或进行变换的酶DNA修饰·分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸基转移酶、DNA连接酶等。作为限制酶，例如R.J.Roberts，Nucleic Acids Res.，13：r165，1985；S.Linn et al.ed.Nucleases，p.109，Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York，1982；R.J.Roberts，D.Macelis，Nucleic AcidsRes.，19：Suppl.2077，1991等所述的酶。
根据本发明，用含有编码多肽(或蛋白质)的核酸的表达载体转化的转化体根据需要使用适当的选择标志，通过反复克隆，可以获得具有稳定高表达能力的细胞株。例如，在作为宿主细胞使用动物细胞的转化体中，作为选择标志利用dhfr基因时，通过慢慢提高MTX浓度进行培养，选择抗性株，使编码本发明的多肽的DNA扩增，可以获得能更高表达的细胞株。本发明的转化体可以在可表达编码本发明的多肽的核酸的条件下进行培养，使目的物生成、蓄积。该转化体可以在该领域中广泛使用的培养基中进行培养。例如以大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞宿主、酵母等作为宿主的转化体最好使用液体培养基。在培养基中可以含有该转化体生育需要的碳源、氮源、无机物等。作为碳源，如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作为氮源，如铵盐类、硝酸盐类、玉米浆、胨、酪蛋白、肉提取物、麦芽提取物、大豆粕、马铃薯提取液等无机或有机物质，作为无机物，例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁、碳酸钙等。另外也可以添加酵母、维生素类、酪蛋白水解物、生长促进因子等。另外根据需要，为了更有效地使启动子起作用，可以添加例如3β-吲哚丙烯酸那样的药剂。培养基的pH希望约5～约8。
培养，例如对于大肠杆菌通常于约15～约45℃下进行约3～约75小时，根据需要，也可以加通气或搅拌。对宿主为动物细胞的转化体进行培养时，作为培养基可以使用例如含有约5～约20％的胎牛血清的MEM培养基、PRMI1604培养基、DMEM培养基等。pH优选约6～约8。培养通常于约30～约40℃下进行约15～约72小时，根据需要，也可以加通气或搅拌。表达所定基因产物的转化体可以直接利用，也可以做成该细胞匀浆液利用，也可以将所定基因的产物分离后使用。当从上述培养细胞提取时，可以适当地运用培养后用众所周知的方法收集菌体或细胞，将它们悬浮于适当的缓冲液中，通过超声波、溶菌酶和/或冷冻融解等破坏菌体或细胞后，通过离心分离或过滤很多粗提取液的方法等。在缓冲液中也可以加尿素或盐酸胍等蛋白质变性剂、TritonX-100(商品名)、吐温-20(商品名)等表面活性剂。目的生成物向培养液中分泌时，培养结束后，通过这方面众所周知的方法将菌体或细胞与上清分离，收集上清。
上述那样得到的培养上清、或提取液中含有的目的生成物可以将对于目的生成物众所周知的分离纯化法适当组合对其进行纯化，例如通过硫酸铵沉淀法等盐析、通过交联葡聚糖等凝胶过滤法、使用带有例如二乙基氨乙基或羧甲基等的载体的离子交换层析法、例如，使用带有丁基、辛基、苯基等疏水性基团的载体等的疏水性层析法、色素凝胶层析法、电泳法、透析、超滤、亲和层析法、高效液相层析法等进行纯化获得。理想的是可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、固定了配体等的亲和层析等进行处理，进行纯化分离处理。例如明胶-琼脂糖亲和层析、肝素-琼脂糖层析等。
得到的本发明的多肽(或蛋白质)可以通过化学的手法再对其含有的氨基酸残基进行修饰，或使用肽酶，例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、肽链内切酶、肽链外切酶等酶进行修饰，进行部分分解后作为其衍生物等。本发明的多肽C末端通常为羧基(-COOH)或羧酸盐基(-COO-)，C末端也可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。其中作为酯中的R，除了可以使用甲基、乙基、n-丙基、异丙基或n-丁基等C1-6烷基、例如环戊基、环己基等C3-8环烷基、例如苯、α-萘等C6-12芳香基、例如苄基、苯乙基等苯-C1-2烷基或α-萘甲基等α-萘-C1-2烷基等C7-14芳烷基之外，还可以使用作为口服用酯被广泛运用的三甲基乙酰氧甲基等。当本发明的蛋白质C末端以外含有羧基(或羧酸盐)时，羧基被酰胺化或酯化后的产物也包括在本发明的多肽中。作为此时的酯，例如可以使用上述的C末端的酯等。
另外，在本发明的多肽(或蛋白质)中，也包括在上述的多肽中，N末端的蛋氨酸残基的氨基被保护基(例如，甲酰基、乙酰基等C1-5烷基-羰基等C1-6酰基等)保护的产物，N端侧在生物体内被切断生成的谷酰基进行焦谷氨酰化的产物、分子内氨基酸的侧链上的取代基(例如，-OH、-COOH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)用适当的保护基(例如，甲酰基、乙酰基等C1-6酰基等)保护的产物、或结合了糖链的所谓糖蛋白等复合蛋白质等。
另外，通过使用以本发明涉及到的基因的碱基序列作为基础的基因工程常用的方法，例如在所定的多肽的氨基酸序列中适当地置换、缺失、插入、转移或附加1个或多个以上氨基酸，可以制造导入了变异相当的多肽。作为这样的变异·变换·修饰法，例如日本生化学会编、“续生化学实验讲座1、基因研究法II”、p.105(广濑进)、东京化学同人(1986)；日本生化学会编、“新生化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)”、p.233(广濑进)、东京化学同人(1992)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.154，p.350&p.367，，Academic Press，New York(1987)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100，p.457&p.468，Academic Press，New York(1983)；J.A.Wells etal.，Gene，34：315，1985；T.Grundstroem et al.，Nueleic AcidsRes.，13：3305，1985；J.Taylor et al.，Nucleic AcidsRes.，13：8765，1985；R.Wu ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant et al.，Gene，44：177，1986等所述的方法。例如，利用合成寡核苷酸等的位置指定突变导入法(部位特异的突变导入法)(Zoller et al.，Nucleic Acids Res.，10：6487，1987；Carter et al.，Nucleic Acids Res.，13：4331，1986)、盒(序列)突变导入法(cassettemutagenesis：Wells et al.，Gene，34：315，1985)，限制部位选择突变导入法(restriction selection mutagenesis：Wells etal.，Philos.Trans.R.Soc.London Ser A，317：415，1986)，丙氨酸·扫描法(Cunningham &Wells，Science，244：1081-1085，1989)，PCR突变导入法，Kunkel法，dNTP[αS]法(Eckstein)，使用亚硫酸或亚硝酸等的区域指定突变导入法等方法。
另外，当用基因重组法进行制造时，以融合多肽(融合蛋白质)使其表达，在生物体内或生物体外，也可以变换·加工为实质上具有与所期望的多肽同等生物学活性的多肽。可以使用基因工程常用的融合产生法，这样融合的多肽利用其融合部，通过亲核层析等也可以进行纯化。作为这样融合多肽，如可以与组氨酸盒融合的融合多肽，或与β-半乳糖苷酶(β-gal)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(thioredoxin)(TRX)或Cre Recombinase的氨基酸序列融合的融合多肽。同样，多肽可以附加异种的抗原表位标记，通过使用与该抗原表位特异结合的抗体的免疫亲和层析也可以进行纯化。在更适合的上述方式中，如聚组氨酸(poly-His)或聚组氨酸-甘氨酸(poly-His-Gly)标记，而作为抗原表位标记，例如AU5，c-Myc，CruzTag 09，CruzTag 22，CruzTag 41，Glu-Glu，HA，Ha.11，KT3，FLAG(registered trademark，Sigma-Aldrich)，Omni-probe，S-probe，T7，Lex A，V5，VPl6，GAL4，VSV-G等(Field et al.，Molecularand Cellular Biology，8：pp.2159-2165(1988)；Evan etal.，Molecular and Cellular Biology，5：pp.3610-3616(1985)；Paborsky et al.，Protein Engineering，3(6)：pp.547-553(1990)；Hopp et al.，BioTechnology，6：pp.1204-1210(1988)；Martin etal.，Science，255：pp.192-194(1992)；Skinner etal.，J.Biol.Chem.，266：pp.15163-15166(1991)；Lutz-Freyermuthet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：pp.6393-6397(1990)等)。也可以利用使用酵母的双杂交(two-hybrid)法。
另外作为融合多肽，也可以是附加了成为可检测的蛋白质那样的标志的融合多肽。在更合适的实施方式中，该可检测标志可以是生物素/链抗生物素蛋白系的Biotin Avi Tag、发荧光的物质等。作为发该荧光的物质，如来自オワン水母(Aequorea victorea)等发光水母的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein：GFP)、对其进行改变后的变异体(GFP变异体)、例如EGFP(enhanced-humanized GFP)、rsGFP(red-shift GFP)，黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein：YFP)，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein：GFP)、蓝绿色荧光蛋白(cyan fluorescent protein：CFP)，蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein：BFP)，来自ウミシイタケ(Renillareniformis)的GFP等(宫胁敦史编、实验医学另册后基因组时代的实验讲座3-GFP和Bioimaging、羊土公司(2000年))。也可以使用特异识别上述融合蛋白的抗体(包括单克隆抗体和其片段)进行检测。这样的融合多肽的表达和纯化也可以使用适用于表达和纯化的试剂盒，按照试剂盒制造者或试剂盒销售者明确给出的程序实施。
得到的蛋白质(可以包括肽和多肽)，通过酶免疫测定法等已知手法使它结合于适当的载体或固相，可以进行固定化。固相化蛋白质、固相化肽可很便利地用于结合分析或物质的筛选。
多肽或蛋白质的结构的修饰·改变等可以参考例如日本生化学会编“新生化学实验讲座1、蛋白质VII、蛋白质工程”东京化学同人(1993)，根据该文献所述的方法或其引用的文献所述的方法、或与其实质上同样的方法进行。在如下面所述的那样的生物学活性中，也可以包括免疫方面活性、例如抗原性。在该修饰·改变中，可以是脱氨基化、羟基化、羧基化、磷酸化、硫酸化、甲基化等烷基化、乙酰化等酰化、酯化、酰胺化、开环、闭环、糖基化、向含糖链种类不同方面改变、将含糖链数增减、脂质结合、对D-体氨基酸残基的置换等。这些方法都是在该领域已知的方法(例如、T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，pp.79-86 W.H.Freeman & Co.，San Francisco，USA(1983)等)。
本发明的来自人的肽或多肽(或蛋白质)，1个以上的氨基酸残基在同一性方面与天然的不同，也可以是1个以上氨基酸残基的位置与天然的位置不同。本发明的来自人的肽包含缺少人半乳凝素9(包括L，M以及S型)蛋白质中特有的氨基酸残基中1个以上(例如，1～80个、优选1～60个、更优选1～40个、更优选1～20个、特别优选1～10个等)的缺失类似物、特有氨基酸残基中的1个以上(例如，1～80个、优选1～60个、更优选1～40个、更优选1～20个、特别优选1～10个等)被其它残基置换的置换类似物、也包含附加1个以上(例如，1～80个、优选1～60个、更优选1～40个、更优选1～20个、特别优选1～10个等)的氨基酸残基的附加类似物。
如果作为天然的人半乳凝素9蛋白质的特征的区域结构或糖结合能力被维持，象上述那样的变异体全部包含在本发明中。另外，可以认为本发明的肽或多肽也包含具有与天然的人半乳凝素9蛋白质实质上同等的一级结构构象或具有其一部分的肽或多肽，还包含与天然的具有实质上同等生物学活性的肽或多肽。另外，还可以是天然产生的变异体之一。本发明的所谓来自人的蛋白质(或肽或多肽)，如对选自WO 02/37114 A1的序列表中的SEQ ID NO：1～3的氨基酸序列具有60％、因场合不同，比70％更高的相同性的蛋白质，更优选的是具有80％或90％以上高的相同氨基酸序列的蛋白质。所谓本发明的来自人的蛋白质的一部分是来自人的蛋白质的一部分肽(即该蛋白质的部分肽)，只要是具有与本发明的半乳凝素9蛋白质实质上同等活性的肽，无论哪一个都可以。例如，该本发明的蛋白质的部分肽如具有该人半乳凝素9的构成氨基酸序列中至少5个以上，优选20个以上、更优选50个以上、更优选70个以上、更优选100个以上、有时200个以上的氨基酸序列的肽，理想的是这些肽是对应于连续的氨基酸残基的肽，或例如有关在该WO 02/37114 A1的序列表中的SEQ ID NO：1～3的任一个表示的氨基酸序列中对于对应的区域的相同性，具有与上述同样的相同性的肽。
在本说明书中，所谓“实质上同等”意思是指蛋白质的活性、例如所定的毒害细胞活性、凋亡诱起活性、抗炎症活性、抗过敏活性、免疫抑制活性、糖链结合活性、生理活性、生物学活性实质上相同。另外，在该用语的意思中还可以包含实质上具有同质的活性的场合，作为该实质上同质的活性，如结合活性、毒害细胞活性、凋亡诱起活性等。所谓实质上同质的活性表示这些活性性质上是同质，例如生理方面、药理学方面、或生物学方面同质。例如，结合活性、毒害细胞活性、凋亡诱起活性等活性最好是同等(例如，约0.001～约1000倍、优选约0.01～约100倍、更优选约0.1～约20倍、更优选约0.5～约2倍)，这些活性的程度、蛋白质的分子量等量的要素也可以不同。然后，氨基酸的置换、缺失、或插入常常都不会使多肽的生理特性或化学特性发生大的变化，在某些场合会给出理想的变化。这样进行的场合，实施其置换、缺失、或插入的多肽应当当作为与没有进行这样的置换、缺失、或插入的多肽实质上同一。作为该氨基酸序列中的氨基酸的实质上同一的置换体，该氨基酸可以从所属的类中的其它氨基酸类选择。例如，作为非极性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸等，作为极性(中性)，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等，作为带有正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)，如精氨酸、赖氨酸、组氨酸等，作为带有负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)，天冬氨酸、谷氨酸等。
对于本发明的蛋白质和其一部分肽的合成，可以使用该肽合成领域中已知的方法，例如液相合成法、固相合成法等化学合成法。在这样的方法中，使用例如蛋白质或肽合成用树脂，使适当保护的氨基酸通过这方面众所周知的各种缩合方法按照所期望的氨基酸序列依次在该树脂上结合。对于缩合反应最好是使用这方面众所周知的各种活化试剂，作为这样的试剂，最好使用例如二环己基碳二亚胺等碳二亚胺类。生成物含有保护基时，可以通过除去适当保护基获得目的生成物。
本发明的肽(或多肽)以游离型得到时，可以通过这方面众所周知的方法或根据这些方法的方法变换为盐，而这些生成物以盐形式获得时，可以通过这方面众所周知的方法或根据这些方法的方法变换为游离型产物或其它的盐。
作为本发明的肽(或多肽)的盐，作为生理上容许的或作为医药容许的盐是优选的，但不限定于这些。作为这样的盐，例如与盐酸、溴氢酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，例如与醋酸、甲酸、马来酸、延胡索酸、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、苯甲酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、苯磺酸等有机酸的盐等。而作为该盐如铵盐、如乙胺、二甲基胺、三甲基胺、羟乙胺等有机碱基的盐等。
对于半乳凝素9表达基因(包括cDNA等DNA以及mRNA等RNA)根据上述“基因重组技术”，通过在该领域中用于检测测定特定基因的表达已知的手法、例如原位(in situ)杂交、Northern blotting、dot blotting、RNase保护分析、RT-PCR、Real-Time PCR(Journalof Molecular Endocrinology，25，169-193(2000)以及其中引用的文献)、DNA阵列解析法(Mark Shena编，“Microarray BiochipTechnology”，Eaton Publishing(2000年3月)等进行检测·测定，可以检测与本说明书公布的半乳凝素9表现出的生物活性相关的现象等。利用这样的技术的半乳凝素9表达测定系、测定系中利用的试剂、方法、程序等都包括在本发明的技术以及技术中利用的系统。对于该in situ杂交，可以包括例如非RI in situ杂交，其中也可以包括直接法和间接法。该直接法是使用可检测的分子(报告分子)直接结合于核酸探针的方法，该间接法是使用针对报告分子的抗体等使信号扩增的方法。在核酸探针中的寡核苷酸中，导入官能团(例如，第一级脂肪族氨基、SH基等)，可以使庚烯、荧光色素、酶等结合于这样的官能团。作为核酸探针的标记，代表性的如洋地黄毒苷(DIG)、生物素、荧光素等，象上述那样在抗体的地方可以从进行说明的标记中适当选择使用，另外也可以利用多重标记，还可以利用标记抗体。作为核酸探针的标记法，可以从该领域中已知的方法中选择使用，例如随机引物法、切口平移法、利用PCR的DNA的扩增、标记/加尾法、in vitrotranscription法等。对于可处理的样品的观察，可以从该领域中已知的方法中适当选择使用，例如可以使用暗视野显微镜、位相差显微镜、反射对照显微镜、荧光显微镜、数字图像显微镜、电子显微镜等，另外也可以利用流式细胞仪。
本说明书中，所谓恶性细胞可以包含进行转移的肿瘤细胞。进行转移的肿瘤在恶性肿瘤中一般将其恶性肿瘤分为上皮性和非上皮性的肿瘤，有时也区分为癌、肉瘤、白血病等，单称为“癌”时，在一般人中大多指恶性肿瘤。在本说明书中所谓“癌”可以按照广泛意思解释，并不单解释为上皮性的恶性肿瘤。在本说明书中所谓“癌”可以包含上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤(既包含肿瘤形成性的肿瘤，也包含非形成性的肿瘤)，如皮肤癌(也包含黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸恶性肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、咽头·喉头癌、舌癌、上顎癌、食道癌、胃癌、结肠·直肠癌、肺·支气管癌、肝癌(包括肝细胞癌、肝内胆管癌)、肝外胆管·胆囊癌、胰赃癌、白血病、恶性淋巴瘤、形质细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性血管瘤、恶性血管内皮瘤、脑肿瘤(包括脑膜瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤等)等，并不限定于这些，应当理解为利用半乳凝素9具有的活性，成为本发明所定目的对象的都包括在内，没有特别限定。
利用在本发明中阐明的半乳凝素9起到的功能，可以筛选对该半乳凝素9的所定生物学活性等功能(例如，毒害细胞活性、凋亡诱导活性、与糖皮质激素类似的活性、抑制恶性细胞的转移的活性等)促进的化合物(激动剂)或抑制的化合物(拮抗剂)或它们的盐。这也意味着可以提供该筛选试剂。因此，也可以提供有关利用在本发明中阐明的该半乳凝素9蛋白质等多肽、其一部分肽或它们的盐表现出的活性的各种各样的物质，对本发明中该半乳凝素9蛋白质、其一部分肽或它们的盐等表现出的生物学活性等所定功能促进的化合物(激动剂)或抑制的化合物(拮抗剂)或它们的盐的筛选方法。
在该筛选中，例如(i)使适当的试验样品与半乳凝素9蛋白质、其一部分肽或它们的盐(也包括表达该蛋白质的转化体)等接触的场合，(ii)与在本发明的蛋白质、其一部分肽或它们的盐等中不存在问题的试验样品场合进行比较。(iii)具体来说，在上述筛选中，测定该生物学活性(例如，与各个半乳凝素9蛋白质和生物体成分之间的相互作用有关的活性等)后进行比较。
在该筛选系也可以存在为了便于测定的适当的检测用底物。作为该底物，只要是在测定中可有效利用的，无论什么样的都可以。例如，从作为众所周知的底物已知的底物中选择使用，优选是可以使用合成的化合物等。底物可以直接使用，但优选是使用用荧光素等荧光、酶或放射性物质标记的底物。
作为试验样品，例如蛋白质、肽、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、植物提取物、动物等组织提取物、细胞提取物等。在试验样品中使用的试验化合物的例子中优选含有抗凝集素抗体、酶抑制剂、细胞因子、各种具有抑制活性的化合物、特别是合成化合物等。这些化合物可以是新的化合物，也可以是众所周知的化合物。该筛选可以根据通常的结合活性或酶活性的测定法实施，例如可以参考该领域中众所周知的方法等进行。另外，可以使用各种标记、缓冲液系以及其它适当的试剂等，可以按照在此说明的操作等进行。使用的肽等可以用活化剂进行处理，也可以预先将其前体或潜在型的前体变换为活性型的前体。测定通常在Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液等对反应没有坏的影响的那样缓冲液等中，例如在pH约4～约10(优选pH约6～约8)中进行。当分别进行筛选时，在各个方法中的通常的条件、操作法中除了同行的通常技术考虑后，可以构建与本发明的该半乳凝素9蛋白质或与其实质上具有同等活性的多肽或肽有关的测定系。有关这些一般的技术手段的详细叙述可以参照综述、出版的书等[例如、Methods in Enzymology Academic Press公司(USA)发行等]。另外，凋亡诱导活性测定法等可以参考田沼靖一监修、“细胞工程手册：实验程序系列、凋亡实验程序”株式会社秀润社、1995年1月20日(第1版第2次印刷)等，也可以使用市售测定试剂盒。
使用本发明的筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐是从上述的试验化合物、例如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物等选择的化合物，是促进或抑制本发明的蛋白质等的功能的化合物。作为该化合物的盐，如药学上容许的盐等。例如，与无机碱基的盐、与有机碱基的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。作为与无机碱基的盐的合适例子，如钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土金属盐，以及铝盐、铵盐等。作为与有机碱基的盐的合适例子，如与三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二碱基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己基胺、二环己基胺、N，N-二苄基乙二胺等的盐。作为与无机酸的盐的合适例子，如与盐酸、溴氢酸、硫酸、磷酸等的盐。作为与有机酸的盐的合适的例子，例如与甲酸、醋酸、丙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等的盐。而作为与碱性氨基酸的盐的合适例子，如与精氨酸、赖氨酸、组氨酸等的盐，作为与酸性氨基酸的盐的合适的例子，如与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
本说明书中，抗半乳凝素9抗体可以使用众所周知的手段获得多克隆抗体或单克隆抗体。
本说明书中，所谓“抗体”用语，可以是在广义的意思使用的用语，可以是针对所期望的半乳凝素9多肽以及相关肽片段的单克隆抗体的单一抗体或针对各种抗原表位的具有特异性的抗体组合物，另外，包括1价抗体或多价抗体以及多克隆抗体和单克隆抗体的用语，也可以是表示天然型(intact)分子以及它们的片段和衍生物的用语，被认为是包含所谓的F(ab’)2，Fab’以及Fab的片段，还包含含有至少两个抗原或表位(epitope)结合部位的嵌合抗体或杂种抗体、或例如四价体(quadrome)、三价体(triome)等二重特异性重组抗体、种间杂种抗体、抗个体基因型抗体、以及经化学修饰或加工等生成的那些衍生物的用语、运用众所周知的细胞融合或杂交瘤技术或抗体工程，使用合成或半合成技术得到的抗体、运用从抗体生成的观点众所周知的以往技术，利用DNA重组技术制备的抗体、对于在本说明书中所述、而且定义的靶抗原物质或靶表位具有中和特性的抗体或具有结合特性的抗体。特别理想的本发明的抗体是能够特异识别天然型的M型半乳凝素9(galectin-9 medium isoform or medium typegalectin-9)多肽或天然型的L型半乳凝素9(galectin-9 longisoform or long type galectin-9)多肽的抗体，例如能够将L型半乳凝素9多肽或M型半乳凝素9多肽和S型半乳凝素9多肽(galectin-9 short isoform or short type galectin-9)区别识别的抗体。
为了以多克隆抗体形式获得抗半乳凝素9抗体，将作为免疫源的半乳凝素9和其片段、半乳凝素9序列的一部分肽免疫哺乳动物、鸟类等，从该哺乳动物、鸟类等採取血清。然后可以使用该抗血清中含有的多克隆抗体。
作为以该半乳凝素9作为致敏抗原被免疫的哺乳动物，没有特别限定，一般来说可以使用啮齿类动物、例如小鼠、大鼠、土拔鼠等，以及兔、绵羊、山羊、牛、马、猪、狗、猫、猴等灵长类、鸡等鸟类等。另外，有时考虑到与细胞融合使用的母细胞的适合性后进行选择更好。
将致敏抗原免疫动物可以根据众所周知的方法进行。例如，作为一般的方法，通过将致敏抗原注射到哺乳动物等腹腔内或皮下进行。另外，在致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。
含有多克隆抗体的抗血清可以在所定期间对被免疫动物进行饲养后，从该动物採集的血液中制备。得到的抗血清确认能够特异识别半乳凝素9后，可以作为本发明的所定的活性成分供给。
首先，作为获得抗体的致敏抗原使用的半乳凝素9可以通过众所周知的表达半乳凝素9基因/氨基酸序列获得(而半乳凝素9的氨基酸序列是WO 02/37114 A1公布的)。即，将编码半乳凝素9或其一部分的结构域、半乳凝素9的一部分蛋白质或多肽片段、具有相当于半乳凝素9的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列的肽的基因序列插入到众所周知的表达载体系后，转化适当的宿主细胞后，通过众所周知的方法从其宿主细胞中或培养上清中纯化目的半乳凝素9或其一部分结构域蛋白质、半乳凝素9的一部分的蛋白质或多肽片段、相当于半乳凝素9的氨基酸序列的一部分氨基酸序列的肽。
另外，在本发明中，作为抗半乳凝素9抗体可以使用来自哺乳动物的以单克隆抗体形式获得的抗体。
针对抗原物质制作的单克隆抗体是通过培养中的一系列细胞系使用可以提供抗体分子产生的任意方法产生的。所谓修饰语“单克隆”表示从实质上均质的抗体集团得到的显示该抗体的性格的抗体，不能看作必须要通过某一个特定方法产生该抗体。各个单克隆抗体除了也许是自然产生的变异体或许只是微量存在的以外，也包含同一的那样抗体集团。单克隆抗体具有高特异性，针对具有单一抗原性的部位。与典型的含有针对不同抗原决定族(表位)的各种各样抗体的通常的(多克隆)抗体制备物相比，各个单克隆抗体是针对该抗原上的单一抗原决定族的抗体。除了其特异性以外，单克隆抗体通过杂交瘤培养合成，其优点是没有其它免疫球蛋白类夹杂或很少夹杂。单克隆抗体包括杂化抗体和重组抗体。这些抗体只要是表现出所期望的生物活性，不管其来源或免疫球蛋白类或亚类的类别如何，将可变区结构域用恒定区结构域置换(例如，人源化抗体)、或轻链用重链置换，或某种链用另外一种链置换，或与异种的蛋白质融合获得(例如美国专利第4816567号；Monclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.79-97，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987等)。
在制造单克隆抗体的合适的方法的例子中，除了杂交瘤法(G.Kohler and C.Milstein，Nature，256，pp.495-497(1975))；人B细胞杂交瘤法(Kozbor et al，Immunology Today，4，pp.72-79(1983))；Kozbor，J.Immunol.，133，pp.3001(1984)；Brodeur etal.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.NewYork(1987)；triome法；EBV-杂交瘤法(Cole et al.，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))(用于产生人单克隆抗体的方法)；美国专利第4946778号(用于产生单链抗体的技术)之外，关于抗体如以下文献所述：S.Biocca et al，EMBO J，9，pp.101-108(1990))；R.E.Bird et al，Science，242，pp.423-426(1988))；M.A.Boss etal，Nucl.Acids Res.，12，pp.3791-3806(1984))；J.Bukovsky etal，Hybridoma，6，pp.219-228(1987))；M.DAINO et al，Anal.Biochem.，166，pp.223-229 (1987))；J.S.Huston et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，pp.5879-5883(1988))；P.T.Jones et al，Nature，321，pp.522-525(1986))；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods inEnzymology”，Vol.121(Immunochemical Techniques，Part I：Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)，AcademicPress，New York(1986)；S.Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.6851-6855(1984))；V.T.Oi et al，BioTechniques，4，pp.214-221(1986))；L.Riechmann et al，Nature，332，pp.323-327(1988))；A.Tramontano et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，pp.6736-6740(1986))；C.Wood et al，Nature，314，pp.446-449(1985)；Nature，314，pp.452-454(1985))或这些文献中引用的文献(这些文献中的某些记载由于参照它们，所有也包括在本说明书的内容中)。
本发明中涉及到的单克隆抗体只要是它们表现出所期望的生物活性，可以是重链和/轻链的一部分与由特定的种诱导的或属于特定的抗体类或亚类的抗体的对应序列同一或同系，另一方面，特别包含链的其余部分是与另外种诱导的或属于另外的抗体类或亚类的抗体的对应序列同一或同系的“嵌合”抗体(美国专利第4816567号说明书；Morrison et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.6851-6855(1984))。
本发明的单克隆抗体如通过来自哺乳动物的杂交瘤产生的抗体、以及通过基因工程手法通过用含有抗体基因的表达载体转化的宿主生产的抗体。
产生抗半乳凝素9抗体的产生单克隆抗体杂交瘤可以象以下那样使用骨髓瘤细胞的细胞融合技术制作。
即，使用半乳凝素9或其片段作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，将得到的免疫细胞通过通常的细胞融合法与众所周知的母细胞融合，可以通过通常的筛选法，通过筛选产生单克隆抗体的细胞制作。有关半乳凝素9或其片段的制备方法以及对哺乳动物的免疫方法等可以按照上述的制备含有多克隆抗体的抗血清的手法进行。此时，特别是在对哺乳动物免疫后，从确认血清中所期望的抗体水平上升的哺乳动物採取免疫细胞，进行细胞融合，作为优选的免疫细胞特别例举脾细胞。
作为可与上述免疫细胞融合的另一方母细胞，使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。作为该骨髓瘤细胞可以使用众所周知的各种细胞株。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合等基本上可以根据众所周知的方法、例如Kohler和Milstein方法(Kohler，G.and Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等进行。
以下以单克隆抗体为例，详细地说明抗体的制作。
本发明的抗体可以是利用使用骨髓瘤细胞的细胞融合技术得到的单克隆抗体，例如可以按照如下那样的工序制作。
(1)免疫原性抗原的制备、(2)用免疫原性抗原免疫动物、(3)骨髓瘤细胞的制备、(4)产生抗体细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合、(5)杂交瘤(融合细胞)的选择以及单克隆化、以及(6)单克隆抗体的制造
(1)免疫原性抗原的制备如下进行。作为抗原如上所述，可以使用对天然型半乳凝素9多肽或由其衍生的大片段(可以包含一部分结构域多肽、连接多肽、片段、一部分肽、合成多肽)进行分离后的多肽，可以利用根据决定的半乳凝素9的氨基酸序列信息为基础，化学合成适当的寡肽作为抗原。代表性的抗原如存在于选自(1)WO02/37114 A1公布的序列表中序列编号：1以及序列编号：2的氨基酸序列或其一部分结构域的氨基酸序列；(2)序列编号：3的一部分结构域的氨基酸序列；(3)序列表中的序列编号4，5，7，8和9的氨基酸序列；(4)序列表中的序列编号：1中的序列编号：构成与4相当的氨基酸序列相接的C端侧结构域的氨基酸序列或其一部分片段；(5)序列表中的序列编号：1中序列编号：构成与4相当的氨基酸序列之前的N端侧结构域的氨基酸序列或其一部分片段等区域的氨基酸残基中的具有连续的至少5个以上氨基酸的肽。
抗原可以直接与适当的佐剂混合后在对动物免疫时使用，也可以做成免疫原性缀合物等。例如，作为免疫原使用的抗原也可以是使半乳凝素9片段化后的产物、或根据其氨基酸序列选择特征性的序列区域，对多肽进行设计，通过化学合成得到的合成多肽。另外。将该片段借助于适当的缩合剂，与种种载体蛋白质结合，做成象半抗原-蛋白质那样免疫原性缀合物，使用该缀合物可以用于设计能够只与特定序列反应(或能够只识别特定序列)的单克隆抗体。在被设计的多肽中可预先附加半胱氨酸残基等，可以很容易地制备免疫原性缀合物。当与载体蛋白质类结合时，载体蛋白质类首先能够被活化。例如，当进行这样的活化时，导入活化结合基。
作为活化结合基，例如(1)活化酯或活化羧基、例如硝基苯酯基、五氟苯酯基、1-苯并三唑酯基、N-琥珀酰亚胺酯基等、(2)活化二硫基、例如2-吡啶二硫基等。作为载体蛋白质类，如眼孔蝛属血篮蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白、球蛋白、聚赖氨酸等多肽、细菌菌体成分、例如BCG等。
(2)用免疫原性抗原免疫动物象如下那样实施。免疫抗原通过同行都知道的方法进行，例如根据村松繁、他编、实验生物学讲座14、免疫生物学、丸善株式会社、昭和60年、日本生化学会编、续生化学实验讲座5、免疫生化学研究法、东京化学同人、1986年、日本生化学会编、新生化学实验讲座12、分子免疫学III、抗原·抗体·补体、东京化学同人、1992年等所述的方法进行。将免疫化剂(根据需要可以与佐剂一起)通过一次或一次以上的次数给哺乳动物注射进行免疫化。代表性作法是通过将该免疫化剂和/或佐剂对哺乳动物进行多次皮下注射或腹腔内注射。免疫化剂如含有上述抗原或其相关肽片段的制剂。免疫化剂也可以使用使它与在进行免疫处理的哺乳动物中可作为免疫原性的已知蛋白质(例如上述载体蛋白质类)形成缀合物后使用。作为佐剂，例如付氏完全佐剂、Ribi佐剂、百日咳疫苗、BCG、脂质A、脂质体、氢氧化铝、二氧化硅佐剂等。免疫可以使用例如BALB/c等小鼠、土拔鼠、以及其它适当的动物进行。抗原的给于量，例如对于小鼠约1～400μg/动物，一般向宿主动物的腹腔内或皮下注射，以后每隔1～4周，优选每隔1～2周向腹腔内、皮下、静脉内或肌肉内反复进行2～10次追加免疫。作为免疫用的小鼠除了BALB/c类小鼠之外，也可以使用BALB/c类小鼠与其他系小鼠的F1小鼠等。根据需要，制备抗体测定系，测定抗体效价后，可以确认动物免疫的程度。本发明的抗体可以是从这样免疫的动物得到的抗体，例如包含抗血清、多克隆抗体等。
(3)骨髓瘤细胞的制备如下实施。作为细胞融合使用的可无限增殖的细胞株(肿瘤细胞株)，可以从不产生免疫球蛋白的细胞株选择，例如可以使用P3-NS-1-Ag4-1(NS-1，Eur.J.Immunol.，6：511-519，1976)、SP-2/0-Ag14(SP-2，Nature，276：269～270，1978)、来自小鼠骨髓瘤MOPC-21细胞株的P3-X63-Ag8-U1(P3U1，Curr.topics Microbiol.Immunol.，81：1-7，1978)、P3-X63-Ag8(X63，Nature，256：495～497，1975)、P3-X63-Ag8-653(653，J.Immunol.，123：1548～1550，1979)等。8-氮杂鸟嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤细胞株在Dulbecco′s MEM培养基(DMEM培养基)、RPMI-1640培养基等细胞培养基中加例如青霉素、丁胺卡那霉素等抗生素、胎牛血清(FCS)等，再加8-氮杂鸟嘌呤(例如5～45μg/ml)的培养基中进行继代培养，在细胞融合的前2～5日用正常培养基进行继代，准备所需要数的细胞株。另外，使用的细胞株也可以将冷冻保存的细胞株于约37℃完全解冻后，用RPMI-1640培养基等正常培养基清洗3次以上后，用正常培养基培养，准备所需数的细胞株。
(4)产生抗体细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合可以象如下那样实施。按照上述(2)的工序被免疫的动物、例如小鼠在最终免疫后2～5日后，摘出他的脾脏，从脾脏中获得脾细胞悬浮液。除了脾细胞之外，还可以得到活体各个地方的淋巴节细胞，在细胞融合时可以使用。更具体来说，细胞融合，例如在细胞融合促进剂存在下，于通常的营养培养液中进行。作为上述细胞融合中使用的培养液，可以使用例如适合上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液以及该种细胞培养中使用的通常培养液，另外也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补液。这样一来，将如此得到的脾细胞悬浮液和在上述(3)工序中得到的骨髓瘤细胞株置于例如最小必需培养基(MEM培养基)、DMEM培养基、RPMI-1640培养基等细胞培养基中，添加细胞融合促进剂、例如聚乙二醇(PEG)。作为细胞融合促进剂，可以使用其它各种该领域中已知的促进剂，作为这样的促进剂如非活化的仙台病毒(HVJ：Hemagglutinating virus of Japan)等。最好是加例如30～60％的聚乙二醇0.5～2ml，可以使用分子量为1,000～8,000的聚乙二醇，更优选使用分子量为1,000～4,000的聚乙二醇。融合培养基中的聚乙二醇的浓度最好配成例如30～60％。根据需要，例如加少量二甲基亚砜等辅助剂，也可以提高融合效率。免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例，即融合中使用的脾细胞(淋巴细胞)：骨髓瘤细胞株的比例可以任意设定，例如设定为1∶1～20∶1，更优选4∶1～10∶1设定。
细胞融合将免疫细胞与骨髓瘤细胞的所定量于培养液中充分混合，按照通常的30～60％(w/v)的浓度添加预先加温到37℃程度的PEG溶液(例如平均分子量1000-6000程度)，通过混合，形成目的融合细胞(杂交瘤)。然后，通过重复进行逐次添加适当培养液，离心除去上清的操作，除去对杂交瘤的生育不利的细胞融合剂。
进行1～10分钟融合反应，融合加RPMI-1640培养基等细胞培养基。融合反应处理也可以进行多次。融合反应处理后，通过离心等分离细胞后移至选择用培养基。
(5)杂交瘤(融合细胞)的选择以及单克隆化象如下那样实施。作为选择用培养基，如通常的选择培养基，例如含有次黄嘌呤、氨基蝶呤以及胸腺嘧啶的含有FCS的MEM培养基、RPMI-1640培养基等培养基，所谓HAT培养基。在上述HAT培养液中培养时，为了消灭除杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)，要继续充分时间(通常数日～数周)。选择培养基交换方法一般是第二天加与分注到培养皿的容量等容量的量，其后每隔1～3日，按照用HAT培养基交换一半量那样进行处理，也可以适当地进行变更。在融合后8～16日，除去氨基蝶呤用所谓HT培养基每隔1～4日进行培养基交换。作为饲养细胞也可以使用例如小鼠胸腺细胞，那样更优选。
将杂交瘤增殖旺盛的培养孔的培养上清用例如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)、发光免疫分析(LIA)、Western blotting等测定系，或荧光激活细胞分选仪(FACS)等，使用所定的片段肽作为抗原，或使用标记抗小鼠抗体测定目的抗体等，进行筛选。对产生目的抗体的杂交瘤进行筛选。克隆于琼脂培养基中对菌落进行收集，或通过有限稀释法可以完成。用有限稀释法进行更理想。克隆最好进行多次。这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤在通常的培养液中可进行继代培养，另外也可以在液氮中长期保存。
(6)单克隆抗体的制造如下实施。为了从该杂交瘤获得单克隆抗体，可以采用按照通常的方法对该杂交瘤进行培养，获得其培养上清的方法、或将杂交瘤注入到与该杂交瘤适合的哺乳动物后，使其增殖，获得其腹水的方法等。前者的方法适于获得高纯度的抗体，而后者的方法适于抗体的大量生产。
这样一来，得到的杂交瘤株于含有FCS的MEM培养基、RPMI-1640培养基等适当的增殖用培养基中进行培养，从该培养基上清可以获得所期望的单克隆抗体。为了获得大量的抗体，如使杂交瘤腹水化。此时，将各杂交瘤移植到与来自杂交瘤细胞的动物同系的组织适合性动物的腹腔内，可以使其增殖、或回收产生在该动物的腹水中的单克隆抗体。动物在杂交瘤移植之前，也可以预先向腹腔内注入姥鲛烷(2，6，10，14-四甲基十五烷)等矿物油，进行该处理后，使杂交瘤增殖，採取腹水。腹水也可以直接使用，或通过以往众所周知的方法、例如硫酸铵沉淀法等盐析、通过交联葡聚糖等凝胶过滤法、离子交换层析法、电泳法、透析、超滤法、亲和层析法、高效液相层析法等进行纯化，作为单克隆抗体使用。优选是将含有单克隆抗体的腹水经硫铵分级后，通过如DEAE-琼脂糖那样的阴离子交换凝胶和蛋白A柱那样的亲和柱等处理，可以纯化分离处理。固定了抗原或抗原片段(例如合成肽、重组抗原蛋白质或肽、抗体特异识别的部位等)的亲和层析、固定了蛋白A的亲和层析、羟磷灰石层析等更优选。
另外，转基因小鼠或其他生物，例如其他哺乳动物可以用于表达针对本发明的免疫原多肽产物的人源化抗体等的抗体。
而决定这样大量获得的抗体的序列，利用编码从杂交瘤株编码得到的抗体的核酸序列，通过基因重组技术也可以制作抗体。编码该单克隆抗体的核酸，例如可以通过使用能够与编码小鼠抗体重链或轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针等的惯用手法进行分离，进行序列决定。一旦分离的DNA插入表达载体，可以进入CHO、COS等宿主细胞。该DNA会取代例如同源的小鼠的序列，置换为编码人的重链或轻链的恒定区结构域的序列等，  可以进行修饰(Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6581，1984)。这样一来，也可以制备具有所期望的结合特异性的嵌合抗体或杂化抗体。另外，抗体可以运用包括使用下面那样的缩合剂的化学的蛋白质合成技术，也可以进行制备嵌合抗体或杂化抗体等的修饰。
人源化抗体可以通过该领域已知的技术进行(例如，Jones etal.，Nature，321：pp.522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：pp.323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，239：pp.1534-1536(1988))。人单克隆抗体也可以通过该领域已知的技术进行，用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞或人·小鼠异骨髓瘤细胞在该领域是已知的(Kozbor，J.Immunol.，133，pp.3001(1984)；Brodeur etal.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.New York(1987))。制造bispecific抗体的方法在该领域中也已知(Millstein et al.，Nature，305：pp.537-539(1983)；WO93/08829；Traunecker et al.，EMBO J.，10：pp.3655-3659(1991)；Suresh et al.，“Methods in Enzymology”，Vol.121，pp.210(1986))。
另外，用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶对这些抗体进行处理，可以变成由于处理状况不同被还原后得到Fab、Fab’、F(ab’)2的抗体片段后使用。
作为代表性的抗半乳凝素9抗体，如与L、M和S型半乳凝素9都结合的抗体，与L以及M型半乳凝素9双方都结合，而与S型半乳凝素9不反应的抗体，与L型半乳凝素9双方都结合，而与M和S型半乳凝素9不反应的抗体，分别对L、M和S型半乳凝素9特异的抗体，对半乳凝素9的C-末端侧CRD或其片段肽特异的抗体，对半乳凝素9的N-末端侧CRD或其片段肽特异的抗体，对各连接肽或其片段肽特异的抗体等。
抗体可以在已知的任意测定法、例如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、以及免疫沉淀测定中使用(Zola，MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.，1987))。
在对可检测抗体的原子基团分别进行缀合时，可以使用该领域中已知的任意方法，例如David et al.，Biochemistry，13卷，1014-1021页(1974)；Pain et al，J.Immunol.Meth.，40：pp.219-231(1981)；以及“Methods in Enzymology”；Vol.184，pp.138-163(1990)所述的方法。作为带有标记物的抗体，可以使用IgG级分、以及胃蛋白酶消化后还原得到的特异结合部Fab’。作为这些场合的标记物的例子，有如下所述那样的酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶等)、化学物质、荧光物质和放射性同位素等。
在本发明中的检测·测定可以通过免疫染色、例如组织或细胞染色、免疫电子显微镜、免疫分析、例如竞争性免疫分析或非竞争性免疫分析进行，可以使用放射免疫测定法(RIA)、FIA、LIA、EIA、ELISA等，也可以进行或不进行B-F分离，进行其测定。优选RIA、EIA、FIA、LIA，以及夹心型分析。例如在夹心型分析中，以其中一方作为针对本发明的L型半乳凝素9多肽的抗体或针对L型半乳凝素9的相关肽片段的抗体，另一方为半乳凝素9的C末端侧残基的抗体，而且将一方进行可检测标记化(不言而喻，其它组合也可以，根据目的可以适当设计)。将可识别同样抗原的其它抗体固定于固相上。根据需要为了使检体和标记化抗体以及固相化抗体依次反应，进行温育处理，然后分离非结合抗体后，测定标记物。被测定的标记的量与抗原、即半乳凝素9多肽抗原的量成比例。在该分析中，按照不溶化抗体和标记化抗体的添加顺序，称为同时夹心型分析、正向(forward)夹心型分析或反向夹心型分析等。例如清洗、搅拌、振荡、过滤或抗原的预备提取等在特定的状况的基础下，于它们测定工序中适当采用。特定的试剂、缓冲液等浓度、温度或温育处理时间等其它测定条件可以根据检体中抗原的浓度、检体样品的性质等要素改变。同行人使用通常的实验法对于各个测定适当选择有效的最适条件进行测定。
已知有很多能够将抗原或抗体固相化的载体，在本发明中，可以从其中适当选择使用。作为载体，已知有各种在抗原抗体反应等中使用的载体，在本发明中，不用说，可以从这些众所周知的载体中选择使用。作为特别合适使用的载体，例如玻璃、例如氨基烷基硅玻璃等活化玻璃、多孔质玻璃、硅胶、二氧化硅氧化铝、氧化铝、磁化铁、磁化合金等无机材料、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙稀、聚偏氟乙烯、聚乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、聚丙烯酰胺、交联聚丙烯酰胺、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、聚缩水甘油基甲基丙烯酸酯、丙烯醛-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物等、交联白蛋白、胶原、明胶、葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、纤维素、微结晶纤维素、羧甲基纤维素、纤维素醋酸酯等天然或变性纤维素、交联葡聚糖、尼龙等聚酰胺、聚氨酯、聚环氧树脂等有机高分子物质、以及将它们乳化聚合得到的物质、硅橡胶等、细胞、红血球等，根据需要通过有机硅烷偶合剂等导入官能团后的物质。
另外，滤纸、珠、管、比色杯、试验容器的内壁、例如试管、滴定板、滴孔、微量板、玻璃室、合成树脂制室等由合成材料构成的室、玻璃棒、由合成材料构成的棒、末端变粗的或变细的棒、末端带有圆的突起或带有偏平突起的棒、成薄板状的棒等固体物质(物体)的表面等。
可以使抗体结合于那些载体，优选是可以使对在本发明中得到的抗原特异反应的抗半乳凝素9抗体(包括抗血清或纯化抗体)或抗半乳凝素9单克隆抗体结合。载体与参与这些抗原抗体反应的抗体之间的结合可以通过使用吸附等物理手法、或使用缩合剂等，或使用被活化的物质等化学方法、以及利用相互的化学结合反应的手法等进行。作为标记，如酶、酶底物、酶抑制剂、补充分子类、辅酶、酶前体、脱辅基酶、荧光物质、色素物质、化学发光化合物、发光物质、发色物质、磁物质、金属粒子、例如金胶体等、非金属粒子、例如硒胶体等、放射性物质等。作为酶，如脱氢酶、还原酶、氧化酶等氧化还原酶、例如催化氨基、羧基、甲基、酰基、磷酸基等转移的转移酶、例如水解酯键、糖苷键、醚键、肽键等的水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶等。酶也可以联合使用多个酶用于检测。例如，也可以利用酶的循环。作为代表性的放射性物质的标记用同位素，如[32P]、[125I]、[131I]、[3H]、[14C]、[35S]等。作为代表性酶标记，如西洋辣根过氧化物酶等过氧化物酶、大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶等半乳糖苷、马来酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶、牛小肠碱性磷酸酶、大肠杆菌碱性磷酸酶等碱性磷酸酶等。使用碱性磷酸酶时，通过使用4-甲基umbellipheryl磷酸盐等伞形酮衍生物、硝基苯磷酸酯等磷酸化苯酚衍生物、利用NADP的酶循环系、虫荧光素衍生物、二氧杂环丁烷(dioxetane)衍生物等底物，通过产生的荧光、发光等可以测定。也可以利用虫荧光素、虫荧光素酶系。使用过氧化氢酶时，由于与过氧化氢反应生成氧，所有该氧气可以通过电极等检测。作为电极可以是玻璃电极、使用难溶性盐膜的离子电极、液膜型电极、高分子膜电极等。
酶标记也可以置换为生物素标记和酶标记抗生物素蛋白(链抗生物素蛋白)。这样一来，可以使用生物素-抗生物素蛋白系，可以适当采用使用针对抗半乳凝素抗体的抗体等二次抗体等在该领域众所周知的灵敏度增强法。标记也可以使用多个不同种类的标记。此时，连续或非连续地、同时或分别地进行多个测定也成为可能。
在本发明中，在信号的形成中也可以利用4-羟基苯乙酸、邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、5-氨基水杨酸、3，3-二氨基联苯胺四氢氯化物(DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、对羟基苯乙胺、氨基苯二酰肼、光泽精荧光素及其衍生物、Pholad luciferin等和西洋辣根过氧化物酶等的过氧化物酶、lumigen PPD、4-甲基umbelliferyl磷酸盐、p-硝基苯酚-磷酸、苯酚-磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)、AMPAKTM(DAKO)、AmpliQTM(DAKO)、等和碱性磷酸酶、称为4-甲基umbelliferyl-β-D-半乳糖苷的umbelliferyl半乳糖苷、称为o-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷的硝苯半乳糖苷等和β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ABTS等和葡萄糖氧化酶等酶试剂的组合，也可以利用通过酶等的作用可以形成对氢醌、羟基苯醌、羟基蒽醌等醌化合物、硫辛酸、谷胱甘肽等巯基化合物、酚衍生物、二茂(络)铁衍生物等产物。
作为荧光物质和化学发光化合物，如异硫氰酸酯荧光素(FITC)、例如罗丹明B异硫氰酸酯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯同分异构体(TRITC)等罗丹明衍生物、7-氨基-4-香豆素-3-乙酸、丹黄酰氯、丹黄酰氟、荧光胺、藻胆色素蛋白质、吖啶鎓盐、荧光素、荧光素酶、aequorin等氨基苯二酰肼、咪唑、草酸酯、稀土类螯合化合物、香豆素衍生物等。为了检测包括发色、荧光等生成的信号等，虽然可以通过视觉，但也可以使用众所周知的仪器，例如荧光光度计、板读出仪等。另外为了检测放射性同位素(同位素)等发出的信号，可以使用众所周知的仪器，例如可以使用γ计数器、闪烁扫描计数器等。
为了进行标记，可以利用巯基和马来酰亚胺基的反应、吡啶二硫化物基团和巯基的反应、氨基和醛基的反应等进行，可以从众所周知的方法或该领域同行容易进行的方法、研究对这些方法进行修饰的方法中选择适用的。另外，可以使用在上述免疫原性复合物制作中可以使用的缩合剂、与载体的结合中可以使用的缩合剂等。作为缩合剂，例如甲醛、戊二醛、六亚甲基二异氰酸酯、六亚甲基二异硫氰酸酯、N，N’-聚亚甲基二碘乙酰胺、N，N’-亚甲基二马来酰亚胺、乙二醇二琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、双二氮联苯胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、N-硫代琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、N-硫代琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺4-(1-马来酰亚胺苯基)丁酯、N-(ε-马来酰亚胺己酰氧)琥珀酰亚胺(EMCS)、iminothiolane、S-乙酰巯基琥珀酸酐、甲基-3-(4′-二硫吡啶基)丙酸亚氨酸酯、甲基-4-巯基丁基亚氨酸酯、甲基-3-巯基丙酸亚氨酸酯、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰巯基乙酸酯等。
根据本发明的测定法，使用酶等标记的抗血清、纯化抗体或单克隆抗体等标记抗体试剂与载体结合的抗体依次与要测定的物质反应，也可以同时反应。加试剂的顺序因选择的载体类型不同而不同。使用被致敏的塑料等珠时，可以将标记的抗血清、纯化抗体或单克隆抗体等标记抗体试剂与含有要测定物质的检体样品一起最初加入到适当的试管中，然后通过加该被致敏的塑料等珠，进行测定。
在本发明的测定法中，可以使用免疫学测定法，此时作为固相载体，可以任意选择对抗体等吸附好的聚苯乙烯制、聚碳酸酯制、聚丙烯制或聚乙烯制的球、微滴板、棒、微粒子或试管等各种材料和形态使用。
在测定时，可以在最适pH、例如pH维持在约4～约9那样适当的缓冲液中进行。作为特别适合的缓冲剂，例如乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸缓冲剂、Tris缓冲剂、三乙醇胺缓冲剂、硼酸缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂、巴比妥缓冲剂等。缓冲剂可以以任何比例混合后使用。抗原抗体反应最好是在约0℃～约60℃之间的温度下进行。
虽然用酶等标记的抗血清、纯化抗体、或单克隆抗体等抗体试剂研究与载体结合的抗体试剂、以及要测定的物质的温育处理可以一直进行到平衡，但在抗原抗体反应的平衡达到之前稍早一点的时刻，对固相和液相进行分离，在有限定的温育处理之后可以停止反应，可以测定液相或固相中任一个中的酶等的标记的存在程度。测定操作可以使用自动化的测定仪器进行，使用发光检测器、光检测器等，检测底物经酶作用被变换生成的表示信号，也可以测定。在抗原抗体反应中，谋求可以使分别使用的试剂、要测定的物质、以及酶等的标记稳定化、使抗原抗体反应本身稳定那样的适当手段。另外，为了除去非特异性反应、将起抑制作用的影响减少，或使测定反应活化，也可以将蛋白质、稳定化剂、下面叙述的那样的表面活性剂、螯合剂等加到温育溶液中。作为螯合剂，更优选乙二胺四乙酸盐(EDTA)。也可以实施在该领域中普通采用的或同行都知道的防止非特异结合反应的封闭处理，例如可以用哺乳动物等的正常血清或血清蛋白质、白蛋白、血红蛋白、卵清清蛋白(OVA)、脱脂奶、乳发酵物质、胶原、明胶等进行处理。只要是防止非特异结合反应的目的，可以没有特别限定地使用那些方法。另外，在样品或固相等的清洗中，从上述缓冲液系或食盐液选择适当的液使用，可以向其中添加从Tween20(商品名)、Tween80(商品名)、NP-40(商品名)、Triton X100(商品名)、Briji(商品名)等非离子表面活性剂、CHAPS等两离子性表面活性剂以及阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂等选择出来的物质后使用。
作为用本发明的测定方法中被测定的样品，可以使用所有形态的溶液或胶体溶液、非流体样品等，优选使用来自生物体的样品，如胸腺、睾丸、肠、肾脏、脑、乳房组织、卵巢、子宫、前列腺、结肠和直肠、胃、肺、支气管、胰赃癌、肝脏等所有的脏器以及组织、以及这些脏器·组织的恶性肿瘤、白血病组织、血液、血清、血浆、关节液、脑脊髓液、胰液、胆汁液、唾液、羊水、尿、其它体液、细胞培养液、组织培养液、组织匀浆液、活检样品、组织、细胞等。
当将包括这些各个免疫学的测定法的各种分析·定量法运用于本发明的测定方法时，不需要特别的条件、操作等的设定。在各个方法中的通常条件、操作法中加上同行的通常技术的关照，可以构建本发明的该对象物质或具有与其实质上同等活性的物质的测定系。
作为半乳凝素9的测定系，例如对于组织可以有利利用免疫染色(METHODS，24，289-296(2001)；J Immunol Methods，47(2)，129-144(1981)；ibid.，150(1-2)，5-21，23-32 & 151-158(1992)；Cancer J；7(1)，24-31(2001)等)、免疫电子显微镜(MolBiotechnol，7(2)，145-151(1997)；J Electron Microsc Tech.，19(1)，57-63 & 64-79(1991)；ibid.，19(3)，305-315(1991)等蛋白质测定系，称为原位杂交的表达基因测定系，对于组织提取物可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、and Western blotting(J ElectronMicrosc(Tokyo)，45(2)，119-127(1996)；Methods BiochemAnal.，33，1-58(1988)；Methods Enzymol.，271，177-203(1996)；ibid.，305，333-345(2000)；J Immunol Methods，152(2)，227-236(1992)；ibid.，170(2)，177-184(1994)；ibid.，195(1-2)，149-152(1996)；口野嘉幸他编、“基因·蛋白质、实验操作封闭法”、株式会社软件科学公司、昭和62年10日发行等)的蛋白测定系、Northernblotting、dot bloting、RNase保护分析、RT-PCR(reversetranscription polymerase chain reaction)、Real-Time PCR(Clinical Chemistry，46：11，1738-1743(2000)的表达基因测定系、而对于血中、体液等，可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、and Westernblotting蛋白测定系。另外，作为抗半乳凝素9抗体的测定系，例如对于血中、体液等可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、Western blotting蛋白测定系。
在EIA的测定系中，例如在竞争法中使用抗半乳凝素9结合分子抗体作为固相化抗体使用，也可以使用标记抗原和非标记抗原(作为抗原如半乳凝素9或其结合分子和其片段肽等)，而在非竞争法中，例如在夹心法中，除了可以利用固相化抗半乳凝素9抗体或标记抗半乳凝素9抗体外，也可以利用对抗半乳凝素9抗体直接进行标记；也可以不固相化，对针对抗半乳凝素9抗体的抗体进行标记进行固相化后进行。作为灵敏度扩增法，例如在与非酶标记一次抗体的组合中，利用与高分子聚合物和酶和一次抗体的组合(应用Envision试剂的组合，Enhanced Polymer One-Step Staining(EPOS))，在与非酶标记二次抗体的组合中，例如PAP(peroxidase-antiperoxidase)法等的酶和抗酶抗体复合物的组合，SABC(avidin-biotinylated peroxidasecomplex)法等的生物素标记二次抗体与生物素标记酶-抗生物素蛋白复合物体的组合、ABC(streptavidin-biotin complex)法、LSAB(labeled streptavidin-biotin)法等的生物素标记二次抗体与生物素标记酶-链抗生物素蛋白复合物的组合、CSA(catalyzed signalamplification)法等的SABC与生物素标记tyramide和酶标记链抗生物素蛋白的组合、用高分子聚合物对二次抗体和酶进行标记等。
有关这些一般技术手段的详细记载可以参照综述、出版的书等[例如，入江宽编，“放射免疫分析”，讲谈社，昭和49年发行；入江宽编，“续放射免疫分析”，讲谈社，昭和54年发行；石川荣治等编，“酶免疫测定法”，医学书院，昭和53年发行；石川荣治等编，“酶免疫测定法”(第2版)，医学书院，昭和57年发行；石川荣治等编，“酶免疫测定法”(第3版)，医学书院，昭和62年发行；H.V.Vunakiset al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.70(ImmunochemicalTechniques，Part A)，Academic Press，New York(1980)；J.J.Langoneet al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.73(ImmunochemicalTechniques，Part B)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langoneet al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.74(ImmunochemicalTechniques，Part C)，Academic Press，New York(1981)；J.J.Langoneet al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.84(ImmunochemicalTechniques，Part D：Selected Immunoassays)，Academic Press，NewYork(1982)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.92(Immunochemical Techniques，Part E：Monoclonal Antibodiesand General Immunoassay Methods)，Academic Press，New York(1983)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.121(Immunochemical Techniques，Part I：Hybridoma Technology andMonoclonal Antibodies)，Academic Press，New York(1986)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods in Enzymology”，Vol.178(Antibodies，Antigens，and Molecular Mimicry)，AcademicPress，New York(1989)；M.Wilchek et al.(ed.)，“Methods inEnzymology”，Vol.184(Avidin-Biotin Technology)，AcademicPress，New York(1990)；J.J.Langone et al.(ed.)，“Methods inEnzymology”，Vol.203(Molecular Design and Modeling：Conceptsand Applications，Part B：Antibodies and Antigens，NucleicAcids，Polysaccharides，and Drugs)，Academic Press，NewYork(1991)等所述的方法或其中引用的文献(其中的某些记载由于参照它们也包括在本说明书的内容中)。
当将本发明的活性成分[例如(a)该半乳凝素9多肽、其一部分肽或它们的盐、与其相关的肽等、(b)编码该半乳凝素9或相关多肽的DNA等核酸等、(c)本发明的所定抗体、其一部分片段(包括单克隆抗体)或其衍生物、(d)控制该半乳凝素9蛋白质的问题活性的化合物(该半乳凝素9蛋白质的毒害细胞活性、凋亡诱导活性、对正常细胞没有坏的影响，促进或抑制·阻碍起着所定功效的活性等的现象、或促进或抑制·阻碍组织或蛋白质的变质·过剩生产或分解现象这些生物学活性的化合物)或其盐、(e)使用本发明发现的活性物质等]作为医药使用时，通常可以单独或与药理上容许的各种制剂辅助剂混合后，作为医药组合物或医药制备物等给予。优选是以适合经口给药、局部给药、或非经口给药等使用的制剂制备物的形态给药，根据目的也可以通过任一种给药方式(也包括吸入法、或直肠给药)给药。
另外，本发明的活性成分也可以配合各种医药、例如抗肿瘤剂(抗癌剂)、肿瘤转移抑制剂、血栓形成抑制剂、关节破坏治疗剂、镇痛剂、消炎剂和/或免疫抑制剂使用，这些制剂只要是具有有利的作用可以无限制地使用，例如可以从该领域中已知的制剂中选择。
而作为非经口给药方式，可以包括局部、经皮、静脉内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内给药，也可以直接向患部给药，对于某些场合也适合。优选的是向包括人在内的哺乳动物经口、或非经口(例如，细胞内、组织内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髓腔内、点滴法、注肠、经直肠、点耳、点眼或点鼻、齿、向皮肤或粘膜涂布等)给药。作为具体的制剂制备物的形态，如溶液制剂、分散制剂、半固形制剂、粉粒体制剂、成型制剂、浸出制剂等，例如片剂、包被片剂、实施了糖衣的制剂、丸剂、口含片、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、埋入剂、粉末剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、注射剂、液剂、酏剂、乳剂、灌注剂、糖浆、水剂、乳剂、悬浊剂、擦剂、洗剂、气雾剂、喷雾剂、吸入剂、喷雾剂、软膏制剂、硬膏制剂、贴附剂、糊剂(paste)、糊剂(cata plasm)、膏剂、油剂、坐剂(例如直肠坐剂)、酊剂、皮肤用水剂、点眼剂、点鼻剂、点耳剂、涂布剂、输液剂、用于注射用液剂等的粉末剂、冷冻干燥制剂、凝胶制备品等。
医药用的组合物可以根据通常的方法进行制剂化。例如，根据适当的需要，可以单独或组合使用生理学上认可的载体、作为医药容许的载体、佐剂、赋形剂、辅形剂、稀释剂、香味剂、香料、甜味剂、膨化剂(expander)、防腐剂、稳定剂、结合剂、pH调节剂、缓冲剂、表面活性剂、基剂、溶剂、填充剂、增量剂、溶解辅助剂、可溶化剂、等渗剂、乳化剂、悬浊化剂、分散剂、增粘剂、凝胶化剂、硬化剂、吸收剂、粘接剂、弹性剂、增塑剂、崩解剂、喷射剂、保存剂、抗氧化剂、遮光剂、保湿剂、缓和剂、防止带电剂、无痛化剂等，通过将它们一起与本发明的蛋白质等混合，可以制造成一般认可的制剂实施中要求的单位用量形态。
作为非经口使用的制剂，活性成分与水或其它的药学上容许的介质的无菌溶液、或悬浊液剂等、例如注射剂等。一般来说，水、盐水、葡萄糖水溶液、其它相关的糖的溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等乙二醇类可作为优选的注射剂用的液体载体。制备注射剂时，使用蒸馏水、林格液、生理盐水那样的载体、适当的分散剂或湿化剂和悬浊化液等，用该领域已知的方法制备成对于像溶液、悬浊液、乳剂可以注射的形式。
作为注射用的水性液，如包括生理盐水、葡萄糖或其它的辅助药(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)等渗液等，也可以与药理上容许的适当溶解辅助剂、例如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(例如，聚山梨酯80TM，HCO-50等)等并用。作为油性液，如芝麻油、大豆油等，也可以与作为溶解辅助剂，如苯甲酸苄酯、苄醇等并用。也可以与缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液等)或用于浸透压调节的试剂、无痛化剂(例如，氯苄烷铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如，苄醇、酚等)、抗坏血酸等抗氧化剂、吸收促进剂等配合。制备的注射液通常被填充到适当的安瓿瓶中。
对于非经口给药，可以加或不加表面活性剂以及其它药学上容许的助剂，水、乙醇或油那样的制备成无菌的药学上容许的液体中的溶液或悬浊液形式的制剂。作为制剂中使用的油性载体或溶剂，如天然的、合成的或半合成的单、或双、或三甘油酯类、天然的、合成的或半合成的油脂类或脂肪酸类，例如，花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如，该注射剂可以通常制备成含有0.1～10重量％程度的本发明化合物。
作为适用于局部、例如口腔或直肠使用的制剂，例如洗口剂、磨齿剂、口腔喷雾剂、吸入剂、软膏剂、牙科填充剂、牙科包被剂、牙科膏剂、坐剂等。作为洗口剂、其它牙科用剂，可以使用药理上容许的载体，通过惯用的方法制备。作为口腔喷雾剂、吸入剂，使本发明化合物本身或与药理上容许的非活性载体一起溶解于气溶胶或喷雾器用的溶液，或做成吸入用微粉末给予牙齿等。软膏剂，可以添加通常使用的基剂、例如软膏基剂(白色凡士林、石蜡、橄榄油、聚乙二醇400、聚乙二醇软膏等)等，通过惯用的方法制备。
向牙、皮肤局部涂布用的药品可以在适当灭菌的水或非水赋形剂的溶液或悬浊液中配制。作为添加剂，如亚硫酸氢钠或乙二胺四乙酸二钠那样的缓冲剂；含有醋酸或硝酸苯汞、氯苄烷铵或双氯苯双胍己烷那样的灭菌和抗真菌剂的防腐剂和羟丙甲纤维素那样的增粘剂。
坐剂使用在该领域中众所周知的载体、优选是非刺激性的适当的辅形剂、例如聚乙二醇类、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等的，优选是在常温下虽然是固体，但在肠道的温度下以液体，在直肠内融解释放药物的载体等，通过惯用的方法制备，通常可以制备成含有0.1～95重量％程度的本发明化合物。通过使用的赋形剂和浓度不同的药品可以悬浮于或溶解于赋形剂中。象局部麻醉剂、防腐剂以及缓冲剂那样的辅助药可以溶解于赋形剂中。
适于作为经口使用的制剂，如片剂、丸剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、口含片(troche)那样的固形组合物，或液剂、糖浆、悬浊剂那样的液状组合物等。进行制剂制备时，使用在该领域中已知的制剂辅助剂等。片剂和丸剂也可以包肠衣后制造。调剂单位形态为胶囊时，可以在上述类型的材料中再含有油脂那样的液状载体。
另外，活性成分为蛋白质或多肽时，由于聚乙二醇(PEG)在哺乳动物中毒性极低，所有与它结合特别有用。而与PEG结合，有时可以有效地减少异种性化合物的免疫原性以及抗原性。该化合物也可以加入到微胶囊装置中给予。象PEG那样的聚合物可以简单地附着于在氨基末端的氨基酸的α-氨基、赖氨酸侧链的ε-氨基、天冬氨酸或谷氨酸的侧链的羧基、羧基末端的氨基酸的α-羧基、或某种天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基的糖基链被活化的衍生物。
已知有很多适于与蛋白质直接反应的被活化形式的PEG。作为对于与蛋白质的氨基反应有用的PEG试剂，羧酸、碳酸衍生物的活性酯、特别是解离基为N-羟基琥珀酰亚胺、p-硝基苯酚、咪唑、或1-羟基-2-硝基苯-4-磺酸酯的PEG。同样，含有氨基肼或酰肼基的PEG在通过蛋白质中的过碘化酸氧化生成的醛反应中有用。
另外，本发明的DNA等核酸作为象上述那样的治疗或预防剂使用时，该核酸可以单独使用，或用于与象上述那样的基因重组技术中使用的适当载体、例如来自逆病毒的载体等来自病毒的载体等结合等。本发明的DNA等核酸可以通过通常的已知的方法给予，直接，或为了促进向细胞内的摄取，与适当的辅助剂或生理上容许的载体等一起被制剂化后，象上述那样可以做成医药组合物或医药制备物等给予。另外，也可以适用作为基因治疗已知的方法。
本发明的活性成分可以在很宽的范围选择其给予量后给予，其给予量以及给予的次数等根据处置患者性别、年龄、体重、一般健康状态、膳食、给予时间、给予方法、排泄速度、药物的组合、患者当时进行治疗的病状的程度，考虑这些因素以及其它要因后决定。
当制造医药品时，其添加剂等或制备方法等可以参考例如日本药局方解说书编辑委员会编、第十四改正日本药局方解说书、平成13年6月27日发行、株式会社广川书店；一番ケ濑尚他编医药品的开发12卷(制剂材料[I])、平成2年10月15日发行、株式会社广川书店；同、医药品的开发12卷(制剂材料[II])、平成2年10月28日发行、株式会社广川书店等记载之后从其中根据需要适当选择运用。
本发明的活性成分如在本说明书中说明的(a)半乳凝素9及其类似物、(b)半乳凝素9以及编码实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子、(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体等，它们在利用半乳凝素9对正常细胞没有毒害作用，而对肿瘤细胞表现出毒害细胞活性的性状、对肿瘤细胞诱导凋亡，而对正常细胞不诱导凋亡的性状、抑制恶性细胞的转移性的性状、活化的免疫细胞、特别是诱导活化的CD4阳性T细胞的凋亡的活性(与此相反，不诱导静止T细胞、特别是CD4阳性T细胞(协助者T细胞)的凋亡的性状)等上是有用的，有望作为抗肿瘤剂、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及利用与肾上腺皮质类固醇激素同样的活性的药剂。
[半乳凝素9结合蛋白质的探索]
可以对与半乳凝素9发挥上述本说明书中公布的新的功能有关的半乳凝素9结合分子、特别是与凋亡有关的半乳凝素9结合蛋白质进行探索·鉴定。作为探索对象没有特别限定，可以使用来自各种生物的材料，代表性的可以将来自人T细胞株MOLT-4那样的由于半乳凝素9添加诱导细胞死亡的细胞株选定为起始材料进行探索·鉴定，有时很理想。作为相互作用分子探索法，可以将该领域中已知的各种各样方法单独或组合后进行。例如，对于从候补蛋白质鉴定与半乳凝素9进行相互作用的蛋白质，例如，可以选择以下方法运用。从已知进行相互作用的蛋白质可以了解靶蛋白的新的功能以及调节机制、例如借助于半乳凝素9的功能与机制。
作为可利用的方法，如①免疫沉降法，②West Western法(包括West Western法，或far Western法、配体印迹法)，③分子间交联法，④表达克隆法，⑤双杂合(体)系统(two-hybrid system)，⑥噬菌体呈现法，⑦表面胞质团共振法，⑧荧光偏光法等，并不限定于这些方法，可以运用在该领域中已知的方法以及其改变法。
所谓免疫沉降法，向作为样品的各种各样的蛋白质溶液加对目的蛋白质特异的抗体，对与目的蛋白质相互作用的蛋白质以免疫复合物的免疫沉降物分离，通过用SDS-PAGE或再通过Western blotting等进行鉴定的手法，研究可能与目的蛋白质相互作用的蛋白质的存在是有效的。在此，除了可以使用捕获目的蛋白质特异的抗体或对已知蛋白质特异的抗体、蛋白A或蛋白G琼脂糖等抗体的树脂等外，最好准备用RI等标记的蛋白质溶液。也可以利用市售的试剂盒，例如，Affi-Prep 10，Affi-Gel Hz(BIO-RAD公司)，NHS Sepharose HP(Pharmacia公司)等。
作为测定对象蛋白质，可以利用作为融合蛋白质制作·纯化的蛋白质，此时，有效利用针对Tag的抗体很便利，作为重组蛋白质，除了可以利用大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等宿主表达系之外，也可以利用网状红细胞的无细胞翻译系。另外，向蛋白质溶液加过量的目的融合蛋白等，对融合蛋白进行简便纯化时也可以利用co-purification。这些方法可以参照例如Rudner，D.Z.etal.，Mol.Cell Biol.，116，1765-1773，1998(利用His-tag)，Cleveland，D.W.et al.，J.Mol.Biol.，116，207-225，1977(利用tau(microtubule-associated protein))等。
所谓West-Western法或far Western法是Western法的变法，是用标记的目的蛋白质等或已知的蛋白质等的探针·蛋白质代替抗体，通过尝试与转移到膜上的蛋白质的结合，进行检测·测定的方法。是以目的蛋白质作为探针，可以了解结合的蛋白质的分布、区域、分子量等的手法。该方法在表达文库的筛选应用后，可以在cDNA克隆中利用(野村照明、他、“免疫’92”(利用蛋白质探针的cDNA克隆)、中山书店、pp169-175(1992))。作为探针的蛋白质是可以被蛋白激酶磷酸化标记的蛋白质，可以有效利用。所谓配体·印迹法是与配体结合的蛋白质的解析手法，指Far Western法中的一种方法，是使用用RI标记的配体，通过该RI进行检测、使用生物素-配体，用链抗生物素蛋白再进行检测，使用未标记配体，使用特异抗体和标记二次抗体进行检测等手法。作为标记，也可以利用非RI标记。本法可以参照例如Soutar，A.K. & Wade，D.P.，Protein function：a practicalapproach(Creighton，T.E.eds.)，IRL press，pp55-76，1989等。
分子间交联法是使用化学交联剂，使蛋白质-蛋白质之间交联，用SDS-PAGE分离，并用Western blotting法或免疫沉降法，进行检测的方法，是在目的蛋白质的寡聚物结构的解析或进行相互作用的蛋白质或存在邻近的蛋白质(或结构域)的解析以及受体等亚基结构的解析中有效的手法。化学交联剂等信息可以参照PIERCB公司的网址(http：//www.piercenet.com/)。本法可以参照例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996等。
表达克隆法是使cDNA库中的任意cDNA在细胞中表达，使用目的蛋白质或带有Tag的蛋白质作为探针，从与相互作用被确认的细胞有关连的使用的cDNA组克隆特定的cDNA的方法，是借助于受体、配体等的克隆进行解析的方法。对于表达克隆，可以利用利用大肠杆菌等的原核细胞的表达系、哺乳动物细胞等的培养细胞的表达系、非洲爪蟾卵细胞的表达系等、在该领域中已知的表达系。本法可以参照例如佐佐木博己编、“无敌的生物技术系列特别编·生物实验进展”、第6章、羊土社、1997等。在用大肠杆菌的表达克隆中，可以用λgtl1，λZAPII等的cDNA文库转化大肠杆菌等，进行筛选，基本上使用Farwestern法进行克隆。另外在培养细胞中的表达克隆，使具有特定的cDNA的表达载体转化培养细胞，从确认表达的细胞中挑选与目的蛋白质结合的蛋白质，通过克隆进行筛选。挑选虽然没有特别限定，但适合使用ELISA法或FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)法等。另外，也可以由特定的cDNA在体外合成mRNA，向非洲爪蟾卵微注射，利用表达的蛋白质与目的蛋白质相互作用或其结果引起的细胞的反应，进行挑选、克隆。
双杂合(体)系统是当目的蛋白质或其蛋白质的结构域部分与独立的蛋白质结构域相互作用，利用为了使报告基因表达而构建的转录活性因子的功能恢复的现象，对相互作用的蛋白质进行探索的手法的克隆系统。在本方法中，也可以利用市售的预制(premade)文库，但并不限定于此，例如MATCHMAKER GAL4 cDNA LIBRARY，MATCHMAKER LexAcDNA LIBRARY(Clontech公司)等。另外作为自作的制作文库用，并不限定于此，例如HybriZAP Two-hybrid vector system(Stratagene公司)等。本法可以参照例如山本雅编、生物手册系列1，基因工程的基础技术、羊土社、1993，Downward，J.，FEBLLett.，338，113-117，1994等。
所谓噬菌体呈现法是通过使用在噬菌体表面带有5～7个残基的随机的氨基酸序列的文库，反复进行收集与目的蛋白质结合单独噬菌体，使噬菌体增殖的操作，醋酸特异性高的氨基酸序列的手法。另外，由得到的结果检索蛋白质数据库，也可以从已知的蛋白质中选择对应的蛋白质。本法可以参照Smith，G.P. & Scott，J.K.，Methods inEnzymology，Vol，217，pp228-257，1993等。
所谓表面胞质团共振法典型的是利用BIACORETM系统，以实时对在传感器芯片上的生物体分子间的相互作用进行监测的目的开发的手法。在该BIACORETM中，将光按照全反射那样照着没有固定生物体分子一侧的传感器芯片(金属膜)，在发射光的一部分可观察到发射光低下单独部分(SPR信号发生)。利用该光表现暗的部分的角度(＝折射率的变化)依赖于传感器芯片上的质量的现象。作为该传感器芯片，如传感器芯片CM5：带有羧甲基葡聚糖表面，传感器芯片SA：是预先固定了链抗生物素蛋白的芯片，传感器芯片NTA：是固定了NTA的芯片，用镍进行螯合，对poly-His融合蛋白进行固定的芯片等。本法如桥本せつ子、分析5、利用表面胞质团共振现象的生物体分子相互作用的解析、pp362-368，1997、夏目徹、生物手册UP系列、蛋白质的分子间相互作用实验法、pp211-230，羊土社、1996等。
荧光偏光法是利用具有在平面偏光激发的荧光水平的分子在激发状态中进行旋转等运转时放射的荧光变成与激发光不同的平面的现象，由于分子的纯度宇受到很大影响，通过形成复合物等变成高分子，保持偏光、在以低分子运动性高时，偏光被解除。因此，测定该偏光度，可以连接其相互作用。至于荧光标记可以利用各种各样的标记，例如可以使用FS、FITC、and FXS等。测定可以使用例如FBEACONTM等进行。
另外，适合利用亲和层析柱对与凋亡有关的半乳凝素9结合蛋白质进行探索·鉴定。作为亲和层析柱的配体，可以使用合成肽、融合蛋白、抗体等。作为代表性的分离例子，就以MOLT-4的细胞破碎液作为起始原料的半乳凝素9结合蛋白质的获得进行说明，将MOLT-4的细胞破碎液通过半乳凝素9CT(C末端区域)柱，回收半乳凝素9结合分子。然后将来自回收的细胞的蛋白质加到凝胶上进行电泳，根据分子量进行分离，对分离得到的凝胶片进行蛋白质内部的氨基酸序列解析，可以鉴定半乳凝素9结合蛋白质。候补半乳凝素9结合蛋白质通过对来自上述候补蛋白质的与半乳凝素9进行相互作用的蛋白质进行鉴定的手法可以确定。
因此，作为半乳凝素9结合蛋白质，是来自人的蛋白质，如以下所示蛋白质：4F2重链抗原(177216)；ATPase，Na+/K+转运，α1多肽(21361181)；钠依赖中性氨基酸转运体类型2截短的异构体(15004317)；基质细胞衍生因子受体1异构体a(9257240)；基质细胞衍生因子受体1异构体b；热休克90kDa蛋白1，β(20149594)；热休克90kDa蛋白1，α；热休克70kDa蛋白5(葡萄糖调节蛋白，78kDa)(16507237)，热休克70kDa蛋白8异构体2(24234686)；热休克70kDa蛋白9B前体(24234688)；脂肪酸辅酶A连接酶，长链3(27469830)；NADH脱氢酶(泛醌)Fe-S蛋白质1，75kDa(NADH-辅酶Q还原酶)(4826856)；S-腺苷高半胱氨酸水解酶类1(21361647)；程序性细胞死亡8异构体1(4757732)；60kDa热休克蛋白，线粒体前体(129379)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基，异构体1，心肌(4757810)；[内质网]核酮糖结合糖蛋白II前体(88567)；法尼基-二磷酸法尼基转移酶1(4758350)；泛醇-细胞色素C还原酶复合物核心蛋白2，线粒体前体(21903482)；长醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基转移酶(21104416)；钙结合转运蛋白(6841066)；NADH脱氢酶-泛醌Fe-S蛋白2前体(3540239)；肌动蛋白，β(14250401)；翻译延伸因子EF-Tu-类蛋白P43前体，线粒体(7443384)；metaxin 1(4505281)；sideroflexin 1(23618867)；TCRβ链(2982508)；Hnrnp A1(2194069)；磷酸酯载体前体异构体1b(4505775)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，γ多肽1(4885079)；电压依赖性阴离子通道1(4507879)；透明质酸结合蛋白前体(8699626)；雄激素调节的短链脱氢酶/还原酶1(20070798)；溶质载体家族25(线粒体载体，酮戊二酸载体)，member 11(21361114)；3-羟基丁酸脱氢酶前体(17738292)；B-细胞受体相关蛋白(1673514)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，O亚基(4502303)；ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合物，亚基d(5453559)；ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合物，亚基b，异构体1(21361565)；小的GTP结合蛋白(13569962)；NADH脱氢酶(泛醌)Fe-S蛋白8，23kDa(NADH-辅酶Q还原酶)(4505371)；小泡运输蛋白sec22b(4759086)；线粒体输入受体Tom22(9910382)；信号肽受体，δ(5454090)；ATP合酶，αchain(114517或P25705)；ATP合酶，β链(114549或P06576)；钠/钾-转运ATPaseβ-3链(1703470或P54709)；ADP，ATP载体蛋白(113463，P12236，113459，P05141，113455，或P12235)；泛醇-细胞色素C还原酶复合物核心蛋白1(731047或P31930)以及细胞色素c氧化酶多肽II(117020或P00403)。作为半乳凝素9结合蛋白质，特别是作为来自人的蛋白质，即关于以下的蛋白质：4F2重链抗原(177216)；ATPase，Na+/K+转运，α1多肽(21361181)；钠依赖中性氨基酸转运体类型2截短的异构体(15004317)；基质细胞衍生因子受体1异构体a(9257240)；基质细胞衍生因子受体1异构体b；热休克90kDa蛋白1，β(20149594)；热休克90kDa蛋白1，α；热休克70kDa蛋白5(葡萄糖调节蛋白，78kDa)(16507237)；热休克70kDa蛋白8异构体2(24234686)；热休克70kDa蛋白9B前体(24234688)；S-腺苷高半胱氨酸水解酶类1(21361647)；程序性细胞死亡8异构体1(4757732)；60kDa热休克蛋白，线粒体前体(129379)；[内质网]核酮糖结合糖蛋白II前体(88567)；法尼基-二磷酸法尼基转移酶1(4758350)；长醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基转移酶(21104416)；钙结合转运蛋白(6841066)；TCRβ链(2982508)；透明质酸结合蛋白前体(8699626)；雄激素调节的短链脱氢酶/还原酶1(20070798)；B-细胞受体相关蛋白(1673514)以及钠/钾转运ATPaseβ-3链(1703470或P54709)，运用上述①免疫沉降法，②West-Western法(包括West-Western法，或Far-Western法、配体印迹法)，③分子间交联法，④表达克隆法，⑤双杂合(体)系统(Two-Hybrid System)，⑥噬菌体呈现法，⑦表面胞质团共振法(SPR)，⑧荧光偏光法等，可以对作为与半乳凝素9进行相互作用的蛋白质的性状进行详细研究。
而上述括弧()内的数字通过在NCBI的主页(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)输入该数字，就可以获得蛋白质信息以及编码该蛋白的DNA等的核酸序列的信息。因此，可以利用该氨基酸序列信息和DNA等核酸序列信息，即以本说明书中半乳凝素9为例说明的技术·手法同样也适用于该蛋白质和编码基因序列。在这样的可适用的技术·手法中，当然包括包含单克隆抗体的制作以及利用在内的抗体制作和利用技术。因此，在本说明书中，取代半乳凝素9置换为半乳凝素9结合分子后，应当可读懂该记载，这样的另一种读法得到的内容也都包括在本说明书中。
例如，可以提供以对被验者的生体样品中的半乳凝素9结合分子的多核苷酸的存在量进行试验，将多核苷酸的存在量比健康人的量多的被验者判定半乳凝素9易感性和可期待的由半乳凝素9诱起的生理活性的人为特征的诊断方法。同样，可以提供以对被验者的生体样品中的半乳凝素9结合分子蛋白质的存在量进行试验，将半乳凝素9结合分子蛋白质存在量比健康人的量多的被验者判定半乳凝素9易感性或可期待的由半乳凝素9诱起的生理活性的人为特征的诊断方法。另外，也提供与半乳凝素9结合分子多核苷酸在严格条件下进行杂交的寡核苷酸和多核苷酸，以及备有与该半乳凝素9结合分子多核苷酸在严格条件下进行杂交的寡核苷酸或半乳凝素9结合分子多核苷酸的DNA微阵列、用于对半乳凝素9结合分子多核苷酸进行PCR扩增的引物组、识别半乳凝素9结合分子的抗体、与该抗体不同的表位结合的抗体等。另外，还提供至少包含以下要素：(a)识别半乳凝素9结合分子的抗体；以及(b)与上述(a)抗体不同的表位结合的抗体，而且以由标记化抗体构成作为特征的半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的检测方法，以及检测试剂盒；至少包括以下要素：(a)固定了识别半乳凝素9结合分子的板或膜；以及(b)与上述(a)抗体不同的表位结合的抗体，而且由标记化抗体构成作为特征的半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的测定或检测方法或测定或检测试剂盒；至少包括以下工序：(a)将被验者的生体样品与固定有上述抗体的载体接触的工序；(b)对与该生体样品接触的固相载体进行洗涤的工序；(c)将与该生体样品接触的固相载体与标记化的上述抗体接触的工序；(d)对固相化标记或游离的标记进行测定的工序；(e)将工序(d)中测定的标记量作为半乳凝素9结合分子量的指标，与对照生体样品的结果进行比较的工序；以及(f)将与对照生体比较后显著高的半乳凝素9结合分子蛋白质存在量作为表示半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的程度的指标使用的工序为特征的测定上述记载的半乳凝素9相关生理反应的程度的方法，至少包含以下工序：(a)由被验者的生体样品制备RNA的工序；(b)对工序(a)制备的RNA进行电泳分离的工序；(c)将工序(b)分离的RNA和半乳凝素9结合分子多核苷酸在严格条件下与标记核苷酸探针进行杂交的工序；(d)将工序(c)进行杂交的标记量作为半乳凝素9结合分子多核苷酸表达量的指标，与对照生体样品的结果进行比较的工序；以及(e)将与对照生体样品比较后显著高的半乳凝素9结合分子多核苷酸表达量作为表示半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的程度的指标使用的工序为特征的测定上述记载的半乳凝素9相关生理反应的程度的方法，至少包含以下工序：(a)由被验者的生体样品制备RNA的工序；(b)以工序(a)制备的RNA为模板，使用dT引物制备第1链cDNA的工序；(c)以工序(b)制备的cDNA为模板，使用用于对半乳凝素9结合分子多核苷酸进行PCR扩增的引物组进行PCR扩增的工序；(d)对工序(c)中得到的PCR产物进行电泳分离的工序；(e)将工序(d)中分离的PCR产物和半乳凝素9结合分子多核苷酸在严格条件下与标记核苷酸探针进行杂交的工序；(f)将在工序(e)中进行杂交的标记量作为半乳凝素9结合分子多核苷酸表达量的指标，与对照生体样品的结果进行比较的工序；以及(g)将与正常的生体样品比较后显著高的半乳凝素9结合分子多核苷酸表达量作为表示半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的程度的指标使用的工序为特征的测定上述记载的半乳凝素9相关生理反应的程度的方法，至少包含以下工序：(a)将被验者的生体样品进行组织固定化处理的工序；(b)以工序(a)制备的组织固定化标本作为切片的工序；(c)切片化的组织进行利用识别半乳凝素9结合分子的抗体的免疫组织染色的工序；(d)将被验者的生体样品中的免疫组织染色的程度与对照样品的染色程度进行比较的工序；以及(e)将与对照样品比较后显著高的半乳凝素9结合分子蛋白质存在量作为表示半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的程度的指标使用的工序为特征的测定上述记载的半乳凝素9相关生理反应的程度的方法，以包含从以下工序：(a)对被验者的生体样品使用用于对半乳凝素9结合分子多核苷酸进行PCR扩增的引物组进行PCR扩增的工序；(b)对从被验者的生体样品分离的核酸级分使用上述DNA微阵列进行分析的工序；(c)将从被验者的生体样品分离的核酸级分与和半乳凝素9结合分子多核苷酸在严格条件下进行杂交的寡核苷酸或多核苷酸进行杂交的工序中选择出来的至少一个工序、而且包括对被验者的生体样品中的半乳凝素9结合分子多核苷酸的存在量进行试验，多核苷酸的存在量与健康人的量进行比较为特征的测定上述记载的半乳凝素9相关生理反应的程度的方法，以定量地测定半乳凝素9结合分子蛋白质存在量或半乳凝素9结合分子多核苷酸表达量为特征的上述任一个所述的测定上述记载的半乳凝素9相关生理反应的程度的方法，以上述任一个所述的测定半乳凝素9相关生理反应的程度的方法中使用的含有上述任一个所述的抗体为特征的试剂，以使用识别半乳凝素9结合分子的抗体，对检体样品中的半乳凝素9结合分子蛋白质的量或半乳凝素9结合分子多核苷酸表达量进行测定为特征的对半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的程度或半乳凝素9相关生理反应的程度进行测定或诊断的方法，也提供含有识别半乳凝素9结合分子的抗体，对检体样品中的半乳凝素9结合分子蛋白质的量或半乳凝素9结合分子多核苷酸表达量进行测定，对半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的程度或半乳凝素9相关生理反应的程度进行测定或诊断的试剂。作为诊断、测定等中的具体的判定基准，被验者的多核苷酸的存在量例如与对照的进行比较，为10％以上、优选30％以上、更优选70％以上、更优选100％以上的场合。
作为微阵列的制作方法，已知有在固相载体表面直接合成寡核苷酸的方法(on-chip法)，将预先制备的寡核苷酸或多核苷酸固定于固相载体表面的方法。在本发明中使用的微阵列可以用任一个方法制作。作为on-chip法，可以通过将光照有选择地除去保护基的使用以及在半导体制造中利用的光刻(蚀)技术和固相合成技术组合，在微少的阵列的所定区域进行有选择合成的方法(掩蔽技术：例如，Fodor，S.P.A.：Science 251，767，1991)等进行。另外，在将预先制备的寡核苷酸或多核苷酸固定于固相载体表面时，合成导入官能团的寡核苷酸或多核苷酸，将寡核苷酸或多核苷酸点着在进行了表面处理的固相载体表面，使其共价结合(例如，Lamture，J.B.et al.：Nucl.AcidsRes.22，2121-2125，1994；Guo，Z.et a1.Nucl.Acids Res.22，5456-5465，1994)。
寡核苷酸或多核苷酸一般是借助于隔片或交联分子与进行表面处理的固相载体共价结合。已知有使聚丙烯酰胺凝胶的微小片定向对准排列于玻璃表面，使合成寡核苷酸共价结合于小片上的方法(Yershov，G.et al.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4913，1996)。另外，已知有在硅微阵列上制作微小电极阵列，在电极上设置含有链抗生物素蛋白的琼脂糖的浸透层，作为反应部位，通过使该部位带正电荷，固定生物素化的寡核苷酸，通过控制部位的带电荷，可以高速进行严密的杂交的方法(Sosnowski，R.G.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，1119-1123，1997)。
当使用这样的微阵列进行诊断或测定时，利用将从被验者的细胞分离的mRNA作为模板，合成cDNA、进行PCR扩增。此时，整合标记dNTP，作为标记cDNA。使该标记cDNA与微阵列接触，对与微阵列的捕捉探针(寡核苷酸或多核苷酸)杂交的cDNA进行检测。杂交可以通过分注到96孔或384孔塑料板，将标记cDNA点着在微阵列上实施。点着的量可以为1～100nl程度。杂交优选是在室温～70℃温度范围，实施6～20小时。杂交结束后，使用表面活性剂和缓冲液的混合溶液进行清洗，除去未反应的标记cDNA。作为表面活性剂，优选使用十二烷基硫酸钠(SDS)。作为缓冲液可以使用柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris缓冲液、Good′s缓冲液等，优选使用柠檬酸缓冲液。
半乳凝素9结合分子多肽的测定使用引物组，也可以测定该多核苷酸(具体来说是mRNA)的表达量。在该手法中，适合使用RT-PCR法。另外也优选使用竞争PCR法进行定量测定。该引物组可以根据众所周知的碱基序列进行设计、经合成·纯化各个工序制备。同样竞争用引物也可以以半乳凝素9结合分子基因的碱基序列为基础设计、合成。另外，作为引物设计的注意点如下所述。考虑使引物的大小(碱基数)满足与模板DNA之间的特异的退火，可以为15-40碱基、希望为15-30碱基。但是，在进行LA(long accurate)PCR时，至少要30碱基才有效果。在避免由有意义链(5’末端侧)和反意义链(3’末端侧)构成的1组和1对(2条)引物相互不能退火那样的两引物间的互补序列的同时，为了防止引物内的发卡结构的形成，也要避免自身互补序列。另外，为了确保与模板DNA的稳定结合，要使GC含量为约50％、引物内GC丰度或AT丰度平均。退火温度由于与Tm(meltingtemperature)值有关，所有为了获得特异性高的PCR产物，选定Tm值在55-65℃相互近似的引物。另外，还需要注意PCR中引物使用的最终浓度要调整到约0.1～约1μM等。另外，可以使用引物设计用的市售的软件、例如OliogoTM[National Bioscienoe Inc.(美国)生产]、GENETYX[软件开发(株)(日本)生产]等。
对于半乳凝素9结合分子表达基因(包括cDNA等DNA和mRNA等的RNA)根据上述“基因重组技术”使用在该领域中用于检测测定特定基因的表达的已知手法，例如原位杂交、Northern blotting、dotblotting、RNase保护分析、RT-PCR、Real-Time PCR(Journal ofMolecular Endocrinology，25，169-193(2000)以及其中引用的文献)、DNA阵列解析法(Mark Shena编，“Microarray BiochipTechnology”，Eaton Publishing(2000年3月)等进行检测·测定，可以检测与本说明书公布的半乳凝素9相关的生理现象以及半乳凝素9结合分子表现出的生物活性相关的现象等。利用这样技术的半乳凝素9结合分子表达基因测定系、凋亡检测系、抗肿瘤检测系、这些系统中利用的试剂、方法、工序、解析程序等都包括在本发明的技术以及技术中利用的系统。对于该原位杂交，可以包括例如非RI原位杂交，其中也可以包括例如直接法和间接法。该直接法是使用可检测的分子(报告分子)直接结合于核酸探针的方法，该间接法是使用针对报告分子的抗体等使信号扩增的方法。在核酸探针中的寡核苷酸中，导入官能团(例如，伯脂肪族氨基、SH基等)，可以使庚烯、荧光色素、酶等结合于这样的官能团。作为核酸探针的标记，代表性的如洋地黄毒苷(DIG)、生物素、荧光素等，可以从在抗体的地方进行说明的标记中适当选择使用，另外也可以利用多重标记，还可以利用标记抗体。
作为核酸探针的标记法，可以从该领域中已知的方法中选择使用，例如随机引物法、切口平移法、利用PCR的DNA的扩增、标记/加尾法、体外转写法(in vitro transcription)等。对于可处理的样品的观察，可以从该领域中已知的方法中适当选择使用，例如可以使用暗视野显微镜、位相差显微镜、反射对照显微镜、荧光显微镜、数字图像显微镜、电子显微镜等，另外也可以利用流式细胞仪等。在本发明中，可以将半乳凝素9结合分子蛋白质或其相关多肽或寡肽和半乳凝素9结合分子表达基因作为各种各样的标志或抗肿瘤标志或发癌或癌恶化的标志使用，通过该标志可以做成各种形态的症状检测剂或危险的检测和/或测定剂、半乳凝素9相关生理现象的检测法或危险的检测和/或测定法、以及这样的检测或危险检测和/或测定试剂盒或系统，在本说明书中公布说明的各种各样的疾病·症状的诊断、预防、治疗中不仅有用，而且很好。另外这些试剂或测定法对于疾病治疗后，即预后也可以作为以该疾病作为对象的再发检测剂或预后检测和/或测定剂、它们的检测法或危险性检测和/或测定法、以及用于这些方法的检测和/或测定试剂盒或系统，作为预后的检测测定预期也具有优良的功能、作用效果。
可以提供将对被验者的生体样品中的半乳凝素9结合分子蛋白质的存在量进行试验，半乳凝素9结合分子蛋白质存在量比对照的量多时判定为半乳凝素9易感性或由半乳凝素9诱起的生理活性的期待度的程度或半乳凝素9相关生理反应的程度高的方法。作为具体的判定基准，被验者的半乳凝素9结合分子蛋白质存在量与对照进行比较，为10％以上、优选30％以上、更优选70％以上、更优选100％以上的场合。半乳凝素9结合分子蛋白质的存在量可以使用识别半乳凝素9结合分子的抗体或与半乳凝素9结合分子特异结合的抗体(抗半乳凝素9结合分子抗体)进行测定。该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以与半乳凝素9结合分子蛋白质的抗原表位结合的全体分子以及Fab、F(ab′)2、Fv片段等都包括在内。
作为测定系，例如对组织可以有利地利用免疫染色、免疫电子显微镜等的蛋白质测定系、原位杂交等表达基因测定系，对于组织提取物可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、Western blotting等蛋白测定系、Northern blotting、Southern blotting、dot blotting、RNase保护分析、RT-PCR(reverse transcription polymerase chainreaction)、Real-Time PCR、竞争PCR等表达基因测定系、而对于血中、体液等可以有利利用EIA、RIA、FIA、LIA、and Western blotting等蛋白测定系。
在EIA的测定系中，例如在竞争法中使用抗半乳凝素9结合分子抗体作为固相化抗体使用，也可以使用标记抗原和非标记抗原(作为抗原如半乳凝素9结合分子和其片段肽等)，而在非竞争法中，例如在夹心法中，除了可以利用固相化抗半乳凝素9结合分子抗体或标记抗半乳凝素9结合分子抗体外，也可以利用对抗半乳凝素9结合分子抗体直接进行标记、也可以不固相化，对针对抗半乳凝素9结合分子抗体的抗体进行标记进行固相化后进行。作为灵敏度扩增法，例如在与非酶标记一次抗体的组合中，利用与高分子聚合物和酶和一次抗体的组合(应用Envision试剂的组合，Enhanced polymer one-StepStaining(EPOS))，在与非酶标记二次抗体的组合中，例如PAP(peroxidase-antiperoxidase)法等的酶和抗酶抗体复合物的组合，SABC(avidin-biotinylated peroxidase复合物)法等的生物素标记二次抗体与生物素标记酶-抗生物素蛋白复合物体的组合、ABC(streptavidin-biotin 复合物)法、LSAB(labeledstreptavidin-biotin复合物)法等的生物素标记二次抗体与生物素标记酶-链抗生物素蛋白复合物的组合、CSA(catalyzed signalamplification)法等的SABC与生物素标记酪酰胺(tyramide)和酶标记链抗生物素蛋白的组合、在高分子聚合物中对二次抗体和酶进行标记的组合等。
实施例
以下给出实施例，对本发明进行具体说明，该实施例只是为了本发明的说明，为了作为其具体方式的参考而提供的。这些例示是为了说明本发明的特定的具体的方式的例子，并不表示限定或限制在本申请中公布的发明的范围。至于本发明应当理解为可以是基于本说明书的思想的各种各样的实施方式。
所有的实施例除了另外详细叙述内容之外，都是使用标准的技术进行实施的例子、或能够实施的例子，这对于同行人是众所周知、惯用的方式。
实施例1
(1)材料和方法
(a)细胞培养物
MOLT-4(T细胞)、Jurkat(T细胞)、BALL-1(B细胞)、THP-1(来自acute monocytic leukemia的细胞)以及HL60(来自acutemonocytic leukemia的细胞)由美国模式培养物保藏所(ATCC)获得。所有细胞系都在添加了10％FCS的RPMI-1640培养基(Sigma、圣路易斯、美国)中于5％CO2的条件、37℃下进行维持。为了抑制Gal-9的活性，在培养用培养基中添加30mM的乳糖。作为对照使用同浓度的蔗糖。
(b)重组体Gal-9(rGal-9)的表达和纯化
按照众所周知的方法(例如，Matsushita，N.et al.，J.Biol.Chem.，275：8355(2000)；以及Nishi，N.et al.，Endocrinology，141：3194(2000))那样操作，将rGal-9做成(His)6-半乳凝素-9(短型)[(His)6-Gal-9(S)]，使其表达，进行纯化。即，使带有Gal-9表达质粒的大肠杆菌BL-21株在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基(Gibco BRL、Rockville、马里兰州、美国)中增殖。
为了诱导融合蛋白的表达，添加IPTG(异丙基-β-D-(-)-硫代半乳糖苷、和光纯药、大阪、日本)。将大肠杆菌提取物加到乳糖琼脂糖(生物化学工业、东京、日本)的亲和层析柱。将被吸附的蛋白质用200mM的乳糖洗脱。收集洗脱级分，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)R250染色后进行解析。将含有rGal-9的级分收集，对含有0.1mM二硫苏糖醇(dithiothreitol(DTT))的PBS进行透析。
另外，有关野生型半乳凝素9(galectin-9S，galectin-9M以及galectin-9L)的表达载体的构建、重组蛋白质的表达以及纯化按照M.Sato et al.，Glycobiology，Vol.12，No.3，pp.191-197(2002)所述那样进行。
(c)凋亡分析
(1)利用PI的细胞周期(apoptosis)解析(PI法)
将被凋亡诱导处理的细胞于4℃、1000rpm下进行5分钟离心处理后，将细胞团再悬浮于PBS(300μl)，一边涡旋、一边向细胞悬浮液慢慢添加100％冷乙醇(700μl)，终浓度变为70％乙醇。于4℃下进行30分钟温育处理，对细胞进行固定，然后加PBS(1ml)，于4℃、1000rpm下进行5分钟离心处理后，将细胞团再悬浮于PBS(440μl)。将细胞与2.5mg/ml的核酸酶A(10μl，终浓度50μg/ml，Sigma，圣路易斯、密苏里州、美国)一起于37℃下进行30分钟温育处理，然后与2.5mg/ml的碘化丙锭(propidium iodide)(4μl；PI，终浓度20μg/ml，Sigma)一起于4℃、暗中进行10分钟温育处理。通过尼龙筛除去变成集块的细胞后，用PBS将细胞增加体积，将染色细胞通过流式细胞仪(Sandstrom，K.et al.，J ImmunolMethods，240：55(2000)以及Zhang L.et al.，CancerLett，142：129(1999))进行解析。
(2)TUNEL(TdT-mediated标记dUTP nick end labeling)法
对于通过DNA的片段化产生的末端，用在DNA末端附加核苷酸的酶(TdT：末端脱氧核苷酸转移酶)整合标记的核苷酸(dUTP-biotin或FITC-dUTP等)后，对作为凋亡的显著特征的细胞核DNA的片段进行检测。
在实验中，使用MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL、名古屋、日本)。根据试剂盒业主的指示，象下述那样进行实验。即，将进行了凋亡诱导的细胞(约2×105个/样品)用含有0.2％FSA的PBS洗，然后加4％多聚甲醛(0.1M NaH2PO4，pH7.4中)，于4℃、下进行30分钟固定化后，用含有0.2％FSA的PBS洗。向细胞团添加70％冷乙醇在-20℃培养30分钟，使透过性亢进。用含0.2％FSA的PBS洗后，向细胞团加TdT反应液(TdT、FITC-dUTP以及TdT缓冲液的混合物)，搅拌后，于37℃下进行1小时温育处理，用含有0.2％FSA的PBS洗后，再悬浮于用含有0.2％FSA的PBS中，对染色细胞通过流式细胞仪进行解析。
(3)将培养的细胞株于rGal-9一起进行适当时间、例如24小时温育。然后通过上述(1)的PI法进行凋亡解析。
另外，为了通过膜联蛋白(Annexin)V-PI进行凋亡解析，使用MEBCYTO(登录商标)凋亡试剂盒(MBL、名古屋、日本)。根据试剂盒业主的指示，象如下那样进行实验。即，将进行了凋亡诱导的细胞(约2×105个/样品)用PBS洗，然后再悬浮于结合用缓冲液。将试剂盒的Annexin V-FITC以及5μl的PI(终浓度5μg/ml)加到细胞悬浮液中后，将细胞于暗处进行15分钟温育处理。使用流式细胞仪(EPICS XL-MCL，CouHer，Miami，FL，美国)进行解析。
细胞与Gal-9一起在10μM的Z-VAD-FMK(泛半胱天冬酶抑制剂)、Z-YVAD-FMK(半胱天冬酶1抑制剂)、Z-IETD-FMK(半胱天冬酶8抑制剂)、Z-LEHD-FMK(半胱天冬酶9抑制剂)、Z-AEVD-FMK(半胱天冬酶10抑制剂)、或Z-LLY-FMK(钙蛋白酶抑制剂)(以上、BioVision，CA，美国)的存在下进行温育处理后，研究半胱天冬酶或钙蛋白酶是否参与由Gal-9诱导的凋亡。使用Z-FA-FMK(BioVision，CA，美国)作为对照(VuC.C.et al.，J.Biol.Chem.，276：37602(2001)以及Sweeney E.A.et al.，FEBS Lett.，425：61(1998))。各个抑制剂在Gal-9刺激的1小时前添加。
以下试剂分别从如下所示的供应商购入：
DEX(BioVision，CA，美国)、抗Fas抗体(Clone CH-11，MBL)、TNFα(Genzyme，Cambridge，MA，美国)、C2神经酰胺(SIGMA)以及依托泊甙(BioVision)。
(d)T细胞解析
将24孔板各个孔，每孔3μg/ml的抗CD3抗体(Immunotech，Marseille、法国)的TBS液(pH8.0)于4℃下温育过夜处理后，除去抗CD3抗体，用PBS洗涤孔，得到用抗CD3抗体包被的孔板。
使用HISTOPAQUE(登录商标、SIGMA)从加肝素的血液中分离单核白血球细胞。然后，使用CD4阳性分离试剂盒(CD4-positiveisolation kit；DYNAL，Oslo，挪威)以及Dynabeads(登录商标，DYNAL，oslo，挪威)M-450 CD8(DYNAL，Oslo，挪威)，按照试剂盒制造业主所述那样分别分离CD4阳性T细胞以及CD8阳性T细胞。
为了对T细胞进行活化，将CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞于含有10％FCS的RPMI-1640中调整为1×106个/ml的细胞，于37℃下在用抗CD3抗体包被的板上于5％CO2培养箱中温育处理20～24小时，然后与rGal-9[(His)6-rGal-9(S)]一起于37℃下在5％CO2培养箱中进行温育处理。然后，象上述(c)那样，进行凋亡·分析。即，将细胞于37℃下与50μg/ml的PI(SIGMA)一起在暗处进行温育处理10分钟。将染色细胞通过流式细胞仪(Sandstrom，K.et al.，JImmunol Methods，240：55(2000)以及Zhang L.et al.，Cancer Lett，142：129(1999))进行解析。
对于非活化(静息)T细胞也与rGal-9[(His)6-rGal-9(S)]一起于37℃下在5％CO2培养箱中进行温育处理后，与上述同样进行凋亡分析。
作为比较，用半乳凝素1以及半乳凝素3处理的场合也进行试验。
(e)Ca2+流入
培养基(10％FCS，含有10mM HEPES的RPMI-1640，pH7.2)中的细胞(大致为106～107个/ml)与作为细胞内钙指示剂的fluo-3AM(最终浓度10μM，Dojindo，Kumamoto，日本)一起于37℃下进行30分钟温育处理(Sharp，B.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8294(1996))。然后将细胞清洗之后，再悬浮于培养基中(最终浓度，大约2×105个/ml·样品)。再用流式细胞仪测定细胞内钙。测定休止细胞的荧光强度后1分钟，对该细胞加刺激。
然后直至在加另一个刺激之前，连续地再次开始收集纪录。有关乳糖抑制分析，在30mM的乳糖的存在下，对细胞进行刺激。作为对照，使用30mM的蔗糖(Sano，H.et al.，J.Immunol.，165：2156(2000))。作为阳性对照使用A23187(钙离子载体、终浓度5ng/ml，Wako，Osaka，日本)。
[结果]
(1)通过Gal-9进行凋亡的诱导
研究Gal-9对各种细胞株的凋亡诱导活性。结果表明，rGal-9一起进行温育处理的MOLT-4细胞用PI被染色。该被染色的细胞作为引起凋亡的细胞计数。就像图1A所示那样，rGal-9(1μM)诱导MOLT-4细胞的凋亡(在对照的PBS中，14.8％的细胞是被PI染色的细胞，是引起凋亡的细胞，而在用Gal-9处理的组中，34.5％的细胞是被PI染色的细胞，引起凋亡)。Gal-9对这样的凋亡诱导与时间、以及用量有关。用PI法检测的凋亡随着rGal-9的浓度变大而增加，如果延长温育时间，还要增加(例如，如果用0.3μM的rGal-9，温育时间24小时，而如果用1μM的rGal-9，温育时间为6小时)。
凋亡期间会产生磷脂酰丝氨酸，由于它可以用染色法进行检测，所有使用Annexin V染色法可以研究Gal-9的促凋亡。用Annexin V染色法检测的引起凋亡的细胞如果使用1μM的Gal-9由对照的13.2％增大到69.1％，(图1B)。由此可确认Gal-9对于MOLT-4细胞具有凋亡活性。
然后，当研究乳糖对Gal-9的凋亡诱导活性的作用时，就像图2所示那样，Gal-9的促凋亡活性几乎被30mM的乳糖完全抑制，但不被蔗糖抑制。这表明对于Gal-9的诱起的凋亡β-半乳糖苷酶结合活性是必需的。
(2)由Gal-9引起的各种各样细胞的凋亡的发生
Gal-9的促凋亡活性对于其它细胞株是否表现出该活性进行研究。即，在1μM的rGal-9存在下或不存在下，对细胞进行24小时培养，研究是否发生凋亡。就像图3所示那样，凋亡不仅在Jurkat细胞和MOLT-4细胞等T细胞，而且在B细胞(BALL-1)、单核细胞(THP-1)以及骨髓性细胞(HL60)也被Gal-9诱导。而图3中的黑棒表示Gal-9的处理组，白棒表示对照。另外，Gal-9的促凋亡活性被乳糖抑制，而不受蔗糖抑制。
接下来，对人的末梢血T细胞进行Gal-9诱起凋亡研究。T细胞分离为CD4+细胞和CD8+细胞，在抗CD3抗体存在下和不存在下进行温育。然后对非活化(静息)T细胞和抗CD3抗体活化的T细胞在1μM的rGal-9存在下进行温育处理。结果如表1所示。
表1
    CD3   半乳凝素-9       CD4      CD8
    (-)   (-)       6.2      7.7
    (-)   (+)       10.8      17.8
    (+)   (-)       8      8.5
    (+)   (+)       41.7      25.7
    CD3   半乳凝素-1       CD4      CD8
    (-)   (-)       6.2      7.7
    (-)   (+)       8.1      9.6
    (+)   (-)       8      8.5
    (+)   (+)       13.9      19
    CD3   半乳凝素-3       CD4      CD8
    (-)   (-)       6.2      7.7
    (-)   (+)       9.6      14.7
    (+)   (-)       8      8.5
    (+)   (+)       15.7      20.9
表1中，CD3(+)表示在用抗CD3抗体包被的板上被处理、活化的状态，CD3(-)由于没有进行通过抗CD3抗体包被的板的处理，所以，表示非活化(静息)细胞。各个半乳凝素下的(+)表示在其存在下的处理，(-)表示不存在下的处理，而CD4表示CD4阳性T细胞，CD8表示CD8阳性T细胞。
由图4表明与静息CD4+T细胞和静息CD8+T细胞进行比较，Gal-9更能使CD3-活化CD4+T细胞和CD3-活化CD8+T细胞两者凋亡。图4中的黑棒表示Gal-9存在下的处理组，白棒表示对照。另外与CD8+T细胞比较，进一步确认CD4+T细胞方对Gal-9的易感性(图4)  。
(3)半胱天冬酶抑制
对于半胱天冬酶活化途径是否参与Gal-9诱起凋亡进行研究。首先与泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK一起对MOLT-4细胞进行温育处理，然后与rGal-9一起进行温育。Gal-9诱起凋亡几乎完全被该半胱天冬酶抑制剂抑制(图5和图6)。例如，通过地塞米松(DEX)、抗Fas抗体、TNF-α、C2神经酰胺等其它的刺激诱导的凋亡可被该泛半胱天冬酶抑制剂抑制也可观察到。
使用各种针对半胱天冬酶的半胱天冬酶抑制剂，即针对半胱天冬酶-1的Z-YVAD-FMK、针对半胱天冬酶-8的Z-IETD-FMK、针对半胱天冬酶-9的Z-LEHD-FMK、以及针对半胱天冬酶-10的Z-AEVD-FMK进行实验。
结果如图5所示。唯一Z-YVAD-FMK(半胱天冬酶-1抑制剂)抑制Gal-9诱起的凋亡，其它的抑制剂都不抑制Gal-9诱起的凋亡。同时发现该半胱天冬酶-1抑制剂抑制DEX诱起的凋亡，半胱天冬酶-8抑制剂以及半胱天冬酶-10抑制剂抑制抗Fas抗体诱起凋亡以及TNF-α诱起凋亡，半胱天冬酶-9抑制剂抑制C2神经酰胺诱起凋亡。另外，如图6所示那样，泛半胱天冬酶抑制剂和半胱天冬酶-1抑制剂两者抑制Gal-9与用量有关。这样的抑制现象也可以在使用其它细胞株的实验中得到。由这些结果可以认为Gal-9是借助于半胱天冬酶-1诱导凋亡的，并不能通过其它的半胱天冬酶的途径进行诱导。
(4)钙-钙蛋白酶途径
对于半胱天冬酶-1的活化由于需要钙依赖性蛋白酶-钙蛋白酶，所以，对钙蛋白酶半胱天冬酶-1活化系统是否与MOLT-4细胞的Gal-9诱起凋亡有关进行研究。如图7所示那样，作为钙蛋白酶抑制剂的Z-LLY-FMK抑制Gal-9诱起凋亡与用量有关。
另外，为了对Gal-9是否能够使MOLT-4细胞中的钙的流入发生进行研究，进行F1uo-3分析。如图8所示那样，当添加Gal-9时，在10～20秒内MOLT-4细胞内钙的流入上升，但Gal-9诱起的钙的流入被乳糖抑制。而蔗糖不抑制Gal-9诱起的钙的流入。作为对照使用的A23187(终浓度5ng/ml)显然抑制MOLT-4细胞中的钙的流入(图8)。
另外，在其它的细胞中，也可以确认在Gal-9诱起凋亡中有钙蛋白酶以及钙的流入参与。
(5)Gal-9对于由DEX、抗Fas抗体以及依托泊甙诱起的凋亡的效果
对于Gal-9对由其它刺激(例如，DEX、抗Fas抗体以及依托泊甙等)诱导的凋亡影响的作用效果进行研究。
rGal-9、DEX、抗Fas抗体以及依托泊甙都显著诱导MOLT-4细胞的凋亡(图9)。
将MOLT-4细胞与rGal-9以及DEX一起进行温育处理时，引起凋亡的细胞的比例(％)几乎为微小的差异或没有差异。另外，rGal-9对抗Fas抗体诱起凋亡以及依托泊甙诱起凋亡表现出附加作用(图9)。这些结果表明由Gal-9引起的凋亡化途径与由DEX以外的其它刺激引起凋亡的途径不同。
接着，发现Gal-9在各种各样的细胞、特别是被试验的所有免疫细胞中都诱导凋亡(图3和4)。这表明Gal-9起着作为对很多类型的细胞具有促凋亡活性因子的功能。
例如，关于糖皮质激素(GC)、抗Fas抗体、氧化性的应激等其它的刺激，可对凋亡化途径分别进行解析。例如，抗Fas抗体与Fas配体结合后，借助于半胱天冬酶-8活性诱导凋亡，依托泊甙阻碍DNA，使线粒体的细胞色素c游离，对半胱天冬酶-9进行活化，最终诱导凋亡(Sun X.M.et al.，J.Biol.Chem.，274：5053(1999))。DEX对钙依赖性内切核酸酶以及半胱天冬酶-1进行活化，引起细胞死亡(Cheneval，D.et al.，J.Biol.Chem.，273：17846(1998))；McConkey，D.J.，J.Biol.Chem.，271：22398(1996)以及Cohen，J.J.et al，JImmunol.，132：38(1984))。GC在很多类型的细胞中诱导凋亡，当然在T细胞中也诱导凋亡(Dobashi H.et al.，FASEB，15：1861(2001)以及Nittoh，T.et al.，Eur.J.Pharmacol.，354：73(1998))。其机制已经被解析，表明GC以及半胱天冬酶-1在胸腺细胞中诱导钙依赖性凋亡(McConkey，D.J.，J.Biol.Chem.，271：22398(1996)以及Cohen，J.J.et al.，J Immunol.，132：38(1984))。
在本发明中发现Gal-9诱导凋亡，凋亡继Ca2+流入(图8)、钙蛋白酶参与(图7)、然后半胱天冬酶-1的活化(图5和6)后发生，该现象表明Gal-9使用钙-钙蛋白酶-半胱天冬酶-1途径，就像GC那样诱导凋亡。
钙通过钙-钙蛋白酶途径和线粒体途径两方诱导U937细胞的凋亡(Li M.et al.，J.Biol.Chem.，275：39702(2000))。另外，Gal-9还会增加由抗Fas抗体或依托泊甙诱导的凋亡。
在由GC诱导的细胞死亡的期间，Gal-1基因被过量表达(Goldstone S.D.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，178：746(1991))。而且Gal-1在Jurkat细胞中诱导Ca2+流入以及凋亡(Walzel，H.et al.，Glycobiology，10：131(2000))。这表明钙-钙蛋白酶-半胱天冬酶-1途径至少部分与由Gal-1介导的凋亡的途径有关。事实上，在Gal-1诱导凋亡中，不需要细胞内钙的上升(Pace，K.E.etal.，J Immunol.，165：2331(2000))。另外，Gal-7应当是具有JNK活化以及在细胞色素C游离的上游的细胞内发挥作用的促凋亡活性的半乳凝素(Kuwabara，I.et al.，J.Biol.Chem.，277：3487(2002)以及Bernerd，F.et al.，Proc.Nat l.Acad.Sci.USA，96：11329(1999))。这表明Gal-7的促凋亡活性途径与Gal-1以及Gal-9的活性途径不同。
本发明人到目前为止发现了Gal-9结合于试验的细胞的细胞表面。GC与细胞内的受体一结合，该受体结合后向核移动(Galigniana，M.D.et al.，J.Biol.Chem.，274：16222(1999)以及Guiochon-Mantel，A.et al.，EMBO J.，10：3851(1991))。另外，我们认为Gal-9与细胞表面的结合分子结合，然后诱导Ca2+流入、钙蛋白酶-半胱天冬酶-1活化，直至使细胞凋亡。Gal-9的受体以及其存在的场所虽然与DEX不同，但Gal-9通过与GC场合相似的凋亡化途径诱导凋亡。事实上，Gal-9表现出对抗Fas抗体介导的凋亡或依托泊甙介导的凋亡双方进行附加的作用，但对于DEX介导的凋亡不具有任何的附加作用或只是具有一点点的附加作用(图9)。另外，本发明人等发现Gal-9可使由抗Fas抗体引起的凋亡增强，而Gal-9抑制由DEX-诱起嗜酸性细胞凋亡。
另外，发现DEX在大鼠中在CD4+T细胞以及CD8+T细胞双方细胞中诱导凋亡(Tsuchiyama，Y.et al.，Kidney Int.，58：1941(2000))以及在人T细胞中诱导凋亡(Dobashi H.etal.，FASEB，15：1861(2001))。另外，Gal-9在肾炎的大鼠中在活化的脾脏CD8+T细胞中诱导有选性的凋亡(Tsuchiyama，Y.etal.，Kidney Int.，58：1941(2000))。
在本发明中发现Gal-9在来自人末梢血细胞中，与被活化的CD8+T细胞(抑制者T细胞和细胞伤害性T细胞)相比，更诱导被活化的CD4+T细胞(协助者T细胞)(图4)。这表明Gal-9作为免疫抑制因子(immunosuppressive factor)起作用的可能性。因此，可以认为Gal-9与嗜酸性细胞活化的活性一起通过诱导CD4+T细胞等各种各样的免疫细胞的凋亡，对免疫的控制调整起着重要的作用。
实施例2
(1)半乳凝素9的毒害细胞活性
对Jurkat T细胞株、K-562白血病细胞、正常淋巴细胞通过使用PI的流式细胞仪解析法测定毒害细胞活性。即，对靶细胞和1mM的半乳凝素9进行16小时温育处理后，在最后的15分钟加PI，在受到伤害的靶细胞中，PI进入细胞内。用FACS测定由该PI发出的荧光。作为阴性对照使用不加任何其它物质的细胞，作为100％死细胞使用用福尔马林固定的细胞，作为阳性对照使用H2O2(过氧化氢溶液)。就像表2表示的那样，半乳凝素9对Jurkat细胞株、K-562细胞表现出明显的毒害细胞活性，而对正常淋巴细胞没有表现出伤害活性。
                  表2
   刺激      16小时
Jurkat    (-)      1.02
   半乳凝素-9      46.2
   H2O2      97.7
K-562    (-)      0.73
   半乳凝素-9      23.4
   H2O2      99.2
正常淋巴细胞    (-)      1.12
   半乳凝素-9      2.47
   H2O2      96.8
(2)由半乳凝素9引起的癌细胞凋亡
用PI法进行凋亡的测定。将与半乳凝素9一起培养的细胞洗净后，用乙醇固定，片段化的DNA流到细胞外。然后，与PI一起进行温育处理时，凋亡细胞荧光强度变低。通过该细胞的比例研究凋亡。就像图10所表示的那样，由于在与半乳凝素9一起共培养72小时的恶性黑素瘤细胞MM-RU中强烈地诱导凋亡，所以表明半乳凝素9诱导癌细胞凋亡。该凋亡与作为阳性对照使用的H2O2(过氧化氢溶液)同等。另外，通过其它的凋亡测定法TUNEL法也得到同样的结果。然后对于其它的恶性肿瘤细胞也进行能否看到由半乳凝素9引起的凋亡诱导进行研究，结果如表3所示。
                     表3
    细胞系      Gal9(-)      Gal9(+)
    Jurkat      13.8      66.6
    MOLT4      14.8      34.5
    BALL-1      9.2      26.0
    THP-1      8.3      61.2
    HL-60      38.1      64.6
    MCF-7      7.5      14.1
    KATO-III      1.0      30.5
    Daudi      59.7      58.5
    HMC-1      27.0      26.2
表3中，Jurkat以及MOLT-4是来自T细胞的恶性细胞、BALL-1是来自B细胞的恶性细胞、THP-1是来自acute monocytic leukemia的细胞、HL60是来自acute promyelotic leukemia的细胞、MM-RU是恶性黑素瘤细胞、MCF-7是乳腺癌细胞、KATO-III是胃癌细胞。在半乳凝素9存在下进行温育处理至少进行48小时以上。由表3可知由半乳凝素9引起的凋亡在非上皮恶性细胞、上皮性恶性细胞中的任一种都可看到。Daudi细胞(B细胞)和HMC-1(肥大细胞)中都看不到凋亡的诱导。由此表明在细胞表面存在作为与凋亡的信号有关系的结合因子，而且与半乳凝素9结合因子没有工序的因子。利用此，可以进行与凋亡有关的半乳凝素9结合分子的鉴定或利用它进行肿瘤增殖抑制技术的开发。
半乳凝素9在上皮性恶性细胞(癌)和非上皮恶性细胞(肉瘤或白血病等)所有细胞中表现出抗肿瘤活性。而在没有被活化的正常的T细胞几乎不表现出凋亡诱导活性。例如，在有1μM的半乳凝素9存在下，测定凋亡诱导活性的结果如下面表4所示那样(表4中半乳凝素3也为1μM)。
                     表4
     CD4T细胞     CD8T细胞
     静息     静息
   (-)      0.8     0.8
   抗-Fas      15.9     8.3
   半乳凝素-9      1.8     1.4
   半乳凝素-3      10.3     15.9
由此可以将半乳凝素9蛋白质、半乳凝素9激动剂、半乳凝素9拮抗剂拮抗物质、抗半乳凝素9结合蛋白抗体、抗半乳凝素9结合糖链抗体、半乳凝素产生·游离诱导物质等用作对于正常细胞没有作用，而对肿瘤细胞表现伤害活性、诱导凋亡的抗肿瘤剂(抗癌剂)使用。
实施例3
(1)由半乳凝素9引起的癌转移抑制活性
在人黑素瘤细胞株中，在MM-BP和MM-RU中如果培养它们的细胞株，前者凝集，对胞巢形成性表现出增殖，而后者以游离的形式进行增殖。从人黑素瘤细胞株的MM-BP和MM-RU探取mRNA，通过RT-PCR法对半乳凝素的DNA量进行解析，结果表明在MM-BP和MM-RU中半乳凝素1和半乳凝素3的量没有差异，而在半乳凝素9中只在胞巢形成性的MM-BP中明显看到，但在以游离形式进行增殖的MM-RU中非常弱(图11)。
乳腺癌细胞株MCF-7虽然是胞巢形成性的细胞MCF-7，但通过有限稀释法制作亚克隆，建立不表现出明显的胞巢形成性的MCF-7K-10株(图12)。MCF-7虽然用Western blot法含有半乳凝素9，但在MCF-7K-10株中不能检测半乳凝素9(图13)。而通过免疫染色法主要在细胞质中看到MCF-7的半乳凝素9。
RT-PCR根据T.Kageshita et al.，Int.J.Cancer，99：809-816(2002)所述的方法进行。
MCF-7的细胞培养在添加谷氨酸盐、10％胎牛血清(fetal bovineserum)以及盘尼西林和链霉素(ICN biomedicals，Aurora，OH，美国)的Dulbecco修饰Eagle′s培养基中进行，温育使用5％CO2/37℃的条件。
Western blot解析象下面那样进行：取大约106个细胞，用含有150mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5，0.5％NonidetP-40(Boehringer-Mannheim，GmbH，德国)，1mM PMSF(ICNbiomedicals)，50TIU抑酶肽(Wako，大阪，日本)以及50mg/ml亮抑酶肽(Calbiochem，San Diego，CA，美国)的溶解缓冲液处理，破坏细胞膜。将得到的上清液与2×样品缓冲液(125mM Tris-HCl，pH6.8，20％丙三醇，2％2-巯基乙醇，4％SDS，0.02％溴酚蓝)一起进行5分钟煮沸处理，加到5-15％梯度胶，通过使用Mini-gel装置(Bio-Rad，Richmond，CA，美国)的SDS/PAGE进行分离处理。被分离的蛋白质转移到PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，美国)上，在含有0.05％Tween 20(Sigma，St.Louis，MO，美国)的5％脱脂乳进行1小时封闭处理后，与2μg/ml的抗半乳凝素-9抗体(α-galectin-9CT)液(5ml)一起进行温育处理。然后用辣根过氧化物酶偶联的山羊的抗兔IgG抗体(Amarsham，Buckinghamshire，UK)处理，通过ECL系统(Amarsham)使带可视化。
免疫染色象下面那样进行：为了用抗半乳凝素-9多克隆抗体(α-galectin-9CT)对福尔马林固定石蜡膜包埋组织切片进行免疫组织化学染色，使用DAKO EnVision+TM，过氧化物酶，兔系统，按照试剂盒制造业者的指示书进行操作。对4μm的福尔马林固定石蜡膜包埋组织切片进行脱石蜡化以及在再水合化之前于抗原再生用的柠檬酸盐缓冲液(10mM)中进行16分钟煮沸处理。用0.3％过氧化物处理，使内因性的过氧化物酶活性消失之后，将该切片用5％牛血清白蛋白(BSA)进行处理2小时，于室温下对非特异染色进行封闭。将该组织切片与第一抗体一起温育处理过夜，然后于室温下与含有抗兔IgG以及辣根过氧化物酶(使两者都结合于聚合物上)的EnVision+TM液一起进行温育处理1小时。使用3，3′-二氨基联苯胺·四氢化氯作为发色剂。作为阴性对照使用来自免疫前的兔得到的血清中的免疫球蛋白级分(DAKO)。所有的切片再用Giemsa液进行复染，对于各个切片中的每一个，二人的观察者分别求被染色的肿瘤细胞的比率，将比50％大的值的细胞染色作为阳性染色。
(2)由半乳凝素9引起的细胞凝集诱导
由外部向MM-RU添加向大肠杆菌导入基因后制作的重组半乳凝素9，就半乳凝素9的作用效果进行研究，结果表明用半乳凝素9从0.1μM浓度开始诱导MM-RU的凝集。而其凝集程度依赖于浓度，在0.3～1.0μM显著。另外凝集在添加半乳凝素9后2小时可看到，12小时后看到强的凝集(图14)。作为对照使用的半乳凝素1和半乳凝素3至少在1μM的浓度也没有诱导明显的凝集。
将半乳凝素9基因导入由乳腺癌细胞株建立的MCF-7 K-10株，该细胞在细胞质中带有半乳凝素9的同时，进行培养时，一边表现出明显的胞巢形成性，一边进行增殖(图15)。
人半乳凝素9的三个亚型、即半乳凝素-9S、半乳凝素-9M、半乳凝素-9L的表达载体的构建将具有编码各个半乳凝素的区域全部、而且在其起始密码子的上游附加7个核苷酸的cDNA插入到pBK-CMV(Stratagene)的EcoRI-XhoI位点进行。半乳凝素9向细胞的导入使用Fugene 6转染试剂(Roche Molecular Medicals)，按照试剂制造业主的程序进行导入。MCF-7K-10株细胞对于以pBK-CMV质粒单独转染的细胞，以及用带有人半乳凝素9cDNA的载体转染的细胞进行试验。细胞在2周内用800μg/ml的G418进行选择处理。
这样一来，显然半乳凝素9对于转移性恶性细胞进行凝集诱导作用，具有癌等的恶性肿瘤的转移抑制活性，作为癌转移抑制剂是有用的。由这样的事实，通过半乳凝素9蛋白质或其衍生物、或半乳凝素9基因导入或诱导半乳凝素9的产生·游离可以获得癌转移抑制作用，以及提供癌转移抑制剂。
人半乳凝素9一方面对肿瘤细胞表现出毒害细胞活性，另一方面对正常细胞不表现出毒害细胞活性引人注目。另外，人半乳凝素9虽然诱导肿瘤细胞凋亡，但不诱导正常细胞凋亡。另外，人半乳凝素9不诱导非活性化T细胞的凋亡，而诱导活化的T细胞的凋亡。由此表明半乳凝素9作为抗肿瘤剂、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及/或肾上腺皮质类固醇激素替代剂是有用的。在本发明中，已经确认人半乳凝素9影响由DEX、抗Fas抗体以及依托泊甙诱起的凋亡的作用和效果，由此确认人半乳凝素9在上述用途中非常有用。
实施例4
对MOLT-4(人T细胞)(约7.25×109个细胞，湿重约18g)反复进行冻融，进行细胞破碎处理。将得到的细胞破碎处理物进行洗涤处理(含200mM乳糖(lac)液)，进行匀浆处理，使细胞破碎液匀一化。进行离心分离，回收沉淀物(块)。使用表面活性剂，进行沉淀物的可溶化。作为代表性的表面活性剂，使用Triton(商品名)进行沉淀物的可溶化。离心处理后回收上清。然后将得到的上清加到GST-柱(非特异性吸附柱)。收集通过柱子的级分。然后将通过GST-柱通过液添加到GST-gal9CT柱，使半乳凝素特异吸附。将柱子洗涤后，使含200mM乳糖(lac)液通过柱子，使半乳凝素9CT(galectin 9CT)与细胞含有蛋白质的结合解离。来自悬浮液gal9CT柱的细胞(MOLT-4)的蛋白质的SDS-PAGE的结果如图16所示。
对于图16所示的各个级分1～12以及A、B、C、D它们中含有的蛋白质进行解析。解析委托株式会社APRO Life Science Institute(德岛县鳴门市濑户町)进行。对于带A、B、C、D它们中含有的蛋白质进行解析，对于带1～12进行质量分析(LC-MS/MS)，对候补进行鉴定。首先，在蛋白质的内部序列解析中，将上述通过SDS-PAGE分离的带得到的样品用蛋白酶有限分解(例如，凝胶消化)，得到的蛋白酶有限分解样品大于1pmol时，利用反向HPLC进行肽的分离处理(肽作图)后，使用序列分析仪进行氨基酸序列分析，当得到的蛋白酶有限水解样品大于0.1pmol时，用质量分析仪(LC-MS/MS)进行分析，进行数据库研究。通过Mascot search对该蛋白质进行记分化，记分高的值(开始值或更高值)作为候补，进行筛选。关于Mascot search由Matrix Science Ltd.可以获得更详细的信息(http：//www.matrixscience.com/)。Mascot是以Mowse算法(D.J.C.Pappin，et al.，Curr.Biol.，3，327-332(1993))作为基础商品化的产物。
作为氨基酸序列分析仪，可以使用Procise 494HT(AppliedBiosystems)，Hewlett-Packard G1005A，岛津PSQ-1(梯度系统)，Procise 494cLC(Applied Biosystems)等。数据库可以使用NCBInr(Protein)，dbEST(DNA)。作为LC-MS/MS仪器如Q-TOF2&毛细管HPLC等。因场合不同，也可以进行MALDI-TOF MS分析，也可以利用MS-Fit检索。MALDI-TOF MS分析可以利用Voyager-DE STR等。
<结果>
至于质量分析(LC-MS/MS)，就所有前体离子得到的产物离子的数值通过Mascot以所有的生物种(all entries)为对象进行数据库(NCBInr)检索。在NCBInr数据库，除了消化酶或人角蛋白以外，在有意义的记分没有达到的场合在dbEST数据库(以人、小鼠、其它动物为对象)中进行检索。
以有意义的记分标的的蛋白质，按照Mascot Search Results的标的编号表示如下。在同一的标的编号中，有许多蛋白质达到时，对代表性蛋白质(主要选择与样品同一的生物种)进行记载。而使用的消化酶或人角蛋白(来自操作上的污染)达到时从数据中除去。
另外，在NCBI主页(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过输入“gi|”后的数字，可以获得蛋白质信息以及编码基因信息。
带1
超过[NCBInr(all entries)]47分的为有意义
(1)蛋白质名：4F2重链抗原
来源         ：人
总分         ：153
肽匹配       ：5
数据库上的鉴定编号：gi|177216
序列覆盖     ：12％
(2)蛋白质名：ATPase，Na+/K+转运，α1多肽
来源         ：人
总分         ：150
肽匹配       ：4
数据库上的鉴定编号：gi|21361181
序列覆盖     ：5％
(3)蛋白质名：钠依赖性中性氨基酸转运类型2截短的异构体
来源         ：人
总分         ：134
肽匹配       ：4
数据库上的鉴定编号：gi|15004317
序列覆盖     ：8％
(5)蛋白质名：基质细胞衍生因子受体1异构体a
来源         ：人
总分         ：57
肽匹配       ：1
数据库上的鉴定编号：gi|9257240
序列覆盖     ：3％
(6)蛋白质名：热休克90kDa蛋白1，β
来源         ：人
总分         ：46
肽匹配       ：1
数据库上的鉴定编号：gi|20149594
序列覆盖     ：3％
带2
超过[NCBInr(all entries)]47分的为有意义
(1)蛋白质名：热休克70kDa蛋白5(葡萄糖调节蛋白，78kDa)
来源         ：人
总分         ：227
肽匹配       ：8
数据库上的鉴定编号：gi|16507237
序列覆盖     ：21％
(3)蛋白质名：热休克70kDa蛋白8异构体2
来源         ：人
总分         ：192
肽匹配       ：5
数据库上的鉴定编号：gi|24234686
序列覆盖     ：20％
(4)蛋白质名：热休克70kDa蛋白9B前体
来源         ：人
总分         ：182
肽匹配       ：3
数据库上的鉴定编号：gi|24234688
序列覆盖      ：6％
(16)蛋白质名：脂肪酸辅酶A连接酶，
              长链3
来源          ：人
总分          ：64
肽匹配        ：4
数据库上的鉴定编号：gi|27469830
序列覆盖      ：6％
(21)蛋白质名：NADH脱氢酶(泛醌)
Fe-S蛋白1，75kDa NADH-辅酶Q还原酶)
来源          ：人
总分          ：55
肽匹配        ：2
数据库上的鉴定编号：gi|4826856
序列覆盖      ：3％
带3
超过[NCBInr(all entries)]47分的为有意义
(4)蛋白质名：S-腺苷高半胱氨酸水解酶-like 1
来源(生物)    ：人
总分          ：100
肽匹配        ：3
数据库上的鉴定编号：gi|21361647
序列覆盖      ：11％
(5)蛋白质名：分子伴侣GroEL
来源(生物)    ：大肠杆菌0157
总分       ：91
肽匹配     ：3
数据库上的鉴定编号：gi|15834378
序列覆盖   ：11％
(6)蛋白质名：程序性细胞死亡8异构体1
来源(生物) ：人
总分       ：78
肽匹配     ：3
数据库上的鉴定编号：gi|4757732
序列覆盖   ：5％
(8)蛋白质名：60kDa热休克蛋白，线粒体前体
来源(生物) ：人
总分       ：66
肽匹配     ：1
数据库上的鉴定编号：gi|129379
序列覆盖   ：3％
(9)蛋白质名：ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基，异构体1，心肌
来源(生物) ：人
总分       ：61
肽匹配     ：1
数据库上的鉴定编号：gi|4757810
序列覆盖   ：2％
(9)蛋白质名：[内质网]核糖体结合糖蛋白II前体
来源(生物) ：人
总分        ：55
肽匹配      ：3
数据库上的鉴定编号：gi|88567
序列覆盖    ：10％
带5
超过[NCBInr(all entries)]47分的为有意义
(1)蛋白质名：法尼基-二磷酸法尼基转移酶1
来源        ：人
总分        ：345
肽匹配      ：6
数据库上的鉴定编号：gi|4758350
序列覆盖    ：18％
(2)蛋白质名：泛醇-细胞色素C还原酶复合物核心蛋白2，线粒体前体
来源        ：人
总分        ：222
肽匹配      ：6
数据库上的鉴定编号：gi|21903482
序列覆盖    ：17％
(3)蛋白质名：长醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基转移酶
来源        ：人
总分        ：158
肽匹配      ：4
数据库上的鉴定编号：gi|21104416
序列覆盖    ：19％
(4)蛋白质名：钙结合转运蛋白
来源          ：人
总分          ：83
肽匹配        ：2
数据库上的鉴定编号：gi|6841066
序列覆盖      ：6％
(5)蛋白质名：NADH脱氢酶-泛醌Fe-S蛋白2前体
来源          ：人
总分          ：71
肽匹配        ：2
数据库上的鉴定编号：gi|3540239
序列覆盖      ：8％
(6)蛋白质名：肌动蛋白，β
来源          ：人
总分          ：57
肽匹配        ：3
数据库上的鉴定编号：gi|14250401
序列覆盖      ：18％
(10)蛋白质名：翻译延伸因子EF-Tu-类蛋白P43前体，线粒体
来源          ：人
总分          ：47
肽匹配        ：1
数据库上的鉴定编号：gi|7443384
序列覆盖      ：3％
带6
超过[NCBInr(all entries)]47分的为有意义
(1)蛋白质名：肌动蛋白，β
来源(生物)    ：人
总分          ：306
肽匹配        ：12
数据库上的鉴定编号：gi|14250401
序列覆盖      ：45％
(4)蛋白质名：半乳凝素9，短异构体
来源(生物)    ：人
总分          ：245
肽匹配        ：4
数据库上的鉴定编号：gi|4504987
序列覆盖      ：15％
(16)蛋白质名：GSTmFra2/2-327
来源(生物)    ：表达载体pGH/F2.2-327
总分          ：139
肽匹配        ：4
数据库上的鉴定编号：gi|3002516
序列覆盖      ：13％
(24)蛋白质名：ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基，异构体1，心肌
来源(生物)    ：人
总分          ：103
肽匹配        ：1
数据库上的鉴定编号：gi|4757810
序列覆盖      ：2％
带7
超过[NCBInr(all entries)]47分的为有意义
(1)蛋白质名：metaxin 1
来源         ：人
总分         ：63
肽匹配       ：1
数据库上的鉴定编号：gi|4505281
序列覆盖     ：4％
(2)蛋白质名：sideroflexin 1
来源         ：人
总分         ：62
肽匹配       ：2
数据库上的鉴定编号：gi|23618867
序列覆盖     ：9％
(3)蛋白质名：TCR β链
来源         ：人
总分         ：60
肽匹配       ：1
数据库上的鉴定编号：gi|2982508
序列覆盖     ：5％
(4)蛋白质名：Hnrnp A1
来源         ：人
总分         ：55
肽匹配       ：1
数据库上的鉴定编号：gi|2194069
序列覆盖     ：8％
带8
超过[NCBInr(all entries)]47分的为有意义
(1)蛋白质名：磷酸载体前体异构体1b
来源         ：人
总分         ：222
肽匹配       ：8
数据库上的鉴定编号：gi|4505775
序列覆盖     ：31％
(2)蛋白质名：sideroflexin 1
来源         ：人
总分         ：204
肽匹配       ：5
数据库上的鉴定编号：gi|23618867
序列覆盖     ：24％
(3)蛋白质名：ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，γ多肽1，
来源         ：人
总分         ：112
肽匹配       ：2
数据库上的鉴定编号：gi|4885079
序列覆盖     ：8％
(4)蛋白质名：电压依赖性阴离子通道1
来源         ：人
总分         ：65
肽匹配       ：2
数据库上的鉴定编号：gi|4507879
序列覆盖    ：10％
(5)蛋白质名：透明质酸结合蛋白前体
来源        ：人
总分        ：62
肽匹配      ：2
数据库上的鉴定编号：gi|8699626
序列覆盖    ：19％
(6)蛋白质名：雄激素调节的短链脱氢酶/还原酶1
来源        ：人
总分        ：58
肽匹配      ：1
数据库上的鉴定编号：gi|20070798
序列覆盖    ：4％
(7)蛋白质名：溶质载体家族25(线粒体载体；酮戊二酸载体)，member11
来源        ：人
总分        ：55
肽匹配      ：3
数据库上的鉴定编号：gi|21361114
序列覆盖    ：11％
(8)蛋白质名：3-羟基丁酸脱氢酶前体
来源        ：人
总分        ：52
肽匹配      ：1
数据库上的鉴定编号：gi|17738292
序列覆盖    ：4％
(9)蛋白质名：B-细胞受体相关蛋白
来源        ：人
总分        ：49
肽匹配      ：2
数据库上的鉴定编号：gi|1673514
序列覆盖    ：8％
带9
超过[NCBInr(all entries)]47分的为有意义
(1)蛋白质名：ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，O亚基，
来源        ：人
总分        ：255
肽匹配      ：7
数据库上的鉴定编号：gi|4502303
序列覆盖    ：39％
(2)蛋白质名：ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合物，亚基d，
来源        ：人
总分        ：217
肽匹配      ：8
数据库上的鉴定编号：gi|5453559
序列覆盖    ：55％
(3)蛋白质名：ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合物，亚基b，异构体1
来源        ：人
总分        ：139
肽匹配      ：4
数据库上的鉴定编号：gi|21361565
序列覆盖    ：24％
(4)蛋白质名：小的GTP-结合蛋白
来源        ：人
总分        ：111
肽匹配      ：2
数据库上的鉴定编号：gi|13569962
序列覆盖    ：15％
(6)蛋白质名：NADH脱氢酶(泛醌)Fe-S蛋白8，23kDa NADH-辅酶Q还原酶)
来源        ：人
总分        ：79
肽匹配      ：2
数据库上的鉴定编号：gi|4505371
序列覆盖    ：28％
(7)蛋白质名：小泡运输蛋白sec22b
来源        ：人
总分        ：76
肽匹配      ：1
数据库上的鉴定编号：gi|4759086
序列覆盖    ：6％
带11
超过[NCBInr(all entries)]46分的为有意义
(1)蛋白质名：线粒体输入受体Tom22
来源          ：人
总分          ：223
肽匹配        ：7
数据库上的鉴定编号：gi|9910382
序列覆盖      ：51％
(2)蛋白质名：信号肽受体，δ
来源          ：人
总分          ：159
肽匹配        ：3
数据库上的鉴定编号：gi|5454090
序列覆盖      ：19％
内部序列解析的结果
带
A+B蛋白质名        ATP合酶，α链
肽匹配             5
添加数据           gi|114517或P25705
序列覆盖           10.13％
C蛋白质名          ATP合酶，β链
肽匹配             4
添加数据           gi|114549或P06576
序列覆盖           8.13％
蛋白质名           钠/钾-转运ATPaseβ-3链
肽匹配             1
添加数据           gi|1703470或P54709
序列覆盖           3.23％
D蛋白质名   ADP，ATP载体蛋白
肽匹配      4
添加数据    gi|113463或P12236
            gi|113459或P05141
            gi|113455或P12235
序列覆盖    14.43％
4蛋白质名   泛醇-细胞色素C还原酶复合物核心蛋白1
肽匹配      1
添加数据    gi|731047或P31930
序列覆盖    2.29％
10蛋白质名  细胞色素c氧化酶多肽II
肽匹配      1
添加数据    gi|117020或P00403
序列覆盖    2.64％
上述被鉴定的候补半乳凝素9结合分子再象以下那样进行与半乳凝素9的相互作用的解析，作为半乳凝素9结合分子可以对最适合的分子进行鉴定，另外对于其功能也可以进行解析、阐明。
①免疫沉降法
加半乳凝素9，使它与细胞反应后，对细胞进行溶解处理，制备细胞提取液。如果细胞内存在与半乳凝素9结合的物质，应当以与半乳凝素9结合的状态存在于细胞提取液中。使挂在凝胶等上的抗半乳凝素9抗体与细胞提取液反应，使抗半乳凝素9抗体结合。或使蛋白A等与抗半乳凝素9抗体结合后，经离心分离处理，与抗体一起使半乳凝素9沉降。此时，如果存在与半乳凝素9结合的蛋白质，由于也与抗体一起沉降，所有可以进行鉴定。沉降物被适当洗涤处理，或根据场合不同被变性，例如进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据需要转移到膜等后，可以通过Western blotting检测。
②West western法或far-Western法
(包括配体印迹法等)
1.对细胞蛋白质提取液进行电泳，转移到膜(PVDF等)上。
2.对半乳凝素9进行标记，使其与膜上蛋白质进行特异结合。
3.通过检测标记，可知半乳凝素9的结合的蛋白质的分布(通过使用来自任意组织的细胞，可知与哪个组织结合的蛋白质是否存在)、局部存在(使用细胞质、细胞膜等的组分)、分子量。
而对于半乳凝素9的标记，可无限制地使用众所周知的手法，例如以下的方法。
A.125I或3H等RI进行检测。
B.用生物素进行标记，用链抗生物素蛋白进行检测。
C.用荧光物质进行标记，检测其激发光或发色光。
D.对半乳凝素9进行磷酸化标记，用抗磷酸化抗体进行检测。
E.使Tag(Flag、His、GST等)与半乳凝素9融合，用针对Tag的抗体进行检测。
③分子加交联法
1.将半乳凝素9添加到培养细胞后，加化学交联剂，增强半乳凝素9与靶蛋白的结合。
2.将细胞溶解，用SDS-PAGE从得到的蛋白质提取液分离半乳凝素9结合蛋白质。
3.靶蛋白质的检测使用抗半乳凝素9抗体，用Western blotting或免疫沉降法等进行。
④表达克隆法
1.用大肠杆菌的表达克隆法
a.使用大肠杆菌，使作为候补的蛋白质表达。
b.将表达候补蛋白质的大肠杆菌重组体溶解，制备蛋白质提取液。
c.对大肠杆菌提取液进行电泳，通过Western blotting法或抗半乳凝素9抗体进行检测。用于检测的标记方法使用与West-Western法同样的方法。
2.使用大肠杆菌和噬菌体的表达克隆法
a.使表达任意蛋白质的噬菌体(噬菌体文库)感染大肠杆菌。
b.将噬菌体重组体转移到硝酸纤维素膜上，使蛋白质表达。
c.将标记的半乳凝素9添加到硝酸纤维素膜上，对结合的表达蛋白质的噬菌体重组体进行鉴定。
d.从噬菌体重组体可以知道与半乳凝素9结合的蛋白质的cDNA。
3.用培养细胞的表达克隆法
a.将作为候补的蛋白质的cDNA导入到培养细胞，使候补蛋白质表达。
b.将半乳凝素9添加到培养细胞进行培养后，为了除去非特异性结合的半乳凝素9，对细胞进行清洗。
c.使用荧光物质或发色剂标记的半乳凝素9反应，半乳凝素9与表达的蛋白质是否结合用ELISA或FACS(读取荧光或发光物质的方法以及机械·仪器)检测。
⑤Two-Hybrid system
本系统是以报告基因的转录活性作为指标，对酵母内两个蛋白质间的相互作用进行检测的系统。本法的特征是可以对酵母生物体内(invivo)两个蛋白质间的相互作用进行检测，可以进行弱的一时的相互作用也能够检测的高灵敏度的分析。另外，还具有在对相互作用进行检测阶段，不需要蛋白质的纯化或抗体。
作为操作步骤：
1.使半乳凝素9基因(bait)与DNA结合蛋白质(DNA-BD)融合的融合基因以及编码认为与使该基因进行相互作用的候补蛋白质的基因(prey)与转录活性化基因(DNA-AD)融合后的基因双方在酵母内进行表达。
2.检测转录活性的报告基因整合到酵母的染色体中，可以开发、利用各种各样的报告基因，这样的基因可以没有限制地利用。该报告基因可以使用通常营养性功能基因或lacZ基因。
3.在酵母细胞内只有半乳凝素9(bait)与候补的蛋白质(prey)进行相互作用时，融合的转录活性化基因起作用，报告基因上游的转录被活化，可使靶基因表达。
4.实际上，通过培养板上的营养要求性的恢复或β半乳糖苷酶活性的测定检测相互作用。即，在预先设置为在进行相互作用时，酵母细胞增殖，而在不相互作用时，酵母不增殖的培养条件，可以通过β半乳糖苷酶引起的发色进行检测。
另外，除了在酵母内对两个蛋白质间的相互作用进行检测的系统之外，还有使用哺乳动物细胞的系统。这样的系统也可以没有限制地使用。
⑥噬菌体显示法
噬菌体显示可用于鉴定具有与其它分子相互作用的蛋白质或肽。
作为步骤：
1.将DNA插入噬菌体基因组，以与噬菌体衣壳蛋白质(包被噬菌体DNA的表面蛋白质)融合的状态时作为候补的蛋白质在噬菌体分子的表面提示。
2.使噬菌体与包被于板表面的半乳凝素9反应。将与半乳凝素9非特异结合的噬菌体重组体(表达蛋白质的噬菌体)冲洗掉。
3.重复进行上述操作，从任意的噬菌体重组体的候补中只选择表达具有与半乳凝素9特异相互作用的候补的分子的噬菌体，并进行浓缩。
4.由于可以从被选择的噬菌体制备表达的蛋白质的cDNA，所有也可以与基因、蛋白质一起进行鉴定。
5.选择时，再使用与包被半乳凝素9的96孔板进行相互作用的噬菌体，进行ELISA，可以从发色的强度选择表达更强结合的蛋白质的噬菌体。
⑦关于表面胞质团共振法(使用BIAcore的方法)
本Biacore的检测系是采用表面胞质团共振(Surface PlasmonResonance＝SPR)的光学现象的手法。这样一来，伴随着2分子间的结合与解离，在传感器芯片表面产生的微量的质量变化可作为SPR信号检测。
本方法的原理如果象全反射那样将光照到生物体分子的没有固定化的一侧的传感器芯片(金薄膜)，在反发射光的一部分中可观察到反射光强度低下的部分(SPR信号发生)。该光的暗部分出现的角度(＝折射率的变化)与传感器芯片上的质量有关。
当向传感器的表面的半乳凝素9(配体)添加候补蛋白质(分析物)，就会引起结合反应，发生质量变化(＝质量增)，光的暗的部分由I漂移到II。可知每1mm2如果结合1ng的物质，I→II漂移0.1度。反之，由于解离如果质量减少，II→I只返回0.1度。
在Biacore中，由I向II漂移的量、即可以将以传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，而将质量的时间变化作为测定数据表示(传感器图)。纵轴的单位用共振单位(＝RU Resonance Unit)表示，表示相当于1RU＝1pg/mm2。
不仅可以进行生物体分子标记，而且可以实时观察相互作用。
步骤如下：
1.将半乳凝素9(称为配体)固定在传感器芯片上。
2.将含有认为有作用的候补蛋白质(称为分析物)的溶液以一定的流速输送到传感器芯片上。
3.当半乳凝素9与候补蛋白质发生结合和解离，其信号可以作为表面胞质团共振被检测。
4.由于结合的强度可以根据信号的强弱定量，所有可以鉴定与半乳凝素9具有更强相互作用的蛋白质。
⑧荧光偏光法
荧光偏光法对于溶液中的糖链-蛋白质、抗原-抗体或蛋白质间相互作用不进行固定化或示踪分子的分离作业，而可以直接分析它们的相互作用。
本荧光偏光法的原理是液体中的荧光标记的半乳凝素9分子被平面偏光一激发，在同一平面上发偏光荧光。然而，在激发状态中由于布朗运动导致旋转，向与激发平面不同的平面发荧光，荧光偏光被解除。即所谓荧光偏光度应当表示在从被激发开始直至发出荧光的期间，荧光性分子进行旋转的程度。一般通过荧光性探针被标记的小的分子在溶液中由于布朗运动激烈旋转，表现出低的偏光度。另外，其它的蛋白质分子一结合，溶液中的布朗运动减少，偏光度上升。因此，通过偏光法以偏光度的变化为指标，应当可以解析溶液中的蛋白质间相互作用。
步骤如下：
1.测定进行了荧光标记的半乳凝素9的荧光偏光度。
2.加其它蛋白质溶液，检测由于结合进行荧光标记的半乳凝素9发出的荧光偏光有无变化。
3.更大偏光度变化时，作为候补蛋白质的结合引起的变化，进行相互作用的蛋白质的鉴定。
如上所述，被鉴定的半乳凝素9结合分子，利用它根据本说明书中公布的技术，可以在控制它的物质的检索中利用。
产业上的可利用性
通过本发明，半乳凝素9虽然对肿瘤细胞表现出毒害细胞活性或凋亡诱导活性，但对正常细胞由于不表现出伤害活性，而且不诱导凋亡，所以可将半乳凝素9蛋白质、半乳凝素9激动剂、半乳凝素9拮抗剂拮抗物质、抗半乳凝素9结合蛋白抗体、抗半乳凝素9结合糖链抗体、半乳凝素9产生·游离诱导物质等用作对于正常细胞没有作用，而对肿瘤细胞表现伤害活性、诱导凋亡的抗肿瘤剂(抗癌剂)的技术的开发变为可能。
另外，人半乳凝素9不诱导非活化(静息)T细胞、特别是CD4阳性T细胞(协助者T细胞)的凋亡，但显著诱导活化CD4阳性T细胞(协助者T细胞)的凋亡，活化CD8阳性T细胞(抑制者T细胞和毒害细胞性T细胞)的凋亡与半乳凝素1或半乳凝素3相比，诱导更强烈，而且与糖皮质激素(地塞米松)同样的途径，即受体→钙流入→钙激活蛋白酶→半胱天冬酶1→半胱天冬酶3以及7这一途径诱导凋亡，半乳凝素9可以作为抗炎剂、抗过敏剂和免疫抑制剂利用，由于半乳凝素9蛋白质、半乳凝素9基因导入和通过诱导半乳凝素9作为副作用少的免疫抑制剂使用，和通过与它并用，可以减少糖皮质激素等的用量，结果也可以使副作用变少。这样一来，可以提供通过半乳凝素9、其类似物等的利用、对半乳凝素9的生物体内浓度、或表达进行控制，可以提供抗肿瘤剂、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素替代用活性成分剂。另外，利用半乳凝素9，可以应用于糖皮质激素表现出的药理作用·生物活性的领域。
本发明除了上述说明以及实施例特别记载的以外，显然可以实施。鉴于上述的示范，本发明的许多的改变和变形都是可能的，因此这些也都是本申请所附的权利要求范围的范围内的内容。

Claims (15)

1.医药或动物药，其特征在于，(i)含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分，
(ii)所述药物选自抗肿瘤剂、抗过敏剂、免疫抑制剂、自身免疫疾病用剂、抗炎症剂以及肾上腺皮质类固醇激素替代用活性成分。
2.抗肿瘤剂，其特征在于，含有半乳凝素9或其类似物肽作为有效成分。
3.抗过敏剂，其特征在于，含有半乳凝素9或其类似物肽作为有效成分。
4.免疫抑制剂，其特征在于，含有半乳凝素9或其类似物肽作为有效成分。
5.自身免疫疾病用剂，其特征在于，含有半乳凝素9或其类似物肽作为有效成分。
6.抗炎症剂，其特征在于，含有半乳凝素9或其类似物肽作为有效成分。
7.肾上腺皮质类固醇激素替代剂，其特征在于，含有半乳凝素9或其类似物肽作为有效成分。
8.恶性毒害细胞剂，其特征在于，含有从(a)半乳凝素9及其类似物，以及(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸选出来的成分作为有效成分。
9.癌转移抑制剂，其特征在于，含有从(a)半乳凝素9及其类似物，以及(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸选出来的成分作为有效成分。
10.对肿瘤细胞表现出毒害细胞活性的药剂，其特征在于，(i)含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分。
11.对肿瘤细胞诱导凋亡的药剂，其特征在于，(i)含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分。
12.对免疫细胞、例如活化T细胞诱导凋亡的药剂，其特征在于，(i)含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分。
13.对起因于活化T细胞的疾病或病的症状的预防和/或治疗剂，其特征在于，(i)含有从(a)半乳凝素9及其类似物、
(b)编码半乳凝素9以及实质上具有与其均等的生物活性的多肽的多核苷酸、
(c)半乳凝素9产生以及释放的诱导因子
(d)抗半乳凝素9受体抗体、以及
(e)针对半乳凝素9结合性糖链的抗体
选出来的成分作为有效成分。
14.半乳凝素9结合因子[括弧内的数字指的是可以通过在NCBI的主页(http：www.ncbi.nlm.nih.gov/)输入该数字获得蛋白质信息以及编码他们的DNA等核酸序列的信息的数据库上识别号]，其特征在于，所述结合因子选自：
4F2重链抗原(177216)；ATPase，Na+/K+转运，α1多肽(21361181)；钠依赖中性氨基酸转运体类型2截短的异构体(15004317)；基质细胞衍生因子受体1异构体a(9257240)；基质细胞衍生因子受体1异构体b，热休克90kDa蛋白1，β(20149594)；热休克90kDa蛋白1，α；热休克70kDa蛋白5(葡萄糖调节蛋白，78kDa)(16507237)，热休克70kDa蛋白8异构体2(24234686)，热休克70kDa蛋白9B前体(2423688)；脂肪酸辅酶A连接酶，长链3(27469830)；NADH脱氢酶(泛醌)Fe-S蛋白1，75kDa(NADH-辅酶Q还原酶)(4826856)；S-腺苷高半胱氨酸水解酶-like1(21361647)；程序性细胞死亡8异构体1(4757732)；60kDa热休克蛋白，线粒体前体(129379)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，α亚基，异构体1，心肌(4757810)；[内质网]核酮糖结合糖蛋白(ribophor)II前体(88567)；法尼基-二磷酸法尼基转移酶1(4758350)；泛醇-细胞色素C还原酶复合物核心蛋白2，线粒体前体(21903482)；长醇基-二磷酸寡糖-蛋白糖基转移酶(21104416)；钙结合转运蛋白(6841066)；NADH脱氢酶-泛醌Fe-S蛋白2前体(3540239)；肌动蛋白，β(14250401)；翻译延伸因子EF-Tu-类蛋白P43前体，线粒体(7443384)；metaxin 1(4505281)；sideroflexin 1(23618867)；TCRβ链(2982508)；Hnrnp A1(2194069)；磷酸盐载体前体异构体1b(4505775)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，γ多肽1(4885079)；电压依赖性阴离子通道1(4507879)；透明质酸结合蛋白前体(8699626)；雄激素调节的短链脱氢酶/还原酶1(20070798)；溶质载体家族25(线粒体载体；酮戊二酸载体)，member11(21361114)；3-羟基丁酸盐脱氢酶前体(17738292)；B-细胞受体相关蛋白(1673514)；ATP合酶，H+转运，线粒体F1复合物，O亚基(4502303)；ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合物，亚基d(5453559)；ATP合酶，H+转运，线粒体F0复合物，亚基b，异构体1(21361565)；小的GTP结合蛋白(13569962)；NADH脱氢酶(泛醌)Fe-S蛋白8，23kDa(NADH-辅酶Q还原酶)(4505371)；小泡运输蛋白sec22b(4759086)；线粒体输入受体Tom22(9910382)；信号序列受体，δ(5454090)；ATP合酶，α链(114517或P25705)；ATP合酶，β链(114549或P06576)；钠/钾-转运ATPaseβ-3链(1703470或P54709)；ADP，ATP载体蛋白(113463，P12236，113459，P05141，113455，或P12235)；泛醇-细胞色素C还原酶复合物核心蛋白1(731047或P31930)以及细胞色素c氧化酶多肽II(117020或P00403)。
15.利用权利要求14所述的半乳凝素9结合因子与半乳凝素9之间的相互作用的半乳凝素9活性控制技术。
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