CN1894409A

CN1894409A - 人LXRα变体

Info

Publication number: CN1894409A
Application number: CNA2004800304393A
Authority: CN
Inventors: 刘强远; P·纳姆比
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2004-08-18
Publication date: 2007-01-10
Also published as: WO2005019264A3; US20070218550A1; US20050095677A1; CA2534567A1; BRPI0413754A; WO2005019264A2; US7341850B2; EP1697413A2; JP2007531502A; MXPA06001329A; AU2004267067A1

Abstract

本发明提供人LXPα变体多肽和编码这种多肽的核酸。本发明还提供这种多核苷酸和多肽的治疗、诊断和研究用途以及生产方法。

Description

人LXRα变体

相关申请的相互参考

本申请要求2003年8月18日提交的美国临时申请序号No.60/496007的优先权，该临时申请通过引用整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及新型肝X受体(LXR)及编码这种受体的核酸序列。

发明背景

在真核细胞中基因表达受转录因子的相互作用调节。已发现类固醇激素(例如糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、黄体酮、雄激素和维生素D)结合为转录因子的其核受体，并以此方式调节特定蛋白编码基因的表达，控制关键的细胞活性，例如分化、增殖和凋亡(Meier，Recept.Signal Transduct.Res.1997，17，319-335)。肝X受体(LXR)是一个首先被鉴别为核受体超家族孤儿成员的转录因子家族。鉴别出一类特别的胆固醇氧化衍生物为LXR配体，这对帮助理解这些受体在体内的功能至关重要，并首先表明了其在脂质代谢调节中的作用。核受体超家族成员LXR包括LXRα(也称为RLD-1)和泛素受体(UR，也叫做LXRβ)。LXR依赖性途径包括但不限于经胆汁酸途径增加胆固醇消耗的胆固醇-7α-羟化酶、潜在刺激反向胆固醇运输和增加血浆HDL-C水平(Venkateswaran et al.，J.Biol.Chem.275，2000，14700-14707；Costet et al.，J.Biol.Chem.2000 275(36)：28240-28245；Ordovas，Nutr.Rev.58，2000，76-79，Schmitz and Kaminsky，Front.Biosci.6，2001，D505-D514)和/或抑制肠胆固醇吸收(Mangelsdorf，XIIth InternationalSymposium on Atherosclerosis，Stockholm，June 2000)的ABC蛋白的表达。另外，已推测肝LXR介导的脂肪酸和胆固醇代谢之间有可能存在干扰(Tobin et al.，Mol.Endocrinol.14，2000，741-752)。

总之，正在进行的研究提示，LXR依赖性途径很复杂，LXR变体可在不同程度上影响这些途径。

为了理解LXR依赖性途径和LXR作用机制，重要地是分离和表征LXR的新亚型、变体和/或同种型。鉴别出导致特定病症或病理状况的基本LXR亚型、变体或同种型可允许更精确地预测LXR相关性疾病后果。而且，这样的多核苷酸和/或所述多核苷酸编码的多肽是否表达或表达量可用于诊断相关的病理状况、判断对相关病理状况的敏感性、开发受LXR影响的疾病或病症的基因特异性和同种型特异性疗法、监视LXR相关性疾病或病症的治疗进程、和/或开发新的药物靶点。

由于认识到这些变体可能与单独编码的蛋白一样对代谢和生理功能至关重要，所以需要鉴别和表征LXRα蛋白的其它变体。本发明满足了这种需要，也具有相关优势。

发明概述

本发明涉及新型LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+和LXRα-42e-)的编码核酸序列的鉴别和这些变体的某些活性和特征。因此，本发明涉及编码人肝X受体α(LXRα)变体多肽的分离核酸分子，例如编码SEQ ID NO：4、6、8、17或19的分离核酸分子；编码与SEQ ID NO：4、6、8、17或19具有至少90％(例如90％、95％或99％)一致性的氨基酸序列的分离核酸分子；在6X SSC(1MNaCl)、50％甲酰胺、1％SDS、42℃的杂交条件和42℃、1X SSC的洗涤条件与68℃、0.2X SSC和0.1％SDS的洗涤条件下与上述分离核酸分子杂交的分离核酸分子；以及和本文描述的任一种LXRα变体序列互补的分离核酸分子。LXRα变体核酸分子还可为全长LXRα变体mRNA或cDNA的片段。一般来说，至少一部分片段是在野生型LXRα mRNA或cDNA中不存在的序列。在某些实施方案中，分离核酸分子由SEQ ID NO：3、5、7、16或18组成。

在某些实施方案中，分离核酸分子为DNA分子。分离核酸分子可为RNA分子，或者可含合成核苷酸和天然核苷酸。在某些情况下，分离核酸分子包括SEQ ID NO：3、5、7、16或18的核酸序列或其片段，或者可由SEQ ID NO：3、5、7、16或18的核酸序列组成。在某些实施方案中，本发明的核酸分子可编码具有LXR反应途径活性的多肽，例如可与野生型LXRα形成二聚体、可与类视黄醇X受体(RXR)(例如RXRα、RXRβ或RXRγ)形成杂二聚体、或者可影响LXR反应途径分子的表达和活性，例如ABCA1或SREBP-1C的表达。

在另一个实施方案中，本发明涉及由本文描述的分离的LXRα变体核酸分子编码的多肽(LXRα变体多肽，例如LXRα-64多肽、LXRα-42e+多肽、LXRα-42e-多肽，或其片段)。在某些情况下，多肽可与野生型LXRα形成二聚体。在某些情况下，多肽可与RXR(例如RXRα、RXRβ或RXRγ)形成杂二聚体。在某些实施方案中，形成杂二聚体可抑制RXR和核受体(其与RXR天然杂二聚化)之间形成杂二聚体。在此情况下，形成杂二聚体可调节与RXR和核受体(其与RXR天然杂二聚化)二聚化相关的活性(例如降低或增加)。在另一个实施方案中，LXRα变体多肽可形成抑制RXR同二聚体形成的杂二聚体。在某些情况下，抑制对RXR同二聚体诱导的活性产生调节(例如增加或降低)。在某些实施方案中，LXRα变体多肽或其片段可对LXR(例如野生型LXRα)显示显性负调控活性。在某些实施方案中，本文描述的多肽为LXRα变体片段，可具有LXRα变体的至少一种功能，例如结合特异性结合LXRα变体的抗体。

本发明还包括含LXRα变体或其片段的分离核酸分子的构建物(例如质粒，包括但不限于pCMV/myc、pcDNA 3.1或其衍生物)。分离核酸分子可有效连接调节序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及含本文所述的分离核酸分子(例如LXRα变体或其衍生物)的宿主细胞或细胞后代。本发明还包括含上述构建物的宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞(例如大肠杆菌细胞)或真核细胞，例如哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞、猴细胞或人细胞(例如人胚细胞或其它类型的干细胞)。宿主细胞的实例包括但不限于人肝癌细胞(HepG2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、猴COS-1细胞和人胚肾细胞(HEK293)。宿主细胞的其它实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

本发明的一个方面是含LXRα-64、LXRα-42e+或/和LXRα-42e-氨基酸序列的分离LXRα变体多肽，例如含SEQ ID NO：4、6、8、17、19的氨基酸序列、其天然等位基因变体或其片段的分离多肽。分离的多肽可由SEQ ID NO：4、6、8、17、19的氨基酸序列或其片段组成。一般来说，片段与SEQ ID NO：2的同源性不超过25个连续氨基酸(例如20、15、10或5个连续氨基酸)。在某些实施方案中，分离的LXRα变体多肽包括异源的氨基酸序列。

在另一方面，本发明涉及检测样品中是否存在LXRα变体多肽(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)的方法。该方法包括使样品和选择性结合LXRα变体多肽(或其片段)的化合物(例如抗体如单克隆抗体)接触，并测定化合物是否结合样品中的多肽。本发明还包括一种试剂盒，其包括选择性结合LXRα变体多肽(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)的化合物及使用说明。

本发明的实施方案包括特异性结合本文所述的分离LXRα变体多肽(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)或其片段的抗体。在某些情况下，抗体不明显结合野生型LXRα。在某些实施方案中，抗体为多克隆抗体。在其它实施方案中，抗体为单克隆抗体。抗体可包含可检测标记。本发明还包括抗体片段，例如特异性结合LXRα变体的抗体Fab片段。本发明还涉及含本文所述抗体或其片段和药物可接受载体的组合物。

本发明的一个方面包括鉴别新LXRα变体核酸分子(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)的方法。该方法包括使含一种或多种核酸分子的样品与LXRα变体核酸分子或其片段在严格杂交条件下杂交，鉴别样品中与LXRα变体核酸分子杂交的核酸分子，由此鉴别推定的LXRα变体核酸分子，并测定推定LXRα变体核酸分子的序列，其中序列与LXRα变体序列不相同的推定LXRα变体核酸分子为新LXRα变体核酸。在某些情况下，新LXRα变体核酸分子编码已知的LXRα变体多肽。在某些情况下，新LXRα变体核酸分子编码的LXRα多肽与已知的LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)不相同。与已知的LXRα变体多肽相比，新LXRα变体多肽可含一种或多种保守置换。

在一个方面，本发明涉及检测生物样品中的LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)表达的方法。该方法包括使生物样品与LXRα变体核酸分子或其片段(如本文所述)杂交，并测定核酸分子是否与样品中的核酸分子杂交，其中杂交代表LXRα变体被表达。在某些实施方案中，测定杂交量(例如绝对量或相比于对照或参比量的相对量)。

本发明的另一方面涉及降低细胞中的RXR二聚体形成的方法。该方法包括使细胞与LXRα变体多肽(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)或其片段接触，由此抑制RXR二聚体形成(例如抑制RXR杂二聚化或抑制RXR同二聚化)。

再另一方面，本发明涉及鉴别LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)的配体的方法。该方法包括提供含LXRα变体多肽的样品，使样品与测试化合物接触，测定测试化合物是否可结合LXRα变体，这样可结合LXRα变体的化合物是LXRα变体配体。在某些实施方案中，配体的Kd小于1×10⁶、小于1×10⁹、在1×10⁶和1×10¹²之间、在1×10⁹和1×10¹²之间。在某些情况下，样品中存在RXR。该方法可包括测定LXRα变体配体是否可结合野生型LXRα，例如测定LXRα变体配体不结合野生型LXRα。在某些情况下，鉴别的LXRα变体配体对LXRα变体的亲和性比对野生型LXRα的亲和性高。

本发明的一个方面涉及调节(例如增加或降低)LXRα调节基因的表达。该方法包括调节LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)的表达或活性。LXRα调节基因的实例包括但不限于SREBP-1C(甾醇调节结合元件1c)、FAS、CYP7A1(胆固醇7-α羟化酶)、ApoE、CETP(胆固醇酯转移蛋白)、LPL(脂蛋白脂酶)、ABCA1(ATP-结合盒转运体-1)、ABCG1、ABCG5、ABCG8、ABCG4和PLTP(磷脂转移蛋白)。

在再另一个方面，本发明涉及调节受试者中的LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)表达或活性的方法。该方法包括将LXRα变体核酸分子或其片段以足以表达LXRα变体和调节LXRα表达或活性的量和时间引入到受试者中。在某些实施方案中，LXRα变体抑制野生型LXRα的表达或活性(例如诱导LXRα依赖性途径基因的表达)。在某些情况下，所述活性为LXRα杂二聚化，例如配体刺激的杂二聚化。

在另一方面，本发明包括调节受试者中RXR表达或活性的方法。该方法包括将LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRα-42e-)核酸分子或其片段以足以表达LXRα变体和调节RXR表达或活性的量和时间引入到受试者中。在某些实施方案中，调节(例如抑制)RXR杂二聚化(例如RXR与PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR的杂二聚化)或调节(例如抑制)RXR同二聚化。RXR可为例如RXRα、RXRβ或RXRγ。

在再另一方面，本发明包括治疗患RXR相关疾病或病症的个体的方法，该方法包括给予该个体药学有效量的LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)或其片段。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含：可表达LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)或其片段的细胞，并任选包含药物可接受载体；本文所述的分离LXRα变体核酸分子或其片段和药物可接受载体；或本文所述的LXRα变体(例如LXRα-64、LXRα-42e+或LXRαe-)多肽和药物可接受载体。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语所具有的含义都和本发明所属领域一般技术人员通常理解的相同。尽管可使用和本文所述相似或等同的方法和材料实施或检验本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献，都通过引用整体结合到本文中。另外，材料、方法和实施例仅为说明目的，无限制意图。

由详述、附图和权利要求书显而易见本发明的其它特征和优势。

附图简述和序列描述

由以下的详述、附图和序列可更全面地理解本发明，详述、附图和序列构成了本发明的一部分。

图1A图示了野生型LXRα(天然)cDNA与部分变体LXRα-64cDNA(参见实施例2)的序列对比。上方的行描述了部分野生型LXRα序列，下方的行描述了部分LXRα-64序列。数字代表自每个cDNA序列起始密码子的核苷酸位置。

图1B图示了人LXRα(天然)的预测氨基酸序列和对应于图1A中序列的LXRα-64的序列对比。上方的行描述了部分天然LXRα氨基酸序列，下方的行描述了部分LXRα-64氨基酸序列。数字代表预测序列中的氨基酸位置。LXRα-64变体特有的另外序列加下划线。

图2A描述了部分野生型LXRαcDNA和部分新型变体LXRα-42e+cDNA(参见实施例2)的序列对比。上方的行描述了部分天然LXRα序列，下方的行描述了部分LXRα-42e+序列。数字代表自cDNA起始密码子的核苷酸位置。

图2B描述了人LXRα(野生型)的预测氨基酸序列和LXRα-42e+的序列对比。上方的行为部分天然LXRα序列，下方的行为部分新型变体。数字代表氨基酸位置。LXRα-42e+变体特有的序列加下划线。

图3A描述了部分野生型LXRαcDNA和部分新型变体LXRα-42e-cDNA(参见实施例2)的序列对比。上方的行描述了部分野生型LXRα序列，下方的行为部分LXRα-42e-序列。数字代表自cDNA起始密码子的核苷酸位置。

图3B描述了野生型人LXRα的预测氨基酸序列和LXRα-42e-的序列对比。上方的行为部分野生型LXRα序列，下方的行为部分新型变体。数字代表氨基酸位置。LXRα-42e-变体特有的序列加下划线。

图4是LXRα-64mRNA的图示。

图5是LXRα-42e⁺mRNA的图示。

图6是LXRα-42e^-mRNA的图示。

图7A是条形图，描述了测定各种组织中LXRα-64的相对RNA表达的实验结果。

图7B是条形图，描述了测定各种组织中LXRα-42(LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-混合)的相对RNA表达的实验结果。

图8A是条形图，描述了测定THP-1细胞中LXRα-64RNA表达的基因调节的实验结果。

图8B是条形图，描述了测定THP-1细胞中LXRα-42RNA表达的基因调节的实验结果。

图9是条形图，描述了测定LXRα-64和LXRα-42抑制报告基因的LXR配体依赖性活化的实验结果。

图10是条形图，描述了测定LXRα-64和LXRα-42抑制报告基因的LXR配体依赖性活化的实验结果。该实验和结果示于图9的实验的差异在于用野生型LXRα和每种新变体同时共转染293细胞。

图11是条形图，描述了测定HEK293细胞中的SREBP-1C表达的实验结果，其中所述HEK293细胞在有或没有LXRα激动剂(TO901317)、RXRα激动剂(9RA)或两种激动剂的情况下用编码RXRα(RXRa)、野生型LXRα(LXRa)和RXRα、或LXRα-64(L64)和RXRα的表达载体转染。样品为RXRα+pCMV(对照载体)、RXRa+L64、RXRa+LXRa。表达表示为相比于对照的倍数变化。

图12是条形图，描述了测定HEK293细胞中的ABCA1表达的实验结果，其中所述HEK293细胞在有或没有LXRα激动剂(TO901317)、RXRα激动剂(9RA)或两种激动剂的情况下用编码RXRα(RXRa)、野生型LXRα(LXRa)和RXRα、或LXRα-64(L64)和RXRα的表达载体转染。样品为RXRα+pCMV(对照载体)、RXRa+L64、RXRa+LXRa。表达表示为相比于对照的倍数变化。

以下提供了简单的序列表描述，序列在实施例之后和附图中提供。

SEQ ID NO：1是编码野生型LXRα的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是推断的野生型LXRα的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是编码变体LXRα-64的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是推断的变体LXRα-64的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是编码变体LXRα-42e⁺的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是推断的变体LXRα-42e⁺的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是编码变体LXRα-42e^-的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是推断的变体LXRα-42e^-的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是正向引物LXRα-For的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10是反向引物LXRα-rev的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11是正向引物L64-for的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是反向引物L64-rev的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13是L64 TaqMan探针的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14是用于荧光素酶实验(参见实施例6)的部分LXRα启动子序列。

SEQ ID NO：15是LXR效应元件(LXRE)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16是LXRα-64变体独有的核苷酸序列，相比于野生型其含有另外的序列，该序列连接野生型LXRα的外显子6和7，在LXRα-64中产生了更长的外显子6。新外显子6包含所述野生型LXRα外显子6的全部，另外还包含来源于野生型LXRα内含子6序列(位于外显子6和外显子7之间)的额外序列。

SEQ ID NO：17是由SEQ ID NO：16编码的推断氨基酸序列。

SEQ ID NO：18是LXRα-42e独有的核苷酸序列，其与野生型LXRα的外显子8组合，在LXRα-42变体中产生了更长的外显子8。该序列长234个核苷酸，在126位含终止密码子(TAG)，因此随后的108个核苷酸是不翻译的。其在LXRα-42e^-和LXRα-42e⁺中都存在。

SEQ ID NO：19是由SEQ ID NO：18编码的推断氨基酸序列。

SEQ ID NO：20是用于本发明的LXRα效应元件(LXRE)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：21是引物L42-For的核苷酸序列。

SEQ ID NO：22是引物L42-Rev的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23是L42探针的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24是野生型(天然)LXRαcDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是LXRα-64cDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：26是LXRα-64cDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是野生型LXRαcDNA的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：28是LXRα-64cDNA的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：29是野生型LXRαcDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：30是LXRα-42e+cDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：31是LXRα-42e+cDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：32是野生型LXRα的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：33是LXRα-42e+cDNA的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：34是野生型LXRαcDNA的部分核苷酸序列。

IDS EQ ID NO：35是LXRα-42e-cDNA的部分核苷酸序列。

IDS EQ ID NO：36是LXRα-42e-cDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：37是野生型LXRαcDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：38是LXRα-42e-cDNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：39是野生型LXRα的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：40是LXRα-43e-的部分氨基酸序列。

发明详述

申请人成功鉴别和表征了LXRα基因的新剪接变体，其编码在本文分别称为LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-的新LXRα变体。新鉴别的序列产生的变体在结构和功能上不同于已知的LXRα蛋白。LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-变体分别由SEQ ID NO：3、SEQID NO：5和SEQ ID NO：7的多核苷酸序列编码，并代表了全长LXRαcDNA的可变变体。

基因组结构分析表明，新分离的变体LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-与野生型LXRα共有某些蛋白结构域和结构组成(图4、5和6)。RT-PCR分析揭示，本发明的变体mRNA转录物在肝脏中最丰富(图7A和7B)。更具体地说，LXRα-64在肝脏、小肠和胰脏中的表达最高。LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-在肝脏中的表达最高。在其它组织中的表达明显较低。三种LXRα亚型的N-端结构域、DNA结合结构域和铰链结构域与野生型LXRα的对应区域相同，而C-端结构域和配体结合结构域(LBD)具有某些变异性。与野生型LXRα相比，LXRα-64变体在其配体结合结构域中具有额外的64个氨基酸，LXRα-42e⁺具有替代的42个氨基酸，其由野生型LXRα序列的残基367开始，野生型LXRα的残基368至末端的C端(80个氨基酸)在该变体中不存在，因此没有存在于野生型LXRα中的部分配体结合结构域。LXRα-42e^-含349个氨基酸，没有由野生型LXRα的外显子6编码的60个氨基酸。由LXRα-42^-的氨基酸237开始，有71个氨基酸与野生型LXRα100％相同。后面的42个氨基酸与野生型完全不同。和LXRα-42⁺一样，野生型LXRα的C-端在LXRα-42e^-中不存在。

本文还证明了新型LXRα变体的功能在于它们可起野生型LXRα活性的显性负调控调节物的作用。另外，已经发现LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-变体在人单核细胞/巨噬细胞THP-1细胞中被LXR或RXR激动剂上调(图8)。而且，当新型LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-变体和报告基因共转染时，发现LXR配体依赖性活化急剧下降(图9和10)。在存在LXRα-64、LXRα激动剂的情况下(图11和12)，在某些情况下甚至在不存在LXRα激动剂时(图11)，LXR依赖性途径基因的配体依赖性诱导也下降。

三种新型LXRα变体还通过起显性负调控基因的作用，表现出拮抗天然(野生型)LXRα蛋白的生物/生化活性。LXRα蛋白的一部分，例如DNA结合结构域(DBD)，也可以活化野生型LXRα蛋白的生物/生化活性，有效性稍微低于野生型LXRα。

增加LXRα变体(例如LXRα-64)表达或活性用于治疗与SREBP-C1表达相关的疾病。例如，通过过表达LXRα-64或增加在细胞中表达的LXRα-64的活性(例如通过给予与野生型LXRα相比差异性结合LXRα-64的化合物)，破坏LXRα的活性，这可提供一种抑制胰岛素诱导SREBP-C1的方法，因此提供了一种抑制不需要的胰岛素诱导脂肪酸合成的方法。在另一个实例中，过表达LXRα变体(例如LXRα-64)或选择性活化LXRα变体(例如用差异性结合LXRα-变体的化合物)可导致抑制SREBP-C1，由此提供了一种治疗高甘油三酯血症的方法，该病症是心脏病的强烈预示。在另一个实例中，降低SREBP-C1表达(通过增加LXRα变体如LXRα-64的表达或活性)可导致VLDL-TG(极低密度脂蛋白甘油三酯)的表达降低，这是某些疾病如糖尿病和某些类型的高脂蛋白血症中需要的作用。野生型LXR具有上调ABCA1的作用，该作用与反向胆固醇运输有关，已经发现LXRα变体可抑制参与甘油三酯合成的SREBP-1C的基础表达。

核受体与RXR杂二聚化，这些杂二聚体的活化导致特定基因的表达增加。在不需要一种或多种这些基因表达的情况下(例如LXR介导的SREBP1c上调)，如果表达的LXRα变体结合RXR，由此降低二聚化的RXR的利用度，并因此降低对不需要的基因表达的诱导，则LXRα-64的过表达有益于受试者。

如下文更详尽的描述，本发明提供编码各种LXRα新型变体的分离核酸、其同源物和片段。本发明进一步提供增殖和表达本发明核酸的载体、含本发明核酸和载体的宿主细胞、本发明的蛋白、蛋白片段和蛋白融合物，以及全部变体中的任一种的特异性抗体。本发明提供药学或生理学可接受的组合物，其含有：本发明的多肽、多核苷酸和/或抗体，以及通常的生理学可接受的载体。本发明另外提供基于本发明的LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-核酸片段、多肽和抗体的诊断、研究和治疗方法。

定义

提供以下的定义和缩写是为了全面理解本说明书使用的术语和缩写。

如本文和所附权利要求书中所使用的一样，单数形式的“一个”和“一种”包括复数形式，除非上下文另外明确指出。因此，例如，所提及的“宿主细胞”包括多种这样的宿主细胞，所提及的“抗体”是指一种或多种抗体或本领域技术人员已知的其等同物，等等。

说明书中的缩写对应于以下测量单位、技术、特性或化合物：“min”表示分钟；“h”表示小时；“μL”表示微升；“mL”表示毫升；“mM”表示毫摩尔；“M”表示摩尔；“mmole”表示毫摩尔；“kb”表示千碱基；“bp”表示碱基对，而“IU”表示国际单位。

“Dulbecco改良型Eagle培养基”缩写为DMEM。

“高效液相层析”缩写为HPLC。

“高通量筛选”缩写为HTS。

“可读框”缩写为ORF。

“聚丙烯酰胺凝胶电泳”缩写为PAGE。

“十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳”缩写为SDS-PAGE。

“聚合酶链反应”缩写为PCR。

“逆转录酶聚合酶链反应”缩写为RT-PCR。

“肝X受体α”缩写为LXRα。

“类视黄醇X受体”缩写为RXR。RXR是指所有的RXR，包括RXRα、RXRβ、RXRγ及其组合。

“DNA结合结构域”缩写为DBD。

“配体结合结构域”缩写为LBD。

“非翻译区”缩写为UTR。

“十二烷基硫酸钠”缩写为SDS。

在本说明书的正文中，将使用许多术语。本文使用的术语“核酸分子”是指磷酸酯形式的核糖核苷酸(RNA分子)或脱氧核糖核苷酸(DNA分子)或任何磷酸酯类似物，其为单链形式或双链螺旋。可能存在双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。术语核酸分子，具体地说为DNA或RNA分子，仅指分子的一级和二级结构，没有将其限定为任何特定的三级形式。因此，该术语包括双链DNA，尤其是以线性(例如限制性片段)或环状DNA分子、质粒和染色体存在的双链DNA。在讨论具体双链DNA分子的结构时，可按照一般惯例描述序列，即仅沿着DNA非转录链(即序列对应于mRNA的链)以5′至3′方向给出序列。

“重组核酸分子”是指经历了分子生物学操作的核酸分子，或其来源于经历了生物学操作的分子(即非天然核酸分子)。而且，术语“重组DNA分子”是指非天然存在的核酸分子，或可通过人工组合两个在其它情况下分离的序列节段制备，即通过将一般不连续的DNA部分连接在一起制备。所述“重组产生的”是指生产非天然组合，经常通过化学合成方法或通过人工操作分离的核酸节段来实现，例如通过使用限制酶、连接酶的基因工程技术和例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，N.Y.；(1989)，或Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.(1989)，和 DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II(ed.D.N.Glover)IREL Press，Oxford，(1985)所述的类似重组技术实现。

在某些情况下，构建重组核酸分子，以用编码相同或保守氨基酸的冗余密码子代替密码子，同时通常导入或去除序列识别位点。或者，设计重组核酸分子用于将所需功能的核酸节段连接在一起，以产生含所需功能组合的、通常在所操作序列的天然形式中不存在的单个遗传实体。限制酶识别位点可为这种人工操作的靶，但其它的位点特异性靶如启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列或其它有用的特征可通过设计掺入。重组核酸分子的实例包括重组载体，例如含DNA序列的克隆或表达载体，其为5′至3′方向(有义)或3′至5′方向(反义)。适于制作含LXRα变体序列及其片段的重组载体(例如表达载体)的载体在本领域是已知的。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”、“基因”、“基因编码的mRNA”是指一系列在DNA和RNA中的核苷酸碱基(也称为核苷酸)，包括两个或更多个核苷酸的任何链、RNA或DNA(单链或双链、编码链、互补链或反义链)，或单链或双链形式的一个以上核苷酸的RNA/DNA杂合序列(尽管以上类别中的每个都可具体指定)。

多核苷酸可为嵌合混合物或衍生物，或其修饰形式，可为单链或双链。多核苷酸可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架部分进行修饰，以例如提升分子的稳定性或改变其杂交参数。反义多核苷酸可包含选自以下的修饰碱基部分：包括但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖苷Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、βD-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。核苷酸序列通常携带遗传信息，包括细胞机器(cellularmachinery)制备蛋白和酶所使用的信息。这些术语包括双链和单链基因组和cDNA、RNA、任何合成多核苷酸、遗传操作的多核苷酸以及有义和反义多核苷酸。其包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂合子，以及碱基结合氨基酸骨架所形成的“蛋白核酸”(PNA)。其还包括含修饰碱基的核酸，例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟尿嘧啶，或包括含碳水化合物或脂质的核酸。

“基因组DNA”是其核苷酸序列与基因同源的DNA链。作为实例，染色体DNA片段为基因组DNA。

在本发明的正文中，对常见的核酸碱基使用以下的缩写。“A”代表腺嘌呤，“C”代表胞嘧啶，“G”代表鸟嘌呤，“T”代表胸腺嘧啶，而“U”代表尿嘧啶。

可使用本领域已知的方法合成本发明的多核苷酸，例如使用自动化DNA合成仪(例如可由Biosearch，Applied Biosystems商购的自动化DNA合成仪)。作为实例，可利用Stein et al.，Nucl.Acids Res.，16，3209，(1988)的方法合成硫代磷酸寡核苷酸，可使用可控多孔玻璃聚合物支持体制备甲基磷酸寡核苷酸(Sarin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，7448-7451，(1988)。

为将反义DNA或RNA传递入细胞中，已开发了许多方法，例如可将反义分子直接注射入组织部位。设计用于靶向特定细胞的修饰反义分子(例如与可特异性结合在靶细胞表面上表达的受体或抗原的肽或抗体连接的反义核酸)可全身给予。反义RNA分子可通过体外或体内转录编码反义RNA分子的DNA序列产生。可将这种DNA序列掺入到各种整合了合适RNA聚合酶启动子(例如T7或SP6聚合酶启动子)的载体中。或者，可将反义构建物稳定导入细胞系中，其中所述反义构建物根据所使用的启动子组成型或诱导型合成反义RNA。为将反义构建物的胞内浓度提升至足以抑制靶向内源mRNA翻译的水平，人们可使用其中反义寡核苷酸处于强启动子控制之下的重组DNA构建物。这种构建物转染靶细胞的用途导致足量的单链RNA转录，其与内源靶基因转录物形成互补碱基对，由此防止靶基因mRNA转录。例如，可将载体体内导入，以使其被细胞吸收，并控制反义RNA在细胞中的转录。这种载体可保持为游离型，或者可成为染色体整合型，只要其可被转录生产需要的反义RNA。这种载体可通过本领域已知的重组DNA技术方法构建。载体可为质粒、病毒或本领域已知的适于在哺乳动物细胞中复制和表达的其它载体。可使用本领域已知的在哺乳动物如人细胞中起作用的任何启动子促进反义RNA编码序列的表达。这种启动子可为诱导型或组成型。这种启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon，Nature，290，304-310，(1981))、包含在Rous肉瘤病毒的3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto et al.，Cell，22，787-797，(1980))、疱疹胸腺嘧啶激酶启动子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，1441-1445，(1981))以及金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.，Nature296，39-42，(1982))。任一种类型的质粒、粘粒、酵母人工染色体或病毒载体都可用于制备可直接导入组织位点中的重组DNA构建物。或者，可使用选择性感染目的组织的病毒载体，在该情况下可通过另一途径实现给予(例如全身给予)。

核酶是有能力以类似于DNA限制性内切核酸酶的方式特异性切割单链RNA的RNA分子。通过修饰编码核酶的核苷酸序列，可将分子加工成识别RNA分子中的特异性核苷酸序列并对其切割(Cech，JAMA，260，3030，(1988))。该方法的主要优势在于：因为它们是序列特异性的，所以只有具有特异性序列的mRNA才失活。

本文描述的多核苷酸可位于天然调节(表达控制)序列侧翼，或者可与异源序列结合，包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它核糖体结合位点序列、增强子、效应元件、抑制基因、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5′-和3′-非编码区等。还可以通过本领域已知的其它方法修饰核酸。这种修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物置换一个或多个天然核苷酸以及核苷酸间修饰，例如具有不带电键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯或氨基甲酸酯)和带电键(例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)的核苷酸间修饰。多核苷酸可包含一个或多个另外的共价连接部分，例如蛋白(如核酸酶、毒素、抗体、单个肽或聚-L-赖氨酸)、嵌入剂(如吖啶或补骨脂素)、螯合剂(如金属、放射性金属、铁或氧化金属)以及烷化剂。多核苷酸可通过形成磷酸三酯(其中一个为甲酯或乙酯)或氨基磷酸烷基酯键而衍化。而且，还可用能够直接或间接提供可检测信号的标记修饰本文的多核苷酸。示例性的标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。

术语“上游”是指由特定参照点到多核苷酸的5′末端的位置。

术语“碱基配对的”和“Watson和Crick碱基配对的”在本文可互换使用，是指可利用其序列一致性相互氢键键合的核苷酸，键合方式类似于存在于双螺旋DNA中的方式：胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键连接至腺嘌呤残基，胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接(参见Stryer，(1995)Biochemistry，第4版，其公开内容通过引用整体结合到本文中)。

术语“外显子”是指存在于基因组DNA中的核酸序列，经预测(例如使用生物信息学)和/或凭经验确定其为成熟mRNA转录物提供连续序列。

术语“分支位点”和“3′接受位点”是指真核mRNA中3-剪接点的共有序列。几乎所有的内含子都以GU开始，以AG结尾。根据许多外显子-内含子的边界分析，已经确定了在5和3末端优选核苷酸的延长共有序列。除了AG以外，恰好位于3′剪接点上游的其它核苷酸对精确剪接也很重要(即分支位点共有序列YNYURAY和3′接受位点(Y)nNAG G)。

术语“编码多肽的核酸片段”包括仅含编码序列的多核苷酸以及含编码序列和其它编码或非编码序列的多核苷酸。

当单链形式的核酸分子可与另一核酸分子在合适的温度和溶液离子强度条件下退火时，核酸分子与另一核酸分子(例如cDNA、基因组DNA或RNA)“可杂交”(Sambrook，J.et al.eds.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd Ed.1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY.Vols.1-3(ISBN 0-87969-309-6)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格性”。为初步筛选同源核酸，可使用相当于T_m 55℃的低严格杂交条件，例如5×SSC、0.1％SDS、0.25％奶，无甲酰胺；或30％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS。中等严格杂交条件对应于较高的T_m，例如40％甲酰胺和5×或6×SSC。高严格杂交条件对应于较高的T_m，例如50％甲酰胺、5×或6×SSC。一般来说，高严格杂交条件是在6×SSC(1M NaCl)、50％甲酰胺、1％SDS、42℃下杂交，接着在1×SSC、0.1％SDS、42℃下漂洗20分钟，然后在0.2×SSC、0.1％SDS、68℃下漂洗3次，每次20分钟。杂交需要两种核酸含互补序列，尽管杂交取决于杂交的严格性，但有可能存在碱基错配。适于核酸杂交的严格性取决于本领域众所周知的变量：核酸长度和互补程度。两种核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有这些序列的核酸杂合子的T_m值越高。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的T_m)按以下顺序下降：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂合子，已经导出了计算T_m的方程式(Sambrook et al.eds.， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6)，9.50-9.51)。对于与较短的核酸(即寡核苷酸)杂交，错配的位置变得更重要，寡核苷酸的长度决定了其特异性(Sambrook et al.eds.， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3.(ISBN 0-87969-309-6)，11.7-11.8)。这种序列的T_m也可以计算，并确定合适的杂交条件。

本文描述的核酸分子包括在严格条件下与本文描述的LXRα变体编码序列及其互补序列杂交的核酸序列。对于本发明目的，术语“严格条件”指仅在核酸序列之间的一致性至少为90％(例如至少为95％)时发生杂交。因此，本发明还包括与所附序列表中报告的完整序列互补的分离核酸片段和与这些序列至少95％相同的序列，以及其序列与前述多核苷酸互补的多核苷酸。一般来说，与本文描述的LXRα变体编码序列的互补物杂交的本发明多核苷酸，其编码的多肽基本保留了和SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的cDNA编码的成熟LXRα多肽相同的生物学功能或活性。

氨基酸或核苷酸序列的“显著部分”是足量的多肽氨基酸序列或基因核苷酸序列，以便本领域技术人员直接评价序列，或使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，et al.，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；另参见ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)之类的算法通过计算机自动化序列比较和鉴别来推测鉴别该多肽或基因。一般来说，必须至少10个(例如至少15个、至少20个、至少25个或至少30个或更多个)连续核苷酸的序列来推测鉴别与已知蛋白或基因同源的多肽或核酸序列。而且，对于核苷酸序列，可在序列依赖性基因鉴别(例如DNA杂交)和分离(例如细菌菌落或噬菌斑原位杂交)方法中使用含15-30(例如20-30)个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针。另外，12-25个碱基(例如12-20个碱基、15-20个碱基)的短寡核苷酸可用作PCR中的扩增引物，以便获得含所述引物的特定核酸片段。因此，“显著部分”的核苷酸序列含所述序列的足量部分，以特异性鉴别和/或分离含所述序列的核酸片段。本发明教导了编码一种或多种特定LXR变体的部分或全部氨基酸序列和核苷酸序列。具有了本文报告的序列的益处，技术人员可使用公开序列的全部或显著部分用于本领域技术人员已知的用途。因此，本发明包含在所附序列表中报告的完整序列，以及如上定义的这些序列的显著部分。

术语“互补”用于描述互相能够杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。

本领域已知的“一致性”和“相似性”是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，其通过序列对比确定。在本领域，一致性还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，根据具体情况，通过这种序列链之间的匹配确定。一致性和相似性都可通过已知方法容易地计算，例如描述于以下的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford UniversityPress，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，e d.，Academic Press，New York，1993；Sequence Analysisin Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991。常用于确定序列之间一致性和相似性的方法包括但不限于在Carillo，H.andLipman，D.，SIAM J.Applied Math.48：1073(1988)中公开的方法。确定一致性和相似性的方法被编程为公众可获得的计算机程序。确定两个或更多个序列之间的一致性和相似性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Res.12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN和FASTA(Paschal，S.F.et al.，J.Molec.Biol.215：403(1990))。

术语“同源的”是指两种聚合物(即多肽分子或核酸分子)之间的序列相似程度。同源性百分率图在本文中用于反映两种聚合物之间的最大可能同源性，即两种聚合物比对以具有最大数目的匹配(同源)位置时的同源百分率。

术语“同源百分率”是指多肽之间的氨基酸序列一致性程度。任何两种多肽之间的同源性是在任一个序列中给定位置的匹配氨基酸总数的正函数，例如如果任一个序列中氨基酸总数的一半相同，则称两个序列具有50％同源性。

术语“直向同源物”是指经物种形成为同系物的基因或蛋白，例如基于结构和功能考虑紧密相关并假定具有共同谱系的基因或蛋白。直向同源蛋白一般在不同物种中具有相同功能和相同活性。术语“种内同源”是指经基因复制为同系物的基因或蛋白，例如基因组中基因的复制变体。另外参见Fritch，W M(1970)Syst.Zool.19：99-113。术语“直向同源物”可指另一个物种中的多肽，其对应于SEQ IDNO：4、6、8、17或19中提出的LXRα变体样多肽氨基酸序列。例如，小鼠和人LXRα样多肽被认为是相互的直向同源物。

术语“片段”、“类似物”和“衍生物”当涉及本发明的多肽(例如SEQ ID NO：4、6、8、17和19)时，可指基本保留所涉及多肽的至少一种生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括可通过切割前体蛋白部分产生活性成熟多肽而活化的前体蛋白。本文描述的多肽(例如SEQ ID NO：4、6、8、17和19)的片段、类似物或衍生物可具有保守或非保守氨基酸置换。置换的氨基酸残基可由或可不由遗传密码编码，或者置换可为一个或多个置换的氨基酸残基含取代基的置换、其中多肽与化合物(例如聚乙二醇)融合以增加多肽半衰期的置换，或其中另外的氨基酸与多肽(如信号肽或序列如用于纯化多肽或前体蛋白的聚组氨酸标记)融合的置换。这种片段、类似物或衍生物实际上属于本发明的范围。

多核苷酸序列的“保守”残基是在要对比的两个或更多个相关序列的相同位置未发生改变的残基。相对保守的残基是在更多相关的序列中与出现在序列中其它位置的残基相比保守的残基。

相关的多核苷酸是共有显著部分的相同残基的多核苷酸。

不同的多核苷酸相互“对应”，假设一个最终得自另一个的话。例如，mRNA对应于转录其的基因。cDNA对应于产生其的RNA，例如通过反转录反应或通过基于RNA序列信息的DNA化学合成产生。cDNA还对应于编码RNA的基因。如果多核苷酸具有相似的功能，例如在要比较的不同物种、菌株或变体中编码相关多肽，则多核苷酸也相互“对应”。

DNA、RNA或多核苷酸的“类似物”是指在形式和/或功能(例如参与和互补多核苷酸序列上的碱基对序列特异性氢键键合的能力)上类似于天然多核苷酸、但与DNA或RNA在例如具有不常见或非天然碱基或改变的骨架方面不同的分子。参见例如Uhlmann et al.，Chemical Reviews 90，543-584，(1990)。

术语“天然的”在应用于目标对象时，是指目标对象可天然存在的事实。例如，存在于生物(包括细菌)中、可分离自天然来源并未经实验室人员故意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然的。本文使用的术语“天然的”用于指已知的LXRα，也称为“野生型”LXRα。此术语的这种用法不应被解释为指本文描述的LXRα变体是非天然的。

“编码序列”或“编码”表达产物(例如RNA、多肽、蛋白或酶)的序列为表达时导致产生该RNA、多肽、蛋白或酶的核苷酸序列，即可编码多肽或蛋白(例如酶)的氨基酸序列的核苷酸序列。

术语“密码简并”是指遗传密码的分散，其允许改变多核苷酸序列，但不影响编码多肽的氨基酸序列。因此，本发明涉及编码全部或显著部分的氨基酸序列的任何核酸片段或其互补物，该氨基酸序列编码SEQ ID NO：4、6和8提出的LXRα-64、LXRα-42e⁺或LXRα-42e^-蛋白。技术人员非常了解特定宿主细胞表现的使用核苷酸密码子指定给定氨基酸的“密码子偏倚”。因此，当在宿主细胞中合成表达改进的基因时，期望设计该基因，使得其密码子选择的频率接近宿主细胞优选密码子选择的频率。

术语“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列在生物过程中用作其它聚合物和大分子的合成模板的固有特性，该聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列，以及由此形成的生物特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白，则该基因编码该蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同的编码链(通常在序列表中提供)和用作基因或cDNA转录模板的非编码链，都可称作编码蛋白或该基因或cDNA的其它产物。

本发明的多核苷酸可为RNA形式或DNA形式，所述DNA包括cDNA和合成DNA。DNA可为单链或双链。如果其为单链，则其可为编码链或非编码(反义)链。编码序列可与SEQ ID NO：3、5、7、16、18或其片段中任一个的编码序列相同，或可为由于遗传密码的简并性或冗余性而与参比编码序列(例如SEQ ID NO：3、5、7、16、18或其片段之一)编码相同多肽的不同编码序列。

本发明包括本文描述的上文所述多核苷酸的变体，其编码由SEQID NO：4、6、8、17或19的推断氨基酸序列所表征的多核苷酸的片段、类似物和衍生物。多核苷酸变体可为多核苷酸的天然等位基因变体，或为多核苷酸的非天然变体。

本发明的多核苷酸的编码序列可为由SEQ ID NO：4、6、8、17或19的DNA序列所表征的编码序列的天然等位基因变体。

编码成熟多肽即LXRα的多核苷酸可仅含成熟多肽的编码序列，或者可含成熟多肽的编码序列和其它序列，例如基因控制序列、调节序列或分泌序列。

因此，本发明包括多核苷酸，使得成熟多肽的编码序列按照相同读框有效连接至有助于表达和从宿主细胞分泌多肽的多核苷酸序列(例如信号肽)。多核苷酸还可编码前体蛋白。

本发明多核苷酸还可具有编码序列，其按照读诓融合至标记序列，例如在基因的3′或5′端以例如允许纯化多肽的六组氨酸标记(Qiagen Inc.)。

“合成基因”可由使用本领域技术人员已知方法化学合成的寡核苷酸结构单元装配。连接并退火这些结构单元，形成基因节段，然后酶促组装这些节段，以构建完整基因。“化学合成的”在涉及DNA序列时指体外组装组成核苷酸。可使用众所周知的方法完成DNA的人工化学合成，或者可使用众多市售机器中的一种进行自动化化学合成。因此，可根据反映宿主细胞密码子偏倚的优化核苷酸序列设计出最优基因表达的基因。如果密码子选择偏向于宿主喜欢的密码子，则技术人员了解基因表达成功的可能性。优选密码子的确定可基于考察获得序列信息的宿主细胞来源的基因。

术语“基因”指表达特定蛋白的核酸片段，包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”或“嵌合构建物”指非天然基因的任何基因或构建物，其含有天然不一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因或嵌合构建物可包含得自不同来源的调节序列和编码序列，或者得自相同来源但以不同于天然存在方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”指在生物体基因组中其天然位置的天然基因。“外源”基因指一般不存在于宿主生物中、但通过基因转移导入宿主生物中的基因。外源基因可包括插入到非天然生物中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组中的基因。

“靶基因”、“靶基因序列”、“靶DNA序列”或“靶序列”指基因、其RNA转录物或其蛋白产物受转录因子调节的基因。靶序列可包括完整基因、外显子、内含子、调节序列或基因之间的任何区域。靶基因可包含受试者基因组DNA中的一部分特定基因或基因座。本文使用的“靶基因”指参与LXR反应途径的差异性表达基因。“差异性表达”指基因的时间和/或组织表达模式中的定量和定性差异。LXR靶基因的实例是SREBP-1c(甾醇调节结合元件1c)、FAS、CYP7A1(胆固醇7-α羟化酶)、ApoE、CETP(胆固醇酯转移蛋白)、LPL(脂蛋白脂酶)、ABCA1(ATP-结合盒转运体-1)、ABCG1、ABCG5、ABCG8、ABCG4和PLTP(磷脂转移蛋白)(Edwards et al.Vasc.Pharmaco1.38，(2002)249-256)。术语“调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、当中或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其影响例如所连编码序列的转录、RNA加工、RNA稳定性或翻译。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。

术语“基因控制序列”指启动基因转录所需的DNA序列加上调节启动发生速率所需的DNA序列。因此，基因控制序列可由启动子(通常转录因子和聚合酶组装的位置)加上结合基因调节蛋白来控制启动子上这些组装过程速率的全部调节序列组成。例如，适于原核生物的控制序列可包括启动子、任选的操纵基因序列以及核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、增强子和/或聚腺苷酸化信号。

术语“启动子”指能够控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般来说，编码序列位于启动子序列的3′。启动子序列由邻近的和更远的上游元件组成，后一元件经常被称为增强子。因此，“增强子”是可刺激启动子活性的核苷酸序列，其可为启动子的先天性元件，或者可为插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可全部来源于天然基因，或可由来源于天然存在的不同启动子的不同元件组成，甚至可包含合成核苷酸节段。本领域技术人员应理解的是，不同启动子可控制基因在不同组织或细胞类型中表达，或在不同发育阶段或响应不同环境条件而表达。

术语“3′非编码序列”指位于编码序列下游的核苷酸序列，包括聚腺苷酸化识别序列和其它能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的编码序列。聚腺苷酸化信号通常其特征为将聚腺苷酸段加入到mRNA前体的3′末端的作用。

术语“翻译前导序列”指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于完全加工的mRNA中翻译起始序列的上游。翻译前导序列可对初级转录物加工为mRNA、mRNA稳定性或翻译效率起作用。

术语“有效连接”指两个或更多个核酸片段结合在单个核酸片段上，使得一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即编码序列处于启动子转录控制之下)时，启动子和编码序列有效连接。编码序列可以有义或反义方向与调节序列有效连接。

术语“结构域”指具有特定生物特性的氨基酸片段。该术语包含所有已知的结构和线性生物基序。这种基序的实例包括但不限于螺旋-转角-螺旋基序、亮氨酸拉链、糖基化位点、泛素化位点、α螺旋和β折叠、引导蛋白分泌的信号肽、翻译后修饰位点、酶活性位点、底物结合位点和酶切割位点。

“DNA结合结构域”指DNA结合蛋白与脱氧核糖核苷酸链特异性相互作用的任何部分。序列特异性DNA结合蛋白结合特异性序列或相互之间显示高度序列一致性的特异性序列家族。

术语“LBD”或“配体结合结构域”指核受体的结合配体(例如类固醇激素)的蛋白结构域，该核受体例如类固醇超家族受体或本文讨论的其它合适核受体。

术语“报告基因”指其编码产物的表达可通过物理、免疫学、化学、生物化学或生物学实验检测和/或计量的任何基因。报告基因产物例如可具有一种以下特征(不是限制性)：特异性核酸芯片杂交模式、荧光(例如绿色荧光蛋白)、酶活性、毒性或特异性结合第二种标记或未标记分子的能力。

术语“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录形成的产物。当RNA转录物是DNA序列的互补拷贝时，其被称为初级转录物，或者其可为来源于初级转录物转录后加工的RNA序列，被称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指无内含子的RNA，可被细胞翻译成多肽。“cDNA”指与mRNA模板互补并来源于mRNA模板的DNA。cDNA可为单链形式，或可使用例如DNA聚合酶1的Klenow片段转变为双链形式。

与部分RNA“互补”的序列指互补性足以能够和RNA杂交形成稳定双链体的序列；因此，在双链反义核酸的情况下，可测试双链DNA的单链，或者可测定三链体形成。杂交能力取决于互补性程度和反义核酸长度。反义RNA的互补性可在特异性核苷酸序列的任何部分中，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列中。一般来说，杂交核酸越长，其可包含越多的RNA错配碱基并仍形成稳定双链体(或三链体，视情况而定)。本领域技术人员可使用标准方法测定杂交复合物的解链温度，来确定容许的错配程度。

“功能RNA”指有义RNA、反义RNA、核酶RNA或其它不被翻译但仍对细胞进程有影响的RNA。

具体多核苷酸的“反义”拷贝指能够与多核苷酸氢键键合并因此能够调节多核苷酸表达的互补序列。这些“反义”拷贝为DNA、RNA或其类似物，包括如上所述的具有改变骨架的类似物。结合反义拷贝的多核苷酸可为单链形式或双链形式。以“反义方向”连接至启动子的DNA序列可连接至启动子，使得产生与靶基因的编码mRNA互补的RNA分子。

反义多核苷酸可包含至少一种选自以下的修饰糖部分：包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。在一个实施方案中，反义寡核苷酸可包含至少一种选自以下的修饰磷酸酯骨架：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸烷基酯三酯(alkyl phosphotriester)及甲缩醛(formacetal)或其类似物。

术语“有义”指和编码mRNA核酸序列方向相同的核酸序列。连接以“有义方向”连接启动子的DNA序列，使得含与mRNA相同序列的RNA分子被转录。但是，产生的RNA分子不需要被转录为功能蛋白。

“有义”链和“反义”链当在相同上下文中使用时，指相互互补的单链多核苷酸。它们可为双链多核苷酸的对立链，或者可按照公认的碱基配对规则由一条链预测另一条链。除非另有说明或暗示，否则分配一条链或另一条链为“有义”或“反义”是任意的。

术语“多核苷酸编码多肽”包括可仅含编码序列的多核苷酸，以及可含另外的编码或非编码序列的多核苷酸。

术语“siRNA”或“RNAi”指小干扰RNA和其起作用的过程。siRNA能够引起RNA干扰，并可引起细胞(如哺乳动物细胞(包括人细胞))和机体(如哺乳动物机体(包括人))中特定基因的转录后沉默。RNA干扰现象描述和讨论于Bass，Nature，411，428-29，(2001)；Elbahiret al.，Nature，411，494-98，(2001)；和Fire et al.，Nature，391，806-11，(1998)，其中还讨论了制备干扰RNA的方法。基于本文公开序列的siRNA可利用本领域已知的方法制备，包括使用互补DNA链或合成方法。示例性的siRNA可具有最多达29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bp或在此附近或在此之间的任何整数。

本文使用的术语“表达”指来源于本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还可以指mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指生产能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。

术语“过表达”指在转基因生物中生产的基因产物超出了在正常或非转化生物中的生产水平。“共抑制”指生产的有义RNA转录物能够抑制相同或基本相似的外源或内源基因的表达(美国专利No.5,231,020，通过引用结合到本文中)。

术语“改变的水平”指以不同于正常或非转化生物的量或比例在转化生物中生产基因产物。本发明多肽的过表达可通过以下步骤实现：首先构建其中编码区有效连接至启动子的嵌合基因或嵌合构建物，所述启动子能够控制基因或构建物在目的组织中于需要的发育阶段表达。为方便起见，嵌合基因或嵌合构建物可含有来源于相同基因的启动子序列和翻译前导序列。还可提供编码转录终止信号的3′非编码序列。所述嵌合基因或嵌合构建物还可含有一个或多个内含子，以便于基因表达。然后可构建含所述嵌合基因或嵌合构建物的质粒载体。质粒载体的选择取决于用于转化宿主细胞的方法。技术人员非常了解必须存在于质粒载体上以便成功转化、选择和增殖含嵌合基因或嵌合构建物的宿主细胞的遗传元件。技术人员还认识到不同的独立转化事件产生不同的表达水平和模式(Jones et al.，1985，EMBO J.4：2411-2418；De Almeida et al.，1989，Mol.Gen.Genetics 218：78-86)，因此，为了获得表现出所需表达水平和模式的谱系，必须筛选多个事件。这种筛选可利用DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白质表达的Western分析或表型分析实现。

术语“盒”或“表达盒”指可在限定的限制位点插入到载体中的DNA编码序列或编码表达产物的DNA节段。盒限制位点设计用于确保盒以正确的读框插入。一般来说，外源DNA插入在载体DNA的一个或多个限制位点上，然后连同可传递载体DNA一起由载体携带进入宿主细胞。具有插入或添加的DNA的DNA节段或序列，如表达载体，也可以称为“DNA构建物”。

术语“表达系统”指处于合适条件下的宿主细胞和相容载体，例如适于由载体携带并导入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白表达的条件。常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。

术语“转染”指外源多核苷酸插入到宿主细胞中，与使用的插入方法或插入的多核苷酸的分子形式无关。其包括插入的多核苷酸本身和插入的组成外源多核苷酸的载体或质粒。外源多核苷酸可由细胞转录和翻译，并保持为非整合载体，如质粒，或可稳定整合入宿主基因组。

术语“转化的”指任何将核酸片段插入到宿主原核细胞中的已知方法。术语“转染的”指任何将核酸片段插入到宿主真核细胞中的已知方法。这种转化或转染细胞包括使插入的DNA能够在宿主细胞中复制的稳定转化或转染细胞。其还包括在有限的时间段内表达插入DNA或RNA的瞬时表达细胞。转化或转染方法取决于要转化的宿主细胞。其可包括将核酸片段封装入病毒中，以及直接摄入核酸片段，例如电穿孔、脂转染或微注射。转化和转染可使插入的DNA掺入到宿主细胞基因组中，或将插入的DNA以质粒形式保持在宿主细胞中。转化方法在本领域众所周知，包括但不限于脂转染、电穿孔、病毒感染和磷酸钙介导的直接摄取。转染方法在本领域是已知的，包括磷酸钙DNA共沉淀(Methods in Molecular Biology，Vol.7，Gene Transfer and Expression Protocols，Ed.E.J.Murray，Humana Press(1991))、DEAE-葡聚糖、电穿孔、阳离子脂质体介导的转染和钨颗粒推动的微粒轰击(Johnston，Nature 346：776-777(1990))。磷酸锶DNA共沉淀(Brash et al.，Molec.Cell.Biol.7：2031-2034(1987))是替代性转染方法。

术语“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文可互换使用。要理解地是，这种术语不仅指特定的目标细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境的影响，某些修饰可在后代出现，所以这种后代可能与亲代细胞不完全相同，但其仍包括在本文使用的术语的范围内。术语“重组细胞”指含异源核酸的细胞，术语“天然细胞”指不含人工导入的异源核酸的细胞。

细胞可为原核或真核细胞。典型的原核宿主细胞包括各种大肠杆菌菌株。典型的真核宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞或人胚肾293细胞(HEK 293细胞)。导入的DNA通常为含DNA插入部分的载体形式。导入的DNA序列可来自和宿主细胞相同的物种或和宿主细胞不同的物种，或者其可为含某些外源DNA和某些同源DNA的杂合DNA序列。进一步要理解地是，这些术语不仅指特定的目标细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境的影响，某些修饰可在后代出现，所以这种后代可能实际上与亲代细胞不完全相同，但其仍包含在本文使用的术语的范围内。

术语“克隆”指来源于单个细胞或有丝分裂共同祖先的细胞群。“细胞系”指能够在体外稳定生长数代的初级细胞的克隆。

术语“细胞生长”指细胞群大小的增加。

术语“细胞分裂”指有丝分裂，即细胞再生的过程。

术语“增殖”指细胞的生长和分裂。“活性增殖”指活跃生长和分裂的细胞。

术语“分化”指具有与原型组织或细胞不同的特征或功能。因此，“分化”是分化的过程或作用。

术语“基因诱导型系统”指使用配体调节基因表达。已经开发了几种利用小分子诱导基因表达的调节系统(综述于Clackson，Curr.Opin.Chem.Biol.，1，210-218，(1997)；Lewandoski，Nat Rev Genet.2，743-755，(2001))。基因诱导型系统是一种分子工具，当系统未激活时允许靶基因低至不可检测的基础表达，当系统激活时增加靶基因的表达水平。

术语“抑制细胞增殖”指减慢和/或防止细胞的生长和分裂。可根据在特定细胞周期阶段的停滞进一步将细胞分为：G1(间期1)、S期(DNA合成)、G2(间期2)或M期(有丝分裂)。

术语“优选抑制细胞增殖”指和正常细胞相比减慢和/或防止细胞的生长和分裂。

术语“凋亡”指当年龄或细胞健康状况和环境发出指示时，由正常功能性人和动物细胞中的细胞核发出信号的程序性细胞死亡。“凋亡”是垂死细胞的主动过程，需要代谢活性，常以将DNA切割成片段而在凝胶上产生所谓的梯状模式为特征。凋亡死亡的细胞通常不激发与坏死相关的炎症反应，但原因不清楚。但是，癌细胞不能经历或缩减了正常细胞转导或凋亡驱动的天然细胞死亡进程。在形态学上，凋亡的特征在于不与邻近细胞接触、胞质浓缩、内切核酸酶活性相关的染色质凝聚和核固缩，以及核分节等。

术语“多肽”指氨基酸聚合物，和聚合物长度无关；因此，“肽”、“寡肽”和“蛋白”包括在多肽定义中，在本文可互换使用。该术语指天然或合成的氨基酸单体(残基)聚合物，与长度无关，其中此处的氨基酸单体包括能够参与肽键的天然氨基酸、天然氨基酸结构变体或合成非天然类似物。该术语也没有指定或排除本发明多肽的化学或表达后修饰，但根据具体实施方案可包括或排除这些多肽的化学或表达后修饰。因此，例如，包括共价连接糖基基团、酰基基团、磷酸基团、脂质基团等的多肽修饰清楚地包含在术语多肽中。而且，具有这些修饰的多肽可作为单个类别包含或排除于本发明。天然或其它化学修饰，例如列于上文的实例，可出现在多肽中的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端。要认识到，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定多肽中的数个位点。另外，给定多肽可包含多种类型的修饰。多肽可为例如由于泛素化所致的分支形式，可为有或没有分支的环状。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚定、羟化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导氨基酸加入到蛋白中(例如精氨酰化)以及泛素化(参见例如proteins-structure and molecular properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；posttranslationalcovalent modification of proteins，b.c.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1-12页，1983；Seifter et al.，Meth.Enzymol.182：626-646，1990；Rattan et al.，Ann.NY Acad.Sci.663：48-62，1992)。该定义还包括含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸、仅天然存在于不相关生物体系中的氨基酸或哺乳动物系统的修饰氨基酸)、具有取代键以及本领域已知其它修饰的天然和非天然多肽。术语“多肽”还可和术语“蛋白”或“肽”互换使用。

术语“肽”指两个或更多个氨基酸的任何聚合物，其中每个氨基酸经肽键(-CONH-)连接至一个或两个其它氨基酸，肽键在相邻氨基酸的NH₂和COOH基团之间形成。氨基酸优选为天然氨基酸，具体地说为L-对映体形式的α-氨基酸。但是，其它氨基酸、对映体形式和氨基酸衍生物可包括在肽中。肽包括“多肽”，其在水解作用下产生两个以上的氨基酸。多肽可包括蛋白，其通常含50个或更多氨基酸。本文的术语“寡肽”表示具有25个或更少单体亚单位的蛋白、多肽或肽。

“变体”指不同于参比多核苷酸或多肽但保留其基本特性的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸变体的核苷酸序列不同于参比多核苷酸。变体核苷酸序列的变化可改变或不改变参比多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所述，核苷酸变化可在参比序列编码的多肽中产生氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短。

术语“变体”指分别不同于参比多肽的一个或多个多肽。一般来说，氨基酸序列和参比多肽不同的多肽和参比多肽之间的差异是有限的，以使参比和变体的氨基酸序列整体上紧密相似，在某些区域可能相同。变体和参比多肽的氨基酸序列可相差一个或多个可以任何组合存在的置换、缺失、添加、融合或截短。置换或插入的氨基酸残基可由或可不由遗传密码编码。典型的保守置换包括：Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；以及Phe和Tyr。另外，变体可为本发明多肽的片段，其与参比多肽序列的差异在于比参比序列短(例如末端或中间缺失)。本发明多肽的变体还包括基本保留与所述多肽相同的生物学功能和活性的多肽，例如可通过切割前体部分产生活性成熟多肽而活化的前体蛋白。而且，变体可为(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)置换的变体，这种置换的氨基酸残基可由或可不由遗传密码编码，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基含取代基的变体，或(iii)其中成熟多肽与另一种化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的变体，或(iv)其中另外的氨基酸融合至成熟多肽(例如前导序列或分泌序列，或用于纯化成熟多肽的序列，或前体蛋白序列)的变体。多肽变体还可为天然变体，例如天然等位基因变体，或者其可为已知非天然存在的变体。非天然存在的多核苷酸和多肽变体可通过诱变技术或直接合成制备。变体还包括具有一种或多种翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、甲基化、ADP核糖基化等)的多肽。实施方案包括甲基化N-端氨基酸、磷酸化丝氨酸和苏氨酸以及修饰C-端甘氨酸。在这点上，多肽变体包括由于氨基酸置换、缺失或添加而与前述多肽不同的变体。置换、缺失或添加可涉及一个或多个氨基酸。氨基酸序列的改变可为保守或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。根据本文教导和本领域知识，以上定义的所有这些变体都被认为在本领域技术人员的范围内。

本文描述的被称为LXRα-64(SEQ ID NO：4)的LXRα变体由于含有DNA结合结构域和配体结合结构域，与先前已知的LXRα同源；但是，由于其含有64个新氨基酸，其与已知的LXRα在序列的中间部分不同。由于其氨基酸序列的部分一致性和部分趋异性，变体和已知同源物可具有某些共同的功能，但在其它功能上可能不同。例如，已知野生型LXRα为细胞氧甾醇的感应器，当其被激动剂活化时，控制甾醇和脂肪酸代谢/稳态的基因的表达增加，而LXRα-L64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-起野生型LXRα的显性负调控调节物的作用。

术语“显性负调控多肽”指蛋白的失活变体，其通过与细胞机器相互作用而取代了与细胞机器相互作用的活性蛋白或与活性蛋白竞争，由此减弱了活性蛋白的作用。例如，结合配体但不响应配体结合而传送信号的显性负调控受体可降低配体表达的生物学作用。同样，显性负调控的催化失活激酶一般与靶蛋白相互作用，但不磷酸化靶蛋白，其可降低响应细胞信号的靶蛋白磷酸化。类似地，显性负调控转录因子结合基因控制区中的启动子位点，但不增加基因转录，其可通过占据启动子结合位点但不增加转录而降低一般正常转录因子的作用。

术语“剪接变体”指由RNA分子产生的cDNA分子，RNA分子最初由相同的基因组DNA序列转录，但其经历了可变RNA剪接。当初级RNA转录物经历剪接时发生可变RNA剪接，一般用于去除内含子，导致产生一个以上的mRNA分子，它们每个都可编码不同的氨基酸序列。术语剪接变体还可指以上cDNA分子编码的蛋白。剪接变体在序列上可部分地与已知同源基因产物相同。“多个剪接变体”指具有不相同的一级氨基酸序列但共有由至少一个相同外显子编码的氨基酸序列的多个蛋白。

本文使用的短语“可变剪接”及其语言学等意词包括所有类型的RNA加工，其导致单个基因表达多个蛋白同种型；因此，短语“可变剪接”及其语言学等意词包括由给定基因转录但加工过的mRNA，其共同地编码多个蛋白同种型。例如，仅作为说明，剪接变体可包括外显子插入、外显子延伸、外显子截短、外显子缺失、在5′非翻译区(“5′UT”)中的变化和在3′非翻译区(“3′UT”)中的变化。这种3′变化包括例如RNA转录物切割位点中的差异和聚腺苷酸添加位点中的差异(例如Gautheret et al.，Genome Res.8：524-530(1998))。

术语“分离的”指将材料由其原始或天然环境(例如其天然存在的自然环境)中取出。因此，存在于活体动物中的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但通过人为干预由天然系统中某些或全部共存材料中分离的相同多核苷酸或多肽是分离的。例如，“分离的核酸片段”是RNA或DNA聚合物，其为单链或双链，任选含合成的、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离核酸片段可由一个或多个cDNA、基因组DNA或合成DNA节段组成。这种多核苷酸可为载体的一部分，在异源位点整合入宿主细胞染色体，和/或这种多核苷酸或多肽可为组合物的一部分，由于这种载体或组合物不是其天然存在环境的一部分，所以仍然是分离的。

术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，其意为相对的定义。本发明明确预期原料或天然材料纯化至少一个数量级，优选2或3个数量级，更优选4或5个数量级。同样地，术语“基本纯化的”指已通过人为干预由其天然存在的直接化学环境中分离或除去的物质。基本纯化的的多肽或核酸可通过本领域周知的多种技术和方法中的任一种获得或产生。

术语“纯化的”在本文中进一步用于描述已由其它化合物(包括但不限于多肽、多核苷酸、碳水化合物或脂质)中分离出来的本发明多肽或多核苷酸。术语“纯化的”可用于表示由寡聚形式如同二聚体、杂二聚体或三聚体中分离本发明的单体多肽。术语“纯化的”还可用于表示由线性多核苷酸中分离共价闭合(即环状)的多核苷酸。基本纯化的多肽或多核苷酸通常分别包含多肽或多核苷酸样品的约50％(重量/重量)，优选60-90％(重量/重量)，更通常约95％纯，优选超过约99％纯，但可指定为50和100之间的任何整数的百分率。多肽和多核苷酸纯度或均一性由本领域众所周知的多种方法显示，例如样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着在染色凝胶后目测单一条带。对于某些目的，可通过使用HPLC或本领域已知的其它方法提供较高分辨率。作为替代的实施方案，本发明多肽和多核苷酸的纯化可表示为相对于异源多肽和多核苷酸(DNA、RNA或二者)的“至少”某个百分率纯度。在一个实施方案中，本发明的多肽和多核苷酸相对于异源多肽和多核苷酸分别为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或100％纯。在另一个实施方案中，相对于异源多肽和多核苷酸，多肽和多核苷酸的纯度分别为90％和100％之间达到千分之一位的任何数值(例如多肽和多核苷酸至少99.995％纯)，或者为相对于所有化合物和分子(载体中存在的化合物和分子除外)的重量/重量比率。每个代表纯度百分率的达到千分之一位的数值都可作为单个纯度类别要求保护。

当蛋白以天然不存在的纯度(其中纯度可相对于存在的其它序列蛋白、相对于存在的非蛋白化合物如核酸、脂质或其它生物细胞组分进行判断)存在时，或者以天然不存在的组合物(例如在天然不表达该蛋白的宿主细胞中)存在时，可认为蛋白是“分离的”。

本发明的多肽和多核苷酸优选以分离形式提供，并优选纯化至均一。

术语“成熟”蛋白指翻译后加工过的多肽；即已经由其中去除了初级翻译产物中存在的任何前肽或原肽的多肽。“前体”蛋白指mRNA的初级翻译产物；即仍存在前肽和原肽。前肽和原肽包括但不限于胞内定位信号。

术语“抗体”指多肽，其至少一部分由至少一个免疫球蛋白基因或其片段编码，其可特异性结合目的靶分子。该术语包括天然形式以及片段和衍生物。

片段可包括各种蛋白酶消化产生的片段、化学切割和/或化学解离产生的片段以及重组产生的片段，只要片段仍能够特异性结合靶分子。这些片段包括Fab、Fab′、Fv、F(ab)′₂和单链Fv(scFv)片段。属于该术语范围的衍生物包括序列已经修饰但仍能够特异性结合靶分子的抗体(或其片段)，包括：种间嵌合和人源化抗体、抗体融合物、异数(heteromeric)抗体复合物和抗体融合物，例如双功能抗体(双特异性抗体)、单链双功能抗体和胞内抗体(参见例如Marasco(ed.)，Intracellular Antibodies：Research and Disease Applications，Springer-Verlag New York，Inc.(1998)(ISBN：3540641513)，其公开内容通过引用整体结合到本文中)。

术语“免疫反应性”指与抗体“免疫反应”的多肽，即由于抗体识别多肽中包含的特异性表位而与抗体结合的多肽。免疫反应性可通过抗体结合测定，更具体地说通过抗体结合的动力学和/或使用已知多肽竞争剂竞争结合而测定，其中所述已知多肽含所述抗体针对的表位。测定多肽是否与抗体免疫反应的技术是本领域已知的。“免疫反应性”多肽也可以是“免疫原性”的。

抗体可通过任何已知技术产生，包括由天然B淋巴细胞的细胞培养物收集、由杂交瘤、重组表达系统和噬菌体的培养物展示收集。

能够与免疫系统的抗原识别分子(例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性相互作用的分子是“抗原性”的。抗原性多肽含至少约5个、优选至少约10个氨基酸。分子的抗原部分可为对抗体或T细胞受体识别免疫显性的部分，或者其可为用于产生该分子抗体的部分，抗体通过将抗原部分缀合至载体分子进行免疫产生。抗原性分子自身不需要具有免疫原性，即能够在没有载体的情况下激发免疫应答。和抗体接触的抗原部分被命名为“表位”。

术语“分子结合配偶体”以及等同的“特异性结合配偶体”指一对分子，通常为一对生物分子，其具有特异结合性。非限制性实例是受体和配体、抗体和抗原，以及生物素对抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、NeutrAvidin^TM和CaptAvidin^TM中的任一种。

术语“结合配偶体”或“相互作用蛋白”指能够特异性识别特定分子或分子复合物或被特定分子或分子复合物特异性识别的分子或分子复合物，例如抗原和抗原特异性抗体，或酶及其抑制剂。结合配偶体可包括例如生物素和抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、IgG和A蛋白、受体-配体对、蛋白-蛋白相互作用，以及互补多核苷酸链。术语“结合配偶体”还可以指在细胞中结合多肽的多肽、脂质、小分子或核酸。蛋白和结合配偶体之间的相互作用的变化自身可表现为相互作用形成可能性增加或降低，或蛋白-结合配偶体复合物的浓度增加或降低。例如，LXRα-64或LXRα-42蛋白可与另一种蛋白或多肽结合，并形成可调节LXR或RXR活性的复合物。

“特异性结合”指共存于异质(不均一)样品中的两个分子类别相比于样品中的其它分子类别优先相互结合的能力。通常，特异性结合相互作用与反应中的偶然结合相互作用差别至少为2倍，更通常至少10倍，经常至少100倍；当用于检测分析物时，特异性结合足以区分异质(不均一)样品中分析物的存在。

术语“二聚化”指两个蛋白多肽通过共价或非共价相互作用结合的特定多聚分子。“二聚化分子”可为由两个相同(同二聚)或不同(杂二聚)蛋白分子亚单位组成的受体。

术语“同二聚体”指其中两个亚单位组分基本相同的二聚化分子，例如RXR和RXR。“同二聚复合物”指两个相同受体(例如RXR/RXR)之间的蛋白复合物。“同二聚复合物”可包括具有较小微观不均一性的二聚化蛋白，其有时在生产或加工重组蛋白时产生。术语“同二聚化”指两个相同亚单位(例如RXR和RXR)二聚化的过程。

术语“杂二聚体”指其中两个亚单位组分不同的二聚化分子，例如RXR和LXR。术语“杂二聚复合物”指任一种核受体之间的蛋白复合物(例如RXR和任一种本发明变体，或RXR和LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR)。术语“杂二聚化”指两个不同亚单位(例如RXR和LXRα-64)二聚化的过程。

术语“天然杂二聚化”指分子(例如多肽)通常天然与不同分子杂二聚化的过程。例如，与RXR天然杂二聚化的多肽是核受体，其通常与天然RXR如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR杂二聚化。

术语“LXR效应途径”指本领域已知的参与核受体(例如LXR或RXR)活化或失活的任一种途径，该途径至少部分由LXR介导。

术语“信号转导途径”指将胞外信号传导通过细胞膜成为胞内信号的分子。然后该信号刺激细胞反应。参与信号转导过程的多肽分子可为受体和非受体蛋白。

术语“受体”指胞内或细胞表面上的分子结构，其一般特征为选择性结合特定物质。示例性的受体包括肽激素、神经递质、抗原、补体片段和免疫球蛋白的细胞表面受体以及甾体激素的胞质受体。

术语“调节”指增强或抑制生物活性或过程(例如受体结合或信号转导活性)的功能特性的能力。这种增强或抑制可随特异性事件而定，例如信号转导途径的活化，和/或可仅在特定细胞类型中表现出来。蛋白“调节物”指各种可直接或间接地对蛋白(例如目的受体)活化和/或阻遏施加影响的分子(例如抗体、核酸片段、小分子、肽、寡肽、多肽或蛋白)和/或条件，包括物理结合蛋白、改变蛋白表达的数量和质量、改变蛋白的任何可测量或可检测活性、特性或行为，或以任何方式和蛋白或化合物相互作用。

术语“抑制”指减少、制止、减轻、防止、降低或消除功能或活性(无论是部分还是全部)的作用。例如，抑制基因转录或表达指这些功能的任何水平下调，包括完全消除这些功能。术语“抑制”可用于体外系统和体内系统。本文使用的术语“抑制剂”或“阻遏物”指任何抑制物。

术语“小分子”指合成或天然的化合物，例如可任选衍化的肽或寡肽、天然产物或任何其它天然或合成来源的低分子量(通常小于约5KD)有机、生物无机或无机化合物。这种小分子可为治疗可传递物质，或者可进一步衍化，以利于传递。

术语“诱导物”指任何诱导、增强、促进或增加特定活性(例如脂质代谢或LXR分子表达)的物质。

术语“物质”或“测试物”或“测试样品”指要测试的任何分子或一种以上分子的组合。

本发明物质的实例包括但不限于肽、蛋白、小分子和抗体。如果有需要，上述的核苷酸片段和部分以及反义实施方案也可用做物质。物质可随机选择，或合理地选择或设计。不考虑物质和靶化合物或位点之间的特异性相互作用而随机选择物质时，认为物质是本文使用的“随机选择”的。考虑与物质作用相关的靶化合物或位点和/或构象和物质之间的相互作用而在非随机基础上选择物质时，认为物质是本文使用的“合理地选择和设计”的。

术语“生物样品”广义地被限定为包括任何细胞、组织、生物液体、器官、多细胞生物等。生物样品可来源于例如体外的细胞或组织培养物。或者，生物样品可来源于活体生物或单细胞生物群。生物样品可为活组织，例如肝脏。术语“生物样品”还意欲包括分离自受试者的样品(例如细胞、组织或生物液体)以及存在于受试者中的样品。即，本发明的检测方法可用于在体外以及体内检测生物样品中的LXR变体mRNA、蛋白、基因组DNA或活性。例如，检测LXR变体mRNA的体外技术包括TaqMan分析、RNA杂交和原位杂交。检测LXRα蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。检测LXR变体基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。

术语“测试样品”指来自目的受试者的生物样品。例如，测试样品可为细胞样品或组织样品。“测试样品”和“生物样品”在本文可互换使用。

术语“体液”指任何体液，包括但不限于血清、血浆、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳、全血、汗液、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗、粘液、组织培养基、组织提取物和细胞提取物。其还可应用于体液的级分和稀释物。体液的来源可为人体、动物体、实验动物、植物或其它生物。

术语“治疗”和“疗法”指任何处理、作用、应用、治疗等，其中为受试者(包括人类)提供医疗救助的目的在于直接或间接改善受试者病情，或减慢受试者疾病或病症的发展。

而且，术语“治疗”被定义为应用或给予受试者或由受试者分离的组织或细胞系(其可能具有疾病、疾病症状或疾病诱因)一种物质(例如治疗剂或治疗组合物)，目的是为了治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响疾病、疾病症状或疾病诱因。本文使用的“治疗剂”指有助于治疗疾病的任何物质或物质组合。因此，治疗剂包括但不限于小分子、肽、抗体、核酶和反义寡核苷酸。

治疗剂或治疗组合物还可包括防止和/或减轻特定疾病症状的药学可接受形式的化合物。例如，治疗组合物可为防止和/或减轻脂质代谢疾病症状的药物组合物。本发明设想以任何合适的形式提供本发明的治疗组合物。治疗组合物的形式取决于许多因素，包括给予方式。治疗组合物可包含稀释剂、佐剂和赋形剂以及其它成分。

术语“治疗有效量”指当将化合物或化合物的组合物给予受试者治疗疾病时，其量足以对这种疾病的治疗有效。“治疗有效量”根据本领域人员已知的参数变化，例如取决于化合物、疾病、疾病严重程度以及要治疗的哺乳动物的年龄、体重或性别。

术语“受试者”指任何哺乳动物，包括人或非人受试者。非人受试者可包括实验动物、测试动物、农业动物、表演动物或宠物。

本发明通过引用结合了分子和细胞生物学领域已知的方法和技术。这些技术包括但不限于以下出版物中描述的技术：Old，R.W.&S.B.Primrose，Principles of Gene Manipulation：An Introduction ToGenetic Engineering(3d Ed.1985)Blackwell Scientific Publications，Boston.Studies in Microbiology；V.2：409页(ISBN 0-632-01318-4)，Sambrook，J.et al.eds.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.1-3卷，(ISBN 0-87969-309-6)；Miller，J.H.&M.P.Calos eds.，Gene Transfer VectorsFor Mammalian Cells(1987)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(ISBN 0-87969-198-0)。本发明蛋白的编码DNA可为任何DNA，只要其含有上述本发明蛋白的编码核苷酸序列。

核酸分子

本发明涉及编码三种新型LXRα变体蛋白(即LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-)的分离核酸分子。本发明还包括与LXRα变体蛋白或其片段具有至少90％序列一致性的核酸分子、LXRα变体的简并变体、具有保守或中等保守置换的编码LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-蛋白的变体、交叉杂交核酸(例如在高严格杂交条件下杂交)，以及其片段。

本发明的序列分别示于SEQ ID NO：3(LXRα-64的全长核苷酸序列，cDNA)、SEQ ID NO：4(LXRα-64的全长氨基酸序列)、SEQ ID NO：5(编码完整LXRα-42e⁺的核苷酸序列)、SEQ ID NO：6(LXRα-42e⁺的全长氨基酸序列)、SEQ ID NO：7(编码完整LXRα-42e^-的核苷酸序列)、SEQ ID NO：8(LXRα-42e^-的全长氨基酸序列)、SEQ ID NO：16(LXRα-64变体独有的核苷酸序列，其连接野生型LXRα的外显子6和7，在LXRα-64变体中产生了比野生型LXRα外显子6大的外显子6)、SEQID NO：17(由SEQ ID NO：16编码的推断氨基酸序列)、SEQ ID NO：18(LXRα-42e独有的核苷酸序列，其组合野生型LXRα的外显子8，在LXRα-42e变体中产生了比野生型LXRα外显子8长的外显子8)，以及SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：18编码的推断氨基酸序列)。

本发明的核酸可通过聚合酶链反应(PCR)生产。这种反应是本领域技术人员已知的(美国专利No.4,754,065、4,800,159、4,683,195和4,683,202提供了PCR技术和方法，这些美国专利通过引用整体结合到本文中)。

在本发明的另一个实施方案中，LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-核酸分子是和天然LXRα变体相比可增加生物利用度、稳定性、效力或降低毒性的合成核酸或核酸模拟物。这种合成核酸可改变组成核苷酸聚合物的基本A、T、C、G或U碱基或糖，以改变核酸的作用。

本文描述的LXRα变体以及由LXRα变体衍生的核酸片段可用作分离方法、诊断实验和法医方法中的试剂。例如，本文描述的来自LXRα-64、LXRα-42e⁺或LXRα-42e^-并可与其杂交(例如在严格杂交条件下)的多核苷酸序列可被检测性标记并用作分离其它序列的探针。另外，来自LXRα-64、LXRα-42e⁺或LXRα-42e^-的多核苷酸序列可用于设计在分离、诊断或法医方法中使用的PCR引物。

本文描述的LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-核酸分子也可用于克隆对应基因组DNA上位于LXRα变体序列上游的序列。这种上游序列能够调节基因表达，并可包含例如启动子序列、增强子序列或影响转录或翻译水平的其它上游序列。一被鉴别和克隆，这些上游调节序列就可用在表达载体中，设计用于以需要的空间、时间、发育或定量方式控制插入基因的表达。

使用染色体步查技术，衍生自本文所述多核苷酸的序列可用于分离对应基因的启动子。染色体步查技术是本领域已知的，例如由BDBiosciences Clontech(Palo Alto，CA)获取的GenomeWalker试剂盒，该试剂盒可按照生产商的说明使用。

一旦克隆和测序上游基因组序列，就可通过比较本发明多核苷酸的上游序列和含已知转录起始位点、转录因子结合位点或启动子序列的数据库，鉴别上游序列中的预期启动子和转录起始位点。

另外，可如下使用启动子报告基因载体鉴别上游序列中的启动子：当报告基因处于LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-启动子区(位于LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-基因的第一个外显子上游)的调节活性多核苷酸片段或变体控制之下时，检测报告基因的表达。可克隆入LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-启动子序列的合适启动子报告基因载体包括得自Clontech的pSEAP-Basic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Enhancer或pEGFP-1启动子报告基因载体，或得自Promega的pGL2-basic或pGL3-basic无启动子荧光素酶报告基因载体。简单地说，这些启动子报告基因载体每个都包含多个位于报告基因上游的克隆位点，报告基因编码可容易测定的蛋白，例如分泌性碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白。将LXRα-64、LXRα-42e⁺或LXRα-42e^-编码区上游序列以两个方向插入报告基因上游的克隆位点，并导入合适的宿主细胞中。测定报告蛋白的水平，并与在克隆位点没有插入序列的载体所获得的水平相比较。相比于对照载体，含插入序列的载体的表达水平提高，这表明在插入序列中存在启动子。在某些情况下，将上游序列克隆入含增加弱启动子序列转录水平的增强子的载体中。含插入序列的载体的表达水平显著高于没有插入序列的载体所观测到的水平，这表明在插入的上游序列中存在启动子序列。上游基因组DNA中的启动子序列可进一步通过位点定向诱变、接头分区分析或本领域人员熟知的其它技术来确定。

每个LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-基因的启动子的强度和特异性都可通过在不同类型细胞和组织中有效连接至LXRα-64、LXRα-42e⁺或LXRα-42e^-启动子的可检测多核苷酸的表达水平来评价。可检测多核苷酸可为与预定寡核苷酸探针特异性杂交的多核苷酸，或编码可检测蛋白的多核苷酸，包括LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-多肽或其片段或变体。本领域技术人员熟知该类型的检测。其中某些方法在本申请的其它部分进行了更详细的论述。

位于本发明多核苷酸上游的启动子和其它调节序列可用于设计表达载体，其能够以所需时间、空间、发育或定量方式控制插入基因表达。可使用本文所述表达分析的结果，选择能够引导所需时间、空间、发育和定量模式的启动子。例如，如果需要在肌肉中提供高表达水平的启动子，则可在表达载体中使用来源于肌肉中高水平表达mRNA的本发明多核苷酸上游启动子序列。

而且，可使用本领域技术人员熟知的任何方法，包括在本节描述的基于杂交或扩增的技术，使用本发明的核酸片段分离和/或纯化与其类似的核酸。这些方法可用于获得基因组DNA，其编码衍生LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-cDNA的mRNA、对应于LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-cDNA的mRNA或与LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-cDNA或其片段同源的核酸(例如变体、种同源物或直向同源物)。

或者，本发明的核酸片段和基因可用作参比，来鉴别表现出这些受体相关功能减弱的受试者(例如哺乳动物、人、患者)。

载体和宿主细胞

本发明涉及含本发明多核苷酸的载体、用本发明载体(例如克隆载体或表达载体)基因工程改造的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明多肽。例如，可将LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-核酸分子连接至载体。载体可为自主复制载体或复制缺陷载体。载体可为用于基因疗法的药学可接受载体。

本发明进一步涉及生产本发明多肽的方法：在合适的宿主中表达本发明多肽的编码多核苷酸，并使用已知重组技术回收表达产物。还可使用肽合成仪合成本发明多肽。可用本发明载体工程改造宿主细胞。宿主生物(重组宿主细胞)可为任何真核细胞或原核细胞或多细胞生物。替代实施方案可使用哺乳动物或人细胞，尤其是胚胎哺乳动物和人细胞。合适的宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞(如人胚肾细胞(HEK 293)、人肝细胞瘤细胞(HepG2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、猴COS-1细胞系、哺乳动物细胞CV-1)、两栖动物细胞(例如非洲爪蟾卵细胞)、酵母细胞(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))和昆虫细胞。而且，可使用各种大肠杆菌菌株(例如DH5α、HB101、MC1061)作为宿主细胞，特别是用于分子生物学操作。

载体可为克隆载体或表达载体，例如质粒、粘粒或噬菌体或任何其它可在宿主细胞中复制和生存的载体形式。工程宿主细胞可在常规营养培养基中培养，该培养基改良得适于激活启动子、选择转化体或扩增本发明多核苷酸。培养条件如pH、温度等，适用于为表达多核苷酸而选择的宿主细胞，是本领域一般技术人员已知的。

本文通常按照本领域技术人员熟悉的标准命名惯例，以小写字母“p”前加和/或后接大写字母和/或数字命名质粒。本文的质粒或者可商购、在不受限的基础上公开获得，或者可通过常规应用众所周知的公开方法由可获得的质粒构建。另外，可按照本发明使用的许多质粒和其它克隆和表达载体是众所周知的，对本领域技术人员来说可容易地获得。而且，技术人员可容易地构建任何数量的适用于本发明的其它质粒。根据本说明书，技术人员很容易明白本发明中的这种质粒以及其它载体的特性、构建和用途。

可通过本领域已知的各种方法将合适的DNA序列插入载体中。

表达载体中的DNA序列可有效连接至合适的表达控制序列(启动子)，以引导mRNA合成。这种启动子包括但不限于：SV40、人巨细胞病毒(CMV)启动子(例如pCMV/myc载体、pcDNA 3.1载体或任何形式的pcDNA系列)、SP6、T7和T3RNA聚合酶启动子。表达载体还可以包括用于转录起始的核糖体结合位点、转录终止子和适于放大表达的序列。表达载体还可以包括一个或多个选择标记基因，以提供特异性表型来选择转化的宿主细胞，例如用于真核细胞的新霉素抗性或用于大肠杆菌的氨苄青霉素抗性。

表达载体可包含至少一个选择标记。这种标记包括但不限于：用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，以及用于培养大肠杆菌和其它细菌的四环素或氨苄青霉素抗性。合适宿主的示例性实例包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，如CHO、Cos和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。适用于上述宿主细胞的培养基和条件是本领域已知的。

用于细菌的载体的说明性实例包括但不限于：得自Qiagen(Valencia，CA)的pA2、pQE70、pQE60和pQE-9；得自Stratagene(CedarCreek，TX)的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript^TM载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及得自Promega(Madison，WI)的pGEMEX^-1、pGEMEX^-2、PinPoint^TM X系列、pET-5系列。真核载体包括但不限于得自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合适的载体对技术人员来说是显而易见的。

基因可置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)、合适的基因控制序列或调节序列控制之下，以使编码蛋白的DNA序列在用含表达构建物的载体转化的宿主细胞中转录为RNA。这种启动子包括但不限于SV40、人巨细胞病毒(CMV)启动子(例如pCMV/myc载体、pcDNA 3.1载体或pcDNA系列的任何形式)、SP6、T7和T3RNA聚合酶启动子。在某些情况下，可能需要加入使宿主细胞分泌多肽的序列，随后切除分泌信号。

对于某些用途，需要减少或消除本发明多肽编码基因的表达。为实现此目的，可通过将编码该多肽的基因或基因片段连接至启动子序列，构建设计用于共抑制该多肽的嵌合基因或嵌合构建物。或者，可通过将基因或基因片段反向连接至启动子序列，构建设计用于表达全部或部分所述核酸片段的反义RNA的嵌合基因或嵌合构建物。可通过转化将共抑制或反义嵌合基因导入目的宿主细胞中，在所述宿主细胞中对应的内源基因的表达被降低或消除。

多肽

LXRα变体多肽可用于各种用途，包括但不限于生产抗体(例如特异性结合LXRα变体的抗体)、调节LXR野生型活性以及改变脂肪酸和胆固醇代谢(例如通过在表达LXRα变体的细胞中调节脂肪酸和胆固醇代谢调节酶的基因表达)。LXRα变体多肽还可用于鉴别差异性结合LXRα野生型多肽和LXRα变体多肽的化合物。这种化合物是差异调节与LXRα相关的代谢活性的候选化合物。

可在表达目的多肽的条件下，通过培养由上述表达载体转化的合适宿主细胞，生产本发明多肽。然后可分离和纯化多肽。由细胞培养物纯化蛋白的方法是本领域已知的，包括但不限于硫酸铵沉淀、阴离子或阳离子交换层析和亲和层析。

还可以使用来源于本发明多核苷酸的RNA，使用无细胞翻译系统生产本发明多肽。

可在表达目的多肽的条件下，通过培养由表达载体(例如本文所述表达载体)转化的合适宿主细胞，生产本发明多肽。然后可分离和纯化多肽。由细胞培养物纯化蛋白的方法是本领域已知的，包括但不限于硫酸铵沉淀、阴离子或阳离子交换层析和亲和层析。

大规模生产克隆的LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-使得能够筛选大量的LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-类似物，并可促进开发用于治疗脂质代谢疾病的新型或改良型激动剂和拮抗剂。更具体地说，筛选大量类似物的LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-活性可导致开发出影响脂质代谢的改良药物。脂质代谢疾病和病症包括但不限于动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖、Alzheimer病、炎性疾病和高胆固醇血症。

对于某些用途，有用的是将本文所述多肽引导入不同细胞区室，或促进细胞分泌多肽。因此，本发明设想可通过加入合适的胞内靶向序列(如转运序列)和/或去除已存在的靶向序列，改变编码本发明多肽的编码序列，借此进一步补充上述嵌合基因。

而且，本发明多肽或其表达细胞可用作免疫原，以使用本领域技术人员已知的方法制备抗体。例如，由SEQ ID NO：3、5或7编码的多肽或其片段和/或由SEQ ID NO：16或18编码的多肽，或表达前述任一种多肽的细胞，都可用作免疫原。其中特别有用的是抗野生型LXRα中不存在的LXRα-64的64个新氨基酸的抗体。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体，可包括嵌合抗体、单链抗体和Fab片段或Fab表达文库产物。抗体可用于原位检测细胞中的本发明多肽，或在体外检测细胞提取物中的本发明多肽。

另外，本发明多肽可用作靶点，以利于可用作药物(例如候选化合物)的化合物的设计和/或鉴别。具体地说，这些化合物可用于治疗由途径(例如胆汁酸合成、血浆脂蛋白组成控制、由外周组织转运胆固醇至肝脏、调节细胞增殖、分化和凋亡)改变而产生的疾病。另外，本发明多肽可用于鉴别可影响LXRα的其它靶点(例如共活化或共抑制蛋白)。本发明LXRα变体的各种用途包括但不限于病理生理性类异戊二烯合成途径、胆固醇代谢、胆固醇分解代谢、胆汁酸合成和细胞分化的治疗性调节(例如基因传递方法、基因沉默方法、蛋白治疗、抗体治疗)、诊断用途、药物靶、鉴别受体型激动剂或拮抗剂以及研究LXRα作用的分子机制。

而且，在由于表型表达本发明的内源性显性负调控LXRα变体而LXRα活性低的细胞中，可使用基因沉默方法如反义、siRNA(小干扰RNA)作为诱导或刺激LXRα活性的策略。另外，本发明的新变体可用于制备融合LXRα变体，其可用于开发受体型激动剂和拮抗剂。

此外，本发明的新序列，如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18，可用于生产野生型LXRα的显性负调控调节物。可将SEQ ID NO：16或18的核酸分子或其片段掺入任一种存在的变体如LXRα和/或其它核受体中。获得的含SEQ ID NO：16和18或其片段编码的氨基酸序列(例如在SEQ ID NO：17和19中提出的序列)的新多肽可产生野生型LXRα的显性负调控调节物。

LXR，具体地说是LXRα，对胆固醇代谢和脂肪酸生物合成的脆弱平衡的重要性，导致开发出用作治疗胆汁酸和胆固醇代谢相关疾病的治疗剂或诊断剂的LXR调节物。本发明的新显性负调控LXRα变体可用于开发这种治疗剂或诊断剂。因此，本发明的一个实施方案是在受试者中治疗其特征为LXR(例如LXRα)表达水平异常或有害的疾病的方法。该方法包括为受试者提供治疗有效量的LXRα-64、LXRα-42e⁺或LXRα-42e^-蛋白、同源蛋白或具有所需活性(例如抑制LXRα变体活性的能力)的LXRα变体蛋白片段，或可调节LXRα活性的其任何组合。在细胞表达LXRα-64、LXRα-42e⁺或LXRα-42e^-蛋白、同源蛋白或其片段(其导致调节野生型LXRα受体和/或其它与RXR杂二聚化的核受体)的条件下，通过将编码LXRα-64、LXRα-42e⁺或LXRα-42e^-蛋白、同源蛋白或片段或其任何组合的核酸序列导入受试者携带LXRα的细胞中，可提供所述蛋白。这些受体的实例包括但不限于LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR和PXR。

将LXRα变体核酸导入受试者细胞中可包括：a)处理受试者的细胞或适于移植入受试者中的活体外培养细胞或组织(例如培养的干细胞系、骨髓细胞、脐带血细胞)，以将核酸序列插入细胞中；和b)将步骤a)的细胞导入受试者中(例如美国专利No.6,068,836和5,506,674)。

受试者可为动物，例如哺乳动物(如小鼠、大鼠、非人灵长类动物、犬、山羊或绵羊)。哺乳动物受试者可为人。

LXR的作用是与类视黄醇X受体(RXR)形成杂二聚体。而且，RXR在多种激素反应途径中同时起同二聚受体和杂二聚配偶体(例如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR和PXR(Miyataet al.，J.Biol.Chem.，2719189-9192，1996))作用的能力是独一无二的。本发明的LXR变体LXR64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-可与RXR杂二聚化。因此，例如，在翻译LXR64、LXRα-42e⁺和/或LXRα-42e^-变体的位置，RXR将与这些变体杂二聚化，而不与LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR和/或PXR杂二聚化或与自身(RXR)同二聚化。这减少了可用于和特定核受体杂二聚化和/或同二聚化的RXR量。

因此，作为显性负调控变体，本发明的新LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-可用于靶向特异性受体，如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR。因此，本发明的显性负调控LXRα变体提供了以下用途：治疗性调节病理生理性疾病、诊断、发病风险或治疗其中RXR、LXR或其它核受体(例如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、PXR、XR)介导的过程与病理生理性病症或疾病相关的各种疾病。这种疾病的实例是动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖、癌症和药物代谢疾病。

而且，本发明的LXRα变体可通过与野生型LXRα结合配偶体如RXR相互作用而调节靶基因表达或靶基因产物活性。本文使用的LXR或RXR活性分别指调节LXR(如LXRα)或RXR靶基因的表达或活性。

在一个实施方案中，可通过使细胞与至少一种本发明的新型LXRα变体接触，改变含RXR的细胞的靶基因特异性。在一个具体实施方案中，可通过使细胞与至少一种本发明的新型LXRα变体接触，活化含RXR的细胞，靶基因与序列为5′-AGGTTAnnnnTGGTCA-3′(SEQ ID NO：15)的效应元件有效连接，其中每个“n”独立地选自A、G、T或C。

可使用本领域已知的各种方法测定本发明的LXRα变体对同二聚化或杂二聚化过程的作用。这些方法的实例描述于Terrillon et al.Molecular Endocrinology 2003，17：677-691，Germain-Desprez et al.，J.Biol.Chem.，2003，278(25)22367-22373，以及Mercier et al.，J.Biol.chem.2002，277(47)44925-44931。例如，可使用以上参考文献中的任一种技术定量评价RXR同二聚化或杂二聚化，测定RXR活性。例如，可通过使一种核受体(例如RXR)cDNA与能量供体Rluc(海肾荧光素酶)在羧基端融合，并使第二种核受体(例如LXRα)cDNA与能量接纳体GFP(绿色荧光蛋白)融合，定量核受体的同二聚化和杂二聚化。使用可区分海肾荧光素酶和绿色荧光蛋白发射光谱的BRET技术(Biosignal Packard)，可定量核受体的同二聚化和杂二聚化。

而且，本发明涉及降低哺乳动物SREBP-1基因表达的方法。本发明基于以下发现：显性负调控的LXRα变体抑制野生型LXRα，并相应地可抑制哺乳动物细胞中的SREBP-1表达。在有和没有本发明变体的情况下，通过评价SREBP-1基因表达，可容易地证实后一结论。SREBP-1基因的不正常表达与脂肪营养不良、高甘氨酸血症、高甘油三酯血症和糖尿病之类的疾病相关。本发明变体不仅对治疗性和预防性治疗由SREBP-1过表达介导的疾病有用，而且对研究脂肪酸稳态机制以及脂肪营养不良的成因和机制有用。

抗体

本发明还提供分离和纯化的抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体，包括对新LXRα变体特异性的独特型或抗独特型抗体。本发明的多肽或其表达细胞可用作免疫原，以通过本领域技术人员已知的方法制备抗体。例如，由SEQ ID NO：3、5、7、16或18或SEQ ID NO：3、5、7、16或18的任何部分和/或SEQ ID NO：3、5、7、16或18编码的这些多肽或表达前述任一种多肽的细胞，都可用作免疫原。这些抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体，可包括嵌合抗体、单链抗体和Fab片段或Fab表达文库产物。抗体可用于原位检测细胞中的本发明多肽，或体外检测细胞提取物中的本发明多肽。

例如，抗体可特异性识别新型变体的64个新氨基酸。用含SEQ IDNO：4或其免疫原性部分的肽或含SEQ ID NO：4的融合肽免疫兔，并分离新型变体特异性的多克隆抗血清。或者，将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤。然后筛选杂交瘤，以鉴别分泌单克隆抗体的杂交瘤，该抗体特异性针对含新型LXRα-64变体64个氨基酸序列的多肽或肽。这些抗体可用于检测生物样品(例如临床样品)中的新型LXRα-64变体，检测新型变体对其它变体的相对量。

筛选实验

一般来说，本文描述的新方法包括鉴别可调节LXRα变体表达或活性的化合物的方法。在某些情况下，鉴别调节LXRα变体表达或活性且不影响或在较小程度上影响野生型LXRα表达或活性的化合物。

本发明还包括生产LXRα(例如大规模生产克隆的LXRα)的方法，其使得能够筛选相对大量的LXRα类似物，并能促进开发用于LXRα相关疾病(如脂质代谢疾病)临床治疗的新型或改良型激动剂和拮抗剂。更具体地说，筛选大量的类似物用于大规模生产克隆的LXRα使得能够筛选大量的LXRα活性，这可导致开发出改良的工具和药物，用于诊断和临床治疗例如脂肪营养不良、高甘油三酯血症、高甘氨酸血症、糖尿病或高胆固醇血症。

在一个实施方案中，本发明的多肽用作靶，例如通过结合多肽，促进调节多肽的表达和活性的化合物的设计和/或鉴别。这种化合物是治疗与LXRα介导途径相关的疾病的候选化合物，例如，可用作调节LXRα途径的一个或多个方面的药物。具体地说，这种化合物可用于治疗由激素反应途径改变而产生的疾病(如糖尿病和药物代谢疾病)。另外，本发明多肽可用于鉴别可影响激素信号转导的其它靶点(例如共活化或共抑制蛋白)。本发明LXRα变体的各种用途包括但不限于治疗性调节与异常脂质代谢相关的病理生理性疾病(例如基因传递方法、基因沉默方法、蛋白治疗、抗体治疗)、诊断用途、药物靶、鉴别受体型激动剂或拮抗剂以及研究LXRα作用的分子机制。

LXRα变体的系统性研究使得有可能推断所研究蛋白的结构-活性关系。这些变体的信息对所研究的疾病来说是基础性的，因为其使得有可能理解病理学分子成因。而且，在鉴别组织选择性核受体调节物如LXRα、LXRβ、PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR和PXR时，新型LXRα变体可以不同的方法用于靶向特异性受体相互作用。

因此，本发明提供了鉴别调节物的方法(本文也称为“筛选实验”)，所述调节物即为结合LXRα变体蛋白的候选化合物或物质(例如蛋白、肽、肽模拟物、拟肽、小分子或其它药物)，其对例如LXRα变体的表达或活性具有刺激或抑制作用，或对例如LXRα变体底物的表达或活性具有刺激或抑制作用。由此鉴别的化合物可在治疗方案中用于调节靶基因产物(例如LXRα变体基因)的活性、详尽阐述靶基因产物的生物学功能或鉴别破坏正常靶基因相互作用的化合物。

在一个实施方案中，本发明提供实验来筛选为LXRα变体蛋白或多肽或其生物活性部分的底物的候选化合物或测试化合物。在另一个实施方案中，本发明提供实验来筛选结合LXRα变体蛋白或多肽或其生物活性部分或调节其活性的候选化合物或测试化合物。

例如可使用任何本领域已知的众多组合文库方法，获得本发明的测试化合物，所述文库方法包括生物文库、拟肽文库(具有肽功能性但具有抗酶降解的新型非肽骨架且仍保持生物活性的分子文库；参见例如Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37：2678-85)、空间可定位平行固相或液相文库、需要去卷积的合成文库法、‘一珠一化合物’文库法和使用亲和层析选择的合成文库法。生物文库和拟肽文库法限于肽文库，而其它四种方法可应用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。

本领域存在合成分子文库的方法实例，例如载于：DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37：2678；Cho et al.(1993)Science 261：1303；CarTell et al.(1994)Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.33：2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；以及Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37：1233。

化合物文库可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques13：412-421)，或存在于珠(Lam(1991)Nature 354：82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364：555-556)、细菌(Ladner，美国专利No.5,223,409)、孢子(Ladner，出处同上)、质粒(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869)或噬菌体(Scott and Smith(1990)Science 249：386-390；Devlin(1990)Science 249：404-406；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382；Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310；Ladner出处同上)上。

在一个实施方案中，实验是基于细胞的实验，其中使表达LXRα变体蛋白或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物调节LXRα变体活性的能力。可通过监测例如表达野生型LXRα的细胞中LXRα变体的显性负调控活性，例如通过监测LXRα诱导型基因或基因产物的表达，实现测定测试化合物调节LXRα变体活性的能力。细胞例如可为哺乳动物来源，例如人。

还可以评价测试化合物调节LXRα变体结合化合物(例如天然的LXRα变体配体)或结合LXRα变体的能力。这可通过例如以下方法实现：将化合物与放射性同位素或酶标记偶联，使得化合物与LXRα变体的结合可通过检测复合物中的标记化合物测定。或者，LXRα变体可与放射性同位素、酶标记偶联，或工程改造为含肽标记，以监测复合物中测试化合物调节LXRα变体结合例如LXRα变体、野生型LXRα或与另一类固醇受体超家族成员杂二聚化的能力。例如，化合物可用¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³H直接或间接标记，并通过直接计数放射性发射或闪烁计数检测放射性同位素。或者，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶标记化合物，并通过测定合适底物向产物的转化检测酶标记。

在有或没有标记任何相互作用物的情况下，可评价化合物与LXRα变体相互作用的能力。例如，可在没有标记化合物或LXRα变体的情况下，使用微生理功能测定仪检测化合物与LXRα变体的相互作用(例如McConnell et al.(1992)Science 257：1906-1912)。本文使用的“微生理功能测定仪”(例如细胞传感器)是一种分析性仪器，其使用光寻址电位传感器(LAPS)检测细胞酸化其环境的速率。该酸化速率的变化可用于指示化合物和LXRα变体之间的相互作用。

在再另一个方法中，提供无细胞实验，其中使LXRα变体蛋白或其生物活性部分与测试化合物接触，并评价测试化合物结合LXRα变体蛋白或其生物活性部分的能力。用于实验的LXRα变体蛋白的优选生物活性部分包括参与和LXRα变体分子、非LXRα变体分子相互作用的片段(例如具有高表面概率记分的片段)，以及预测的LXRα变体的配体结合结构域。

可溶性和/或膜结合形式的分离蛋白(例如LXRα变体蛋白或其生物活性部分)可用于本发明的无细胞实验。

无细胞实验包括在足以允许两种组分相互作用并结合的条件和时间下，制备靶基因蛋白和测试化合物的反应混合物，由此形成可使用本领域已知方法取出和/或检测的复合物。

还可以使用例如荧光能量转移(FET)检测两种分子之间的相互作用(参见例如Lakowicz et al.，美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos，et al.，美国专利No.4,868,103)。选择在第一个‘供体’分子上的荧光团标记，使得其能够发射出荧光能量，荧光能量被第二个‘接纳体’分子上的荧光标记吸收，该荧光标记由于吸收能量又能够发荧光。或者，‘供体’蛋白分子可仅使用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长光的标记，使得‘接纳体’分子标记可与‘供体’不同。因为标记之间能量转移的效率与分子间距相关，所以可估测分子之间的空间关系。在分子间发生结合的情况下，实验中‘接纳体’分子标记的荧光发射应最大。FET结合事件可通过本领域众所周知的标准荧光检测法(例如使用荧光计)进行常规检测。

在另一个实施方案中，可使用实时生物分子相互作用分析(BIA)(例如Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63：2338-2345和Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705)，实现对LXRα变体蛋白结合靶分子能力的测定。“表面等离子共振”或“BIA”实时检测生物特异性相互作用，而不需要标记任何相互作用物(例如BIAcore)。结合表面质量的变化(指示结合事件)导致表面附近的光的折射率改变(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，产生的可检测信号可用作生物分子间实时反应的指示。

在一个实施方案中，将靶基因产物(例如LXRα变体蛋白或其片段)或测试物锚定在固相上。锚定在固相上的靶基因产物/测试化合物复合物可在反应结束时检测。一般而言，靶基因产物可锚定在固体表面，而测试化合物(其未被锚定)可用本文论述的可检测标记直接或间接标记。

可能需要将LXRα变体、抗LXRα变体抗体或其靶分子固定化，以促进一种或两种蛋白的复合与非复合形式的分离，以及适于实验自动化。在有和没有候选化合物的情况下测试化合物与LXRα变体蛋白的结合或LXRα变体蛋白与靶分子的相互作用，可在任何适于包含反应物的容器中完成。这种容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供加入结构域的融合蛋白，该结构域允许一种或两种蛋白结合基质。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/LXRα变体融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白可吸附到谷胱甘肽Sepharose^TM珠(Sigma Chemical，St.Louis，Mo)或谷胱甘肽衍化的微量滴定板上，然后将其与测试化合物混合，或者将其与测试化合物和未吸附靶蛋白或LXRα变体蛋白混合，在有助于形成复合物的条件下(例如在生理盐和pH条件下)温育混合物。温育后，漂洗珠或微量滴定板孔，以去除任何未结合的组分，对于珠，固定基质，例如如上所述直接或间接测定复合物。或者，复合物可与基质解离，使用标准技术检测LXRα变体结合或活性水平。

其它将LXRα变体蛋白或靶分子固定在基质上的技术包括使用缀合的生物素和链霉抗生物素。可使用本领域已知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化LXRα变体蛋白或靶分子，并固定在链霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。

为进行实验，将未固定组分加至含锚定组分的包被表面。反应完成后，在使所形成的任何复合物仍固定在固体表面的条件下去除(例如通过漂洗)未反应组分。可以多种方法完成对锚定在固体表面上的复合物的检测。当先前未固定的组分预先标记过时，检测固定在表面上的标记，其代表形成复合物。当先前未固定的组分未预先标记时，可使用间接标记检测锚定在表面上的复合物；例如使用对固定组分特异性的标记抗体(抗体又可用例如标记的抗Ig抗体直接标记或间接标记)。

在一个实施方案中，使用与LXRα变体蛋白或靶分子反应但不干扰LXRα变体蛋白与其靶分子结合的抗体进行实验。这种抗体可被衍化至板的孔，未结合的靶或LXRα变体蛋白通过抗体结合被捕获在孔中。检测此复合物的方法除了上述用于GST-固定化复合物的方法以外，还包括使用与LXRα变体蛋白或靶分子反应的抗体免疫检测复合物，以及依靠检测与LXRα变体蛋白或靶分子相关的酶活性的酶联实验。

或者，可在液相中进行无细胞实验。在该实验中，可通过任何本领域已知的众多技术，包括但不限于：差速离心(例如Rivas andMinton，(1993)Trends Biochem Sci 18：284-7)、层析(凝胶过滤层析、离子交换层析)、电泳(例如Ausubel et al.，eds.Current Protocols inMolecular Biology 1999，J.Wiley：New York.)，以及免疫沉淀(例如Ausubel et al.，eds.(1999)Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley：New York)，分离反应产物和未反应组分。这种树脂和层析技术是本领域技术人员已知的(例如Heegaard，(1998)J.Mol.Recognit.11：141-8；Hage and Tweed，(1997)J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.699：499-525)。此外，如本文所述，也可以常规性使用荧光能量转移，以在没有进一步纯化溶液中复合物的情况下检测结合。

在某些情况下，实验包括使LXRα变体蛋白或其生物活性部分与已知结合LXRα变体(例如LXRα、LXRα变体或类固醇受体超家族的其它成员)的化合物接触，形成实验混合物，使实验混合物与测试化合物接触，并测定测试化合物与LXRα变体蛋白相互作用的能力，其中测定测试化合物与LXRα变体蛋白相互作用的能力包括测定测试化合物优先结合LXRα变体或其生物活性部分的能力，或破坏LXRα变体和已知化合物之间相互作用的能力，或和已知化合物相比调节靶分子活性的能力(例如通过监测LXRα变体的显性负调控活性)。

本发明的靶基因产物可与一种或多种细胞或胞外大分子如蛋白体内相互作用。对于该讨论的目的，这种细胞和胞外大分子在本文被称为“结合配偶体”。破坏此相互作用的化合物可用于调节靶基因产物的活性。这种化合物可包括但不限于抗体、肽和小分子之类的分子。用于本实施方案的靶基因/产物一般为本文鉴别的LXRα变体基因。在一个替代实施方案中，本发明提供方法，测定测试化合物通过调节LXRα变体靶分子下游效应子的活性调节LXRα变体蛋白活性的能力。例如，可测定效应分子对合适靶的活性，或者可如前所述测定效应子与合适靶的结合。

为鉴别干扰靶基因产物与其细胞或胞外结合配偶体之间相互作用的化合物，在足以使两种产物形成复合物的条件和时间下，制备含靶基因产物和结合配偶体的反应混合物。为了测试抑制剂，在有和没有测试混合物的情况下提供反应混合物。首先可将测试化合物加入反应混合物中，或者可在加入靶基因及其细胞或胞外结合配偶体之后的时间加入测试化合物。在没有测试化合物的情况下温育对照反应混合物，或将对照反应混合物与安慰剂温育。然后检测靶基因产物与细胞或胞外结合配偶体之间形成的任何复合物。在对照反应中形成复合物，但在含测试化合物的反应混合物中未形成复合物，这表明化合物干扰靶基因产物和相互作用性结合配偶体的相互作用。另外，在含测试化合物和正常靶基因产物的反应混合物中形成的复合物还可与在含测试化合物和突变靶基因产物的反应混合物中形成的复合物对比。这种对比对于需要鉴别破坏突变靶基因产物的相互作用但不破坏正常靶基因产物的相互作用的化合物的情况可能很重要。

这些实验可以异质或均质形式进行。异质实验包括将靶基因产物或结合配偶体锚定在固相上，并在反应结束时检测锚定在固相上的复合物。在均质实验中，整个反应在液相中进行。在每一种方法中，反应物加入的顺序都可改变，以获得有关待测试化合物的不同信息。例如，干扰靶基因产物和结合配偶体之间相互作用(例如通过竞争)的测试化合物，可通过在测试物质存在下进行反应来鉴别。或者，可通过在形成复合物后向反应混合物中加入测试化合物，检验破坏预先形成复合物的测试化合物，例如具有较高结合常数的化合物替换了复合物中的一种组分。下文简要描述了各种形式。

在异质实验系统中，靶基因产物或相互作用的细胞或胞外结合配偶体被锚定在固体表面(例如微量滴定板)上，而未锚定组分被直接或间接标记。锚定的组分可通过非共价或共价连接固定化。或者，可使用对待锚定的组分特异性的固定化抗体将组分锚定在固体表面上。

为了进行实验，在有或没有测试化合物的情况下，使固定化组分的配偶体接触包被表面。在反应完成后，去除(例如通过漂洗)未反应的组分，形成的任何复合物都仍固定在固体表面上。当未固定化组分预先标记时，检测固定在表面上的标记，其代表形成复合物。当未固定化组分未预先标记时，可使用间接标记检测锚定在表面上的复合物；例如使用对最初未固定化的组分特异性的标记抗体(抗体又可用例如标记的抗Ig抗体直接或间接标记)。根据反应组分加入的顺序，可检测抑制复合物形成或破坏预先形成的复合物的测试化合物。

或者，可在有或没有测试化合物的情况下在液相中进行反应，分离反应产物和未反应组分，并检测复合物；例如使用对一种结合组分特异性的固定化抗体，以锚定在溶液中形成的任何复合物，以及使用对其它配偶体特异性的标记抗体，以检测锚定的复合物。此外，根据反应物加入到液相中的顺序，可鉴别抑制复合物或破坏预先形成的复合物的测试化合物。

在某些方法中，可使用均质实验。例如，制备靶基因产物和相互作用性细胞或胞外结合配偶体产物的预先形成复合物，使得靶基因产物或其结合配偶体被标记，但标记产生的信号由于形成复合物而被猝灭(参见例如使用该方法进行免疫实验的美国专利No.4,109,496)。加入竞争并替代预先形成复合物中一种组分的测试化合物，导致产生了高于背景的信号。以此方式可鉴别破坏靶基因产物-结合配偶体相互作用的测试物。

在再另一方面，LXRα变体蛋白可在双杂交实验或三杂交实验中用作“饵蛋白”(参见例如美国专利No.5,283,317；Zervos et al.(1993)Cell 72：223-232；Madura et al.(1993)J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel et al.(1993)Biotechniques 14：920-924；Iwabuchi et al.(1993)Oncogene 8：1693-1696；和Brent WO94/10300)，以鉴别与LXRα变体结合或相互作用并与LXRα变体活性相关的其它蛋白(“LXRα变体-结合蛋白”或“LXRα变体-bp”)。这种LXRα变体-bp可为LXRα变体蛋白或LXRα变体靶(例如LXRα变体介导的信号转导途径的下游元件)的信号(例如配体)的激活剂或抑制剂。进行这些实验的试剂盒可商购(如Stratagene，La Jolla，CA；BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)。

在另一个实施方案中，鉴别LXRα变体表达的调节物。例如，使细胞或无细胞混合物接触候选化合物，并相对于没有候选化合物情况下的LXRα变体mRNA或蛋白的表达水平，评价LXRα变体mRNA或蛋白的表达。当存在候选化合物时LXRα变体mRNA或蛋白的表达高于没有候选化合物时，候选化合物被鉴别为LXRα变体mRNA或蛋白表达的刺激剂。或者，当存在候选化物时LXRα变体mRNA或蛋白的表达低于(统计学显著地低于)没有候选化合物时，候选化合物被鉴别为LXRα变体mRNA或蛋白表达的抑制剂。LXRα变体mRNA或蛋白表达水平可通过本文描述的用于检测LXRα变体mRNA或蛋白的方法测定。

在另一个方面，本发明涉及本文描述的两种或更多种实验的组合。例如，可使用基于细胞或无细胞的实验鉴别调节剂，调节剂调节LXRα变体蛋白活性的能力可在例如动物(如高胆固醇血症或与脂肪酸代谢相关的其它疾病的动物模型)中体内证实。

本发明进一步涉及通过上述筛选实验鉴别的新物质。因此，在合适的动物模型中进一步使用如本文所述鉴别的物质(例如LXRα变体调节剂、反义LXRα变体核酸分子、LXRα变体特异性抗体或LXRα变体-结合配偶体)，确定用该物质治疗的效力、毒性、副作用或作用机制，属于本发明的范围。而且，由上述筛选实验鉴别的新物质可用于本文所述的治疗。

转基因动物

本发明还涉及非人转基因动物。这种动物用于研究LXRα变体蛋白的功能和/或活性，以及用于鉴别和/或评价LXRα变体表达或活性的调节剂。本文使用的“转基因动物”是其中一个或多个动物细胞含转基因的非人动物，例如哺乳动物，如大鼠或小鼠之类的啮齿动物。转基因动物的其它实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因是外源DNA或重排，例如缺失内源染色体DNA，其一般整合入或出现在转基因动物细胞的基因组中。转基因可引导编码基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达，其它转基因如敲除基因降低表达。因此，转基因动物可为这种动物：其中内源LXRα变体基因已通过例如内源基因和导入动物细胞(例如动物胚胎细胞)中的外源DNA分子之间的同源重组改变，然后培育动物。在某些情况下，鉴别动物中的LXRα变体的直系同源物，并使用直系同源序列生产转基因动物。当已知基因(例如人基因)和目的LXRα变体基因之间的同源性足够时，可使用人序列。

转基因中还可以包含内含子序列和多腺苷酸化信号，以增加转基因的表达效率。组织特异性调节序列可有效连接至本发明的转基因，以控制特定细胞表达LXRα变体蛋白。可根据其基因组中存在LXRα变体转基因和/或在动物组织或细胞中表达LXRα变体mRNA，鉴别转基因起始动物。还可以通过其它与转基因相关的特征鉴别转基因动物。例如，表达LXRα-64转基因的转基因动物的SREBP-1C表达量降低，相比于对照动物，其在LXRα激动剂存在时特别显著。然后可使用转基因起始动物繁殖携带转基因的其它动物。而且，可将携带LXRα变体蛋白编码转基因的转基因动物进一步繁殖成携带其它转基因的其它转基因动物。

可在转基因动物中表达LXR变体蛋白或多肽，例如可将编码蛋白或多肽的核酸导入动物基因组中。一般来说，核酸置于组织特异性启动子(例如乳或卵特异性启动子)控制之下，并由动物生产的奶或蛋中回收。适用于该用途的动物包括小鼠、猪、牛、山羊和绵羊。

本发明还包括转基因动物细胞群。分离和繁殖这种细胞的方法是本领域已知的，包括培育和繁殖初级、次级和无限增殖化细胞。

实施例

在以下的实施例中进一步阐述了本发明，除非另有说明，否则其中所有的份和百分率都是重量，度数是摄氏度。应当理解，这些实施例尽管代表本发明实施方案的实例，但仅以说明的方式提供。由以上论述和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的基本特征，在不偏离其精神和范围的情况下，可对本发明实施各种改变和修饰，以使其适于各种用途和条件。实施例不应被以任何方式解释为限制本发明的范围或内容。

实施例1

克隆人LXR变体

使用QIAGEN试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)由THP-1细胞(人单核细胞-巨噬细胞细胞系)分离总RNA。在20μL反应混合物中由0.1μg总THP-1RNA合成第一条链cDNA，所述反应混合物含4μL 5XRT反应缓冲液、10单位Rnasin、200μM dNTP、20pM随机引物和20单位逆转录酶。混合物于42℃温育1小时，然后于53℃温育30分钟。然后用10单位RNase H于37℃消化未杂交的RNA 10分钟。使用人LXRα特异性引物对2μL逆转录酶产物进行PCR扩增。引物序列为：LXRα-For：5′-CG GTCGACATGTCCTTGTGGCTGGGG(SEQ IDNO：9)和LXRα-Rev：5′-CA GCGGCCGCTTCGTGCACATCCCAGATCTC(SEQ ID NO：10)(限制性位点加下划线)。在热循环仪中以94℃(30秒)、58℃(30秒)和72℃(2分钟)进行35轮扩增。在1.2％琼脂糖凝胶上分析RT-PCR产物。在PCR中使用相同量的总RNA作为模板，以检验由cDNA扩增的条带。将RT-PCR产物亚克隆入pCMV表达载体的Sal I/Nit I位点，进行测序。亚克隆测序结果是鉴别出许多新序列，包括本文称为LXRα-64、LXRα-42e⁺和LXRα-42e^-的序列。

实施例2

克隆的测序和初步分析

使用实施例1的LXRα-For和LXRα-Rev引物(见上文)，由人单核细胞/巨噬细胞THP-1细胞鉴别和克隆人LXRα的三种可变剪接变体。变体是被发现比天然(野生型)LXRα长64个氨基酸的LXRα-64；有42个氨基酸与天然LXRα不同的LXRα-42e⁺；以及有42个氨基酸与天然LXRα不同且对应于天然LXRα外显子6的序列缺失的LXRα-42e^-。新LXRα变体和野生型人LXRα的核苷酸序列和预测氨基酸序列的对比示于图1B、2B和3B。

图1A列出的新核苷酸序列存在于LXRα-64中，但不存在于野生型LXRα中(核苷酸1121-1154)。图1B列出的新氨基酸序列存在于LXRα-64中，但不存在于野生型LXRα中(氨基酸368-409)。

图2A列出的新核苷酸序列存在于LXRα-42e⁺中。LXRα-42e⁺中的缺失序列(在野生型LXRα中存在(核苷酸1121-1154))引起移码。这在LXRα-42e⁺中产生了新的氨基酸序列(LXRα-42e⁺的氨基酸368-409)。LXRα-42e⁺缺失的氨基酸序列对应于野生型LXRα-42e⁺的氨基酸368-447。

图3A显示了核苷酸651-1220的LXRα-42e^-完整序列。该图未显示野生型LXRα对应区域(核苷酸651-1166)的完整序列。对应于野生型LXRα的核苷酸708-887的序列在LXRα-42e^-中不存在。对应于LXRα-42e^-的核苷酸1101-1134的序列在野生型LXRα中不存在。图3B显示了存在于野生型LXRα中但不存在于LXRα-42e^-中的序列(野生型LXRα的氨基酸237-296和368-447)，以及仅存在于LXRα-42e^-中的序列(LXRα-42e^-的氨基酸308-349)。

新变体的完整cDNA编码区和预测的氨基酸序列示于SEQ IDNO：3(编码LXRα-64的核苷酸序列)、SEQ ID NO：4(LXRα-64的推测氨基酸序列)、SEQ ID NO：5(编码LXRα-42e⁺cDNA的核苷酸序列)、SEQ ID NO：6(LXRα-42e⁺的推测氨基酸序列)、SEQ ID NO：7(编码LXRα-42e^-的核苷酸序列)、SEQ ID NO：8(LXRα-42e^-的推测氨基酸序列)、SEQ ID NO：16(LXRα-64独有的核苷酸序列，其连接野生型LXRα的外显子6和7，来源于内含子6，产生了更大的外显子6)、SEQ ID NO：17(LXRα-64独有的氨基酸序列，由SEQ IDNO：16编码)、SEQ ID NO：18(LXRα-42e mRNA中外显子8的新部分，其不存在于野生型LXRα的外显子8中)，以及SEQ ID NO：19(由在LXRα-42cDNA中鉴别的其它序列编码的推测氨基酸序列)。

实施例3

基因特征

测定本发明新变体LXRα-64、LXRα-42⁺和LXRα-42^-的基因组结构。LXRα-64、LXRα-42⁺和LXRα-42^-的转录起始位点、基因组结构、可变剪接和功能结构域以及其与野生型LXRα的对比分别描述于图4、5和6。

图4图示了LXRα-64mRNA的结构，表明新序列掺入到对应于野生型LXRα的外显子6的序列中。因此，具有新序列的探针可用于例如鉴别LXRα-64的表达或鉴别LXRα-64变体。由新序列编码的氨基酸序列可用作抗原，来产生特异性结合LXRα-64变体的抗体。LXRα-64变体的特征在于：其mRNA含新核酸序列，并编码新氨基酸序列。这种变体可含保守置换。

图5图示了LXRα-42e⁺mRNA的结构，表明新序列掺入到对应于野生型LXRα的外显子8的序列中，该序列将终止信号引入到外显子9之前的序列中。新LXRα-42e⁺序列还缺失野生型LXRα的外显子10。具有新序列的探针可用于例如鉴别LXRα-42e⁺的表达或鉴别LXRα-42e⁺变体。LXRα-42e⁺变体的特征在于：其mRNA含新核酸序列，并编码新氨基酸序列。这种变体可含保守置换。某些LXRα-42e⁺变体缺失外显子10。在某些情况下，LXRα-42e⁺变体既含新序列，又缺失外显子10。

图6图示了LXRα-42e^-mRNA的结构，表明在LXRα-42e^-中没有野生型LXRα的外显子6。(野生型LXRα的某些报告将外显子1命名为外显子1A，将外显子2命名为外显子1B。在这种命名法中，野生型LXRα的外显子5对应于缺失的外显子6序列)。因此，含LXRα-42e^-的连续外显子5和外显子7序列的探针可用于例如特异性检测该序列的表达，或用于鉴别LXRα-42e^-新变体。因此，LXRα-42e^-变体的特征在于：缺失野生型外显子6。由桥接外显子5和7的序列编码的氨基酸序列还可用于产生特异性结合LXRα-42e^-的抗体。

实施例4

组织分布

使用BD Biosciences Clontech(Palo Alto，CA)的实时PCR和多组织cDNA文库(MTC，人cDNA)进行组织分布研究。使用AppliedBiosystems 7700序列检测仪(Foster City，CA)对文库进行实时定量PCR实验。各扩增混合物(50μL)含50ng cDNA、400nM正向引物(SEQID NO：11)、400nM反向引物(SEQ ID NO：12)、200nM双标记荧光探针(SEQ ID NO：13)(Applied Biosystems)、5.5mM MgCl₂和1.25单位Gold Taq(Applied Biosystems)。引物扩增约80个核苷酸长的一部分LXRα序列。PCR热循环参数为95℃10分钟，以及95℃15秒和60℃1分钟的40个循环。与样品和无模板对照一起平行分析连续稀释的cDNA标准。使用用于GAPDH的Predeveloped Assays(Applied Biosystems)的探针和引物，在相同实验中平行分析所有样品的人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达。将所有的靶基因表达对GAPDH表达归一化。按照生产商(Perkin-Elmer)的方法，使用阈值法进行定量分析，由标准曲线计算相对量。

在这些研究中用于检测LXRα变体LXRα-64的引物和探针如下：L64-For(5′-TGGGAAGCAGGGATGAGG-3′；SEQ ID NO：11)、L64-Rev(5′-GAGGGCTGGTCTTGGAGCA-3′；SEQ ID NO：12)，以及L64TaqMan探针(FAM-TCGGCCTCCCTGGMGAGGCC-TAMRA；SEQ ID NO：13)。L64引物和探针位于在LXRα-64cDNA中存在的64个核苷酸中。

LXRα-64mRNA被发现在肝中表达最丰富(图7A)。还在小肠、胎盘、胰腺、卵巢和结肠中检测到相对较高水平的转录物。在其它测试组织中观测到的表达非常少。在这些研究中用于检测LXRα变体LXRα-42的引物和探针如下：L42-For(5′-GGTGGAGGCATTTGCTGTGT-3′；SEQ ID NO：21)、L42-Rev(5′-CCCAAATTGCMCCAAAATATAGA-3′；SEQ ID NO：22)和L42探针(FAM-TTTAGGATGAGAGAGCTTGGCTGGAGCAT-TAMRA；SEQ ID NO：23)。FAM/TAMRA荧光探针可由BioSearch Technologies(Novato，CA)获得。

与LXRα-64相比，LXRα-42的表达具有不同的模式。尽管在肝中观测到的表达最丰富，但在其它测试组织中仅检测到低水平的LXRα-42序列或没有检测到。

野生型LXRα以及LXRα变体在肝中高表达。在肝之后，野生型LXRα在胰腺中的存在量最丰富，其后是睾丸、小肠和脾脏，它们具有相似的mRNA水平。前列腺、胸腺、肾脏、卵巢、胎盘、肺和结肠表达低于睾丸，而白细胞、心脏、脑和骨骼肌含有的野生型LXRαmRNA的量可忽略不计。LXRα-64在肝脏中的表达水平也是最高，其后是小肠。胎盘、胰腺、卵巢、结肠和肺表达的LXRα-64低于小肠。在肾脏和白细胞中观测到的表达甚至更低，而心脏、脑、骨骼肌、脾脏、胸腺、前列腺和睾丸含有的表达量可忽略不计。LXRα-42在肺中的表达(LXRα-42e^-+LXRα-42e⁺)比在肝脏中低。其余组织(见前文讨论)的表达水平明显比肝脏低。

实施例5

LXR激动剂在dTHP-1细胞中上调LXRα-64

进行实验，以确定野生型LXRα激动剂是否也可调节LXRα变体的表达。在这些实验中，THP-1细胞由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，并在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中培养。为在分化的THP-1细胞中进行基因表达分析，在补加10％无脂蛋白血清(LPDS)(Intracel Corp，Rockville，MD)的RPMI培养基中温育THP1细胞，并用150nM佛波酯处理3天，接着用LXR、RXR或过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂化合物处理，具体地说是用仅载体(对照)、10μM T0901317、10μM GW 3965、10μM Ciglitazone或1μM9RA处理。用于实时RT-PCR的引物和TaqMan探针如实施例4所述。数据表明，在与两种合成LXR激动剂(T0901317([N-(2，2，2，-三氟-乙基)-N-[4-(2，2，2，-三氟-1-羟基-1-三氟甲基-乙基)-苯基]-苯磺酰胺])(Repa et al.，Science 2000 289(5484)：1524-9，和Schultz et al.，GenesDev.200014(22)：2831-8)、GW3965[3-(3-(2-氯-3-三氟甲基苄基-2，2-二苯基乙氨基)丙氧基)苯乙酸](Collins et al.，J.Med.Chem.，2002 45：1963-1966和Laffitte et al.，Mol.Cell.Biol.2001，21：7558-7568))中的任一种、PPARγ配体(10μM Citglitazone)和RXR配体(9-顺式视黄酸)温育的THP-1细胞中，LXRα-64和LXRα-42mRNA的表达都增加(图8A和8B)。

这些数据表明，可使用已知LXRα激动剂诱导LXRα变体的表达。

实施例6

LXRα变体的功能特征

使用公开的LXRα基因组结构和序列信息(GenBank检索号AC090589)，通过PCR扩增人LXRα启动子(SEQ ID NO：14)。将LXRα启动子由-2660至-2363(相对于外显子1的转录起始位点)的片段亚克隆入pGL3基本质粒，产生pGL-3-LXRα-Luc，其中所述片段含LXR效应元件(5′-TGACCAgcagTAACCT-3′，SEQ ID NO：20)(Laffitte et al.2001，Mol.Cell.Biol.21，7558-7568和Whitney et al.，2001，J.Biol.Chem.276，43509-43515)。用作本文公开实验和分析的参比的LXRα“天然”序列其GenBank登录号是人LXRα的Genbank登录号BC008819。根据GenBank中的序列，通过RT-PCR扩增人LXRα和RXRα(GenBank登录号BC007925)的编码区，将其亚克隆入pCMV/myc/nuc表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将新的LXRα-L64编码区亚克隆入pCMV/myc/nuc表达载体。

在含10％FBS的Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)中培养HEK 293细胞。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)在24孔板中一式三份进行转染。每个孔用400ng报告基因质粒、100ng报告基因表达载体以及200ng含细菌β-半乳糖苷酶基因的pCMV-βgal参比质粒转染。调节每个孔的加入量，以使每个孔含恒定量的DNA和pCMV(Invitrogen，Carlsbad，CA)表达载体。在转染后6-8小时，用磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗细胞1次，然后与含10％无脂蛋白血清(LPDS)(IntracelCorp，Rockville，MD)的新鲜培养基和LXR激动剂、RXR激动剂或载体对照温育24小时。收获细胞，进行分析，以微量滴定板发光计/光度计读数器(Lucy-1；Anthos，Salzburg，Austria)测定提取物的荧光素酶活性和β-半乳糖苷酶活性。将荧光素酶活性对β-半乳糖苷酶活性归一化。

更详细地说，用对照pGL3-基本载体(Promega Madison，WI 53711)或pGL3-LXRα-Luc(含LXRα启动子的LXRE序列(TGACCAgcagTAACCT；SEQ ID NO：20)的部分LXRα启动子亚克隆入pGL3-基本载体的Kpn I/Xho I位点中)报告基因和pCMV-hLXRα/pCMV-hRXRα、pCMV-LXRα-64/pCMV-hRXRα、pCMV-LXRα-42e⁺/pCMV-hRXRα、pCMV-LXRα-42e^-/pCMV-hRXRα分别共转染HEK 293细胞。在转染后，将细胞在补加10％无脂蛋白血清(LPDS)和10μM T0901317或载体对照的DMEM中温育24小时，然后测定荧光素酶活性并归一化。

如图9所示，当新LXRα变体与报告基因共转染时，与天然LXRα共转染相比，LXR配体依赖性活化急剧下降。而且，如图10所示，当变体和LXRα与报告基因同时共转染时，与一同的LXRα共转染相比，外源LXRα的活化受到抑制。这些数据表明，新克隆的LXRα变体可起天然LXRα表达的显性负调控调节物的作用。

实施例7

LXRα变体调节LXR靶基因

LXRα的重要特征在于其与多种生理作用相关，其中某些生理作用对生物体是有利的，而其中某些生理作用至少在某些情况下对生物体是有害的。因此，本文描述的新LXRα变体的发现提供了以下目标：允许差异调节细胞中LXRα的不同方面。为测定变体的功能，检测在表达的LXRα变体存在下LXR靶基因的表达。

在这些实验中，通过RT-PCR扩增人LXRα、RXRα和LXRα变体(LXRα-64)的编码区。将PCR产物亚克隆入pCMV/myc/nuc表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并用于下文描述的实验。

使用在含10％FBS的Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)中繁殖的HEK 293细胞进行表达实验。用含LXRα(野生型)编码序列的表达载体或编码LXRα-64的表达载体转染培养的细胞。所有的样品都用编码RXRα序列的表达载体共转染。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)在24孔板中一式三份进行转染。每个孔用200ng LXRα表达载体(LXRα)、LXRα-64表达载体(L64)或对照质粒(pCMV)连同200ng人RXRα表达载体(RXRα)转染。调节每个孔的加入量，以使每个孔含恒定量的DNA和pCMV表达载体。在转染后6-8小时，用磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗细胞1次，然后将细胞与含10％无脂蛋白血清(LPDS)(Intracel Corp，Rockville，MD)的新鲜培养基和合成LXR激动剂(TO901317)和/或RXR激动剂(9-顺式视黄酸，9RA)或仅载体(对照)温育48小时。然后收获细胞，使用QIAGEN试剂盒由细胞中分离总RNA。使用Applied Biosystems 7700序列检测仪，以实时定量PCR测定基因表达水平。

当用人RXRα编码序列和编码新变体LXRα-64的序列共转染并在HEK 293细胞中表达时，与用野生型LXRα和RXRα或空表达载体和RXRα转染的细胞中的SREBP-c1表达相比，基础的、LXR-配体依赖性和LXR+RXR配体依赖性诱导的SREBP-c1(LXR靶基因)表达急剧下降(图11)。变体L64和RXRα引入到细胞中未影响另一种LXR靶基因ABCA1的基础表达。但是，与天然LXRα和RXRα或空表达载体和RXRα转染的细胞中的表达相比，LXR以及LXR+RXR-配体依赖性诱导的ABCA1表达在表达LXRα-64和RXRα的细胞中较少(图12)。

这些数据表明，LXRα变体可差异性调节HEK 293细胞中的LXR靶基因表达，起LXRα诱导型基因表达的显性负调控调节物的作用。因此，调节LXRα变体的表达或活性提供了在细胞中差异性调节LXRα相关性作用的方法。

这些数据还表明，LXRα变体的过表达可抑制SREBP-C1表达。另外，LXR激动剂对SREBP-1C表达的诱导在表达LXRα变体(例如LXRα-64)的细胞中显著下降。因此，增加LXRα变体(例如LXRα-64)的表达或活性对治疗与SREBP-1C表达相关的疾病有用。例如，通过过表达LXRα-64或增加在细胞中表达的LXRα-64的活性(例如通过给予与野生型LXRα相比差异性结合LXRα-64的化合物)破坏LXRα的活性，可提供抑制胰岛素诱导SREBP-1C的方法，因此提供抑制不需要的胰岛素诱导脂肪酸合成的方法。在另一个实施例中，过表达LXRα变体(例如LXRα-64)或选择性激活LXRα变体(例如用差异性结合LXRα变体的化合物)可对SREBP-1C产生抑制，由此提供治疗高甘油三酯血症的方法，高甘油三酯血症是心脏病的强烈预示。在另一个实施例中，降低SREBP-1C表达(通过增加LXRα变体如LXRα-64的表达或活性)可降低VLDL-TG(极低密度脂蛋白甘油三酯)的表达，这在某些疾病如糖尿病和某些类型的高脂蛋白血症中是需要的效果。

在LXR激动剂存在下野生型LXR表达对参与反向胆固醇转运的ABCA1具有上调作用。LXRα变体(例如LXRα-64)的表达对细胞进程几乎没有明显作用。因此，LXRα变体过表达的有益之处在于：其降低了特定LXRα靶基因(例如SREBP-1C)的表达，但不影响可能需要其表达的另一种LXRα靶基因(例如ABCA1)。

与RXR杂二聚化并活化这些杂二聚体的核受体导致特定基因的表达增加。对于这些基因中的一种或多种的表达不需要的情况(例如LXR介导的SREBP1c上调)，如果表达的LXRα变体结合RXR，由此降低了用于杂二聚化的RXR的利用度，并因此减少了对不需要的基因表达的诱导，则LXRα-64的过表达可对受试者有益。

序列表

SEQ ID NO：1

野生型LXRα完整编码区的cDNA

1 atgtccttgt ggctgggggc ccctgtgcct gacattcctc ctgactctgc

51 ggtggagctg tggaagccag gcgcacagga tgcaagcagc caggcccagg

101 gaggcagcag ctgcatcctc agagaggaag ccaggatgcc ccactctgct

151 gggggtactg caggggtggg gctggaggct gcagagccca cagccctgct

201 caccagggca gagccccctt cagaacccac agagatccgt ccacaaaagc

251 ggaaaaaggg gccagccccc aaaatgctgg ggaacgagct atgcagcgtg

301 tgtggggaca aggcctcggg cttccactac aatgttctga gctgcgaggg

351 ctgcaaggga ttcttccgcc gcagcgtcat caagggagcg cactacatct

401 gccacagtgg cggccactgc cccatggaca cctacatgcg tcgcaagtgc

451 caggagtgtc ggcttcgcaa atgccgtcag gctggcatgc gggaggagtg

501 tgtcctgtca gaagaacaga tccgcctgaa gaaactgaag cggcaagagg

551 aggaacaggc tcatgccaca tccttgcccc ccaggcgttc ctcacccccc

601 caaatcctgc cccagctcag cccggaacaa ctgggcatga tcgagaagct

651 cgtcgctgcc cagcaacagt gtaaccggcg ctccttttct gaccggcttc

701 gagtcacgcc ttggcccatg gcaccagatc cccatagccg ggaggcccgt

751 cagcagcgct ttgcccactt cactgagctg gccatcgtct ctgtgcagga

801 gatagttgac tttgctaaac agctacccgg cttcctgcag ctcagccggg

851 aggaccagat tgccctgctg aagacctctg cgatcgaggt gatgcttctg

901 gagacatctc ggaggtacaa ccctgggagt gagagtatca ccttcctcaa

951 ggatttcagt tataaccggg aagactttgc caaagcaggg ctgcaagtgg

1001 aattcatcaa ccccatcttc gagttctcca gggccatgaa tgagctgcaa

1051 ctcaatgatg ccgagtttgc cttgctcatt gctatcagca tcttctctgc

1101 agaccggccc aacgtgcagg accagctcca ggtggagagg ctgcagcaca

1151 catatgtgga agccctgcat gcctacgtct ccatccacca tccccatgac

1201 cgactgatgt tcccacggat gctaatgaaa ctggtgagcc tccggaccct

1251 gagcagcgtc cactcagagc aagtgtttgc actgcgtctg caggacaaaa

1301 agctcccacc gctgctctct gagatctggg atgtgcacga atga

SEQ ID NO：2

野生型LXRα的推断氨基酸序列

1 MSLWLGAPVP DIPPDSAVEL WKPGAQDASS QAQGGSSCIL REEARMPHSA

51 GGTAGVGLEA AEPTALLTRA EPPSEPTEIR PQKRKKGPAP KMLGNELCSV

101 CGDKASGFHY NVLSCEGCKG FFRRSVIKGA HYICHSGGHC PMDTYMRRKC

151 QECRLRKCRQ AGMREECVLS EEQIRLKKLK RQEEEQAHAT SLPPRRSSPP

201 QILPQLSPEQ LGMIEKLVAA QQQCNRRSFS DRLRVTPWPM APDPHSREAR

251 QQRFAHFTEL AIVSVQEIVD FAKQLPGFLQ LSREDQIALL KTSAIEVMLL

301 ETSRRYNPGS ESITFLKDFS YNREDFAKAG LQVEFINPIF EFSRAMNELQ

351 LNDAEFALLI AISIFSADRP NVQDQLQVER LQHTYVEALH AYVSIHHPHD

401 RLMFPRMLMK LVSLRTLSSV HSEQVFALRL QDKKLPPLLS EIWDVHE*

SEQ ID NO：3

编码LXRα-64的cDNA序列

1 atgtccttgt ggctgggggc ccctgtgcct gacattcctc ctgactctgc

51 ggtggagctg tggaagccag gcgcacagga tgcaagcagc caggcccagg

101 gaggcagcag ctgcatcctc agagaggaag ccaggatgcc ccactctgct

151 gggggtactg caggggtggg gctggaggct gcagagccca cagccctgct

201 caccagggca gagccccctt cagaacccac agagatccgt ccacaaaagc

251 ggaaaaaggg gccagccccc aaaatgctgg ggaacgagct atgcagcgtg

301 tgtggggaca aggcctcggg cttccactac aatgttctga gctgcgaggg

351 ctgcaaggga ttcttccgcc gcagcgtcat caagggagcg cactacatct

401 gccacagtgg cggccactgc cccatggaca cctacatgcg tcgcaagtgc

451 caggagtgtc ggcttcgcaa atgccgtcag gctggcatgc gggaggagtg

501 tgtcctgtca gaagaacaga tccgcctgaa gaaactgaag cggcaagagg

551 aggaacaggc tcatgccaca tccttgcccc ccaggcgttc ctcacccccc

601 caaatcctgc cccagctcag cccggaacaa ctgggcatga tcgagaagct

651 cgtcgctgcc cagcaacagt gtaaccggcg ctccttttct gaccggcttc

701 gagtcacgcc ttggcccatg gcaccagatc cccatagccg ggaggcccgt

751 cagcagcgct ttgcccactt cactgagctg gccatcgtct ctgtgcagga

801 gatagttgac tttgctaaac agctacccgg cttcctgcag ctcagccggg

851 aggaccagat tgccctgctg aagacctctg cgatcgaggt ggctggagaa

901 gggcaaggga tgaagggaga agcagagtgg gattatctgt gggaggggcc

951 tccagacatc gagctgggag agccaaatct gctgggaagc agggatgagg

1001 agaatcggcc tccctggaag aggccatgct ccaagaccag ccctcctagt

1051 ccccgtttga ggtttgctgc ttgtgtgcag gtgatgcttc tggagacatc

1101 tcggaggtac aaccctggga gtgagagtat caccttcctc aaggatttca

1151 gttataaccg ggaagacttt gccaaagcag ggctgcaagt ggaattcatc

1201 aaccccatct tcgagttctc cagggccatg aatgagctgc aactcaatga

1251 tgccgagttt gccttgctca ttgctatcag catcttctct gcagaccggc

1301 ccaacgtgca ggaccagctc caggtggaga ggctgcagca cacatatgtg

1351 gaagccctgc atgcctacgt ctccatccac catccccatg accgactgat

1401 gttcccacgg atgctaatga aactggtgag cctccggacc ctgagcagcg

1451 tccactcaga gcaagtgttt gcactgcgtc tgcaggacaa aaagctccca

1501 ccgctgctct ctgagatctg ggatgtgcac gaatga

SEQ ID NO：4

LxRα-64的推断氨基酸序列

1 MSLWLGAPVP DIPPDSAVEL WKPGAQDASS QAQGGSSCIL REEARMPHSA

51 GGTAGVGLEA AEPTALLTRA EPPSEPTEIR PQKRKKGPAP KMLGNELCSV

101 CGDKASGFHY NVLSCEGCKG FFRRSVIKGA HYICHSGGHC PMDTYMRRKC

151 QECRLRKCRQ AGMREECVLS EEQIRLKKLK RQEEEQAHAT SLPPRRSSPP

201 QILPQLSPEQ LGMIEKLVAA QQQCNRRSFS DRLRVTPWPM APDPHSREAR

251 QQRFAHFTEL AIVSVQEIVD FAKQLPGFLQ LSREDQIALL KTSAIEVAGE

301 GQGMKGEAEW DYLWEGPPDI ELGEPNLLGS RDEENRPPWK RPCSKTSPPS

351 PRLRFAACVQ VMLLETSRRY NPGSESITFL KDFSYNREDF AKAGLQVEFI

401 NPIFEFSRAM NELQLNDAEF ALLIAISIFS ADRPNVQDQL QVERLQHTYV

451 EALHAYVSIH HPHDRLMFPR MLMKLVSLRT LSSVHSEQVF ALRLQDKKLP

501 PLLSEIWDVH E*

SEQ ID NO：5

LXRα-42e+编码区的cDNA序列

1 atgtccttgt ggctgggggc ccctgtgcct gacattcctc ctgactctgc

51 ggtggagctg tggaagccag gcgcacagga tgcaagcagc caggcccagg

101 gaggcagcag ctgcatcctc agagaggaag ccaggatgcc ccactctgct

151 gggggtactg caggggtggg gctggaggct gcagagccca cagccctgct

201 caccagggca gagccccctt cagaacccac agagatccgt ccacaaaagc

251 ggaaaaaggg gccagccccc aaaatgctgg ggaacgagct atgcagcgtg

301 tgtggggaca aggcctcggg cttccactac aatgttctga gctgcgaggg

351 ctgcaaggga ttcttccgcc gcagcgtcat caagggagcg cactacatct

401 gccacagtgg cggccactgc cccatggaca cctacatgcg tcgcaagtgc

451 caggagtgtc ggcttcgcaa atgccgtcag gctggcatgc gggaggagtg

501 tgtcctgtca gaagaacaga tccgcctgaa gaaactgaag cggcaagagg

551 aggaacaggc tcatgccaca tccttgcccc ccaggcgttc ctcacccccc

601 caaatcctgc cccagctcag cccggaacaa ctgggcatga tcgagaagct

651 cgtcgctgcc cagcaacagt gtaaccggcg ctccttttct gaccggcttc

701 gagtcacgcc ttggcccatg gcaccagatc cccatagccg ggaggcccgt

751 cagcagcgct ttgcccactt cactgagctg gccatcgtct ctgtgcagga

801 gatagttgac tttgctaaac agctacccgg cttcctgcag ctcagccggg

851 aggaccagat tgccctgctg aagacctctg cgatcgaggt gatgcttctg

901 gagacatctc ggaggtacaa ccctgggagt gagagtatca ccttcctcaa

951 ggatttcagt tataaccggg aagactttgc caaagcaggg ctgcaagtgg

1001 aattcatcaa ccccatcttc gagttctcca gggccatgaa tgagctgcaa

1051 ctcaatgatg ccgagtttgc cttgctcatt gctatcagca tcttctctgc

1101 aggtgtggag gaggggcaat gggaaacagc aagagactta caccaaggag

1151 ggctgcaggt cccacaggaa tcggtggggg gaggggggtg gtggcttggg

1201 agggtggagg catttgctgt gttattttag

SEQ ID NO：6

LXRα-42e+的推断氨基酸序列

1 MSLWLGAgVP DIPPDSAVEL WKPGAQDASS QAQGGSSCIL REEARMPHSA

51 GGTAGVGLEA AEPTALLTRA EPPSEPTEIR PQKRKKGPAP KMLGNELCSV

101 CGDKASGFHY NVLSCEGCKG FFRRSVIKGA HYICHSGGHC PMDTYMRRKC

151 QECRLRKCRQ AGMREECVLS EEQIRLKKLK RQEEEQAHAT SLPPRRSSPP

201 QILPQLSPEQ LGMIEKLVAA QQQCNRRSFS DRLRVTPWPM APDPHSREAR

251 QQRFAHFTEL AIVSVQEIVD FAKQLPGFLQ LSREDQIALL KTSAIEVMLL

301 ETSRRYNPGS ESITFLKDFS YNREDFAKAG LQVEFINPIF EFSRAMNELQ

351 LNDAEFALLI AISIFSAGVE EGQWETARDL HQGGLQVPQE SVGGGGWWLG

401 RVEAFAVLF*

SEQ ID NO：7

编码LXRα-42e-的cDNA序列

1 atgtccttgt ggctgggggc ccctgtgcct gacattcctc ctgactctgc

51 ggtggagctg tggaagccag gcgcacagga tgcaagcagc caggcccagg

101 gaggcagcag ctgcatcctc agagaggaag ccaggatgcc ccactctgct

151 gggggtactg caggggtggg gctggaggct gcagagccca cagccctgct

201 caccagggca gagccccctt cagaacccac agagatccgt ccacaaaagc

251 ggaaaaaggg gccagccccc aaaatgctgg ggaacgagct atgcagcgtg

301 tgtggggaca aggcctcggg cttccactac aatgttctga gctgcgaggg

351 ctgcaaggga ttcttccgcc gcagcgtcat caagggagcg cactacatct

401 gccacagtgg cggccactgc cccatggaca cctacatgcg tcgcaagtgc

451 caggagtgtc ggcttcgcaa atgccgtcag gctggcatgc gggaggagtg

501 tgtcctgtca gaagaacaga tccgcctgaa gaaactgaag cggcaagagg

551 aggaacaggc tcatgccaca tccttgcccc ccaggcgttc ctcacccccc

601 caaatcctgc cccagctcag cccggaacaa ctgggcatga tcgagaagct

651 cgtcgctgcc cagcaacagt gtaaccggcg ctccttttct gaccggcttc

701 gagtcacggt gatgcttctg gagacatctc ggaggtacaa ccctgggagt

751 gagagtatca ccttcctcaa ggatttcagt tataaccggg aagactttgc

801 caaagcaggg ctgcaagtgg aattcatcaa ccccatcttc gagttctcca

851 gggccatgaa tgagctgcaa ctcaatgatg ccgagtttgc cttgctcatt

901 gctatcagca tcttctctgc aggtgtggag gaggggcaat gggaaacagc

951 aagagactta caccaaggag ggctgcaggt cccacaggaa tcggtggggg

1001 gaggggggtg gtggcttggg agggtggagg catttgctgt gttattttag

SEQ ID NO：8

LXRα-42e-的推断氨基酸序列

1 MSLWLGAPVP DIPPDSAVEL WKPGAQDASS QAQGGSSCIL REEARMPHSA

51 GGTAGVGLEA AEPTALLTRA EPPSEPTEIR PQKRKKGPAP KMLGNELCSV

101 CGDKASGFHY NVLSCEGCKG FFRRSVIKGA HYICHSGGHC PMDTYMRRKC

151 QECRLRKCRQ AGMREECVLS EEQIRLKKLK RQEEEQAHAT SLPPRRSSPP

201 QILPQLsPEQ LGMIEKLVAA QQQCNRRSFS DRLRVTVMLL ETSRRYNPGS

251 ESITFLKDFS YNREDFAKAG LQVEFINPIF EFSRAMNELQ LNDAEFALLI

301 AISIFSAGVE EGQWETARDL HQGGLQVPQE SVGGGGWWLG RVEAFAVLF*

SEQ ID NO：9

正向引物LXRα-For的核苷酸序列

5′-CGGTCGACATGTCCTTGTGGCTGGGG

SEQ ID NO：10

反向引物LXRα-Rev的核苷酸序列

5′-CAGCGGCCGCTTCGTGCACATCCCAGATCTC

SEQ ID NO：11

正向引物L64-For的核苷酸序列

5′-TGGGAAGCAGGGATGAGG-3′

SEQ ID NO：12

反向引物L64-Rev的核苷酸序列

5′-GAGGGCTGGTCTTGGAGCA-3′

SEQ ID NO：13

L64 TaqMan探针的核苷酸序列

FAM-TCGGCCTCCCTGGAAGAGGCC-TAMRA

SEQ ID NO：14

部分LXRα启动子序列；用于实施例6中提及的荧光素酶实验

1 tgggaactgg agttcatagc aaaacaggaa gagccggtga gcaggaaact

51 gggaatgggg cagggggtga atgaccagca gtaacctcag cagcttgcct

101 cccacatctg gactggagca tctgcagggt tctcagcctc tcccctgtag

151 cccaccagcc ctggctgctt ccattacagc acttcactgg cccaagacgc

201 aacaagacaa gattgtcctg gactctgaca cagcaaaggg actggagtga

251 ggacatctgg gttctgatcc cagcccagcc actaactgtg tggtcttgga

SEQ ID NO：15

LXR效应元件(LXRE)的核苷酸序列

5′-AGGTCAnnnnAGGTCA-3′

SEQ ID NO：16

LXRα-64变体独有的核苷酸序列，其形成了一个新的更大的外显子6，连接野生型LXRα的外显子6和7。

GCTGGAGAAG GGCAAGGGAT GAAGGGAGAA GCAGAGTGGG ATTATCTGTG GGAGGGGCCT

CCAGACATCG AGCTGGGAGA GCCAAATCTG CTGGGAAGCA GGGATGAGGA GAATCGGCCT

CCCTGGAAGA GGCCATGCTC CAAGACCAGC CCTCCTAGTC CCCGTTTGAG GTTTGCTGCT

TGTGTGCAGG TG

SEQ ID NO：17

由SEQ ID NO：16编码的推断氨基酸序列

VAGEGQGMKGEAEWDYLWEGPPDIELGEPNLLGS RDEENRPPWKRPCSKTSPPSPRLRFAACVQ

SEQ ID NO：18

LXRα-42e独有的核苷酸序列，其形成了新的外显子8，该序列包括野生型LXRα的外显子8，产生了外显子8更长的LxRα-42变体

GTGTGGAGGA GGGGCAATGG GAAACAGCAA GAGACTTACA CCAAGGAGGG CTGCAGGTCC

CACAGGAATC GGTGGGGGGA GGGGGGTGGT GGCTTGGGAG GGTGGAGGCA TTTGCTGTGT

TATTTTAGGA TGAGAGAGCT TGGCTGGAGC ATGTCTCTAT ATTTTGGTTG CAATTTGGGG

TATGGAACTG GACCCTGGCC AGACCTGCTC CTCAACTCTC TTGGTGACCT ATAG

SEQ ID NO：19

由SEQ ID NO：18编码的推断氨基酸序列

GVEEGQWETARDLHQGGLQVPQESVGGGGWWLGRVEAFAVLF

SEQ ID NO：20

LXRα启动子中的LXR效应元件(LXRE)的核苷酸序列

5′-TGACCAgcagTAACCT-3′

SEQ ID NO：21

L42-For的核苷酸序列

5′-GGTGGAGGCATTTGCTGTGT-3′

SEQ ID NO：22

LA2-Rev的核苷酸序列

5′-CCCAAATTGCAACCAAAATATAGA-3′

SEQ ID NO：23

L42探针的核苷酸序列

FAM-TTTAGGATGAGAGAGCTTGGCTGGAGCAT-TAMRA

其它实施方案

要理解地是，尽管已结合本发明的详述阐述了本发明，但前文的描述意在说明，而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围所限定。其它的方面、优势和修改都属于以下权利要求书的范围。

Claims

1.一种编码人肝脏X受体α(LXRα)变体多肽的分离核酸分子，所述分离核酸分子选自：

(a)编码SEQ ID NO：4、6、8、17或19的分离核酸分子；

(b)编码与SEQ ID NO：4、6、8、17或19具有至少90％一致性的氨基酸序列的分离核酸分子；

(c)在以下杂交条件下与(a)或(b)的分离核酸分子杂交的分离核酸分子：6×SSC(1M NaCl)、50％甲酰胺、1％SDS，42℃，以1×SSC于42℃漂洗，以及以0.2×SSC和0.1％SDS于68℃漂洗；和

(d)与(a)、(b)或(c)互补的分离核酸分子。

2.权利要求1的分离核酸分子，所述分离核酸分子由SEQ IDNO：3、5、7、16或18组成。

3.权利要求1的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子为DNA分子。

4.权利要求1的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子为RNA分子。

5.权利要求1的分离核酸分子，其中所述分离核酸分子包含SEQID NO：3、5、7、16或18。

6.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有LXR反应途径活性的多肽。

7.权利要求1的核酸分子，其中由所述分离核酸分子编码的多肽可与野生型LXRα形成二聚体。

8.权利要求1的核酸分子，其中由所述分离核酸分子编码的多肽可与类视黄醇X受体(RXR)形成杂二聚体。

9.权利要求8的核酸分子，其中所述RXR是RXRα、RXRβ或RXRγ。

10.一种多肽，所述多肽由权利要求1的分离核酸分子编码。

11.权利要求10的多肽，其中所述多肽可与野生型LXRα形成二聚体。

12.权利要求10的多肽，其中所述多肽可与RXR形成杂二聚体。

13.权利要求12的多肽，其中杂二聚体的形成可抑制RXR和核受体之间形成杂二聚体，所述核受体与RXR天然杂二聚化。

14.权利要求12的多肽，其中杂二聚体的形成可抑制RXR同二聚体的形成。

15.权利要求12的多肽，其中RXR是RXRα、RXRβ或RXRγ。

16.权利要求10的多肽，其中所述多肽可表现出LXRα显性负调控活性。

17.权利要求12的多肽，其中所述LXRα变体为LXRα-64、LXRα-42⁺或LXRα-42^-的片段。

18.权利要求17的多肽，其中所述LXRα变体片段可表现出LXRα变体的至少一种功能。

19.一种构建物，所述构建物包含权利要求1的分离核酸分子。

20.权利要求19的构建物，其中所述分离核酸分子有效连接至调节序列。

21.权利要求19的构建物，其中所述构建物为质粒。

22.权利要求19的构建物，其中所述构建物包含pCMV/myc或pcDNA 3.1或是其衍生物。

23.一种宿主细胞或细胞的子代，其包含权利要求1的分离核酸分子。

24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求19的构建物。

25.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞。

26.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。

27.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

28.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞为人细胞。

29.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞为人胚胎细胞。

30.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：人肝细胞瘤细胞(HepG2)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、猴COS-1细胞和人胚肾细胞(HEK 293)。

31.权利要求23的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)细胞和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

32.一种分离的多肽，所述多肽包含LXRα-64、LXRα-42⁺或LXRα-42^-的氨基酸序列。

33.权利要求32的分离多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：4、6、8、17、19的氨基酸序列、其天然等位基因变体或其片段。

34.权利要求32的分离多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：4、6、8、17、19的氨基酸序列或其片段组成，该片段不与SEQ ID NO：2的超过5个连续氨基酸共享同源性。

35.权利要求32的多肽，所述多肽进一步包含异源氨基酸序列。

36.一种检测样品中是否存在权利要求32的多肽的方法，所述方法包括：

a)使样品与选择性结合权利要求32的多肽的化合物接触；和

b)测定该化合物是否结合样品中的多肽。

37.权利要求37的方法，其中所述结合多肽的化合物为抗体。

38.一种试剂盒，所述试剂盒包含选择性结合权利要求32的多肽的化合物和使用说明。

39.一种抗体，所述抗体特异性结合权利要求14或权利要求32的分离多肽。

40.权利要求39的抗体，其中所述抗体为多克隆抗体。

41.权利要求39的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。

42.权利要求39的抗体，其中所述抗体含可检测标记。

43.一种组合物，所述组合物包含权利要求39的抗体和药物可接受载体。

44.一种鉴别新LXRα变体核酸分子的方法，所述方法包括：

(a)在严格杂交条件下，使含一种或多种核酸分子的样品与LXRα变体核酸分子或其片段杂交；

(b)鉴别样品中与LXRα变体核酸分子杂交的核酸分子，由此鉴别推定的LXRα变体核酸分子；和

(c)测定推定的LXRα变体核酸分子的序列，其中其序列与LXRα变体序列不相同的推定LXRα变体核酸分子是新LXRα变体核酸。

45.权利要求44的方法，其中所述新LXRα变体核酸分子编码LXRα变体多肽。

46.权利要求45的方法，其中所述新LXRα变体多肽与LXRα变体多肽相比包含一个或多个保守置换。

47.一种检测生物样品中LXRα变体表达的方法，所述方法包括：

(a)使生物样品与权利要求1的核酸分子杂交；和

(b)测定核酸分子是否与样品中的核酸分子杂交，其中杂交表示表达了LXRα变体。

48.权利要求47的方法，其中对杂交量进行测定。

49.一种降低细胞中RXR二聚体形成的方法，所述方法包括使细胞与权利要求10的多肽接触，由此抑制RXR二聚体形成。

50.权利要求49的方法，其中RXR杂二聚化受到抑制。

51.权利要求49的方法，其中RXR同二聚化受到抑制。

52.一种鉴别LXRα变体配体的方法，所述方法包括：

(a)提供含LXRα变体多肽的样品；

(b)使样品与测试化合物接触；

(c)测定测试化合物是否可结合LXRα变体，其中可结合LXRα变体的化合物为LXRα变体配体。

53.权利要求52的方法，其中所述配体的Kd小于1×10⁶。

54.权利要求52的方法，其中所述配体的Kd小于1×10⁹。

55.权利要求52的方法，其中RXR存在于样品中。

56.权利要求52的方法，所述方法进一步包括测定LXRα变体配体是否可结合野生型LXRα。

57.权利要求52的方法，其中所述LXRα变体配体不结合野生型LXRα。

58.权利要求52的方法，其中与野生型LXRα相比，所述LXRα变体配体对LXRα变体的亲和性较高。

59.一种调节LXRα调节性基因表达的方法，所述方法包括调节LXRα变体的表达或活性。

60.权利要求59的方法，其中所述LXRα调节性基因为FAS、CYP7A1(胆固醇7-α羟化酶)、ApoE、CETP(胆固醇酯转移蛋白)、LPL(脂蛋白脂酶)、ABCG1、ABCG5、ABCG8、ABCG4或PLTP(磷脂转移蛋白)。

61.权利要求59的方法，其中所述LXRα调节性基因为SREBP-1C(甾醇调节结合元件1c)、FAS、CYP7A1(胆固醇7-α羟化酶)、ApoE、CETP(胆固醇酯转移蛋白)、LPL(脂蛋白脂酶)、ABCA1(ATP-结合盒转运体-1)、ABCG1、ABCG5、ABCG8、ABCG4或PLTP(磷脂转移蛋白)。

62.权利要求59的方法，其中所述LXRα调节性基因的表达增加。

63.权利要求59的方法，其中所述LXRα调节性基因的表达降低。

64.权利要求59的方法，其中所述LXRα变体为LXRα-64、LXRα-42⁺或LXRα-42^-。

65.一种调节受试者中LXRα变体表达或活性的方法，所述方法包括

将LXRα变体核酸分子或其片段以足以表达LXRα变体的量和时间导入受试者中，并调节LXRα的表达或活性。

66.权利要求65的方法，其中所述LXRα变体抑制野生型LXRα的表达或活性。

67.权利要求65的方法，其中所述活性为LXRα杂二聚化。

68.权利要求66的方法，其中所述LXRα杂二聚化受配体刺激。

69.权利要求68的方法，其中所述LXRα变体为LXRα-64、LXRα-42⁺或LXRα-42^-。

70.一种调节受试者中RXR表达或活性的方法，所述方法包括

将LXRα变体核酸分子或其片段以足以表达LXRα变体的量和时间导入受试者中，并调节RXR的表达或活性。

71.权利要求70的方法，其中RXR的杂二聚化受调节或RXR的同二聚化受调节。

72.权利要求70的方法，其中RXR与PPARα、PPARγ、PPARδ、RAR、XR或PXR的杂二聚化受调节。

73.权利要求70的方法，其中RXR杂二聚化受抑制或RXR同二聚化受抑制。

74.权利要求70的方法，其中所述LXRα变体为LXRα-64、LXRα-42⁺或LXRα-42^-。

75.权利要求70的方法，其中所述RXR为RXRα、RXRβ或RXRγ。

76.一种治疗具有RXR相关疾病或病症的个体的方法，所述方法包括给予该个体药学有效量的LXRα变体。

77.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求23的细胞和药物可接受载体、权利要求1的分离核酸分子和药物可接受载体、或权利要求10的多肽和药物可接受载体。