CN110218724A

CN110218724A - 猪nr1h3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测

Info

Publication number: CN110218724A
Application number: CN201910512066.1A
Authority: CN
Inventors: 曹果清; 高鹏飞; 张雪莲; 郭晓红; 秦本源; 刘敏; 王媛媛; 张万锋; 王海珍; 宋鹏康; 蔡春波; 李步高
Original assignee: Shanxi Agricultural University
Current assignee: Shanxi Agricultural University
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2019-09-10

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测。本发明提供了序列如SEQ ID NO:1‑2所示的用于构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的引物，以及猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法；本发明还提供了序列如SEQ ID NO:3‑4所示的用于检测猪NR1H3基因表达水平的引物，以及检测猪NR1H3基因表达水平的方法。本发明为猪NR1H3基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。

Description

猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测方法。

背景技术

肝X受体α(LXRα/NR1H3)是LXR核超受体家族的成员，作为转录调控因子，其活性受到胆固醇降解产物氧化型胆固醇的调节。NR1H3的生理功能主要是维持胆固醇水平、碳水化合物代谢、脂蛋白代谢和脂肪合成的稳态。LXR具有调节组织脂质生物合成的作用，LXRα影响动物的脂肪沉积和脂肪细胞脂质代谢，是肌肉中脂肪生成的正调节因子。从结构上看，LXRs包含5个结构域，即氨基端的配体非依赖性转录活化结构域、DNA结合结构域、铰链区、配体结合域和羧基端的配体依赖的转录活化域。DNA结合结构域包含一个高度保守的锌指结构，该结构域与靶基因特异DNA结合，启动靶基因的转录，调控靶基因表达；铰链区可保持受体蛋白的稳定性，使受体在二聚化的同时与DNA结合，调控靶基因的表达。

目前对NR1H3基因的研究大多集中在人和鼠上，而关于猪NR1H3基因的研究报道很少。猪NR1H3基因表达载体的高效构建和猪NR1H3基因表达水平的快速、特异、准确检测对于猪NR1H3基因的功能研究具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供用于构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的引物、猪NR1H3基因过表达载体质粒的高效构建方法以及用于检测猪NR1H3基因表达水平的特异性引物和猪NR1H3基因表达水平的快速、特异、准确的检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：为实现猪NR1H3基因的高效特异扩增以及与表达载体质粒的快速高效连接，本发明通过大量筛选和人工优化获得了用于猪NR1H3基因扩增和过表达载体质粒构建的引物，其序列如SEQ ID NO.1-2所示，该引物能够实现猪NR1H3基因的特异扩增，并且能够与表达载体质粒进行高效的同源重组连接，快速、准确地构建猪NR1H3基因过表达载体质粒，将上述构建的猪NR1H3基因过表达载体质粒导入猪细胞中，可获得过表达猪NR1H3基因的细胞。为便于猪NR1H3基因的表达水平检测，本发明通过大量筛选和人工优化获得了用于荧光定量PCR进行猪NR1H3基因表达水平检测的特异性引物(序列如SEQ ID NO.3-4所示)，与其它引物相比，序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物能够实现特异、准确的猪NR1H3基因的表达水平检测。

具体地，本发明提供用于构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的引物，包括引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

上游引物：TY-NR1H3-F：

5′-CTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCCACCATGTCCTTGTGGGTGGAGG-3′；

下游引物：TY-NR1H3-R：

5′-CACCGTCATGGTCTTTGTAGTCCATCTCGTGCACATCCCAGATCTCAG-3′。

上述引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R的序列包含结合猪NR1H3基因的序列和为与载体进行同源重组连接的同源区序列。采用序列分别如SEQ ID NO:1-2所示的引物，能够在保证猪NR1H3基因高效特异扩增的同时，有效提高扩增获得的猪NR1H3基因片段与过表达载体质粒进行同源重组连接的效率和准确率。

本发明还提供包含序列如SEQ ID NO:1-2所示的用于构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的引物的试剂盒。

本发明还提供一种构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的方法，其为利用引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R PCR扩增NR1H3基因，利用同源重组方法将NR1H3基因与pIRES2-EGFP-3×flag连接。所述引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

本发明中，所述pIRES2-EGFP-3×flag质粒为将3×flag标签序列通过BamHI和EcoRI酶切位点连接至pIRES2-EGFP质粒构建得到。

上述3×flag标签序列如SEQ ID NO.9所示。

针对引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R，本发明进行了PCR扩增反应条件的优化和筛选。作为优选，猪NR1H3基因的PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。采用上述PCR反应程序，能够更好地保证猪NR1H3基因的高效特异扩增。

作为优选，猪NR1H3基因的20μL PCR扩增反应体系为：Green Taq Mix 10μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，cDNA模板4μL，ddH₂O 4μL。

具体地，所述构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的方法包括如下步骤：

(1)提取猪组织的总RNA，反转录成cDNA；

(2)以步骤(1)的cDNA为模板，利用引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R PCR扩增NR1H3基因；

(3)利用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切pIRES2-EGFP-3×flag；

(4)将所述NR1H3基因与经双酶切的pIRES2-EGFP-3×flag进行同源重组连接，构建猪NR1H3基因过表达载体质粒。

作为优选，上述步骤(3)中所述双酶切的10μL反应体系为：限制性内切酶NheI和EcoRI各1μL，pIRES2-EGFP-3×flag载体质粒300ng，NEB 2.1Buffer 1μL，ddH₂O补齐至10μL。

作为优选，上述步骤(3)中，所述双酶切的反应程序为：37℃酶切1h，65℃失活20min。

作为优选，上述步骤(4)中，所述同源重组连接的20μL反应体系为：pIRES2-EGFP-3×flag线性化载体质粒1μL，100ng PCR产物，5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，ddH₂O补齐至20μL。

作为优选，上述步骤(4)中，所述同源重组连接的反应程序为：37℃连接30min。

本发明还提供猪NR1H3基因表达水平的检测引物，包括引物N2F和N2R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。

上游引物：N2F：5′-GGTAGAGAGGCTGCAACATAC-3′；

下游引物：N2R：5′-GGAGGCTCACCAGTTTCATTA-3′。

上述猪NR1H3基因表达水平的检测引物为本发明通过大量筛选和人工优化获得，采用该引物可显著提高检测的特异性和准确性，更好地保证猪NR1H3基因表达水平的快速、高效检测。

本发明还提供含有所述猪NR1H3基因表达水平的检测引物的试剂盒；

作为优选，所述试剂盒还包括用于扩增18S rRNA内参基因的引物18S-F和18S-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示。

上游引物：18S-F：5′-ATGCCAGAGTCTCGTTCGTTAT-3′；

下游引物：18S-R：5′-CGGACAGGATTGACAGATTGAT-3′。

进一步地，本发明还提供所述猪NR1H3基因表达水平的检测引物或含有所述猪NR1H3基因表达水平的检测引物的试剂盒在检测猪NR1H3基因表达水平中的应用。

本发明还提供一种猪NR1H3基因表达水平的检测方法，其为利用所述猪NR1H3基因表达水平的检测引物或含有所述猪NR1H3基因表达水平的检测引物的试剂盒进行荧光定量PCR检测。

具体地，所述猪NR1H3基因表达水平的检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测猪细胞的总RNA，反转录成cDNA；

(2)以步骤(1)的cDNA为模板，利用引物18S-F和18S-R、荧光定量PCR扩增18S rRNA内参基因，同时利用引物N2F和N2R、荧光定量PCR扩增NR1H3基因；

(3)分析步骤(2)的荧光定量PCR结果，获得的猪NR1H3基因表达水平。

作为优选，上述步骤(2)中，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环；95℃15s，65℃1min，95℃15s制作熔解曲线。

作为优选，上述步骤(2)中，所述荧光定量PCR的20μL反应体系为：2×GoTaq qPCRMaster Mix 10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。

作为优选，上述步骤(3)中，对荧光定量PCR的实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析，采用相对定量方法，以对照组作为外参(设置外参是为消除不同批次试验误差)计算在不同处理中的相对表达量＝2^-△△CT。采用独立样本T检验分析比较NR1H3基因在不同处理中表达差异，结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，所有统计分析用SPSS version 20.0软件完成。

本发明的有益效果至少包括：

(1)本发明提供了用于猪NR1H3基因过表达载体质粒构建的引物，该引物能够在保证猪NR1H3基因高效特异扩增的同时，有效提高扩增获得的猪NR1H3基因片段与过表达载体质粒进行同源重组连接的效率和准确率；利用该引物本发明实现了快速、高效的猪NR1H3基因过表达载体质粒构建；

(2)本发明提供了用于猪NR1H3基因表达水平检测的特异性引物，采用该引物可显著提高检测的特异性和准确性，更好地保证猪NR1H3基因表达水平的快速、高效、准确检测，

本发明提供的猪NR1H3基因过表达载体质粒构建和猪NR1H3基因表达水平的检测方法具有很强的实用性，为猪NR1H3基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中过表达载体Sus-NR1H3-pIRES2-EGFP-3×flag的质粒图谱。

图2为本发明实施例4中过表达载体Sus-NR1H3-pIRES2-EGFP-3×flag质粒转染猪肾上皮细胞PK15培养36h，采用qPCR方法检测NR1H3基因的表达水平的结果。柱状图中，柱子的值为平均数±标准误；***表示差异极显著(P＜0.001)，图中个体重复数为3，qPCR加样技术重复数为4。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1用于猪NR1H3基因过表达载体质粒构建的引物的筛选和获得

根据NCBI公布的猪NR1H3基因mRNA序列(GenBank Accession No.NM_001101814.1)设计可扩增NR1H3基因全长的同源重组引物。

本发明经过大量实验研究发现，并非只要满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现在保证猪NR1H3基因的扩增效果的同时保证扩增片段能够与过表达质粒载体通过同源重组高效连接。在满足一般性的设计原则的基础上，本发明针对引物与靶序列的亲和力和错配率、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构以及引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选，最终得到序列如SEQ ID NO:1-2所示的引物对TY-NR1H3，该引物对能够在保证猪NR1H3基因的特异高效扩增的同时保证扩增片段能够与过表达质粒载体通过同源重组实现较高的连接效率和准确率。引物对TY-NR1H3的序列如下：

上游引物，TY-NR1H3-F(SEQ ID NO:1)：

5′-CTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCCACCATGTCCTTGT GGGTGGAGG-3′；

下游引物，TY-NR1H3-R(SEQ ID NO:2)：

5′-CACCGTCATGGTCTTTGTAGTCCATCTCGTGCACATCCCA GATCTCAG-3′。

实施例2猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建

本实施例提供猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法，具体包括以下步骤：

1、组织样品的采集

1月龄马身猪3头，来自于山西省大同市种猪场。屠宰后采集组织样，立即投入液氮中，随后置于-80℃冰箱保存备用。

2、组织RNA提取及cDNA合成

采用TaKaRa RNAiso Plus试剂盒提取各组织的总RNA，提取方法参照试剂盒说明书。总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定；总RNA浓度通过NanoDrop1000微量紫外分光光度计测定。

采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒将RNA反转录成cDNA。

3、PCR扩增

采用实施例1筛选得到的引物对TY-NR1H3(序列如SEQ ID NO:1-2所示)扩增NR1H3基因，PCR的反应体系为：Green Taq Mix 10μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，cDNA模板4μL，ddH₂O4μL；PCR的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。对扩增产物进行电泳鉴定并进行胶回收。

4、pIRES2-EGFP-3×flag质粒的构建

(1)设计含有3×flag序列的引物，具体如下：

改造F：AATTCATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAA AGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGT；

改造R：GATCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCGATGTCA TGATCTTTATAATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCCATG；

(2)利用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切pIRES2-EGFP；

(3)将上述(1)中的引物进行退火，退火PCR的反应体系为：10×PNK buffer 2.2μL，10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，ddH₂O 14μL；退火PCR的反应程序如下：93℃3min，93℃变性30s(57个循环，从第二个循环开始，每一个循环降低1℃)，25℃保存；

(4)将退火产物与经双酶切的pIRES2-EGFP进行连接，构建pIRES2-EGFP-3×flag载体；连接体系为：2×SolutionⅠ5μL，酶切载体(50ng)，退火产物1μL，ddH₂O 3μL；连接程序为：16℃30min；

5、线性化载体的构建

复苏并扩大培养带有pIRES2-EGFP-3×flag的菌液，按照OMEGA质粒提取试剂盒说明书，进行质粒提取并通过电泳验证。提取产物用限制性内切酶NheI和EcoRI进行双酶切，双酶切的反应体系为：限制性内切酶NheI和EcoRI各1μL，pIRES2-EGFP-3×flag载体质粒300ng，NEB 2.1Buffer 1μL，ddH₂O补齐至10μL。双酶切的反应程序为：37℃酶切1h，65℃失活20min。

6、猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建

将上述获得的NR1H3基因PCR产物与pIRES2-EGFP-3×flag线性化载体质粒通过Vazyme同源重组试剂盒进行连接，得到猪NR1H3基因过表达载体Sus-NR1H3-pIRES2-EGFP-3×flag。同源重组的反应体系为：pIRES2-EGFP-3×flag线性化载体质粒1μL，100ng PCR产物，5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2μL，ddH₂O补齐至20μL。同源重组的反应程序为：37℃连接30min。

7、猪NR1H3基因过表达载体的鉴定

将连接产物Sus-NR1H3-pIRES2-EGFP-3×flag转入DH5α大肠杆菌，涂于带有卡那霉素抗性的LB固体培养基上过夜培养。挑取10个阳性克隆，进行菌落PCR验证，经1％的琼脂糖凝胶验证，得到了6个符合目的片段大小的克隆菌株。选取3个阳性克隆菌株，进行扩大培养后将猪NR1H3基因过表达载体的阳性菌液样本送到华大生物公司使用通用引物进行测序。测序结果如SEQ ID NO.10所示，表明猪NR1H3基因过表达载体构建成功。采用SnapGene绘制上述构建的猪NR1H3基因过表达载体质粒图谱(如图1所示)。对测序正确的菌液样品进行保菌和质粒提取。

实施例3猪NR1H3基因表达水平检测引物的筛选和获得

根据NCBI公布的猪NR1H3基因mRNA序列(GenBank Accession No.NM_001101814.1)设计可用于检测猪NR1H3基因表达水平的引物。

本发明经过大量实验研究发现，并非只要满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现猪NR1H3基因表达水平的高效特异检测。在满足一般性的设计原则的基础上，本发明针对引物与靶序列的亲和力和错配率、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构以及引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选，最终得到序列如SEQ ID NO:3-4所示的引物对N2，该引物对能够实现猪NR1H3基因表达水平的荧光定量PCR高效特异检测。引物对N2的序列如下：

上游引物，N2F(SEQ ID NO.3)：

5′-GGTAGAGAGGCTGCAACATAC-3′；

下游引物，N2R(SEQ ID NO.4)：

5′-GGAGGCTCACCAGTTTCATTA-3′。

猪NR1H3基因的荧光定量PCR检测以18S rRNA为内参，因此，同时根据NCBI公布的18S rRNA序列，设计用于18S rRNA扩增的引物对18S(SEQ ID NO:5-6)：

上游引物，18S-F(SEQ ID NO.5)：

5′-ATGCCAGAGTCTCGTTCGTTAT-3′；

下游引物，18S-R(SEQ ID NO.6)：

5′-CGGACAGGATTGACAGATTGAT-3′。

实施例4猪NR1H3基因表达水平的检测方法

采用实施例2中获得的猪NR1H3基因过表达载体Sus-NR1H3-pIRES2-EGFP-3×flag质粒，转染猪肾上皮细胞PK15，对转染细胞的NR1H3基因表达水平进行荧光定量PCR(qPCR)检测。具体包括如下步骤：

1、细胞培养与收集

复苏猪肾上皮细胞PK15，将细胞铺于100mm细胞皿中，细胞汇合度达到80％左右时，根据Lonza Nucleofector 4D核转染系统培训手册，将猪肾上皮细胞PK15消化后离心留沉淀，与100μL电转试剂P1和2000ng质粒(过表达组为猪NR1H3基因过表达载体质粒，对照组为对照质粒pIRES2-EGFP-3×flag)混合，放于电转杯中，采用DS130电转程序，将猪NR1H3基因过表达载体Sus-NR1H3-pIRES2-EGFP-3×flag质粒和对照质粒pIRES2-EGFP-3×flag通过电转仪瞬时转入细胞内，接种到6孔板培养36h后收集细胞。

2、细胞RNA提取及cDNA合成

采用TaKaRa RNAiso Plus试剂盒提取各处理组(过表达组和对照组)的总RNA，提取方法参照试剂盒说明书。总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定；总RNA浓度通过NanoDrop1000微量紫外分光光度计测定。

3、荧光定量PCR扩增

采用实施例3筛选得到的N2引物对(序列如SEQ ID NO:3-4所示)对NR1H3基因进行荧光定量PCR扩增，采用18S引物对(序列如SEQ ID NO:5-6所示)对内参18S rRNA进行荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和一次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个去RNA酶的1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到荧光定量PCR专用的8联管中，然后分别加入模板cDNA，再瞬时离心后进行荧光定量PCR扩增，整个操作过程尽量避光；荧光定量PCR反应体系为：GoTaq qPCR Master Mix(2×)10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环；95℃15s，65℃1min，95℃15s制作熔解曲线。

4、荧光定量PCR数据分析

对荧光定量PCR结果的扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果表明各基因扩增曲线均呈“S”形且到达平台期，说明为有效扩增；且各基因熔解曲线峰值单一，说明扩增产物特异、无引物二聚体及其他非特异性扩增，可以进行后续结果的分析。根据不同处理组的CT值，以对照组作为外参(设置外参是为消除不同批次试验误差)，采用相对定量方法计算猪NR1H3基因的相对表达量，计算公式为：NR1H3基因的相对表达量＝2^-△△CT。

5、作图

根据相对定量的计算结果，利用SPSS version 20.0软件进行差异显著性检验，并通过GraphPad Prism 5作图，结果如图2所示，表明与对照组相比，过表达NR1H3基因使其表达量极显著上调。

利用本发明提供的同源重组引物构建猪NR1H3基因过表达载体质粒，并对猪NR1H3基因的表达水平进行定量分析，具有特异、准确、快速、方便的优势，具有很强的实用性，为猪NR1H3基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山西农业大学

<120> 猪NR1H3基因过表达载体质粒的构建方法及其表达水平的检测

<130> KHP191112426.7

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctggtttagt gaaccgtcag atccgccacc atgtccttgt gggtggagg 49

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccgtcatg gtctttgtag tccatctcgt gcacatccca gatctcag 48

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtagagagg ctgcaacata c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaggctcac cagtttcatt a 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgccagagt ctcgttcgtt at 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggacaggat tgacagattg at 22

<210> 7

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aattcatgga ctacaaagac catgacggtg attataaaga tcatgacatc gattacaagg 60

atgacgatga caagt 75

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatcacttgt catcgtcatc cttgtaatcg atgtcatgat ctttataatc accgtcatgg 60

tctttgtagt ccatg 75

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gactacaaag accatgacgg tgattataaa gatcatgaca tcgattacaa ggatgacgat 60

gacaag 66

<210> 10

<211> 1468

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaccgtcaga tccgccacca tgtccttgtg ggtggaggcc cctgtgcctg atgtttctcc 60

tgactctgca gtggagctgt gggagtcaga tgcacaagat gcaagcagcc agtctctggg 120

aagcagcagc tgcatcctca gggaggaatc cagcacaccc cagtctgcgg ggggcgcttc 180

gagggtgggg ctggatgcaa cagagtccac ggccctgctt cccggggtgg aggcctctcc 240

agagtccaca gagctccgtc cacaaaagcg gaaaaagggg ccagccccca aaatgctggg 300

gaatgagctg tgcagtgtgt gtggggacaa ggcctccggc ttccactaca acgtgctgag 360

ctgcgagggc tgcaagggat tcttccgtcg cagtgtcatc aaaggggccc gctatgtctg 420

ccacagcggg ggccactgcc ccatggacac ctacatgcgt cgcaagtgcc aggagtgccg 480

tcttcgcaag tgccgccagg cgggcatgcg agaggagtgt gtcctgtcag aagaacagat 540

ccgcctgaag aaactgaagc ggcaagagga ggaacaggct caggccacat ctgtgccccc 600

aagggcttcc tcgccgcccc aagtcctgcc ccagcttagc ccagagcagc tgggcatgat 660

cgagaagctg gtggctgccc agcagcagtg taacagacgc tccttttcag accagcttag 720

agtcacgcct tggcccatgg caccagatcc ccagagccgg gaggcccgtc agcaacgctt 780

tgcccacttc actgagctgg ccatcgtctc tgtgcaggag atcgttgatt ttgccaaaca 840

gctgccaggc ttcttgcagc tcagccggga ggaccagatc gccctcctaa agacctctgc 900

gattgaggtg atgcttctgg agacatctcg gaggtacaac cctgggagtg agagtatcac 960

cttcctcaag gatttcagtt ataatcggga agactttgcc aaagcagggc tgcaggtgga 1020

gttcatcaac cctatcttcg agttctccag agccatgaat gagctgcaac taaatgatgc 1080

tgagtttgcc ctgctcattg ccatcagcat cttctctgca gaccggccca acgtgcagga 1140

ccagctccag gtagagaggc tgcaacatac atatgtggag gccctgcatg cctacgtctc 1200

catccaccac ccccatgacc gactgatgtt cccacggatg ctaatgaaac tggtgagcct 1260

ccggacactg agcagcgtcc actcagagca agtgtttgca ctgcgcctgc aggataaaaa 1320

gcttcccccg ctgctctctg agatctggga tgtgcacgag atggactaca aagaccatga 1380

cggtgattat aaagatcatg acatcgatta caaggatgac gatgacaagt gatccgcccc 1440

tctccctccc ccccccctaa cgttactg 1468

Claims

1.用于构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的引物，其特征在于，包括引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

2.一种构建猪NR1H3基因过表达载体质粒的方法，其特征在于，利用引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R PCR扩增NR1H3基因，利用同源重组方法将NR1H3基因与pIRES2-EGFP-3×flag连接；

所述引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取猪组织的总RNA，反转录成cDNA；

(3)利用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切pIRES2-EGFP-3×flag；

(4)将所述NR1H3基因与经双酶切的pIRES2-EGFP-3×flag进行同源重组连接，构建猪NR1H3基因过表达载体质粒；

优选地，所述PCR扩增的反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

4.猪NR1H3基因表达水平的检测引物，其特征在于，包括引物N2F和N2R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示。

5.含有权利要求4所述检测引物的试剂盒；

优选地，所述试剂盒还包括用于扩增18S rRNA内参基因的引物18S-F和18S-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5-6所示。

6.权利要求4所述检测引物或权利要求5所述试剂盒在检测猪NR1H3基因表达水平中的应用。

7.一种猪NR1H3基因表达水平的检测方法，其特征在于，利用权利要求4所述检测引物或权利要求5所述试剂盒进行荧光定量PCR检测。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测猪细胞的总RNA，反转录成cDNA；

(2)以步骤(1)的cDNA为模板，利用引物18S-F和18S-R荧光定量PCR扩增18S rRNA内参基因，同时利用引物N2F和N2R荧光定量PCR扩增NR1H3基因；

(3)分析步骤(2)的荧光定量PCR结果，获得猪NR1H3基因表达水平。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，45个循环；95℃15s，65℃1min，95℃15s制作熔解曲线。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的20μL反应体系为：2×GoTaq qPCR Master Mix10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。