CN108359692A - 一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统 - Google Patents

一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，由打靶载体和打靶供体两部分组成，其中，打靶供体携带需要引入的外源DNA片段，该外源DNA片段包括T2A小肽、荧光素酶基因cDNA序列、eGFP表达框、Neomycin基因序列和上、下游同源臂序列；打靶载体含有核酸酶Cas9表达框和靶向hDGKθ的引导链sgRNA表达框。该报告系统的建立方法，包括筛选靶向hDGKθ基因3′非编码区的sgRNA，构建携带Cas9、sgRNA表达元件的真核表达载体作为打靶载体，构建携带荧光素酶基因cDNA序列以及用于定点整合的上、下游同源臂和筛选基因的打靶供体，将这两种载体共同转染目标细胞，利用抗性基因筛选，即可完成靶向hDGKθ的荧光素酶报告系统在目标细胞中的建立。

Description

一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统
本发明属于生物技术和药理学领域，涉及一种荧光素酶报告系统，特别涉及一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，可用于内源性人二酰甘油激酶(hDGKθ)表达活性的监测，也可用于对DGKθ产生调控作用的新药筛选。
背景技术
二酰甘油激酶(Diacylglycerol Kinases，DGKs)是重要的内源性脂类调节酶，能同时调控细胞内两种第二信使——DAG和PA的浓度，参与细胞内多种信号通路。DGKθ是DGKs同工酶第五型中的唯一亚型，也是DGK亚型中了解最少的之一。DGKθ最初在小鼠脑组织中被发现，在结构上含有三个富集的半胱氨酸区域(CRD),使它有别于其他亚型(含有两个CRD区域)。另外，其N末端具有脯氨酸/甘氨酸富集结构域，pleckstrin同源结构域(pleckstrinhomolog,PH)以及Ras相关结构域，C末端则是催化区域(catalytic domain)。这些功能结构域选择性和不同的效应物相互作用，并影响DGKθ的转录效率。
有研究表明，DGKθ可能涉及2型糖尿病、癌症、神经系统等多种疾病，是潜在的药物治疗靶点。建立一种报告系统，有效的对DGKθ基因的表达和调控进行监测，既可以研究其转录水平的调控机制，也可以靶向筛选活性药物，无疑具有重要意义。
目前，基于细胞转录激活检测的报告基因系统，是建立药物筛选模型的常用手段。传统报告基因系统一般通过体外克隆目标基因的启动子来驱动报告基因的表达。在细胞水平，报告基因相应启动子活性的变化，呈现出改变的荧光素酶活性，从而提供待测质粒和药物有效性的评估依据。但这种外源启动子活性的变化不能真实反映基因组的真实状态，因此难以准确反映基因组上基因表达情况。
基因编辑技术的发展，使得我们可以建立一种基于细胞内源性基因表达改变的新型报告系统，例如利用CRISPR/Cas9技术，将报告基因靶向性插入到目标基因下游，使报告基因的表达直接受内源靶基因启动子调控，能够真实反映细胞内真实的转录水平。根据申请人所进行的资料检索，到目前为止，尚没有发现针对靶向内源性DGKθ报告系统的相关报道，也没有关于DGKθ转录调控和新药筛选的文献资料可以参考。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，该报告系统同时携带Cas9和gRNA表达框的打靶载体，在转染时，使Cas9和sgRNA同时进入细胞，保证有效切割。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，其特征在于，该特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统由打靶载体和打靶供体两部分组成，其中：
所述打靶供体携带需要引入的外源DNA片段，该外源DNA片段是荧光素酶基因cDNA序列和位于其两侧的上、下游同源臂；
所述的打靶载体含有核酸酶Cas9表达框，同时还含有靶向hDGKθ的引导链sgRNA表达框。
根据本发明，所述的靶向hDGKθ的引导链sgRNA，其识别位点位于hDGKθ基因3′端，终止密码子的下游。
进一步地，所述的靶向是指将荧光素酶基因定点整合于hDGKθ基因组下游，使其受内源性DGKθ基因启动子的调控。
所述的上、下游同源臂是长度为500到1000bp的DNA片段，分别与hDGKθsgRNA识别位点上、下游的部分基因组序列同源。
上述特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统的建立方法，其特征在于，按下列步骤进行：
(1)筛选靶向DGKθ基因3′非编码区的sgRNA
从NCBI查找DGKθ基因的基因组序列，在位于终止密码子之后的非编码区选择四个sgRNA结合位点并设计相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连接到Cas9表达载体，转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，利用T7E1法筛选具有最高切割活性的sgRNA；
(2)构建携带Cas9、靶向DGKθ基因的sgRNA的打靶载体
将筛选获得的靶向DGKθ基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体，获得pCas9-DGKθsgRNA；
(3)构建携带上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供体
以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂，依次连入携带T2A-Luciferase cDNA-CMV-eGFP-T2A-Neomyci-SV40pA元件的表达载体的两端；
(4)将打靶载体与打靶供体共同导入细胞用筛选基因筛选，将筛选稳定后的细胞进行克隆化，对克隆化后的细胞克隆进行测序鉴定。
进一步地，所述的四个sgRNA位点分别为：
SgRNA1：CCCGCCCTCATCCCATTGGTGA；
SgRNA2：TGTTACCCCGTGTCCCGGGTGGG；
SgRNA3：TGATCTCACTTTGTGCCCCTCGG；
SgRNA4：CTGGTGACTTCCTTGTGTTCAGG；
所述的上游同源臂序列如下所示：
ACACCAGGTTTGAGAAGCCACGCATGGACGACGGGCTGCTGGAGGTTGTGGGCGTGACGGGCGTCGTGCACATGGTGAGCCGCCGGCCGAGTGGGCGGGCGAGCCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCAGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCTGGTCCCTGCTCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCAGCGGTGGGCGTCCCTGATCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCTGCGCTCCGGAATCCGGATTGCCCAGGGTTCCTACTTCCGAGTCACGCTCCTCAAGGCCACCCCGGTGCAGGTGGACGGGGAGCCCTGGGTCCAGGCCCCGGGGCACATGATCATCTCAGCTGCTGGCCCTAAGGTATGTGGGGTGAGGCTGGAGAGCCAGGGGAGGTGGGCCGGGCTGGGCCGGCCATGGGAGTGGCCAGTGGTACCCAGGTGGTGCTGGCATGGCCGGCTGCGGCCAGGGAGCACTGACTCCGGGAGGGTGCCTGCTTCAGAGGAGGGCTGTGCCAGTGGCCAGGCGGGCCACAGGTGGCACAGGGAGCAGCCAGACAGGTCCCTCCCCTTCCGTGAAATGGGGCTGAGATGGCATCAGCTGCCCGGGGCCCCAGGACCGGGGGCTGCCCGTGTACCGTTCTTTCATCGGCCATGTCACCCTGGTCCTCTGTCCCCTGCCCTGGGACAGGTGCACATGCTGAGGAAGGCCAAGCAGAAGCCGAGGAGGGCCGGGACCACCAGGGATGCCCGGGCGGATGCTGCGCCTGCCCCTGAGAGCGATCCTAGG。
所述的下游同源臂序列如下所示：
AGGCTAGGAGGTCTCAGGTGCTGCCCTGGCAGCACCAGAGTGTGGGCCGGGCCCGAGTGTCTGCCCCTCGGCCCTCAGGGTGGGGCACTTAGCACCCAGAAGGGACCAAAAGCAGGGCATGGCGGTGCAGAGGAGTTTGGGAGGTGTAAACAGCCCATGC ACGTGGAGGAGGAGCTGGCTTTCAGCCCCAGACCCCACGCTAGCACTTTCCACGCTGCTTGCCCGCTGTTGATGTGCAGTTCCCAGTGCCTGTGTGAGCCGACATCTGCTCAGTCCTATCCCTCGTCAGCGTGTGGAGACCCAGCTCCTGCAGCCCTCCTGCTCCCACGCCCCCAGACAGCTTGGTGGAGGGTCCTGCATCTGGGCCAGGCTGGGGTGCACCCAGCCAAAGACAAAGCTGCCTCCACGTGCCCAAGGATTCAGATGGTGCACTGGCCCCGGGAGGAGTCTGACCAAAAATGGAGCCCGCTCTGTGGGGAAGCCCCGACTCCCCCACGAGAAACGGTCCCACGGTGCGGATCTCCCCCTTCCCTTGTGGGGCACAGCTGGCCTGGGCCTCCAATCCTGCGGAGCTTTCCTGGGTGTGGCTTTGACCTCAGAAGTGGCTCTGGTTTGGCCTCAGGAGTGTGGCCTGGCCCAGCCTGCTGCAGCCTCCTGGGGGGCCCTTGATGCCACTAATCCCCCGACCCCCCGCATCTGCCAAACTGCACAGACACACG。
本发明公开了一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统。利用该系统，荧光素酶基因可以被定点整合到hDGKθ基因下游，在自剪切小肽T2A介导下，与hDGKθ基因同时受hDGKθ启动子转录起始，实现了荧光素酶活性与内源性靶基因hDGKθ活性直接相关。在不影响DGKθ基因自身的表达和基因组其他位点基因的表达的前提下，又能真实反映内源性DGKθ的转录活性，从而可以筛选对DGKθ基因具有转录调控作用的上游转录因子或者小分子活性药物。
附图说明
图1是打靶载体pCas9/hDGKθsgRNA结构图；
图2是打靶供体pUC19-DGKθ-Luciferase donor结构图；
图3是T7E1检测电泳图；
图4是在HEK293细胞系中荧光素酶基因的定点整合鉴定图。其中，图4-A是筛选后阳性细胞的荧光表达图，图4-B是阳性单克隆细胞的PCR产物电泳图。图4-C和图4-D是B图中PCR产物的测序结果图；
图5是在HepG2细胞系中荧光素酶基因的定点整合鉴定图。其中，图5-A是筛选后阳性细胞的荧光表达图，图5-B是阳性单克隆细胞的PCR产物电泳图。图5-C和图5-D是B图中PCR产物的测序结果图；
图6是小分子药物在HEK293-hDGKθ-T2A-luciferase-KI细胞系中的作用检测图。其中，A图是药物诱导下knock in细胞系中荧光素酶的活性图，B图是药物诱导下HEK293细胞中hDGKθmRNA相对表达量图；
图7是小分子药物在HepG2-hDGKθ-T2A-luciferase-KI细胞系中的作用检测图。其中，A图是药物诱导下knock in细胞系中荧光素酶的活性图，B图是药物诱导下HepG2细胞中hDGKθmRNA相对表达量图；
图8是转录因子在HEK293-hDGKθ-T2A-luciferase-KI细胞系中的作用检测图。其中，A图是转录因子诱导下knock in细胞系中荧光素酶的活性图，B图是转录因子诱导下HEK293细胞中hDGKθmRNA相对表达量图；
图9是转录因子在HepG2-hDGKθ-T2A-luciferase-KI细胞系中的作用检测图。其中，A图是转录因子诱导下knock in细胞系中荧光素酶的活性图，B图是转录因子诱导下HepG2细胞中hDGKθmRNA相对表达量图；
以下结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。
具体实施方式
为了提高基因编辑的效率，本实施例给出一种利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，该特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统由打靶载体和打靶供体两部分组成，其中：
所述打靶供体携带需要引入的外源DNA片段，该外源DNA片段是荧光素酶基因cDNA序列和位于其两侧的上、下游同源臂；
所述的打靶载体含有核酸酶Cas9表达框，同时还含有靶向hDGKθ的引导链sgRNA表达框。
本实施例中，所述的靶向hDGKθ的引导链sgRNA，其识别位点位于hDGKθ基因3′端，终止密码子的下游。
进一步地，所述的靶向是指将荧光素酶报告基因定点整合于hDGKθ基因组下游，使其受内源性DGKθ基因启动子的调控。
所述的上、下游同源臂是长度为500到1000bp的DNA片段，分别与hDGKθsgRNA识别位点上、下游的部分基因组序列同源。
该报告系统同时携带Cas9和gRNA表达框的打靶载体，在转染时，使Cas9和sgRNA同时进入细胞，保证有效切割。
为了实现报告基因在目标基因组上的靶向整合，该报告系统同时携带上、下游同源臂、报告基因、筛选基因和自剪切小肽的打靶供体。
为了测试该报告系统的有效性，本实施例构建四种转录因子表达载体，它们分别是转录因子E2F1，c-Myc，USF1和Bmal1。另外，本实施例购买了相应的小分子化合物：棕榈酸(PA)、油酸(OA)和脂溶性EGCG(Sigma)。其中，棕榈酸(PA)和油酸(OA)以2：1的比例配制游离脂肪酸(FFA)。
上述特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统的建立方法，按下列步骤进行：
(1)筛选靶向DGKθ基因3′非编码区的sgRNA
从NCBI查找DGKθ基因的基因组序列，在位于终止密码子之后的非编码区选择四个sgRNA结合位点并设计相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连接到Cas9表达载体，转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，利用T7E1法筛选具有最高切割活性的sgRNA；
(2)构建携带Cas9、靶向DGKθ基因的sgRNA的打靶载体
将筛选获得的靶向DGKθ基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件依次连入真核表达载体，获得pCas9-DGKθsgRNA；
(3)构建携带上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供体
以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂，依次连入携带
T2A-Luciferase cDNA-CMV-eGFP-T2A-Neomyci-SV40pA元件的表达载体的两端；
(4)将打靶载体与打靶供体共同导入细胞用筛选基因筛选，将筛选稳定后的细胞进行克隆化，对克隆化后的细胞克隆进行测序鉴定。
其中：所述的四个sgRNA位点分别为：
SgRNA1：CCCGCCCTCATCCCATTGGTGA；
SgRNA2：TGTTACCCCGTGTCCCGGGTGGG；
SgRNA3：TGATCTCACTTTGTGCCCCTCGG；
SgRNA4：CTGGTGACTTCCTTGTGTTCAGG；
所述的上游同源臂序列如下所示：
ACACCAGGTTTGAGAAGCCACGCATGGACGACGGGCTGCTGGAGGTTGTGGGCGTGACGGGCGTCGTGCACATGGTGAGCCGCCGGCCGAGTGGGCGGGCGAGCCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCAGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCTGGTCCCTGCTCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCAGCGGTGGGCGTCCCTGATCCCCGCTGAGCCCGGCTGGC CTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCTGCGCTCCGGAATCCGGATTGCCCAGGGTTCCTACTTCCGAGTCACGCTCCTCAAGGCCACCCCGGTGCAGGTGGACGGGGAGCCCTGGGTCCAGGCCCCGGGGCACATGATCATCTCAGCTGCTGGCCCTAAGGTATGTGGGGTGAGGCTGGAGAGCCAGGGGAGGTGGGCCGGGCTGGGCCGGCCATGGGAGTGGCCAGTGGTACCCAGGTGGTGCTGGCATGGCCGGCTGCGGCCAGGGAGCACTGACTCCGGGAGGGTGCCTGCTTCAGAGGAGGGCTGTGCCAGTGGCCAGGCGGGCCACAGGTGGCACAGGGAGCAGCCAGACAGGTCCCTCCCCTTCCGTGAAATGGGGCTGAGATGGCATCAGCTGCCCGGGGCCCCAGGACCGGGGGCTGCCCGTGTACCGTTCTTTCATCGGCCATGTCACCCTGGTCCTCTGTCCCCTGCCCTGGGACAGGTGCACATGCTGAGGAAGGCCAAGCAGAAGCCGAGGAGGGCCGGGACCACCAGGGATGCCCGGGCGGATGCTGCGCCTGCCCCTGAGAGCGATCCTAGG。
所述的下游同源臂序列如下所示：
AGGCTAGGAGGTCTCAGGTGCTGCCCTGGCAGCACCAGAGTGTGGGCCGGGCCCGAGTGTCTGCCCCTCGGCCCTCAGGGTGGGGCACTTAGCACCCAGAAGGGACCAAAAGCAGGGCATGGCGGTGCAGAGGAGTTTGGGAGGTGTAAACAGCCCATGCACGTGGAGGAGGAGCTGGCTTTCAGCCCCAGACCCCACGCTAGCACTTTCCACGCTGCTTGCCCGCTGTTGATGTGCAGTTCCCAGTGCCTGTGTGAGCCGACATCTGCTCAGTCCTATCCCTCGTCAGCGTGTGGAGACCCAGCTCCTGCAGCCCTCCTGCTCCCACGCCCCCAGACAGCTTGGTGGAGGGTCCTGCATCTGGGCCAGGCTGGGGTGCACCCAGCCAAAGACAAAGCTGCCTCCACGTGCCCAAGGATTCAGATGGTGCACTGGCCCCGGGAGGAGTCTGACCAAAAATGGAGCCCGCTCTGTGGGGAAGCCCCGACTCCCCCACGAGAAACGGTCCCACGGTGCGGATCTCCCCCTTCCCTTGTGGGGCACAGCTGGCCTGGGCCTCCAATCCTGCGGAGCTTTCCTGGGTGTGGCTTTGACCTCAGAAGTGGCTCTGGTTTGGCCTCAGGAGTGTGGCCTGGCCCAGCCTGCTGCAGCCTCCTGGGGGGCCCTTGATGCCACTAATCCCCCGACCCCCCGCATCTGCCAAACTGCACAGACACACG。
利用本实施例给出的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，荧光素酶基因可以被定点整合到hDGKθ基因下游，在自剪切小肽介导下，与hDGKθ基因同时受hDGKθ启动子转录起始，实现了荧光素酶活性与内源性靶基因hDGKθ活性直接相关。从而可以筛选对DGKθ基因具有转录调控作用的上游转录因子或者小分子药物。可以促进对hDGKθ在相关的神经系统性疾病及代谢性疾病治疗中作为潜在靶标的研究。
以下是发明人给出的具体实施例，需要说明的是，这些实施例仅是本发明的优选例子，本发明不限于这些实施例。
实施例1：HEK293细胞中建立靶向DGKθ的报告系统
1、HEK293细胞系中靶向DGKθ的报告系统结构如下：
以人类4号染色体为基础，DGKθ基因组序列NCBI编号为NC_000004。其中一条DNA链上，去除了DGKθ基因组距离5＇端12918bp到13656bp之间的DNA序列，在12918bp到13656bp之间依次插入T2A序列、荧光素酶基因序列、eGFP表达框、T2A序列、Neomycin基因序列。另一条等位基因链上，在DGKθ基因组距离5＇端13171bp处随机插入了长172bp的片段。
2、HEK293细胞中靶向hDGKθ的报告系统构建过程如下：
(1)打靶载体pCas9/hDGKθsgRNA的构建
在华大基因公司合成以下引物，各引物序列如下：
P1(hDGKθ-sgRNA1for)：ACCGtcaccaatgggatgagggc；
P2(hDGKθ-sgRNA1reverse)：AAACgccctcatcccattggtga；
P3(hDGKθ-sgRNA2for)：ACCGtgttaccccgtgtcccgggt；
P4(hDGKθ-sgRNA2reverse)：AAACacccgggacacggggtaaca；
P5(hDGKθ-sgRNA3for)：ACCGtgatctcactttgtgcccct；
P6(hDGKθ-sgRNA3reverse)：AAACaggggcacaaagtgagatca；
P7(hDGKθ-sgRNA4for)：ACCGCTGGTGACTTCCTTGTGTTC；
P8(hDGKθ-sgRNA4reverse)：AAACGAACACAAGGAAGTCACCAG。
将sgRNA表达载体pU6-sgRNA1.0(商业化购买)用BsaI消化、处理。将以上引物两两退火形成sgRNA寡聚核苷酸链。退火形成的sgRNA寡聚核苷酸链与pU6-sgRNA酶切产物连接，获得相应的sgRNA表达质粒pU6/hDGKθsgRNA1、pU6/hDGKθsgRNA2、pU6/hDGKθsgRNA3、pU6/hDGKθsgRNA4。
在华大基因公司合成Cas9表达元件KpnI-XbaI-CMV-Cas9-SV40Pa-SpeI，并将其以KpnI/SpeI酶切后，然后与经过同样酶切处理的pUC19(酶切位点改造)载体连接，得到pCas9。合成的KpnI-XbaI-CMV-Cas9-SV40Pa-SpeI序列如下：
GGTACCTCTAGAACGCGTGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATgccaccATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACA AATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGA AAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGACACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCASGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAGGTCGACTCTAGTCCCCGCGGTGGCGGTACCGAATTCACTAGT。
以KpnI/SpeI酶切得到pU6/hDGKθsgRNA1～4表达框，连入KpnI/XbaI酶切处理的pCas9，得到pCas9/hDGKθsgRNA，结构如图1所示。
(2)打靶供体pUC19-DGKθ-Luciferase donor的构建
由华大基因公司合成以下引物，各引物的序列如下：
P9(hDGKθuparm for)：actcgagCACCAGGTTTGAGAAGC；
P10(hDGKθuparm reverse)：atctagaCCTAGGATCGCTCTCAGGG；
P11(hDGKθdownarm for)：AGTCGACAGGCTAGGAGGTCTCAGGTG；
P12(hDGKθdownarm reverse)：AAGATCTCGTGTGTCTGTGCAGTTTGG。
以HEK293细胞基因组为模板，PCR扩增获得两个片段，分别与DGKθ基因组距离5＇端11999bp到12917bp之间的DNA序列和13657bp到14375bp之间的DNA序列同源，即为上、下游同源臂。将上、下游同源臂分别用相应的酶切处理，用SalI和BglII酶切回收下游同源臂片段，用XhoI和XbaI酶切回收上游同源臂片段，依次连入本实验室已有的pUC19/T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA载体，获得打靶载体pUC19-DGKθ-Luciferasedonor，该载体结构如图2所示。
(3)sgRNA打靶活性筛选
将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后pCas9/sgRNA表达质粒通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞，转染48小时后收集细胞，用天根基因组提取试剂盒提取基因组DNA，通过T7E1assay分析每个sgRNA的切割效率。
T7E1assay步骤如下：以提取的基因组DNA为模板，扩增靶向hDGKθ的四个sgRNA切割位点附近约800bp的DNA片段，引物及序列如下：
P13(hDGKθdetection for)：ACAGGTGCACATGCTGAGG；
P14(hDGKθdetection reverse)：CCTGAGACCTCCTAGCCTCC。
将扩增得到的PCR产物进行变性退火，利用琼脂糖凝胶电泳回收纯化。然后取500ng纯化的PCR产物，0.5μl的T7E1酶，37摄氏度处理25分钟，进行琼脂糖凝胶电泳检测。T7E1检测结果见附图3。依据T7E1检测结果，选择sgRNA3用于进一步研究。
(4)HEK293细胞中靶向hDGKθ的报告系统的建立(HEK293-hDGKθ-T2A-luciferase-KI细胞系)
将1×106HEK293细胞铺到60mm培养皿，24小时后，将4μg的pCas9/U6-hDGKθsgRNA3与8μg pUC19-hDGKθ-Luciferase donor通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞，转染24小时后加入G418至终浓度1μg/ml筛选10天，待细胞系稳定后，再加入GCV至终浓度为10μg/mL筛选3周。用倒置荧光显微镜观察并记录筛选后细胞eGFP的表达情况，结果如图4(A)。
将筛选后的细胞通过有限稀释法进行克隆化，挑选10-50个克隆，进行Luciferase活性检测。对其中Luciferase活性较高的克隆化细胞进行基因组提取，PCR整合位点，对PCR产物进行TA克隆并测序，鉴定基因型。PCR引物在基因组上位置如图2箭头所示，引物及其序列在华大基因合成，序列如下：
P15(hDGKθintegration detection for)：ACAGGTGCACATGCTGAGG；
P16(hDGKθintegration detection reverse)：GGGCTCGCGAAGCAAAACTA。
如图4(B)所示，PCR产物中较大的带为knock in大小，较小的带为野生条带大小。对clone2所得的PCR产物中两条带进行回收、测序。较大条带的测序结果，如图4(C)，表明在其中一条等位基因链上，靶向hDGKθ的荧光素酶基因在目标位点处正确重组；较小条带的测序结果如图4(D)，表明另一条链发生了碱基的随机插入(INDEL)。以上结果显示，HEK293-hDGKθ-T2A-luciferase-KI单克隆细胞系的成功建立。
实施例2：
以下是HepG2细胞中建立靶向DGKθ的报告系统为例的具体实例。
1、HepG2细胞系中靶向DGKθ的报告系统结构组成如下：
以人类4号染色体为基础，DGKθ基因组序列NCBI编号为NC_000004。其中一条DNA链上，去除了DGKθ基因组距离5＇端12918bp到13656bp之间的DNA序列，在12918bp到13656bp之间依次插入T2A序列、荧光素酶基因序列、eGFP表达框、T2A序列、Neomycin基因序列。另一条等位基因链上，随机修复没有改变基因组碱基的组成。
2、HepG2细胞中靶向hDGKθ的报告系统(HepG2-hDGKθ-T2A-luciferase-KI细胞系)构建过程如下：
构建过程与实施例1所提到的HEK293细胞的构建过程相同。附图5(A)显示了抗性基因筛选后HepG2细胞系中荧光的表达。表达绿色荧光的细胞显示了携带绿色荧光蛋白的荧光素酶基因在该细胞中的定点整合。附图5(B)为PCR检测克隆化HepG2细胞中hDGKθ基因组定点整合的情况，PCR产物中较大的带为knock in大小，较小的带为野生条带大小。测序结果表明，在其中一条等位基因链上，靶向hDGKθ的荧光素酶基因在目标位点处正确重组(图(5C))，而另一条等位基因则发生了随机修复，且碱基组成没有改变(图5(D))。表明，靶向hDGKθ的报告系统在HepG2细胞中的成功建立。
实施例3：
以下是HEK293细胞中建立的靶向hDGKθ的报告系统在药物筛选中的应用：
购买棕榈酸(PA)、油酸(OA)和EGCG(Sigma)用于药物测试。棕榈酸(PA)和油酸(OA)以2：1的比例配制游离脂肪酸(FFA)。将已报道的hDGKθ抑制剂R59949为阳性对照组。
将1×105hDGKθ-T2A-Luciferase-HEK293细胞铺到24孔细胞培养板，24小时后，分别加药诱导。各组剂量如下：FFA(0.5μM/L)group，EGCG(5μM/L)，R59949(15μM/L)。DMSO为阴性对照组。72小时后，收集各孔细胞，检测荧光素酶活性。附图6(A)显示了药物诱导下荧光素酶的活性的变化。FFA同R59949类似，降低了荧光素酶活性，而EGCG增强了荧光素酶活性。
将2×105HEK293细胞铺到6孔细胞培养板，24小时后，加药诱导细胞。DMSO为阴性对照组。72小时后，收集各孔细胞，提取mRNA，对药物诱导下HEK293细胞系中hDGKθ的表达水平检测。附图6(B)显示，药物诱导下，hDGKθ基因的mRNA表达水平也发生了相应改变，这种改变与荧光素酶活性一致。表明利用该系统，可成功进行药物筛选。
筛选药物不限于以上药物，也适用于高通量分子药库的筛选。
实施例4：
以下是HepG2细胞中建立的靶向hDGKθ的报告系统在药物筛选中的应用：
药物剂量和分组情况同实施例3所提到的HEK293细胞的实施过程相同。在hDGKθ-T2A-Luciferase-HepG2细胞系中，药物诱导下荧光素酶活性的变化如图7(A)所示。FFA和R59949，均使荧光素酶活性降低，而EGCG上调了荧光素酶的活性。而在HepG2细胞系中，药物对hDGKθmRNA水平的改变也与荧光素酶活性变化一致，如附图7(B)所示。
实施例5：
以下是HEK293细胞中建立的靶向hDGKθ的报告系统在转录因子筛选中的应用：
(1)克隆并构建hDGKθ基因的转录激活因子表达载体
利用Promo 3.0预测可能对hDGKθ有调控作用的转录因子，选择转录因子E2F1,c-Myc,USF1,Bmal1进行测试。由华大公司合成引物及其序列如下：
E2F1for：aggtaccatggccttggccggggcccct；
E2F1reverse：atctagattagaaatccaggggggtga；
c-Myc for：actcgagatgcccctcaacgttag c；
c-Myc reverse：cactagtttacgcacaagagttccgtag；
USF1for：aatcgatatgaaggggcagcagaaaaca；
USF1reverse：gctctagattagttgctgtcattcttgat；
BmalI for：cctcgagtatgacagctccagtgggaca；
BmalI reverse：GACTAGTTttacagcggccatggcaagt。
以人cDNA文库为模板，PCR扩增获得四种转录因子，分别连入pcDNA3.1(+)(addgene购买)表达载体。
将1×105hDGKθ-T2A-Luciferase-HEK293细胞铺到24孔细胞培养板，24小时后，分别将pcDNA3.1/E2F1、pcDNA3.1/c-Myc、pcDNA3.1/USF1、pcDNA3.1/BmalI各1μg，通过脂质体转染法转染hDGKθ-T2A-Luciferase-HEK293细胞。设pcDNA3.1/mcherry转染组为对照。每组三个重复。72小时后，收集各孔细胞，检测荧光素酶活性。如图8(A)所示，E2F1造成了Luciferase活性的下降，而其他三种转录因子不同程度的增强了Luciferase活性。
将2×105HEK293细胞铺到6孔细胞培养板，24小时后，将pcDNA3.1/E2F1、pcDNA3.1/c-Myc、pcDNA3.1/USF1、pcDNA3.1/BmalI各3μg，分别通过磷酸钙法转染hDGKθ-T2A-Luciferase-HEK293细胞。设pcDNA3.1/mCherry转染组为阴性对照。72小时后，收集各孔细胞，提取细胞总mRNA，对转录因子诱导下HEK293细胞系中hDGKθ的表达水平进行Real-time检测(如图8(B)所示)。结果显示，四种转录因子对hDGKθ分子的mRNA水平的改变与Luciferase活性变化一致，表明Luciferase活性的与hDGKθ的调控直接相关。
该报告系统不仅限于对以上四种转录因子的筛选检测，也适用于对其他多种转录因子的筛选检测。
实施例6：
以下是HepG2细胞中建立的靶向hDGKθ的报告系统在转录因子筛选中的应用：
转录因子的筛选、转录因子表达载体的构建及细胞转染测试同实施例5所提到的HEK293细胞的实施过程相同。附图9(A)显示了在hDGKθ-T2A-Luciferase-HepG2细胞系中转录因子作用下，荧光素酶活性的变化。图中可见，转录因子E2F1造成了Luciferase活性的下降，其他三种转录因子对于Luciferase活性没有明显调节效果。同样，在HepG2细胞中过表达以上四种转录因子，检测hDGKθmRNA水平的改变情况，如图9(B)所示，发现，hDGKθmRNA水平的表达变化与荧光素酶活性保持一致。进一步证明了，该报告系统用于反映内源性表明hDGKθ基因表达情况的可靠性，同时也暗示在不同的细胞中hDGKθ可能具有不一样的转录调控通路。
该靶向hDGKθ的报告系统不仅限于用于HEK293、HepG2细胞，也适用于对其他多种细胞类型中hDGKθ的表达进行监测，对于深入了解hDGKθ在多种生理代谢活动中的作用具有重要帮助。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120>一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统
<160>
<210> 1
<211> 22
<212> SgRNA1位点
<213> DNA
<220>
<400>
CCCGCCCTCATCCCATTGGTGA
<210> 2
<211> 23
<212> SgRNA2位点
<213> DNA
<220>
<400>
TGTTACCCCGTGTCCCGGGTGGG
<210> 3
<211> 23
<212> SgRNA3位点
<213> DNA
<220>
<400>
TGATCTCACTTTGTGCCCCTCGG
<210> 4
<211> 23
<212> SgRNA4位点
<213> DNA
<220>
<400>
CTGGTGACTTCCTTGTGTTCAGG
<210> 5
<211> 918
<212> 上游同源臂序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACACCAGGTTTGAGAAGCCACGCATGGACGACGGGCTGCTGGAGGTTGTGGGCGTGACGGGCGTCGTGCACATGGTGAGCCGCCGGCCGAGTGGGCGGGCGAGCCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCAGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCTGGTCCCTGCTCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCAGCGGTGGGCGTCCCTGATCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCTGCGCTCCGGAATCCGGATTGCCCAGGGTTCCTACTTCCGAGTCACGCTCCTCAAGGCCACCCCGGTGCAGGTGGACGGGGAGCCCTGGGTCCAGGCCCCGGGGCACATGATCATCTCAGCTGCTGGCCCTAAGGTATGTGGGGTGAGGCTGGAGAGCCAGGGGAGGTGGGCCGGGCTGGGCCGGCCATGGGAGTGGCCAGTGGTACCCAGGTGGTGCTGGCATGGCCGGCTGCGGCCAGGGAGCACTGACTCCGGGAGGGTGCCTGCTTCAGAGGAGGGCTGTGCCAGTGGCCAGGCGGGCCACAGGTGGCACAGGGAGCAGCCAGACAGGTCCCTCCCCTTCCGTGAAATGGGGCTGAGATGGCATCAGCTGCCCGGGGCCCCAGGACCGGGGGCTGCCCGTGTACCGTTCTTTCATCGGCCATGTCACCCTGGTCCTCTGTCCCCTGCCCTGGGACAGGTGCACATGCTGAGGAAGGCCAAGCAGAAGCCGAGGAGGGCCGGGACCACCAGGGATGCCCGGGCGGATGCTGCGCCTGCCCCTGAGAGCGATCCTAGG
<210> 6
<211> 719
<212> 下游同源臂序列
<213> DNA
<220>
<400>
AGGCTAGGAGGTCTCAGGTGCTGCCCTGGCAGCACCAGAGTGTGGGCCGGGCCCGAGTGTCTGCCCCTCGGCCCTCAGGGTGGGGCACTTAGCACCCAGAAGGGACCAAAAGCAGGGCATGGCGGTGCAGAGGAGTTTGGGAGGTGTAAACAGCCCATGCACGTGGAGGAGGAGCTGGCTTTCAGCCCCAGACCCCACGCTAGCACTTTCCACGCTGCTTGCCCGCTGTTGATGTGCAGTTCCCAGTGCCTGTGTGAGCCGACATCTGCTCAGTCCTATCCCTCGTCAGCGTGTGGAGACCCAGCTCCTGCAGCCCTCCTGCTCCCACGCCCCCAGACAGCTTGGTGGAGGGTCCTGCATCTGGGCCAGGCTGGGGTGCACCCAGCCAAAGACAAAGCTGCCTCCACGTGCCCAAGGATTCAGATGGTGCACTGGCCCCGGGAGGAGTCTGACCAAAAATGGAGCCCGCTCTGTGGGGAAGCCCCGACTCCCCCACGAGAAACGGTCCCACGGTGCGGATCTCCCCCTTCCCTTGTGGGGCACAGCTGGCCTGGGCCTCCAATCCTGCGGAGCTTTCCTGGGTGTGGCTTTGACCTCAGAAGTGGCTCTGGTTTGGCCTCAGGAGTGTGGCCTGGCCCAGCCTGCTGCAGCCTCCTGGGGGGCCCTTGATGCCACTAATCCCCCGACCCCCCGCATCTGCCAAACTGCACAGACACACG
<210> 7
<211> 23
<212>引物P1（hDGKθ-sgRNA1 for）序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCGtcaccaatgggatgagggc
<210> 8
<211> 23
<212>引物P2（hDGKθ-sgRNA1 reverse）序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAACgccctcatcccattggtga
<210> 9
<211> 24
<212> 引物P3（hDGKθ-sgRNA2 for）序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCGtgttaccccgtgtcccgggt
<210> 10
<211> 24
<212> 引物P4（hDGKθ-sgRNA2 reverse）序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAACacccgggacacggggtaaca
<210> 11
<211> 24
<212> 引物P5（hDGKθ-sgRNA3 for）序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCGtgatctcactttgtgcccct
<210> 12
<211> 24
<212> 引物P6（hDGKθ-sgRNA3 reverse）序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAACaggggcacaaagtgagatca
<210> 13
<211> 24
<212> 引物P7（hDGKθ-sgRNA4 for）序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACCGCTGGTGACTTCCTTGTGTTC
<210> 14
<211> 24
<212> 引物P8（hDGKθ-sgRNA4 reverse）序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAACGAACACAAGGAAGTCACCAG
<210> 15
<211> 5143
<212> KpnI-XbaI-CMV-Cas9-SV40Pa-SpeI序列
<213> DNA
<220>
<400>
GGTACCTCTAGAACGCGTGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATgccaccATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGACACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCASGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCCGGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGAGGTCGACTCTAGTCCCCGCGGTGGCGGTACCGAATTCACTAGT
<210> 16
<211> 24
<212> 引物P 9（hDGKθ uparm for）序列
<213> DNA
<220>
<400>
actcgagCACCAGGTTTGAGAAGC
<210> 17
<211> 26
<212> 引物P 10（hDGKθ uparm reverse）序列
<213> DNA
<220>
<400>
atctagaCCTAGGATCGCTCTCAGGG
<210> 18
<211> 27
<212> 引物P11（hDGKθ downarm for）序列
<213> DNA
<220>
<400>
AGTCGACAGGCTAGGAGGTCTCAGGTG
<210> 19
<211> 27
<212> 引物P12（hDGKθ downarm reverse）序列
<213> DNA
<220>
<400>
AAGATCTCGTGTGTCTGTGCAGTTTGG
<210> 20
<211> 19
<212> 引物P13（hDGKθ detection for）序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACAGGTGCACATGCTGAGG
<210> 21
<211> 20
<212> 引物P14（hDGKθ detection reverse）序列
<213> DNA
<220>
<400>
CCTGAGACCTCCTAGCCTCC
<210> 22
<211> 28
<212> 引物E2F1 for序列
<213> DNA
<220>
<400>
Aggtaccatggccttggccggggcccct
<210> 23
<211> 27
<212> 引物E2F1 reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
atctagattagaaatccaggggggtga
<210> 24
<211> 25
<212> 引物c-Myc for序列
<213> DNA
<220>
<400>
actcgagatgcccctcaacgttag c
<210> 25
<211> 28
<212> 引物c-Myc reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
cactagtttacgcacaagagttccgtag
<210> 26
<211> 28
<212> 引物USF1 for序列
<213> DNA
<220>
<400>
aatcgatatgaaggggcagcagaaaaca
<210> 27
<211> 29
<212> 引物USF1 reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
gctctagattagttgctgtcattcttgat
<210> 28
<211> 28
<212> 引物BmalI for序列
<213> DNA
<220>
<400>
cctcgagtatgacagctccagtgggaca
<210> 29
<211> 28
<212> 引物BmalI reverse序列
<213> DNA
<220>
<400>
GACTAGTTttacagcggccatggcaagt

Claims (8)

1.一种特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，其特征在于，该特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统由打靶载体和打靶供体两部分组成，其中：
所述打靶供体携带需要引入的外源DNA片段，该外源DNA片段包括荧光素酶基因cDNA序列、eGFP表达框、Neomycin基因序列和上、下游同源臂片段；
所述的打靶载体含有核酸酶Cas9表达框，同时还含有靶向hDGKθ的引导链sgRNA表达框。
2.如权利要求1所述的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，其特征在于，所述的靶向hDGKθ的引导链sgRNA，其识别位点靠近hDGKθ基因的3′端，位于hDGKθ基因终止密码子的下游。
3.如权利要求1所述的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，其特征在于，所述的靶向是指将荧光素酶报告基因定点整合于hDGKθ基因组下游，使其受内源性DGKθ基因启动子的调控。
4.如权利要求1所述的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统，其特征在于，所述的上、下游同源臂是长度为500到1000bp的DNA片段，分别与基因组上hDGKθsgRNA识别位点上、下游的部分基因组序列同源。
5.权利要求1至4其中任一所述的特异性靶向hDGKθ基因的荧光素酶报告系统的建立方法，其特征在于，按下列步骤进行：
(1)筛选靶向hDGKθ基因3′非编码区的sgRNA
从NCBI查找hDGKθ基因的基因组序列，在位于终止密码子之后的非编码区选择四个sgRNA结合位点并设计相应的sgRNA引物，将sgRNA引物退火后连接到Cas9表达载体，转染HEK293细胞，转染72小时后，提取基因组DNA，对打靶区域进行PCR扩增，利用T7E1法筛选具有最高切割活性的sgRNA；
(2)构建携带Cas9和靶向hDGKθ基因的sgRNA的打靶载体
将筛选获得的靶向hDGKθ基因的sgRNA连入商业化载体U6/sgRNA表达载体，获得pU6-sgRNA。再将Cas9表达元件连入pU6-sgRNA表达载体，获得pCas9-hDGKθsgRNA；
(3)构建携带上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供体
以人源化细胞基因组为模板，PCR扩增上、下游同源臂，依次连入携带T2A-LuciferasecDNA-CMV-eGFP-T2A-Neomyci-SV40pA元件的表达载体的两端；
(4)将打靶载体与打靶供体共同导入细胞用筛选基因筛选，将筛选稳定后的细胞进行克隆化，对克隆化后的细胞克隆进行测序鉴定。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的四个sgRNA位点分别为：
SgRNA1：CCCGCCCTCATCCCATTGGTGA；
SgRNA2：TGTTACCCCGTGTCCCGGGTGGG；
SgRNA3：TGATCTCACTTTGTGCCCCTCGG；
SgRNA4:CTGGTGACTTCCTTGTGTTCAGG。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的上游同源臂的序列如下所示：
ACACCAGGTTTGAGAAGCCACGCATGGACGACGGGCTGCTGGAGGTTGTGGGCGTGACGGGCGTCGTGCACATGGTGAGCCGCCGGCCGAGTGGGCGGGCGAGCCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCAGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCTGGTCCCTGCTCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCAGCGGTGGGCGTCCCTGATCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCTGCGCTCCGGAATCCGGATTGCCCAGGGTTCCTACTTCCGAGTCACGCTCCTCAAGGCCACCCCGGTGCAGGTGGACGGGGAGCCCTGGGTCCAGGCCCCGGGGCACATGATCATCTCAGCTGCTGGCCCTAAGGTATGTGGGGTGAGGCTGGAGAGCCAGGGGAGGTGGGCCGGGCTGGGCCGGCCATGGGAGTGGCCAGTGGTACCCAGGTGGTGCTGGCATGGCCGGCTGCGGCCAGGGAGCACTGACTCCGGGAGGGTGCCTGCTTCAGAGGAGGGCTGTGCCAGTGGCCAGGCGGGCCACAGGTGGCACAGGGAGCAGCCAGACAGGTCCCTCCCCTTCCGTGAAATGGGGCTGAGATGGCATCAGCTGCCCGGGGCCCCAGGACCGGGGGCTGCCCGTGTACCGTTCTTTCATCGGCCATGTCACCCTGGTCCTCTGTCCCCTGCCCTGGGACAGGTGCACATGCTGAGGAAGGCCAAGCAGAAGCCGAGGAGGGCCGGGACCACCAGGGATGCCCGGGCGGATGCTGCGCCTGCCCCTGAGAGCGATCCTAGG。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述下游同源臂的序列如下所示：
AGGCTAGGAGGTCTCAGGTGCTGCCCTGGCAGCACCAGAGTGTGGGCCGGGCCCGAGTGTCTGCCCCTCGGCCCTCAGGGTGGGGCACTTAGCACCCAGAAGGGACCAAAAGCAGGGCATGGCGGTGCAGAGGAGTTTGGGAGGTGTAAACAGCCCATGCACGTGGAGGAGGAGCTGGCTTTCAGCCCCAGACCCCACGCTAGCACTTTCCACGCTGCTTGCCCGCTGTTGATGTGCAGTTCCCAGTGCCTGTGTGAGCCGACATCTGCTCAGTCCTATCCCTCGTCAGCGTGTGGAGACCCAGCTCCTGCAGCCCTCCTGCTCCCACGCCCCCAGACAGCTTGGTGGAGGGTCCTGCATCTGGGCCAGGCTGGGGTGCACCCAGCCAAAGACAAAGCTGCCTCCACGTGCCCAAGGATTCAGATGGTGCACTGGCCCCGGGAGGAGTCTGACCAAAAATGGAGCCCGCTCTGTGGGGAAGCCCCGACTCCCCCACGAGAAACGGTCCCACGGTGCGGATCTCCCCCTTCCCTTGTGGGGCACAGCTGGCCTGGGCCTCCAATCCTGCGGAGCTTTCCTGGGTGTGGCTTTGACCTCAGAAGTGGCTCTGGTTTGGCCTCAGGAGTGTGGCCTGGCCCAGCCTGCTGCAGCCTCCTGGGGGGCCCTTGATGCCACTAATCCCCCGACCCCCCGCATCTGCCAAACTGCACAGACACACG。
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