CN112921002A - 一种以人内源性tert蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以人内源性TERT蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型及其制备方法和应用,所述细胞模型为采用外源稳定表达人TERT蛋白的细胞作为目的报告细胞,将P2A‑GFP敲入到hTERT的3’端、终止密码子TGA的前面,并稳定转染内参蛋白,得到所述hTERT‑P2A‑GFP报告细胞系,即得。所述模型以GFP的平均荧光值作为检测指标,内源特异性、灵敏度高,操作简便快速,用于高效筛选人内源性TERT蛋白为靶点的增强或抑制端粒酶活性的天然小分子化合物,为端粒酶调控剂的筛选提供一个敏感、快速、非放射性的检测模型,用此系统还可筛选端粒酶激活剂,对抗衰老的研究和应用也具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,更具体地,涉及一种以人内源性TERT蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型及其制备方法和应用。
背景技术
端粒是由一段高度重复有序的DNA序列(TTAGGG)与一系列相互作用的蛋白质组成的复杂的特殊结构。它位于真核生物染色体的末端,在保护染色体末端、维持基因组稳定性方面起到了至关重要的作用。随着正常细胞每分裂一次,因末端复制问题导致端粒长度逐渐缩短。当端粒缩短到一定程度时,细胞无法继续分裂,启动一系列相应的应答事件,进而进入了细胞衰老或凋亡的进程。因此,端粒和细胞衰老有着密切的联系。
端粒酶是细胞内存在的一种逆转录酶。人源端粒酶由催化亚基(humanTelomerase Reverse Transcriptase,hTERT)和RNA亚基(Telomerase RNA,hTR)以及其他端粒酶相关蛋白组成。端粒酶的激活或者高表达端粒酶可以逆转端粒的缩短。由于hTR携带了一段与端粒重复序列互补的序列,因此,端粒酶可以以自身的RNA为模板,在hTERT亚基的催化作用下不断延伸端粒片段,维持端粒长度。hTERT亚基是包含了1132个氨基酸,其7号外显子和8号外显子所编码的蛋白序列构成了负责逆转录酶功能的蛋白结构域。hTERT蛋白还包含了两个与端粒酶RNA结合的结构域(RNA-interacting domain,RD),其中RD2能够与hTR的CR4-CR5茎环结构相互作用,并参与DNA的合成。也有研究表明hTERT蛋白还能调控细胞生长与细胞存活,帮助细胞抗凋亡等非端粒酶功能。
绝大多数体细胞的端粒酶活性极低,只有在大部分的肿瘤细胞或者祖干细胞中保持着较高的端粒酶活性。乳腺癌、肝癌是一些较为常见的恶性肿瘤,其癌组织都高表达端粒酶。作为肿瘤细胞的重要特征之一,端粒和端粒酶是一个非常有潜力的治疗靶径,通过抑制癌细胞的端粒酶活性来阻碍细胞增殖,从而“杀死”癌细胞。
为了确保细胞不发生衰老或者癌变,端粒酶的活性受到了多个不同层面的严格调控。相比细胞内高表达的hTR,表达受到严格限制的端粒酶催化亚基hTERT蛋白才是端粒酶活性的关键限速步骤。端粒酶选择性地在癌细胞内表达,使得近十多年以端粒酶为靶标的抗肿瘤治疗药物层出不穷,尤其是天然产物,在临床方面表现出了较好的用药安全性和药物耐受性。因此,针对人内源性TERT蛋白的天然小分子抑制剂的研究对于临床上广谱抗肿瘤药物的研发有着重要的指导意义。此外,针对人内源性TERT蛋白的天然小分子激活剂的研究在抗衰老的应用方面也具有转化价值。然而,目前还未见有以人内源性TERT蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型的相关报道。陈晓娜等(陈晓娜,王晓丹,孙丽光,等.携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定[J].吉林大学学报(医学版),2017,43(002):213-219.)公开了关于携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒,将EGFP作为蛋白质标签,利用DNA重组技术,将目的基因(hTERT)与GFP基因构成融合基因,转染HEK293FT细胞,然后借助荧光显微镜直观地判断转染效率,并间接判断目的蛋白在细胞中的表达是用于细胞转染。然而其是一个持续性过表达的TERT质粒,并不能用于筛选影响TERT转录的药物。因此,亟需开发一种以TERT蛋白为筛选靶点的细胞模型以筛选针对人内源性TERT蛋白的天然小分子抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足,提供一种以人内源性TERT蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型。
本发明的第二个目的在于提供所述细胞模型的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供所述细胞模型在筛选具有抑制或增强端粒酶活性的外源化合物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
一种以人内源性TERT蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型的制备方法,为采用外源稳定表达人TERT(hTERT)蛋白的细胞作为目的报告细胞,将P2A-GFP敲入到hTERT的3’端、终止密码子TGA的前面,并稳定转染内参蛋白,得到所述hTERT-P2A-GFP报告细胞系,即为以人内源性TERT蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型。
本发明的细胞模型具有两个指标:TERT基因表达和报告系统GFP的荧光信号,报告基因GFP的表达受hTERT基因的内源启动子调控,通过报告基因GFP的平均荧光值来指示hTERT基因的表达情况,当GFP的平均荧光值变化时,则提示所述待筛选外源化合物能够上调或下调hTERT的基因表达,进而增强或抑制端粒酶活性。本发明的细胞模型能够稳定表达外源TERT蛋白,既避免内源性基因编辑带来的细胞致死,又不会干扰内源基因转录调控过程;而内参蛋白主要用于排除假阳性筛选结果。
具体地,所述外源稳定表达人TERT蛋白的细胞为将体外克隆的hTERT全长的编码序列连接到EF1a启动子的真核表达载体中,稳定转染到细胞内获得。
具体地,为采用稳定表达外源稳定表达人TERT蛋白的细胞作为目的报告细胞,将带有与敲入位点上下游同源序列的P2A-GFP载体以及带有识别敲入位点的sgRNA序列的pX330载体同时双瞬转到稳定表达外源HAFL-hTERT蛋白的细胞中,得到以内源hTERT为靶点的报告系统,再随机稳转内参蛋白作为筛选的内参指标。
优选地,所述细胞为293T细胞;所用细胞为实验室常见工具细胞系,易于获取。
优选地,所述敲入为采用CRISPR-CAS9技术。
优选地,所述内参蛋白为dsRed2蛋白。
本发明还提供上述任一所述的细胞模型的制备方法,具体包括如下步骤:
S1.将体外克隆的hTERT全长的编码序列连接到EF1a启动子的真核表达载体中,稳定转染到293T细胞内,构建外源稳定表达hTERT蛋白的细胞系;
S2.在步骤S1外源稳定表达hTERT蛋白的细胞系中,利用CRISPR-Cas9技术将P2A肽-GFP敲入到hTERT基因的3’端、终止密码子TGA的前面,构建内源hTERT的报告基因系统;
S3.在步骤S2构建的内源报告基因系统中,随机插入dsRed2基因,构建能稳定表达dsRed2的内源hTERT报告细胞模型。
本发明还请求保护上述任一所述方法制备得到的细胞模型。
本发明利用上述细胞模型,从天然产物库中筛选到了两种受试天然产物处理组的GFP平均荧光值降低,提示受试物能够下调hTERT基因表达。经功能验证,证明这两种天然小分子受试物具有端粒酶抑制剂的功能,表明本发明的细胞模型可用于筛选具有抑制或增强端粒酶活性的天然小分子化合物。因此,本发明还请求保护所述细胞模型在筛选具有抑制或增强端粒酶活性的外源物中的应用。所述外源物包括合成化合物、天然产物、有机小分子化合物、脂类、糖类、蛋白质、核酸的一种或多种。
本发明通过上述细胞模型筛选到了两种具有端粒酶抑制剂作用的小分子天然产物巴西木素和穿心莲内酯,两者均为常见的天然植物提取物,相比人工合成类药物,其产业化风险小、成本低。所述巴西木素的化学结构式如式I所示,所述穿心莲内酯的化合结构式如式II所示:
本发明还提供巴西木素和/或穿心莲内酯在制备端粒酶抑制剂中的应用。具体地,为在制备靶向抑制TERT的基因表达的端粒酶抑制剂中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种以人内源性TERT蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型,所述模型以GFP的平均荧光值作为检测指标,通过报告基因GFP的平均荧光值来指示hTERT基因的表达情况,当GFP的平均荧光值变化时,则提示所述待筛选外源化合物能够上调或下调hTERT的基因表达,进而增强或抑制端粒酶活性,特异性地针对内源TERT蛋白、灵敏度高,操作简便快速,用于高效筛选人内源性TERT蛋白为靶点的增强或抑制端粒酶活性的天然小分子化合物,为端粒酶调控剂的筛选提供一个敏感、快速、非放射性的检测模型。本发明所述模型检测过程快速、且操作简易,只需细胞培养和流式细胞术即可实现快速高通量筛选,且筛选的结果也更加精准可靠,用此系统筛选出的端粒酶抑制剂,为临床药物应用于广谱抗癌提供新的可能,用此系统还可筛选端粒酶激活剂,对抗衰老的研究和应用也具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中内源性hTERT-P2A-GFP/dsRed2双荧光报告系统的鉴定图。a为检测外源HAFL-hTERT蛋白表达水平;b为基于CRISPR-Cas9技术敲入P2A肽-GFP的原理示意图;c为对hTERT-P2A-GFP/dsRed2双荧光报告细胞的流式分析
图2为本发明实施例1中对800种天然产物流式筛选后的结果。
图3为本发明实施例1中两种天然产物对双荧光报告细胞系中GFP平均荧光值的影响。a为巴西木素;b为穿心莲内酯。
图4为本发明实施例2中受试药物处理后检测293T细胞中hTERT mRNA表达结果,所有处理组均经DMSO对照组校正。图中,a为巴西木素;b为穿心莲内酯。
图5为本发明实施例2中受试药物处理后检测293T细胞中端粒酶活。图中,a为巴西木素;b为穿心莲内酯。
图6为本发明实施例2中受试药物(巴西木素)处理后,分别检测短期给药(PD5)和长期给药(PD25)后HTC75细胞中的端粒酶分析。图中,a为TERT的mRNA表达水平;b为端粒酶活性分析。
图7为本发明实施例2中受试药物(巴西木素)直接抑制具有天然构象的端粒酶活性及其抑制拟合曲线,PC组为BIBR1532阳性对照。
图8为本发明实施例2中受试药物(巴西木素)直接作用于体外端粒酶活重构。图中,a为原核表达纯化的hTERT蛋白(红色箭头指示);b为体外纯化的hTERT蛋白体外端粒酶活重构;c为阴性对照组(薄荷醇)处理后的体外端粒酶活重构;d为巴西木素处理后的体外端粒酶活重构。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1构建内源性hTERT-P2A-GFP/dsRed2双荧光报告系统
1、构建稳定表达外源hTERT蛋白的293T细胞系
考虑到在hTERT基因的C-末端插入GFP也可能会影响hTERT蛋白本身的表达或者功能发挥,我们首先构建了外源hTERT的稳定表达细胞系,即将体外克隆的hTERT全长的编码序列(序列信息:ATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCCGTGCGCTCCCTGCTGCGCAGCCACTACCGCGAGGTGCTGCCGCTGGCCACGTTCGTGCGGCGCCTGGGGCCCCAGGGCTGGCGGCTGGTGCAGCGCGGGGACCCGGCGGCTTTCCGCGCGCTGGTGGCCCAGTGCCTGGTGTGCGTGCCCTGGGACGCACGGCCGCCCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAGGTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGGTGGCCCGAGTGCTGCAGAGGCTGTGCGAGCGCGGCGCGAAGAACGTGCTGGCCTTCGGCTTCGCGCTGCTGGACGGGGCCCGCGGGGGCCCCCCCGAGGCCTTCACCACCAGCGTGCGCAGCTACCTGCCCAACACGGTGACCGACGCACTGCGGGGGAGCGGGGCGTGGGGGCTGCTGCTGCGCCGCGTGGGCGACGACGTGCTGGTTCACCTGCTGGCACGCTGCGCGCTCTTTGTGCTGGTGGCTCCCAGCTGCGCCTACCAGGTGTGCGGGCCGCCGCTGTACCAGCTCGGCGCTGCCACTCAGGCCCGGCCCCCGCCACACGCTAGTGGACCCCGAAGGCGTCTGGGATGCGAACGGGCCTGGAACCATAGCGTCAGGGAGGCCGGGGTCCCCCTGGGCCTGCCAGCCCCGGGTGCGAGGAGGCGCGGGGGCAGTGCCAGCCGAAGTCTGCCGTTGCCCAAGAGGCCCAGGCGTGGCGCTGCCCCTGAGCCGGAGCGGACGCCCGTTGGGCAGGGGTCCTGGGCCCACCCGGGCAGGACGCGTGGACCGAGTGACCGTGGTTTCTGTGTGGTGTCACCTGCCAGACCCGCCGAAGAAGCCACCTCTTTGGAGGGTGCGCTCTCTGGCACGCGCCACTCCCACCCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGCGGGCCCCCCATCCACATCGCGGCCACCACGTCCCTGGGACACGCCTTGTCCCCCGGTGTACGCCGAGACCAAGCACTTCCTCTACTCCTCAGGCGACAAGGAGCAGCTGCGGCCCTCCTTCCTACTCAGCTCTCTGAGGCCCAGCCTGACTGGCGCTCGGAGGCTCGTGGAGACCATCTTTCTGGGTTCCAGGCCCTGGATGCCAGGGACTCCCCGCAGGTTGCCCCGCCTGCCCCAGCGCTACTGGCAAATGCGGCCCCTGTTTCTGGAGCTGCTTGGGAACCACGCGCAGTGCCCCTACGGGGTGCTCCTCAAGACGCACTGCCCGCTGCGAGCTGCGGTCACCCCAGCAGCCGGTGTCTGTGCCCGGGAGAAGCCCCAGGGCTCTGTGGCGGCCCCCGAGGAGGAGGACACAGACCCCCGTCGCCTGGTGCAGCTGCTCCGCCAGCACAGCAGCCCCTGGCAGGTGTACGGCTTCGTGCGGGCCTGCCTGCGCCGGCTGGTGCCCCCAGGCCTCTGGGGCTCCAGGCACAACGAACGCCGCTTCCTCAGGAACACCAAGAAGTTCATCTCCCTGGGGAAGCATGCCAAGCTCTCGCTGCAGGAGCTGACGTGGAAGATGAGCGTGCGGGACTGCGCTTGGCTGCGCAGGAGCCCAGGGGTTGGCTGTGTTCCGGCCGCAGAGCACCGTCTGCGTGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTGTGTACGTCGTCGAGCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATGTCACGGAGACCACGTTTCAAAAGAACAGGCTCTTTTTCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGTTGCAAAGCATTGGAATCAGACAGCACTTGAAGAGGGTGCAGCTGCGGGAGCTGTCGGAAGCAGAGGTCAGGCAGCATCGGGAAGCCAGGCCCGCCCTGCTGACGTCCAGACTCCGCTTCATCCCCAAGCCTGACGGGCTGCGGCCGATTGTGAACATGGACTACGTCGTGGGAGCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAAGAGGGCCGAGCGTCTCACCTCGAGGGTGAAGGCACTGTTCAGCGTGCTCAACTACGAGCGGGCGCGGCGCCCCGGCCTCCTGGGCGCCTCTGTGCTGGGCCTGGACGATATCCACAGGGCCTGGCGCACCTTCGTGCTGCGTGTGCGGGCCCAGGACCCGCCGCCTGAGCTGTACTTTGTCAAGGTGGATGTGACGGGCGCGTACGACACCATCCCCCAGGACAGGCTCACGGAGGTCATCGCCAGCATCATCAAACCCCAGAACACGTACTGCGTGCGTCGGTATGCCGTGGTCCAGAAGGCCGCCCATGGGCACGTCCGCAAGGCCTTCAAGAGCCACGTCTCTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCAGGAGACCAGCCCGCTGAGGGATGCCGTCGTCATCGAGCAGAGCTCCTCCCTGAATGAGGCCAGCAGTGGCCTCTTCGACGTCTTCCTACGCTTCATGTGCCACCACGCCGTGCGCATCAGGGGCAAGTCCTACGTCCAGTGCCAGGGGATCCCGCAGGGCTCCATCCTCTCCACGCTGCTCTGCAGCCTGTGCTACGGCGACATGGAGAACAAGCTGTTTGCGGGGATTCGGCGGGACGGGCTGCTCCTGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCACCTCACCCACGCGAAAACCTTCCTCAGGACCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAGTATGGCTGCGTGGTGAACTTGCGGAAGACAGTGGTGAACTTCCCTGTAGAAGACGAGGCCCTGGGTGGCACGGCTTTTGTTCAGATGCCGGCCCACGGCCTATTCCCCTGGTGCGGCCTGCTGCTGGATACCCGGACCCTGGAGGTGCAGAGCGACTACTCCAGCTATGCCCGGACCTCCATCAGAGCCAGTCTCACCTTCAACCGCGGCTTCAAGGCTGGGAGGAACATGCGTCGCAAACTCTTTGGGGTCTTGCGGCTGAAGTGTCACAGCCTGTTTCTGGATTTGCAGGTGAACAGCCTCCAGACGGTGTGCACCAACATCTACAAGATCCTCCTGCTGCAGGCGTACAGGTTTCACGCATGTGTGCTGCAGCTCCCATTTCATCAGCAAGTTTGGAAGAACCCCACATTTTTCCTGCGCGTCATCTCTGACACGGCCTCCCTCTGCTACTCCATCCTGAAAGCCAAGAACGCAGGGATGTCGCTGGGGGCCAAGGGCGCCGCCGGCCCTCTGCCCTCCGAGGCCGTGCAGTGGCTGTGCCACCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGACACCGTGTCACCTACGTGCCACTCCTGGGGTCACTCAGGACAGCCCAGACGCAGCTGAGTCGGAAGCTCCCGGGGACGACGCTGACTGCCCTGGAGGCCGCAGCCAACCCGGCACTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTGGAC)连接到EF1a启动子的pLenti真核表达载体中,稳定转染到293T细胞内,培养48小时后通过嘌呤霉素抗性筛选得到阳性细胞群,在通过流式细胞术获得稳定表达外源hTERT蛋白的单克隆细胞系。经western blot实验检测外源HAFL-hTERT蛋白的表达情况,用flag标签的鼠抗识别,以野生型293T细胞作为阴性对照(Ctrl),GAPDH作为上样量内参,用GAPDH的兔抗识别,结果如图1a所示,显示成功构建外源hTERT的稳定表达细胞系。
2、构建内源性hTERT-P2A-GFP荧光报告系统
利用CRISPR-Cas9技术将GFP敲入到hTERT基因的C-末端、终止密码子TGA的前面(图1b)。所设计的sgRNA(序列信息:TCAAGACCATCCTGGAC)识别的靶位点就是终止子TGA之前的一段约20bp的序列,PAM序列(TGG)位于终止子TGA之后,GFP的上下游各有一段约2kb的同源臂,其序列分别与敲入位点上下游的序列同源,可以确保GFP能够通过同源重组修复机制插入到内源hTERT基因的C端。为了避免敲入的GFP与内源hTERT共表达产生融合蛋白,在GFP和内源hTERT基因之间插入了一个自剪切位点P2A肽(Porcine teschovirus-1 2A,猪捷申病毒2A肽),其作用是将hTERT和GFP的mRNA切割为两个独立的部分。P2A的长度较短,仅有18~22个氨基酸。由于P2A序列两端的蛋白来自同一条转录的mRNA,因此这两个蛋白表达水平是完全一致的。
pX330载体上本身可以同时表达Cas9蛋白和sgRNA序列,不需要加诱导物就能在sgRNA的指导下对靶位点进行切割产生缺口。将带有上下游同源臂的P2A-GFP载体以及带有sgRNA序列的pX330载体同时双瞬转到稳定表达外源hTERT蛋白的293T细胞中,P2A-GFP序列就可以利用上下游同源臂,通过细胞内的同源重组修复机制,将GFP插入到sgRNA的切割位点,也就是hTERT基因的C-末端。转染48h后通过四轮流式细胞仪分选富集具有GFP信号的细胞群。
3、构建内源性hTERT-P2A-GFP/dsRed2双荧光报告系统
将dsRed2连接到pgk启动子的pHAGE慢病毒载体中,并稳定转染到内源性hTERT-P2A-GFP荧光报告细胞系中,培养48小时后,直接通过流式分选单克隆双荧光报告细胞株。流式分析显示(图1c)所选克隆荧光信号明显,考虑到正常生理环境下,内源TERT蛋白表达较弱,故所选其GFP荧光信号明显比内参dsRed2荧光信号弱。
4、报告细胞系培养及给药,筛选天然产物库
将所得内源性hTERT-P2A-GFP/dsRed2双荧光报告细胞接种10000个至96孔板中,置于细胞培养箱中培养至贴壁后,更换新鲜培养基,并加入待筛选的天然小分子药物,培养48小时后,弃去上清培养基,用20微升胰酶置培养箱中消化2分钟后,用50微升完全培养基终止消化,并重悬吹匀孔板细胞,流式上机高通量分析红、绿两种荧光蛋白的平均荧光值。
所用于筛选的天然产物库购于陶氏化学,共含800种天然小分子化合物。经筛选,得到18种天然产物能够降低GFP的荧光信号值(图2),其中有两种天然产物下调较为显著(图3),提示这两种天然小分子化合物(巴西木素、穿心莲内酯)有抑制端粒酶活性的潜能。
实施例2筛选出的两种天然小分子化合物抑制端粒酶活性的功能验证
1、受试药物对hTERT基因表达水平检测
将待测细胞分别计数,均匀种置6孔板,每个孔105个细胞。待细胞贴壁后,更换新鲜培养基,加入天受试药物或DMSO(对照组)。培养48小时后,收取细胞沉淀,通过Trizol法提取总RNA,进行逆转录PCR,得到cDNA库,进行后续的实时荧光定量PCR,经GAPDH作为内参基因校正。结果如图4所示,两种天然产物(巴西木素、穿心莲内酯)处理293T细胞48小时,能够下调内源hTERT基因的转录。
2、利用Q-TRAP技术用于端粒酶活性检测
将待测细胞分别计数,均匀种置6孔板,每个孔105个细胞。待细胞贴壁后,更换新鲜培养基,加入天受试药物或DMSO(对照组)。培养48小时后,进行细胞传代并给药。待到所需给药时间点,收细胞沉淀并计数,按1000个细胞/1微升的比例加入NP40裂解液(DEPC水配制)。冰上裂解30分钟后,4℃14000g离心12分钟,取部分上清用于BCA蛋白定量分析,剩余的上清放置-80℃暂存。根据BCA蛋白定量的结果,稀释细胞裂解液至总蛋白浓度1μg/μL。取1μg的裂解液,以2xRealStar Green Power Minxture with ROX(Genestar,货号A313-10)为染料,TS(AATCCGTCGAGCAGAGTT)和ACX(GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCC)为引物,进行实时荧光定量PCR。设置PCR程序:第一步,95℃10分钟;第二步:95℃15秒,60℃1分钟,40个循环。溶解曲线程序:第一步,95℃10分钟;第二步:95℃10秒,55℃10秒,每循环将55℃提升0.5℃,升至95℃后结束。以野生型293T细胞裂解液做标准曲线。根据“相对端粒酶活水平-Ct值”换算出不同组的相对端粒酶活水平进行下一步的分析。
实验结果(图5)显示,两种天然产物(巴西木素、穿心莲内酯)处理293T细胞48小时,能够抑制细胞内端粒酶活性。
此外,巴西木素无论是短期给药(PD5)还是长期给药(PD24),都能显著抑制HTC75细胞中的TERT的基因表达和端粒酶活性。(图6)。
3、受试药物对于天然构象的人端粒酶活性抑制效果分析实验
在293T细胞中瞬转过表达hTERT-SFB蛋白,通过免疫共沉淀实验获得出具有天然构象的端粒酶组分。与不同浓度的受试药物(巴西木素)均匀混合后,通过TRAP技术进行体外端粒酶活性分析。
结果如图7所示,巴西木素能够直接作用于端粒酶。随着药物作用的浓度增加,端粒酶活性的抑制程度增加,其巴西木素的IC50值约为2.5μM。
4、原核表达纯化hTERT蛋白和体外端粒酶活重构实验
将密码子优化过的GST-hTERT原核表达载体转化至BL21感受态细胞中。经IPTG低温诱导表达20小时后,收集菌液沉淀。冰上超声裂解后,进行GST pull-down实验,得到GST-hTERT蛋白。然后,与体外转录的hTR各1μL均匀混合,加入8μL的重构缓冲液(25mM Tris-HCl,pH 7.4;136mM NaCl;2.6mM KCl;1mM MgCl2;1mM EGTA;10%glycerol;1mM DTT以及蛋白酶和RNase抑制剂),30℃水浴半小时后,加入不同浓度的受试药物(巴西木素),进行端粒酶活检测。密码子优化过的GST-hTERT原核表达载体由军事医学研究院叶棋浓课题组提供。
结果表明,体外表达的hTERT蛋白同样也具有催化端粒延伸的功能(图8a和图8b)。体外端粒酶活重构实验(图8c和图8d)更是证明了巴西木素可以直接抑制端粒酶分子(纳摩尔浓度级)与WO2001093864A1公开的巴西木素可作为一种微摩尔端粒酶抑制剂的结果相一致,薄荷醇是所筛选药库中的一种天然小分子化合物作为阴性对照。
以上结果表明,本发明构建得到的内源性hTERT-P2A-GFP/dsRed2双荧光报告细胞可用于筛选以人内源性TERT蛋白为靶点的增强或抑制端粒酶活性的外源产物,具有较大的应用前景。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,故凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种以人内源性TERT蛋白为靶点筛选端粒酶调控剂的细胞模型,其特征在于,为采用外源稳定表达hTERT蛋白的细胞作为目的报告细胞,将P2A-GFP敲入到hTERT的3’端、终止密码子TGA的前面,并稳定转染内参蛋白,得到所述hTERT-P2A-GFP报告细胞系,即得。
2.根据权利要求1所述的细胞模型,其特征在于,所述外源稳定表达人TERT蛋白的细胞为将体外克隆的hTERT全长的编码序列连接到EF1a启动子的真核表达载体中,稳定转染到细胞内获得。
3.根据权利要求1或2所述的细胞模型,其特征在于,所述细胞为293T细胞。
4.根据权利要求1所述的细胞模型,其特征在于,所述敲入为采用CRISPR-CAS9技术。
5.根据权利要求1所述的细胞模型,其特征在于,所述内参蛋白为dsRed2蛋白。
6.根据权利要求1~5所述的细胞模型的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1.将体外克隆的hTERT全长的编码序列连接到EF1a启动子的真核表达载体中,稳定转染到293T细胞内,构建外源稳定表达hTERT蛋白的细胞系;
S2.在步骤S1外源稳定表达hTERT蛋白的细胞系中,利用CRISPR-Cas9技术将P2A肽-GFP敲入到hTERT基因的3’端、终止密码子TGA的前面,构建内源hTERT的报告基因系统;
S3.在步骤S2构建的内源报告基因系统中,随机插入dsRed2基因,构建能稳定表达dsRed2的内源hTERT报告细胞模型。
7.权利要求1~6任一所述的方法制备得到的细胞模型。
8.权利要求1~6任一所述细胞模型在筛选具有抑制或增强端粒酶活性的化合物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,所述化合物为天然小分子化合物。
10.巴西木素和/或穿心莲内酯在制备端粒酶抑制剂中的应用。
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