CN110724704B

CN110724704B - 用于转基因水稻转化体鉴定的阳性质粒及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN110724704B
Application number: CN201910984651.1A
Authority: CN
Inventors: 马卉; 张秀杰; 汪秀峰; 焦小雨; 许学; 李夏莹; 吴爽; 陈子言; 王颢潜; 梁晋刚
Original assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2019-10-16
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2039-10-16
Also published as: CN110724704A

Abstract

本发明公开了用于转基因水稻转化体鉴定的阳性质粒及其构建方法和应用。所述阳性质粒包括载体骨架和筛选元件，该筛选元件由11个水稻转化体侧翼序列以及2个水稻内标准基因组成，2个水稻内标准基因分别是SPS基因和PLD基因。本发明所构建的阳性质粒能够应用于转基因水稻筛查和检测，包括：将所述的阳性质粒作为转基因水稻检测用的阳性对照质粒或阳性标准品，对待检测的水稻样品进行转基因成分的普通PCR或实时荧光PCR筛查检测，能够准确检测多种转基因水稻，满足转基因水稻安全监管和检测工作的需求，避免了现有检测鉴定过程中针对多个检测靶标需要制备多个阳性对照的问题，具有覆盖面积广、易大量获得、制备简单等特点。

Description

用于转基因水稻转化体鉴定的阳性质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及转基因植物转化体鉴定的阳性质粒，尤其涉及用于转基因水稻转化体鉴定的阳性质粒及其构建方法，本发明进一步涉及该阳性质粒在鉴定11种转基因水稻转化体中的应用，属于转基因水稻的鉴定领域。

背景技术

水稻作为世界上超过一半人口的主食，是重要的粮食作物之一。转基因技术作为一种新兴的育种手段，已被广泛应用于农作物品质改良。迄今已有许多抗虫、抗病、耐除草剂等转基因水稻研究被报道。在中国，目前仅转基因抗虫水稻品种华恢1号及其杂交种Bt汕优63在2009年和2014年获得农业部颁发的生产应用安全证书，证书有效期为5年，此外，还有部分转基因水稻品系已申请环境安全评价，但尚未有转基因水稻获批进行商业化种植。

随着转基因技术的迅速发展，大量进口国外转基因产品、自主研发转基因产品不断涌现，田间试验的转基因作物也越来越多，转基因作物意外或故意泄漏的风险也随之加大，给中国的转基因产品安全管理带来了巨大挑战。因此，提高转基因检测的技术和方法，加强对转基因水稻的检测和监管十分重要。

在日常检测过程中，阳性标准物质是检测过程中的标尺。但目前中国未有转基因水稻被批准商业化种植，且由于转基因作物产权保密和信息管理等原因，一些转化体品系很难获取可靠的原材料以制备阳性标准物质，相应的，阳性标准品匮乏和制备困难等问题严重阻碍了日常检测和监管工作的开展。

2002年，日本科学家Kuribara等提出“多靶标质粒标准分子”的概念为解决阳性标准品匮乏等问题提供了新的思路和方法。在这之后，质粒标准物质相较于基体标准物质易获得、纯度高、均匀性好等优势也逐步得到学者们的关注和认可。此外，将多种水稻转化事件外源靶标基因共同构建入一个质粒载体中，在一定程度上也降低了检测成本，给检测工作增添便利。

目前，有关水稻转化体特异性检测用的单靶标阳性质粒分子的构建和应用方面的报道较多，但其在多靶标阳性质粒分子的构建和研发方面的报道较少。CN103146824A(发明名称：一种用于转基因水稻PCR检测的重组标准质粒及试剂盒)以及李晓飞等(转基因水稻检测用阳性质粒分子的构建及应用，2013)公开了构建适用于3种转基因水稻TT51-1、KF6和KMD1特异性检测的多靶标阳性质粒分子。这些公开的多靶标阳性质粒分子只能覆盖三种转基因品系，存在覆盖面较窄，适用性以及特异性不够好等缺陷，有待改进。

因此针对现有水稻转化体鉴定的检测实际中所存在的问题，亟待需要研制一种覆盖面更宽、适用性更佳以及特异性更强的阳性质粒应用于转基因水稻的筛查、检测或监测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种覆盖面更宽、适用性更佳的用于转基因水稻筛查、检测或监测的阳性质粒。

本发明的目的之二是提供一种构建所述阳性质粒的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于水稻转化体鉴定的阳性质粒，包括载体骨架和筛选元件，所述的筛选元件由11个水稻转化体侧翼序列以及2个水稻内标准基因序列组成；其中，所述的11个水稻转化体侧翼序列分别是TT51-1/华恢1号/Bt汕优63侧翼序列、T1C-19侧翼序列、T2A-1侧翼序列、克螟稻1侧翼序列、科丰2号侧翼序列、科丰6号侧翼序列、科丰8号侧翼序列、G6H1侧翼序列、M12侧翼序列、PA110-15侧翼序列和114-7-2侧翼序列。

作为一种优选的实施方案，所述TT51-1/华恢1号/Bt汕优63侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述T1C-19侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述T2A-1侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述克螟稻1侧翼序列的核苷酸序列为SEQ IDNo.4所示；所述科丰2号侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；所述科丰6号侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；所述科丰8号侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示；所述G6H1侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；所述M12侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；所述PA110-15侧翼序列的核苷酸序列分为3'端侧翼序列和5'端侧翼序列，其中，3'端侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示，5'端侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.11所示；114-7-2的侧翼序列位于4号染色体插入位点5'端，其核苷酸序列为SEQ ID No.12所示。

所述的2个水稻内标准基因分别是SPS基因和PLD基因，其中，SPS基因可以选自SEQID No.13或SEQ ID No.14这两个片段中的任何一个或同时选取这两个片段；所述水稻内标基因PLD基因的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示。

所述的筛选元件由11个水稻转化体的侧翼序列和2个水稻内标准基因按照任意的连接次序进行连接或拼接得到，所构建的阳性质粒分子在11种水稻转化体的检测效果上相同；作为本发明的一种具体的实施方案，可以依次按照TT51-1/华恢1号/汕优63侧翼序列、T1C-19侧翼序列、T2A-1侧翼序列、克螟稻1侧翼序列、科丰2号侧翼序列、科丰6号侧翼序列、科丰8号侧翼序列、G6H1侧翼序列、M12侧翼序列、PA110-15侧翼序列、114-7-2侧翼序列、SPS基因序列(SEQ ID No.13和SEQ ID No.14)和PLD基因序列的顺序拼接得到一段长为4721bp的融合序列。

本发明进一步提供了一种构建所述用于水稻转化体鉴定的阳性质粒分子的方法，包括：将TT51-1/华恢1号/汕优63侧翼序列、T1C-19侧翼序列、T2A-1侧翼序列、克螟稻1侧翼序列、科丰2号侧翼序列、科丰6号侧翼序列、科丰8号侧翼序列、G6H1侧翼序列、M12侧翼序列、PA110-15侧翼序列、114-7-2侧翼序列、SPS基因和PLD基因按照任意次序拼接在一起后得到融合基因；将该融合基因连接到载体骨架上得到重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌受体菌，即得。

作为一种优选的实施方式，将TT51-1/华恢1号/汕优63侧翼序列、T1C-19侧翼序列、T2A-1侧翼序列、克螟稻1侧翼序列、科丰2号侧翼序列、科丰6号侧翼序列、科丰8号侧翼序列、G6H1侧翼序列、M12侧翼序列、PA110-15侧翼序列、114-7-2侧翼序列、SPS基因序列(SEQ ID No.13和SEQ ID No.14)和PLD基因序列依次拼接在一起后得到的长为4721bp的融合基因。

作为一种优选的实施方式，所述的载体骨架是pUC18质粒。

本发明采用普通PCR方法对所构建的转基因水稻转化体鉴定用阳性质粒的外源插入基因进行验证，检验所构建的阳性质粒是否含有预期的外源片段以及是否适用于现有农业部、出入境和专利上的普通PCR定性检测标准；根据扩增结果可见，阳性质粒中各水稻转化体侧翼序列均可被有效扩增，说明所构建的阳性质粒含有预期目的基因且适用于现有农业部、出入境和专利上检测标准。

本发明进一步以不同浓度的阳性质粒的DNA样品为模板，利用各水稻转化体对应公告、标准和专利中的引物、反应体系和程序进行普通PCR扩增，判断所构建的阳性质粒用于普通PCR定性检测的适宜浓度；试验结果显示，各水稻转化体的检测引物都能从1×10³copies/μL(梯度6)含量以上的阳性质粒中得到有效扩增，可满足相应水稻转化体定性PCR检测的需求。

本发明更进一步选择6个浓度梯度的阳性质粒作为DNA模板，利用对应公告、标准和专利中的荧光引物、反应体系和反应程序，使用实时定量PCR仪对阳性质粒进行实时荧光PCR检测，判断所构建的阳性质粒用于实时荧光PCR检测的适宜浓度。qPCR检测结果显示，在6个不同质粒浓度下，均出现典型性扩增曲线，且在阳性质粒分子浓度为1×10²～1×10⁶copies/μL时，表18中所列转化体Ct值均≤36。qPCR检测结果说明，本发明所构建的阳性质粒适用于对应农业部、出入境和专利上的qPCR检测标准，可满足相应的检测需求，其中，阳性质粒分子浓度在1×10³～1×10⁵copies/μL时，更适宜作为各水稻转化体实时荧光PCR检测的阳性对照品。

由此，本发明所构建的阳性质粒能够应用于转基因水稻筛查和检测，包括：将所述的阳性质粒分子作为转基因水稻检测用的阳性对照质粒或阳性标准品，采用普通PCR或实时荧光PCR方法对待检测的水稻样品进行转基因成分的筛查检测。

本发明所构建的阳性质粒可用作水稻转化体检测鉴定时的阳性对照或标准品，应用于转基因水稻筛查、检测或监管，能够准确检测多种转基因水稻转化体，满足转基因水稻安全监管和检测工作的需求，避免了现有的检测鉴定过程中需要针对多个检测靶标分别制备多个阳性对照的问题，有效降低了人力成本和经济成本，具有覆盖面积广、易大量获得、制备简单等特点，便于在实践中推广应用。

附图说明

图1 TT51-1/华恢1号/Bt汕优63的靶标序列的确定。

图2 T1C-19的靶标序列的确定。

图3 T2A-1的靶标序列的确定。

图4克螟稻1的靶标序列的确定。

图5科丰2号的靶标序列的确定。

图6科丰6号的靶标序列的确定。

图7科丰8号的靶标序列的确定。

图8 G6H1的靶标序列的确定。

图9 M12的靶标序列的确定。

图10 PA110-15(3'端)的靶标序列的确定。

图11 PA110-15(5'端)的靶标序列的确定。

图12 114-7-2的靶标序列的确定。

图13内标准基因SPS(1)的靶标序列的确定。

图14内标准基因SPS(2)的靶标序列的确定。

图15内标准基因PLD的靶标序列的确定。

图16 pUC18-RICE-event阳性质粒结构图。

图17 pUC18-RICE-event阳性质粒各水稻转化体现有普通PCR定性检测标准/专利适用性验证的电泳图；M：分子量标准100bp；1：TT51-1/华恢1号(274bp)；2：Bt汕优63(bp)；3：T1C-19(188bp)；4：T2A-1(183bp)；5：克螟稻1(363bp)；6：科丰2号(201bp)；7：科丰6号(301bp)；8：科丰8号(278bp)；9：G6H1(247bp)；10：M12(380bp)；11：PA110-15的3'端(262bp)；12：PA110-15的5'端(376bp)；13：SPS(277bp)；14：SPS(287bp)；15：空白对照。

图18 pUC18-RICE-event阳性质粒用于各水稻转化体普通PCR定性检测的适宜浓度测试实验的电泳图。

图19 pUC18-RICE-event阳性质粒用于具有实时荧光PCR检测标准/专利的水稻转化体的适宜浓度测试实验的扩增曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1阳性质粒分子的构建、提取、纯化和测序验证

1、确定各水稻转化体的检测靶标及其序列

通过检索国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)网站的“GM ApprovalDatabase”数据库、相关专利、文献，以及分离、鉴定、测序获取水稻转化体外源基因插入的外源表达框，获得11个水稻转化体和2个水稻内标准基因的核苷酸序列信息：

11个水稻转化体：TT51-1/华恢1号/汕优63、T1C-19、T2A-1、克螟稻1、科丰2号、科丰6号、科丰8号、G6H1、M12、PA110-15、114-7-2；

2个水稻内标准基因：SPS(2个片段)和PLD。

通过转基因检测方法数据库(GMDD，http://gmdd.sjtu.edu.cn/)、现有专利以及已发布的农业部标准和出入境标准获得各水稻转化体的检测引物序列和检测方法，并将其与检索到的各水稻转化体核苷酸序列进行比对；每个水稻转化体靶标序列的选择遵循力求其具有最广的适用性的原则，最终确定水稻转化体和内标准基因的靶标序列。

(1)TT51-1/华恢1号/汕优63的靶标序列确定见图1。

表1 TT51-1/华恢1号检测标准对应引物/探针序列

表2 Bt汕优63检测标准对应引物序列

(2)T1C-19的靶标序列确定见图2。

表3 T1C-19检测标准对应引物序列

(3)T2A-1的靶标序列确定见图3。

表4 T2A-1检测标准对应引物序列

(4)克螟稻1的靶标序列确定见图4。

表5克螟稻1检测标准对应引物序列

(5)科丰2号的靶标序列确定见图5。

表6科丰2号检测标准对应引物序列

(6)科丰6号的靶标序列确定见图6。

表7科丰6号检测标准对应引物序列

(7)科丰8号的靶标序列确定见图7。

表8科丰8号检测标准对应引物序列

(8)G6H1的靶标序列确定见图8。

表9 G6H1检测标准对应引物序列

(9)M12的靶标序列确定见图9。

表10 M12检测标准对应引物序列

(10)PA110-15(3'端)、PA110-15(5'端)的靶标序列确定分别见图10、图11。

表11 PA110-15检测标准对应引物序列

(11)114-7-2的靶标序列确定分别见图12。

表12 114-7-2检测标准对应引物序列

(12)内标准基因SPS(片段1)的靶标序列确定见图13。

表13 SPS基因检测标准对应引物/探针序列

(13)内标准基因SPS(片段2)的靶标序列确定见图14。

表14 SPS基因检测标准对应引物/探针序列

(14)内标准基因PLD的靶标序列确定见图15。

表15 PLD基因检测标准对应引物/探针序列

2、阳性质粒分子构建和保藏

按照表16中对应所述的核苷酸序列，将靶标序列SEQ ID No.1～SEQ ID No.15按顺序拼接成一段长4721bp的序列SEQ ID No.16。将拼接的融合序列SEQ ID No.16委托通用生物系统(安徽)有限公司合成，并装载到pUC18质粒上，从而得到转基因水稻转化体鉴定阳性质粒，命名为pUC18-RICE-event。连接顺序及质粒分子大小见图16。

表16水稻转化体鉴定/基因和内标准基因的序列号

构建得到的阳性质粒pUC18-RICE-event转化入大肠杆菌受体菌中，菌种保藏在-80℃冰箱，以载体氨苄青霉素抗性(Amp⁺)为筛选标记。

3、阳性质粒的提取、纯化和测序验证

将保藏的菌种划平板，37℃过夜培养，第二天挑取单克隆菌落在含有氨苄青霉素抗性(Amp⁺)的LB培养液中，37℃，200rpm培养12h，然后用Axygen公司质粒小量DNA提取试剂盒(AxyPrep^TMPlasmid Miniprep Kit)进行提取和纯化。

将提取和纯化的质粒分子完成测序验证。测序分析结果显示，pUC18-RICE-event质粒是由2641bp的pUC18载体骨架和4721bp的转化体特异性集成序列(靶标序列)构成，序列总长7362bp且阳性质粒中的外源序列与预期序列一致。

试验例1阳性质粒分子对各转化体定性检测标准适用性验证试验

1、阳性质粒pUC18-RICE-event的提取与检测

将含有阳性质粒分子pUC18-RICE-event的大肠杆菌于37℃，200rpm培养12h，按照Axygen公司质粒小量DNA提取试剂盒(AxyPrep^TMPlasmid Miniprep Kit)说明书提取质粒DNA。用超微量核酸蛋白检测仪检测质粒的纯度和浓度，结果显示OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8左右，符合定性、定量PCR检测要求。

阳性质粒验证利用表17中对应公告、标准中的普通PCR引物、和表18所述的反应体系和程序对转基因水稻转化体鉴定用阳性质粒pUC18-RICE-event的外源插入基因进行验证，检验构建质粒是否含有预期的外源片段以及是否适用于现有农业部、出入境和专利上的普通PCR定性检测标准；PCR扩增采用ABI公司生产的PCR仪，扩增结果如图17所示。

由图17可知，各水稻转化体侧翼序列均可被有效扩增，说明所构建的质粒标准分子含有预期目的基因，且适用于现有农业部、出入境和专利上检测标准。

表17水稻转化体和内标准基因普通PCR检测引物

试验例2转基因水稻转化体鉴定阳性质粒pUC18-RICE-event用于普通PCR定性检测的适宜浓度测试试验

根据阳性质粒DNA初始浓度和大小，用ddH₂O将其依次稀释成1×10⁸copies/μL(梯度1)、1×10⁷copies/μL(梯度2)、1×10⁶copies/μL(梯度3)、1×10⁵copies/μL(梯度4)、1×10⁴copies/μL(梯度5)、1×10³copies/μL(梯度6)、1×10²copies/μL(梯度7)、1×10copies/μL(梯度8)、1copies/μL(梯度9)，4℃保存备用。

以不同浓度的阳性质粒pUC18-RICE-sceen的DNA样品(1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10、1copies/μL)为模板，利用各水稻转化体对应公告、标准和专利中的引物(表17)、反应体系和程序(表18)进行普通PCR扩增，判断转基因水稻转化体鉴定阳性质粒用于普通PCR定性检测的适宜浓度。

试验结果显示，各水稻转化体的检测引物都能从1×10³copies/μL(梯度6)含量以上的阳性质粒中得到有效扩增(图18)，可满足相应水稻转化体定性PCR检测的需求。

试验例3转基因水稻转化体鉴定阳性质粒pUC18-RICE-event用于实时荧光PCR检测的适宜浓度测试试验

选择试验例2中9个浓度梯度中的6个梯度：1×10⁶copies/μL(梯度3)、1×10⁵copies/μL(梯度4)、1×10⁴copies/μL(梯度5)、1×10³copies/μL(梯度6)、1×10²copies/μL(梯度7)、1×10copies/μL(梯度8)的水稻转化体阳性质粒分子作为DNA模板，利用下述对应公告、标准和专利中的荧光引物(表19)、反应体系(表20)和反应程序，使用Applied Biosystems QuantStudio 5实时定量PCR仪对水稻转化体阳性质粒pUC18-RICE-event进行实时荧光PCR检测，判断转基因水稻转化体鉴定阳性质粒用于实时荧光PCR检测的适宜浓度。

表19各水稻转化体和内标准基因实时荧光PCR检测引物

20各水稻转化体实时荧光PCR检测反应体系

试剂	体积
		TaqMan反应缓冲液	10.0μL
10μmol/L上游引物(F)	1.0μL
		10μmol/L上游引物(R)	1.0μL
10μmol/L探针(P)	0.5μL
		DNA模板	2.0μL
ddH2O	5.5μL
		总体积	20.0μL

反应程序为：50℃、2min；95℃、2min；95℃、1s；60℃、20s；循环数40；在第二阶段的退火延伸(60℃)时收集荧光信号。

qPCR检测结果显示，在6个不同质粒浓度下，均出现典型性扩增曲线，且在pUC18-RICE-event阳性质粒浓度为1×10²～1×10⁶copies/μL时，表19中所列转化体Ct值均≤36(图19)。

qPCR检测结果说明所构建的阳性质粒适用于对应农业部、出入境和专利上的qPCR检测标准，可满足相应的检测需求。且阳性质粒浓度在1×10³～1×10⁵copies/μL时，更适宜作为各水稻转化体实时荧光PCR检测的阳性对照品。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 用于转基因水稻转化体鉴定的阳性质粒及其构建方法和应用

<130> AH-2001-190833A

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 461

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 1

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 60

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 120

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 180

gaactttaac ccccgaacat cgcctcgctc cagtcaatga ccgctgttat gcggccattg 240

atttgtagag agagactggt gatttcagcg ggcatgcctg caggtcgact ctagaggatc 300

ccggacgagt gctggggcag ataagcagta gtggtggggc tacgaacata ttccttttcc 360

ttctggacgc taccactcat atgttccaaa attacaaatt tgtcctttgt atttgttgca 420

attttcatgt aagaaatcca acgaggctct gttttttttt a 461

<210> 2

<211> 216

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 2

cctcccaaca ccccaggtcc acaatgtgat aagccaggag caactgtgtt gtaggtatgt 60

ttgcttggct gtttgctctc tctctctctc tctttctcag ttcaaacact gatagtttaa 120

actgaaggcg ggaaacgaca atctgatcca agctcaagct gctctagcat tctgccattc 180

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgg 216

<210> 3

<211> 212

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

atctgaaagc tagcctcgtt tattcctggt catcgtcaac gaatcttcct gtctgcctgc 60

tagctattgg tacctagctt aaactgtacg aacgctagca gcacggatct aacacaaaca 120

cggatctaac acaaacatga acagaagtag aactaccggg ccctaaccat ggaccggaac 180

gccgatctag agaaggtaga gagggggggg gg 212

<210> 4

<211> 380

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

ttgccgattt cggaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg 60

accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct 120

cactggtgaa aagaaaaacc accccagtac attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt 180

tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa tatatcccga gatgggcagg catatcggcg 240

tacgcacgca gcccggtgag acccgccgca gttggagcgc gcatcgccat cgccgcgagc 300

ccgcgaagtc cacggcgccc tcgtcggcgg aacaccccag ttgctgacga gactgacagg 360

tgacagccga gacagccaga 380

<210> 5

<211> 240

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 5

gcgcagcctg aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg gatcagattg tttgctctag 60

ttgcgaatcg cgcatatgaa atcacaccat gtagtgtatt gaccgattcc ttgcggtccg 120

aatgggccga acccgctcgt ctggctaaga tcggccgaag cgatcgcatc ctatggtcaa 180

agcggtttgt ttgctctaac atcacaactt gtatagtccg tgcaaactta ggtcaaagcg 240

<210> 6

<211> 363

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

agcagcttgg gcttggatca gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagcgaca 60

aaagatcagg atttgggaag ggcgattgct ggcgaggcac atatagctcc atatagcttg 120

tttgcctcag cttgcttctt gatcagacca atcagtttat ctgactttgc atatgcttgg 180

gcaccaccaa gaccacccta cagaaaacat ggaaggtcat ttaaccagca agctagatta 240

taaattatta gacattaaat caatctaaag tccaacgttc ccttgaaata cttcttgaag 300

tccatttttc accttaacat tcaaaaaaca gttgttttcg ctcttaaact ccaaacgaga 360

caa 363

<210> 7

<211> 315

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 7

tgctgatttc tgttacaaac cttgcaagtc cagggatgaa gatgatgaga aagatgaact 60

ctagatcaag ctcgattcta gagtcaagca gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 120

ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 180

gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtgatctca 240

cccatgcttg ggtactaaga aatggcagaa cagcatcatg gtcgccacta tacaaataaa 300

ataggaaggg atgag 315

<210> 8

<211> 247

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 8

gctggtggcg atacatccat cgatccatca tcttatatat tgtggtgtaa acaaattgac 60

gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta acgccgaatt 120

aattcggggg atctggattt tagtactgga ttttggtttt aggaattaga aattttattg 180

atagaagtat tttacaaata caaatacata ctaagggttt cttatatgct caacacatga 240

gcgaaac 247

<210> 9

<211> 380

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 9

gttggagatt ttgggcttgc aagaatactt gttgatggga cctcattgat acaacagtca 60

acaagctcga tgggatttat agggacaatt ggctatgcag caccaggtca gcaactcctt 120

ccagtatttt gcattttctg atctctagtg ctccagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 180

agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac acaaagtaaa 240

ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat ctgatcaaga 300

gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc 360

cgcttgggtg gagaggctat 380

<210> 10

<211> 394

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 10

attcgaccgg atctgtcgat cgacaagctc gagtttctcc ataataatgt gtgagtagtt 60

attcgaccgg atctgtcgat cgacaagctc gagtttctcc ataataatgt gtgagtagtt 120

cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa 180

accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc ccgaattaat tcggcgttaa ttcagtacat 240

taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta caccacaata 300

tatatatgta caggtatata tgcaaggaga tggtagtagt aactcctaga tcagccaaat 360

caaatctcag ttggccactg gcggcagatg gctg 394

<210> 11

<211> 280

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 11

ctagaatgct cgatcagtgc atctgctgtg gctggtagca gtagcagttc atccatccat 60

cctacgatca acatccaatg atatacctgt acatatatat atggatgcat ataatcatat 120

atgatgggct ggacaatctg atccaagctc aagctgctct agcattcgcc attcaggctg 180

cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 240

gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 280

<210> 12

<211> 318

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 12

gcgcgcgggc gatacagaag atgatacgtc tgatccagtt catcatcccc tgcaaaacga 60

agcgcacgtt aggctagata caactcaacc gcggcgaacc cacggcggca agcgacaaga 120

gtcacctctc ctcgccatcg ccgacgcgga ggaagacgag gcggaggcgg cgtcaaacac 180

tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga attaagggag 240

tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga 300

accgcaacgt tgaaggag 318

<210> 13

<211> 295

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 13

ctttttattt gcgcctgaac ggatatcttt cagtttgtaa ccaccggatg acgcacggac 60

ggctcggatc atcccgaaaa gatcaaccgc ggcgcgagca cgagaccacc gtgggcccca 120

tggcccaccg acttacacaa tctctcccac tgccatgcgg gcccacacca gcaacagtcc 180

agtccagaga gccccgaact cctccaaacc cggggggcca caccctgcca cgtgtcaccc 240

gccagcctcc ctctcatcct ctctctcctc gtccagtgct tctccttctc ctcgc 295

<210> 14

<211> 310

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 14

tacagagtgg atctgtttac tcgtcaagtg tcatctcctg aagtggactg gagctatggg 60

gagcctactg aaatgttaac tccggttcca ctgacggaga gggaagcggt gagagtgctg 120

gtgcgtacat tgtgcgcatt ccgtgcggtc caagggacaa gtacctccgt aaagagccct 180

gtggccttac ctccaagagt ttgtcgacgg agctctcgcg catatctgaa catgtccaag 240

gctctggggg aacaggttag caatgggaag ctggtcttgc catatgtaat ccatggccac 300

tatgccgatg 310

<210> 15

<211> 310

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 15

atcaggcctt gtcagtggca agaacaacac cattgacagg agcatccaag atgcatacat 60

ccacgcaatt cgccgcgcca agaacttcat ctacatcgag aatcagtact tccttggcag 120

ctcatttgca tggaaagccg atggcatcag accagaagac attgaggcgt tgcatctgat 180

tcccagagag atttctctga agattgtgaa caagattgaa gctggtgagc gttttgcagt 240

ctatgttgtg ctgccaatgt ggcctgaagg acctcctgct agtggatcag tgcaggcaat 300

actggattgg 310

Claims

1.一种用于转基因水稻转化体鉴定的阳性质粒，包括载体骨架和筛选元件；其特征在于，所述的筛选元件由11个水稻转化体侧翼序列以及2个水稻内标准基因序列组成；其中，所述的11个水稻转化体侧翼序列分别是TT51-1/华恢1号/Bt汕优63侧翼序列、T1C-19侧翼序列、T2A-1侧翼序列、克螟稻1侧翼序列、科丰2号侧翼序列、科丰6号侧翼序列、科丰8号侧翼序列、G6H1侧翼序列、M12侧翼序列、PA110-15侧翼序列和114-7-2侧翼序列；所述的2个水稻内标准基因分别是SPS基因和PLD基因；

所述TT51-1/华恢1号/Bt汕优63侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述T1C-19侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述T2A-1侧翼序列的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示；所述克螟稻1侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示；所述科丰2号侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；所述科丰6号侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；所述科丰8号侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示；所述G6H1侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；所述M12侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；所述PA110-15侧翼序列的核苷酸序列分为3'端侧翼序列和5'端侧翼序列，其中，所述3'端侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示，所述5'端侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID No.11所示；所述114-7-2的侧翼序列位于4号染色体插入位点5'端，其核苷酸序列为SEQ ID No.12所示；所述水稻内标准基因SPS基因选自SEQ ID No.13或SEQ ID No.14所示的任何一个序列或同时选取这两个序列；所述水稻内标准基因PLD基因的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示。

2.按照权利要求1所述的阳性质粒，其特征在于，所述的筛选元件由所述的11个水稻转化体侧翼序列和2个水稻内标准基因按照任意的连接次序进行连接或拼接得到的融合序列。

3.按照权利要求1所述的阳性质粒，其特征在于，所述的筛选元件依次按照TT51-1/华恢1号/汕优63侧翼序列、T1C-19侧翼序列、T2A-1侧翼序列、克螟稻1侧翼序列、科丰2号侧翼序列、科丰6号侧翼序列、科丰8号侧翼序列、G6H1侧翼序列、M12侧翼序列、PA110-15侧翼序列、114-7-2侧翼序列、SPS基因和PLD基因的顺序连接得到的融合序列。

4.按照权利要求1所述的阳性质粒，其特征在于，所述的载体骨架是pUC18质粒。

5.一种构建权利要求1或2所述用于水稻转化体鉴定的阳性质粒的方法，包括：将TT51-1/华恢1号/汕优63侧翼序列、T1C-19侧翼序列、T2A-1侧翼序列、克螟稻1侧翼序列、科丰2号侧翼序列、科丰6号侧翼序列、科丰8号侧翼序列、G6H1侧翼序列、M12侧翼序列、PA110-15侧翼序列、114-7-2侧翼序列、SPS基因和PLD基因按照任意次序拼接在一起后得到融合基因；将该融合基因连接到载体骨架上得到重组质粒。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，依次按照TT51-1/华恢1号/汕优63侧翼序列、T1C-19侧翼序列、T2A-1侧翼序列、克螟稻1侧翼序列、科丰2号侧翼序列、科丰6号侧翼序列、科丰8号侧翼序列、G6H1侧翼序列、M12侧翼序列、PA110-15侧翼序列、114-7-2侧翼序列、SPS基因和PLD基因连接在一起后得到融合基因，将该融合基因连接到载体骨架上得到重组质粒。

7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的载体骨架是pUC18质粒。

8.权利要求1-4任何一项所述的阳性质粒在转基因水稻筛查、检测或监测中的应用。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述的阳性质粒作为转基因水稻检测用的阳性对照或阳性标准品，采用普通PCR或实时荧光PCR方法对转基因水稻样品进行转基因成分的筛查或检测。