CN111410695A

CN111410695A - 基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用

Info

Publication number: CN111410695A
Application number: CN202010240616.1A
Authority: CN
Inventors: 杨爱民; 梅礼刚; 林昌海
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2020-07-14
Anticipated expiration: 2040-03-31
Also published as: CN111410695B

Abstract

本发明公开了一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5或7所示。还公开了一种核酸分子，编码所述基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子；一种表达载体，包含所述的核酸分子。还公开了所述的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子、核酸分子、表达载体在降解Tau蛋白中的应用。本发明开发新型靶向嵌合分子，嵌合分子结合在聚集蛋白Tau的表面，从而将Tau蛋白招募进入细胞自噬小体，促进其通过细胞自噬途径降解。本发明提供的新的蛋白靶向降解技术，有望将这种新技术应用到不同的目标蛋白上，从而克服当前基于泛素‑蛋白酶体途径的蛋白靶向降解技术不能高效降解胞内大分子组分的缺陷。

Description

基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用。

背景技术

神经退行性疾病是一类以中枢神经元进行性丧失为特征的疾病的总称，因其不可成药性和严重影响中老年患者生活质量而备受关注。其中包括帕金森综合症(PD)、阿尔兹海默症(AD)、亨廷顿舞蹈症(HD)以及肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)。研究表明，大部分神经退行性疾病的发生都伴随着错误折叠蛋白形成的聚集体在神经细胞中的异常积累，从而对神经元产生毒性作用。

针对这一类疾病，目前临床上主要是通过小分子抑制剂结合靶蛋白的活性位点，抑制靶蛋白活性，从而缓解神经退行性疾病的症状。然而，单一小分子药物的长期使用会不可避免的会导致耐药性及脱靶效应的产生，且靶蛋白必须要有可供小分子药物结合的活性位点。这就决定了目前仍然有一些疾病具有不可“成药性”。

近些年来，在翻译水平通过基于泛素-蛋白酶体途径的PROTACs(ProteinTargeting Chimeras)蛋白靶向降解技术实现了对目标蛋白水平的调控。PROTACs是通过将靶蛋白配体与特定的泛素E3连接酶的配体相连形成的双功能嵌合分子。PROTACs蛋白靶向降解嵌合分子能够通过其靶蛋白配体特异性识别靶蛋白，并通过泛素E3连接酶的配体招募E3，从而形成靶蛋白-PROTACs蛋白靶向降解分子-泛素E3连接酶的三元复合体。泛素E3连接酶进一步使靶蛋白被泛素化修饰，最终被26S蛋白酶体识别并被降解。利用PROTACs蛋白靶向降解技术实现了多种致病性蛋白的靶向降解，并且已有相应的药物进入临床试验。

然而蛋白酶体只能用于降解一些半衰期短的小分子蛋白，而对于长寿命蛋白、大分子的蛋白质聚集体，则很难通过泛素-蛋白酶体途径得到高效率的清除。因此这也极大地限制了当前的蛋白靶向降解技术在降解胞内大分子组分及神经退行性疾病等研究领域的应用。细胞自噬是真核生物中高度保守的蛋白质降解途径，主要由双层膜结构包裹着待降解的底物(蛋白质聚集体、细胞器、病原菌等)形成自噬小体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，待降解的底物随后在溶酶体酸性水解酶的作用下被降解。自噬小体膜蛋白LC3在自噬小体的形成、成熟以及底物的识别过程中扮演着重要的角色。在细胞水平及小鼠等动物模型中的研究表明，通过药物激活细胞自噬可以降低胞内致病性β-淀粉样蛋白、亨廷顿蛋白(mHTT)以及α-Synuclein蛋白聚集体的水平，从而有效缓解这些蛋白聚集体对神经细胞的毒性。而自噬相关基因的缺失以及细胞自噬被抑制则能够促进蛋白聚集体的形成及其对神经细胞的毒性。这些研究表明，细胞自噬可能成为一个有效的靶点，用于神经退行性疾病的药物研发。通过细胞自噬途径促进胞内大分子组分的特异性降解，将有望为神经退行性疾病的治疗提供新的思路。然而，目前利用细胞自噬途径靶向调控蛋白水平的研究还比较少。

微管系统是神经细胞的骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。正常脑组织中Tau蛋白的生物学功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。Tau蛋白为磷酸化修饰蛋白，正常成熟脑组织中Tau蛋白分子含2～3个磷酸化修饰基团。而阿尔茨海默症(老年痴呆症)患者脑组织中的Tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9个磷酸化修饰基团，并丧失正常的生物学功能。阿尔茨海默症患者脑组织中的Tau蛋白总量多于正常人，且正常Tau蛋白减少，异常过度磷酸化的Tau蛋白大量增加。这些异常磷酸化的Tau蛋白在神经细胞中聚集，对神经细胞产生毒性作用而导致神经元功能退化。由于磷酸化的Tau蛋白易形成聚集体，这也导致泛素-蛋白酶体途径很难高效降解Tau蛋白聚集体。因此，开发新的靶向降解策略降解胞内功能异常的Tau蛋白将是治疗阿尔兹海默症最为直接有效的手段之一。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用。

本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：

一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子，所述嵌合分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或7所示。

一种核酸分子，编码上述基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子。

进一步，所述核酸分子核苷酸序列为SEQ ID NO:16或18所示。

一种表达载体，包含上述的核酸分子。

一种前述的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子在降解Tau蛋白中的应用。

一种前述的核酸分子在降解Tau蛋白中的应用。

一种前述的表达载体在降解Tau蛋白中的应用。

p62也称为SQSTM1蛋白，是自噬底物及介导选择性自噬的受体，在肿瘤细胞中发挥自噬与凋亡的作用，其包含4个结构域，分别是PB1，TB，LIR(LC3 interacting region，LC3相互作用序列)，UBA。其中LIR结构域负责与自噬小体膜蛋白Atg8/LC3结合。

本发明通过基因克隆技术构建基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子。该嵌合分子由Tau蛋白配体TTP(Tau targeting peptide)与自噬小体膜蛋白LC3相互作用序列LIR共同组成，本发明的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的原理如图1所示。

本发明提出的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子的研究包括如下过程：(1)EGFP-Tau及其相应突变体EGFP-TauP301L表达载体的构建：以Xho I和EcoR I为酶切位点，通过基因克隆技术将Tau和TauP301L蛋白的核酸序列分别连接到pEGFP-C1载体；(2)介导Tau降解的嵌合分子(TTP-LIR)表达载体的构建：通过基因克隆技术，分别以Xho I和HindIII为酶切位点连接Tau蛋白配体的核酸序列，以EcoR I和BamH I为酶切位点连接LIR结构的核酸序列到pHA-C1载体；(3)介导Tau降解的嵌合分子与EGFP-Tau或EGFP-TauP301L在细胞中的共表达：将EGFP-Tau及其相应突变体EGFP-TauP301L的表达载体分别与不同的介导Tau降解的嵌合分子(TTP-LIR)表达载体通过转染试剂共转染HEK293细胞；(4)Westernblot检测目标蛋白EGFP-Tau或EGFP-TauP301L的降解水平：利用EGFP抗体，通过Westernblot技术对靶蛋白EGFP-Tau或EGFP-TauP301L的蛋白水平进行检测，来评价TTP-LIR嵌合分子介导Tau蛋白降解的效率。

本发明的有益效果是：本发明开发新型靶向嵌合分子，嵌合分子在细胞中表达时，能够通过Tau蛋白配体识别Tau蛋白，利用LIR结合在细胞自噬相关蛋白LC3，从而将Tau蛋白招募进入细胞自噬小体，促进其通过细胞自噬途径降解。本发明提供了一种新的蛋白靶向降解技术，有望将这种新技术应用到不同的目标蛋白上，从而克服当前基于泛素-蛋白酶体途径的蛋白靶向降解技术不能高效降解胞内大分子组分的缺陷。

附图说明

图1是本发明的基于自噬机制介导Tau蛋白降解原理图。

图2是Western blot检测EGFP-Tau蛋白降解效率结果，其中，A为EGFP-Tau的降解效率；B为图A的定量分析及其显著性比较(与对照组相比较，**代表P值小于0.01)。

图3是Western blot检测EGFP-TauP301L蛋白降解效率结果，其中，A为EGFP-TauP301L的降解效率；B为图A的定量分析及其显著性比较(与对照组相比较，**代表P值小于0.01,*代表P值小于0.05)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明所用主要试剂来源如下：

质粒pET28a-Tau：清华大学陈永湘博士赠送，本实验室进行保存

质粒pEGFP-C1、pHA-C1：美国Addgene质粒保藏中心

转染试剂：Roche,X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent

PCR扩增预混液：2×PCR Bestaq^TM MasterMix with dye(G464-dye)，爱必梦(加拿大abm有限公司)

所有限制性核酸内切酶和T4连接酶均购自Takara生物公司

质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、胶回收试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司

ECL显影液：上海碧云天生物技术有限公司，货号P0018FS

Cocktail蛋白酶抑制剂：MedChemExpress(MCE)公司

0.45μm PVDF膜:GE公司

本发明实施例中的PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

实施例1

一、EGFP-Tau和EGFP-TauP301L融合蛋白(靶蛋白)表达载体的构建

(1)Tau蛋白全长核酸片段的PCR扩增，提取质粒pET28a-Tau(含有野生型Tau蛋白的全序列)的DNA作为扩增模板：PCR反应体系为：2×PCR Bestaq^TM MasterMix with dye12.5μl，上游引物Tau-F 1μl，下游引物Tau-R 1μl，DNA模板1μl，加9.5μl ddH₂O至终体积为25μl。引物序列参考表1。野生型Tau蛋白的全长核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

表1.Tau蛋白全长核酸序列PCR扩增引物

PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，反应32个循环；72℃延伸10min，反应终止后PCR产物保存于4℃。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测片段大小后，进行胶回收，获取Tau蛋白全长核酸片段。

(2)酶切、连接及质粒验证：将获得的Tau蛋白全长核酸片段与pEGFP-C1载体质粒同时用限制性核酸内切酶Xho I和EcoR I进行双酶切，酶切后的DNA片段与载体片段经过胶回收试剂盒纯化后，用T4连接酶在16℃下过夜连接；连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于LB固体平板上(Kan终浓度为50ug/ml)，37℃过夜培养；挑取单克隆进行菌落PCR验证；提取质粒并送往上海生工生物工程股份有限公司测序，测序正确即表明pEGFP-Tau表达载体构建成功。

(3)EGFP-TauP301L突变质粒的构建：

TauP301L核酸序列的获取：通过两轮PCR反应，对野生型Tau蛋白P301氨基酸位点处的碱基进行定点突变，获得TauP301L全长核酸序列。

Tau蛋白氨基酸序列全长为441个氨基酸，第一轮PCR反应以M-F(5'-GGCTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCTGGGAGGCGGCAGTGTGCAAAT-3'，SEQ ID NO:4)为上游引物，以Tau-R(SEQID NO:3)为下游引物，以野生型Tau蛋白的全长核酸序列(SEQ ID NO:1)为模板，扩增Tau291-441片段，其中上游引物M-F的核酸序列已将301位点处的P突变为L。PCR反应体系为：2×PCR Bestaq^TM MasterMix with dye 12.5μl，上游引物M-F 1μl，下游引物Tau-R 1μl，DNA模板1μl，加9.5μl ddH₂O至终体积为25μl。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，反应32个循环；72℃延伸10min，反应终止后PCR产物保存于4℃。

第二轮PCR反应以Tau-F(SEQ ID NO:2)为上游引物，直接以第一轮PCR反应产物为下游引物，以野生型Tau蛋白的全长核酸序列(SEQ ID NO:1)为模板进行PCR反应。PCR反应体系为：2×PCR Bestaq^TM MasterMix with dye 12.5μl，上游引物Tau-F 1μl，第一轮PCR产物1μl，模板0.5μl，加10μl ddH₂O至终体积为25μl，此步骤中应减少野生型Tau蛋白核酸序列模板的含量。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，反应32个循环；72℃延伸10min，反应终止后PCR产物保存于4℃。琼脂糖凝胶电泳确定片段大小无误后，PCR产物(即是TauP301L核酸片段)即可用于后续酶切连接实验。

以pEGFP-C1为载体框架，TauP301L核酸片段与载体的酶切、连接、转化及单克隆菌落PCR步骤与pEGFP-Tau的构建过程相同。质粒经过上海生工生物工程股份有限公司测序验证正确后，即pEGFP-TauP301L表达载体构建成功。

二、TTP-LIR嵌合分子表达载体的构建(TTP:Tau targeting peptide)

以pHA-C1为载体框架，通过基因克隆技术在其C末端依次以Xho I和Hind III为酶切位点连接Tau蛋白配体的核酸序列，以EcoR I和BamH I为酶切位点连接与自噬小体膜蛋白LC3相互作用的LIR结构的核酸序列，构建介导Tau蛋白降解的TTP-LIR嵌合分子表达载体(分别为Y185，Y186，Y208)。设计的用于靶向降解Tau蛋白的嵌合分子由Tau蛋白配体、Linker及LIR组成，嵌合分子表达载体中对应的TTP-LIR嵌合分子的氨基酸序列(SEQ IDNO:5～7)如表2所示，其中单下划线部分是Linker序列，双下划线部分是LIR序列。

表2.TTP-LIR嵌合分子氨基酸序列

具体构建过程如下：

(1)pHA-TTP质粒的构建

①根据Tau蛋白配体氨基酸序列相应的核酸序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成单链核酸片段，通过在其序列的两端引入Xho I和Hind III酶切位点的粘性末端，使其在体外退火形成的双链DNA片段可以直接与线性化的载体片段进行连接。形成的双链DNA片段包含TTP核酸序列及Linker(GSGS)的核酸序列，单链核酸片段的序列设计如表3所示：

表3.构建pHA-TTP表达载体的单链核酸序列

②DNA的退火：以185-F/R配对的核酸序列体外退火合成“YQQYQDATADEQGGSGS”氨基酸序列的双链DNA片段；以186-F/R配对的核酸序列体外退火合成“KDYEEVGVDSVEGSGS”氨基酸序列的双链DNA片段；以208-F/R配对的核酸序列体外退火合成“ATVIVITLVMLKGSGS”氨基酸序列的双链DNA片段。

退火步骤：500μl离心管中加入20μl 50μM的正向核酸片段185-F，20μl 50μM的反向核酸片段185-R，10μl 10×DNA annealing buffer(100mM TRIS,500mM NaCl,10mMEDTA,pH7.5)，加50μl Nuclease free H₂O至终体积为100μl。95℃金属浴加热10min，室温冷却后，进行核酸浓度测定，用于后续连接实验。186-F/R及208-F/R核酸序列的体外退火与185-F/R的退火步骤相同。

③Tau蛋白配体核酸片段的连接：pHA-C1经过限制性核酸内切酶Xho I和Hind III双酶切，回收线性化的载体片段并与步骤②中退火合成的Tau蛋白配体的双链DNA片段用T4连接酶于16℃下过夜连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于LB固体平板上(Kan终浓度为50ug/ml)，37℃过夜培养；单克隆菌落PCR验证后提取质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序验证，测序结果正确则表明Tau蛋白配体的核酸序列已连入pHA-C1载体，即pHA-TTP质粒构建成功。

(2)pHA-TTP-LIR载体的构建

①根据LIR氨基酸序列相应的核酸序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成单链核酸片段。通过在其序列的两端引入EcoR I和BamH I酶切位点的粘性末端，使其在体外退火形成的双链DNA片段可以直接与线性化的载体片段进行连接。单链核酸片段的序列设计如表4所示。

表4.LIR结构的单链核酸序列

②DNA的退火：以LIR-F/R配对的核酸序列在体外退火合成“SGGDDDWTHLSSKEV”氨基酸序列的双链DNA片段。

退火步骤：500μl离心管中加入20μl 50μM的正向核酸片段LIR-F，20μl 50μM的反向核酸片段LIR-R，10μl 10×DNA annealing buffer(100mM TRIS,500mM NaCl,10mMEDTA,pH7.5)，加50μl Nuclease free H₂O至终体积为100μl。95℃金属浴加热10min，室温冷却后，进行核酸浓度测定，用于后续连接实验。

③LIR核酸片段的连接：将(1)中构建成功的pHA-TTP载体经过限制性核酸内切酶EcoR I和BamH I双酶切，回收线性化的载体片段并与步骤②中退火合成的LIR结构的双链DNA片段用T4连接酶于16℃下过夜连接。连接产物转化DH5α大肠杆菌，涂布于LB固体平板上(Kan终浓度为50ug/ml)，37℃过夜培养；单克隆菌落PCR验证后提取质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序验证，测序结果正确则表示TTP-LIR嵌合分子表达载体pHA-TTP-LIR构建成功。3个TTP-LIR嵌合分子的核酸表达序列分别为SEQ ID NO:16(对应Y185)，SEQ IDNO:17(对应Y186)，SEQ ID NO:18(对应Y208)。

三、细胞培养与细胞转染

细胞培养：

本发明所采用细胞为人源HEK293细胞系，所用培养基为DMEM高糖培养基(Gibco,货号：C11995500BT)，含有10％胎牛血清(NTC特级，货号：SFBE)、5％青链霉素双抗(Gibco，货号：15140-122)。培养条件为5％CO₂，37℃恒温细胞培养箱。

细胞共转染：

将pEGFP-Tau表达载体分别与不同的TTP-LIR嵌合分子表达载体进行共转染：提前将细胞种植在6孔板中培养12h使其贴壁完全；各取1ug的DNA用100μl Opti-MEM培养基稀释；加入2μl的转染试剂到DNA稀释液中，室温静置20min以形成转染复合物；将转染复合物逐滴加入到含完全培养基的贴壁细胞培养皿中，并于24h后更换新鲜培养基。

pEGFP-TauP301L的细胞转染步骤与pEGFP-Tau的细胞转染步骤相同。

四、靶蛋白降解水平的检测

以溶酶体抑制剂氯喹(氯喹二磷酸盐，Chloroquine Diphosphate，缩写为CQ)处理组为对照。在转染后36h后，转染细胞用20μM溶酶体抑制剂CQ处理12h，提取蛋白通过Western blot检测靶蛋白水平的变化。具体实验步骤如下：

(1)弃去细胞培养基，六孔板每孔用2ml预冷的PBS洗两遍，并按照每孔120μl的体积加入RIPA裂解液(含终浓度为1mM的Cocktail蛋白酶抑制剂和PMSF)，冰上裂解30min；

(2)刮取细胞，转移细胞悬液至1.5ml离心管，冰上继续裂解30min，期间每隔10min涡旋振荡30s使其裂解充分，4℃、15000rpm离心20min。转移上清液至1.5ml离心管，样品置于-80℃备用，或直接用于蛋白浓度的测定。蛋白浓度测定采用BCA法，通过酶标仪测定其在562nm波长下的OD值，计算出蛋白样品的浓度；

(3)Western blot检测Tau蛋白水平

SDS-PAGE：将各组蛋白样品用RIPA裂解液稀释至相同浓度，并按照4：1的体积与5×SDS loading buffer混匀，98℃变性5min后，按照每组蛋白样品50ug的上样量，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％；60V恒压待蛋白样品跑至浓缩胶和分离胶界面时将电压调至120V，待loading buffer跑至凝胶底部即终止电泳。

转膜，封闭及一抗孵育：电泳结束后，取下凝胶并按照Bio-Rad湿转装置组装“三明治”结构，转膜采用0.45μm的PVDF膜，并且转膜前已用甲醇活化，转膜条件为250mA,90min。转膜结束后可在膜上看见预染蛋白Marker，将膜取出用TBST漂洗一次，置于5％的脱脂牛奶(TBST配制)中室温封闭1h。弃去封闭液，TBST漂洗2次，每次5min，将PVDF膜置于一抗稀释液中4℃孵育过夜，抗体与一抗稀释液按1：1000的比例稀释。一抗：GFP antibody(Mouse)，货号：sc-9996，购于Santa Cruze Biotechnology；Actin antibody(Mouse)，货号：AF0003，购于碧云天生物技术公司；LC3A/B antibody(Rabbit)，货号：12741，购于Cell SignalingTechnology。

二抗孵育，显影：PVDF膜用TBST漂洗三次，每次10min。HRP标记的二抗按照1：3000的比例用TBST稀释，将PVDF膜置于二抗稀释液中室温孵育1h。反应结束后，PVDF膜用TBST漂洗三次，每次10min。按照A液和B液1：1的比例配制ECL显影液，将显影液均匀覆盖在PVDF膜表面，即可置于Bio-rad化学发光成像系统显影检测。二抗：HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)货号：A0216，购于碧云天生物技术公司；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)，货号：A0208，购于碧云天生物技术公司。

结果显示，在选择的三个靶向Tau蛋白的嵌合分子中，Y185、Y208质粒在与pEGFP-Tau共转染HEK293细胞之后，EGFP-Tau的蛋白水平显著降低，并且在溶酶体抑制剂氯喹(CQ)的作用下得到恢复(结果如图2A和2B所示)。结果表明，由Tau蛋白配体与LIR融合表达形成的嵌合分子，能够介导EGFP-Tau通过自噬途径降解，即通过将LIR锚定到目标底物Tau蛋白的表面，并通过LIR结合LC3蛋白，招募Tau蛋白进入细胞自噬小体，通过自噬途径高效降解。

在阿尔兹海默症的部分患者中，通常伴随着Tau蛋白301位P的突变。同野生型Tau蛋白相比，突变型的TauP301L蛋白更容易被磷酸化，导致其从微管结构中解离出来，从而在胞质中聚集。因此，Tau蛋白P301L的突变是导致阿尔兹海默症发生的原因之一，TauP301L也常常作为病理性的模型Tau蛋白用于阿尔兹海默症致病机理的体外研究。实验结果显示，Y185、Y208质粒在与pEGFP-TauP301L共转染HEK293细胞之后，EGFP-TauP301L的蛋白水平也有了显著的降低(结果如图3A和3B所示)。结果表明本发明所提出的TTP-LIR嵌合分子对于胞内易聚集而导致细胞毒性的TauP301L蛋白也有明显的降解效果，本发明提出的这种Tau蛋白降解思路可作为一种策略用于阿尔兹海默症疾病治疗的药物研发。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子及其应用

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctgagc cccgccagga gttcgaagtg atggaagatc acgctgggac gtacgggttg 60

ggggacagga aagatcaggg gggctacacc atgcaccaag accaagaggg tgacacggac 120

gctggcctga aagaatctcc cctgcagacc cccactgagg acggatctga ggaaccgggc 180

tctgaaacct ctgatgctaa gagcactcca acagcggaag atgtgacagc acccttagtg 240

gatgagggag ctcccggcaa gcaggctgcc gcgcagcccc acacggagat cccagaagga 300

accacagctg aagaagcagg cattggagac acccccagcc tggaagacga agctgctggt 360

cacgtgaccc aagctcgcat ggtcagtaaa agcaaagacg ggactggaag cgatgacaaa 420

aaagccaagg gggctgatgg taaaacgaag atcgccacac cgcggggagc agcccctcca 480

ggccagaagg gccaggccaa cgccaccagg attccagcaa aaaccccgcc cgctccaaag 540

acaccaccca gctctggtga acctccaaaa tcaggggatc gcagcggcta cagcagcccc 600

ggctccccag gcactcccgg cagccgctcc cgcaccccgt cccttccaac cccacccacc 660

cgggagccca agaaggtggc agtggtccgt actccaccca agtcgccgtc ttccgccaag 720

agccgcctgc agacagcccc cgtgcccatg ccagacctga agaatgtcaa gtccaagatc 780

ggctccactg agaacctgaa gcaccagccg ggaggcggga aggtgcagat aattaataag 840

aagctggatc ttagcaacgt ccagtccaag tgtggctcaa aggataatat caaacacgtc 900

ccgggaggcg gcagtgtgca aatagtctac aaaccagttg acctgagcaa ggtgacctcc 960

aagtgtggct cattaggcaa catccatcat aaaccaggag gtggccaggt ggaagtaaaa 1020

tctgagaagc ttgacttcaa ggacagagtc cagtcgaaga ttgggtccct ggacaatatc 1080

acccacgtcc ctggcggagg aaataaaaag attgaaaccc acaagctgac cttccgcgag 1140

aacgccaaag ccaagacaga ccacggggcg gagatcgtgt acaagtcgcc agtggtgtct 1200

ggggacacgt ctccacggca tctcagcaat gtctcctcca ccggcagcat cgacatggta 1260

gactcgcccc agctcgccac gctagctgac gaggtgtctg cctccctggc caagcagggt 1320

ttgtga 1326

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagc tatggctgag ccccgccagg a 31

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccggaattct cacaaaccct gcttggccag gg 32

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggctcaaagg ataatatcaa acacgtcctg ggaggcggca gtgtgcaaat 50

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Tyr Gln Gln Tyr Gln Asp Ala Thr Ala Asp Glu Gln Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val

20 25 30

<210> 6

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Lys Asp Tyr Glu Glu Val Gly Val Asp Ser Val Glu Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val

20 25 30

<210> 7

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val

20 25 30

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcgagcttac cagcagtacc aggacgccac cgccgacgag cagggcggca gcggcagcca 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcttggctg ccgctgccgc cctgctcgtc ggcggtggcg tcctggtact gctggtaagc 60

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcgagctaag gactacgagg aggtgggcgt ggacagcgtg gagggcagcg gcagcca 57

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcttggctg ccgctgccct ccacgctgtc cacgcccacc tcctcgtagt ccttagc 57

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgagctgcg acagtgatcg tcatcacctt ggtgatgctg aagggcagcg gcagcca 57

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agcttggctg ccgctgccct tcagcatcac caaggtgatg acgatcactg tcgcagc 57

<210> 14

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aattcttcag gaggagatga tgactggacc catctgtctt caaaagaagt gtgag 55

<210> 15

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gatcctcaca cttcttttga agacagatgg gtccagtcat catctcctcc tgaag 55

<210> 16

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

taccagcagt accaggacgc caccgccgac gagcagggcg gcagcggcag ccaagcttcg 60

aattcttcag gaggagatga tgactggacc catctgtctt caaaagaagt gtga 114

<210> 17

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaggactacg aggaggtggg cgtggacagc gtggagggca gcggcagcca agcttcgaat 60

tcttcaggag gagatgatga ctggacccat ctgtcttcaa aagaagtgtg a 111

<210> 18

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcgacagtga tcgtcatcac cttggtgatg ctgaagggca gcggcagcca agcttcgaat 60

tcttcaggag gagatgatga ctggacccat ctgtcttcaa aagaagtgtg a 111

Claims

1.一种基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子，其特征在于：所述嵌合分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或7所示。

2.一种核酸分子，其特征在于：编码权利要求1所述基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO:16或18所示。

4.一种表达载体，其特征在于：包含权利要求2或3所述的核酸分子。

5.一种如权利要求1所述的基于自噬机制介导Tau蛋白降解的嵌合分子在降解Tau蛋白中的应用。

6.一种如权利要求2或3所述的核酸分子在降解Tau蛋白中的应用。

7.一种如权利要求4所述的表达载体在降解Tau蛋白中的应用。