JPH06505561A - レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈＧＲＢタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈ ＧＲＢタンパク質 及川９宣用 及用旦立野 分子及び細胞生物学の分野におけるこの発明は、レセプターチロシンキナーゼの カルボキシ末端ドメインに結合しかつ主要シグナル伝達経路内でこの酵素のため の基質として役立つことのできる細胞タンパク質を識別するための、直接発現ク ローニングに基づく新しい方法に関する。本発明は同様に、この方法を用いて識 別された新しいタンパク質にも関する。

！東技皿９韮朋 さまざまなポリペプチド性成長因子及びホルモンが、チロシンキナーゼ酵素活性 をもつ細胞表面レセプターと相互作用することに劫μＬ謝：　７７０９−７７１ ２　（１９９０年）を参照）。これらのリガンドとそのレセプターの相互作用は 、レセプターの二量体化及びタンパク質チロシンキナーゼ活性の刺激を含む一連 の事象を誘発する。上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）ならびに血小板由来成 長因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）といったようなチロシンキナーゼ活性をもつそ の他のレセプターについては、キナーゼ活性化及びレセプター自己リン酸化反応 の結果として、レセプターはいくつかの細胞質基質と物理的に会合することにな る（Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ工、前出）ＥＧＦＲキナーゼのための２つの基 質が現在最終的に生体細胞内で同定されている。すなわち、（ａ）ホスファチジ ルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ−ガンマ（ＰＬＣ−ガンマ）及び（ｂ） ｒａｓタンパク質のエフェクターループ内にある可能性のあるタンパク質である ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）である（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、　Ｂ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５７：　１１０１−１１０７　（１９８９年ｂ）； Ｍｅｉｓｅｎｈｅｌｄｅｒ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５７：　１１ ０９−１１２２　（１９８９年）；Ｍｏ１ｌｏｙ、　Ｃ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ　３４２：　７１１−７１４　（１９８９年）；　Ｗｏｈｌ。

Ｍ、１．　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：　３９４ ４−３９４８　（１９９０年）；Ｅｌｌｉｓ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３４３：　３７７−３８１　（１９９０年）；にａｐｌａｎ。

Ｄ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６１．１２１−１３３　（１９９０年）） 。

同様に、活性化されたＰＤＧＦＲは、チロシンをリン酸化すること、又ｐ　ｐ　 ６０　”’といった細胞チロシンキナーゼ、ＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰと会合した 状態になることが示された。（Ｇｏ　ｕ　ｌ　ｄ　＋に、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８−：　３３４５−３３５６　（１ ９８８年）；Ｍｅｉｓｅｎｈｅｌｄｅｒ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　 ５７：　１１０９−１１２２　（１９８９年）；Ｍｏ１ｌｏｙ、Ｃ０Ｊ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４２：　１ｌｌ−７１４（１９８９年）；　Ｋａ ｐｌａｎ。

Ｄ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６１：　１２１−１３３　（１９９０年） ；　Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ、　Ａ、　ｅｔａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７： 　１５７８−１５８１　（１９９０年）；　Ｋｒｙｐｔａ、　Ｒ，Ｍ、　ｅｔと 、ＥＧＦＲとの会合に関与する正確な部位は完全に解明されているわけではない が、最近の研究は、この会合に寄与するレセプターと基質の両方の上の領域を識 別し始めてきた。

Ｓ　Ｈ２（ｓｒｃ　ｊｏｍｏｌｏｇｙ　２）　ドメインが、活性化された成長因 子レセプターといくつかのチロシンキナーゼ基質との会合に関与する領域である と思われる。ＳＨ２ドメインは、ｐｐ６ｏ″ｒｅ、ＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰ及び ｖ−ｃｒｋといった細胞質性非レセプターチロシンキナーゼの中に発見された、 保存された約１００個のアミノ酸の配列である（Ｍａｙｅｒ、　Ｂ、Ｊ、　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２：　２７２−２７５　（１９８８年）；　Ｐ ａｗｓｏｎ、　Ｔ、、　四並駐匹３：　４９１−４９５　（１９８８年））。異 なる触媒ドメインを有するものの、これらの分子は全て、保存されたＳＨ２及び ＳＨ３（≦ｒｅ　！ｌ！ｏｍｏｌｏｇｙ　３）　ドメイン及びチロシンキナーゼ 活性をもつレセプターと会合する能力を共有する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｄ、　 ｅｔ匪、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５０：　９７９−９８２　（１９９０年））。

チロシンキナーゼ活性化及びレセプター自己リン酸化反応は、成長因子レセプタ ーとＳＨ２ドメイン含有タンパク質との間の会合の必須条件である（Ｍａｒｇｏ ｌｉｓ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０： を全て含むＥＧＦＲのカルボキシ末端（Ｃ−末端）フラグメントは、特異的にＧ ＡＰ及びＰＬＣ−ガンマのＳＨ２ドメインに結合する（以下参照）。従って、こ れらの基質タンパク質のＳＨ２ドメインとＥＧＦＲのチロシンリン酸化されたＣ 末端テールの間に、主要な会合部位が存在する。

活性化されたチロシンキナーゼレセプターに対する結合がいくつかの基質タンパ ク質の間で保存されるということを認識した上で、これらの特性を共有するさら なる基質を同定するための努力が払われた。活性化されたレセプターに対して結 合する標的タンパク質は、成長因子レセプターと共に免疫沈降するか又は固定化 マトリックスに付着されたレセプターに結合するタンパク質の分析によって同定 された（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５８：　 ６４９−６５７　（１９８９年）；　Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ、　Ａ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　ＥＭＢ旦トリエ旦：　３２７９−３２８６　（１９９０年））。これら のタンパク質のいくつかのアイデンティティは既知であるものの、これらのアプ ローチを利用して検出されたその他のいくつかのタンパク質は、完全に特徴づけ されていない。さらに、活性化されたレセプターと相互作用する希な標的分子が 、これらの技術の限られた感度のために検出されなかったということも考えられ る。実際の結合化学量論は低いものであってよく、タンパク質を可溶化するのに 必要な界面活性剤溶液は結合を粉砕しつる。

これらのタンパク質を単離しクローニングするための従来のアプローチは、微細 配列分析及びそれに続〈従来のｃＤＮＡクローニングのために充分な量のタンパ ク質を精製するべ（、大量の組織又は株細胞系統の使用を必要とする骨の折れる 方法であった。従って、これらのタンパク質のクローニング及びそれに続（単離 及び同定のための新しいアプローチに対する必要性が当該技術分野において認識 されている。

Ｌ町Ω！豹 細胞の成長及び発がんの調節を理解しそれを制御できるようになろうという我々 の研究努力における最も切迫した必要性の１つは、チロシンキナーゼのための標 的タンパク質を識別する能力をもつことである。

本発明者は、チロシンキナーゼタイプの細胞レセプターに対する標的タンパク質 の迅速なりローニングのための新たな発現／クローニングシステムを開発してき た。このクローニング方法は、成る種のクラスの基質がもつ、上皮成長因子（Ｅ ＧＦＲ）のチロシンリン酸化カルボキシ末端（Ｃ末端）に特異的に結合する能力 に基づいている（以下の例ＶＩ；　Ｍａｒｇｏｌｉｓ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、 　ＥＭＢＯＪ、　旦：　４３７５−４３８０（１９９０年）参照）。

本発明者が考案したアプローチは、微小配列決定分析のために潜在標的タンパク 質を精製する、骨が折れコストのかかる作業を回避することを含め、従来のクロ ーニング方法に比べて重要な利点を有する。その上、本発明のアプローチは、従 来の他の技術を用いては活性化レセプターとのその会合を検出することができな かったような希な標的分子を識別するための方法を提供する。さらに、この方法 によると、ＤＮＡレベルでは相同性が低いものでしかないものの、チロシンキナ ーゼ活性をもつ活性化されたレセプターに対するその結合特性において類似のも のであるような、構造的又は機能的に関連したタンパク質の識別が可能となる。

後者の能力は、関連する遺伝子を識別するのに使用された従来のスクリーニング 方法が、典型的にストリンジエンシーの低い核酸ハイブリダイゼーションに基づ いていることから、重要なものである。実際、このようなハイブリダイゼーショ ンに基づくスクリーニングは、ＤＮＡレベルでの類似性の欠如のために、本発明 の新しいタンパク質すなわちＧＲＢ−１とＧＲＢ−２をクローニングし同定する 上で成功しなかったであろうと思われる。

本発明者のアプローチの根源は、以前にＤＮＡ結合タンパク質及び止旦旦結合タ ンパク質をクローニングするのに利用されてきた方法にある（Ｓｉｎｇｈ、　Ｈ ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５２：　４１５−４２３　（１９８８年）：Ｍａ ｃＧｒｅｇｏｒ、　Ｐ、Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　卯並り匹’ｇ：　４５１−４５ ８　（１９９０年））。

本発明の方法は、チロシン残基がリン酸化されるＥＧＦＲタンパク質のＣ末端が 基質を結合できるという発明人の考え及び観察を利用している（以下参照）。チ ロシンが３２Ｐでリン酸化されている標識プローブを作製することによって、本 発明者は、ヒトのさまざまな組織からのラムダｇｔ　ｌ　１ｃＤＮＡ発現ライブ ラリーをスクリーニングし、ＥＧＦＲのリン酸化されたＣ末端と会合した状態と なる数多（のタンパク質を同定した。本発明者は、この要領で発見したタンパク 質をｒ　Ｇ　ＲＢ　Ｊ　（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐ ｏｕｎｄの略）と名付けた。本発明のクローニング方法は、ｒ　ＣＯＲＴ　Ｊ　 （Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｔａｒｇｅｔｓ（レセプター標的ク ローニング）の略）と名付けた。

本発明の方法は、チロシンキナーゼに対する標的分子の識別及びクローニングの ための一般性と迅速性の両方を有する新しいアプローチとして提案されている。

従って本発明は、レセプターチロシンキナーゼの標的であり、レセプターチロシ ンキナーゼのチロシンリン酸化されたポリペプチド部分に結合することができる タンパク質の発現を、発現ベクターを宿す細胞によって検出するための方法にお いて、（ａ）細胞、その抽出物、そのライセード（溶解物）又はその上清を、固 相担体と接触させて、担体に対するタンパク質の結合をひき起こすこと； （ｂ）チロシン−リン酸化されたポリペプチドと共に担体に結合したタンパク質 をインキュベートし、ポリペプチドが担体結合タンパク質に結合できるようにす ること； （ｃ）担体に結合していない物質を除去すること；及び（ｄ）担体に結合したチ ロシンリン酸化ポリペプチドの存在を検出するか又はその量を測定すること、 を特徴とし、かくしてそのタンパク質の発現を検出する方法に関する。

好ましい一実施態様においては、レセプターは、上皮成長因子レセプター、血小 板由来成長因子レセプター又は線維芽細胞成長因子レセプターである。

この方法は、好ましくは、原核細胞、最も好ましくはＥ、　ｃｏｌｉ（大腸菌） といった細菌細胞を用いて行なわれる。細胞は同様に、酵母又は哨乳動物細胞と いったような真核細胞であってもよい。

好ましくは、リン酸化されたポリペプチドは、例えば３２ｐのような放射線標識 を用いて、検出可能な形に標識付けされる。

固相担体は、好ましくはニトロセルロース膜であり、ラムダｇｔｌｌライブラリ ーをスクリーニングするときには溶菌された細菌細胞から放出されたタンパク質 が、この膜にトランスファーされる。

本発明は同様に、レセプターチロシンキナーゼ分子のチロシンリン酸化されたポ リペプチド部分に結合できるタンパク質をコードする遺伝子を、ヒト染色体にマ ツピングするための方法において、（ａ）ヒト遺伝子発現ライブラリーで細菌細 胞を感染させること； （ｂ）請求項１に記載の方法を用いて、タンパク質を発現するクローンを検出す ること； （ｃ）クローンのＤＮＡを配列決定すること；及び（ｄ）ヒト染色体に対しその 配列をマツピングすること、を特徴とする方法をも提供する。

本発明は同様に、レセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化ポリペプチド 部分に結合することのできるタンパク質の発現の検出に有用なポリペプチドブロ ーブにも関する。このプローブは、レセプター分子のチロシンリン酸化部分から 誘導されたアミノ酸配列又はその機能的誘導体を含み、チロシンキナーゼドメイ ンが欠如しており、この配列は少なくとも１つのホスホチロシン残基、好ましく は４個又は５個のホスホチロシンを含んでいなければならない。プローブは、好 ましくは３２ｐで検出可能な形に標識されるべきである。

好ましいプローブは約２５〜２５０個のアミノ酸残基を有する。

本発明のプローブは、上皮成長因子レセプター、血小板由来成長因子レセプター 及び線維芽細胞成長因子レセプターを含むレセプターチロシンキナーゼに対する 標的タンパク質を検出するために有用である。

本発明は同様に、上述のプローブを調製するための方法において、 （ａ）チロシンキナーゼによってリン酸化されつる少なくとも１つのチロシン残 基を含むチロシンリン酸化ドメインとチロシンキナーゼドメインを両方有する、 レセプター又は遺伝子工学的に処理されたレセプター様の誘導体を実質的に純粋 な形で提供すること、 （ｂ）チロシン残基のリン酸化を可能にする条件下で〔ガンマ−３ｆｆｉｐｌア デノシン三リン酸と共にレセプター又はレセプター様の誘導体をインキュベート し、チロシン残基のリン酸化をひき起こすこと、 を特徴とし、かくしてプローブを産生ずる方法をも含んでいる。好ましい一実施 態様において、この方法は（Ｃ）チロシンキナーゼドメインとチロシン−リン酸 化ドメインの間で分子を切断することのできる作用物質で、リン酸化レセプター 分子をさらに処理する、 工程を含んでいる。

好ましい切断作用物質は、臭化シアノゲンである。

また別の実施態様においては、上述の方法には、作用物質がその切断部位で切断 できる酵素であり、チロシンリン酸化ドメインをコードするＤＮＡ配列に連結し ている選択的酵素的切断部位をコードするＤＮＡ配列に連結しているチロシンキ ナーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子によってコードされたポリペプ チドである、遺伝子工学的に処理されたレセプター様の誘導体が関与する。好ま しい酵素は、Ｘａ因子とトロンビンである。

同様に提供されているのは、レセプターチロシンキナーゼ分子のチロシンリン酸 化ポリペプチド部分に結合することのできるタンパク質を、複雑な混合物から精 製するための方法において、（ａ）プローブが結合されている固相担体と複雑な 混合物とを接触させ、タンパク質のプローブへの結合を可能にすること、（ｂ） 担体に結合していない物質を除去すること、及び（ｃ）担体から結合タンパク質 を溶出することを特徴とし、かくしてタンパク質を精製する方法である。

本発明は同様に、図４に示されているアミノ酸配列をもつタンパク質ＧＲＢ−１ にも関する。本発明は、図１７に示されているアミノ酸配列を含むタンパク質、 ＧＲＢ−２を含む。

本発明は同様に、ＧＲＢ−１タンパク質をコードするＤＮＡ分子、及びＧＲＢ− ２タンパク質をコードするＤＮＡ分子にも関する。これらのタンパク質の機能的 誘導体をコードするＤＮＡ分子も本願発明に含まれる。ＤＮＡ分子が天然のもの である場合、それは、それが生来会合するヌクレオチド配列を実質的に有さない 。

本発明のＤＮＡ分子はプラスミドといった発現運搬体であってよい。

同様に提供されるのは、上述のＤＮＡ分子の各々で形質転換された宿主である。

本発明は同様に、各々が天然に会合しているその他のタンパク質を実質的に含ま ないＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質、又はその機能的誘導体を調製する方 法において、（ａ）培養条件下でタンパク質を発現することのできる宿主細胞を 培養すること、 （ｂ）タンパク質又は機能的誘導体を発現させること、及び（Ｃ）培養からタン パク質又は機能的誘導体を回収すること、を特徴とする方法をも含んでいる。

区画Ω固単皇説朋 図１は、ニトロセルロースフィルター上に固定化されたＧＡＰ−５Ｈ２とＥＧＦ Ｒのカルボキシ末端が相互作用するのを示すフィルタープロットパターンである 。細菌により発現されたｔｒｐＥ／ＧＡＰ−３Ｈ２融合タンパク質又は対照とし てのｔｒｐＥを、さまざまな濃度でニトロセルロースフィルター上にスポットし た。フィルターを［１２Ｐ］　−標識されたＥＧＦＲのＣ−末端ドメインを用い て一晩ハイブリダイゼーションに付した。オートラジオグラフィは２時間であっ た。

図２は、レセプター標的のクローニング方法（ＣＯＲＴ）を表わす概略図である 。ＥＧＦＲのＣ末端ドメインを、放射線標識されたリンでリン酸化させる。ラム ダｇｔｌｌライブラリーを１５０−のプレートあたり４Ｘ１０’プラークの密度 でブレーティングした。

プラークに、Ｉ　ＰＴＧ含浸したニトロセルロースフィルターを１２時間かぶせ 、その後プラークをニトロセルロースへとトランスファーし、標識されたプロー ブと共にインキュベートした。次にさらなる分析のため陽性コロニーを選択する 。

図３は、ＧＲＢ−１タンパク質を発現するファージのオートラジオグラムを示す 。Ａ）ブレーティングされた４０，０００ファージのうもの１つの陽性シグナル （矢印）を立証する一次スクリーン。

Ｂ）ＧＲＢ−１を発現するファージのプラーク精製。全てのプラークが［”Ｐｌ 標識されたＥＧＦＲのＣ末端ドメインに結合した。

図４は、ＧＲＢ−１のＤＮＡ配列及び予想されたアミノ酸配列を示す、このタン パク質は、７２４アミノ酸残基を有する。

図５は、類似のモチーフをもつその他のタンパク質とＧＲＢ−１のＳＨ２ドメイ ンの配列を比較する。Ａ）ＧＲＢ−１、Ｃ−５ｒｃ、ｖ−ａｂｌ、ウシＰＬＣ− ガンマ、ＧＡＰ、及びＶ−ｃｒｋのＳＨ２ドメイン。Ｎ及びＣは、それぞれＮ末 端及びＣ末端ＳＨ２ドメインを表わしている。保存アミノ酸置換は、Ｓｃｈｗａ ｒｔｚ及び坦山■により定義づけされている通りである：すなわち（Ａ、Ｇ、Ｐ 、Ｓ、Ｔ）；　（Ｌ％Ｉ、■、Ｍ）；　（Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ）；　（Ｋ、Ｒ，Ｈ） ；　（Ｆ、Ｙ、Ｗ）；及びＣ０太字はこれらの位置が同じであったか、又は５力 所以上に保存的アミノ酸置換が存在していることを識別している。囲みは、保存 されたモチーフを識別している。Ｂ）ＧＲＢ−１（７）ＳＨ３ドメインの類似の 比較。

図６は、ＳＨ２及びＳＨ３ドメインの構造組織を比較する概略図である。この図 には、ｃ−ｓｒｃ、ｖ−ｃｒｋ、ＰＬＣ−ガンマ、ＧＡＰＩ及びＧＲＢ−１とい った、ＳＨ２及びＳＨ３ドメインを含む既知のタンパク質が含まれている。

図７は、ＧＲＢ−１プローブを用いたサルｍＲＮＡのノーザンプロットである。

さまざまなサルの組織から得たポリ（Ａ）”ｍＲＮＡ５μｇを、１．２％／２． ２Ｍのアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動した。プロットを、クロ ーンｋｉ４からのインサートに相応する［”Ｐｌ−ニックトランスレーションを 受けたＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションした。

図８は、生物合成的に標識された細胞からの８５ｋＤａのタンパク質をＧＲＢ− １に対する抗体が免疫沈降させることを示すゲルパターンである。細胞を、［” Ｓｌメチオニンで代謝的に標識腰その後ライセードを調製し、免疫（Ｉ）又は前 免疫（Ｐ）血清のいずれかで免疫沈降させた。免疫沈降されたタンパク質を、８ ％のＳＤＳ／ＰＡＧＥ上で分離した。オートラジオグラフィは一晩行なった。使 用した細胞系統には、ヒトのグリオブラストーマ（多形性神経膠芽腫）細胞系統 、Ｕ１２４２、ラット膀胱がん細胞系統、ＮＢＴ−ＩＩ及びＮＩＨ−３Ｔ３細胞 が含まれている。

図９は、研究に使用したい（っかの野生型及び突然変異タンパク質を描いている 。（Ａ）その既知の又は予想された自己リン酸化部位を伴うＥＧＦレセプタ構築 体。野生型（Ｗ、Ｔ、）、キナーゼ陰性（Ｋ７２１Ａ）、及びカルボキシ末端欠 失（ＣＤ１２６）が、−３００，０ＯＯＥＧＦレセプターを発現する前述のトラ ンスフェクションを受けたＮＩＨ３Ｔ３細胞から免疫沈降された。ＥＧＦＲ−Ｃ は、バキュロウィルス感染ＳＦ９細胞によって産生されたＥＧＦレセプターの細 胞質ドメインを含む欠失突然変異体を表わす。（Ｂ）ＳＨ２及びＳＨ３ドメイン 及びＰＬＣ−ガンマチロシンリン酸化部位の場所を示すＰＬＣ−ガンマ及びｔ　 ｒ　ｐ　Ｅ／ＧＡＰ　ＳＨ２タンパク質の構造。

図１０は、ＥＧＦＲ突然変異体とＰＬＣ−ガンマの会合を示すゲルパターンであ る。野生型（ＨＥＲ１４）、カルボキシ末端欠失（ＤＣ１２６）又はキナーゼ陰 性（Ｋ７２１Ａ）ＥＧＦＲを、抗ＥＧＦＲｍＡｂ　１０８で免疫沈降させた。レ セプターを、〔ガンマ−”Ｐ−ＡＴＰで自己リン酸化させた。同時にＥＧＦＲ− ＣをプロティンＡ−セファロースビーズ単独、又はＡＴＰを含むかもしくは含ま ない免疫沈降されたに７２１Ａレセプターに添加した。ＡＴＰを除去するためさ らに洗浄した後、ＰＬＣ−ガンマを過剰発現する一１５ＸＩＯ’個の３Ｔ−Ｐ　 Ｌ細胞のライセードを添加し、９０分間４℃で混合した。未結合のＰＬＣ−ガン マを除去するため洗浄した後、６％の５ＤＳ−ゲル上でタンパク質を分離し、免 疫プロット法のためニトロセルロースにトランスファーした。抗−ＰＴｙｒプロ ット法のためには試料の８分の１を利用し、残りを抗−ＰＬＣ−ガンマプロット 法のために利用した（露出時間１４時間）。

図１１は、ＰＬＣ−ガンマのリン酸化がＥＧＦレセプターに対するその結合を低 減させることを示すゲルパターンである。

ｍＡｂ１０８で全長ＥＧＦＲを免疫沈降させ、自己リン酸化させた。ＰＬＣ−ガ ンマを過剰発現する３Ｔ−ＰＬ細胞のライセードを添加し、９０分間４℃で混合 した。結合後、試料の２分の１に対してＡＴＰを添加し、ＰＬＣ−ガンマ分子が ＥＧＦレセプターによってリン酸化されつるようにした。次にＥＧＦＲ−ＰＬＣ −ガンマ複合体の半分に対し５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加しく「洗浄なし 」、左側パネル）、直接６％のゲル上にロードした。もう半分はＨＮＴＧで３度 洗浄し、次にゲル上にロードした（「洗浄あり」、右側パネル）。５ＤＳ−ＰＡ ＧＥに、重複して試料をかけた後、タンパク質をニトロセルロースにトランスフ ァーし、抗−ＰＬＣ−ガンマ及び〔１０■〕プロテインＡでプローブ探査した。

ひき続きニトロセルロースからバンドを切り出し、ガンマカウンターで定量した 。ＨＮＴＧで３回洗浄した後、５０±５％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）のリン酸化 されていないＰＬＣ−ガンマがＥＧＦＨに結合した状態で残り、一方残ったリン 酸化されたＰＬＣ−ガンマは２２±４％にすぎなかった（露出時間：１２時間） 。

図１２は、ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥタンパク質に対する結合を示すゲルパターン である。（Ａ）ＥＧＦＲ−Ｃ（０，５μｇ）を、抗体Ｃで免疫沈降させ、洗浄し た。次に単独のＭ　ｎ　Ｃ１２又はＭ　ｎ　Ｃｌ　２とＡＴＰを添加して自己リ ン酸化を容易にした。ｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２（約２μｇ）、免 疫沈降物を１０％の５ＤＳ−ゲル上で分離し、ニトロセルロースへとトランスフ ァーし、抗−ｔｒｐＥを用いて免疫プロット法を行なった。比較を目的として、 約０．１μｇのｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／’ＧＡＰ　ＳＨ２のライセードを直接ゲ ルにロードした（Ａの右側パネル）。（Ｂ）抗−ｔｒｐＥ抗体を用いてｔｒｐＥ 又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２を免疫沈降させ、洗浄した。次に、リン酸化され た又はリン酸化されていないＥＧＦＲ−Ｃ（０，５μｇ）を添加して上述のとお り結合させた。洗浄の後、１０％のゲル上で試料を分離し、ニトロセルロースへ とトランスファーし、抗体Ｃでプローブ探査した。右側の２つの試料は、直接ゲ ル上にロードされたリン酸化された及びリン酸化されていないキナーゼ０．５μ ｇを表わす（露出時間＝２時間）。

図１３は、野生型及び突然変異ＥＧＦＨに対するｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２の結 合を示すゲルパターンである。（Ａ）野生型しセブター（ＨＥＲ１４）又はカル ボキシ末端欠失ＣＤ１２６レセブターをｍＡｂ　１０８で免疫沈降させた。次に ＭｎＣ１□単独又はＭｎＣ１□とＡＴＰをレセプター含有試料の自己リン酸化さ れた半分に対して添加した。１セツトのＣＤ１２６を同様に０、’５ｕｇのＥＧ ＦＲ−Ｃと交叉リン酸化した。次に４℃で９０分間、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２ を添加し、さらに３回洗浄した後５ＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。ニトロセルロ ースに対するトランスファーの後、抗−ｔｒｐＥ　（左側パネル）、抗−ＥＧＦ ＲＲＫ２　（中央パネル）又は抗−ＰＴｙｒ　（右側パネル）を用いてプロット をプローブ探査した。ＲＫ２及び抗−ＰＴｙｒは両方共総試料の８分の１であり 、７％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。

残りの試料を、抗−ｔｒｐＥプロットのため１０％のゲル上にロードした（露出 時間１４時間）。（Ｂ）ＥＧＦＲを全く含まないＮＩＨ３Ｔ３　２．２細１ｔａ 　（３Ｔ３）又はキナーゼ陰性レセプターを有する細胞（Ｋ２１Ａ）からのライ セードを、ｍＡｂ１０８で免疫沈降させた。全ての免疫沈降物に対して、０．５ ＦｇのＥＧＦＲ−Ｃを添加し、次に単独ＭｎＣ１□又はＭｎＣ１□とＡＴＰを添 加した。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２を添加し、（Ａ）の場合と同じように試料を 調製し、免疫プロットに付した（露出時間７１９時間）。

図１４は、ＥＧＦＲのＣＮＢｒ切断Ｃ末端フラグメントに対するＰＬＣ−ガンマ 及びｔｒｐＥ／Ｇ、６．Ｐ　ＳＨ２の結合を示すゲルパターンである。ＥＧＦＲ −Ｃ（１０μｇ）を、担体タンパク質として１００　ｔＪｇのＢＳＡを含むｐＨ ７，５の２０ｍＭＨＥＰＥＳ中でＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０の中でインキュベー トした。次に、リン酸化された及びリン酸化されていないＥＧＦＲ−Ｃを、各々 ２つに分割し、半分を緩衝液中に保管する一方、もう半分をＣＮＢｒで切断した 。次にＡＴＰを含む又は含まない、又ＣＮＢｒを含む又は含まない４つの試料を 、各々５００μの１％トリトンＸ−１００溶菌緩衝液中にもって行き、２つに分 け、抗−Ｃ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物を洗浄した後、ＰＬＣ−ガンマ又 はｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２を含むライセードを添加した。次に、抗−ｔｒｐＥ 又は抗−ＰＬＣ−ガンマを用いて上述のとおり試料について免疫プロット法を実 行した。右側パネルについては、切断された及び切断されていない、ＥＧＦＲ− Ｃの１分画（０，１Ｆｇ）を、免疫沈降無しに直接ゲル上にロードし、ＲＫ２で 免疫プロットに付した（露出時間１４時間）。抗−ｔｒｐＥプロットの全てのラ インに見られる黒いバンドは、およそ４０　ｋＤａ　、あたりにあり（図１３に も見られる）、免疫沈降抗体の重鎮に結合するＥ′！８Ｉ］プロティンＡを表わ す。

図１５は、ｔｒｐＥに対してではなくｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２に対するチロシ ンリン酸化されたＣ末端ＥＧＦＲフラグメントの結合を示すゲルパターンである 。ＥＧＦＲ−Ｃ（５Ｆｇ）を、［ガンマ−”ＰＩＡＴＰＩの添加によって自己リ ン酸化させた。リン酸化されたＥＧＦＲ−ＣをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０の中で 濃縮し、次に７０％蟻酸中のＣＮＢｒで切断させた。試料の半分（３５０，ＯＯ Ｏｃｐｍ　）を図１２Ｂにある通りにｔｒｐＥ又はｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２に 結合させ、洗浄して、１０％の５ＤＳ−ゲルにかけた。（Ａ）リン酸化されたＣ ＮＢｒ切断ＥＧＦＲ−ＣのｔｒｐＥに対する結合、（Ｂ）リン酸化されたＣＮＢ ｒ切断ＥＧＦＲＣのｔ　ｒ　ｐ　Ｅ　Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｓ　Ｈ２に対する結合、（Ｃ ）３、ＯＯＯｃｐｍのＣＮＢｒ−切断ＥＧＦＲ−Ｃ１（Ｄ）比較のための３，０ ００ｃｐｍの切断ＥＧＦＲ−Ｃ（露出時間２０時間）、ＥＧＦＲ９８４／ｌ　１ ８６は、ＣＮＢｒによって生成されたヂロシン自己リン酸化フラグメントの配列 を示している。

図１６は、ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び予想されるアミノ酸配列を 示している。

ましい　態　の６　な看日 本発明者は、レセプターチロシンキナーゼ分子、特に上皮成長因子レセプター（ ＥＧＦＲ）のチロシンリン酸化されたＣ末端テールに結合するという特徴をもつ タンパク質をコードするＤＮＡの急迅速な発現クローニングのための新しいプロ ーブ及びその利用方法を開発した。

「発現」という語は、タンパク質分子を生み出すための、タンパク質をコードす るＤＮＡ配列の転写及び翻訳のことを意味する。発現クローニングは、クローニ ングされるＤＮＡがあるタンパク質をコードするような方法である。典型的には ｃＤＮＡライブラリーの形態の望ましいＤＮＡは、その発現及びそれがコードす るタンパク質の直接検出を用いて検出される。発現クローニングシステムは、当 該技術分野において周知のものである（参考；　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ。

ｅｔ　ａｌユ（「　クローニング：　マニュアル」第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　 ＮＹ　（１９８９年）、なおこれは本書に参照により含まれる）。典型的には、 タンパク質は、ラムダｇｔｌ１発現ベクターでの細菌感染を介して、ラムダｇｔ １１ライブラリーといったライブラリーから発現される。バクテリオファージプ ラークの部域内に放出された発現タンパク質は、ニトロセルロースフィルターへ とトランスファーされ、典型的にはフィルターを染色すべ（抗体を用いて検出さ れる。新しいタンパク質、抗体を調製するのに充分な量で入手できないタンパク 質又は親和力に基づく検出のための既知のリガンドをもたないタンパク質につい ては、このような従来の発現クローニング方法は使用できない。

本発明の発現クローニング方法は、その他の数多くのレセプターシステムに対し 容易に適用できる。例えば、い（つかの標的分子は、ＰＤＧＦＲのチロシンリン 酸化部分及びコロニー刺激因子−１（Ｃ３Ｆ−１）に結合する（Ｃｏｕｇｈｌｉ ｎ、　Ｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ２４３：　１１９１−１１９４ 　（１９８９年）；　Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ ｌ　５８：１１２１−１１３３　（１９８９年）；　５ｈｕｒｔｌｅｆｆ、　Ｓ 、Ａ、　ｅｔ　ａｌｌ、　ＥＭＢＯＪ、　９：２４１５−２４２１　（１９９０ 年）；　Ｒｅｅｄｊｉｋ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ’ｏｌ。

１０＋　５６０１−５６０８　（１９９０年））。これら２つのレセプターにお いて、チロシンリン酸化反応は、ＥＧＦＲの場合のようにＣ末端ドメイン内では な（、キナーゼインサートドメイン内で起こる。従って、ＰＤＧＦＲ又はＣ３Ｆ −ルセブターのいずれかのキナーゼインサートドメイン又はその機能的誘導体（ 以下に規定のもの）を利用する特異的プローブも、同様に、発現クローニングの ために利用することができる。両者共ＰＬＯ−ガンマといったＳＨ２含有含有タ ンパ上質互作用することもできる線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）レセプター（こ れはＣ末端ドメイン内でチロシンリン酸化される）又はＨＥ　Ｒ２／　ｎ　ｅ　 ｕレセプターについても、類似のプローブを構築することが可能である。インシ ュリンレセプターといったようなその他のレセプターにおいては、チロシンリン 酸化反応は、キナーゼドメイン自体の中で起こる。

かくして、例えばＥＧＦＲ内のＣ末端ドメイン、インシュリンレセプター内のキ ナーゼドメイン及びＰＤＧＦＲ内のキナーゼドメインインサートといったように 、異なるタンパク質内で異なる部位がチロシンリン酸化されるということがわか ると思われるものの、本発明は、これらの構造全ての共通の特徴、単数又は複数 のホスホチロシンの存在及び単数又は複数のホスホチロシンを含むポリペプチド に対する親和力をベースとした成る種の細胞タンパク質の結合能力を認識する。

一般的に以下ではＥＧＦＲを基準としてＣ末端ドメインであるプローブを基準に しているものの、この言葉は制限的な意味をもつものではな（、上述のその地金 ての代替的チロシンリン酸化ドメインを内含すべく意図されたものである。

本発明の方法及びアプローチは、上述の活性化されたリン酸化レセプターなどの ようなチロシンリン酸化ポリペプチドと、特異的な形で相互作用することのでき る全ての標的分子のクローニング及び識別に適用することができる。例えば、Ｒ −ＰＴＰａｓｅｓといったようなチロシン特異的ホスファターゼなどのチロシン リン酸化された配列に対して結合するさらなるタンパク質（Ｓａｐ、　Ｊ、　ｅ ｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７： 　６１１２：　６１１６　（１９９０年）；Ｋａｐｌａｎ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：　７００ ０−７００４（１９９０年））。これらの方法は同様に、セリン／トレオニン特 異的ホスファターゼの場合のようにリン酸化されたセリン／トレオニン残基に結 合するタンパク質のクローニング及び識別においても適用可能である。

本発明のプローブを使用すると、遺伝子発現ライブラリーからの、コードされた タンパク質の識別及びＤＮＡのクローニングを迅速に行なうことが可能になる。

この方法は、特に、バクテリオファージラムダｇｔｌｌライブラリーの場合に有 用である。ヒトの胎児脳ラムダｇｔｌ１発現ライブラリーをスクリーニングする ことにより、本発明者は２つの遺伝子をクローニングし、それらがコードするタ ンパク質を特徴づけすることができた。そのうちの１つＧＲＢ−１と呼ばれるも のは、完全に配列決定され、２つのＳＨ２ドメインと１つのＳＨ３ドメインを含 む約８５ｋＤａの分子量をもつ新しいヒトタンパク質をコードすることがわかっ た（図４及び図５）。部分的に配列決定されたＧＲＢ−２も同様にユニークＳＨ ２及びＳＨ３ドメインを含んでいる。

ＧＡＰ及びＰＬＣガンマタンパク質内のようなＳＨ２ドメインは、ＥＧＦＲのリ ン酸化されたＣ末端とこれらのタンパク質の会合に関与する（以下の第Ｖ１例参 照）。従って、ＳＨ２ドメインの１つの機能は、効果的なチロシンリン酸化反応 を容易にするため、レセプターチロシンキナーゼ分子の細胞内部分とその基質を 並置することである。

本発明の方法を用いて識別された本発明のｃＤＮＡクローンのうちのひとつ、Ｇ ＲＢ−１を詳細に分析することにより、２つのＳＨ２ドメインと１つのＳＨ３ド メインを含む新しい配列が明らかにされる。このタンパク質は、さまざまな組織 及び細胞系統において発現される。その予想された分子量８５ｋＤａは、ドデシ ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上での その移動と一貫性をもつ。

「レセプターチロシンキナーゼ」という語は、チロシンキナーゼ酵素活性をもつ ドメインを含む単数又は複数の細胞内ドメインと細胞外レセプタードメインをも つ膜貫通タンパク質を意味する。さらなる細胞内ドメインは、ＳＨ２に対する配 列相同性を有しつる。これらの分子は、当該技術分野において周知のものである （Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｌ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３： 　１５６４−１５７０　（１９８９年）；Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｃｅ１ｌ旦：　２０３−２１２　（１９９０年）；　Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ 、　Ｇ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：　７７０９−７７１ ２　（１９９０年））。

レセプターチロシンキナーゼと相互作用しこのレセプターチロシンキナーゼによ ってリン酸化されつるタンパク質は、細胞外レセプタードメインに結合するこれ らのレセプターに対する「リガンド」とは区別して、これらのレセプターに対す る「標的」タンノ（り質と呼ばれる。

本発明に従うと、発現クローニング方法は、ラムダｇｔｌｌといったような遺伝 子発現ライブラリー上で直接実施される。好ましい実施態様においては、ＤＮＡ はヒトｃＤＮＡである。より好ましくは、ＤＮＡはヒト胎児脳ＤＮＡである。ヒ トの遺伝子のクローニングのための出発物質としてこのような供給源を使用する ことは、大量の組織を取って抗体を産生ずるか又はタンパク質を精製し部分的に 配列決定しオリゴヌクレオチドプローブをこの配列から調製したゲノム、ＤＮＡ 又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いる代替的手段に比べ、 著しい利点を有する。これらの工程を回避することの利点は、胎盤を除き、組織 が一般に大量に入手できないことから、ヒト遺伝子の場合に最も適切である。

発現ライブラリーは、単一の工程でスクリーニングされる。好ましくは、ラムダ プラークは、感染した細菌内で発現され担体にトランスファーされるライブラリ ーＤＮＡにコードされたタンパク質のトランスファーを可能にするべく、固体担 体、好ましくはニトロセルロース上にブロッティングされる。この担体は、次に 、本明細書に記述しているように、本発明のプローブと共にインキュベートされ る。プローブは、チロシン−リン酸化ポリペプチドに対する結合能力を有するタ ンパク質に結合することができる。プローブに用いられる標識、好ましくは放射 性同位元素ｓａｐに基づいて、問題のタンパク質を含むプラークを識別するため に適切な検出システムが用いられる。このときこれらのプラーク内のファージが 選択され、それらの中のＤＮＡインサートを再クローニングし、切り出し、当該 技術分野において周知のようにタンパク質の大規模な発現のために使用されるそ の他のベクター内などに入れることができる。

当業者であれば、使用されるシステムの精確な性質に応じて濃度、時間、温度を 変化させることができることがわかるであろうし、又、過度の実験無しに該当す るパラメータを変化させる方法がわかるだろう。さらに、この分野における一般 的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ工銀ユ　（前出）の中に記述されている。

固相担体を作製できる材料としては、ニトロセルロース、セルロース、紙、置換 型ポリスチレン、アクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリベンテン、酸化シ リコーンが含まれるが、これらに制限されるわけではない。

本発明のプローブは、レセプターチロシンキナーゼ、好ましくはＥＧＦＲのＣ末 端ドメインから誘導されたチロシンリン酸化ポリペプチド分子である。ポリペプ チドは、約２５個から約２５０個のアミノ酸の長さを有していてよい。プローブ は、リン酸化された天然配列又はその機能的誘導体（以下に規定）でありうる。

１個から５個のチロシン残基でＣ末端領域を自己リン酸化するため、レセプター 分子上に存在するチロシンキナーゼドメインを用いることによって、きわめて効 率の良いリン酸化反応が得られる。チロシ〉・残基なリン酸化するためには（例 Ｉに詳細に記述されている）既知の方法及び条件が用いられる。好ましい基質は 〔ガンマ−ｐｓｉ−アデノシン三リン酸Ｊである。プローブを作るために源材料 として用いられる！／セブター分子の供給源としては、組織又は細胞から化学的 に精製された分子又は組換え型ＤＮＡ方法により産生された分子が考えられる。

組換え技術を用いる場合、天然型レセプターを産生させてもよいし、或は又代替 的には、レセプター様の誘導体を産生させてもよい。好ましいレセプター様の誘 導体としては、Ｃ末端ドメインに連結されたチロシンキナーゼドメインが挙げら れる。また別の実施態様においては、別々の分子として２つのドメインを産生さ せ、混合してＣ末端由来ポリペプチドのチロシンリン酸化を達成することができ る。

本明細書に記述するようなレセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化され たＣ末端部分を含むプローブは、融合タンパク質の形で組換え手段によって産生 されつる。

本明細書で使用する場合「融合タンパク質」というのは、ＳＨ２ドメインを有す るタンパク質といった、細菌性タンパク質及び問題のポリペプチドを含む融合さ れたタンパク質のことであってよい。代替的には、融合タンパク質は同様に、キ ナーゼによってリン酸化されつる単数又は複数のチロシン残基をもつレセプター チロシンキナーゼＣ末端ドメインに連結されている選択的酵素的切断部位に、チ ロシンキナーゼドメインをコードするＤＮＡ配列が連結されている、人工的に構 築されたレセプターチロシンキナーゼ様誘導体であってもよい。このタイプの「 融合タンパク質」をコードするこのような遺伝子構築物を、発現運搬体中に挿入 し、細菌又は真核生物の宿主内で発現させられる。ひとたび発現されると、この ような融合タンパク質は自己リン酸化することができ、ここでキナーゼはＣ末端 ドメイン内でチロシン残基をリン酸化するべく作用する。このリン酸化反応に続 いて、適切な酵素を使用することによって選択的に切断部位における切断が起こ り、かくしてＣ末端リン酸化ポリペプチドをＮ末端キナーゼから分離し、これを プローブとして役立てることができる。

Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：　１０５６−１０ ６３　（１９７７年））及びＲｉｇｇｓ（米国特許第４．３６６．２４６号（１ ９８２年））は、外来性タンパク質の細胞内崩壊を妨げる融合タンパク質の形で の外来性タンパク質の細菌発現のための方法を教示した。さらに、過剰に発現さ れた融合タンパク質は、往々にして細菌細胞内に細胞封入体として貯えられてお り、従って単離及び精製が比較的容易である（Ｍａｒｓｔｏｎ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｊ、２４０：　１−１２　（１９８６年））。これらの参考文献は、選択的 切断部位の概念に基づく代替的切断方法を示唆していた。すなわち、メチオニン が望まれる接合部に挿入されて臭化シアノゲンのための標的部位として役立つこ とができたのと全く同じように、アミノ酸特異性をも−）タンパク質分解酵素に よる攻撃を受け）る特異的アミノ酸部位も導入することができた。Ｎａｇａｉ　 ｅｔ　ａｌ。

（Ｎａｔｕｒｅ　３０９：　８１０−８１２　（１９８４年）は、血液凝固因子 Ｘａのための切断部位として役立つ４つのアミノ酸の配列を導入することによる 融合タンパク質におりる望ましい遺伝子産物の産生を開示していた。Ｘｓ因子に よる切断は同様に、従来の方法によりＥ、ｃｏｌｉの中で発現された大部分の真 核性タンパク質の中に存在する開始コドンによってコードされる余分なＮ末端メ チオニンも除去した。Ｘａ因子又はトロンビンによって認識される酵素的切断部 位を、望まれるタンパク質の細菌内での発現を強化しその精製をさらに容易にす るために使用することを記述したその他の参考文献（Ｇｅｒｍｉｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ １：　６９２−４６９６　（１９８４年）；　５ｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　６２：　５５−６４　（１９８８年）；　Ｓｍ１ｔｈｅｔ 　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　６７：　３１−４０　（１９８８年）；　Ｋｎｏｔｔ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７４：　４０５−４１０　（１９８８年）；及びＤｙｋｅ ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７４：　４１１−４１６　（１９８８年））。

「選択的切断部位」という語は、化学物質又は酵素のいずれかによって選択的に 切断され、予想可能な形で切断を達成することのできる単数又は複数のアミノ酸 残基のことを意味する。選択的酵素的切断部位は、タンパク質分解酵素により認 識され、加水分解されるアミノ酸又はペプチド配列である。このような部位の例 としては、トリプシン又はキモトリプシン切断部位が含まれる。本発明の好まし い一実施態様においては、選択的切断部位は、血液凝固Ｘａ因子によって認識さ れ切断される配列Ｉ　１　ｅ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒ　ｇから成る。ま た別の実施態様においては、選択的切断部位は、トロンビンによって認識され切 断される配列Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有する。

レセプター様の誘導体を構築するにあたっては、酵素認識部位をコードする配列 に対して５′にあるオリゴヌクレオチド配列を含ませることができ、又長さを変 化させてもよい。例えば、１つの実施態様においては、Ｉｌｅに対するコドン（ Ｘａ因子認識部位の開始）とチロシンキナーゼドメインをコードする配列の３′ 末端の間に、１３のヌクレオチドを位置させている。

従って、本発明の１実施態様においては、チロシンキナーゼドメインとＣ末端ド メインの間に、Ｉ　ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇ４ｙ−Ａｒｇ配列が導入されている。また 別の実施態様においては、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列が導入される。

この切断部位をもつタンパク質は、標準方法を用いて細菌内で発現させられる。

その後、好ましくはＥガンマ−１ｐｌアデノシン三リン酸を用いたＣ末端ドメイ ンの自己リン酸化反応が起こることができ、それに続いて、例えばＸａ因子とい った適切な切断作用物質を用いたチロシンリン酸化Ｃ末端ドメインの選択的切断 が起こる。

本発明は同様１乙特定のヒト染色体に対して、レセプターチロシンキナーゼのた めの標的タンパク質（例えば本明細書に規定されているようなＧＲＢタンパク質 ）をコードする遺伝子、好ましくはヒト遺伝子をマツピングする方法も提供して いる。この方法は本明細書に記されている新しい発現クローニング方法と、特定 の染色にある遺伝子をマツピングするためのいくつかの既知の技術のうちの１つ を組合わせている。かくして、本発明に従うと、ラムダｇｔｌｌクローンといっ たＧＲＢタンパク質をコードするＤＮＡインサートを含むクローンが、本明細書 に開示されている発現クローニング方法を用いて識別される。インサートは、望 まれる場合、当該技術分野で周知の方法ならびに、クローンの核酸の直接標識が 又はクローンの配列のユニーク部分に相応するオリゴヌクレオチドプローブを産 生することによって構築されたプローブを用いて、さらにサブクローニングされ つる（参考：　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、但ニ銀ユ　（分子クローニング：　マ ニュアル、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９年））。この標識され たプローブは、次に、ヒト−ハムスタ一体細胞ハイブリッドのパネルがらのＤＮ Ａを含むＢｉｏｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　Ｃｏｎ ｎｅｃｔｉｃｕｔ）製のＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｂｌｏｔといった市販のプロッ トを用いたハイブリダイゼーション検定において使用できる（Ｋｏｕｒｉ、　Ｒ ，Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｔｏ　ｅｎｅｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　５１：　１０２５（１９８９年 ））。そのヒト−ハムスターハイブリッド細胞内などのヒト染色体が残っている がと問題のＧＲＢ遺伝子に特異的なプローブのハイブリダイゼーションを比較す ることによって、遺伝子は特定のヒト染色体にマツピングされる。このようにし て、この染色体上に存在する既知のヒト遺伝子（又はその中の突然変異によりひ き起こされる疾病）に対するリンケージが立証される。より細かいマツピングの ために当該技術分野において周知の方法、例えば既知のヒト欠失突然変異を使用 して、ＧＲＢ遺伝子をさらに精確にその他のヒト遺伝子に対してマツピングする ことができる。

本発明のチロシンリン酸化されたレセプターチロシンキナーゼＣ末端ブローブボ リベブチド及び本発明のＧＲＢタンパク質、ならびに本発明の方法を用いて発見 されるさらなるまだ未知のＧＲＢタンパク質は、レセプタチロシンキナーゼを通 したシグナル伝達を介して起る細胞成長制御を変調することのできるその他の作 用物質及び薬物をスクリーニングするための方法において有用である。チロシン リン酸化ブローブボリベブチド又はＧＲＢタンパク質あるいはそれらのフラグメ ントを固相担体マトリックスに付着させることによって、その親和カブローブに 結合することのできる複雑な混合物から分子を単離し精製するのに使用可能な親 和カブローブが作り出される。さらに、このような親和カブローブは、チロシン リン酸化プローブ又はＧＲＢタンパク質を結合できる分子の生物学的流体中にお ける存在を検出するためにも有用である。同様にして、このプローブ又はＧＲＢ と相互作用するその能力について、化学的作用物質をテストすることも可能であ る。

固相に対してタンパク質及びペプチドをカップリングさせるための方法、これら の方法において有用な固相物質及び溶出手段は、当業者にとって周知のものであ る。

ＥＤＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ及びＦＧＦＲを含む、レセプターチロシンキナーゼであ る成長因子レセプターの場合、チロシンリン酸化反応は細胞成長及び発がん性形 質転換に連関している。細胞内のＧＲＢの作用の妨害は、成長を妨げるが又は抑 制する可能性があり、又腫瘍の発達を妨げる手段としても役立ちつる。さらに、 レセプターチロシンキナーゼ又はＧＲＢのＣ末端部分内の突然変異あるいはその 相互作用の調節不良は、ガンの可能性を促進しつる。

インシュリンレセプター（ＩｎｓＲ）も同様にレセプターチロシンキナーゼであ り、Ｉｎ５Ｒを担持する細胞内のチロシンリン酸化反応は、正常な生理学的機能 と結びつけられる。細胞成長及びガンの場合とは対照的に、ＧＲＢ及びレセプタ ーのチロシンリン酸化部分の正常な相互作用の妨害はインシュリンの効果を妨げ ることになる。ＧＲＢタンパク質の正常以下のレベル又は活性は、正常な対調節 メカニズムを無くするように作用しつる。恐らくは、ＧＲＢタンパク質の過剰発 現又は過剰活性は、細胞に対するインシュリンの作用を抑制するか又は完全に妨 げる可能性があり、か（して糖尿病（インシュリン抵抗性の）へと導きつる。従 って、糖尿病に対する罹病性は、ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質の調節不 良と結びつけることができる。

従って、正常な又は突然変異体のＧＲＢタンパク質遺伝子を識別するためのある いは細胞内のＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２の存在又はその量を検出するための本発 明の方法は、レセプターチロシンキナーゼ経路によって媒介される細胞代謝にお ける変化と関連するがん、糖尿病その他の病気に対する罹病性を識別するための 方法として役立つことができる。

本発明は、被検者体内の正常又は突然変異体ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク 質の存在及びそのレベルを評価するための方法を提供する。被検者体内のこれら のタンパク質の変調した発現又は突然変異体ＧＲＢタンパク質の存在は、発ガン 性形質転換及びガンの発病に対する罹病性の重要な予測物として役立ちつる。代 替的には、ＧＲＢタンパク質の変調した発現は、糖尿病に対する罹病性の重要な 予測物として役立つことができる。

ＧＲＢタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列の存在について被検者から の細胞をテストするのに、ＧＲＢタンパク質のさまざまな部分をコードするオリ ゴヌクレオチドプローブが用いられる。好ましいプローブは、本発明のＧＲＢ− １又はＧＲＢ−２タンパク賃の少な（とも４個のアミノ酸残基、好ましくは少な くとも５個のアミノ酸残基をコードする核酸配列に対し向けられたものである。

このようなプローブを使用して、定性的又は定量的検定を行なうことができる。

例えば、細胞又は組織の調製物におけるＧＲＢタンパク質のｍＲＮＡの発現を測 定するためには、ノーザン分析（以下の例ｍを参照のこと）が使用される。

このような方法は、選択的増幅技術の使用の後、被検者から得られるきわめて少 量のＤＮＡを用いてさえ利用できる。精製された核酸フラグメントを増幅するこ とのできる組換えＤＮＡ法が長い間認知されてきた。典型的にこのような方法に は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター内への核酸フラグメントの導入、ベクターのクロ ーン増幅、及び増幅された核酸フラグメントの回収が関与している。このような 方法論の例は、Ｃｏｈｅｎ他（米国特許第４，２３７，２２４号）、Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　（前出）などによって提供されている。

最近、このような望ましい核酸分子の濃度を増大させることのできるインビトロ 酵素法が記述されてきた。この方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応又はｒＰｃＲＪ として呼称されてきた（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ 　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ　ｍ　、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ。

５１：　２６３−２７３　（１９８６年）；　Ｅｒ１ｉｃｈ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ 、、ＥＰ　５０，４２４；ＥＰ　８４，７９６．　ＥＰ　２５８，０１？、　Ｅ Ｐ　２３７，３６２；　Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、、　ＥＰ　２０１Ｊｌｌ１４；ポ リメラーゼ連鎖反応は、その配列が予め精製されておらずかつ特定の試料内Ｉこ 単一のコピーでしか存在しない場合でさえ、特定の核酸配列の濃度を選択的に増 大させるための方法を提供する。この方法は、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡのいずれ かを増幅するために使用できる。この方法の核心には、望まれる核酸分子の鋳型 依存型のポリメラーゼ媒介複製のためのプライマーとして役立つ２つのオリゴヌ クレオチドプローブの使用が関与している。

ＰＣＲ法の２つのオリゴヌクレオチドプローブの精確さは、この方法の成功にと ってきわめて重要である。周知のように、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子は、分子のリ ン酸基の５′−３’連鎖を通して付与される指向性を有する。ＤＮＡ又はＲＮＡ の配列は、１つの配列の末端５′　リン酸基と第２の配列の末端３′ヒドロキシ ル基の間のホスポジエステル結合の形成を通して連結される。核酸分子のポリメ ラーゼ依存型増幅は、核酸分子の３′ヒドロキシル末端に対する５′ヌクレオチ ド三リン酸の付加によって進行する。かくしてポリメラーゼの作用は、核酸分子 の３′末端を伸長させる。これらの固有の特性は、ＰＣＲのオリゴヌクレオチド プローブの選択において活用されている。ＰＣＲ法のプローブのオリゴヌクレオ チド配列は、それが、増幅の望まれる特定の核酸配列のフランキング配列と同一 の又はそれに相補的な配列を含んでいるように選択される。

さらに特定的に言うと、「第１の」プローブのオリゴヌクレオチド配列は、望ま しい配列に対し３′に位置するオリゴヌクレオチド配列にハイブリッド形成でき るように選択されており、一方「第２の」プローブのオリゴヌクレオチド配列は 、それが望ましい領域に対し５′のところに存在するものと同一のオリゴヌクレ オチド配列を含むような形で選択される。両方のプローブは共に３′　ヒドロキ シ基を有し、従って核酸合成のためのプライマーとして役立つことができる。

ＰＣＨにおいては、反応条件は、ハイブリダイゼーション及び核酸重合の助けと なる条件及び二重鎖分子の変性を結果としてもたらす条件の間で循環させられる 。反応の第１段階では、試料の核酸は過渡的に加熱され、次に冷却されて、存在 しつるあらゆる２本鎖分子が変性される。次に「第１の」及び「第２の」プロー ブは、望まれる核酸分子の濃度をはるかに上回る濃度で試料に添加される。試料 が、ハイブリダイゼーション及び重合の助けとなる条件下でインキュベートされ ると、「第１の」プローブは、増幅されるべき配列に対して３′の位置で試料の 核酸分子とハイブリッド形成することになる。試料の核酸分子が当初２本鎖であ った場合、「第２の」プローブは、増幅が望まれている配列の相補体である配列 に対して３′の位置において核酸分子の相補鎖とハイブリッド形成することにな る。ポリメラーゼを添加した時点で、「第１の」及び（核酸分子が２本鎖である 場合には）「第２の」プローブの３′末端は伸長されることになる。「第１の」 プローブの伸長は結果として、望まれる核酸の正確な配列をもつオリゴヌクレオ チドの合成をもたらすことになる。「第２の」プローブの伸長は、結果として、 望まれる核酸の相補体の正確な配列をもつオリゴヌクレオチドの合成をもたらす 。

ＰＣＲ反応は、「第１の」プローブの伸長産物が必然的に「第２の１プローブの 配列に相補的な配列を含み、か（して「第２のＪプローブの伸長産物の産生のた めの鋳型として役立つことから、特異的核酸配列の指数増幅を行なうことができ る。同様に、「第２の」プローブの伸長産物は、必然的に、「第１の」プローブ の配列に対して相補的な配列を含み、かくして「第１の」プローブの伸長産物の 産生のための鋳型として役立つことができる。従って、重合及び変性のサイクル を可能にすることにより、望まれる核酸分子の濃度の幾何学的増加を達成するこ とが可能である。ＰＣＲに関する総説は、Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、（Ｃｏｌｄ 　Ｓ　ｒｉｎ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ　ｍ　、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ。

５１：　２６３−２７３　（１９８６年））；　５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、　ｅｔ 　ａｌ、、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ。

３：　１００８−１０１２　（１９８５年））；及びＭｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、 　ｅｔ　ａｌ、（Ｍｅｔｈ。

」ｙ芸咀ＬＵ壜：　３３５−３５０　（１９８７年））に提供されている。

１つの実施態様においては、本発明は、天然のＧＲＢ　１及びＧＲＢ−２タンパ ク質に向けられている。また別の実施態様においては、本発明は、組換え型ＧＲ Ｂ−１及びＧＲＢ２タンパク質に向けられている。本発明は、天然に関連してい るその他のタンパク質を実質的に含まない天然のタンパク質分子を提供している 。「その他のタンパク質又は糖タンパク質を実質的に含まない」というのは、そ のタンパク質が少な（とも９０パーセント（重量ベースで）以上さらには望まし くは少な（とも９９パ一セント以上の天然に関連するその他のタンパク質及び糖 タンパク質から精製され切っており、従って実質的にこれらを含まないことを意 味している。これはＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２タンパク質を含む細胞、組織又は 流体を、そのタンパク質に対して反応するモノクローナル抗体を担持する免疫吸 着剤カラムといった標準的なタンパク質精製技術に付すことによって達成するこ とが可能である。

ＧＲＢ−１遺伝子のヌクレオチド配列、及びＧＲＢ−１タンパク質のアミノ酸配 列は、図４に示されている。ＧＲＢ−２の部分的ヌクレオチド配列及び部分的ア ミノ酸配列は、図１６に示されている。

好ましい実施態様においては、ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２あるいは未知のＧＲＢ タンパク質は、レセプターチロシンキナーゼのチロシンリン酸化Ｃ末端ドメイン 、又はその機能的誘導体である本発明のプローブを、親和カブローブとして用い ることによって、単離かつ精製することができる。

代替的には、硫酸アンモニウム沈殿、分子ふるいクロマトグラフィ及びイオン交 換クロマトグラフィなどの標準的な方法の組合せにより、精製を達成することが できる。

本発明のＧＲＢ−１及びＧＲＢ−２タンパク質が、さまざまな細胞又は組織供給 源から生化学的に精製可能であることが理解できるだろう。天然のＧＲＢタンパ ク質の調製のためには、晴乳動物の胎盤又は脳といった組織が好まれる。

もう１つの方法として、ＧＲＢｌ及びＧＲＢ−２の遺伝子が単離又は合成できる ため、このポリペプチドは、要すれば、他のタンパク質すなわち原核生物中の晴 乳類起源又は非哨乳類真核生物におけるグリコプロティン類を実質的に含まない ように合成することができる。本発明において意図されているように、トランス フェクションによって生産されたＣＯＳ、ＮＩＨ−３Ｔ３又はＣＨＯ細胞のよう な哨乳動物細胞において生産される組換えＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２分子は、例 えば、天然に存在するタンパク配列であるか、あるいは、その官能性誘導体であ る。天然産のタンパク質又はグリコプロティンが組換え手法によって生産される 場合、それは、それが本来結びついている他のタンパク質及びグリコプロティン を実質的に含まない形で提供される。

さらには、固相支持体上で所望の配列を有するポリペプチドを合成し、次いでそ の支持体から分離するいくつかの方法が良（知られている。特に、本発明のチロ シン−リン酸化Ｃ末端領域プローブ又はその官能性誘導体は、ホスホチロシンが チロシンの代りに提供されるポリペプチド合成法を用いることによって合成する ことができ、その結果、ポリペプチドのリン酸化されたものが直接合成されるこ とになる。

本発明は、チロシン−リン酸化Ｃ−末端領域ポリペプチド及び／又はＧＲＢ−１ 及びＧＲＢ−２タンパク質の「官能性誘導体」を提供する。

「官能性誘導体」とはＧＲＢタンパク質の「断片」、「変種」、［類縁体Ｊ又は 「化学的誘導体」を意味するが、これらの用語については、以下に定義する。官 能性誘導体は、本発明による有用性を与える本来のタンパク質の機能を少なくと も一部分を保持している。

本発明のいかなるタンパク質（プロティン）又はポリペプチド類の「断片」も、 該分子のサブセットすなわち短鎖ポリペプチドのことを言う。

該プロティンの「変種」とは、完全ペプチド又はその断片に実質的に類似した分 子のことを言う。変種ペプチドは、当業界で周知の方法を用いることによって、 変種ペプチドの直接化学合成によって好都合に調製することができる。

もう１つの場合として、該プロティンのアミノ配配列の変異種は、合成ペプチド をコードするＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。そのような変 異種には、例えば、該アミノ酸配列からの欠失体、又は、その挿入体もしくは置 換体、該アミノ酸配列内の残基が含まれる。欠失、挿入及び置換のいかなる組合 せも、最終構成体が目的とする活性を備えているかぎり、最終構成体に到達する ために、適用することができることは明らかである。変異ペプチドをコードする ＤＮＡにおいて起きる突然変異は、リーディング・フレームを変化させてはなら ず、二次的なｍＲＮＡ構造を産出することが可能な相補性領域を創出しないこと が好ましい（ヨーロッパ特許公報筒ＥＰ７５，４４４参照）。

遺伝学的レベルにおいては、これらの変異種は、通常、ペプチド分子をコードす るＤＮＡにおけるヌクレオチドの位置特異的変異によって調製され（例えばＡｄ ｅｌｍａｎら、ＤＮＡ　２：　１８３　（１９８３））、それにより、該変異種 をコードするＤＮＡを生成せしめ、その後、組換え細胞培養中のＤＮＡを発現せ しめる（下記参照）。これらの変異種は、通常、非変異ペプチドと同じ定性的な 生物学的活性を示す。

チロシン−リン酸化ポリペプチド又はＧＲＢタンパク質の「類縁体」とは、完全 分子又はその断片に実質的に類似した非天然分子のことを言う。

チロシン−リン酸ポリペプチド又はＧＲＢタンパク質の「化学的誘導体」は、通 常はこのペプチドの一部分ではない付加的な化学的部分を含む。このペプチドの 共有結合変異（体）も本発明の範囲に含まれる。そのような変異（修飾）は、該 ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又は末端残基と反応することが できる有機誘導体化剤と反応させることによって、その分子中に導入することが できる。

システィンニル残基は、殆んどの場合、アルファーハロアセテート類（及び対応 するアミン類）、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応せしめられ 、カルボキシメチル又はカルボキサミトメチル誘導体を与える。システィンニル 残基は、また、プロモトリフルオロアセトン、アルファーブロモ−ベーター（５ −イミダゾリル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマ レイミド類、３−ニトロ−２−ピリジル・ジスルフィド、メチル・２−ピリジル ・ジスルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロ−マーキュリ −４−二トロフェノール又はクロロ−７−ニドロベンゾー２−オキサ−１，３− ダイアゾールとの反応によっても誘導体化される。

ヒスチジル残基は、ｐｏｓ、ｓ〜７．Ｑにおけるジエチルプロカーボネートとの 反応によって誘導体とすることができる。というのは、この試薬が、ヒスチジル 側鎖に対し比較的特異性があるからである。パラブロモフェナシルプロミドもま た有用であり、反応は、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６，０で行うの が好ましい。

リジニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応 させる。これらの試薬による誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果が ある。アルファーアミノ含有残基を誘導体化するに適した他の試薬には、メチル ・ピコリンイミデート、ピリドキサール・ホスフエート、ピリドキサール、クロ ロ水素化ホウ素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２、 −４−ペンタンジオンが含まれ、さらには、グリオキシレートとのトランスアミ ナーゼ触媒による反応を適用してもよい。

アルギニル残基は、−又は数種の従来の試薬、中でも、フェニルグルオキサール 、２．３−ブタンジオン、１．２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンと の反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基 の高ｐＫａ値のために、アルカリ性条件で反応を行うことが必要である。さらに は、これらの試薬は、リジンの基とも、あるいは、アルギニンのイプシロンアミ ノ基とも反応することができる。

チロシル残基そのものの特異的修飾については、芳香族ジアゾニウム化合物又は テトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基中ヘスベクトルに掛る標！（ ラベル）を導入する特定の関心を持って、広汎に研究が行われている。殆んどの 場合、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンが用いられ、０−アセ チル・トシル体及び３−ニトロ誘導体を、それぞれ生成する。

カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロへキシル− ３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３− （４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジ イミド類（Ｒ′−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）との反応によって、選択的に修飾される。

さらには、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウム・イオンとの反応 によって、アスパラギニル及びグルタミル残基に変換される。

グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば脱アミノ化されて、相当する グルタミル及びアスパルチル残基となる。あるいはまた、これらの残基は、穏や かな酸性条件下で脱アミノ化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の 範囲に入る。

二官能性試薬による誘導体化は、水不溶性支持体マトリックス又は他の巨大分子 担体へ、ペプチドを架橋結合せしめるのに有用である。通常使用される架橋剤ど しては、例えば、１．１−ビス（ジアゾ−アセチル）−２−フェニルエタン、グ ルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類（例えば、４−ア ジドサリチル酸とのエステル類）、３．３′−ジ−チオビス（スクシンイミジル プロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステル類をはじめとするホモ二 官能性イミドエステル類、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのよう な三官能マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチ オ］プロピオイミデートは、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化 可能な中間体を生成する。もう一つの方法として、シアノーゲン・プロミド活性 化炭化水素のような反応性水不溶性マトリックス並びに米国特許第３，９６９． ２８７；３，６９１，０１６゜４．１９５，１２８．４，２４７，６４２．４， ２２９，５３７゜及び４，３３０，４４０に記載された反応性基材がプロティン の不溶化に用いられる。

他の修飾反応としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化（水酸化）、セリ ルもしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及 びヒスチジン側鎖のアルファーアミノ基のメチル化（Ｔ、Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔ ｏｎ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌｅ　 Ｐｒｏ　ｅｒｔｉｅｓ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｇｏ、、　Ｓａｎ　Ｆ ｒａｎｃｉｓｃｏ、　ｐｐ。

７９−８６　（１９８３））　、Ｎ末端アミンのアセチル化そして、い（つかの 場合には、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

そのように誘導体化された部分は、溶解性、吸収、生物学的寿命（耐久性）など を改善しつるであろう。かかる部分は、一方で、プロティン等の望ましくない副 作用を除去ないしは軽減する。このような効果をもたらす部分については、例え ば、助凪」１匹）Ｐｈａｒ　ｅｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ｑ、Ｍａｃ ｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、。

Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８０）に開示されている。

本発明のための好ましい細菌宿主はＥ、　ｃｏｌｉ、　（イー・コリ）である。

他の実施態様においては、他の細菌の種を使用することができる。さらに他の実 施態様においては、真核細胞、例えば、酵母、糸状菌等を利用することができる 。ごれらのタイプの細胞の使用は、当業界で周知である。いかなる宿主も、発現 プラスミド中のレプリコン配列及び制御配列と相容性があるプロティンを発現す るために用いられる。一般的に、宿主細胞と相客れる種から誘導された、レプリ コン及びコントロール配列を含むベクターが、該宿主と関連付けて用いられてい る。ベクターは、通常、レプリコン部位及び感染されるか形質転換された細胞に フェノタイプの選択を与えることができる特定の遺伝子を有している。融合プロ ティンの発現もまた、形質転換されない状態にある生物に相同的でありうる他の 通常の配列と共に制御下に置くことができる。

本発明は、また、ＧＲＢ−１又はＧＲＢ−２のエピトープに特異的な抗原、細胞 、細胞もしくは組織抽出物、又は生物学的流体中のＧ　ＲＢプロティンの存在を 検出し、そのプロティンの量及び濃度を測定するための、かかる抗体の使用にも 関する。

「抗体」なる用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、 キメラ抗体及び抗イデオタイム（アンチ−Ｉｄ）抗体を含むことを意図している 。

ポリクローナル抗体は、アンチゲンにより免疫された動物の血清から誘導された 抗体分子の不均一集団である。

モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の均一な集団である。ｍＡｂｓ は、当業者に公知の方法で得ることができる。例えば、にｏｈｌｅｒ及びＭｉｌ ｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２５６＋　４９５−４９７　（１９７５）並びに 米国特許第４，３７６．１１０号参照。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｉ ｇＥ、Ｉ　ｇＡ、ＧＩＬＤ及びそれらのサブクラスをはじめとする免疫グロブリ ンのクラスのものであればいかなるものであってもよい。本発明のｍＡｂｓを産 生ずるハイブリドーマは、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）又は生体内（Ｌｎ　ｖｉ ｖｏ）で培養することができる。生体内での高い力価のｍＡｂｓの産生は、この 方法を、しばしば、現在のところ好ましい産生方法にしている。簡潔に言うと、 個々のハイブリドーマからの細胞がｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ　Ｂ　Ａ　 Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に注射され、目的とするｍＡｂｓを高濃度で含む 腹水を産生せしめる。イソタイプのＩｇＭ又はＩｇＧは、そのような腹水から、 あるいは培養上澄み液から、当業者に周知のカラムクロマトグラフィーを用いる ことによって、精製することができる。

キメラ抗体は、その異った部分が異った動物種から誘導される分子、例えば、ネ ズミｍＡｂｓから誘導される可変領域及びヒトイムノグロブリン一定領域を有す るものである。キメラ抗体及びその製造方法は、公知である（Ｃａｂｉｌｌｙら 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８１：　３２７３−３２７７　（１９８４）；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：　６８５１−６８５５　（１９８４）；　Ｂｏｕｌｉ ａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６４３−６４６　（１９８４）；　Ｃａｂ ｉｌｌｙら、ヨーロッパ特許願第１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開） ；　Ｎ６ｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１４：　２６８−２７０　（１９ ８５）；　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ヨーロッパ特許出願第１７１４９６号（１９ ８５年２月１９日公開）；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ヨーロッパ特許出願第１７３ ４９４号（１９８６年３月５日公開）ＨＮｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願第Ｗ ０　８６１０１５３３（１９８６年３月１３日公開）ＨＫｕｄｏら、ヨーロッパ 特許出願第１８４１８７　（１９８６年６月１１日公開）Ｈｌ□ｒｒｉｓｏｎら 、ヨーロッパ特許出願第１７３４９４　（１９８６年３月５日公開）；　Ｓａｈ ａｇａｎら、ムＩｍ＋＋＋ｕｎｏ１．１３７：　１０６６−１０７４；　Ｒｏｂ ｉｎｓｏｎら、国際公開＃ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２２６９　（１９８７年５月７ 日公開）　；Ｌｉｕら、均３匹ユＮａｔ１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４ ：　３４３９−３４４３　（１９８７）；　Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：　２１４−２１８　（１９８７）ＨＢｅｔｔｅｒら、５ ｃｉｅｎｃｅ　２４０：　１０４１−１０４８゜これらの参考文献は、ここに引 用によって、組み込まれる。

抗イデイオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合位に一般に結合し ている独特の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、同じ種及び遺伝子常用 のタイプのもの（例：マウスの株）の動物を、ｍＡｂのソースとしてそれに対す るａｎｔｉ　−Ｉ　ｄが作られつつあるｍＡｂで免疫することにより調製するこ とができる。免疫された動物は、イディオタイプの決定基（ａｎｔｉ−Ｉｄ抗体 ）に対する抗体を産生ずることにより、免疫抗体のイデオタイブの決定基を認識 し、それに応答する。

抗−Ｉｄ抗体は、また、さらに他の動物における免疫応答を誘起して、いわゆる 抗−抗−Ｉｄ抗原を産生ずる「免疫原」として用いることもできる。この抗−抗 −Ｉｄは、抗−Ｉｄを誘起した元のｍＡｂに、エピトープ的に同一でありうる。

かくして、ｍＡｂのイディオタイプの決定基に対する抗体を用いることにより、 同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することができる。

したがって、本発明のＧＲＢタンパク質に対して産生したｍＡｂｓはＢ　Ａ　Ｌ 　Ｂ　／　ｃマウスのごとき適当な動物中で抗−Ｉｄ抗体を誘起するために用い ることができる。そのような免疫されたマウスからの牌細胞は抗−ＩｄｍＡｂｓ を分泌する抗−Ｉｄハイブリドーマを産生ずるために使用される。さらに、この 抗−ＩｄｍＡｂｓはｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔヘモシアニン（ＫＬＨ）のよ うな担体に結合せしめて、さらなるＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを免疫するこ とができる。これらのマウスからの血清は、ＧＲＢタンパク質のエピトープに特 異的な元のｍＡｂの結合性能（結合能）を有する抗−抗−Ｉｄ抗体を含むであろ う。

この抗−ＩｄｍＡｂｓは、かくして、それら自身のイディオタイプのエピトープ 、すなわち、ＧＲＢプロティン−αのような評価さるべきエピトープに構造的に 類似した「イディオトープ」を有する。

「抗体Ｊなる用語は、また、完全な分子はもとより、例えば、抗体に結合するこ とができるＦａｂ及びｆ’　（ａｂ′）ｚのような、その断片（フラグメント） をも含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ′）ｘフラグメントは、完全抗体 のＦｃフラグメントを欠き、環化（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）からより早（解き 放たれ、そして、完全抗体よりもより少ない非特異的組織結合能を有することが できる（　Ｗａｈ　ｌら、Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、　２４：　３１６−３２ ５　（１９８３））。

本発明に有用なＦａｂやＦ　（ａｂ′Ｌ及びこれらの抗体の他のフラグメントは 、本明細書において、完全抗体分子について開示された方法に従って、ＧＲＢタ ンパクの検出及び定量に使用することができる。このようなフラグメントは、通 常、パパイン（Ｆａｂのフラグメント類を産生ずる）又はペプシン（Ｆ　（ａｂ ′）ｚのフラグメント類を産生ずる）のような酵素を用いる、タンパク分解によ る開裂によって産生される。

抗体は、もしそれがある分子と特異的に反応して、それにより、該抗体に該分子 を結合させることができる場合に、該分子に「結合能を有する」と言われる。「 エピトープ」なる用語は、抗体によって認識もされつる、抗体によって結合され る分子のその部分のことを言うことを意味する。エピトープすなわち「抗原決定 基」は、通常、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面群からな り、特定の三次元構造特性と特定の電荷特性を有する。

「抗原」は、抗体によって結合されることができる分子又は分子の部分であり、 それは、さらに該抗原のエピトープに結合可能な抗体を産生ずるように動物を誘 起することができる。抗原は、一つ又はそれ以上のエピトープを有することがで きる。上述した特異的反応とは、該抗原が、高度に選択的な形で、その対応する 抗原と反応はするが、他の抗原によって誘発されつる他の抗体の多くのものとは 反応しないことを示すことを意味する。

本発明において有用な、抗体もしくは抗体のフラグメントは、ＧＲＢプロティン を発現する細胞の存在を定量的又は定性的に検出するために用いることができる 。これは、光学顕微鏡による測定、フローサイトメトリーによる測定又は蛍光分 析による測定と一緒に、蛍光標識抗体（以下参照のこと）を用いる免疫蛍光技術 によって達成される。

本発明において有用な抗体（又はそのフラグメント類）は、ＧＢＲプロティンを その場で（ｉｎ　５ｉｔｕ）検出するために、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡的分 析におけるように、組織学上使用することができる。その場でのＧＲＢプロティ ンの検出は、患者から組織標本を取り出してそのような標本に本発明の標識抗体 を合わせることにより達成することができる。これらの抗体（又はフラグメント ）は、生物学的試料に標識抗体（又はフラグメント）を塗るか、積層することに よって提供するのが好ましい。そのような手法を使用することにより、ＧＲＢプ ロティンの存在だけでなく、試験された組織におけるその分布をも検出すること ができる。本発明を用いるに当って、当業者は、そのような、その場での検出を 達成するために広汎な組織学的方法（例えば、染色方法）を修正することができ る。

ＧＲＢプロティンのかかる試験法は、通常、ＧＲＢプロティンを同定することが できる検出可能なように標識化された抗体の存在化で、生物学的流体、組織抽出 物、リンパ球もしくは白血球のごとき新たに摂取された細胞又は組織培養でイン キュベートされた細胞のような生物学的試料をインキュベートし、数多（の周知 技術のいずれかによって該抗体を検出することを特徴とする。

生物学的試料は、ニトロセルロースのような固体相支持体又は細胞、細胞粒子又 は溶解性プロティン類を不溶化することができる他の固体支持体によって処理す ることができる。該支持体は、次に、非結合抗体を除去するために、緩衝液で二 度洗浄することができる。該固体支持体上の結合標識の量を、次に、従来法を用 いて検出することができる。

「固相支持体」とは、抗原又は抗体と結合することができるものならいかなる支 持体であってもよい。周知の支持体もしくは担体には、ガラス、ポリスチレン、 ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然 もしくは修飾セルロース、ポリアクリルアミド、はんれい岩（ｇａｂｂｒｏ）及 びマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的に照らして、ある程度 溶解してもよ（、あるいは、不溶性であってもよい。この支持体の材料は、結合 した分子が抗原又は抗体を結合することができるかぎり、実際上、いかなる可能 な構造上の形態をとってもよい。かくして、支持体の形状は、ビーズのように球 形であってもよ（、あるいは、試験管の内側壁又はロッドの外壁のようにシリン ダー状であってもよい。さらには、表面は、シート、試験片等々のごとく、平坦 であってもよい。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。

当業者ならば、抗体又は抗原を結合するための他の多くの適当な担体を知ってい るであろうし、日常的実験によってそれを確認することができるであろう。

抗−ＧＲＢ−１及び抗−ＧＲＢ−２抗体の与えられたロットの結合活性は、周知 の方法によって測定することができる。当業者は、日常的な実験を用いて各測定 用の操作上の最適条件を決定することができるであろう。

洗浄、攪拌、ｉｎｎ、３濾過等のごとき他の操作を、個々の場合、通常行オつれ るごとく、あるいはまた、必要に応じて、試験法に付加することかできる。

ＧＲＢ特異性抗原が検出可能であるように標識化できる一つの方法は、それを酵 素に結合させて、酵素免疫試験法（Ｅ　Ｉ　Ａ）において使用することである。

この酵素は、次に、後にしかるべき基質に触れた場合、該基質と反応して、例え ば分光光度測定法、蛍光測定法あるいは、肉眼による方法によって検出できる化 学的部分を生成する。抗体を検出可能なように標識するために用いることができ る酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコツヵル・ヌクレアー ゼ、デルタ−５−ステロイド・イソメラーゼ、イーストアルコール・デヒドロゲ ナーゼ、アルファーグリセロホスフェート・デヒドロゲナーゼ、トリオースホス フェート・イソメラーゼ、ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホ スファターゼ、アルパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ベーターガラク トシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホ スフェート・デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステ ラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。検出・測定は、酵素 に対する色原性基質を用いる比色測定法によって遂行することができる。測定は 、また、基質の酵素反応の程度を同様に調製された標準と目視比較することによ ってもなされる。

検出は、種々の他の免疫試験法のいずれかを用いて行うことができる。例えば、 放射能で抗体又は抗体のフラグメントを標識化することにより、ラジオイムノア ッセイ（ＲＩ　Ａ）を用いてＲ−ＰＴＰａｓｅを検出することができる。ＲＩＡ についての良き記述は、Ｗｏｒｋ、　Ｔ、Ｓ、ら、Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ 　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ＮＹ（１９７ｇ）によるＬａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉ ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ中に見出すことができる。特に、ここに 参考文献として包含せしめる、Ｃｈａｒｄ、　Ｔ、による「ラジオイムノアッセ イ及び関連技術の紹介（Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉ ｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）Ｊを 参照のこと。ラジオアイソトープは、ガンマ−計数器又はシンチレーション・カ ウンターを用いるような手段あるいはオートラジオオートグラフィーによって検 出することができる。

抗体は、蛍光化合物によって標識することもできる。蛍光によって標識された抗 体をしかるべき波長の光に曝すと、その存在は、蛍光によって測定することがで きる。最も普通に用いられる蛍光標識化合物の中には、フルオレセイン・イソチ オシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシ アニン、０−フタルアルデヒド及びフルオレスカミンが含まれる。

抗体は、また、それを化学発光性化合物と結合させることによっても検出可能な ように標識化することができる。化学発光部分をぶら下げた抗体の存在は、次に 、化学反応の過程で発生する発光（ルミネッセンス）の存在を検出することによ り測定される。特に有用な化学発光性標識化化合物の例は、ルミノール、イソル ミノール、テロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）　・アクリジウム・エステル 、イミダゾール、アクリジウム塩及びシュウ酸エステルである。

同様に、生物発光性化合物も、本発明の抗体を標識するために用いられる。生物 発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、生物学的な系の中に見出される一 種の化学発光（Ｃｈｅｎ＋ｉｌｕｍｉｎｅｓｅｅｎｃｅ）であり、この場合、触 媒のプロティン（酵素）が化学発光反応の効率を高める。生物発光性プロティン は、ルミネッセンスの存在を検出することによって測定される。標識の目的に重 要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びニーフォリン（ａ ｅｑｕｏｒｉｎ）である。

本発明の抗体分子は、［二部値（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）　Ｊ法もしくは「サンドイ ッチ」法としても知られる免疫測定試験に利用するために適合させてもよい。典 型的な免疫測定試験法においては、非標識化抗体（又はその抗体のフラグメント ）の多（を固体支持体に結合させ、検出可能なように標識された溶解性抗原の一 定量を加えると、固相支持体、抗原及び抗体の間に形成される三成分系コンプレ ックスの検出及び／又は定量ができる。

典型的で、かつ、好ましい免疫測定試験法は、固体相に結合していた抗体を先ず 、テストされるべき試料と接触せしめ、二成分系固相抗体−抗原コンプレックス を形成することにより、試料から抗原を抽出する前進試験じｆｏｒｗａｒｄ　ａ ｓｓａｙ”）を含む。適当なインキュベーション時間の後、固体支持体を洗浄し て、もし存在するならば未反応抗原を含む、流体試料の残部を除去し、次に未知 量の標識抗体（それは「リポータ分子」として働（）を含む溶液と接触せしめる 。標識化抗体をして、非標識抗体を介して固体支持体に結合された抗原と複合体 を形成せしめるための第二のインキュベーション時間の後、固体支持体を再び洗 浄して、未反応の標識抗体を除去する。

本発明の抗原についても有用でありうるもう一つの型の「サンドウィッチ（”ｓ ａｎｄｗｉｔｃｈ”）法」においては、いわゆる同時試験法（ｓｉｍｕｌｔａｎ ｅｏｕｓ　ａｓｓａｙ）と逆試験法（ｒｅｖｅｒｓｅ　ａｓｓａｙ）が用いられ る。同時試験法は、固体支持体に結合した抗体と標識抗体を同時に試験さるべき サンプルに添加するため、単一のインキュベーションステップを要する。インキ ュベーション終了後、固体支持体を洗浄して流体試料及び複合体を形成しなかっ た標識抗体を除去する。固体支持体と合金した標識抗体の存在を、次に、従来の 前進（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドウィッチ試験において、そのまま測定する。

逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）試験法においては、段階的添加が行われる。すなわち、先 ず流体試料への標識の溶液の添加とそれに続く、適当なインキュベーション時間 の後固体支持体に結合した非標識抗体の添加が行われる。第２のインキュベーシ ョンの後、固体相を従来のやり方で洗浄して試験されるべきサンプルの残りと、 未反応標識抗体の溶液を除く。固体支持体と結合した標識抗体の測定は同時（ｓ ｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）試験法及び前進（ｆｏｒｗａｒｄ）試験法におけるよ うにニトロセルロース・フィルター上に不溶化された、ＳＨ２領域を含むプロテ ィン（タンパク質）に対するＥＧＦＲのＣ末端領域の結合の検出可能性を測定す るために研究を行った。この目的のために、細菌によって発現された融合プロテ ィンへのＣ−末端領域の結合について調べた（Ｆｉｇ、　１、参照のこと）。

Ａ、ＥＧＦＲのカルボキシ　＠３ＪＡＥ、の　とユ・チロシンキナーゼ領域とカ ルボキシ末端領域を含むＥＧＦＲの細胞内部分を、先に述べた様に、ヒトＥＧＦ Ｒの細胞内領域に相補的なｃＤＮＡを発現した組換えバキュロウィルスから精製 した（Ｈｓｕ、　Ｃ，Ｙ、ら、Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅ ｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉ：　１９１−２００（１９９０））。この組換えプロティ ン（２℃１ｇ）を、次に、〔ガンマ−”Ｐｌ　ＡＴ　Ｐ　（２００ｐＣｉ　、　 ６．０００Ｃｉ／Ｍｍｏ７）を用い、４℃で、５ｍＭＭｎＣ１ａを含む、ＨＮＴ Ｇ　（２００ｍＭＨＥＰＥＳ。

ｐＨ７，５，１５０ｍＭＮａＣ１，０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００及び１ ０％グリセリン）緩衝液中でリン酸化した。導入されなかった［γ−３２Ｐｌ　 ＡＴＰを除去するために、１００μｇのＢＳＡを含むｐＨ７，５の２０ｍＭＨＥ ＰＥＳで１１１ｄｌにまで稀釈し、次いで、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　−１０中で５ ０−の体積にまで濃縮した。この操作を３回繰返すと、９９％を超える未導入Ａ ＴＰが除去された。キナーゼ領域からＣ−末端領域を分離するために、濃縮され たプロティンを、次に、シアノーゲン・プロミド（臭化シアン、ＣＮＢｒ）で、 ７０％ギ酸中、１４時間、室温で消化した（下記例Ｖｌも参照のこと）。次いで 、サンプルを３回水洗、乾燥し、結合用緩衝液中、２　ｘ　ｌ　Ｏｓｃｐｍ／− になるように再懸濁させた。

Ｂ、ニトロセルロース　にＸ′　された　によって　されたＴｒ　Ｅ　ＧＡＰ− ＳＨ２虫Ａプロティンへの、ＥＧＦＲのＣ惺櫨Ω積合 ＴｒｐＥ及びＴｒｐＥ／ＧＡＰ−３Ｈ２を、Ｄｒ、　Ｔｏｎｙ　Ｐａｗｓｏｎの 研究室から得、そして、以前に述べたようにして調製した（Ｍｏｒａｎ。

Ｍ、　Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７ ：　８６２２−８６２６　（１９９０））。

フィルターへの結合の研究を、発表された方法（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｗ、Ｊ 。

ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７６：　５５７７−５ ５８１　（１９７９）；　Ｄａｎｉｅｌ。

たものに従って行った。種々の濃度の、細菌によって発現したＴｒｐＥ融合プロ ティンか、あるいは、細菌のプロティン単独をニトロセルロースのフィルターに スポットした。５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ　ドライミルクを含むＰＢＳ中、４℃で 、１時間フィルターをブロックしたのち、ＥＧＦＲの、２Ｐ−標識Ｃ末端領域を 添加し、−晩、４℃でインキュベーションを続けた。２４時間後、ニトロセルロ ース・フィルターを、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００を含むＰＢＳで、室 温で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、−８０℃でＫｏｄａｋ　Ｘ　Ａ　Ｒ− ５フイルムに曝した。

Ｃ１給釆 上述の方法は、５ｎｇ未満の細菌によって発現されたＧＡＰ−３Ｈ２融合タンパ ク質に対するＥＧＦＲＣ末端領域の特異的結合の検出を可能にした。結合は特異 的である。というのは、プローブのチロシンリン酸化を必要としたし、関係がな いプロティンをニトロセルロース・フィルターに塗布しても何も起きなかった。

ＥＧＦＲＣ末端領域が、ニトロセルロース・フィルター上に不溶化された５Ｈ− ２含有プロテインは対し、特異的結合することが出来たという事実は、本発明者 らを、元気づけて、本研究をラムダｇｔｌ１発現ライブラリーへ応用させんとし 、新規なＥＧＦＲ結合性プロティンの同定を最終目的にしている。

伝ユ なＳ　Ｈ２−プロティンをコード　るｃＤＮＡクローンのライブラリーのスクリ ーニングと ＥＧＦＲのチロシンリン酸化Ｃ−末端尾部を、上述したいくつかの異ったヒト組 織からの発現ライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いた。

スクリーニングの手法は、Ｆｉｇ、　２にまとめである。この手法を用いて多く の陽性のクローンが、今までに同定されているが、そのうちで二つを詳細に解析 した。

Ａ、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングラムダｇ　ｔ　Ｌ　ｌ　（ｌａｍｂ ｄａ　ｇｔ　１１）すなわちヒト脳幹から単離されたｍＲＮＡから構成されるラ イブラリーをＭ、　Ｙａｙｅから入手した。このライブラリーなスクリーニング するため、ラムダｇｔｌｌファージを、１５０ｍｍの寒天プレート当り４Ｘ１０ ’プラークが産生されるに充分な密度で、塗り付けた。全部で６つのプレートを 最初にスクリーニングした。これらのプレートを６時間４２℃でインキュベート した後、これらのプレート上に、先に述べられたようにして（ＭａｃＧｒｅｇｏ ｒ、　Ｐ、Ｆ、ら、垣姐話匹”４：　４５１−４５８　（１９９０））　、イソ プロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で含浸しておいたニト ロセルロースフィルターを重ねた。インキュベーションを、３７℃で一晩続けた 。次に、フィルターをとり出し、ｔＢＳＴ（１０ｍＭトリス−Ｈｃｔ、ｐｕｓ、 １５０ｍＭＮａＣ１及び０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００）で、室温で洗浄 し、次にＨＢＢ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，５，５ｍＭＭｇ／Ｃ１，１ｍ ＭＫＣ１）緩衝液（５％のカーネーション・ドライ・ミルクを含む）で、１時間 、４℃で上に述べたようにして（上記ＭａｃＧｒｅｇｏｒらの文献）、洗浄した 。ブロッキングに続いて、標識化チロシンリン酸化カルボキシ末端（Ｃ−末端） プローブを１．６Ｘ１０−’μｇ／−の濃度で添加し、インキュベーションを一 晩続けた。フィルターを、次に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００を含むＰＢＳ 中、室温で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、−８０℃でにｏｄａｋＸＡＲ− ５フイルムに曝した。

陽性のクローンに相当する寒天ブラッグをプレートから集め、それを３Ｍ培地１ −中に入れた。寒天からファージを拡散せしめた後、ファージを再塗布し、上述 したようにして再スクリーニングした。次のスクリーニングで豊富化（ｅｎｒｉ ｃｈｍｅｎｔ）を示したファージを単離し、配列を決めた。ラムダｇｔｌｌファ ージＤＮＡは、Ｍａｎｉａｔｉｓらに従ってプレート・ライセード法で単離し、 ＥｃｏＲＩ−消化Ｍ　１３　Ｍ　Ｐ　１９　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８８） 　へサブクローニングした。単鎖ＤＮＡを単離し、５ｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｄ　Ｎ 　Ａ配列決定キット（Ｕ、Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、ジデオキシ鎖終了法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃ ｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）によって配列を決めた。

一つの実験においては、ヒト脳幹ラムダｇｔｌｌライブラリーからの２４０，０ ＯＯｐｆｕをスクリーニングした。単一のプラーク、クローンｋ　ｉ　４　（Ｆ ｉｇ、　３　Ａ）を単離した。次のスクリーニングで、このクローンは集積（ｅ ｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を示し、第３回目のスクリーニングで全てのプラークがプ ローブに結合した（Ｆｉｇ、　３　Ｂ　）。Ｃ１ｏｎｅｋｉ４は、約９００個の ヌクレオチドの挿入物を含み、この挿入物は、Ｉ　ＰＴＧを用いて、劣且旦プロ モーターを誘発すると、ＥＧＦＲに結合可能な融合プロティンを産生した。融合 プロティンのサイズ（大きさ）から、ｃＤＮＡ挿入物が約３００個のアミノ酸の プロティン（このサイズは、もしもｃＤＮＡが単一の大きなオーブンリーディン グフレームを含んでいるならば予想された大きさである）をコードしていること が予想された。クローンｋｉ４をより詳しく分析するために、ＤＮＡを単離し、 ヒトｃＤＮＡ挿入物（インサート）に相当するＥｃｏＲＩフラグメントをＭ１３ 中にサブクローニングし、配列を決めた。このインサートからの配列の翻訳によ れば、単一の大きなオーブンリーディングフレームが示され、これは、シーンバ ンクのデータベースによれば、他の公知のプロティンのＳＨ２領域と同一の配列 を有する約１００個のアミノ配の単一鎖を含むことが判った（Ｆｉｇ、　４及び ５Ａ）。か（して、このスクリーニング法を用いて、ＥＧＦＲに結合可能な、新 規なＳＨ２含有プロティンが同定された。

Ｂ、”’　ｃＤＮＡの 単離された最初のクローンはＳＨ２領域をコードしていたが、遺伝子の３′又は ５′端末を含んでいなかった。完全長のｃＤＮＡを単離するために、ライブラリ ーを、初期の陽性ファージから単離されたＤＮＡを用いて再スクリーニングした 。陽性のクローンを発現した組換えＭ１３バクテリオファージからのＤＮＡを、 Ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ、すなわちＴａｑＩポリメラーゼ及びＭ１３ベクト ルのＥｃｏＲＩフランキング領域に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて増幅し た。情報（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）中により多（の５′配列を含むクローンを 得るために、最初の単離されたファージの最も多い５’　２５０ヌクレオチドに 相当する第２の増幅ＤＮＡ生成物が、またこの領域の両端における配列に相補的 なオリゴヌレオチドを用いても生成せしめられた。［３！ｐｌ−標識化ＤＮＡプ ローブが、次に、この増幅生成物のニック翻訳によって調製された。

ｃＤＮＡライブラリーな再スクリーニングするために、このライブラリーを上述 の様にして再塗布した。プレートを３７℃で８時間インキュベートしたのち、プ レートを１時間４℃に冷却、次いでファージＤＮＡをニトロセルロースフィルタ ーに移した。フィルターを０．２Ｎ　ＮａＯＨと１．５Ｍ　ＮａＣ１の溶液中で 変性させ、次いで、減圧下、２時間、８０℃で焼いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ 。

ら、　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍ ａｎｎａｌ、　２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９））。

このフィルターを、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションに付した後、３ ２ｐ−標識ＤＮＡプローブを添加し、ハイブリダイゼーションを４２℃で一晩、 ５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄ　’　ｔ、５０％ホルムアミド、５ｘｓｓｃ、０．１％ ＳＤＳ、２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　、ｐＨ７，６及び１００μｇ／−のサ ケ精子ＤＮＡを含む溶液中で続けられた。これらのフィルターを、次いで、Ｏ， ｌＸ５ｓｃ及び０．　１％ＳＤＳを含む溶液中で洗浄し、軟焼し、そして、Ｋｏ ｄａｋ　Ｘ　Ａ　Ｒ−５フイルムに一７０℃で曝した。次いで、陽性クローンを 単離し、上述のようにして配列を決めた。

クローンｋｉ４からのインサートは、遺伝子の３′及び５′末端を欠いていたた め、ライブラリーを、クローンｋｉ４からのＤＮＡを増幅することによって生成 した二つのＤＮＡプローブを用いて再スクリーニングした。この手法は、さらに ５つのクローンの同定を可能にした。

これらのクローンのうち三つが最初のクローンｋｉ４がら３′伸長しており、そ れらのうち二つ、すなわち、クローンｋｉ２．２及びｋｉ２．４ポリアデニル化 のシグナル及び長い３′非翻訳領域（＞１，０００ヌクレオチド）を含んでいた 。さらに、これらのクローンは、第２のＳＨ２領域を含むプロティンをコードし ていた（Ｆｉｇ、　４及び５Ａ）。

他二つのクローン、すなわち、ｋｉ３．０及びｋｉ５．３は、クローンｋｉ４か ら５′伸長していた。両クローンは、長いオーブンリーディングフレームとＫｏ ｚａｋによって定義された翻訳開始基準に合うＡＵＧコドンを含んでいた（Ｋｏ ｚａｋ、　Ｍ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０８：２２９−２４１　 （１９ｇ９））。しかしながら、クローンｋｉ３．０だけが、プロティンに翻訳 され、シーンバンク中の公知の配列と比較したとき、他の公知のプロティン中に 存在するＳＨ３領域に相同な５０のアミノ酸の領域を含んでいることが見出され た。重複クローン、ｋｉ２．２及びｋｉ３．０によってコード化された完全長プ ロティンの予想された分子量は、約８．４ｋＤａであった。この新しいプロティ ンをＧＲＢ−１と名付けた。

肛 ＧＲＢ−１プロテインは、ＳＨ２び５Ｈ３６を　んでい虹 ＧＲＢ−１プロテインの配列を、シーンバンクのデータベース中の配列と比較し て分析したところ、アミノ酸３３３及び６２４のところから発する、約１００個 のアミノ酸から成る２本の伸長鎖（ｓｔｒｅｔｃｈ）の存在が明らかとなったが 、これらは、ＥＧＦＲと相互作用することが知られている他のプロティンのＳＨ ２領域と配列の相同性を示していた（Ｆｉｇ、　５　Ａ　）。ＧＲ，Ｂ−１は、 プロティンのレベルでは、他のＳＨ２領域に驚くべき相同性を示したが、ＤＮＡ レベルでは、有意な相同性は明らかにならなかった。ＧＲＢ−１は、また、Ｎ− 末端領域に位置し、５０個のアミノ酸のセグメントを含んでおり、このセグメン トはＳＨ３領域に対する配列の相同性を有していた（Ｆｉｇ、　４及び５Ｂ）。

ＧＲＢ−１の構造的機構の、いくつかの他のＳ　Ｈ２／Ｓ　Ｈ３含有プロテイン との比較をＦｉｇ、　６に示した。この模式図から明らかなように、ＳＨ２及び ＳＨ３領域の極在化は、プロティン毎に異る。このことにもかかわらず、これら のＳＨ２含有含有プロン４２間、ある類似性と相違が存在する。ＧＲＢ−１は、 Ｐ　Ｌ　Ｃ−ｇａｍｍａ及びＧＡＰのようなＥＧＦＲと相互作用することが判っ ているいくつかの他の基質と、ＧＲＢＩが２つのＳＨ２領域と一つのＳＨ３領域 を含んでいるという点で相似ている。しかしながら、これらの基質とちがって、 ＧＲＢ−１は、公知の触媒の領域には相同性を示さず、この点でａｖｉａｎ　ｓ ａｒｃｏｍａウィルス、ｖ−ｃｒｋによってコード化されたプロティンに似てい る。

これらの領域以外では、シーンバンクにある他のプロティン配列どは何らの配列 の相同性はなかった。特に、ＧＲＢ−１は、ＡＴＰ−結合共通領域を欠いており 、セリン／トレオニン・キナーゼ又はチロシン・キナーゼと配列上の相同性を示 さなかった。

このＳ　Ｈ２領域は、それによって酵素学的に明白なシグナル分子がチロシンキ ナーゼ活性を有する活性化レセプターに結合しつる共通のモチーフを与えるもの と考えられている（Ｍｏｒａｎ、　Ｍ、Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：　８６２２−８６２６　（１９９０）；　Ａ ｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｄ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５０：　９７９−９８２　（１９９０））。

ＧＲＢ−１中（Ｆｉｇ、　４　）及びＧＲＢ−２中のＳＨ２領域の存在は、この 領域が、ＥＧＦＲのＣ−末端尾部とこれらのプロティンの相互作用を仲介してい るという点で、この領域の重要性を強調する。さらには、チロシン・レセプター （受容体）と相互作用することができる多くのプロティンが同定されていること から、このことは、このプロティンのファミリーのさらなるメンバーが発見され るであろうことを示唆している。

ＧＲＢ−１は、２つのＳＨ２領域を含んでいる他に、ＳＨ３領域をも含んでいる 。ＳＨ３領域は、多くのＳＨ２含有プロティンに共通に見られる、約５０個のア ミノ酸からなる非触媒領域である。ＳＨ３領域は、スペクトリン（ｓｐｅｃｔｒ ｉｎ）やフォトリン（ｆｏｄｒｉｎ）のような細胞骨格タンパク質中にも見出さ れているので、この領域の機能は、これらのタンパク質を、それらが（ＳＨ３領 域が）他の分子と相互作用するであろう膜もしくはザブメンプランの細胞骨格に 、極在化させんとする点にあり得る。

ＧＲＢ−１の推定されるアミノ酸配列を、ａｖｉａｎ　ｏｎｃｏｇｅｎｅｖ　− １且ニブロチインから構成されるタンパク質をコードするＰ　４７　Ｍ　ｍ　Ｋ 　−ｅ　ｒ　ｋプロティンは公知の触媒領域とは相同性がない。しかしながら、 Ｐ　４７　Ｋ　＠　ｌ−Ｃｒ　１１で形質転換されたニワトリ胚繊維芽細胞は、 高いレベルのホスホチロシン含有タンパク質を示す（Ｍａｙｅｒ。

Ｂ、　Ｊ、ら、上記；　Ｐｒｏｃ、　Ｎ　ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　８７：　２６３８−２６４２（１９９０）；　Ｍａｔｓｕｄａ、　Ｍ、ら、 ５ｃｉｎｅｅ　２４８：　１５３７−１５３９　（１９９０））。

ｖ−ｃｒｋ生成物が、ｖ−ａｒｋ形質形質転換細胞−くつかのホスホチロシン含 有プロティンを結合させることが示されているからには、ｃ−ｃｒｋの機能は、 おそらく、キナーゼと基質の橋渡しをすることであろう。この点で、ＧＲＢ−１ が、ＧＡＰ及びＰＬＣ−ガンマと同様に、二つのＳＨ２領域を含み、これらの組 合せが、他のプロティンを活性化されたチロシンキナーゼレセプターに結合させ るのに理想的に適しているということは、興味深い。

週■ ＧＲＢ−１のノーザン　逝 Ａ、方払 全細胞性ＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら（上述）によって記載されたグ アニジウムイソシアナート／塩化セリウム法により、サルの組織から調製した。

Ｐｏ　ｌ　ｙ　（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロース・クロマトグラフ ィーによって調製した。ノーザン分析のために、ＲＮＡを１．２％アガロース／ ２．２Ｍホルムアルデヒドゲル中の電気泳動によって大きさ別に分画し、毛細管 作用によってナイロン膜上に移し、８０℃で２時間加熱した。ブレ（予備）ハイ ブリダイゼーションに続き、プロットを、上述のようにして調製した［”Ｐｌ− ニック−翻訳ＤＮＡプローブとハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーショ ンは、４２℃で１晩、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ及び５ 　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓの存在下、行った。膜（メンブレン）を、次に、Ｏ ，ｌＸ５ｓｃ、０．１％ＳＤＳで、４２℃で洗浄し、Ｋｏｄａｋ　Ｘ　Ａ　Ｒフ ィルムに、−７０”Ｃで１２時間、強化スクリーンを用いて曝した。

Ｂ、債里 新たい単離されたｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの発現について試験するために、 クローンｋｉ　１４からのインサートに対応するＤＮＡをプローブとして用いる 、異ったサルの組織のＤＮＡのノーザン・プロット分析によって、検討した多（ の組織中に４．４ｋｂ及び７．０ｋｂの２つの主バンドの存在が示された（Ｆｉ ｇ、　７　）。発現は、脳において最も高く、心臓、肺臓、肝臓及び胸腺は、次 第に低くなって行くレベルの発現を示した。４．４ｋｂのメツセージは、単離さ れたクローンをコードするであろうトランスクリプト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ） の予想された大きさに対応する。多の組織において観察された４、４ｋｂ及び７ ．０ｋｂのトランスクリプトとは対照的に、皮ふは、３．６及び６．６ｋｂの２ つのわずかに小さい大きさのｍＲＮＡを含んでいた。

３．６．６．６及び７．０ｋｂのトランスクリプトは、さらに、ｍＲＮＡのスプ ライスされた形のものを表わしている可能性もあり、また、別個の、しかしなが ら関連するｍＲＮＡの種をコードしている可能性がある。

阿ｙ −ＧＲＢ−１の　びＧＲＢ−１”タンパク　のＡ、万広 ポリクローナル抗体を、最初の単離されたファージ・クローンｋｉ４によって発 現されたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質で、兎を免疫することにより生産 した。Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＧＡＧ　４５６細菌（Ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ の叶、　Ｍｉｃｈａｅｌ　５ｎｙｄｅｒより入手）を、組換えファージｋｉ４で 、感染回数１０で感染せしめ、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を、１．５ 時間後、タンパク質ペレットから回収した。タンパク質抽出物を調製し、６％５ ＤＳ−ゲル上で分離し、融合タンパク質に相当するバンドをゲルから切り取り、 これを免疫に使用する。

ヒトのグリオブラストーマ・セルラインＵ１２４２、ラット膀胱ガン・セルライ ンＮＢＴＩＩ及びＮＩＨ３７３細胞を、１０％の子牛血清を補足したＤＭＥＭ培 地で密集状態になるまで成長せしめた。細胞は、０．５％子牛血清中、［”Ｓｌ −メチオニン（５０ｐｃｉ／ｉ）でラベルし、先に述べられているようにして、 １２時間後に分解した（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、　Ｂ、ら、Ｃｅ１ｌ　５７：　１１ ０１−１１０７　（１９８９１）。プロティンＡ−セファロースにカップリング した抗体１０−で免疫沈殿を行った後、ビーズを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７ ，５，３００ｍＭＮａＣ１，１０％グリセリン、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１０ ０、Ｏ，１％ＳＤＳ及び１％ナトリウム・デオキシコーレートを含む溶液で３回 洗浄した。サンプル緩衝液中で沸とうせしめたのち、タンパク質は、８％５ＤＳ −ゲル上で分離した。

Ｂ、■ ポリクローナル抗体が、最初の単離されたファージによって発現されたβ−ガラ クトシダーゼ融合タンパク質に対して誘起された。

生合成的に標識した細胞を用いる免疫沈殿実験によれば、これらの抗体は、三つ の異ったセルラインにおける８５ｋＤａのタンパク質を認識したことが明らかと なった（Ｆｉｇ、　８、“工”と指定されたレーン）。この抗血清による８５ｋ Ｄａタンパク質の認識は特異的である。というのは、プレ免疫血清はこのタンパ ク質を認識しなかったからである（“Ｐ”と指定されたレーン）。これらの結果 は、クローン化ＧＲＢ−１のアミノ酸配列に基づ（予測された分子量に支持を与 えた。

Ｃ９挾… ＧＲＢ−１の遺伝子は予想された分子量８５ｋＤａを有するタンパク質をコード するという知見並びに、ＧＲＢ−１に対する抗体が三つの異ったセルラインから の８５ｋＤａタンパク質を免疫沈澱せしめたという事実は、ＧＲＢ−１が、以前 、活性化成長因子のレセプター（受容体）、すなわちｐ８５と会合（結合）する ことが以前から示されている特定のタンパク質を代表することができることを示 唆している。ｐ８５の正確な機能（役割）は未知であるが、それは、おそらく、 ホスファチジルイノシトール（ＰＩ３）−キナーゼであると思われる。というの は、ＰＩ３−キナーゼ活性が刺激されたＰＤＧＦならびに中央Ｔ−抗原（ＭＴＡ ｇ）−転換細胞中で見出された８５ｋＤａタンパク質と同時に共に精製された（ Ｋａｐｌａｎ、　Ｄ、Ｒ。

ら、Ｃｅ１ｌ　５０：　１０２１−１０２９　（１９８７）；　Ｗｈｉｔｍａｎ 、　Ｍ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：２３９−２４２　（１９８５）；　Ｃｏｕ ｇｈｌｉｎ、　Ｓ、Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：　１１９１−１１９４（ １９８９）　）。ＡＴＰ結合部位の欠除は、ＧＲＢ−１は、おそら（、十中へ九 、ホスホリビッドキナーゼではない。ＧＲＢ−１は、ハツカネズミ及びウシｐ８ ５と９７％配列が一致している。したがって、ＧＲＢ−１は、ｐ８５のヒトのカ ウンターバートである。組換えｐ８５は、活性化ＰＤＧＦＲ又はＥＧＦＲに結合 することはできるが、それ自身本来的なＰＩ３キナーゼ活性を有さない。しかし ながら、ｐ８５は、ＰＩ３キナーゼの触媒としてのサブユニットとなりつる１１ ０ｋＤａのチロシンリン酸化タンパク質と関連を有することが判っている。ＰＩ ３キナーゼとｐ８５間の厳密な関係は知られていないものの、ｐ８５の過大発現 （ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）はＰＩ３キナーゼとＰＤＧＦＲの間の相互作 用を調節する。ｐ８５は、調節サブユニット又は活性化されたレセプターとＰＩ ３キナーゼ間の橋渡しとして働（可能性がある。

皿型 ＥＧＦレセプターのチロシンリン　カルボキシ　ｒはＧＡＰびＰＬＣ−ガンマの ±へ〇亡で　る 以下に述べる研究は、ＰＬＣ−ガンマとＧＡＰ　（ｔｒｐＥ／ＧＡＰ　５Ｈ２） のＳＨ２及びＳＨ３を含む融合タンパク質の結合がＥＧＦＲの自動リン酸化によ って、特異的に制御されていることを確認する。結果が示すところによれば、Ｐ ＬＣ−ガンマのリン酸化は、そのＥＧＦＲとの関係を実際に軽減している。提示 された証拠によれば、ＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２融合タンパ ク質の両者は、ＥＧＦＨのチロシンリン酸化Ｃ−末端に特異的に結合することが 示されている。つまり、これらの結果は、ＳＨ２／ＳＨ３領域がＥＧＦレセプタ ーのホスホチロシン含有領域と直接相互作用することを示している。

Ａ１杯社及１方伝 １、セルライン、′・　レセプター　び　ＡタンパクセルラインＣＤ　ｌ　２６ 　（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、　Ｂ、Ｌ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、　２６４： １０６６７−１０６７１　（１９８９ａ））　、ＨＥ　Ｒ１４、Ｋ　７２１　（ Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、　Ａ、Ｍ。

ら、Ｃｅ１ｌ旦＋　１９９−２０９　（１９８７）；　Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、　Ａ 、Ｍ、ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　７：　４５６７−４５７１　（１９８７））を、それぞれ野生型Ｅ ＧＦレセプター、キナーゼ陰性（ｋｉｎ−）　Ｅ　Ｇ　Ｆレセプター及びＣ−末 端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）截頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）　Ｅ　Ｇ　Ｆレセプタ ーのソースとして用いた。ＥＧＦレセプターの細胞内領域（ＥＧＦＲ−Ｃ）を、 バキュロウィルスの発現システム（Ｈｓｕ、　Ｃ，Ｊ、ら、Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗ ｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ、　１：１９１−２００　（１９９０））から精製した（Ｆ ｉｇ、　９　Ａ　）。３ＴＰ１、すなわちトランスフェクションを受けたＰＬＣ −ガンマのｃＤＮＡを過大に発現するが、ＥＧＦレセプターを持たないセルライ ンをＰＬＣ−ガンマのソースとして用いた（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、　Ｂ、ら、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２４８：６０７−６１０　（１９９０ｂ））。

ＧＡＰ　ＳＨ２領域（ＧＡＰ残基１７１−４４８、Ｆｉｇ、　９　Ｂ　）を含む ｔｒｐＥ融合タ融合タンパ調質については、すでにＭｏｒａｎらによって記載さ れている（Ｍｏｒａｎ、　Ｍ、Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８７：　８６２２−８６２６　（１９９０））。ｔｒｐＥ／ ＧＡＰ　ＳＨ２融合タンパク質を含むバクテリアのライゼートは、１ｇのバクテ リアを３ｍｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，０，５ｍＭＥＤＴＡ、Ｏ，１ ｍＭＰＭＳＦに再懸濁させることによって調製した。１　ｍｇ／−リゾチ−ム及 Ｕｏ、２％ＮＰ−４０中、４℃でインキュベーションを行ったのち、細胞を５秒 間、５回超音波処理し、ライゼートをｔｏ、０００ｇで３０分間遠心することに より清澄にした。バクテリアのライゼートを、上述したような、ブロティナーゼ 及びホスファターゼ阻害剤を含む１％Ｔｒｉｔｏｎリシス（ｌｙｓｉｓ）緩衝液 中で１：１００に稀釈し、プロティンＡ−セファロースで予めクリアにした。

２、　、　゛　び　ブロッティング 次の抗−ＥＧＦＲ抗体（Ｆｉｇ、　９　Ａ　）を用いた。すなわち、（ａ）ｍＡ ｂ　１０８、細胞外領域の領域ＩＴＪ　（ｄｏｍａｉｎｌ［［）に対するモノク ローナル抗体（Ｌａｘ、　１．ら、聾凹Ｊ、　８：　４２１−４２７　（１９８ ９））；（ｂ）残基９８４−９９６に特異的な抗ペプチド抗体ＲＫ２　。

（ｃ）残基１１７６−１１８６に特異的な抗ペプチド抗体Ｃ；及び （ｄ）残基６５６−６７６に特異的な抗ペプチド抗体ＦｔｒｐＥ融合タンパク質 を免疫沈澱させるために、アガロースに結合した抗−マウスＩ　ｇＧ　（Ｓｉｇ ｍａ）に結合したｔｒｐＥに対するマウスのモノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅ ｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）を利用した。免疫プロッティング用には、ｔｒｐＥに対 する兎のポリクローナル抗体を用いた（Ｍｏｒａｎ、　Ｍ、　Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：　８６２２−８６２６ 　（１９９０））、　ＰＬＣ−ガンマを先に述べた兎のポリクローナル抗−ベブ ヂド抗体を用いて免疫プロッティング及び免疫沈澱に付した（Ｍａｒｇｏｌｉｓ 、　Ｂ、ら、Ｃｅ１ｌ　５７：　１１０１−１１０７　（１９８９ｂ））。

手法については、本発明者らの研究室から出たい（つかの文献に記載されている （Ｍａｒｇｏｌｉｓ、　Ｂ、Ｌ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４： 　１０６６７−１０６７１　（１９８９）；蝕旦５７：　１１０１−１１０７　 （１９８９））。刺激されていない細胞を１０％子ウシ血清を含むＤｕｌｂｅｃ ｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地中で密集状態になるまで成育せし め、プロテイナーゼ及びホスファーターゼ阻害剤を含む１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　 −１００リシス用緩衝液中で溶菌する前に１％ウシ胎児血清中で１晩飢餓状態に した。

ＥＧＦレセプターを、プロティンＡ−セファロースに結合した抗体を用いて免疫 沈澱せしめた。レセプター材料をＨＮＴＧ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７，５， １５０ｍＭＮａＣ１，０，１％７ｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００及び１０％グリセリ ン）で洗った後、　５ｍＭＭｎＣｌ　ｍ及び３０７ＪＭＡＴＰを添加することに よって自動リン酸化を誘発した。対照（コントロール）は、Ｍｎ”＋のみと共に インキュベートした。ＨＮＴＧでさらに洗浄したのち、ＰＬＣ−ガンマ−（３Ｔ Ｐ１細胞から）か、細菌の融合タンパク質のどちらかを含むライゼートを添加し た。９０分間結合反応を進行せしめたのち、ＨＮＴＧによる洗浄をさらに３回行 い、そしてサンプルをＳＤＳゲル上に流し、免疫プロッティングに付した。

３、シアン　ＣＮＢｒ ＥＧＦＲ−Ｃを、４℃で、Ｍ　ｎ　Ｃｌ　を及びＡＴＰを用いて、時には、［ｇ ａｍｍａ　−”Ｐ）　ＡＴ　Ｐ　（ＮＥＮ／Ｄｕｐｏｎｔ、６　、　ＯＯＯＣｉ ／　ｍｍｏｉりの存在下でリン酸化した。レセプター調製物を、次に、１００μ ｇＢＳＡを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５中に再懸濁させ、Ｃｅｎｔｒｉ ｃｏｎ　］　Ｏ（Ａｍｉｃｏｎ）中で５０μに濃縮した。次いで、２４０ｄの８ ８％ギ酸を、２粒のＣＮＢｒと共に添加し、サンプルを、窒素雰囲気下、暗所に 、室温で、１４時間保存した。サンプルを乾燥せしめ、５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ　（ Ｓａｖａｎｔｌ中で３日水洗し、次いで１％Ｔｒｉｔｏｎ溶菌用緩衝液中に再懸 濁した。

Ｂ、■ 天然型ＥＧＦＲ及び変異ＥＧＦＲに対するＰＬＯ−ガンマの結合（ｂｉｎｄｉｎ ｇ）について比較を行った（Ｆｉｇ、　９　Ａ　）　。先ず、天然型及びトラン スフェクトされたＮＩ　Ｈ−３Ｔ３細胞からの変異レセプターを免疫沈澱せしめ 、レセプターの免疫沈澱のい（つかを、試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で、ＡＴ Ｐ及びＭｎ”を用いて自動リン酸化せしめた（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、　Ｂ、ら、Ｍ ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０：　４３５−４４１（１９９０ａ＞）　 、　Ｐ　Ｌ　Ｃ−ガンマを過大発現するＮ　Ｉ　Ｈ−３Ｔ３細胞からのライゼー ト（Ｍａｒｇｏｌｉｓ、　Ｂ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４８：　６０７−６１０ （１９９０ｂ）　）を添加し、結合反応を４℃で９０分間進行せしめた。免疫沈 澱をＨＮ　Ｔ　Ｇで洗浄したのち、結合したＰＬＯ−ガンマの量を免疫プロッテ ィングによって調べた。

Ｆｉｇ、　１０に例証されているように、Ｐ　Ｉ−Ｃ−ガンマはチロシンリン酸 化天然型レセプターにのみ結合し、非リン酸化レセプターには結合しなかった。

次に、自動リン酸化（Ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔ、１ｏｎ）の重要性を 検証するために、変異レセプターを用いた２つの研究を行った。最初に調べるべ きことは、Ｃ−末端から１２６のアミノ酸を欠き（ＣＤ１２６、Ｆｉｇ、９Ａ） 、かつ、４つの主要な自動リン酸化部位を欠いた截頭ＥＧＦレセプター（Ｄｏｗ ｎｗａｒｄ、　Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３］ユニ　４８３−４８５（１９８４） ）に対するＰＬＣ−ガンマの結合であった。この截頭レセプターは、おそらくは 、チロシン９９２のところで自動リン酸化された（Ｗａｌｔｏｎ、　Ｇ、Ｍ、ら 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：　１７５０−１７５４（１９９０） 　）。しかしながら、このレベルのチロシンの自動リン酸化にもかかわらず、Ｐ ＬＣ−ガンマの結合は、完全長レセプターに比べて著しく減少した。減少した結 合は、また、２個の自動リン酸化部位を含む６３Ｃ−末端残基を欠く大田変異Ｅ 　Ｇ　ＦレセプターであるＣＤ６３についても観察された。これらの結果は、レ セプターのＣ−末端が、ＰＬＣ−ガンマがＥＧＦレセプターに結合したり、ある いは、ＰＬＣ−ガンマのＥＧＦレセプターへの結合を調節する際に果す役割を示 唆している。

Ｆｉｇ、　１０は、また、ＰＬＣ−ガンマがｋｉｎ−変異レセプターに結合する ことができないことを示している。この点に関する自動リン酸化の重要性を精査 するために、ｋｉｎ−レセプターをＣＤ１２６レセブター（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、 　Ａ、Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８６：　９２５−９２９　（１９８９））と交叉リン酸化せしめた。こ の結果、ＰＬＣ−ガンマの結合は、天然型レベルまで平準化された。このことは 、ｋｉｎ”レセプターのリン酸化は、ＰＬＣ−ガンマへの結合を平準化するに充 分であることを示した。

ｋｉｎ−レセプター単独でも、リン酸化ののちには、ＰＬＣ−ガンマと結合する ことができることを確認するために、このレセプターを、ｍＡｂ１０８には結合 しない可溶性の、バキュロウィルス発現ＥＧＦＲ細胞質領域（ＥＧＦＲ−Ｃ）と 交叉リン酸化せしめた（Ｆｉｇ、　９　Ａ　）。

交叉リン酸化は、ＣＤ１２６変異の場合に比べて強いものではなかったけれども 、Ｋ７２１Ａ変異のチロシンのリン酸化及びＰＬＣ−ガンマの結合は明らかに検 出された。この知見は、ＥＧＦＲのチロシンリン酸化がＰＬＣ−ガンマの結合を 促進することを確認している。

天然型ＥＧＦＲとＰＬＣ−ガンマ間の相互作用におけるＰＬＣ−ガンマのチロシ ンリン酸化の役割りを調べた。チロシンリン酸化ＰＬＣ−ガンマはＥＧＦＲから 、非リン酸化ＰＬＣ−ガンマよりも容易に解離しつる（Ｆｉｇ、　１１　）が、 このことは、チロシンリン酸化ＰＬＣ−ガンマのＥＧＦＨに対するアフィニティ ーが低いことを示している。

これらの知見を、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２領域（Ｆｉｇ、　９　Ｂ　）を含む 融合タンパク質のバキュロウィルスによって発現されたＥＧＦＲ−Ｃへの結合に 関する検討にまで拡げた。完全長ＥＧＦＲ及びＰＬＣ−ガンマの場合のように、 ｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２融合タンパク質領域は、チロシンリン酸化ＥＧＦＲ− Ｃにのみ結合した（Ｆｉｇ、１２Ａ）、ｔｒｐＥタンパク質単独では、ＥＧＦＲ −Ｃに結合しなかった。同様に、リン酸化ＥＧＦＲ−ＣはｔｒｐＥ／ＧＡＰ　Ｓ Ｈ２にのみ結合した。しかしながら、非リン酸化ＥＧＦＲ−Ｃの非特異的結合は 高い（Ｆｉｇ、　１２Ｂ）。これらの結果は、ＥＧＦＨの結合部位がその細胞内 領域に位置することを示している。

一般に、ｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２融合タンパク質は、ＰＬＣ−ガンマよりもよ り高い化学量論で、完全長のＥＧＦＨに結合した。

しかしながら、この融合タンパク質はＥＧＦＲによってチロシンリン酸化がなさ れなかった。ｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２タンパク質は、ＣＤ１２６欠失変異体（ Ｆｉｇ、　ｌ　３　Ａ）に比べて、リン酸化完全長レセプターに対し、はるかに 良い。Ｆｉｇ、　１３　Ｂに示されるように、ＥＧＦＲ−Ｃによるｋｉｎ−完全 長ＥＧＦレセプターの交叉リン酸化によって、それがｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２ タンパク質に結合できるようになった。

対照群においては、ＥＧＦＲ−Ｃは、おそらくは、このレセプターがすでに最大 限にチロシンがリン酸化されているためであろうが、ＣＤ１２６レセブターへの 結合能を向上させないことが示された。また、ＥＧＦレセプター（Ｆｉｇ、　１ ３　Ｂ　）を含まない細胞からのｍＡｂ１０８免疫沈澱の存在下でＥＧＦＲ−Ｃ を試験したところ、結合は観察されなかった。このことは、ＥＧＦＲ−Ｃの効果 は、セファロースに対するチロシンリン酸化ＥＧＦＲ−Ｃの非特異的結合のせい ではあり得ないことを示している。これらの研究は、結合を仲介する際の自動リ ン酸化の重要性を確認し、かつ、ＥＧＦレセプター結合については、ＧＡＰ　Ｓ Ｈ２領域は、そのままのＰＬＣ−ガンマに類似した挙動を示すことを示している 。

ＣＤ１２６欠失変異体に対する弱い結合は、分子中の結合部位の少なくとも一部 分がＣ−末端にあることを示唆している。レセプターの全体の立体配座（ｃｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に対するこの欠失の効果、おそら（は、アロステリックな 効果を除外することはできなかった。したがって、ＰＬＣ−ガンマ及びｔｒｐＥ ／ＧＡＰ　ＳＨ２のＥＧＦＲのＣ−末端フラグメントへの結合を調べた。ＥＧＦ Ｒにおいては、大抵のＣ−末端メチオニン残基は９８３位に見出される。したが って、ＣＮＢｒ分解は、すべての公知のリン酸化部位を含む２０３のアミノ酸フ ラグメントを生成する。このタンパク質フラグメントは、ＥＧＦＲＣ−末端に特 異的な抗体、すなわちアンチ−Ｃ（Ｆｉｇ、９Ａ）によって認識される。

このＣ−末端フラグメントを特異的に免疫沈澱に付し、チロシンをリン酸化する と、それは、ＰＬＯ−ガンマ及びｔｒｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２融合タンパク質に結 合した（Ｆｉｇｕｒｅ１４）。ＣＮＢｒ分解は完全であった。したがって、結合 の原因となりつる完全長のＥＧＦＲ−Ｃは、タンパク分解の後では検出できなか った。繰り返すが、非リン酸化Ｃ−末端ＣＮＢｒフラグメントに対する結合は見 られなかった。ＥＧＦＲ−ＣのＣＮＢｒ分解は、また、抗体Ｆによって同定され た９７個のアミノ酸のＮ−末端ペプチドを生成した（Ｆｉｇ、９Ａ、ＥＧＦＲ残 基６４５−７４２）。抗体Ｆによって免疫沈澱されたこのフラグメントは、ｔｒ ｐＥ／ＧＡＰ　ＳＨ２と結合しなかった。さらに、ＥＧＦＲ−Ｃを［ｇａｍｍａ 　−”Ｐｌ　ＡＴＰを用いて自動リン酸化し、５ｉｐ−標識化ＣＮＢｒ　Ｃ−末 端フラグメントが生じた。Ｆｉｇ、　ｌ　５に示されているように、このフラグ メントはｔｒｐＥ／ＧＡＰ　Ｓ　Ｈ２融合タンパク質に結合したが、ｔｒｐＥに は結合しなかった。総括すると、これらの知見から、チロシンリン酸化Ｃ−末端 への直接結合は少なくとも部分的には、ＥＧＦＲへのＳＨ２及びＳＨ３領域タン パク質の特異的結合に寄与していることが示される。

Ｃ１挾尉 総合して考えると、上記の知見及びいくつかの付加的な一連の証拠から、ホスホ チロシン残基がＥＧＦＲのＳＨ２領域に対する実際の結合部位の一部であること が強く主張される。先ず、ｐ　４７　ｇｌｌｌ−Ｃｒｋが、ｖ−ｃｒｋ形質転換 細胞（Ｍａｔｓｕｄａ、　Ｍ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４８：　１５３７−１５ ３９　（１９９０））中の殆んど全てのホスホチロシン含有タンパク質に結合す ることが見出された。第２に、ＰＤＧＦにおける２つの自動リン酸化部位の変異 はＧ　Ａ　Ｐ　（１（Ｂｚｌａｕｓｋａｓ、　Ａ。

ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７＋　１５７８−１５７１　（１９９０））の結合を 大きく減少せしめた。最後に、上に示した結果から、ＥＧＦＲのＣ−末端に対す る特異的結合は、ホスホチロシンが存在する場合にのみ示される。かくして、ホ スホチロシン残基は、結合部位の一部を構成するか、あるいは、この領域の立体 配座を極部的に変化させて、結合を可能にしていることが結論付けられる。ホス ホチロシン単独で結合部位を形成しているとは言えない。例えば、ホスホチロシ ン単独ではＰ　４７　Ｋ　ｍ　ｇ　−ｃｒ　１１のホスホチロシン−含有タンパ ク質（ｌｄＢｊｓｕｄａら、上述）への結合を干渉することができない。さらに 、ＰＬＣ−ガンマは、Ｃ３Ｆ−ルセブター（Ｄｏｗｉｎｇ、　Ｊ、Ｒ，ら、ＥＭ ＢＯＪ、　８：３３４５−３３５０　（１９８９））のようなホスホチロシン残 基を含む活性化された全ての分子に結合するわけではない。同様に、ＰＬＣ−ガ ンマのＰＤＧＦＲの結合は、ＧＡＰ結合と同一であるとは思えない。異ったＳＨ ２とＳＨ３の領域を含むタンパク質では、結合の特異性（Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ ら、上述）が異なる可能性があるからである。

上記に引用した引例は、特に断りがなくとも、引用により全て本明細書中に組み 込まれる。

今ここで本発明を充分に記載したけれども、本発明の精神や範囲を逸脱すること なく、また、不当な実験なしに、広範囲の等価なパラメータ、濃度、条件の内で 同じようなことを行うことができるということが当業者によって考えられるであ ろう。

本発明は、具体的な実施態様と関連づけて記載したが、さらなる修正が可能であ ることが理解されるであろう。本発明は、一般に、本発明の原理に従い、本発明 が係っている技術における公知かつ慣用のプラクティスに当るような、本明細書 の開示からの離脱を含み、かつ、添付したクレームの範囲に述べた必須の特徴事 項に適用しつる、本発明のいかなる変形、用途、適用をもその範囲に含むもので ある。本書において用いた言葉使い、用語は、記載するためのものであって、限 定のためのものではないことを理解すべきである。

ＦＩＧ、２ Ｅ　Ｇ　Ｆ−レセプター　んｇｔｌｌ　ライブラリーのプレート３２ｐ　ｊ票識 　陽性コロニーの選択 カルボキシ末端 ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、３Ｂ ロ　ｏ　ｏ　ロ　０　ロ Ｎ　ａ５　啼　０　ψ　へ −−−１哨　１％ｏｌ　リ　１　ト　替１１ｍ１　ｍ 口　０ ロ　ロ　ロ　ＯＮ　ａ。

ＣＤ　啼　ｏ　ｖＤ　ロ　ロ ト　ａ３　１　■　１　■　−１−１ ｍ　句　−−− ＩＩｌ　１）　ｌｌｌｌｌ１１ ａａ　＠　＠ｌ　ｌ！　ｍ ｍ　ｅａ　＃　ｗ３　ｌ！＠ ｓ　ｓ　ｗ　ＩＩＩｅ　ｍ ｍ　ｓ　ｇ　ｓ　ｓ −−＠　輻　Ｓ　− Ｏ ＩＧ　７ ！Ｌ！　震　＊　庫　Ｗ　鷹 虐　遅　裾　−：；　副　訊　誌　瞑 ｗ−ｗ　冨 ＦＩ　Ｇ、９Ａ ネ （氾 −Ｌ Ｑ ＦＩＧ、１５ ＢＣＤ Ｉｌｌ＋　−昭　１１１　ｇ＋ ＩＩ　ｍ　＠ａ　ｍ ｇ　ｇ＋　ａ　ｍ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）　璽平成５年７月１９ 日

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．レセプターチロシンキナーゼ分子のチロシンがリン酸化されたポリペプチド 部分に結合できるタンパク質の細胞内での発現を検出する方法であって、 （ａ）該細胞、その抽出物、そのライゼート又はその上清を、固相担体に接触せ しめて、該タンパク質を該担体に結合させ；（ｂ）該担体に結合したタンパク質 を、上記チロシンがリン酸化されたポリペプチドと共にインキュベートして、該 ポリペプチドを上記担体に結合したタンパク質に結合せしめ；（ｃ）該担体に結 合していない物質を除き；そして、（ｄ）該担体に結合した上記チロシンがリン 酸化されたポリペプチドの存在を検出するか、その量を測定し、それにより該タ ンパク質の発現を検出することを特徴とする方法。
2. ２．該レセプターチロシンキナーゼが、上皮成長因子レセプター、血小板由来成 長因子レセプター、繊維芽細胞成長因子レセプター、コロニー刺激因子−１レセ プター及びインシュリンレセプターよりなる群から選ばれる請求項１記載の方法 。
3. ３．該タンパク質がヒト起源のものである請求項１記載の方法。
4. ４．該リン酸化ポリペプチドが検出できるように標識されている請求項１記載の 方法。
5. ５．該検出可能な標識が放射線ラベルである請求項４記載の方法。
6. ６．該放射線ラベルが３２Ｐである請求項５記載の方法。
7. ７．ヒト染色体に、レセプターチロシンキナーゼ分子のチロシンがリン酸化され たポリペプチド部分に結合することができるタンパク質をコードする遺伝子をマ ッピングする方法であって、（ａ）細菌の細胞を、ヒト遺伝子発現ライブラリー で感染し； （ｂ）請求項１記載の方法を用いて、該タンパク質を発現するクローンを検出し ： （ｃ）該クローンのＤＮＡの配列を決定し；そして（ｄ）該配列をヒト染色体に マッピングする、ことを特徴とする方法。
8. ８．レセプターチロシンキナーゼのチロシンがリン酸化されたポリペプチド部分 に結合することができるタンパク質の発現の検出に有用なポリペプチドプローブ であって、該プローブが、該レセプター分子のチロシンがリン酸化された部分か ら誘導されるアミノ酸配列又はその機能的誘導体を含み、該配列が少なくとも１ のリン酸化チロシン残基を有し、かつ、該レセプターのチロシンキナーゼ部分を 欠き、そして、該プローブが検出可能なように標識されていることを特徴とする プローブ。
9. ９．１〜５個のリン酸化チロシン残基を有する請求項８記載のプローブ。
10. １０．２５〜２５０のアミノ酸残基を有する請求項８記載のプローブ。
11. １１．検出可能な標識が、該リン酸化チロシン残基の放射活性リン原子である請 求項８記載のプローブ。
12. １２．請求項８記載のプローブの製造方法であって、（ａ）該レセプターもしく は遺伝子工学的に製造されたレセプター様誘導体を、実質的に純粋な形態で提供 し、ここで該レセプターもしくは該レセプター様誘導体は、チロシンキナーゼド メインとチロシンがリン酸化されたドメインの両方を有し、該チロシンがリン酸 化されたドメインは該チロシンキナーゼによってリン酸化され得る少なくとも１ のチロシン残基を含み；（ｂ）該レセプターもしくはレセプター様誘導体を、該 チロシン残基のリン酸化を可能にする条件下、（ガンマー３２Ｐ）−アデノシン 三リン酸と共にインキュベートして、該チロシン残基のリン酸化を起し、 それにより、該プローブを製造することを特徴とする方法。
13. １３．工程（ｂ）のあとに、 （ｃ）さらに、該分子をチロシンキナーゼドメインとチロシンがリン酸化された ドメインの間で開裂することができる試薬（ａｇｅｎｔ）で、該リン酸化レセプ ター分子を処理すること、を含む請求項１２記載の方法。
14. １４．該試薬が臭化シアンである請求項１３記載の方法。
15. １５．該レセプター様誘導体が、チロシンキナーゼをコードし、選択的な酵素切 断部位をコードするＤＮＡ配列にリンクし、該カルボキシ末端ドメインをコード するＤＮＡ配列にリンクしたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子によってコードされた ポリペプチドであって、該試薬が該切断部位において切断を行うことができる酵 素である請求項１２記載の方法。
16. １６．レセプターチロシンキナーゼ分子のチロシンがリン酸化されたポリペプチ ド部分に結合することができるタンパク質を、複雑な混合物から精製する方法で あって、 （ａ）請求項８記載のプローブが結合した固相担体に、該複雑な混合物を接触さ せて、該タンパク質を該プローブに結合させるようにし； （ｂ）該担体に結合していない物質を除き；そして、（ｃ）該担体から該結合タ ンパク質を溶出し、それにより、該タンパク質を精製する、ことを特徴とする方 法。
17. １７．Ｆｉｇ．４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、ＧＲＢ−１。
18. １８．Ｆｉｇ．１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、ＧＲＢ−２。
19. １９．請求項１７のタンパク質又はその機能的誘導体をコードするＤＮＡ分子で あって、該ＤＮＡ分子が天然のものである場合、それに関連するヌクレオチド配 列を実質的に含まないＤＮＡ分子。
20. ２０．請求項１８記載のタンパク質又はその機能的誘導体をコードするＤＮＡ分 子であって、該ＤＮＡ分子が天然のものである場合、それに関連するヌクレオチ ド配列を実質的に含まないＤＮＡ分子。
21. ２１．Ｆｉｇ．４に示されるヌクレオチド配列から実質的になるＤＮＡ分子。
22. ２２．請求項１８のタンパク質をコードする、又はその機能的誘導体をコードす るＤＮＡ分子。
23. ２３．請求項１９のタンパク質をコードする、又はその機能的誘導体をコードす るＤＮＡ分子。
24. ２４．発現運搬体である請求項２０記載のＤＮＡ分子。
25. ２５．該運搬体がプラスミドである請求項２４記載のＤＮＡ分子。
26. ２６．請求項２５の分子によって形質転換された宿主。
27. ２７．それに関連する他のタンパク質を実質的に含まない請求項１７のタンパク 質又はその機能的誘導体の製造方法であって、（ａ）培養条件下で該タンパク質 を発現することができる宿主細胞を培養し； （ｂ）該タンパク質又は機能的誘導体を発現させ；そして（ｃ）該培養物から該 タンパク質又は機能的誘導体を回収すること、 を特徴とする方法。
28. ２８．それに関連する他のタンパク質を実質的に含まない請求項１８のタンパク 質又はその機能的誘導体の製造方法であって、（ａ）培養条件下で該タンパク質 を発現することができる宿主細胞を培養し； （ｂ）該タンパク質又は機能的誘導体を発現させ；そして（ｃ）該培養物から該 タンパク質又は機能的誘導体を回収すること、 を特徴とする方法。