JPH08506480A

JPH08506480A - 新種蛋白質分離のための相互作用を用いる補捉システム

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Publication number: JPH08506480A
Application number: JP6511161A
Authority: JP
Inventors: ロジャーブレント
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-20
Publication date: 1996-07-16
Anticipated expiration: 2019-06-14
Also published as: EP1362913A2; US5580736A; HK1059635A1; CA2148252A1; DE69333366D1; EP0672131A1; EP1362913B1; DE69333366T2; WO1994010300A1; DE69333969T2; ATE256738T1; US5786169A; JP3537141B2; HK1012027A1; ATE316573T1; DE69333969D1; EP0672131A4; EP1362913A3; CA2148252C; EP0672131B1

Abstract

(57)【要約】第一の蛋白質が第二の蛋白質と物理的に作用し合う能力を持つかどうかを判定する方法を開示する。本方法は：（ａ）次の三つの遺伝子すなわち（ｉ）操作によって一つの蛋白質結合部位に連結されるリポータ遺伝子、（ｉｉ）前記蛋白質結合部位に特異的に結合する能力を持つ一つの結合部分に共有的に結合された前記第一の蛋白質を含むところの第一の融合蛋白質を発現する第一の融合遺伝子、（ｉｉｉ）一つの弱い遺伝子活性化領域に共有結合された前記第二の蛋白質を含むところの第二の融合蛋白質を発現する第二の融合遺伝子、を含有するホスト細胞を用意すること、および（ｂ）前記第一と第二の蛋白質の間の相互作用の尺度として、前記リポータ遺伝子の発現を測定すること、を含む。上述の判定方法によって、相互作用をする蛋白質をコードする遺伝子の分離が容易になる。さらに、本明細書は組換え体Cdilポリペプチド、そのCdilポリペプチドをコードする核酸、およびそれらの用途を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】新種蛋白質分離のための相互作用を用いる捕捉システム発明の背景本発明は、国立衛生研究所が授けた国の助成金で賄われ、政府に一定の権利がある。本発明は、新蛋白質分離法に関するほか、ガンの診断や治療にも関するものである。殆どの真核細胞では、Ｇ１およびＧ２中で働く制御により細胞サイクルが調節されている。ＤＮＡ合成の完了を示す信号のような比較的特色の薄い細胞内での信号に反応して細胞がＭに入るかどうかがＧ２中に決定される（Nurse，Nature3 44:503-508，1990;Enoch and Nurse，Cell 65:921-923，1991）。Ｇ１中、細胞はＳに入るか、あるいは細胞サイクルから撤退してＧ０として知られる非分割状態に入る（Pardee，Science 246:603-608）。これを決定する制御メカニズムはまだ良く知られていないが、その機能は明らかに後生動物の正常発達や発ガンの過程の中心をなす。酵母および、おそらくあらゆる真核生物で、Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍへの移行は、−34ｋｄ蛋白キナーゼ族つまり、ｃｄｃ２⁺（S.Pombe中）およびＣＤＣ２８（S.cerevisiae中）遺伝子によりコード化されているＣｄｃ２蛋白質に依存する。ほ乳類細胞からもＣｄｃ２族の蛋白質が確認されている。Ｃｄｃ２（Lee and Nurse，Nature 327:31-35，1987）、Ｃｄｋ２（Elledge and Spotswood，EMBO J .10:2653-2659，1991; Tsai et al.，Natrure 353:174-177，1991）、Ｃｄｋ３（Meyerson et al.，EMBO J.11:2909-2917，1992）を始めとする幾つかは、発育に向け、ｃｄｃ２８^-（S.cerevisiae）を捕捉できる。Ｇ２／Ｍ移行点でのＣｄｃ２蛋白質の活動は、サイクリンと呼ばれる調整的蛋白質と組み合わさりポジティブにか、その蛋白質のＡＴＰ分割部位近くでのチロシンのリン酸化によりネガティブにという2つの方法で調整される。こうした調整メカニズムの少なくとも一つはＧ１中に作用する（図1Ａ参照）。この時点で、Ｃｄｃ２蛋白質の活性は、異なるＧ１に特異的なサイクリンとの任意の組み合わせにより調整される。S.Cerevisiaeでは、少なくとも5つの推定上のＧ１サイクリンが、CLN1、CLN2、CLN3、HSC26およびCLB5遺伝子の生成物を含む遺伝子スクリーン中で確認されている（Cross，Mol.Cell.Biol 8:4675-4684，1988;Nash et al.，EMBO J．7:4335-4346，1988; Hadwiger el al.，Proc．Nat.Acad.Sci.USA8 6:6255-6259，1989; and Ogas et al.，Cell 66 1015-1026，1991）。CLN1、CLN 2、CLN3の各蛋白質（ここではCln1、Cln2、Cln3と呼ぶ）は、それぞれに単独で、細胞に対しＧ１をＳへ移行させることを十分可能にさせ（Richardson et.al. ，Cell 59:1127-1133，1989）、それらのうちの最低一つ（Cln2）は蛋白キナーゼとして活性な複合体の中でCdc28と関連する（Witternberg et al.，Cell 62 2 25-237，1990）。最近、ほ乳類細胞の中にサイクリンC、サイクリンD（3形態）およびサイクリンEという推定上のＧ１サイクリンが確認された（Koff et al.， Cell 66:1217-1228,1991;Xiong et al.，Cell 65:691-699,1991）。これら3つのほ乳類サイクリンのそれぞれが、Cln1、Cln2、Cln3の中の酵母欠乏を補足し、また、Ｇ１中に発現される。合成体であるS.cerevisiaeにおいて、及びいくつかの場合においても、Ｇ１サイクリンの活性は、Ｇ１調整決定に対する細胞外環境の一対の変化を助ける遺伝子ネットワークの支配下にある（図1A）。例えば、SW14とSW16遺伝子生成物は、 CLN1とCLN2転写をポジティブに制御し、また、Cln3の活性をポジティブに調整することができる（Nasmyth and Dirick，Cell 66:995-1013,1991）。FAR1生成物は、Cln2の転写とその生成物の活性の両方をネガティブに調整（Chang and Hers kowitz，Cell 63:999-1011，1990）し、FUS3生成物はCln3活性をネガティブに調整する（Elion et al.，Cell 60:649-664,1990）。ほ乳類の場合のＧ１のＳへの移行も類似のメカニズムにより調整される可能性が幾つかの一連の証拠により示唆されている。酵母内で見受けられるものと似た調整分子（Cdc2キナーゼとサイクリン）がほ乳類のＧ１中に観察され、また、他の細胞との接触や負の成長因子（例えば、ＴＧＦ−β）による処理を含む、養分が奪われるような場合並びに特定のネガティブ調整信号に反応する場合などに、 S.cerevisiaeと同様、ほ乳類細胞はＧ１中で停止する（図１Ｂ）。ただし、酵母の真核Ｇ１調整機構の方がより高度であるらしいことが幾つかの要件から示唆されている。第一に、ほ乳類細胞内では、プロセスに関与する蛋白質の数がより多いようである。少なくとも10種類の異なるCdc2族の蛋白質と関連蛋白キナーゼ（ Meyerson et al.，EMBO J.11:2909-2917，1992参照）のほか、推定上Ｇ１サイクリンの少なくとも3つの明確なクラス（Koff et al.，Cell 66:1217-1228，1991; Matsushime et al.，Cell 65:701-713，1991; Motokura et al.，Nature 339:5 12-518，1991; Xiong et al.，Cell 65:691-699，1991）が確認されている。第二に、酵母と違い、殆どのほ乳類細胞増殖は細胞外蛋白因子に依存しており（特に、ポジティブな発育調整蛋白質の中で）、それが失われるとＧ１中の停止につながる。第三に、Ｇ１中で多数の細胞タイプが停止すると、酵母の細胞サイクルのどの段階にも厳密には匹敵しないであろうＧ０の状態へと進むことがあり得る。ほ乳類（例えば、ヒト）の正常細胞分割決定の制御に関与する蛋白質は、悪性細胞の発育においても重要な役割を果たす可能性が大きいので、そうした蛋白質を識別し分離することは、抗ガン治療のみならず有益なガン診断をも促進する。ここで、（ｉ）その存在中に時として特定の蛋白質対蛋白質の相互作用に参加するような蛋白質を識別するための新システム、（ｉｉ）ほ乳類細胞分割のキーレギュレーターである相互作用蛋白質の識別に向けたこのシステムの利用、および（ｉｉｉ）そうした相互作用蛋白質の一つで、ガンの診断や治療に有益な手段を提供するCdilと呼ばれる細胞サイクル制御蛋白質について、説明する。発明の要約本発明は、一般に、ある第一蛋白質が第二の蛋白質と物理的に相互作用（直接または間接的に）するかどうかを判断するための方法を主にとりあげている。この方法は、（ａ）（ｉ）蛋白質結合部位に機能できるように連結されたリポーター遺伝子、（ｉｉ）第一の融合蛋白質を発現する第一融合遺伝子、蛋白質結合部位への特異的に結合し得る結合部分に共有結合された第一蛋白質を含む第一融合蛋白質、および（ｉｉｉ）第二の融合蛋白質を発現する第二融合遺伝子、弱い遺伝子活性化部分と共有結合された第二蛋白質を含む第二融合蛋白質、の供給、および、（ｂ）第一および第二蛋白質間の相互作用の尺度としてのリポーター遺伝子発現の測定を含む。望ましい実施例では、さらに第二蛋白質をコードする遺伝子の分離を含む。別の望ましい実施例では、弱い遺伝子活性化部分がGAL4活性化区域IIよりも活性化の可能性が低く、B42遺伝子活性化部分またはより少ない活性化能力を持つ遺伝子活性化部分が望ましい。ホスト細胞は酵母細胞であり、リポーター遺伝子はLEU2遺伝子またはlacZ遺伝子を含み、ホスト細胞はさらに蛋白質結合部位に機能できるように連結された第二リポーター遺伝子を含む。例えば、ホスト細胞は、LEU2リポーター遺伝子とlacZリポーター遺伝子の両方を含み、蛋白質結合部位はLexA結合部位であり、結合部分はLexA DNA結合領域も含む。第二の蛋白質は、例えばcdc2細胞分割制御蛋白質のように真核細胞分割制御に関与する蛋白質である。本発明の第二の側面においては、cdilポリペプチドのほぼ純粋な調合が主な特長である。cdi1ポリペプチドは、図６（配列番号１）に示されたアミノ酸配列を含む、ほ乳類例えばヒトから得られたものであることが望ましい。本発明は、関連する側面において、本発明のｃｄｉｌポリペプチドをコードする配列（および、望ましくはヒトのｃｄｉｌポリペプチド）を含む精製されたＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を主な特長としている。その他の関連する側面において本発明は、本発明の精製されたＤＮＡを含むベクターと細胞、本発明のｃｄｉｌポリペプチドのみに特異的に結合する精製された抗体、並びに、関与する組換えｃｄｉｌポリペプチドを生産する方法、細胞内での発現のために位置付けられたｃｄｉｌポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された細胞の提供、ＤＮＡを発現するための条件下で形質転換された細胞の培養、および、組換えｃｄｉｌポリペプチドの分離を主な特長としている。本発明はさらに、本発明の精製されたＤＮＡのそうした表現により生産された組換えｃｄｉｌポリペプチドを主な特長としている。さらにもう一つの側面において本発明は、活性材料としての本発明のCdilポリペプチドを含む治療組成物を主な特長としており、その活性材料は生理学的に受容し得る担体内で生成されている。そうした治療組成物は、そのほ乳類の細胞分割防止に効果的な投与量で治療を施すことを含むほ乳類内の細胞増殖の防止法において有益である。本発明の最終的な側面は、サンプル内のCdil遺伝子表現の測定、悪性細胞の存在を指摘する野生型サンプルに比較したCdil表現における変化を含む生物学的サンプル内での悪性細胞の検出方法を主な特長としている。ここで使用される『リポーター遺伝子』とは、その発現が分析（assay）可能である遺伝子を意味する。そうした遺伝子には、lacZ、アミノ酸生合成遺伝子（例えば、酵母LEU2、HIS3、LYS2、あるいはURA3遺伝子）、核酸生合成遺伝子、ほ乳類のクロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）遺伝子、あるいは、それ用の特定抗体がある表面抗原遺伝子が含まれるが、これらには限られない。『機能できるように結合した』という意味は、適切な分子（例えば、転写活性体蛋白質、または転写活性化領域を含む蛋白質）が制御配列に結合されている場合に、遺伝子発現を許容する方法で遺伝子と制御配列とが接続されていることである。『結合部分』とは、特定のＤＮＡ配列（例えば、蛋白質結合部位）に対して特異的なポリペプチドが結合し得る能力を備えるアミノ酸伸張領域である。『弱い遺伝子活性化領域』とは、当該遺伝子が結合している調整領域の遺伝子発現の誘導能が弱いアミノ酸の伸張領域をいう。ここで用いられている『弱』とは、GAL4活性化区域II（Ma and Ptashne，Cell 48:847，1987）によりもたらされた活性化レベルに満たない意味であり、Ma and Ptashne（Cell 51:113，1987 ）のＢ42活性化領域によりもたらされた活性化のレベルまたはそれ以下であることが望ましい。活性化レベルは、任意の下流のリポーター遺伝子システムを使用し、並列的な分析において、GAL4区域II−ポリペプチドにより刺激された発現レベルをテスト対象のポリペプチドに刺激された発現レベルと比較し、測定できる。『ほぼ純粋な』という意味は、重量（乾燥重量）にして少なくとも60％が関心のある化合物、例えばCdilポリペプチドであるという意味である。関心のある化合物の割合は最低75％であることが望ましく、さらには最低90％であることが望ましく、また、最低99％であることが最も望ましい。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動あるいはHPLC分析のような適切な全ての方法で測定できる。『精製されたＤＮＡ』とは、そこから派生している有機体の自然発生ゲノムの中で直接隣接（5末端の1、および3末端の1）する双方のコード化配列と直接隣接しないＤＮＡを意味する。従ってこの用語は、例えばベクターへと、自律的に反復するプラスミドまたはウィルスへと、若しくは、原核または真核のゲノミックＤＮＡへと統合される組換えＤＮＡ、又は、他の配列から独立し別個の分子として存在するもの（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により生産されたcDNAもしくはゲノムＤＮＡフラグメント）を含む。また追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。『実質的に同一である』が意味するのは、例えば、一つのアミノ酸をもう一つの同じクラスのアミノ酸で置き換える（例えば、グリシンをバリンで、リジンをアルギニンで等）保存的なアミノ酸の置換か、または、アミノ酸配列の蛋白質機能を破壊しないところに位置している（例えばここに記述され、分析済のように）一個またはそれ以上の非保存性の置換、削除または挿入、のみにより異なるものとなっているアミノ酸配列のことである。『実質的に同一』な核酸配列は、既に定義した実質的に同一なアミノ酸配列をコードする。『形質転換された細胞』とは、組換えＤＮＡ技術により、それに対し（あるいはその祖先に対し）、Cdilポリペプチドをコード（ここで使用されている通り）するＤＮＡ分子を導入された細胞を意味する。『発現のために位置付けられた』とは、ＤＮＡ分子が、配列の転写と翻訳を司る（すなわち、例えばCdilポリペプチドの生産を促す）ＤＮＡ配列に隣接して位置付けられているという意味である。『精製された抗体』とは、重量にして最低60％が、それと自然に組み合わさる蛋白質及び自然発生有機分子から分離されている抗体を意味する。抗原、例えば Cdil特異的抗原の比率が重量にして最低75％、さらには最低99％であることが望ましい。精製されたCdilポリペプチドは、例えば、組換えにより生産されたCdil ポリペプチドを使用したアフィニティークロマトグラフィーや標準的な技術により取得できる。『特異的に結合する』とは、例えばCdilポリペプチドが自然に含まれている生物学的サンプルのようなサンプル中で、抗原がCdilポリペプチドだけを認識し結合するが、その他の分子については殆ど認識も結合もしないことを意味する。『悪性細胞』とは、正常な細胞分割制御から解放された細胞を意味する。この定義には形質転換され不滅化された細胞が含まれる。ここに記述されている相互作用捕捉システムは、相互作用蛋白質または相互作用蛋白質をコードする遺伝子の分離のための在来型方法よりも高い有利性を提供する。最も特筆すべきは、出願人のシステムが、診断や治療の実用性として知られる蛋白質とポリペプチドとの物理的相互作用に基づき幅広い有益蛋白質をコードする遺伝子の識別および精製のための非常に幅広い効用を持つ急速かつ安価な方法を提供することである。この幅広い効用は、一部には、システムの構成要素に極めてばらつきがある親和蛋白質の相互作用の検出を促進するための修正が容易にできる（例えば、蛋白質相互作用に対する感度の量が異なるリポーター遺伝子を使用することにより）という事実から得られている。長期にわたる発現がホスト細胞に有毒である蛋白質でさえも単に蛋白質の発現の一挙噴出を誘導しその相互作用能力をテストしβ−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子の発現を刺激することにより分離できることから、相互作用蛋白質の発現に用いられる助触媒を誘導可能であるという性質もまた、検出可能なインタラクター候補の範囲を広げる。さらに、弱い遺伝子活性化領域タグの使用を通じた相互作用蛋白質の検出は、より強力な活性化領域（GAL4またはVP16のような）と典型的に関連する相互作用蛋白質の入手可能候補のプールに制約されない。そのメカニズムは不明確だが、そうした制約は明らかに、強力な活性化領域に介在されたホスト細胞の毒性の低ないし中度のレベルに起因している。本発明のその他の特長と利点は、以下の詳細な説明や請求の範囲から明らかである。図の簡単な説明まず、各図を簡単に説明する。図1は、細胞サイクル制御システムを示す。図1（Ａ）は酵母におけるＧ１制御を説明している。図１Ｂは、酵母とほ乳類における細胞サイクル制御を説明している。図2Ａ−Ｃは、本発明に基づく相互作用捕捉システムを示す。図3Ａは、本発明で有益な『ベイト』蛋白質を図示したもので、数字がアミノ酸を示している。図3Ｂは、本発明の中で有益なリポーター遺伝子を図示したものである。図3Ｃは、本発明の中で有益なライブラリ発現プラスミドと、本発明において例示的な『プレイ』蛋白質のＮ末端アミノ酸配列の図示である。図4は、Cdil/Cdc2相互作用の特異性を明らかにする酵母アッセイを示す。図5は、Cdilが物理的にCdc2と相互作用することを明らかにする免疫沈殿の実験結果を示す。図6は、Cdilコード配列を、そのオープンリーディングフレーム（配列番号1）の予想アミノ酸配列とともに示す。図7Ａには、Cdilを発現する酵母細胞の生長の程度が描かれている。塗りつぶされていない正方形は、発現ベクターのみにより形質転換された細胞である。楕円形はCdc2を発現する細胞である。三角形はCdilを発現する細胞である。塗りつぶされている四角形は、CdilとCdc2を発現する細胞である。図7Ｂに示されているのはCdilを発現する酵母の発芽指数である。図7Ｃに示されているのはCdilを発現する酵母のＦＡＣＳ分析である。細胞数（Ｙ軸上）の関数として蛍光性（Ｘ軸上）が示されている。図8Ａは制御細胞の形態を示す。図8ＢはDAPIで着色された制御細胞の形態を示す。図8ＣはCdilを発現する細胞の形態を示す。図8ＤはDAPIで着色されたCdilを発現する細胞の形態を示す。図9Ａはヒーラ細胞におけるCdil発現のタイミングを示し、各レーンがそれぞれ異なるタイムポイントを示している：解放後（1）0時間、（2）3時間、（3）6 時間、（4）9時間、（5）12時間、（6）15時間、（7）18時間、（8）21時間、（ 9）24時間、および（10）27時間。図9ＢはCdil過剰発現の影響を示す。第10図は、Cdc2蛋白の配列と、FUS3を示す。図示されているのは、この中において使用したベイト蛋白の連続した配列である。アミノ酸は、ヒトCdc2中のものとして付番されている。略号は下記の通りである。ヒトCdc2は、HsCdc2; ヒトCd k2は、HsCdk2; S．carevisiae Cdc28は、ScCdc28; 2種の隔離ショウジョウバエ属のハエは、DmCdc2及びDmCdc2c; 及びS．cerevisiae FUS3は、ScFus3である。肉太活字で示される残基は、Cdc2科のメンバー間で保存されている。また、Fus3 として存在する残基も肉太で示してある。*印は、潜在的Cdil接点を示す。即ち、アミノ酸は、ヒトCdc2，Cdk2，S．cerevisiae Cdc28,及びショウジョウバエ属Cdc2の間で保存されるけれども、ショウジョウバエ属Cdc2cとFus3とにおいては異なる。ここで、特定の細胞分割蛋白を分離するための、相互作用トラップ・システムの一例と、その用法について説明する。この例は、この発明を説明するためのものであり、限定するためのものではない。詳細な説明出願人は、既知の診断用または治療用設備の二番目の蛋白と、物理的に相互作用する蛋白をエンコードする遺伝子を分離するための、インヴィヴォ相互作用トラップ・システムを開発した。このシステムには、既知のＤＮＡ結合範囲と電子対結合された融合蛋白として、治療または診断的興味のある蛋白を表すように処理された真核ホスト株（例、イースト株）が含まれる。この蛋白は、システムにおけるその目的が、有用な相互作用ポリペプチド（「プレイ」と呼ばれる。下記参照）を「取り入れる」ことであるので、「ベイト（Ｂａｉｔ）」蛋白と呼ばれている。相互作用ポリペプチド（「プレイ」と呼ばれる。下記参照）は、なおかつ不明か特徴づけられないものではある。真核ホスト株もまた、一つまたはそれ以上の“リポータ遺伝子、即ち転写がベイトープレイ相互作用に対応して検出される遺伝子”を含有する。ベイト蛋白は、それぞれのＤＮＡ結合ドメインを通って、リポータ遺伝子の上流のそれぞれに特異的なＤＮＡ部位に結合する。けれども、ベイト蛋白はそれ自身の活性化ドメイン（活性化範囲）が不足しているので、リポータの転写は刺激されない。新規な相互作用蛋白をコードする遺伝子を分離するために、この株の細胞（リポータ遺伝子を含有し、かつベイト蛋白を発現する）は、ＤＮＡ（例、cDNA）発現ライブラリーの個々のメンバーにより形質転換される。ライブラリーの各メンバーは、弱くての遺伝子活性化範囲タグに結合される候補の相互作用蛋白の合成を指示する。促進剤結合ベイト蛋白と物理的に相互作用する、それらのライブラリーによりコードされた蛋白は、「プレイ」蛋白と呼ばれる。そのような結合ベイト蛋白は（それらの活性化範囲タグを経て）、下流のリポータ遺伝子の記録を検出可能な限り活性化し、かつ、興味ある相互作用蛋白をエンコードするＤＮＡクローンをかくまう、特殊な細胞を確認するための簡単な分析評価を提供する。そのような相互作用トラップ・システムの一例を、第２図に示す。第２Ａ図は、２個のリポータ遺伝子、LexAop-LEU2及びLexAop-lacZを含有するイースト株、及び構造に基づいて発現されたベイト蛋白、LexA-cdc2、を示す。プレイ蛋白の合成は、ガラクトースの存在するイーストを育てることにより誘導される。第２Ｂ図は、もしプレイ蛋白が、転写的に不活性なLexA結合ベイト蛋白と相互作用しない場合には、リポータ遺伝子は転写されない。細胞はleu- mediumではコロニーに成長することはできないし、かつ、それは、Xgal培地では、それが、β−ガラクトシダーゼ活性を含まないので、白色である。第２Ｃ図は、もしベイト蛋白がベイトと相互作用する場合には、リポータ遺伝子は二つ共活性である。細胞は、leu- mediumではコロニーを形成し、かつ、同コロニー内の細胞は、β−ガラクトシダーゼ活動を有しかつXgal培地では青色である。ここに述べるように、第２図に図式的に示す相互作用トラップ・システムの開発に当たっては、３種の構成要素に十分注意を払った。（ｉ）転写的に不活性として知られる部位に特定のＤＮＡ結合範囲を含んだ、ベイト蛋白の使用。（ii）実質的に基礎的記録のない、かつ、プレイ蛋白により結合されたリポータ遺伝子の使用。（iii）ライブラリーによりコードされたプレイ蛋白の使用。そのすべては、キメラとして発現され、そのアミノ端末には、同一の弱い活性化範囲、及び、むしろ核の位置測定信号等その他の有用な部分を含んでいた。システムの各構成要素を更に詳細に説明する。ベイト蛋白第２図に示す選択ホスト株は、Cdc2のベイト、及び、バクテリアLexA蛋白から得たＤＮＡ結合部分を含む（第３Ａ図参照）。LexA ＤＮＡ結合範囲の使用は、ある種の利点を与える。例えば、イースト内のLexAの部分は、活性化機能を含まないし、イースト遺伝子の転写に既知の影響を与えない（Brent and Ptashne，N ature 312:612-615，1984; Brent and Ptashne，Cell 43:729-736，1985）．更に、GAL4 DNA結合範囲よりもむしろ、LexAを使用した方が、ガラクトースの誘導に対応する、プレイ蛋白の条件付き発現を可能する。これにより、もし連続的に発現されれば、宿主細胞に有毒となる恐れのあるプレイ蛋白の検出が容易となる。最後に、LexAの使用により、LexAとLexA結合部位（即ち、LexAのオペレータ）間の相互作用に関する知識を、オペレータ占有度を最適とするために、開発することができる。第３Ａ図に説明するベイト蛋白もまた、LexA 2分化範囲を含む。この選択範囲により、効率的LexA 2量体形成が容易となる。LexAは、２量体として、そのＤＮＡ結合部位を結合するので、ベイト蛋白内にこの範囲を含むことはまた、オペレータ占有度の効率をも最適化する（Golemis and Brent，Mol．Cell Biol．12:30 06-3014，1992）。 LexAは、本発明において望ましいＤＮＡ結合範囲を示す。けれども、その他の転写的に不活性または本質的に転写的に不活性ないかなるＤＮＡ結合範囲でも、相互作用トラップ・システムに使用することができる。このようなＤＮＡ結合範囲は、よく知られており、かつ、蛋白ACE1（CUP1），lambda cI，lac repressor ，jun fos，またはGCN4 が含まれる。上記の理由により、GAL4 DNA 結合範囲は、ベイト蛋白にとっては、やや望ましくないＤＮＡ結合部分を示す。ベイト蛋白は、既知のまたは疑わしい診断的または治療的に重要などんな蛋白からでも選択することができる。望ましいベイト蛋白には、オンコプロテイン（ oncoproteins）（例えば、myc，特に、myc，ras，src，fosのc-末端、及び特に、fosのオリゴメリック（oligomeric）相互作用の範囲のc-末端）または細胞サイクル制御に含まれるその他すべての蛋白（例えば、キナーゼ、フォスファターゼ、膜に関連する受容体の細胞質部分、及びその他のCdc2科メンバー）が含まれる。各事例毎に、診断的または治療的に重要な蛋白は、LexA-Cdc2について通常述べられているように、既知のＤＮＡ結合範囲と融合されるのが常である。リポータ第３Ｂ図に示す通り、発明に従って一つの望ましいホスト株には、２種の異なったリポータ遺伝子、LEU2遺伝子とlacZ遺伝子、が含まれ、それぞれベイト蛋白用の上流結合部を有する。第３Ｂ図に示すリポータ遺伝子はそれぞれ、上流結合部位として、それらの本来の上流活性化順序（UASs）の代わりに、一つか、それ以上のLexAオペレータを含む。これらのリポータ遺伝子は、染色体内に統合され、または、送られて自主的にプラスミドを複製することがある（例えば、イースト2μプラスミド）。本発明においては、多くの理由により、このような二つのリポータの組み合わせが望ましい。第一に、LexAop-LEU2構造により、相互作用蛋白を含有する細胞に、ロイシン不足の媒体で成長させて、多数の潜在的相互作用蛋白含有細胞の検査を容易とする。第２に、LexAop-lac2リポータにより、LEU⁺細胞を素早くスクリーニングして、相互作用を確認させる。かつ、第３に、技術的考慮のうち特に（下記参照）、LexAop-LEU2リポータは、極めて敏感な第一選択を提供するが、一方、LexAop-lacZリポータは、異なる相互作用類縁の蛋白間の識別を可能とする。ここに述べるリポータ遺伝子は、本発明の望ましい具体例を示すけれども、その発現が標準手法により検出され若しくは分析評価されうる、その他同等の遺伝子もまた、LEU2及びlac2遺伝子に関して若しくはその代わりに採用されることがある。転写が検出できるその他有用な遺伝子の例には、アミノ酸及び核酸生合成遺伝子（イーストHIS3，URA3 及びLYS2）,GAL1，E．coli galK（イーストGAL1遺伝子を補って完全にする）、並びに、より高い細胞リポータ遺伝子CAT，GUS，及び抗体が利用可能である（例えば、CD4）細胞表面の抗原をコードする何らかの遺伝子が含まれる。プレイ蛋白本書に記載の選択において、それぞれが弱い活性化ドメイン（たとえば、プレイ蛋白）に融合した、一連の候補相互作用蛋白をコードした第４のＤＮＡ構造が用いられた。かかるプレイ蛋白構造の１つを図３Ｃに示したが、このプラスミドは不変Ｎ−末端部分を含むプレイ融合蛋白をコードする。この部分はアミノ−カルボキシ末端、蛋白発現のためのＡＴＧ、選択的核局在化配列、弱い活性化ドメイン（すなわちＭａとＰｔａｓｈｎｅのＢ４２活性化ドメイン；Cell 51:13，19 87）と、融合蛋白合成の迅速な免疫学的検出のための選択的エピトープタグを担持する。本書に記載のごとく、ＨｅＬａｃＤＮＡライブラリが構築され、プレイ蛋白をコードする融合遺伝子を生成するためにライブラリ配列が無作為にこのＮ−末端断片の下流に挿入された。たとえば、ｃＤＡＮｓは任意のｍＲＮＡ集団から構築して、等価の発現ベクター内に挿入することができる。このような選択のライブラリは市販の入手可能なキット（たとえば、ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 La Jolla，CA）や確立した調整手順（たとえば、Current Protocols in Molecul ar Biology，New York，John Wiley & Sons，1987参照）を用いて新たに構築することができる。代案として、多数のｃＤＮＡライブラリ（多数の異なる生体からのもの）は公的にまたは商業的に入手可能で、ライブラリ源としてはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Palo Alto，CA）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（La Jolla，CA）があげられる。ここでさらに注意すべきは、プレイ蛋白は自然発生する全長ポリペプチドである必要はないことである。たとえば、プレイ蛋白は合成配列によってコードしてもよいし、無作為に生成したオープンリーディングフレームでもまたはその一部であってもよい。１つの特定の実例において、プレイ蛋白は相互作用ドメインだけを含んでいるが、かかるドメインはベイト蛋白活性を修飾するための治療として有益である。同様に、他の弱い活性化ドメインはプレイ分子のＢ４２部分に代わることができるが、かかる活性化ドメインはＧＡＬ４活性化領域ＩＩ部分よりも弱くなければならず、好適にはＢ４２より強くてはならない（たとえば、ｌａｃＺレポーター遺伝子を用いる並列β−ガラクトシダーゼ検定においてＧＡＬ４活性化領域ＩＩまたはＢ４２と比較して測定したとき）が、かかるドメインはＢ４２より弱くてもよい。特に、ＬＥＵ２選択方式（上述）の異常な感作性は、極端に弱い活性化ドメインでも本発明に用いることを可能にする。他の有益な弱い活性化ドメインとしてはＢ１７、Ｂ１１２並びに、ＭａとＰｔａｓｈｎｅ（Cell 51:113，198 7）、Ｒｕｄｅｎら（Nature 350:426-430,1991）およびＧｉｎｉｇｅｒとｐｔａｓｈｎｅ（Nature 330:670，1987）に記載の両極性のヘリックス（ＡＨ）ドメインがあげられる。最後に、プレイ蛋白は、所望ならば、他の選択的核局在化配列（例えば、ＧＡＬ４またはＭＡＴα２遺伝子から派生したもの）または他の選択的エピトープタグ（たとえば、Ｉｍｍｕｎｅｘから入手できるｃ−ｃｍｙ蛋白またはフラッグエピトープの一部分）を含むことができる。これらの配列は系の効率を最適化するが、その操作に絶対必要ではない。特に、核局在化配列はプレイ分子が核局在化レポーター遺伝子構造に到達する効率を最適化し、それによって効果的な濃縮を増し、弱い蛋白相互作用の検出を可能にする。そして、エピトープタグは融合蛋白発現のための単純な免疫測定を容易にするだけである。さらに当業者には明らかなごとく、上述のレポーター遺伝子、ＤＮＡ結合ドメインおよび遺伝子活性化ドメイン構成要素は、酵母、哺乳類の細胞、および原核生物細胞ゲノムまたはｃＤＮＡｓ並びに人工的配列などの真核生物または原核生物源から誘導することができる。加えて、酵母が相互作用トラップ系のための推奨ホスト生体である（増殖、遺伝子操作および大規模選別の容易さのため）が、哺乳類の細胞などの他のホスト生体も使用できる。哺乳類系を選択したとき、推奨レポーター遺伝子は感作性の測定が容易なＣＡＴ遺伝子とし、有益なＤＮＡ結合ドメインと遺伝子活性化ドメインは上述のもの（例えば、ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインおよびＢ４２またはＢ１１２活性化ドメイン）から選択できる。本書に記載の相互作用とラップ系の一般的類型は多数の利点を提供する。たとえば、系は変化する親和性のベイト−プレイ相互作用の検出に使用できる。これは、たとえば、ライブラリ蛋白との相互作用に対する感作性が定量的に異なるレポーター遺伝子を用いて実現することができる。特に、ＬｅｘＡｐｏ−ＬＥＵ２レポーターを活性化するためにライブラリーコード化蛋白がそれをもってベイトと相互作用しなければならない平衡Ｋｄはおそらく≦１０￣６Ｍである。この値は、たとえば、一般的な物理的方法によって検出されるものよりも弱く、寿命の短い蛋白質相互作用を検出するために明らかに充分である。ｌａｃＺレポーターは感作性が低いので、適切な数と、親和性と、ＬｅｘＡオペレーター位置をもつレポーターを用いて異なるプレイ蛋白の選択が可能になる。特に、ｌａｃＺレポーター遺伝子の感作性はＬｅｘＡ結合二量体に対する親和性が増強されたＬｅｘＡオペレーターを用いて上流のＬｅｘＡオペレーターの数を増し、および／またはＬｅｘＡオペレーターと下流のレポーター遺伝子プロモーターの間の距離を減らすことによって増強される。系の感作性を操作するこの能力によって検出された相互作用の強さの制御の尺度が提供され、それによって単離可能な蛋白の範囲が広がる。この系は他にも少なくとも３つの利点を提供する。第１に、ライブラリ−コード化蛋白上の活性化領域は、検出されたライブラリ蛋白の範囲を制限しないために比較的弱い、かかる制限はＧＡＬ４またはＶＰ１６によるものなどの強い、半中毒性活性化ドメインをもちいたときによく見られる（Gill and Ptashne，Natu re 334:721-724，1988; Triezenberg et al.，Genes Dev．2:730-742，1988; Be rger et al.，Cell 70:251-265，1992）。第２に、ベイトをＤＮＡに結合するためにＬｅｘＡを用いることによってＧＡＬ４⁺酵母ホストの使用と、ライブラリ蛋白の条件付き発現をもたらすためにＧＡＬ１プロモーターを用いることが可能になる。次にこれによってＬｅｕまたはｌａｃＺ表現型はライブラリ蛋白の発現に無条件に帰されることが可能になり、偽陽性の数が最小になる。さらに連続的に発生したときにホスト細胞にたいして有毒な相互作用蛋白の条件付き発現と選択を可能にする。また第３に、融合蛋白のカルボキシ末端ではなく、アミノ末端に活性化ドメインを配置することによって、蛋白の活性化ドメインが枠内に翻訳され、そのゆえに、３つの融合遺伝子の内の１つが候補の活性化ドメインタグ付き相互作用蛋白をコードする。次に特定の相互作用トラップ系を説明する。既知の細胞分割制御蛋白（Ｃｄｃ２と称する）と物理的に相互作用する蛋白（Ｃｄｉ１と称する）を単離するためにこの系を使用することも説明する。Ｃｄｉ１の単離と特性化Ｃｄｉ１ｃＤＮＡＮの単離細胞分割制御蛋白Ｃｄｃ２と相互作用する蛋白を単離するために、酵母株ＥＧＹ４８／ｐ１８４０を用いた。この株にはＬｅｘＡｏｐ−ＬＥＵ２とＬｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺレポーターの両方と、ＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２ベイト蛋白の合成（後述）を導いたプラスミドも含んでいた。ＬｅｘＡｏｐ−ＬＥＵ２レポーターは染色体ＬＥＵ２遺伝子にとって代わった。このレポーターは高親和性ｃｏｌＥ１二重ＬｅｘＡオペレーターの３つのコピー（Ebine et al.，J．Biol．Chem．258:132 58-13261，1983）、主要ＬＥＵ２転写開始点の上流の４０のヌクレオチドを担持していた。ＬｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺ（ｐ１８４０）はＵＲＡ３⁺２μプラスミド上に担持されていた。このレポーターは主要ＧＡＬ１転写開始点の上流に単一のＬｅｘＡオペレーター１６７ヌクレオチドを担持していた。ＨｅＬａｃＤＮＡ相互作用ライブラリ（後述）も図３Ｃに示したプラスミド（ｐＪＧ４−５と称す）を用いてこの株の中に導入された。このライブラリベクタはＧＡＬ１プロモーターの誘導体の制御の下に蛋白の条件付き発現を導くように設計されている。このプラスミドは２μレプリケーターとＴＲＰ１^＋選択自在マーカーを担持していた。ｃＤＮＡはＥｃｏＲ１−ＸｈｏＩ断片上でこのプラスミド内に挿入された。ＸｈｏＩ部位の下流で、ｐＪＧ４はＡＤＨ１転写ターミネーター含んでいた。プラスミドによってコード化され、全てのライブラリ蛋白のＮ末端に融合された変形しない１０７アミノ酸部分の配列は図３Ｃのプラスミド地図の下に示されている。この部分はアミノからカルボキシ末端、ＡＴＧ、ＳＶ４０Ｔ核局在化配列（Kalderon et al.，Cell 39:499-509，1984）、Ｂ４３転写活性化ドメイン（Ma and Ptashne，Cell 51:113-119，1987; Ruden et al.，N ature 350:426-430，1991）およびインフルエンザウィルス血球凝集素蛋白からの１２ＣＡ５エピトープタグ（Green et al.，Cell 28:477-487，1982）を担持している。プレイ−コード化プラスミドをＥＧＹ４８／ｐ１８４０中に導入したあと、百万個以上の形質転換体が単離され、そのうち３−４×１０⁵が融合蛋白を発現した（下記の実験手順を参照）。コロニーを溜め、希釈し、ライブラリ暗号化蛋白の合成を誘導するためにガラクトースの存在の下で培養液の中で５時間成長させた。つぎにそれぞれの原形質転換体が約２０倍になるようにプールを再度希釈して、ロイシンのないガラクトース含有媒養基上で培養した。約２×１０⁷の細胞から４１２のＬＥＵ２＋コロニーが単離された。これらのコロニーの内の５５は、おそらくｌａｃＺレポーターの低い感作性のためにガラクトースＸｇａｌ媒養基上で青かった。両方のレポーターが活性化している全ての細胞内で、両方の表現型がガラクトース依存型であり、それらがライブラリーコード化蛋白を必要としたことがわかった。ライブラリプラスミドはこれらの細胞から救済され、制限マッピングによって３つの等級の１つに割り当てられ、プラスミドは最長ｃＤＮＡインサートを含むそれぞれの等級から識別された。プラスミドによる融合蛋白の合成は抗エピトープ抗血清をもちいてウェスタンブロット分析によってケースごとに確認された。詳細なマッピングと部分的ＤＮＡ配列決定によってさらに分析することによって、回復したｃＤＮＡ等級の内の２つが先に識別された遺伝子コード化ＣＫＳ１ｈｓとＣＫＳ２ｈｓと同一であることがわかった（Richardson et al.，Genes D ev．4:1332-1344，1990）、これはＳ．ポンベｓｕｃ１⁺生成物のヒトの相同物である。第３の制限マップ等級の配列決定からそれがさきに識別されなかった遺伝子であることがわかった。この遺伝子はＣｄｃ２Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ１からとってＣＤｉ１と命名され、その蛋白生成物はＣｄｉ１と名付けられた。ＣＤＩ１遺伝子はＣｄｃ２とＣｄｉ１のあいだの相互作用の再現性と特異性を試験するためにＥＧＹ４８誘導株（すなわち、ことなるＬｅｘＡ融合ベイトをふくむＥＧＹ４８／１８４０）のパネル内に導入された。Ｃｄｉ１と所与のベイト（水平縞）または同じベイトとライブラリベクタを対照（隣接する垂直縞）として含んでいる８個の個別転換細胞からの細胞を爪楊枝で３つのプレートのそれぞれの上に縞を付けた（図４）。図４に示したプレートは、「対照」プレートとして、ベイトプラスミド、ＬｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺレポーターとＣｄｉ１発現プラスミドの存在のために選択したＵｒａ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ￣グルコースと、「グルコース」プレートとして、ＬｅｘＡｏｐ−ＬＥＵ２レポーターの活性化のためにさらに選択した、Ｕｒａ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ￣Ｌｅｕ￣グルコースプレートと、「ガラクトース」プレートとしてＬｅｘＡｏｐ−ＬＥＵ２レポーターの活性化のために選択し、Ｃｄｉ１の発現をもたらした、Ｕｒａ￣Ｔｒｐ￣Ｈｉｓ￣Ｌｅｕ￣ガラクトースプレートを含んでいた。この試験に用いたベイトには（１）ＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２、（２）ＬｅｘＡ−Ｂｉｃｏｉｄ、（３）ＬｅｘＡ−Ｍａｘ、（４）ＬｅｘＡ−ＣＬｎ３、（５）ＬｅｘＡ−Ｆｕｓ３と（６）ＬｅｘＡ−ｃＭｙｃ −Ｃｔｅｒｍが含まれる（図４）。ＬＥＵ２とｌａｃＺ転写表現型から判断すると、Ｃｄｉ１はＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２と特異的に相互作用を起こし、ＬｅｘＡ−ｃＭｙｃ−Ｃｔｅｒｍ、ＬｅｘＡ− Ｍａｘ、ＬｅｘＡ−Ｂｉｃｏｉｄ、ＬｅｘＡ−Ｃｌｎ３またはＬｅｘＡ−Ｆｕｓ３とは相互作用を起こさない（図４）。Ｃｄｉ１は、後述のごとく、ＬｅｘＡ− Ｃｄｃ２８をはじめとする他のＣｄｃ２族蛋白との相互作用も起こす。出願人らはさらに、グルコースにおいて、ＬｅｘＡ−Ｃｌｎ３ベイトがＬｅｘＡｏｐ−ＬＥＵ２レポーターをわずかに活性化するが、グルコースにおいて、炭素源の劣性とＡＤＨ１プロモーターから消滅したベイト発現がこのバックグラウンドを除去したことにも注目している。つぎにＣｄｉ１／Ｃｄｃ２相互作用の特異性を、免疫沈降実験をはじめとする物理的基準によって確認した。抽出物はタグ付きＣｄｉ１の合成を導き、ＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２またはＬｅｘＡ−Ｂｉｏｃｏｉｄベイトのいずれかをふくむライブラリプラスミドを含むＥＧＹ４８細胞から製造した。特に、細胞１００ｍｌをグルコースまたはガラクトース媒養基中（その中にＣｄｉ１発現が誘導された）で０．６−０．８のＯＤ₆₀₀まで成長させ、遠心分離でペレットにし、５００μｌのＲＩＰＡ中に再懸濁し、２分間ずつ５回ガラス玉をぶつけて溶解し、４℃で小型遠心分離器（１０、０００×Ｇ）中で５分間×２回旋回させてビーズと細胞の破片を分離した。この上澄みを５μｌとって対照とし、１５μｌのウサギの抗ＬｅｘＡ抗血清を残りに加え、回転台上で４時間のあいだ４０℃に保温した。ＬｅｘＡ含有蛋白はＷｉｔｔｅｎｂｅｒｇとＲｅｅｄ（ Cell 54:1061-1072，1988）に記載のごとく、５０μｌのＳｔａｐｈＡ被覆セファローズビーズ（Pharmacia，Piscataway，NJ）でこの残りから最初に沈降した。次にペレット全体をＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中に溶解し、１２．５％蛋白ゲル（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）上を走らせ、ニトロセルロース上にブロットした。タグ付きのＣｄｉ１融合蛋白はほぼＳａｍｓｏｎら（Cell 57:1045-1052，198 9）に記載どおりに１２ＣＡ５モノクローナル抗血液凝集素抗体によるブロットした蛋白のウェスタン分析で識別した。結果は図５に示したが、レーンは次のとおりである：（１）ガラクトース培地、ＬｅｘＡ−Ｂｉｃｏｉｄベイト、免疫沈降、（２）グルコース培地、ＬｅｘＡ −Ｂｉｃｏｉｄベイト、免疫沈降、（３）ガラクトース培地、ＬｅｘＡ−Ｂｉｃｏｉｄベイト、細胞抽出物、（４）グルコース培地、ＬｅｘＡ−Ｂｉｃｏｉｄベイト、細胞抽出物、（５）ガラクトース培地、ＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２ベイト、免疫沈降、（６）グルコース培地、ＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２ベイト、免疫沈降、（７）ガラクトース培地、ＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２ベイト、細胞抽出物、と（８）グルコース培地、ＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２ベイト、細胞抽出物。図５に示されるごとく、抗ＬｅｘＡ抗血清はＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２とＣｄｉ１を含む後部抽出液からＣｄｉ１を沈降させたが、ＬｅｘＡ−ＢｉｃｏｉｄとＣｄｉ１を含むものからは沈降しなかったので、Ｃｄｉ１はＣｄｃ２を含むベイト蛋白としか物理的に相互作用を起こさないことが確認される。ＣＤｉ１蛋白生成物Ｃｄｉ１蛋白生成物を分析するために、Ｃｄｉ１ｃＤＮＡを４つの異なる長さのｃＤＮＡを含む１２の異なるライブラリプラスミドから単離した。配列の分析から全てのｃＤＮＡインサートが開いた読み取り枠を有することがわかり、最長ｃＤＮＡの配列（図６）の検査からＫｏｚａｋ共通翻訳開始配列（ＰｕＣＣ／ＧＡＴＧＧ）（Kozak，Cell 44:283-292，1986）に完全に整合するＡＴＧが判明した。ＨｅＬａ細胞内のＣｄｉ１ｍＲＮＡの大きさを完全に分析すると、このＡＴＧはｃＤｉ１メッセージの５’末端から１５と４５ヌクレオチドのあいだで発生したことが判明したので、最長ｃＤＮＡはオープンリーディングフレーム全体にわたると思われる。ＣＤｉ１遺伝子は２１２アミノ酸の蛋白をコードすると予測されている。Ｃｄｉ１アミノ酸配列は先に識別された蛋白のどれとも明らかな類似性を示していない。しかしながら、蛋白配列について２つのことが注目される。第１に、アミノ末端の３５のアミノ酸中１９はプロリン、グルタミン酸、セリンまたはトレオニンのいずれかである。ＰＥＳＴ配列と呼ばれるこれらの伸長部を有する蛋白は迅速に劣化すると思われる（Rogers et al.，Science 234:364-368，1986）、事実、Ｃｄｉ１のこの伸長部は、ＰＥＳＴ配列が機能することがわかっている酵母Ｇ１サイクリンのＣ末端よりもこれらのアミノ酸が豊富である（Cross，Mol．Cell ．Biol 8:4675-4684，1988; Nash et al.，EMBO J．7:4335-4346，1988; Hadwig er et al.，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 86:6255-6259，1989）。第２に、プラスミドがそこからコード化されたｃＤＮＡライブラリはオリゴｄＴで開始され、全ての単離されたｃＤｉ１ｃＤＮＡは定義上Ｃｄｃ２と相互作用した蛋白質をコード化したのだから、スクリーニングで得られたＣｄｉ１ｃＤＮＡの大きさを分析して、Ｃｄｃ２からＣｄｉ１のＣ末端−１７０アミノ酸との相互作用に充分な蛋白の部分を必然的につきとめられる。酵母の中のＣｄｉ１機能の分析Ｃｄｉ１機能を理解するための最初の努力の一環として、酵母におけるＣｄｉ１発現の効果を検討した。特に、Ｃｄｉ１はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣｄｃ２８をはじめとするＣｄｃ２族の蛋白と相互作用するので、Ｃｄｃ２８と相互作用する他の既知の蛋白に依存する表現型にＣｄｉ１が影響するかどうか検討を実施した。この目的のために、Ｓ．ポンベｓｕｃ１⁺またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣｋｓ蛋白の発現が特定のｃｄｃ２８^ts対立遺伝子を有する株の温度感作性を救済するという事実が利用された。この効果は不安定なＣｄｃ２８^ts蛋白と複合体を形成し、それを熱変性から保護するこれらの蛋白の能力によるものと考えられる（Hadwiger et al.，Proc．Nat．Acad.Sci．USA 86:6255-6259，1989）。Ｃｄｉ１発現は試験したｃｄｃ２８の温度感作性を救済しないことがわかった、ただしヒトＣｋｓ２は救済する。つぎに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはより高い真核生物のサイクリンの発現にともなう２つの表現型のいずれかを酵母に与えるＣｄｉ１の能力が検査された。かかる表現型にはα因子によるＭＡＴａの阻止に対する耐性、Ｃｌｎ１、Ｃｌｎ２、Ｃｌｎ３が欠如した株の成長阻止の救済などがふくまれる。しかし、ここでも、Ｃｄｉ１発現はどの表現型も付与しなかった。最初の研究のあいだ、Ｃｄｉ１の発現が酵母細胞サイクル進行が阻止されることがわかった。Ｃｄｉ１を発現した細胞の培養は対照群よりもおそくその細胞数と光学的密度を増した（図７Ａ）。この成長遅延表現型をもっとくわしく調べるために、Ｃｄｉ１発現細胞の形態を検査した。Ｗ３０３細胞はＣｄｉ１合成を導くガラクトース誘導ベクタであるｐＪＧ４−４Ｃｄｉ１で転換した。細胞の形態は１０００倍の倍率でＮｏｍａｒｓｋｉレンズで検査した。図８に示すごとく、細胞のこのような顕微鏡検査によって、対照と比較したとき、Ｃｄｉ１が発現した細胞は大きく、部分母集団は異常な形態を示すことがわかった、すなわち細胞の５％は伸長した奇形を形成し、５％は多数の芽を出した。ＤＡＰＩで染めた（後述）これらの細胞のサンプルを免疫蛍光法で検査したところ一番大きな細胞のいくつかのものの核は濃縮されないことが示された。最後に、細胞の発芽能力を検査した。対照群とＣｄｉ１を発現する群からの４００の細胞のサンプルを位相差顕微鏡で検査し、発芽率をＷｉｔｔｅｎｂｅｒｇとＲｅｅｄ（Mol．Cell．Biol．9:4064-4068，1989）に記載のごとくそれぞれの群の発芽細胞数の百分率で計算した。図７Ｂに示すごとく、Ｃｄｉ１発現群の細胞の１０％未満が発芽を示し、対照群の細胞の発芽率は３０％であったので、Ｃｄｉ１発現群の細胞の中でＧ１からＳ遷移をへたものは少ないと思われる。この所見は細胞の大きさの増加と成長遅延もＧ１の延長によるものとの仮説と整合している。この仮説はさらに細胞ＤＮＡのＦＡＣＳ分析によって試験された。特に、Ｃｄｉ１をふくむＷ３０３細胞は上記のごとく成長させ、２％グルコースまたは１％ラフィノース、１％ガラクトース中でＯＤ₆₀₀＝０．１で希釈し、ＯＤ₆₀₀＝０．８−１．０に成長させた。この点で、細胞を採集し、超音波分解し、７０％エタノールで固定し、沃化プロピジウムで染色し、前述のごとく（Lew et al.，Cell 63:317-328，1992）ＤＮＡ含有率を測定するためにＦＡＣＳ分析にかけた。およそ２０、０００の事象を分析した。これらの結果は、図７Ｃに示したごとく、Ｃｄｉ１発現群内の細胞の大半は細胞ＤＮＡの量をふやすことを示している。このことはおそらく数が増えた細胞はＳ相にあることを示している、あるいは細胞のサイズが大きくなり、ミトコンドリアＤＮＡの量が増加した結果にすぎないのかもしれない。まとめると、このようにこれからの実験はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内の伸長したＣｄｉ１発現は、まずまちがいなくＧ１中の細胞比率の増加によって、細胞が細胞サイクルをとおる通過の遅延を引き起こすことを示している。さらにこのようにして、Ｃｄｉ１発現が細胞サイクル進行のこれら２つの基質のあいだの正常な共時態を分離することも示している。Ｃｄｉ１はＣｄｃ２族の蛋白と相互作用するので、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内のＣｄｉ１成長遅延表現型はＣｄｃ２８が細胞をＧ１越えられなかった蛋白複合体に取り込まれることによって説明できると仮定された。この仮説を試験するために、過剰発現した固有ヒトＣｄｃ２のある、およびそれがないＣｄｃ２８を含む細胞内の固有Ｃｄｉ１発原効果を比較した。具体的には、ガラクトース誘導Ｃｄｉ１発現ベクタおよび／またはＣｄｃ２発現ベクタの指定された組合せを担持するＷ３０３細胞を、２％のラフィノースの存在の下でトリプトファンとヒスチジンの欠けた完全な最小媒養基内で１４時間成長させた。次に細胞を洗浄し、２％のグルコースまたは１％のラフィノースと１％のガラクトースのいずれかを含有する同じ培地内でＯＤ₆₀₀＝０．１に希釈した。光学的密度は２時間おきに１２時間のあいだ測定した。これらの成長測定実験の結果は図７Ａに示した。意外なことに、追加のＣｄｃ２の存在はＣｄｉ１に依存する成長阻止の重さを増した（図７Ａ）。この結果はＣｄｉ１がＣｄｃ２族の蛋白に１つの新しい機能、少なくともＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、細胞にＧ１とＳを越えさせるそれらの能力を阻害する機能を付与したことがうかがわれる。Ｃｄｉ１とＣｄｃ２発現プラスミドはともにグルコース培地内においてさえも、ある成長阻害も引き起こすが、この結果は発現プラスミド上のＧＡＬプロモーターからの漏れやすい発現に帰された。哺乳類の細胞内のＣｄｉ１機能の分析酵母における上述の結果からＣｄｉ１はＧ１またはＳを越える哺乳類の細胞の能力にも同様の効果をもつことが推測される。Ｃｄｉ１はＨｅＬａｃＤＮＡから単離されたのだから、これらの細胞中でＣｄｉ１ｍＲＮＡが発現した細胞サイクル中の箇所が最初に測定された。具体的には、付着ＨｅＬａ細胞はＬｅｗら（Cell 66:1197-1206，1991）に記載のごとく二重チミジンブロックによって（Rao and Johnson，Nature 225:159- 164，1970）遅れたＧ１に同期した。ブロックから解除したあと３時間おきに細胞のアリコートを採取した。解除された細胞は、ＤＮＡ内容のＦＡＣＳ分析で測定して、解除から９時間後に細胞サイクル内に再投入した。トータルＲＮＡは異なる時点でそれぞれのアリコートから調整し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上を走らせて、Ausubelらに記載のごとく（Current Protocols in Molecular Bi ology ，New York，John Wiley & Sons，1987）ナイロン上にブロットした（Nytr an，Schleider and Schuell，Keene，NH）。ブロットはｃＤｉ１を含む６９０ｂｐＥｃｏＲＩ断片、ヒトのサイクリンＥ配列からの１３８９ｂｐＰｓｔＩ断片（Lew et al.，Cell 66:1197-1206，1991）、ヒトサイクリンＢ１遺伝子のコード配列からの１２２８ｂｐＮｃｏＩ−ＳｐｈＩ断片（Pines and Hunder， Cell 58:833-846，1989）および標準化対照の役割をはたす全長ヒトリン酸グリセルアルデヒド＝デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）遺伝子を担持する１２６８ｂｐＰｓｔＩ断片（Tokunaga et al.，Cancer Res．47:5616-5619，1987）から製造した無作為に開始させたＤＮＡプローブ（Feinberg and Vogelstein，Anal．B iochem．132:6-13，1983）で厳密に調べた。図９Ａに示したごとく、Ｃｄｉ１ｍＲＮＡの発現は、サイクリンＥメッセージの発現と平行して、Ｇ１からＳへの遷移の直前の、Ｇ１の端でピークになる。この時間的発現パターンはＣｄｉ１発現がＧ１からＳへの遷移に影響するのではないかという仮説と整合していた。この仮説をさらに検討するために、ＨｅＬａ細胞は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウィルスＬＴＲ（下記参照）の制御の下にあるＣｄｉ１の合成を導いた構造であるｐＢＮＣｄｉ１、またはベクター単体のいずれかでトランスフェクションされた。個別の転換クローンはＧ４１８に対する耐性によって選択し、これらのクローンからの細胞を沃化プロピジウムで染色し、ＤＮＡの内容を測定するためにＦＡＣＳ分析にかけた（後述）。Ｇ１の中点はそれぞれのグラフの分散モードと定義された、２つのパネル上のモードは高さが異なっていた（ベクターから転換した細胞では２７２カウント、Ｃｄｉ１を含む細胞では１０１カウント）、Ｃｄｉ１発現細胞内のこの広くなったピークはおよそ１×ＤＮＡ内容を含む群の比率が増したことを反映していた。４つの独立した形質転換体を分析したが、どれも同じような結果を示した。図９Ａに示したこれらの結果は、Ｃｄｉ１が発現した細胞内の群が対照群に比較してＧ１内の細胞の増加した群をふくんでいることを示していた。Ｃｄｃ２−Ｃｄｉ１相互作用Ｃｄｉ１によって認識されるＣｄｃ２の決定子を識別するために、Ｃｄｉ１は酵母、ヒト、ハエからのＣｄｃ２蛋白、ならびに酵母Ｆｕｓ３蛋白キナーゼを含む異なるベイト蛋白のパネルと相互作用する能力を試験した、この蛋白キナーゼはＣｌｎ３の負の調節を行い、配列の標準によって、これらの蛋白相互間よりもＣｄｃ２蛋白への関係が少ない蛋白キナーゼである（Elion et al.，Cell 60:64 9-664,1990）。これらの実験を実施するために、タグ付きＣｄｉ１のガラクトース誘導合成を導いたプラスミドを含むＥＧＹ４８／ＪＫ１０３（後述）を異なる転写不活性ＬｅｘＡ−Ｃｄｃ２族蛋白ベイトの系列の１つで転換した。それぞれのベイトの５個の異なる形質転換体は２％のガラクトースを含むが、ウラシル、トリプトファンとヒスチジンの欠けた最小媒養基内でＯＤ₆₀₀＝０．５〜１．０まで成長させた。結果は表１に示した通りで、β−ガラクトシダーゼ単位で表した。個別の形質転換体の間の変動は２０％未満であった。表１に示したごとく、タグ付きのＣｄｉ１はこれらのベイトから他のレベルへの転写を促したが、それを対象として選択されたヒトＣｄｃ２ベイトを含む株では強く活性化し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣｄｃ２８またはヒトＣｄｋ２ベイトを含む株ではそれより弱く、２つのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＣｄｃ２相同体の１つであるＤｍＣｄｃ２ベイトをふくむ株ではごくわずかにしか活性化しなかった（Jimenez et al.，EMBO J．9:3565-3571，1990; Lehner and O'Farrell，E MBO J．9:3573-3581，1990）。ＤＭＣｄｃ２ｃベイトまたはＦｕｓ３を含む株では、Ｃｄｉ１は全く活性化しなかった。このパネルの中のベイトは配列に関係があり、同じベクタから製造され、おなじ５’非翻訳配列と同じＬｅｘＡコード化配列を有するメッセージから翻訳され、同じ量の酵母内に発現しているので、ベイト株のあいだの転写の差はタグ付きＣｄｉ１との相互作用の差を反映している可能性が高かった。Ｃｄｉ１が認識するかもしれないＣｄｃ２蛋白上の残基を識別するために、転写相互作用データをベイトの配列と比較した。ベイト配列のラインアップに、Ｃｄｉｄ１がそれと相互作用した蛋白内に保存されたが、Ｃｄｉ１が触れなかった蛋白が異なる残基をさがした。この基準を用いて識別された７つの残基は、図７に＊印で示されている。これらの残基の中でＧｌｕ５７とＧｌｙ１５４（ヒトＣｄｃ２内）の２つは、化学的種類が異なるアミノ酸と相互作用しないベイト内で変更された。ＤｍＣｄｃ２ｃにおいて、残基５７はＧｌｕからＡｓｎに、残基１５４はＧｌｙからＡｓｎに変更された、またＦｕｓ３において、これらの残基はＨｉｓとＡｓｐに変更された。ヒトＣｄｃ２において、これらの残基の両方がサイクリンとの相互作用に必要な分子の領域を結合する（Ducommun et al.，Mol.C ell．Biol．11:6177-6184，1991）。ヒトＣｄｃ２１次配列をウシｃＡＭＰ依存蛋白キナーゼについてＫｎｉｇｈｔｏｎらが解いた構造上に投影すると（Scienc e 253:407-413，1991）、残基５７と１５４は事実上折り畳まれた蛋白内のこれらのサイクリン接触点に近い可能性があることがうかがわれた。このように、これらの結果はＣｄｉ１が特定のシクリンに対するＣｄｃ２蛋白の親和性を変化させ、したがって、潜在的にその基質の特異性を変えることによってその効果を発揮するという仮説と整合している。まとめると、Ｃｄｉ１はＣｄｃ２族の蛋白と複合体をつくる蛋白である。それはＧ１からＳへの遷移時間の前後に発現し、上述の結果から、サイクルのこの部分をとおる細胞の通過に負の調節をおこない、それによって細胞外信号を接続する調節ネットワークを結合することがうかがわれる。Ｃｄｉ１が実際に負の調節子であるならば、その正規の機能がＧ１のあいだ細胞サイクルを遅延させるか阻止する信号を運ぶことにあるのではないかと考えることは興味深い。正常な差別化とガンの両方がＧ１調節の変化の結果であると考えられるので、この仮説から、差別化を可能にするためにＣｄｉ１が活性サイクルから細胞を除去する役割を果たし（Pardee，Science 246:603-608，1989）、Ｇ１の正規機構内の損傷がＣｄｉ１がその効果を全面的に発揮することを妨げる可能性が示唆される。実験手順バクテリアと酵母特記事項無き限り、バクテリア株とＤＮＡの操作は標準法にしたがった（参照：Ausbel et al.，Current Protocols in Molecular Bioloby, New York，John Wiley & Sons，1987; and Sambrook et al.，Molecular Cloning; a Laboratory Manual, Cold Spring Mabor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory，1989、など）。全体を通じてバクテリア寄主にはE．coli″Sure″mcrA△（mrr，hsdRMS， mcrBC）endAl supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5（kan^R ）uvrC/F′［proAB,lacI^q Z△_M15］::Tn10（tet^R）（Stratagene Inc.，Lajoll a，CA）とKC8（pyrF::Tn5 hsdR leuB600 trpC9830 lac△７４ strA galK hisB4 36）が用いられた。Ｃｄｉ１がｃｄｃ２８のＧ１またはＧ２機能を補足したかどうかを決定するために下記の酵母株を用いた：制限的温度で主としてＧ２内で阻止するｃｄｃ２８ −１Ｎ（MATa ura3 adel trpl cdc28-1N）と、制限的温度で主としてＧ１のあいだ阻止するｃｄｃ２８−１３（MATα leu2 trp1 his3 ura3 ade1 tyr1 cdc28-13 ）及びｃｄｃ２８−１７（MATa leu2 trp1 his3 ura3 met14 arg5 arg6 tyr1 cd c28-17）。これらの株中に、アミノ末端に血液凝集素エピトープタグを含むＣｄｉ１の合成を導く酵母発現プラスミドであるｐＪＧ４−６Ｃｄｉ１（後述）と、正の対照として、ｐＪＧ４−７Ｃｋｓ２（同じ選択から誘導）を導入した。これらの株を一晩培養して２％グルコースと２％ガラクトースを含むｔｒｐ￣完全最小媒養基内に２０：１に希釈し、２５℃で５時間成長させた。これらの培養希釈物を同じ炭素源を含む二重板上で培養し、一方の板は２５℃に、他方は３６℃においた。５日間保温した後、コロニーを数えた。Ｃｄｉ１がＧ１サイクリン内の株欠損を補足したかどうかを決定するために、正の対照としてｐＪＧ４−７Ｃｄｉ１またはＧＡＬ１−ＣＬＮ３構造が導入された株３ｃ−１ＡＸ（MATa bar1 △cln1 △cln2 △cln3 cyh2 trp1 leu2 ura2 ade1 his2［pLEU2-CYH2（CYH^S）-CLN3⁺］）を用いた。一晩培養してからグルコースとガラクトース培地内に上述のごとく希釈し、３０℃で５日間増殖させた。培地が１０μｇ／ｍｌのシクロヘキサアミドを含有する他は上述と同じグルコース＝とガラクトース＝含有培地上で細胞を培養し、細胞を３日間増殖させ、数えた。コロニーはＣＹＨ^s−ＣＬＮ３⁺プラスミドが失われたときだけこの培地上に生じるが、この事象自体は他のプラスミドがＣｌｎ欠損を救済するときにだけ発生する。 α因子による阻止に対する耐性を生じるＣｄｉ１の能力は、自生Ｃｄｉ１の合成を導くプラスミドであるｐＪＧ４−４Ｃｄｉ１が導入されたＷ３０３の誘導体（MATa trp1 ura3 his3 leu2 can1 bar1::LEU2）を用いて試験された。株Ｗ３０３も正の対照としてα因子耐性を付与する能力によって単離された１組の哺乳類のｃＤＮＡによって転換された。一晩培養して、上述のごとくグルコースとガラクトース内で増殖させてから１０^-7Ｍのα因子の存在の下で、あるいはそれなしに、グルコースとガラクトースの媒養基に植えた。３日後にコロニーを数えた。増殖率の実験でＷ３０３には，ＡＤＨ１プロモーターの制御の下に酵母中に固有ヒトＣｄｃ２の合成を導くＨＩＳ３⁺プラスミドであるｐＪＧ１４−２またはベクタ対照のいずれかと組み合わせてｐＪＧ４−４Ｃｄｉ１またはベクター対照が含まれていた。２％のラフィノースを含むＨｉｓ−Ｔｒｐ−最小培地内で一晩増殖させた培養物を採取し、洗浄して、２％グルコースまたた１％ガラクトース＋１％ラフィノースを含む新しい媒養基内でＯＤ₆₀₀＝０．１まで希釈した。２時間ごとに取ったアリコートのＯＤを測定して成長速度を追跡した。ベイトオペレーター占有を最適化するために、ベイトは本質的にＡＤＨ１プロモーターの制御の下に製造され（Ammerer，Math．Enzym．101:192-210，1983）、ＬｅｘＡＣ末端低重合体化領域を含んでいたので、ＬｅｘＡ含有蛋白によるオペレーター占有に貢献したが、それはおそらく隣接するオペレーターの半分部位のＬｅｘＡ網の末端の正確な整列を助けるからである（Golemis and Brebt，Mol．Ce ll．Biol．12:3006-1014，1992）。これまで検査した全てのＬｅｘＡ−ベイト蛋白が、他の核局在化信号を含んでいないかぎりＬｅｘＡ誘導体が特異的に核に局在していない場合でも、オペレーターの結合を可能にするのに充分な濃度で酵母の核に進入することは注意に値する（参照：Silver et al.，Mol.，Cell．Biol. 6:4763-4766,1986など）。ｐＬ２０２ｐｌは開示されている（Ruden el al.，Nature 350:426-430，1991 ）。ｐＭＡ４２４とｐＳＨ２−１（Ma and Ptashne，Cell 51:113-119，1987; H anes and Brent，Cell 57:1275-1283，1989）と近い関係にあるこのプラスミドはＨＩＳ３⁺マーカーと２μレプリケーターを担持し、アミノ末端に野生種のＬｅｘＡ蛋白を担持する融合蛋白の酵母内での合成を導く。本研究に使用したベイトはつぎのように作られた：ヒトＣｄｃ２（Lee and Nurse，Nature 327:31-35 ，1987）、Ｃｄｋ２（Tsai et al.，Nature 353:174-177，1991）およびＳ．セレビシエＣＤＣ２８遺伝子（Lorincz and Reed，Nature 307:183-185，1984）をＶｅｎｔポリメラーゼを用いるＰＣＲによって増幅し（New England Biolabs，B everley，MA）、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＬ２０２ｐｌ内にクローン化した。これらの蛋白にはＬｅｘＡの最後のアミノ酸とベイト蛋白の間に挿入された２つのアミノ酸（glu phe）を含んでいた。ドロソフィラＣｄｃ２（Jimen ez et al.，EMBO J．9:3565-3571，1990; Lehner and O'Farrell，EMBO J．9:35 73-3581，1990）はＰＣＲ増幅に続いてＢａｍＨＩ−Ｓａ１Ｉ断片としてクローン化された。ＬｅｘＡ−Ｆｕｓ３（Elion，Cell 60:649-664,1990）とＬｅｘＡ −Ｃｌｎ３（Cross，Mol．Cell．Biol 8:4675-4684，1988，Nash et al.，EMBO J.7:4335-4346，1988）はＢａｍＨＩ断片としてクローンされた他は同様な仕方で製造された。これらのプラスミドはＬｅｘＡとベイトの間に挿入された５個のアミノ酸（glu phe pro gly ile）（配列識別番号：２）を含んでいた。これら全ての融合は第２のアミノ酸から停止コドンまでの暗号化領域全体を含んでいた。ＬｅｘＡ−ｃＭｙｃ−ＣｔｅｒｍはヒトｃＭｙｃのカルボキシ末端の１７６のアミノ酸をふくみ、ＬｅｘＡ−ＭａｘはヒトＭａｘ暗号化配列の全てを含んでいた。ＬｅｘＡ−Ｂｉｃｏｉｄ（アミノ酸 2-160）は開示されている（Golemis a nd Brent，Mol．Cell．Biol．12:3006-3014，1992）。リポータ相互作用トラップにおいては、LexAop-LEU2構造のリポータ１個をイースト染色体LEU2遺伝子で置き換えた。LexAop-GAL1-lacZ遺伝子の一つである（ブレントおよびプタシュン、セル43:729-736、1985；カメンズ他、モル．セル．バイオル． 10:2840-2847、1990）他のリポータは、２μプラスミドで運んだ。リポータは、恐らく２つのリポータからUASを全て取り除いていることと、プロモーターに導入されたLexAオペレーターが転写を少なくする傾向があるという事実（原因は不明）の２つの理由によって、基礎転写が非常に低くなるように設計された（ブレントおよびプタシュン312:612-615、1984；レック、DNA結合FosおよびMyc蛋白質による遺伝子の活性化。博士論文、ハーバード大学、1990）。リポータは、LexA 融合蛋白質による活性化に対する反応を変えるように選択した。本研究では、LE U2リポータは、E.coli colE1の上流に見られる高親和性結合サイトの３つのコピーを含み（エビナ他、J.バイオル．ケム．258:13258-13261、1983；カメンズ他、モル．セル．バイオル．10:2840-2847、1990）、そのため恐らくベートの６二量体全てを結合する。これとは対照的に、初期スクリーンに用いたlacz遺伝子は、ベートの二量体１個を結合する単一の低親和性コンセンサスオペレーター（プラントおよびプタシュン、ネーチャー312:612-615、1984）を含むものであった。LEU2リポータ内のLexAオペレーターは、lacZリポータの中よりも転写開始点に近かった。数、親和性およびオペレーターの位置におけるこれらの違いはすべて、この方法にとって有用な性質である、LEU2遺伝子がlacZ遺伝子より感度のよいインジケーターとすることに寄与した。 p1840およびpJK103はすでに説明した（ブレントおよびプタシュン、セル43:72 9-736、1985、カメンズ他、モル．セル．バイオル．10:2840-2847、1990）。pHR 33（エラーストローム他、プラントモル．バイオル．18:557-566、1992）は、Hi ndIIIで切断し、yEP24の誘導体であるyEP24M13-2によるURA3⁺遺伝子を含む-1166 bp断片は、pLEU2-0を操作するためにその中に導入された。このプラズミドは、主要LEU2転写開始点の上流にBg1IIサイト87ヌクレオチドを含む。pLEU2-0はBg1I Iで切断し、コレシンE1遺伝子（エビナ他、J.バイオル．ケム．258:13258-13261 、1983）の上流に見られるオーバーラップするLexAオペレーターを含み、また恐らく2LexA二量体を結合する42bp二本鎖Bg1II末端のオリゴマー5'GATCCTGCTGTATA TAAAACCAGTGGTTATATGTACAGTACG3′（配列番号3）3′GACGACATATATTTTGGTCACCAAT ATACATGTCATGCCTAG 5′（配列番号4）がその中に導入された。このオリゴマーの 3つのコピーを含むプラスミド１個、pLEU2-LexAop６、が選択されたが、これはLexA融合蛋白質の二量体６個を結合すると思われる。選択菌株 EGY12（MATa trp1 ura2 LEU2::pLEU2-0（△UASLEU2））およびEGY38（上記と同じ、ただし::pLEU2-LexAop6）は、次のように構成された。pLEU2-0とpLEU2-Le xAop６は、LEU2遺伝子内のClaIで消化して直線化し、DNAがリチウムアセテート形質転換（イトー他、J.バクテル．153:163-168、1983）によってU457（MATaSUP 53-a ade2-1 can1-100 ura3-52 trp1-1 ［phi+］）に導入され；LEU2に統合されたプラスミドDNAを含むと見られるura⁺コロニーが選択された。これらの形質転換体の一部は、YPDの中で育成された。Ura~細胞は、これらの培養基を、5-FOA（オースベル他、分子生物学における現状のプロトコル、ニューヨーク、ジョンワイリー＆サンズ、1987）を含む培地上に植え付けることによって選択された。プラスミドはともにTY1エレメントを内包する。各統合において、一部のura3~復帰突然変異体藻trp1~であったが、これはURA3⁺マーカーが、LEU2プラズミドの上の TY1系列とSUP53-aの上流の染色体TY1エレメントを含む相同再結合において消滅したことを窺わせる（オリバー他、ネーチャー357:38-46、1992）。各統合によるTrp-、EGY12（LexAオペレーターなし）およびEGY38（オペレータ6個）が保全された。これらは、GG100-14Dと接合された（MATa his3 trip1pho5）。結果として得られたジオプロイドは、胞子形成され、任意に（MATa leu2- ura3- trp1- h is3- GAL+）選んだ多数の胞子生成物が回収された。EGY40とEGY48は、このハイブリッドの結果であり、EGY40はLexAオペレーターを持たないが、EGY48は６個持っている。ベート菌株を作るため、EGY48オペレーターを、P1840またはpJK103ならびに別のベートプラズミドにより形質転換した。二重形質転換体をグルコース Ura~ His~プレート上で選択し、ベート蛋白質の発現をアンチ-LexA抗体を使ったウェスターンブロッティングと標準の技術で確認した。ライブラリー（“プレイ”）発現ベクターライブラリーエンコード蛋白質を、相互作用トラップに使われ、分離した蛋白質の分析に役立つように設計された一連の表現プラズミドの仲間であるpJG4-5から発現した。これらのプラスミドはすべてイーストにおける高複製数を約束する 2MレプリケーターとTRP1マーカーを内包する。pJG4-5は次の特徴を持つように設計された、すなわちライブラリー蛋白質の条件付き発現ができるガラクトース誘導プロモーター、その検出を容易にするエピトープタグ、選択されたものの感度を増加するために核間密度を最大にする核局在化信号および弱酸ブロッブ活性ドメイン（Ｍａおよびプタシュナ、セル51:113-119、1987）。このドメインは、次の２つの理由で選ばれた、すなわちその活動が主要なGAL4活性度メインのようなよく知られたイースト蛋白質による抑制の対象とならないこと、またより重要なこととして、これがより弱いアクチベーターであって、回収された相互作用蛋白質の数と種類を制限する可能性が高い抑制、その他のメカニズムによる毒性を排除すると見られることである（ギルおよびプタシュナ、ネーチャー334:721-724 、1988）。 pJG4-5は、次のように構成された。GAL1プロモーターとADH1ターミネーターを含む「発現カセット」と、107アミノ酸領域をコードした345 ntインサートを、T RP1遺伝子、2Mレプリケーター、pUC13レプリケーションオリジンおよびアンピシリン耐性遺伝子を内包するpJG4-0に挿入した。pJG4-5発現カセットは、それぞれが次のものをアミノ末端に、またアミノはカルボキシル末端に持つ融合蛋白質の合成を制御する、すなわちATG、SV40核局在化系列（PPKKKKVA）（配列番号5）（カルデロン他、セル39:499-509、1984）、B42酸ブロッブ転写活性ドメイン（Ｍａおよびプタシュン、セル51:113-119、1987）およびHA1エピトープタグ（YPYDV PDYア）（配列番号6）（グリーン他、セル28：477-487、1980）（図3C）。このプラスミドの他に、これらの実験では２つのCdil発現プラスミドが使われた。プラスミドpJG4-4Cdilを作るためにEcoR1-XhoI Cdilを含有する断片がpJG4-4に導入され、CdilはGAL1プロモーターの制御の下で固有の、融合していない蛋白質としてこのプラスミドから転写された。プラスミドpJG4-6Cdilを作るためにEcoRI-Xh oI Cdilを含有する断片もpJG4-6に導入され、この場合はCdil９、アミノ端部にA TGイニシエーションコードンと血清エピトープタグを含むフレーム内融合として表現された。ライブラリーの構成活性タグをつけたイーストcDNA発現ライブラリーは、プレート上で70％のコンフルエンスに育成されたHeLa細胞を増殖している成長した血清から分離したRNA から作られた。RNAはすべてチョムジンスキーおよびサッチが説明しているようにして（アナル．バイオケム．162:156-159、1987）表現され、polyA⁺ mRNAがオリゴドT-セルロースコラム上で純化された。cDNAの合成は、ガブラーおよびホフマン（ジーン25:263-269、1983）によるものをハスおよびハンセン（ストラテジーズ1:1-3、1988）により修正された方法にしたがって、XhoIサイトを保護するため5′から3′、18ntトラクト、XhoIサイトおよび25nt長でGAの多い系列を含むリンカープライマーを使って行われた。内部のXhoIサイトを保護するため、最初のストランドは、5′^-メチル-CTPを介在させて、モロニーウィルス逆転写酵素の RNAseH検出バージョンで合成された。２番目のストランドの合成では、mRNA/cDN AハイブリッドをRNAseHとE.Coli DNAポリマーIで処理され、結果として得られた末端をクレノウ、ムンビーンエクソニュークリースおよびクレノウにより連続的に処理して揃え、その上でEcoRIアダプター、5′AATTCGGCACGAGGCG 3′（配列番号7、3′GCCGTGCTCCCC5′（配列番号8）をつなぎ、cDNAをXhoIで消化した。このDNAは、余分なアダプター配列を除くためにさらにセファクリルS-400スピンコラム上で純化し、5-20％のKoAcグラジエント上で分溜した。〉700 bpcDNAsを含む断片を回収し、cDNA約1/5をEcoRI-とXhoI-消化pJG4-5の中に縛帯（lingatio n）した。この縛帯混合体は、メーカーの指示にしたがってエレクトロポレーション（ジーンパルサー、バイオラド、ハーキュール、CA）によってE.coli SURE 細胞に導入された。9.6x10⁶のプライマリートランスフォーマントは、LBアンピシリンプレートをこすって回収した。コロニーは、６リットルのLB媒体に入れて１晩（約３世代）育成し、プラズミドDNAを標準の技術で、２個のCaClグラジエント上で連続的に純化した。個々のライブラリーメンバーのトランスフォーマントをEcoRlとXhoIで消化した結果、ライブラリーメンバーの＞90％は、その標準のサイズが1kb-2kbの間であるcDNAインサートを含むことが判明した。抗ヘマグルチニンモノクローン抗体を使った個々のイーストトランスフォーマントのウェスターンブロットは、メンバーの1/4から1/3で融合蛋白質を発現することを示唆した。Cdc2インテラクターの選択上述の菌株のライブラリー形質転換は、イトウ他（J.バクテル．153:163-168 、 1983）が説明する方法にしたがって行われたが、次の点が異なる、すなわち核はシースルおよびギーツ（カレ．ジェネト．16:339-346、1989）の説明のように高 ODに育成し、一末端のキャリアDNAを、シースルおよびギーツが説明するように（カレ．ジェネト．16:339-346、1989）形質転換体混合物に含めた。この手順により、1.2x10⁶のプライマリーライブラリートランスフォーマント（10⁴ライブラリートランスフォーマント／mg DNA）が得られた。トランスフォーマントはグルコースUra~ His~ Trp~プレート上で選択し、掻き取り、約20mlの65%グリセロール、10mM Tris-HCl pH 7.5、10mM MgCl₂で懸濁し、-80度Ｃのアリコート１mlで保存した。プレーティングの効率は、50mlの細胞懸濁液を、2%のガラクトースを介在させて５mlのVPに入れて育成した後にガラクトースUra~ His~ Trp~上で決定した。ライブラリーのスクリーニングについては、この媒体／オリジナルのトランスフォーマント上の約20のコロニー形成ユニット（約2x10⁷）を、上記のVP／ガラクトース誘導の後に、４枚の標準円形10cmガラクトースUra~ His~ Trp~プレート上に置いた。 30度Cで4日間培養した結果412 Leu⁺のコロニーが現われた。これらのコロニーをガラクトースUra~ His~ Trp~ マスタープレート上に回収し、グルコースUra ~ His~ Trp~ Leu~、ガラクトースUra~His~Trp~、グルコースXgaI Leu~ Ura~ His ~ Trp~およびガラクトースXgal Leu~ Ura~ His~ Trp~プレート上に乗せた。これらのコロニーの55個は、Ieu~媒体上でガラクトース依存の成長をしまたXgal媒体上でガラクトース依存の青色を示し、さらに分析を続けた。これらのコロニーのプラスミドDNAは、記述（ホフマンおよびウィンストン、ジーン57:267-272、1987）の通り回収し、バクテリア菌株KCS中に導入し、トランスフォーマントをTrp~アンピシリンプレート上に回収した。プラズミドDNAsは、EcoRIとXhoIおよびAluIまたはHaeIIIによる3回の消化の後で1.8%アガロース1/ 2X TBEに与えた抑制断片のパターンに基づいて分析、カテゴリー分けした。これらのcDNAの別の抑制マップクラスの特徴的プラスミドは、別のLexA融合蛋白質のパネルを発現したEGY48の派生物に再度形質転換させた。LexA-Cdc２ベートと相互作用したが、LexA-バイコイド、LexA-Fus３、LexA-Cln３、LexA-cMyc-ct ermおよびLexA-Maxを含む他のLexA融合蛋白質とは相互作用しない蛋白質をコードするcDNAが内包するプラスミドは、さらに特性化された。顕微鏡検査イースト細胞の5ml培地は、OD₆₀₀=0.8-1までの適当な完全最小培地で育成し、群を分解するためにショートバースト中でソニケートした（オースベル他、分子生物学における現状のプロトコル、ニューヨーク、ジョンワイリー＆サンズ、19 87）。細胞は遠心分離によって回収し、1ml のTEで洗い、1ml 70%のエタノールで再度懸濁し、室温で１時間撹拌して固定し、回収し、再度TE内で懸濁した。固定した細胞は、シルバー他の説明のように（モル．セル．バイオル．6:4763-476 6、1986）2.5μg/ml DAPIで染色した後ノマルスキー照明または蛍光灯の下でツァイスアクシオスコープを使って直接1000xで検査した。FACS分析イースト細胞は上述のように育成、固定し、基本的にリュー他（セル63:317-3 28、1992）のようにしてDNA成分のFACS分析のために調整した。細胞は、固定した後、回収し、0.8ml 50mM Tris/HCL pH8.0中で3回洗い、次に200μl 2mg/ml RN aseAを加え、37度Cで連続的に撹拌しながら5時間培養した。細胞はペレット化し、0.5mlの5mg/mlペプシンで再度懸濁し（新しく55mM HClで溶解し）、37度の水槽で30分間培養した。細胞を回転して、沈め、1mlの200mM Tris/HCl pH7.5、211 mM NaCl、78mM MgCl₂で洗い、同じバッファーで再度懸濁した。次に55μlの50μ g/mlヨウ化プロピジウムを加え、細胞を４度Cで１晩着色した。標準的に10,000- 20,000の結合を読み取ることができ、これをベクトンディッキンソン蛍光活性細胞ソーター（ベクトンディッキンソン、リンカーンパーク、NJ）を使い、CellFI T細胞サイクル分析プログラムのバージョン2.01.2で分析した。 DNA成分のFACS分析については、HeLa細胞をプレート上で育成し、MoMuLVプロモーターの制御の下で固有のCdilの発現を操作するレトロウィルスクローンベクター（モーゲンスターンおよびランド、ニュークル．アシッヅ．レス．18:3587- 3596、1990）のDNAコピーであるpBNCdilまたはベクターのみを使ってトランスフェクトを行った（オースベル他、分子生物学における現状のプロトコル、NY）ジョンワイリー＆サンズ、1987）。トラスフェクトした細胞のクローンは、400m g/mlのG418を含む媒体で育成して選択し、Cdil発現により、回収されたG418耐性細胞の数が減ることはなかった。各トランスフェクションの個々のクローン（約 20）は、回収し、DMEM+10%の小牛の血清中のプレート上で育成し、0.05%トリプシン、0.02%EDTAを使って回収し、1X PBSで1回洗った。Cdilトランスフェクションから得られた４個のクローンとコントロールトランスフェクションから得られた４個のクローンから得られた細胞は、3.4mMシトラート、0.1% NP40、1.5mMスペルミンおよび0.5mM Tris中に溶解した30μg/ml トリプシン225μl中で懸濁し、室温で10分間ローテーター上で培養した。次にトリプシンインヒビター0.5mg/ mlとRNAse A 0.1mg/mlの188μlを加え、懸濁液を渦動させた。ヨード化プロピジウム0.4mg/mlとスペルミン1mg/mlの188μlを加えた後、サンプルを４度Cで30分間培養した。上述のようにFACS分析を行った。 Cdilポリペプチドと抗体ポリペプチドの発現一般的に、本発明のポリペプチドは、適切なホスト細胞を適切な発現ビヒクル中でCdilコード化cDNA断片の全部または一部を使ってトランスフォームすることによって製造できる。分子生物学の当業者は、組換え型蛋白質の生成に使われる様々な発現システムを理解できるはずである。本発明においては使われる正確なホスト細胞は重要な問題ではない。Cdil細胞ポリペプチドは、プロカリオチックホスト（例えばE.co li）または真核ホスト（例えばサッカロミセスセレビジアまたはほ乳動物の細胞、例えばCOS １、NIM 3T3またはHeLa細胞）中で生成できる。このような細胞は、多様なソースから入手できる（例えば、アメリカ型培地補集、ロックランド、 MD、参照、例えばオースベル他、分子生物学における現状のプロトコル、ジョンワイリー＆サンズ、NY、1989）。形質転換またはトランスフェクションの方法および発現ビヒクルの選択は、使われるホストシステムによって決まる。形質転換とトランスフェクションの方法は、例えばオースベル他（オースベル他、分子生物学における現状のプロトコル、ジョンワイリー＆サンズ、NY、1989）に説明されており、発現ビヒクルは、例えばクローンニングベクター、ラボラトリーマニュアル（P.H.パウエル他、1995、サップ．1987）で得られるものから選択できる。望ましい発現システムとしては、pMAMneo発現ベクター（クローンテック、パロアルト、CA）でトランスフェクトしたマウス3T3フィブロブラストホスト細胞があげられる。pMAMnecは、次のものを提供する、すなわちデクサメタソン誘導MMTV- LTRプロモーターにリンクしたRSV-LTRエンハンサー、ほ乳類システムにレプリケーションを行うことができるレプリケーションのSV40オリジン、選択できるネオミシン遺伝子およびSV40スプライス、ポリアデニレーションサイト。CdilポリペプチドをコードするDNAは、発現ができるように設計された方向に、pMAMneo中に挿入される。組換え型Cdil蛋白質は、下記のようにして分離される。pMANneo発現ビヒクルに関連して使うことができる他の望ましいホスト細胞は、COS細胞およびCHO細胞（ATCCアクセスNo．はそれぞれCRL1650およびCCL61）を含む。別の方法としては、Cdilポリペプチドは、安定的にトランスフェクトされたほ乳類の細胞系によって製造される。ほ乳類の細胞の安定したトランスフェクションに適するベクターとしては様々なものが流通しており、例えば、パウエル他（ supra）参照、その様な細胞系の構成方法も一般的に入手が可能であり、たとえはオースベル他（supra）がある。例えば、CdilポリペプチドをコードするoDNA は、ジハイドロフォレートレダクタース（DHFR）遺伝子を含む発現ベクター中にクローン化される。プラズミドの統合および、したがってCdilコード化遺伝子をホスト細胞染色体に入れることは、0.01-300mMメトトレクセートを細胞培養媒体に含めることによって選択できる（オースベル他、supra）。この優れた選択は、ほとんどの種類の細胞にに対して行うことができる。再組換え蛋白質表現は、トランスフェクトした遺伝子をDHFRを仲介とした増殖によって増加することができる。遺伝子増殖を行う細胞系を選択する方法は、オースベル他（supra）に説明されており、このような方法は一般的に、メトトレクセートのレベルを徐々に増して行くことを含む、媒体中での長時間の培養を含む。このような目的に通常使われるDHFRを含む発現ベクターは、pCVSEII-DHRFおよびpAdD26SV（A）を含む（オースベル他、supra）。上述のホスト細胞のいずれもまたは、望ましくは、DHFRが不足するCHO細胞系（例えば、CHO DHFR-細胞、アクセスNo.CRL9096）は、安定的にトランスフェクトされた細胞系またはDHFRを仲介とする遺伝子の増殖のDHFRの選択に望ましいホスト細胞の中にある。再組換えCdil蛋白質が発現されると、例えばアフィニティークロマトグラフィーを使って分離される。例えば、抗Cdil抗体は（例えば本書の中で説明するようにして製造される）、コラムに付着させ、Cdilポリペプチドを分離するのに使うことができる。アフィニティークロマトグラフィーの前にCdilを秘匿（harborin g）する細胞の溶菌と分流は、標準の方法（オースベル他、supra参照）で行うことができる。別の方法としては、Cdil融合蛋白質、例えばCdilマルトース結合蛋白質、Cdil-b-ガラクトシダーセ、またはCdil-trpE融合蛋白質は、Cdil蛋白質の分離のために構成、使用することができる（例えば、オースベル他supra、ニューイングランドバイロラブ、ビバリー、MA、参照）。分離された後は、再組換え蛋白質は、必要があれば、例えば高性能液体クロマトグラフィー（例えば、フィッシャー、生化学および分子生物学における試験所技術、eds.、作業と負荷、エルセビア、1980、参照）によってさらに純化することができる。本発明のポリペプチドは、特に短いCdil断片は、化学合成によっても製造できる（例えば、固相ペプチドの合成、２版、1984パース化学社、ロックフォード、 IL）。ポリペプチド表現と純化のこれらの一般的な技術は、有用なCdil断片または類似体を製造、分離することにも使うことができる。抗Cdil抗体人のCdil（または免疫断片または類似体）は、本発明において有用な抗体を生み出すために使うことができ、その様なポリペプチドは、再組換えまたはペプチド合成技術によって製造できる（例えば、固相ペプチドの合成、supra、オースベル他、supra、参照）。ペプチドは、オースベル他、supraに説明されているように、KLHのようなキャリア蛋白質と合体できる。KLMペプチドは、フロンドのアジュバントを混合し、モルモット、ラットまたは望ましくは兎に注射される。抗体は、ペプチドアンチゲン親和性クロマトグラフィーにより純化できる。モノクローン抗体は、上記のCdilポリペプチドおよび標準のバイブリドーマ技術を使って調整できる（例えば、ケラー他、ネーチャー256:495、1975、ケラー他、ユル．J．6:511、1976、ケラー他、ユル．J．イミュノル．6:511、1976、ハンマリング他、モノクローン抗体およびT細胞ハイブリドーマ、エルセビア、NY 、1981、オースベル他、supra、参照）。ポリクローンまたはモノクローン抗体は、製造後、ウェスターンブロットまたは免疫沈降分析によって特定のCdilの認識についてテストされる（オースベル他、supraで説明する方法により）。特にCdilポリペプチドを認識する抗体は、本発明では有用であると考えられ、その様な抗体は例えば、ほ乳類によって作られるCdilのレベルをモニターする免疫分析に使うことができる。Cdilポリペプチド治療のための治療面と診断面での用途治療本発明のCdilポリペプチドは、人間の細胞領域の主要な調節因子と相互に作用し合うこと、および、イーストや人間の細胞のインヴィヴォ増殖を阻止することが示された。Cdilは細胞領域で制御の役割を演じるので、格別に優れた抗癌治療手段の一候補である。この治療手段は、センス（sence）RNAまたはアンチセンス（antisence）RNAとして、例えば施用されたレトロウイルスのベクターから得られる発現により、例えば骨髄に対して、施用されることが望ましい。治療処置は、もっと伝統的な癌治療法、例えば手術、放射線、または別形式の化学療法と組み合わせる場合もあり得る。その別法であるが、本明細書に記述された相互作用による捕捉システムを使用して、多数の有望な薬品を容易に選別することができる。例えばイーストの場合は、CdilとCdc2の相互作用を強めたり、弱めたりする薬品の選別である。Cdc2： Cdil間の相互作用を強める薬品は、本例のシステムにおいてはリポータ遺伝子の表現を強めることになろうし、その反対に、Cdc2：Cdil間の相互作用を弱める薬品は、リポータ遺伝子の表現を弱めることになろう。そうなった薬品は、その次に、効率について動物試験を行い、良い結果が得られた場合は、それらの正規の投与量と投与経路に従って、抗癌治療手段として使用することができる。悪性症状の検出 Cdilポリペプチドは、癌症状の検出または監視という診断面の用途に供されることもあり得る。特にCdilは細胞領域の制御に関与しているから、Cdil生成レベルの変化が悪性または前期悪性症状を示す場合があり得る。 Cdilの表現レベルは、どのような標準的手法で調べてもよい。例えば、生物学的標本（例えば生体組織片検査）におけるそれの表現は、標準的なノーザーン（ Northern）プロット分析で監視しても良いし、PCR（例えば次の文献を参照されたい：Ausubei et al.，SUPRA; PCR Technology: Principics and Application for DNA Amplification，ed,，H.A.Ebrich，Stockton Press，NY: およびYap an d McGee，Nucl．Acids．Res．19: 4294，1991）の助けを借りても良い。それらの手法は、Cdil配列を用意することによって使用可能になる。別法として、生物学的標本のCdil蛋白質を検出するために免疫学的検定法を使用することができる。Cdilを特定したポリクローン抗体またはモノクローン抗体（上述により生成されたもの）で、後者の方が望ましいが、それを、Cdilポリペプチドのレベルを測定するために使用することができる。その場合のフォーマットは、標準的な免疫学的検定フォーマットであればどれでも差し支えない（例えば、ELISA、ウエスターンプロット、またはRIA検定法）。この場合もまた、野生型のCdilレベルに対して比較を行うもので、Cdil生成状況の変化が悪性または前期悪性症状を示すことになるであろう。免疫学的検定の実例は、例えば「Ausu bei et al.，supra」に記述されている。免疫学的検定手法は、Cdil検出にも利用することができる。例えば、患者から組織標本を取り、Cdilの有無を調べるために、抗Cdil抗体と標準検出システムのどれか（例えば、西洋わさびのベルオキシダーゼに結合させた二次抗体を含むこの）を使って、その切片を染色することができる。その種の手法に関する全般的な情報は、例えば「Bancroft and Steve ns（Theory and Practice of Histological Techniques，Churchil Livingstone ，1982）およびAusubel et al.，（supra）」に記載されている。具体的な一例であるが、診断向きの方法の目標を、哺乳動物のCdil遺伝子がN- ターミナルPEST領域のコード配列を含むかどうかの判定とすることができる。この配列はCdil蛋白質を安定させる傾向が非常に強いので、それを削除すると細胞のCdilポリペプチドレベルの変更をもたらす可能性があり、従って、悪性または前期悪性症状を示すことになり得る。PESTが削除されているかどうかは、標準的な核酸分析またはポリペプチド分析によって明らかにすることができる。 Cdilポリペプチドは、哺乳動物の細胞のどの区画で重要な細胞領域制御機能が生じているかを明らかにするためにも有用である。Cdilに特有の抗体は、上述の通りにして生成することができる。その次に、蛋白質の細胞の下位レベルでの（ subcellular）正常な位置を、標準的な免疫学的要領または免疫組織化学的要領により、本来の場所で、あるいは細かく砕いた細胞を用いて判定する（例えば、 Ausubel et al.，supra: Bancroft and Stevens，Theory and Practice of Hist ological Techniques，Churchill Livingstone，1982を参照すること）。例示した本発明の方法は、あらゆる哺乳動物、例えば人間、家庭のペット、あるいは家畜に関して本明細書に記述された疾患を軽減し、あるいは診断するために使用することができる。人間以外の哺乳動物を処置する場合、採用されるCdil ポリペプチドまたは抗体は、その種に固有であることが望ましい。その他の実施例その他の実施例において、本発明は、人間のCdilに対して実質的に同族である蛋白質の全てを含む（図６、配列番号１）；そのような同族蛋白質は、自然に発生するそれ以外の実質的に純粋な哺乳動物のCdil蛋白質ならびに対立遺伝子による変種；自然の突然変異体；誘発された変異体、ハイストリンジェンシーな条件、またはローストリンジェンシーな条件（例えば、少なくとも40個のヌクレチオド相当のプロープ長（probe length）を用い、40℃で、2X SSCにおいて洗浄する）の下で、図６のCdil配列にハイブリッド化するDNAによってコード化された蛋白質；および、Cdilポリペプチドに向けられた抗血清によって特異的に結合させられたポリペプチドまたは蛋白質、特に、活性の強い場所またはCdilのCdi2結合領域に向けられた抗血清によって結合させられたポリペプチドまたは蛋白質；を含む。前記同族蛋白質という用語は、Cdilの断片を含有するキメラ型ポリペプチドも含む。本発明はさらに、自然に発生する一切のCdilポリペプチドの類似体を含む。類似体というものは、アミノ酸配列の違いによって、またはポストトランスレーションによる一部改変によって、またはその両方によって、自然に発生するCdil蛋白質との差異を生じる可能性がある。本発明の類似体は一般的に、自然に発生するCdil配列の全体またはその一部と、少なくとも70％、もっと望ましい例として 80％、あるいは99％という相同性さえ示すことであろう。比較する配列の長さは、少なくとも８個のアミノ酸残分、望ましい長さとして少なくとも24個のアミノ酸残基分、さらに望ましい長さとして35個以上のアミノ酸残基分であるだろう。一部改変の内容には、ポリペプチドのインヴィヴォまたはインヴィトロでの化学的誘導、例えば、アセチル化、カルボキシル化、ホリホリル化、またはグリコシル化が含まれる；その種の一部改変は、ポリペプチドの合成または加工、またはそれに続く酵素を用いた処理の実施中に生じる可能性がある。類似体は、一次配列の変更によって、自然に発生した遺伝的変異体と、誘発された遺伝的変異（例えば、照射、または、エタンメチルサルファイトへの暴露による不規則性変異誘発によってもたらされたもの、あるいは、次に示す文献に記述されているように、場所に固有の変異誘発によってもたらされたもの）の両方を含む。上述の文献は：「Sambrook，Fritsch，and Maniatis，Molecular Cloning; A Laboratory M anual（2d ed.），CSH Press，1989」この記載により本文献は本明細書の参照文献目録に含まれたことになる；「Ausubel et al.，Current Protocols in Molec ular Biology，John Willey & Sons，1989」この記載により本文献は本明細書の参照文献目録に含まれたことになる。さらに、類似体に含まれるものとして、還状ペプチド分子、および、L-アミノ酸以外のアミノ酸残分を含有する類似体、例えばD-アミノ酸、自然には生じないアミノ酸、または合成アミノ酸、例えばβアミノ酸やγアミノ酸の残分を含有する類似体がある。完全な長さのポリペプチドに加え、本発明は、Cdilポリペプチドの断片も含む。本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、少なくとも10個、望ましい長さとして少なくとも30個、さらに望ましい長さとして少なくとも50個、最も望ましい長さとして少なくとも60個ないし80個あるいはそれ以上の、切れ目なく続くアミノ酸を意味する。 Cdilの断片は、当業者に周知の方法によって生成可能であるし、普通の蛋白質加工（例えば、生物的活性を必要としない発生期のポリペプチドからのアミノ酸除去、または、二者択一的mRNAスプライシングの実施あるいは二者択一的蛋白質加工の実施によるアミノ酸の除去）からもたらされる場合もある。本発明に従って望ましいとされる断片または類似体は、生物学的活性（例えば、本明細書で検討したように、哺乳動物の細胞区域に支障を与える能力）を現すものである。望ましいとされるのは、Cdilポリペプチド、断片、または類似体が、自然に発生するCdilポリペプチドの全長の少なくとも10％、さらに望ましい割合として30％、最も望ましい割合として70％以上の生物学的活性を現すことである。配列リスト（1）一般情報：（i）出願人：ブレントロジャーギュリスジェノゴレミスエリカ（ii）発明の名称：新種蛋白質分離のための相互作用を用いる補捉システム（iii）配列の数：３３（iv）対応アドレス：（A）名宛人：フィッシュアンドリチャードソン（B）通り：２２５フランクリンストリート（C）市：ボストン（D）州：マサチューセッツ（E）国：アメリカ合衆国（F）郵便番号： 02110-2804 （v）コンピュータ読み出し形態：（A）媒体形式： 3.5” ディスク，1.44 Mb （B）コンピュータ： IBM PS/2 モデル 50Z または 55SX （C）作動システム： MS-DOS（バージョン 5.0）（D）ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージョン 5.1）（vi）現出願データ：（A）出願番号：07/969,038 （B）出願日：１９９２年１０月３０日（C）分類：（vii）優先出願データ：（A）出願番号：（B）出願日：（viii）代理人情報：（A）氏名：クラークポールティー（B）登録番号： 30,162 （C）整理番号： 00786/143001 （ix）遠隔通信情報：（A）電話番号：（617）542-5070 （B）ファックス番号：（617）542-8906 （C）テレックス番号： 200154 （2）配列番号１の情報（i）配列の特徴（A）配列の長さ： 804 （B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号1の記載：（2）配列番号2 の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 5 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号2 の記載：（2）配列番号3 の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 42 （B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号3 の記載：（2）配列番号4 の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 42 （B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号4 の記載：（2）配列番号5 の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 9 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号5 の記載：（2）配列番号6 の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：9 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号6 の記載：（2）配列番号7 の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 16 （B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号7 の記載：（2）配列番号8 の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 12 （B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号8 の記載：（2）配列番号9 の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 73 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号9 の記載：（2）配列番号10の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 73 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号10の記載：（2）配列番号11の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 82 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号11の記載：（2）配列番号12の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 73 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号12の記載：（2）配列番号13の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 77 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号13の記載：（2）配列番号14の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 86 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号14の記載：（2）配列番号15の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 84 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号15の記載：（2）配列番号16の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 83 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号16の記載：（2）配列番号17の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 84 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号17の記載：（2）配列番号18の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 84 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号18の記載：（2）配列番号19の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 82 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号19の記載：（2）配列番号20の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 86 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号20の記載：（2）配列番号21の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 83 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号21の記載：（2）配列番号22の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 83 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号22の記載：（2）配列番号23の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 83 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号23の記載：（2）配列番号24の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 83 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号24の記載：（2）配列番号25の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 83 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号25の記載：（2）配列番号26の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 90 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号26の記載：（2）配列番号27の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 57 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号27の記載：（2）配列番号28の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 59 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号28の記載：（2）配列番号29の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 57 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号29の記載：（2）配列番号30の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 57 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号30の記載：（2）配列番号31の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 72 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号31の記載：（2）配列番号32の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 60 （B）配列の型：アミノ酸（C）鎖の数：（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号32の記載：（2）配列番号33の情報：（i）配列の特徴：（A）配列の長さ： 345 （B）配列の型：核酸（C）鎖の数：二本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列番号33の記載：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】１．第一の蛋白質が第二の蛋白質と相互に作用しあう能力を持つか否かを判定する方法であって：（ａ）前記方法は次の３種類の遺伝子を含有するホスト細胞を用意することを含み、（ｉ）前記ホスト細胞は機能できるように蛋白質結合部位に連結されるリポータ遺伝子を含み、（ii）前記ホスト細胞は第一の融合蛋白質を発現する第一の融合遺伝子を含み、前記第一の融合蛋白質が前記蛋白質結合部位に特異的に結合する能力を持つ一つの結合部分に共有結合された前記第一の蛋白質を有し、（iii）前記ホスト細胞は第二の融合蛋白質を発現する第二の融合遺伝子を含み、前記第二の融合蛋白質が一つの弱い遺伝子活性化領域に共有結合された前記第二の蛋白質を有し、そして（ｂ）前記方法は前記第一と前記第二の蛋白質の間の相互作用の尺度として、前記リポータ遺伝子の発現を測定すること、を含むことを特徴とする方法。２．請求項１の方法であって、さらに、前記第二の蛋白質をコードする遺伝子の単離を含むことを特徴とする方法。３．請求項１の方法であって、前記弱い遺伝子活性化領域の活性化能力がGAL4活性化区間IIより低いことを特徴とする方法。４．請求項３の方法であって、前記弱い遺伝子活性化領域の活性化能力がB42活性化領域であることを特徴とする方法。５．請求項１の方法であって、前記ホスト細胞が酵母の細胞であることを特徴とする方法。６．請求項１の方法であって、前記リポータ遺伝子が、LEU2遺伝子またはlacZ遺伝子を含むことを特徴とする方法。７．請求項１の方法であって、前記ホスト細胞がさらに、操作によって前記蛋白質結合部位に連結された第二のリポータ遺伝子を含むことを特徴とする方法。８．請求項１の方法であって、前記蛋白質結合部位がLexA結合部位であり、前記結合部分がLexA DNA結合領域を含むことを特徴とする方法。９．請求項１の方法であって、前記第二の蛋白質が真核細胞区域の制御に関与する蛋白質であることを特徴とする方法。１０．請求項９の方法であって、前記細胞区域を制御する前記蛋白質がCdc2遺伝子によってコードされていることを特徴とする方法。１１．Cdilポリペプチドの実質的に純粋な調整品。１２．請求項11のポリペプチドであって、図６（配列番号：１）に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記ポリペプチド。１３．請求項11または12のポリペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする精製されたDNA。１４．請求項13の精製されたDNAであって、前記DNAがcDNAであることを特徴とする精製されたDNA。１５．請求項11の精製されたDNAであって、前記DNAがヒトのCdilポリペプチドをコードすることを特徴とする精製されたDNA。１６．請求項15の精製されたDNAを含むことを特徴とするベクター。１７．請求項15の精製されたDNAを含むことを特徴とする細胞。１８．組換え体Cdilポリペプチドを生産する方法であって；前記細胞内に発現のために位置付けられたCdilポリペプチドをコードするDNA で形質転換された細胞を用意すること、前記形質転換された細胞を、前記DNAを発現させるための条件下で培養すること、および前記組換え体Cdilポリペプチドを単離すること、を含むことを特徴とする方法。１９．請求項11または12のポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする精製された抗体。２０．生物学的標本内部の悪性細胞を検出する方法であって、前記方法が、前記標本内でのCdil遺伝子発現の測定、すなわち、前記悪性細胞の存在を示している野生型標本に関連するCdil遺伝子の発現の変化の測定を含むことを特徴とする方法。