JP3091769B2 - プロテインキナーゼ - Google Patents

プロテインキナーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】 本願出願は、1991年７月３日に出願された米国特許出
願No.728,783の一部継続出願である、1993年１月21日に
出願された米国特許出願No.08/008,001の一部継続出願
である、1994年１月21日に出願された米国特許出願No.0
8/185,359の一部継続出願である。
発明の分野 本発明は、以下にカゼインキナーゼＩと称するプロテ
インキナーゼ単離物に対応し、また、プロテインキナー
ゼおよび／またはDNA組み換え／修復促進機能特性を有
するポリペプチドをコードする新規のポリヌクレオチド
に関する。
発明の背景 プロテインキナーゼ プロテインキナーゼは、外部刺激への細胞の反応を媒
介する真核プロテインの一際大きな超科を含み、また、
酵素のいわゆる「触媒領域」内のアミノ酸配列相同性に
よって関連付けられる。今日まで、多種多様の真核生物
から100を超える独特のプロテインキナーゼ科に属する
ものが、アミノ酸配列レベルにて報告され、そして特徴
付けられている。約250〜300アミノ酸の範囲の大きさの
65のプロテインキナーゼ触媒領域の配列対比を示したHa
nks,et al.（Science, 241:42−52,1988）、ならびに、
脊椎、無脊椎、高等植物、および酵母種酵素を含む117
個の独立したプロテインキナーゼ科に関する触媒領域の
対比を示したHanks,et al.（Methods in Enzymol., 20
0:38−62,1991）を参照のこと。プロテインキナーゼ内
の触媒領域の位置は、一定していない。ほとんどの単一
サブユニット酵素の場合、その領域はポリペプチドのカ
ルボキシ末端近傍にあるが、多重結合のプロテインキナ
ーゼの場合、サブユニットポリペプチドのほとんど全体
に及んでいる。
プロテインキナーゼは、燐酸化基質特性に基づいて、
プロテイン−セリン／スレオニン亜科、あるいはプロテ
イン−チロシン亜科に分類される。プロテイン−セリン
／スレオニンキナーゼ亜科にある酵素の多くの分類は、
DEAEセルロースからの溶出順序に基づいて、カゼインキ
ナーゼＩとカゼインキナーゼIIと称する２つの別異のク
ラスに分類される。カゼインキナーゼは、カゼインに見
られるような酸性認識配列内のセリンあるいはスレオニ
ン残基を燐酸化する能力によって、他のプロテインキナ
ーゼと区別できる。Tuazon,et al.,（Adv.in Second Me
ssenger and Phosphoprotein Res., 23:123−164,199
1）は、酵素のこれら二つの分類に関する理化学的特
性、認識配列、基質特異性、および代謝調整に関する効
果について、カゼインキナーゼＩとIIに関連した200以
上の文献の検討を行っている。カゼインキナーゼIIは、
異種四量体としての活性を有し、ヒト、ラット、Drosop
hilaおよび酵母種の触媒領域の完全なアミノ酸配列が決
定されている。部分的に精製したカゼインキナーゼＩ調
製物が、多様な植物および動物種の細胞核、細胞質、お
よび細胞膜から取得できるにもかかわらず、本願発明以
前に、酵素的に活性な単量体ユニットの一次構造に関す
る知見は何ら得られていなかった。
それ故、本願発明が完成された当時に、当該技術分野
では、カゼインキナーゼＩクラスでのプロテイン−セリ
ン／スレオニンキナーゼ酵素の一次構造（アミノ酸配
列）に関する情報が待望されていたのである。１種以上
のこれらキナーゼをコードするDNA配列（これより一次
構造が推定される）の形態にて提供されるかような情報
は、組み換え技法によるキナーゼの大規模生産、ならび
に、これら酵素の分布と機能、膜結合形態と非膜結合形
態との間での構造上の相違点、これらキナーゼが影響す
るリガンド−レセプター相互作用、および、リガンド−
レセプター結合、キナーゼ、および他の活性を調整する
ことができる薬剤の同定のための決定を可能ならしめる
ものである。
DNA組み換えおよび修復 染色体は、高エネルギー照射、化学薬剤、ならびに複
製中における自然変異の結果として、一本鎖あるいは二
本鎖損傷を生じる。染色体に存在する遺伝子は、損傷、
修復、交換、移動、および接着の作用を継続的に被る
が、ある種の酵素は、染色体の特定な塩基配列を保護あ
るいは復原する。
DNA損傷の修復は、莫大な数の遺伝子生成物の調整を
含む複雑なプロセスである。この複雑さの一部は、DNA
損傷および細胞周期の経過の双方に依存している。例え
ば、紫外線（UV）照射に応答して、遺伝子障害を訂正す
るために、細胞は光回復あるいは切出修復機能を使用す
ることが可能である。鎖破損の修復は、Ｘ線によって生
じたようなもので、組換機構を通して行うことができ
る。DNA損傷の多様な形態に対して、細胞は、細胞周期
のG2相に捕獲されるように誘導される。このG2捕獲期間
中に、有糸分離に先駆けて染色体の正常性を保つために
遺伝子障害が修復される。
世代間における遺伝子情報の伝達がDNAの正常性に依
存していることから、遺伝子組換および修復に影響ある
いはそれらを調整する遺伝子生成物を同定することは重
要である。特定の遺伝子変異を行った生物の使用を通し
て、正常機能遺伝子が取得され、分子的にクローニング
され、そして、遺伝子生成物が研究されている。
Saccharomyces cerevisiaeのような真核細胞での遺伝
子研究によって、30以上の放射線感受性（RAD）変異体
の同定を可能にする修復欠陥変異体が決定されている
（Haynes et al.,in Molecular Biology of the Yeast
Saccharomyces,pp.371,1981;J.Game in Yeast Genetic
s:Fundamental and Applied Aspects,pp.109,1983）。
これら変異体は、それらの感受性によって、三つのクラ
スに分類できる。これらクラスは、切出修復、誤差傾向
修復、および組み換え修復機能に大別できる。酵母RAD
遺伝子の分子特性は、切出修復に関与する酵素機構、な
らびにDNA損傷による細胞分裂の捕獲の理解を深める結
果を導いた。
RAD遺伝子およびその発現生成物は、より効果的な治
療用組成物を開発するための研究が継続されるつれて、
その重要性の大きさが認識された。これらの新規の組成
物が、ある種の腫瘍のような特定の疾患状態に極めて効
果的である場合がよくあるが、それら疾患を患った動物
でのin vivo治療にて過剰の毒性を呈することがある。
実際のところ、これら組成物は、同様の突然変異誘発を
増大させるものである。
ほとんどの突然変異誘発性あるいは発癌性物質は、そ
れ自体が非反応性であるが、in vivoにて反応性の中間
体に分解される。突然変異をもたらすDNAとこれら反応
性の中間体は、相互作用を呈する。この現象は、化学的
発癌現象の第一段階であると考えられている。大量の遺
伝子での突然変異は、DNAを損傷する薬剤に対する細胞
性反応に影響を与える。同様に、これら変異した遺伝子
の多くは、DNA修復系に関与する酵素をコードする。従
って、修復系が正常でない場合、細胞は極端に毒性薬物
に対して感受的になる。DNA修復機構が正常に機能すれ
ばDNAは正常な状態に復元されるが、その機構が正常に
機能しない場合には、増殖を続ける形質転換した腫瘍細
胞を生じる結果を招く。
化学物質および組成物の毒性あるいは突然変異性を決
定するための試験方法があるが、実験室でのスクリーニ
ング法および動物毒性試験の双方にて制約が課されてい
る。これら制約には、実験室で得た動物に関するデータ
の、ヒトへの援用が含まれる。実験動物から得た結果
を、ヒトでの効果に当てはめようととして矯正する際
に、予想だにしない測定値の相違を生じることがよくあ
る。たいていの場合、ヒトに投与しても安全性が確保さ
れる量が、試験薬剤の用量として、試験動物に使用され
る。加えて、特定の種に薬剤を投与した時に、ある種の
毒性は検出できるが、適正な動物種での実験が行われて
いない場合には、その他の毒性については見過ごされて
いることになる。さらに、多くの利用可能な実験室用試
験法では、ヒトにおいても発現するある種の毒性を検出
することはできない。
相同的標準機能性遺伝子を同定するための手段であ
る、表現方相補性が広く使用されている。例えば、酵母
細胞周期調節遺伝子、cdc2、のヒト相同体は、Schizosa
ccharomyces pombeにてヒトcDNAライブラリーを発現
し、そして、酵母cdc2遺伝子での突然変異と相補できる
クローンを選択することで、クローニングされた（Lee,
et al.,Nature,327:31,1987）。酵母のRAS2va119遺伝子
の熱ショック感受性を復元することができる哺乳類遺伝
子も、相補性を利用してクローニングされた（Colicell
i,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3599,1989）。ラ
ット脳cDNAライブラリーを、酵母での活性化したRAS2遺
伝子に関連する成長調節の欠失を補うことができる哺乳
類cDNAをクローニングするために用いた。遺伝子、DPD
（dunce−様ホスフォジエステラーゼ）は、高親和性CAM
Pホスフォジエステラーゼをコードする。
要するに、実験室での試験にて存在する制約と不明確
さは、DNAの完全性に関する組成物の効果を検定する正
確な方法の提供の障害となっている。この点に鑑み、安
価で、迅速で、そして、組成物で処置される動物の関連
遺伝子を含んだスクリーニング方法の相当な必要性が存
在しているのである。かような方法は、組成物が細胞の
DNA修復系に作用するのであれば、決定のための直接分
析手段を提供する。
発明の概要 本願発明の一態様にて、本願発明は、本明細書にて
「HRR25様」プロテインと称するカゼインクラスＩの真
核プロテインキナーゼをコードし、そして、原型酵母酵
素HRR25のプロテインキナーゼ触媒領域との35％を超え
るアミノ酸配列相同性を有することを特徴とした、精製
および単離したポリヌクレオチド（例えば、DNA配列お
よびそのRNA転写体）を提供する。本発明によって提供
されるポリヌクレオチドには、アンチセンス形態を含ん
だRNA、mRNA、およびDNAが包含される。本願発明の好適
なDNA配列には、ゲノミックおよびcDNA配列、ならびに
全体的あるいは部分的に化学合成したDNA配列およびそ
の生物学的複製物が含まれる。特に、本願発明にて言及
しているのは、HRR25およびNUF1をコードするものを含
むSaccharomyces cerevisiae DNA、Hhp1＋およびHhp2＋
をコードするものを含むSaccharomyces pombe DNA、お
よびCK I α1Hu、CK I α2Hu、CK I α3Hu、CK I γ1H
u、CK I γ2HuおよびCK I δHuをコードするものを含む
ヒトDNAである。さらに、本願発明によって得られるも
のは、かような配列を組み込んだプラスミドおよびウィ
ルスDNAベクターのような自律複製組み換え構築体、特
に、HRR25−様カゼインキナーゼＩプロテインをコード
するDNAが、内因性あるいは外因性発現調節DNA配列に連
結されでいるベクターである。
本願発明の他の態様によると、宿主細胞、特に、原核
あるいは真核細胞のような単細胞性の宿主細胞が、所望
のポリペプチドが発現されるような条件下にて、本願発
明のDNA配列により安定裏に形質転換される。HRR25−様
生成物を発現する宿主細胞は、様々な用途での応用が期
待される。発現した生成物が宿主細胞表面に「表れる」
程度にまで、当該生成物に免疫学的に特異的に反応する
抗体基質を作成するために、貴重な免疫原から構成する
こともできる。
本願発明の宿主細胞は、細胞を適切な培養培地にて成
長させ、所望のポリペプチド生成物を細胞、もしくは細
胞を成長させた培地から単離する、HRR25−様プロテイ
ンの大規模生産に非常に適している。
本願発明にさらに包含されているものは、抗体基質
（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、
一本鎖抗体、キメラ抗体、CDR−移植した抗体、等）、
およびHRR25−様プロテインに特異的な他の結合タンパ
ク質（すなわち、HRR25のプロテインキナーゼ触媒領域
と少なくとも35％の相同性での関連が無い、プロテイン
キナーゼ分子と非反応性）である。抗体基質は、単離し
た天然あるいは組み換えHRR25−様プロテイン、あるい
はその表面にかような生成物を発現する細胞を用いて、
作成することができる。目下のところ本願発明の好まし
い抗体としては、12301パークロウンドライブ、ロック
ビル、メリーランド州に所在のamerican Type Culture
Collectionに、1995年１月17日に寄託され、受託No.HB
11800、HB 11802、HB 11804、HB 11803、HB 11805およ
びHB 11801がそれぞれ付与された、ハイブリドーマ75C1
0H、80J9E、94A1D、94F4A、94J11C、および128Aによっ
て産生されたモノクローナル抗体が含まれる。そして、
この抗体基質は、組み換えあるいは自然発生したHRR25
−様ポリペプチドの精製、およびその表面にかようなポ
リペプチドを生成する細胞を同定するのに有用である。
この抗体基質および他の結合タンパク質は、HRR25−様
プロテインが関与するリガンド−レセプター結合反応の
調整（すなわち、ブロッキング、阻害、あるいは刺激）
においても非常に有用である。抗HRR25−様抗体基質に
特異的な、抗イディオタイプ抗体も、本願発明で意図し
ている。細胞表面、および血清ならびに細胞質画分など
の液体でのHRR25−様プロテインの検出および定量のた
めの分析では、「サンドウィッチ」分析形態にて、単一
抗体基質あるいは多重抗体基質が関与する。
プロテインキナーゼのイソ体と特異的な免疫反応性を
有する抗体、あるいは特定のイソ体のサブタイプと特異
的な免疫反応性を有する抗体は、一つ以上のプロテイン
キナーゼのイソ体の異なる免疫精製においても有用であ
る。
本願発明に従って得られた組み換えHRR25−様タンパ
ク生成物は、真核細胞プロテインキナーゼの中で独特の
幾つもの特性を表した。その一例として、HRR25プロテ
インは、プロテイン−チロシンキナーゼおよびプロテイ
ン−セリン／スレオニンキナーゼ活性の双方を備えてい
た。さらに、HRR25を、特異的なヌクレオチド配列にてD
NA鎖損傷の修復を促進するために使用し、そして、HRR2
5は、このような組み換え／修復促進活性を有している
ことが知られているプロテインキナーゼに他ならないの
である。
本願発明によって得られる酵母および哺乳類（ヒトを
含む）種のHRR25−様タンパク質に関するDNA配列情報
は、DNA/DNAハイブリダイゼーションおよびポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）クローニングなどの公知技術によっ
て、他のHRR25−様タンパク質をコードするDNAの同定お
よび単離を可能にした。
組み換えHRR25−様タンパク質およびそれを発現する
宿主細胞は、DNA損傷の修復に関する様々な組成物の効
果、およびタンパク質のプロテインキナーゼ活性を検定
するためのスクリーニング法として有用である。プロテ
インキナーゼ阻害活性は、Hidaka et al.（Methods in
Enzymology,201:328−339,1991）に記載されたような公
知のスクリーニング方法によって評価することができ
る。
図面の簡単な説明 本願発明の他の態様および利点は、好適な態様を述べ
た以下の詳細な説明を考慮し、図面を参照することで明
らかになるであろう。そして； 図１（Ａ）には、酵母CDC28、酵母KSS1、およびヒトR
AF1プロテインキナーゼの触媒領域と、HRR25の推定した
アミノ酸配列との対比を示している。図１（Ｂ）には、
HRR25の構造の概要を示しており；および 図２には、三つの他のSaccharomyces cerevisiae HRR
25−様タンパク質（YCK1/CK I 2、YCK2/CK I 1、および
NUF1）、Saccharomyces pombeからの二つのHRR25−様タ
ンパク質（Hph1＋、およびHhp2＋）、およびヒトHRR25
−様タンパク質の三つの推定イソ体（CK I α1Hu、CK I
α2HuおよびCK I α3Hu）の配列と、HRR25の推定アミ
ノ酸配列との対比を示している。
発明の詳細な説明 本願発明の一態様にて、本願発明は、DNA正常性に関
する様々な組成物の効果を検査する分析システムに使用
できるDNA組換／修復促進ポリペプチドに関する。DNA鎖
損傷の修復を促進する能力で特徴付けられるこれら機能
配列は、特定の組成物におけるかような修復活性の復原
効果の有無を決定するための組成物のスクリーニングを
可能ならしめるものである。本願発明は、正常有糸分裂
組み換えを促進するが、プロテインキナーゼ活性が欠け
ており、DNA鎖損傷を実質的に修復できないポリペプチ
ドをコードするDNA配列も提供する。この欠陥のあるDNA
配列は、機能性プロテインキナーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードする他のDNA配列を同定するのに非常に有
用である。加えて、本願発明は、この欠陥のあるDNA配
列によってコードされたポリペプチド、ならびに機能性
野性型DNAによってコードされたポリペプチドに関す
る。
プロテインキナーゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNA配列を同定するために、かような活性が欠け
た変異体にてDNA鎖損傷修復を復原できるヌクレオチド
配列に関してDNAライブラリーをスクリーニングするこ
とによる方法が提供される。プロテインキナーゼ活性を
有する哺乳類ポリペプチドの活性が欠けた変異体にて、
DNA二本鎖損傷修復活性を復元することができるポリペ
プチドに影響を与える組成物を同定するための方法が、
さらに提供される。
一般に、欠陥のあるプロテインキナーゼは、正常有糸
組換を促進する能力と、開裂部位： にて生ずるDNA二本鎖破損の修復を必須的に不能にする
能力によって特徴付けされる。
欠陥のあるプロテインキナーゼの修復が必須的に不能
であるDNA二本鎖損傷は、エンドヌクレアーゼ、Ｘ線、
あるいはアルキル化剤を含む放射線様薬剤を含んだ様々
な手段で誘発することができる。好ましいエンドヌクレ
アーゼは、エンドヌクレアーゼHOのような同じヌクレオ
チド開裂部位を認識するものである。メチルメタンスル
ホン酸を含む放射線様薬剤が好ましい。当業者であれ
ば、別段の実験を経なくとも、適当なDNA損傷を誘発す
る他の薬剤を同定できるであろう。
本願発明は、接合型相互変換を開始する65キロダルト
ン部位特異性エンドヌクレアーゼをコードする、DNA二
本鎖エンドヌクレアーゼHOの継続的発現に感受的な変異
体を特に開示している（Kostriken,et al.,Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol.,49:89,1984）。これら変異
体は、損傷を受けた染色体の認識および修復を含めた機
能を理解する上で重要である。本発明は、酵母野性型DN
A組換え遺伝子およびHRR25と称する修復遺伝子（HOおよ
び／または放射線修復）も開示している。ホモ接合性変
異株hrr25−１は、メチルメタンスルホン酸およびＸ線
に感受的であるが、紫外線照射には感受的でない。野性
型遺伝子は、リン酸化によるDNA修復機能の活性におい
て不可欠である、新規タンパク質キナーゼ、他のセリン
／スレオニンキナーゼの相同体をコードする。
HRR25キナーゼは、正常細胞の生長、核分裂、DNA修復
および減数分裂にとって重要であり、HRR25の削除は細
胞周期欠陥の結果をもたらす。HRR25キナーゼとRaf/c−
mosタンパク質キナーゼサブユニットとの間の配列類似
性にて連結された表現型は、S.cerevisiae成長および発
達において同様の役割を果たすものと思われる。DNA鎖
破損修復における欠陥およびHRR25キナーゼにおける変
異により表れる異常型生長特性は、タンパク質キナーゼ
が果たす役割にまで及び、DNA代謝に関連した特性の機
能範疇にHRR25を位置させることになる。
本願発明のタンパク質キナーゼポリペプチドをコード
する特異的DNA配列の開発は、様々な技術を用いて達成
される。例えば、（１）真核生物のゲノミックDNAから
の二本鎖DNA配列の単離、（２）重要なポリペプチドの
ための必須コドンを提供するDNA配列の化学合成、およ
び（３）真核ドナー細胞から単離したmRNAの逆転写によ
る二本鎖DNA配列のin vitro合成、を含む方法を採用す
ることができる。後者の方法の場合、mRNAの二本鎖DNA
相補体は、cDNAと一般的に称されている形態に形成され
る。
本願発明の新規DNA配列は、本願発明の新規プロテイ
ンキナーゼの機能的特性を示すポリペプチドの原核ある
いは真核宿主細胞での発現をもたらすのに有用なすべて
の配列を含む。これらDNA配列には、（ａ）配列番号:1
に示したDNA配列もしくはその相補鎖（ｂ）前記（ａ）
で定義したDNA配列もしくはその断片によってコードさ
れたアミノ酸配列と、プロテインキナーゼ領域にて少な
くとも約35％の相同性を有するアミノ酸配列をコードす
るDNA配列；および（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）にて
定義されたDNA配列、が含まれる。上記（ｂ）において
特に包含されるのは、対立性変異体をコードするゲノミ
ックDNA配列である。項目（ｃ）には、プロテインキナ
ーゼの断片、およびプロテインキナーゼのDNA配列が、m
RNAの翻訳を促進するコドンを組み込んでいる該プロテ
インキナーゼの類似体をコードするDNA配列の製造が包
含されている。項目（ｃ）にさらに包含されているの
は、遺伝子コードの結果として変性されたDNA配列であ
る。
本明細書にて使用している「保存変異」からなる語彙
は、アミノ酸残基を、他の生物学的に同様の残基と置換
することを指す。保存変異の例には、イソロイシン、バ
リン、あるいはメチオニンのような疎水性残基から他の
ものへの置換、あるいは、アルギニンからリシン、グル
タミンからアスラギン酸、あるいはグルタミンからアス
パラギン等の置換を含む極性残基から他のものへの置換
がある。
本願発明のDNA配列は、この配列もしくは対応するDNA
配列からのDNAの少量のポリペプチド断片を調製し、サ
ブクローニングし、および発現することは今や定型とな
っている。「ポリペプチド」の語彙は、本願発明の変異
型もしくは野性型プロテインキナーゼの特徴的活性を有
する、本願発明のDNA配列の全部もしくは一部によって
コードされたアミノ酸の配列を意味している。
本願発明のDNA配列の発現の結果として得られたポリ
ペプチドは、他の真核ポリペプチドもしくは自然の細胞
環境下ではプロテインキナーゼと他の状態で関連を有す
る汚染物質との関連性が無いという点で、さらに特徴付
けできる。
本願発明によって提供された微生物中に発現したポリ
ペプチドの単離および精製は、従来の手段によって、調
製用クロマトグラフィー分離およびモノクローナルおよ
び／またはポリクローナル抗体調製物を含む免疫学的分
離を含む。
一般に、本願発明において有用な発現ベクターは、挿
入した真核遺伝子配列の有効な転移を促進するプロモー
ター配列を含む。発現ベクターは、典型的には、複製の
開始点、プロモーター、およびターミネーターと同様
に、形質転換した細胞の表現型選択を可能かなしめる特
異的遺伝子を含む。形質転換した宿主は、至適細胞生育
を達成するために当該技術分野で周知の技術に従い、培
養器中で成長させ、培養することができる。本願発明の
ポリペプチドは、成長培地、細胞溶解物、あるいは細胞
膜画分から単離することができる。
本願発明のDNA配列は、原核細胞もしくは真核細胞の
いずれにおいてもin vivoで発現することができる。原
核細胞での真核細胞コード配列を含むDNA配列の発現方
法は、当該技術分野では周知である。宿主細胞での発現
および複製のために、本願発明のDNA配列を組み込むた
めに用いる生物学的機能性ウィルスおよびプラスミドDN
Aベクターは、当該技術分野では周知である。例えば、D
NAは適当なベクターを用いて酵母に挿入でき、そして宿
主細胞に生成物をもたらす。酵母での外来遺伝子の発現
のための様々なシャトルベクターが報告されている（He
inemann,et al.,Nature,340:205,1989;Rose,et al.,Gen
e,60:237,1987）。当業者であれば、原核細胞および真
核細胞双方にて遺伝子発現を得るための適切な技術、あ
るいは特別な実験を経ること無しにかような技術を容易
に確かめうるであろう。
宿主には、微生物、酵母、および哺乳類宿主細胞を含
む。「宿主」の語彙は、原核細胞のみならず、酵母、繊
維状真菌のような真核細胞、ならびに本願発明のイント
ロンを含まないDNA配列を複製および発現できる植物お
よび動物細胞をも含む。この語彙は、上記した細胞の子
孫をも含む。複製の際に変異が生じるので、前述した子
孫は親細胞と同一でないと理解されている。しかしなが
ら、かような子孫も、上記した語彙を使用した場合には
当然含まれるものである。
組換えDNAでの形質転換は、当業者に周知の技術によ
って実施できる。宿主が原核細胞である場合、DNA取り
込みができる大腸菌のような反応能細胞は、対数増殖期
後に収穫した細胞から調製でき、続いて当該技術分野で
周知の手順を用いた塩化カルシウム法によって処理する
ことができる。また、反応において、塩化マグネシウム
あるいは塩化ルビジウムも使用できる。形質転換は、宿
主細胞のプロトプラスト形成後でも実施できる。
宿主が真核細胞である場合、DNA転移の様々な方法が
使用できる。これら方法は、リン酸カルシウム沈殿によ
るDNAの形質転換、極微注射のような従来の機械的手
順、リポソームで含んだプラスミドの挿入、スフェロプ
ラスト電気泳動、単細胞生物の塩介在形質転換、もしく
はウィルスベクターの使用を含む。
真核DNAは当該技術分野で周知のベクターを用いた原
核細胞でクローニングできるので、真核DNAの分析は非
常に簡素化された。かようにクローニングした配列は大
量に容易に取得でき、および細菌遺伝子技術によるin v
ivo技術および特異的酵素修飾によるin vitro技術に代
替できる。真核細胞遺伝子の機能および発現に関するこ
れら実験的に誘発した改変の効果を決定するために、ク
ローニングされ、真核生物へ再導入した細菌の配列換え
した配列を取り出さなければならない。原核細胞に欠け
ている多くの機能が真核細胞にはあるので、（例えば、
ミトコンドリアへのATP生成系の局在化、ヒストンへのD
NAの会合、有糸分裂ならびに減数分裂、および細胞の分
化）、かような機能の遺伝子調節は、真核細胞環境下で
評価しなければならない。酵母中の他の真核細胞からの
クローニング遺伝子は、クローニングした真核遺伝子な
らびに他の酵母遺伝子の分析のために有用である。数多
くの多様な酵母ベクターが、この目的のために構築され
てきた。ベクターDNAの増幅にとって重要である、すべ
てのベクターが大腸菌において複製する。すべてのベク
ターが、酵母中で容易に選択できる、例えば、LEU2、HI
S3、URA3などのマーカーを含んでいる。加えて、大腸菌
での使用のために、これらベクターは、抗生物質耐性マ
ーカーを保有している。
周知の酵母遺伝子のヒト相同体をクローニングするた
めの多くの方法が、当該技術分野では周知である。特に
限定を意図するものではないが、これらには、１）分割
したヌクレオチド配列を検出するための緩やかな条件下
でのハイブリダイゼーション、２）分割した構造特徴を
検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニン
グ、および３）同様の機能を有する遺伝子を検出するた
めの変異体の相補性、などがある。
本願発明の目的のために、相同体であるプロテインキ
ナーゼを、構造的および機能的類似性によって同定でき
る。構造的類似性は、例えば、アミノ酸相同性、あるい
は本願発明のプロテインキナーゼに存在する独特のエピ
トープを認識する抗体、特にモノクローナル抗体による
スクリーニングによって評価することで決定できる。構
造的類似性を評価するためにアミノ酸相同性を使用する
場合には、プロテインキナーゼにおいて、原型のHRR25
プロテインに対して少なくとも約35％の相同性を有する
アミノ酸配列は、独特の特徴付けがされたポリペプチド
であると考えられる。
HRR25アミノ酸残基での保存領域は、他の種からのHRR
25−様遺伝子を同定するために使用することができる。
HRR25−様遺伝子（相同体）の同定と単離のためのプロ
ーブとして使用できる保存領域には、例えば、GPSLED
（配列番号:2の86〜91位のアミノ酸）、PDIKPDNFL（配
列番号:2の127〜135位のアミノ酸）、HIPYRE（配列番
号:2の164〜169位のアミノ酸）、およびSVN（配列番号:
2の181〜183位のアミノ酸）をコードするヌクレオチド
が含まれる。これら保存部分は、例えば、ポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）のような当該技術分野で周知の方法に
よる他のHRR25−様遺伝子を検出するためのヌクレオチ
ドプライマーを作成するために使用することができる。
相同的アミノ酸配列が機能的特徴に基づいて評価され
た場合、相同性配列が、ヌクレオチド開裂部位： にて生ずる破損を含んだDNA二本鎖損傷を、必須的に修
復できず（欠陥変異遺伝子の修復の場合）、または修復
できる（自然遺伝子の）場合、および相同的アミノ酸配
列が正常有意図分裂組換えを許容する場合に、相同的ア
ミノ酸配列が、本願発明のアミノ酸配列と同等であると
考えられる。
本願発明により、スクリーニング法が提供され、それ
により、遺伝子が劣性マーカーの相補性によるプラスミ
ドライブラリーからクローニングされる。Saccharomyce
s cerevisiaeのような受入株は、目的の遺伝子において
劣性変異を保有するように構築される。この株は、プラ
スミド、例えば、野性型ゲノミックDNAもしくはcDNAを
含むpYES2（インビトロジェン社、サンディエゴ、カリ
フォルニア州）によって形質転換される。目的の遺伝子
を保有するクローンは、目的の遺伝子について、野性型
表現型から変異体を識別するレプリカ培養によって選択
することができる。プラスミドは、クローンから抽出さ
れ、DNAは研究に付される。いくつかの酵母ベクター
が、酵母遺伝子の単離に結びつく相補性システムへの適
用を許容する。様々な種類の種からの遺伝子を、これら
ベクターを用いて単離することができる。このようなシ
ステムにおいて、入手元を問わずに取得したDNA配列
は、ベクターにクローニングされ、酵母変異体に特異的
に相補する活性に関して酵母にて直接スクリーニングで
きる。
好適な態様において、本願発明は、HOエンドヌクレア
ーゼによって誘発されたDNA二本鎖損傷への感受性によ
って同定された酵母での変異、hrr25変異体を用いる。
この変異に相補的なゲノミックDNAが、hrr25株のDNAラ
イブラリーによる形質転換およびそれに続くメチルメタ
ン硫酸塩（MMS）耐性に関してスクリーニングすること
によって単離された。あるいは、様々な哺乳種からの機
能遺伝子が、前述したシステムを用いて今やクローニン
グできるようになっている。
酵母遺伝子は、ハイブリダイゼーションプローブとし
ての精製RNA、調節されたRNA転写の特異性ハイブリダイ
ゼーション、抗体スクリーニング、トランスポゾン変
異、変異体表現型の交差抑制、異種cDNAもしくはオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いた交差ハイブリダイゼーシ
ョン、ならびに大腸菌での相補性の使用を含む、様々な
方法によってクローニングできる。
最初のアミノ酸配列の小さな改変は、配列番号:2に示
した配列と比較して、実質的に同様あるいは向上した活
性を有するタンパク質によるものであると考えられる。
改変は、特定部位の突然変異誘発のような選択的なも
の、あるいは微生物を産生するHRR25による自然発生的
であったりする。これら改変のすべてが、HRR25活性が
保持されている限り、本願発明に包含される。配列番
号:2に示した第151位のアスパラギン酸のグリシン酸残
基への置換によって、変異体hrr25と同一になった。
本願発明により提供される抗体は、変異ポリペプチド
および／または自然発生プロテインキナーゼとの免疫反
応性を有する。異なるエピトープ特異性を有する無数の
モノクローナル抗体から必須的に構成される抗体、なら
びに別異のモノクローナル抗体調製物が提供される。モ
ノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法による
ポリペプチドの断片を含む抗原から作製される（Kohle
r,G.et al.,Nature 256:495,1975;Current Protocols i
n Molecular Biology,Ausubel,F.et al.,ed.,1989）。
本願発明は、チロシンキナーゼ活性を有するポリペプ
チドの活性に影響を与える組成物を同定するための方法
も開示している。このポリペプチドは、hrr25遺伝子を
含む宿主細胞にてDNA二本鎖損傷の修復活性を復原する
ことができる。組成物およびポリペプチドは、一定の時
間、構成要素が相互作用を及ぼすのに十分な条件下で宿
主細胞と共にインキュベートされ、プロテインキナーゼ
活性の変化、例えば、DNA二本鎖損傷の減少した修復を
モニターする。DNA鎖損傷には、例えば、メチルメタン
硫酸塩のような放射線様薬剤、Ｘ線、もしくはHOのよう
なエンドヌクレアーゼによるものを含む。当該技術分野
で周知の他の二本鎖損傷を誘発する手段も同様に使用で
きる。
本願発明の一態様にて、HRR25−様タンパク質活性を
調整する試薬の治療上有効量を、細胞増殖疾患を患った
対象に対して投与することを含む、HRR25あるいはHRR25
−様タンパクに関連する細胞増殖疾患を治療する方法が
提供される。「細胞増殖障害」なる語彙は、形態学およ
び／または遺伝子型的に周囲の組織とは異なる、悪性な
らびに非悪性の細胞群を指す。かような障害は、例え
ば、HRR25−様タンパク質遺伝子の不正常な発現に関連
するものと思われる。「不正常な発現」とは、発現の増
大あるいは減少したレベル、ならびにHRR25−様遺伝子
の正常機能が改変された変異形態を含む。不正常な発現
とは、細胞周期中での不適切な一時的な発現、あるいは
誤った細胞型での発現も含む。本願発明のアンチセンス
・ポリヌクレオチドは、様々な器官系での悪性腫瘍を処
置する上で有用である。HRR25−様遺伝子の改変した発
現が原因である障害は、本願発明の試薬にて処置する候
補である。細胞増殖障害の「処置」とは、悪性あるいは
非悪性細胞の増大あるいは減少した個体を指す。
本明細書で使用している「調整」なる語彙は、HRR25
−様タンパク質発現あるいは発現の増大の抑制を意図す
るものである。細胞増殖疾患が、HRR25−様遺伝子の過
剰発現に関連するのであれば、アンチセンスあるいは結
合抗体のような適切な試薬を、細胞に導入することがで
きる。この方法は、例えば、アンチセンス核酸によるmR
NAの遮蔽、あるいはリボ酵素によるmRNAの開裂のいずれ
かにより、特異的なHRR25−様タンパク質mRNAの翻訳を
ブッロクするために、アンチセンス核酸あるいはリボ酵
素を利用できる。あるいは、細胞増殖障害が、不十分な
HRR25−様タンパク質に関連するものであるならば、セ
ンス・ポリヌクレオチド配列（DNAコード鎖）あるいはH
RR25−様ポリペプチドが、公知の方法によって、細胞に
導入することができる。
本明細書で使用している「治療上有効」なる語彙は、
HRR25−関連障害を改善するに十分なポリヌクレオチ
ド、抗体、あるいはポリペプチドの量を指す。「改善」
とは、治療を受ける対象における、HRR25−関連障害の
症状が快方に向かうことを意味する。
アンチセンス核酸とは、特異的なmRNA分子（Weintrau
b,Scientific American, 262:40,1990）の少なくとも一
部と相補的なDNAあるいはRNA分子である。細胞におい
て、対応するmRNAとハイブリダイズしたアンチセンス核
酸は、二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖のmRNAを翻
訳しないので、これはmRNAの翻訳に作用するであろう。
アンチセンス核酸は容易に合成でき、また、目標とする
HRR25産生細胞に導入した際に、大きな分子よりも翻訳
への非特異的作用が小さいので、約15個のヌクレオチド
からなるアンチセンスオリゴマーが好ましい。遺伝子の
in vitroで翻訳を阻害するアンチセンス法の使用は、当
該技術分野にて公知である（Marcus−Sakura,Anal.Bioc
hem., 172:289,1988）。
リボ酵素は、DNA制限エンドヌクレアーゼと同様の方
法にて、他の一本鎖RNAを特異的に開裂する能力を有す
るRNA分子である。これらRNAをコードするヌクレオチド
配列の修飾を通じて、RNA分子にて特異的なヌクレオチ
ド配列を認識する分子を加工し、それを開裂することは
可能である（Cech,J.Amer.Med.Assn. 260:3030,198
8）。この方法の最大の利点は、リボソームが配列特異
的であるので、特定の配列を有するmRNAのみが不活性化
できることにある。
リボソームには二つのタイプ、すなわち、tetrahymen
a型および「ハンマーヘッド」型がある。Tetrahymena型
リボ酵素は、４塩基長の配列を認識し、一方で「ハンマ
ーヘッド」型リボ酵素は、11〜18塩基長の配列を認識す
る。認識する配列が長くなるに従い、目標とするmRNA種
でのみしかその配列が生じない結果になりやすい。従っ
て、ハンマーヘッド型リボ酵素は、特異的なmRNA種を不
活性化する上でtetrahymena型リボ酵素より好ましく、
また、長い認識配列が、短い認識配列よりも好ましい。
本願発明は、HRR25−様ポリペプチドによって媒介さ
れた細胞増殖障害を治療するための遺伝子治療も提供す
る。かような治療では、増殖疾患を有する対象の細胞に
HRR−25アンチセンスポリヌクレオチドを導入すること
を含む。アンチセンス・ポリヌクレオチドの運搬は、キ
メラウィルスのような組み換え発現ベクターあるいはコ
ロイド分散系を用いて行うことができる。HRR25の発現
下に関連する障害は、ヌクレオチドコード配列を用いた
遺伝子治療によって処置できる。
本明細書にて言及している遺伝子治療のために使用で
きる様々なウィルスベクターには、アデノウィルス、ヘ
ルペスウィルス、ワクシニア、もしくは、好ましくは、
レトロウィルスのようなRNAウィルスが含まれる。レト
ロウィルスベクターは、マウスあるいはトリレトロウィ
ルスの誘導体が好ましい。レトロウィルスベクターとし
ては、単一外来遺伝子が挿入されたものを含むが、モロ
ニーマウス白血病ウィルス（MoMuLV）、ハービィーマウ
ス肉腫ウィルス（HaMuSV）、マウス哺乳類腫瘍ウィルス
（MuMTV）、およびラウス肉腫ウィルス（RSV）に限定さ
れるものではない。他のレトロウィルスベクターの多く
も、多重遺伝子に組み込むことができる。これらベクタ
ーのすべてが、形質導入した細胞の同定あるいは精製の
ための選択性マーカーのために、遺伝子に転移あるいは
組み込むことができる。例えば、特異的な目標細胞に関
するセレプターに対するリガンドをコードする他の遺伝
子に加えて、対象となるHRR25−様配列をウィルス性ベ
クターに挿入することにより、そのベクターは目標細胞
に特異的になる。レトロウィルスベクターは、例えば、
糖、糖脂質、あるいはタンパク質をコードするポリヌク
レオチドを挿入することにより、目標細胞に特異的とす
ることができる。好ましい標的作りは、レトロウィルス
ベクターを標的とする抗体を用いることで達成される。
当業者であれば、別段の実験を経ること無しに、HRR25
−様アンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウィル
スベクターの標的に特異的な伝播を許容するレトロウィ
ルスゲノムへの挿入が可能な、特異的ポリヌクレオチド
配列を容易に想到できるものと思われる。
組み換えレトロウィルスには欠陥があるため、感染ベ
クター粒子を生成するための補助が必要となってくる。
この補助は、例えば、LTRの調節配列による制御の下、
レトロウィルスの構造遺伝子のすべてをコードするプラ
スミドを含むヘルパー細胞系を用いることによって得る
ことができる。これらプラスミドには、粒子包埋のため
のRNA転移を認識する包含機構を実現するヌクレオチド
配列を欠いている。ヘルパー細胞系は、包含シグナルの
削除を含むが、例えば、Ψ２、PA317およびPA12に限定
されるものではない。これら細胞系は、ゲノミックを包
含していないので空のビリオンを生成する。包含シグナ
ルが無傷の細胞にレトロウィルスベクターを導入する
が、構造遺伝子を他の対象とする遺伝子と置換したとす
れば、ベクターは包含され、そしてベクタービリオンが
生成される。
あるいは、NIH 3T3または他の組織培養細胞は、従来
の燐酸カルシウム形質転換により、レトロウィルス構造
遺伝子gag、pol、およびenvをコードするプラスミドで
直接形質転換することができる。そして、これら細胞
は、対象となる遺伝子を含んだベクタープラスミドで形
質変換される。得られた細胞は、培養培地中にレトロウ
ィルスベクターを放出する。
HRR25−様アンチセンスポリヌクレオチドのための標
的への他の運搬システムは、コロイド分散システムを含
む。コロイド分散システムは、巨大分子体、超微小カプ
セル、微小球、ビーズ、および水中油エマルジョン、ミ
セル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質を基礎
としたシステムを含む。本願発明の好ましいコロイド分
散システムは、リポソームである。リポソームは、in v
itroおよびin vivoでの運搬体として有用な人造膜泡体
である。0.2〜4.0μｍの範囲の大きさの大単層状泡体
（LUV）が、巨大分子を含む水性緩衝液の実質的な割合
でカプセル被包されることが明らかになっている。RN
A、DNA、および無傷のビリオンが、水性成分中にカプセ
ル被包され、そして、生物学的に活性な細胞に誘導され
る（Fraley et al.,Trends Biochem.Sci.,6:77,198
1）。哺乳類細胞に加えて、リポソームは、植物、酵
母、および細菌細胞にてポリヌクレオチドの運搬のため
に使用されてきた。リポソームを効果的な遺伝子運搬体
とするためには、下記の特徴を備えるべきである：
（１）生物学的活性の有無にかかわらず、高率での挿入
体遺伝子のカプセル被包；（２）非標的細胞と比較し
た、標的細胞への好適かつ実質的な結合；（３）高率で
の標的細胞質への泡体の水性成分の運搬；および（４）
遺伝子情報の正確かつ効果的な発現（Mannino et al.,B
iotechniques,6:682,1988）。
リポソームの標的付けは、解剖学上および機構上の側
面から分類されてきた。解剖学上の分類は、例えば、器
官特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性などの
選択性のレベルに基づいている。機構上の標的付けは、
受動性あるいは活動性かによって識別している。受動的
標識付けは、洞様血管を含む器官の網内系（RES）を細
胞へ分布させるリポソームの性質を利用する。一方で、
活動性標識付けは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、
あるいはタンパク質のような特異なリガンドをリポソー
ムに結合、または、局在している自然発生部位以外の器
官および細胞型への標的付けを行うための、リポソーム
の組成あるいは大きさを変えることによるリポソームの
改変を含む。
標的付けした運搬系の表面は、様々な態様で修飾でき
る。リポソームで標的付けした運搬系の場合、標的とす
るリガンドとリポソーム二重層との安定会合を維持する
ために、脂質をリポソームの脂質二重層に組む込むこと
ができる。様々な結合基が、標的とするリガンドへ脂質
鎖を接合するために使用することができる。
一般に、標的付けした運搬系の表面に結合した化合物
は、標的付けした運搬系が所望の細胞にて認められ、そ
して「落ち着く」ことを許容するためのリガンドあるい
はレセプターである。リガンドは、レセプターのよう
な、他の化合物に結合するいかなる化合物であってもよ
い。
本願発明は、下記実施例を考慮すれば、さらに理解が
進むものと思われる。すなわち：実施例１は、Saccharo
myces cerevisiaeのhrr25変異株の単離を記述し；実施
例２は、相補性スクリーニングによるHRR25DNAの単離を
記述し；実施例３は、HRR25のDNAおよび推定アミノ酸配
列の特徴付けに関し；実施例４は、HRR25野性型およびh
rr25変異酵母の形態の顕微鏡観察を記述し；実施例５
は、HRR25のアミノ酸配列と、HRR25−様でない三つの例
示的なプロテインキナーゼとの関連を記述し；実施例６
は、二つのSaccharomyces pombe HRR25−様プロテイン
キナーゼをコードするDNAの単離を記述し；実施例７
は、他のSaccharomyces cerevisiaeタンパク質NUF1をコ
ードするDNAの単離に関し；実施例８は、三つのヒトイ
ソ体、CK I α1Hu、CK I α2HuおよびCK I α3Huを含む
様々な真核種HRR25−様タンパク質をコードするDNAの単
離に関し；実施例９および10はそれぞれ、カゼインキナ
ーゼ、およびHRR25のセリン−スレオニンキナーゼなら
びにチロシンキナーゼ活性双方の決定に関し；実施例11
は、HRR25生成物の組み換え発現および発現物に対する
抗体の作成を記述し；実施例12は、ヒトCK I イソ体、C
K I γ1HuおよびCK I γ2Huの単離に関し；実施例13
は、他のイソ体CK I δHuの単離を記述し；実施例14
は、ヒトCK I イソ体と酵母CK I の変異体との相補性を
記述し；そして、実施例15は、ヒトCK I δHuイソ体の
ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の生成に関
し；実施例16は、CK I δHuによるcisおよびtransチロ
シン燐酸化の観察に関し、および実施例17は、TNFαに
よるCK I δHu活性の刺激に関する。
下記の実施例は例示的なものであり、これに本発明が
限定されるものではない。下記実施例は本発明態様の典
型例であるが、当業者に周知の他の手順も選択的に使用
できる。
実施例１ hrr25の単離 S.cerevisiae株K264−5B（MAT α ho ura3 can1R tyr
1 his7 lys2 ade5 met13 trp5 leu1 ade5）を、変異体
単離に用いた。その酵母は、GAL1,10−調節したHOエン
ドヌクレアーゼを含むURA3−に基づいたプラスミドによ
る標準的方法に従って形質転換され、該形質転換体は
（前出のCurrent Protocols in Molecular Biology）に
記載された通り、約50％が生存するように、エチルメタ
ン硫酸塩（EMS）で突然変異された。培養液を、グリセ
ロール含有の肥沃な培地（YPG、プチットを避けるた
め）に拡散し、コロニーは30℃で形成し、プレートをグ
ルコース（HO抑制）とガラクトース（HO誘導）培地に複
製した。変異体はガラクトースでの非増殖性により同定
した。約200の変異体が初期性状に関して、また反復単
一コロニー精製を通じてgal−表現型を有する62の変異
体が選抜された。これらの中で、多くは、様々なgal−
特然変異体特異的とは相補的でなかった。残りの（25個
の）変異体は、紫外線（UV）照射ならびにメチルメタン
スルホン酸塩（MMS）に関する感受性を決定することに
よって、重複したDNA修復欠陥を調査した。このスクリ
ーニング方法は、周知のrad突然変異の五つの対立遺伝
子ならびに一つの新規変異を同定した。この新規突然変
異hrr25−１（HOおよび／または放射修復）は、重大な
欠陥を示し、そしてさらに研究された。
劣性DNA欠陥は、MMSに対する感受性を含むHrr25−１
により付与される。Hrr25−１株は、放射性修復遺伝子R
AD50及びRAD52（Cole,et al.,Mol.Cell.Biol.,９:3101,
1989）における変異にて観察されるのと同様の５−20Kr
ad X−線照射にて感受性を示す。hrr25−１株は野性型
よりもUV照射に対して感受的ではなく、また、37℃での
増殖に関して温度感受性ではない。nrr25−１表現型の
いくつかを有するhypo−およびhyper−rec rad変異体と
異なり、hrr25−１株は標準有糸分裂組換えを受ける（C
ole,et al.,Mol.Cell.Biol.,９:3101,1989）。自発性遺
伝子転換および交換は、ホモ型接合性hrr25−１および
野性型株に関して同じであった。しかしながら、hrr25
−１ホモ型接合体には、減数分裂の正確な完成が要求さ
れる。hrr25−１ホモ型接合体は同系野性型株において7
5〜80％の胞子を生成する条件下で、１％以下の胞子
（四核細胞）を示す。hrr25−１変異が、いくつかのhrr
25表現型を示す多数の放射性感受性変異体（rad6,50,5
2,54および57）に相補的であるということは、hrr25−
１は新規の暴露したrad−様変異体であり、前述したこ
れら遺伝子の一つでないことを示唆するものである。こ
れらの結果は、HRR25はDNA修復および減数分裂において
役割を果たすが、組換による自発的有糸分裂損傷の修復
は特に必要とされないことを示している。
実施例２ HRR25の単離 HRR25遺伝子は、プラスミドYCp50に構築された酵母ゲ
ノミックライブラリーを用いたMMS感受性への相補によ
って取得した（Rose,et al.,Gene,60:237,1987）。hrr2
5−１株、MHML3−36d（ura3 hrr25）は、ウラル原栄養
株に対して標準方法（Nickoloff,et al.,J.Mol.Biol.,
207:527,1989）によって形質転換し、形質転換体はウラ
シルを含まない培地にて増殖され、0.01％MMSを含む培
地で複製した、1200個の形質転換体の内、単一のMMS耐
性分離株が同定された。MMS感受性に関する相補性は、
当該技術分野で周知の方法により決定されたプラスミド
で分離するために認められた。
12kbのゲノミック断片が同定され、相補活性が、トラ
ンスポゾン変異生成およびサブクローニングにより、3.
1kb BamH I−Sal I断片に局在していた。この領域は、D
NA修復欠陥ならびに原数分裂欠如に相補した。遺伝子目
標実験では、このクローニングした領域をhrr25−１に
結合させた。同起源のHRR25ゲノミック遺伝子座へ戻さ
れたBamH I−Sal I断片内のトランスポゾン挿入変異
は、MMS感受性に関するhrr25−１と相補しなかったのに
対し、hrr25−１に対して相補した時に、相補領域の外
側の近接する染色体挿入体は、相反して分離した。
Mini−Tn10LUKトランスポゾン（Huisman,et al.,Gene
tics,116:191,1987）は、12kbのBamH I−Sal I断片にお
けるHRR25の概ねの位置を定めるために用いられた。（1
2kbのゲノミック断片の）左手側9kbに位置する挿入体
は、変異しなかったプラスミドと比較して、hrr25−1MM
Sの相補耐性を不活性化しなかった。右手側2kbにあるEc
oR V部位近傍に位置する二つの挿入体は、相補性を不活
性化した。HRR25相補活性は、3.4kbにあるSal I断片に
局在していた。この断片（12kbの右手側）の約300塩基
対は、（pBR322に基づくYCp50のBamH I間の）pBR322テ
トラサイクリン耐性遺伝子の一部である。HRR25の読取
枠は、右末端3kbにあるEcoR V部位と二つのBgl IIを横
断する内部領域にわたっている。
3.1kb断片のDNA配列は、中央部に位置する1482個のヌ
クレオチドの読取枠を示した。この読取枠内のトランス
ポゾン挿入変異体は、HRR25相補性を不活性化したが、1
2kbクローンのその他の挿入体はHRR25相補性に影響を与
えなかった。HRR25のトランスポゾンが介在した分裂
も、hrr25−１には見られなかったいくつかの表現型を
示した。予期していた通り、プラスミド保有HRR25コー
ド領域中央部へのTn10に基づいたLUKトランスポゾン挿
入体（Huisman,et al.,Genetics,116:191,1987）は、MM
S感受性に関する相補性を不活性化した。ゲノミックHRR
25遺伝子へのこの挿入体の移入は、MMS感受性および減
数分裂不能に加えて、いくつかの成長欠陥を示した。こ
のいくつかの成長欠陥は、hrr25−１株には見られなか
った。野性型HRR25株は、肥沃な培地にて、30℃で、約8
0〜90分にて二倍になったのに対し、同系のhrr25::LUK
株およびhrr25:Δは、各９〜12時間で二倍になった。hr
r25−１は、二倍になるために２〜４時間の時間を要し
た。
変異体表現型が、hrr25::LUK分裂対立遺伝子が存在し
ない表現型を意味するか否かを決定するために、HRR25
全コード配列を削除した。要約すれば、HRR25全コード
配列の削除には、hisG::URA3::hisGカセット（Alan,et
al.,Genetics,116:541,1988）を用いた。3.1kbのHRR25
Sal I断片をpBluescriptにクローニングした（ストラタ
ジェン社、ラヨラ、カリフォルニア州）。このプラスミ
ドをBgl IIで消化し、HRR25全遺伝子にわたる長さの二
つのBgl II断片およびその端部処理した配列を削除し
た。hrr25Δ対立遺伝子を生成するために、この削除部
分を、pNKY51からの3.8kb BamH I−Bgl II hisG::URA
3::hisG断片に導入した。Sal I消化により、HRR25全遺
伝子座が削除された直線状断片を生成した。削除−分裂
対立遺伝子（hrr25Δ）を保有する酵母は、MMS感受性、
緩やかな成長、および胞子形成欠陥を含む、野性型HRR2
5タンパク質がこれらプロセスと関連があり、ならびにH
RR25::LUK対立遺伝子がDNA修復、成長、もしくは胞子形
成を間接的に干渉しないという検討したすべての特性に
関して、hrr25::LUK対立遺伝子の表現型と同一であるこ
とが示された。直接対比において、hrr25::LUKおよびHR
R25Δ対立遺伝子は同一の挙動を示した。
酵母株MHF−14（MATa/MATα ura3/ura3）を、ウラシ
ル原栄養株に対するBgl II−直線化YCp50−HRR25::LUK
で形質転換し、HRR25の異種接合体分裂をサザーン・ブ
ロット分析法によって確認し、窒素および醗酵性炭素源
欠乏によって二倍体の胞子形成を行い、四分子を切開
し、細胞を30℃で、７日間、成長させた。２日間の標準
培養に先駆けて、hrr25::LUKの重大な成長欠陥が、HRR2
5の欠損が致命的であることを示唆している。しかしな
がら、分離体の顕微鏡観察では、hrr25::LUK成長細胞が
ゆっくりと生育し、観察したすべての事例（20/20四分
子）にて、緩やかな成長、MMS感受性、およびウラシル
原栄養株共分離体が認められた。アデニン生合成での変
異のため、二倍体MFH14分離体による、色彩変化が観ら
れた。MFH14は、ade5/ADE5 ade2/ade2である。ade5/ade
2株は白、およびADE5/ade2株は赤色を示した。
実施例３ HRR25遺伝子の配列および構造 HRR25遺伝子の両鎖のDNA配列の決定をセキナーゼ（US
B社、クリーブランド、オハイオ州）およびExo−Meth
（ストラジェン社、ラヨラ、カリフォルニア州）法を用
いて使用説明書に従って、一方向削除によって行い、そ
の結果を配列番号:1および２にそれぞれ示した。図1Aに
は、HRR25、CDC28、KSS1およびRAF1のアミノ酸配列の対
比を示している。図1Bは、HRR25の構造の概略図であ
る。プロテインキナーゼ相同体には影を付け、P/Q豊富
領域は交差斜線によって示した。突然変異体、hrr25は
一つのアミノ酸置換によって、HRR25と区別できる。151
位にて、アスパラギン酸はグリシンに置換される。
HRR25の予想される翻訳生成物は、rad−様DNA修復機
能の予想外の特性を示した。HRR25はセリン／スレオニ
ンプロテインキナーゼの上科（Hanks et al.,Science,2
41:42,1988）の触媒領域との相同配列である特徴的な記
号を含む。比較のために、HRR25翻訳生成物を、CDC28/c
dc2グループおよびKSS1/FUS3グループの、酵母タンパク
質キナーゼの二つのサブグループの触媒領域と対応させ
た。アミノ酸15および30の間に位置する領域は、GXGXXG
保存領域を含んでいた。この領域のまさにＣ末端が、最
も周知のキナーゼ人存在するリシンおよびグルタミン酸
の保存領域である。これら領域は、キナーゼ反応（Hank
s et al.,Science,241:42,1988）のヌクレオチド結合お
よびリン酸転移工程にて機能するものと考えられてい
る。アミノ酸残基120から150は、HRDおよびDFG態様を含
み、たいていのプロテインキナーゼ科にて認められる。
加えて、すべての周知のセリン／スレオニンキナーゼの
配列検討にて、HRR25はRaf/PKS/mosサブグループ（Hank
s et al.,Science,241:42,1988）との付加的類似性を共
有していることが示された。プロテインキナーゼ触媒領
域でのGXGXXG、DGF、およびDXXSXGの周辺領域にて、最
も強力な相同体が認められた。
HRR25とプロテインキナーゼとの間で観察された配列
類似性機能の関連を、HRR25キナーゼ領域内の特定の残
基を交換し、これら変換の表現型の成果を検討すること
で研究した。38位のリシン（Lys38）を、当該技術分野
で周知の方法による、特定部位の突然変異誘発によって
アルギニン残基へ変異させた。突然変異誘発性のオリゴ
ヌクレオチド、配列番号:22は； であった。
HRR25でのLys38は、周知のタンパク質キナーゼのすべ
てにおいて認められるリシンと対応しており、このサブ
領域はATP結合を含んでいる。ｖ−src、ｖ−mos、およ
びDBF2のようなプロテインキナーゼにて保存されたリシ
ンの変異は、これらタンパク質を不活性化した。変異体
hrr25−Lys38対立遺伝子は、試験したすべての特性に関
して、hrr25−１、hrr25::LUK、およびhrr25Δ対立遺伝
子と相補できず、またHRR25キナーゼ領域の明示が、HRR
25のin vivo機能において求められている。
予想されたHRR25翻訳生成物（配列番号:2）は、タン
パク質キナーゼ触媒領域の相同領域の外側に、数々の顕
著な特徴を有している。例えば、最後の100アミノ酸
は、これら残基の50個を含むプロリンおよびグルタミン
が多く包含されている。これら二つのアミノ酸が多い領
域を含む他のタンパク質は、転写要因Sp1、jun、および
HAP2、ステロイドホルモン受容体、S.pombe ran1キナ
ーゼ、およびmak−雄性微生物細胞関連キナーゼを含ん
でいる（Courey,et al.,Cell,55:887,1988:Bomann,et a
l.,Science,238:1386,1987;Roussou,et al.,Mol.Cell.B
iol., 8:2132,1988;Arriza,et al.,Science,237:268,19
87;Matsushima,et al.,Mol.Cell.Biol.,10:2261,199
0）。Sp1およびjunの場合、プロリン−グルタミン領域
は活性化を含むものであるのに対して、ヒト電解質コル
チコイド受容体でのP/Q領域は、分子間架橋として作用
すると考えられている。HRR25でのこのプロリン−グル
タミン領域は、基質相互作用あるいは亜細胞性局在化の
構造特徴として機能すると思われる。また、この領域で
のグルタミンの多さは、DrosophilaおよびXenopus Notc
h/Xotchタンパク質（Wharton,et al.,Cell.40:55,1985;
Coffman,et al.,Science,249:1438,1990）に見られるop
aもしくはＭ−反復体と類似している。opa−反復体の機
能は定かではないが、いくつかのDrosophila遺伝子にて
認められている。最後に、タンパク質キナーゼに相同な
領域のＣ末端における配列TKKQKYは、SV40ラージＴ抗原
および酵母ヒストンH2Bの核局在シグナルと同様である
（silver,et al.,J.Cell.Biol.,109:983,1989;Morelan
d,et al.,Mol.Cell.Biol.,7:4048,1987）。
実施例４ hrr25細胞の発生および増殖の顕微鏡分析 肥沃な培地での発生後、HRR25およびhrr25::LUKコロ
ニーの顕微鏡写真を取った。MFH14 hrr25::LUKヘテロ接
合形質転換体は、滅菌顕微鏡スライド上のYPD肥沃培地
の薄いフィルム上で切開され、分離物は湿潤した30℃の
チャンバー内のスライドにて発生させた。２日間成長さ
せた後に、コロニーの写真を取った。増殖しているHRR2
5Δおよびhrr25:LUK細胞の位相差およびDAPI染色を比較
した。細胞をYPD肥沃培地に接種し、30℃での1.3×107
細胞/mlの中間対数密度にまで成長させ、要するに、凝
集を超音波的に破砕し、ホルムアルデヒドで固定し、そ
して、DAPIで染色した（Williamson,et al.,Meth.Cell.
Biol., 12:335,1975）。hrr25::LUKを有する多くの細胞
が、DAPI染色できる核を有していなかった。
発生および活性成長対数相半ばのhrr25::LUK細胞の顕
微鏡観察から、異常型細胞形態が明らかになった。HRR2
5トランスポゾン破壊は細胞の拡大を招き、細胞の25〜4
0％は、繊維状になるかあるいは伸長していた。対数相
半ばのDAPI細胞核染色（Williamson,et al.,Meth.Cell.
Biol., 12:335,1975）は、hrr25変異体での通常の細胞
周期が喪失されていたことを示していた。単細胞操作に
より生存不能とされたDAPI染色できる核を欠いた大量の
細胞があった。この細胞核分離欠陥と一致して、hrr2
5::LUK半数体のプレート効果も、野性型の75〜80％の減
少であった。しかしながら、このプレート効果での減少
は、重大な生成率の減少を説明するには不十分であっ
た。血球計計測により決定した細胞の総計に対する肥沃
な培地でのコロニー形成の効果を比較することで、プレ
ート効果を対数相半ばの細胞から測定した。細胞集団
を、血球流量分析およびそれに続く（Hutter et al.,J.
Gen.Microbiol.,113:369,1979）に記載のヨウ化プロピ
ディウムによる染色によって、DNA含量の分布について
解析された。細胞種分析では、hrr25::LUK半数体集団で
の細胞の多くが、細胞環状に遅れがあり、G2DNA含量を
示したが、細胞集団は、細胞周期において均一に抑止さ
れる。
実施例５ CDC28、KSS1およびRAF1を有するHRR25の配列比較 HRR25の予測した翻訳生成物（配列番号:2）、セリン
／スレオニンプロテインキナーゼ上科の幾つかの触媒領
域を比較した。最初の配列比較には、UWGCGプログラム
（Devereux,et al.,Nuc.Acids.Res., 12:387,1984）を
用いたのに対し、サブグループの比較には前出のHanks,
et al.,の方法を用いた。HRR25は、前出のHanks,et a
l.,に記載された11個のサブ領域をすべて含んでいた。
構造的に類似する集団を、配列比較にて対比した。これ
らには、無極性鎖状残基、芳香性あるいは環含有残基、
略中性極性をもつ小規模残基、酸性残基、非荷電極性残
基、および塩基性極性残基が含まれる。
CDC28およびKSS1は、酵母中のセリン／スレオニンプ
ロテインキナーゼの２つのサブグループを示す。CDC28
は細胞周期調節に含まれ、一方、KSS1は酵母交配経路の
調節下で活動する。HRR25はCDC28に対して21％の同一
性、および41％の類似性を示し、KSS1（図1A）に対して
19％の同一性、および43％の類似性を示した。HRR25は
タンパク質キナーゼのRaf1/PKS/Mos科に最も高い類似性
を示した。触媒領域において、HRR25はRaf1に対して、3
0％の同一性、および49％の類似性を示した。
実施例６ Sc.pombe Hhp1＋およびHhp2＋遺伝子の同定、単離およ
び分析 A.Hhp1＋およびHhp2＋遺伝子の単離 クローンを以下に示す２つの方法で単離した。すなわ
ち、ｉ）DNAに基づいたスクリーニング法；およびii）
S.cerevisiae hrr25突然変異株中の直接相補性法。２つ
の遺伝子を同定した（Hhp1＋およびHhp2＋;Schizosacch
aromyces pombeのHRR25相同性から命名）。S.cerevisia
e hrr25突然変異株中のHhp1＋の発現は、全ての突然変
異株の欠損を完全に回復した。S.cerevisiae中のHhp2＋
の発現もまた、hrr25突然変異に関わる欠損を種々の程
度で回復した。
Fikes等の方法（Nature,346:291−293,1990）に従っ
て調製したSc.pombeゲノムおよびcDNA配列から得たHRR2
5−様DNAのDNAに基づいた増殖を、以下に示す部分的に
変性したオリゴヌクレオチドプライマーとのポリメラー
ゼ連鎖反応を用いて行なった。
（１）プライマーNo.4583（配列番号:13）HRR25の残基1
6〜15をコードする先端鎖DNA;［1nmol/5μｌ］、Tm＝52
℃ （２）プライマーNo.4582（配列番号:14）HRR25の残基1
26〜133をコードする先端鎖DNA;［1.5nmol/5μｌ］、Tm
＝54℃ （３）プライマーNo.4589（配列番号:15）HRR25の残基1
26〜133をコードする末端鎖DNA;［0.5nmol/5μｌ］、Tm
＝54℃ （３）プライマーNo.4590（配列番号:16）HRR25の残基1
94〜199をコードする末端鎖DNA;［2nmol/5μｌ］、Tm＝
38℃ パーキンエルマー自動装置を用いて２つのシリーズの
増幅を行なった。すなわち、第１のシリーズは、HRR25
−ベースのプライマーNo.4583および4589を、そして、
第２のシリーズは４つのプライマー全てを用いて行なっ
た。第１のシリーズでは、30サイクルの変性（94℃、１
分間）、アニーリング（48℃、１分間）および伸長（66
℃、３分間）を行ない、最終サイクルでは伸長時間を５
分間に延長した。反応生成物をアガロースゲル上で測定
したところ、約306bpの推定サイズの顕著なバンドが認
められた。第２のシリーズの増幅では、アニーリングお
よび伸長を、それぞれ35℃および60℃で行なった以外
は、上記と同様に30サイクルを行なった。予測されたサ
イズ（513bp、180bp、および306bp）の３種類の主要生
成物が、ゲノムおよびcDNAのライブラリの両方に発生
し、これらを調製用アガロースゲル電気泳動で精製し
た。
生成物を、M13mp19にクローニングし、ジデオキシ法
（Maniatis et al.,Molecular Cloning;A Laboratory M
anual,1982）により配列決定した。２種類の配列が同定
された。各種類の代表的クローンを、比放射能106cpm/
μｇまでランダムプライム切断した標識法（前出のMani
atis et al）により、32Pで放射標識し、これをハイブ
リダイゼーションプローブとして用いることにより、全
長のcDNAクローンを単離し、サザンブロットにより酵母
ゲノムDNAを、そしてノーザブンロットにより総RNAを実
験対象とした。ハイブリダイゼーションは、６×SSPE、
0.1％SDS、５％デキストランスルフェートを含む緩衝液
中で16時間行なった。２つの遺伝子を同定し、Sc.pombe
由来のHRR25 Homologuesを、略してHhp1＋およびHhp2＋
と命名した。
Hhp1＋では７つのクローン（６つのクローンおよび１
つの全長クローン）が同定された。Hhp2＋では、２つの
全長クローンが同定された。サザン分析およびノーザン
分析の両方にて、これらのクローンが、別の遺伝子に由
来することが証明された。これらの遺伝子を標準ジデオ
キシ法（前出のManiatis et al.,）を用いて配列決定し
た。Hhp1＋のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、
配列番号:3および４に示す。Hhp2＋のヌクレオチド、お
よび推定アミノ酸配列を、配列番号:5および６に示す。
B.S.cerevisiae hrr25突然変異株におけるHhp1＋および
Hhp2＋の機能分析 Sc.pombe Hhp1＋およびHhp2＋のcDNAをURA3を基にし
たベクターpDB20中のS.cerevisiaeアルコールデヒドロ
ゲナーゼ−１（ADH1）プロモーターの制御下になるよう
な位置にクローニングし、S.cerevisiae中で発現させた
（前出のFikes et al）。このようにして得られたクロ
ーンを、標準的な方法で、適切な酵母株へ形質転換した
後に、hrr25−１突然変異およびhrr25△突然変異に関す
る抑制表現型を変性／修飾する能力を分析した（Ito et
al.,J.Bacteriol.153:163,1983）。形質転換体を、hrr
25突然変異に関する欠損を修復する能力について分析し
た（Hoekstra et al.,Science,253:1931,1991）。Hhp1
＋の発現は、hrr25関連の欠損に対して完全な相補性を
示し、全ての分析において野性型のHRR25と区別はつか
なかった。相補性のDNA修復、細胞周期の進行、細胞形
態および胞子形成に対する作用を分析した。Hhp2＋は、
Hhp1＋と比較して相補性の程度は低かった（相補性レベ
ルは真正のHRR25の相補性レベルの50〜75％であっ
た）。hrr25関連の表現型の変性は、相補Sc.pombe Hhp
プラスミドを有し、かつhrr25突然変異を有するような
形質転換酵母株により変化した。
HRR25プロテインとHhp1＋プロテインとのアミノ酸相
同性の程度は、キナーゼ領域全体について73％である。
同様および同一のアミノ酸の存在を考慮した類似性の程
度は、85％より大きい。HRR25プロテインおよびHhp2＋
プロテインのアミノ酸の同一性は63％であり、百分率で
の同一性は、80％である。Hhp1＋プロテインとHhp2＋プ
ロテインとの種間比較では、72％の同一性であった。こ
の構造および相補性の分析によれば、明らかに、Sc.pom
beクローンは、Sc.cerevisiae HRR25の機能性相同体で
ある。このように高い程度の関連は、プロテインキナー
ゼの他の何れのグループにおいても観察されていない。
ここで、比較の手段として真正の機能相同体（すなわ
ち、S.cerevisiae、Sc.pombeおよびヒトに由来するcdc2
プロテインキナーゼ）は、40〜45％の同一性を示す。無
作為に比較した、何れの二つのプロテインキナーゼで
も、比較を種内または種間で行なうかに関わらず、約20
〜25％の同一性の程度が示された。
C.Sc.pombeにおけるHhp1＋およびHhp2＋の分裂および突
然変異 S.cerevisiae中のHRR25のプロテインキナーゼ活性を
不活性化するか、または低下させるような突然変異は広
範な種類の表現型、例えば種々の形態のDNA損傷への感
受性、重度の細胞周期の遅延、細胞周期の進行に影響す
る薬剤（例えば、カフェイン）への感受性、微小管の一
体性に影響する薬剤（例えば、ベノミル）への感受性、
および、複製DNAの一体性に影響する薬剤（例えば、ヒ
ドロキシ尿素）への感受性をもたらす。
同様に、Sc.pombeにおいては、Hhp1＋およびHhp2＋遺
伝子を不活性化してコードされたプロテインキナーゼの
活性を低下あるいは消滅させることにより、hee25の突
然変異を模倣した細胞表現型をもたらした。例えば、Hh
p1＋遺伝子の欠失は、細胞周期の遅延および異常な細胞
形態、MMSのようなDNA損傷薬剤への感受性、およびベノ
ミルおよびヒドロキシル尿素への感受性をもたらした。
Hhp2＋遺伝子の欠失は、他の欠損からしても、特に、カ
フェイン感受性、ベノミル感受性、およびヒドロキシル
尿素感受性をもたらしていた。
Hhp1＋遺伝子を、以下のとおり破壊した。cDNAを、S
c.pombeベクターpHSS19にサブクローニングし（Hoekstr
a et al.,Meh.Emzymol., 194:329,1991）し、これを、N
he I−EcoR Iと命した。Sc.pombe URA4遺伝子を挿入
し、Hhp1＋キナーゼ領域を欠失させた。得られたプラス
ミド構築物由来の線状DNAを用いて標準的な方法（Moren
o et al.,Meh.Enzymol.,194:795,1991）により、Sc.pom
beを形質転換した。安定な形質転換体を同定し、半数性
のhhp1△株を、標準的な方法（Moreno et al.,Maniatis
et al.,）により評価した。
Hhp2＋遺伝子を以下のとおり破壊した。Hhp2＋のcDNA
を、Sc.pombeを基にしたベクターであるプラスミドpHSS
19にクローニングし、ミニTn3トランスポゾンmTn3Leu2
を用いてトランスポゾンシャトル突然変異により破壊し
た（前出のHoekstra et al.,Meth.Enzymol）。得られた
プラスミド構築物由来の線状DNAを用いて、標準的な方
法によりSc.pombeを形質転換した。安定な形質転換体を
同定し、半数性のhhp2△株を標準的な方法により評価し
た（上記参照）。
S.cerevisiaeについて記載されている標準的な生理学
的方法（Hoekstra et al.,Science,253:1031,1991）を
用いて、hhp突然変異株を特性化した。表現型の分析に
よれば、hhp1およびhhp2の突然変異体の両方とも、MMS
処置およびＸ線処置を含む、種々のDNA損傷処置への感
受性を含む以前にhrr25突然変異体で見られた欠損を示
した。
上記した結果によれば、Hhp1＋およびHhp2＋はS.cere
visiae HRR25プロテインキナーゼのイソ体である。これ
ら３種類のプロテインキナーゼは高い水準の配列の同一
性を示す。さらに、これらのキナーゼを不活性化する突
然変異は広範の種類の微生物中に極めて似た欠損をもた
らす。
D.S.cerevisiae HRR25遺伝子に対するSc.pombe突然変異
株の相補性 上記したとおり調製したSc.pombe hhp突然変異体が、
S.cerevisiae hrr25突然変異体と同一であることを示す
ために、そして、35％より大きいアミノ酸同一性を有す
るHRR25様プロテインキナーゼが、機能的に相同体であ
ることを示すために、S.cerevisiae HRR25遺伝子を、S
c.pombe発現ベクターに導入し、Sc.pombe hrr突然変異
体に形質転換した。メチオニンで始まるHRR25におけるD
NA配列はNdel部位で変化していた（読み枠を保持してい
るが、HRR25遺伝子を適切なSc.pombeプラスミドに導入
させるようなサイレントコード変化）。これは、部位特
異的DNA変化により行ない、市販のシステム（Bio Rad
社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を用いた標準
的な方法により、S.cerevisiae HRR25遺伝子内で作成し
た。改変したHRR25遺伝子を、Sc.pombe発現プラスミ
ド、pREP1（Maundrell,K.J.,Biol.Chem. 265:10857,199
0）に、Ndel部位で連結し、得られた構築物をSc.pombe
hhp突然変異体に、標準的方法で形質転換した。Sc.pomb
e突然変異株内でのHRR25の発現は、Hoekstra et al（前
出のScience）により記載された生理学的方法で評価し
たところ、突然変異体欠損の相補性をもたらした。
実施例７ 酵母HRR25様遺伝子の単離および特徴付け さらに別のHRR25様遺伝子のS.cerevisiaeからの単離
を、HRR25コード配列を欠失したS.cerevisiae株（Demag
gio et alの7D株,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 89:7008−
7012,1992、参考文献として本明細書に組み込んでい
る）からのゲノミックDNAのDNAを基にした増幅を行なう
ことにより、増幅からHRR25配列を獲得する機会を排除
して行なった。プライマーおよび増幅条件は、実施例６
の通りである。
得られた増幅生成物を、M13mp19にクローニングし、
ジデオキシ鎖停止法により配列決定した。これらの独特
のクラスの増幅生成物を同定した。これら生成物の２つ
はそれぞれ、Robinson et al（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,89:28−32,1992）およびWang et al（Molecular Biol
ogy of the Cell,3:275−286,1992）のYCK1/CK I 2およ
びYCK2/CK I 1遺伝子に相当した。第３の遺伝子生成物
は、NUF1（Number Fourを称する）と命名した。NUF1に
相当する増幅生成物を、実施例６に示した通にり放射標
識し、酵母YCp50を基にしたゲノムライブラリー（ATC
C、ロックビル、メリーランド州）をスクリーニングす
るために用いた。８つのクローンを同定し、内１つはNU
F1ハイブリダイゼーション遺伝子を含む約4KbのHind II
I断片を有していた。サザン分析によれば、NUF1は、HRR
25,YCK1/CK I 2およびYCK2/CK I 1とは別の遺伝子であ
った。Hind III断片を配列決定したところ、そのプロテ
インキナーゼ領域全体において、HRR25に対する同一性
が約65％のプロテインキナーゼであることがわかった。
NUF1のDNAおよび推定アミノ酸配列を、配列番号:23およ
び24に示す。
NUF1遺伝子をさらに特徴付けるために、Hind III断片
を、酵母プラスミドYEplac112にサブクローニングした
（GietzおよびSugino,Gene 74:527−541（1988））。得
られた構築物をhrr25△欠失株7dに形質転換して、NUF1
が、hrr25△有糸分裂欠損に対して相補性を有すること
が判明した（例えば、NUF1は遅延成長欠損、異常形態欠
損、DNA損傷薬剤感受性に対して相補性を示した）。さ
らに、NUF1のゼロ突然変異体対立遺伝子を、トランスポ
ゾンシャトル突然変異誘発により構築し、NUF1遺伝子生
成物を欠損した株が、hrr25△突然変異体様欠損を有す
ることを発見した。特に、hrr25△突然変異体と同様、N
UF1突然変異体は、より遅い有糸分裂成長速度を示し、M
MS、UVおよびＸ線照射のようなDNA損傷処置に対して、
より高い感受性を示した。
実施例８ ヒトHRR25様遺伝子の同定および単離 上記実施例6Aに記載したアミノ酸配列由来のオリゴヌ
クレオチドを用いて、以下の材料:Arabidopsis thalian
a、Drosophila melanogaster、Xenopus、ニワトリ、マ
ウス、ラットおよびヒトHeLa細胞から得たcDNAを増幅し
た。これらのcDNAは、逆転写mRNA（前出のManiatis et
al.,）から得るか、または、市販のcDNAライブラリ（St
ratagene社、ラヨラ、カリフォルニア州およびClonetec
h社、パロアルト、カリフォルニア州）より得た。S.cer
evisiae HRR25およびSc.pombe、Hhp1＋およびHhp2＋か
ら得たものと同様の移行サイズの増幅生成物を、1.0％
アガロースゲル中に観察した（前出のManiatis et a
l.,）。この結果によれば、HRR25様遺伝子は、検査した
全ての種に存在することが解った。
ヒトHRR25様プロテインキナーゼをコードする全長のD
NAの単離は、Rowles et al（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
8:9548−9552,1991）が報告した、ウシ脳カゼインキナ
ーゼI cDNAの一部を基にした独特の配列のオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて、ヒトゲノムDNAのPCR増幅を
行ない、これによりその触媒分解領域において、HRR25
に対して60％の相同性を有する哺乳類プロテインをコー
ドするようにした。
以下に示すような多くの種類のプライマーを作成し、
対にして用いた。
（１）プライマーJH21（配列番号:17）、ウシ先端鎖DNA
塩基47〜67: （２）プライマーJH22（配列番号:18）、ウシ先端鎖DNA
塩基223〜240: （３）プライマーJH29（配列番号:19）、ウシ先端鎖DNA
塩基604〜623: （４）プライマーJH30（配列番号:20）、ウシ先端鎖DNA
塩基623〜604;および （５）プライマーJH31（配列番号:21）、ウシ先端鎖DNA
塩基835〜817。
オリゴヌクレオチドJH21/JH30、JH22/JH30およびJH29
/JH31の組合せを用いたDNA増幅は、第１のサイクルでは
４分間、そして残りのサイクルでは１分間で94℃の変
性、２分間で50℃のアニーリング、そして４分間で72℃
の伸長を行なうことにより、30サイクルを行なった。３
回の増幅で得られた推定サイズの生成物を、調製用アク
リルアミドゲル上で精製し、ランダム・ニック・トラン
スレーションを用いて32Pで（比放射能７×106cpm/μｇ
〜1.4×107cpm/μｇとなるまで）標識した。標識された
プローブを１つのグループとして用いて、市販のヒト胎
児脳cDNAライブラリ（Stratagene社）をスクリーニング
した。ハイブリダイゼーションは３×SSC、0.1％Sarkos
yl、10×Denhart溶液、および20mMリン酸ナトリウム（p
H6.8）を含むハイブリダイゼーション緩衝液中にて、65
℃で、16時間行なった。２×SSC、0.1％SDS中にて、65
℃で３回洗浄した。二連のフィルターを用いて30プレー
ト上で、約1.5×106個のプラークをスクリーニングし
た。ライブラリー調製業者の使用説明書に従って、６個
の高い陽性のクローンを単離し、精製し、プラスミド形
態に変換した。制限酵素による分解により、６クローン
につき以下の挿入サイズが判明した：クローン35A1、1k
b;クローン35B1、1.4kb;クローン41A1、3.7kb;クローン
42A1、＞4kb;クローン47A1、3.35kb;およびクローン51A
1、2.75kb。全ての６個の挿入体は、ウシCK I α遺伝子
のDNAと推定プロテイン配列の両方を照合できる配列を
含んでいた。省略した部分cDNAのクローン35A1および35
B1は、これ以上分析しなかった。クローン41A1および42
A1はサイズ以外は、同一であった。クローン42A1、51A1
および47A1は、CK I α1Hu、CK I α2HuおよびCK I α3
Huと命名した。挿入体のDNAおよび推定アミノ酸配列を
それをれ、配列番号:7および8;9および10;および、11お
よび12に示す。CK I α1Huの推定アミノ酸配列は、報告
されたウシCK I αの配列と同一であった。以下に示す
表１には、ウシとヒトのDNAのヌクレオチドの差を示し
ており、番号は開始コドンATGの最初の塩基から付けて
ある。
CK I α3Hu DNAはまた、コード配列中の＋454の位置
に84塩基の挿入部を有しており、これはCK I α2Hu発現
生成物の28個のアミノ酸の中間伸長を与えている。この
DNA挿入体は、ウシ遺伝子には存在しないが、Rowles et
alがCK I −アルファ−Ｌと命名したアミノ酸配列挿入
体をコードしている。CK I α1Hu DNAの＋971の位置で
のCK I α2HuおよびCK I α3HuのDNAの挿入。この挿入
はウシの配列の何れにも認められず、カルボキシ末端に
隣接する13個のアミノ酸の伸長をコードしている。CK I
α3Hu配列の最後の２個のコドンは、ウシの配列または
CK I α1HuおよびCK I α2Huの配列とは異っており、全
てのその他のウシおよびヒトのカゼインキナーゼＩ配列
で認められる、フェニルアラニンではなく、リジンを末
端に有するCK I α3Hu発現生成物を与える。CK I α3Hu
の３′フランク配列は、CK I α1HuおよびCK I α2Huの
ものとは明らかに異っている 図２は、HRR25、Hhp1＋、Hhp2＋、CK I α1Hu、CK I
α2Hu、およびCK I α3HuならびにYCK1/CK I 2およびYC
K2/CK I 1を含む、上記実施例でDNAを単離したHRR25様
プロテインの触媒領域のアミノ酸配列の対応を示してい
る。CK I α3Hu中間挿入体およびCK I α2HuおよびCK I
α3Huのカルボキシ末端領域挿入体を除いて、３個のヒ
ト生成物の配列は同一である。「共通の」残基が図に示
されており、ここでは７個の残基の少なくとも３個が、
対応する位置で同一である（ヒトの配列を単一の配列と
みなした）。
Hhp1＋およびHhIp2＋と同様、３種類のヒトHRR25様プ
ロテインキナーゼは、HRR25遺伝子生成物に対する極め
て高い程度のアミノ酸同一性（68％）を示し、これらの
ヒトクローンが、酵母HRR25遺伝子の酵素的イソ体であ
ることが確認された。HRR25、Hhp1＋、Hhp2＋およびヒ
ト相補様キナーゼのイソ体の対応関係によれば、これら
酵素が、多くの一次構造の特徴を共有しており、これら
酵素が、異る種で同等の活性を示すことを示唆してい
る。この結論の根拠は、一連の証拠に基づく。第１に、
全ての酵素が、プロテインキナーゼに特徴的な共通の一
次配列認識体を共有している。第２に、酵素は、無関係
のプロテインキナーゼ中には保存されていないプロテイ
ンキナーゼ領域中に高い程度のアミノ酸の同一性を共有
している。最後に、これら酵素は、他のプロテインキナ
ーゼとは一次配列においてその領域が異るようなキナー
ゼ領域中に、同一性の領域を共有している。例えば、全
ての知られたプロテインキナーゼの95％以上が、キナー
ゼドメイン全体の約2/3にいわゆるＡ−Ｐ−Ｅ（アラニ
ン−プロリン−グルタミン）を有している。HRR25様プ
ロテインキナーゼは、Ａ−Ｐ−Ｅ配列を有しておらず、
その代わりに、Ｓ−I/V−Ｎ配列（セリン−イソロイシ
ンまたはバリン−アスパラギン）を有している。公知の
プロテインキナーゼと種々の微生物より得た、本発明の
プロテインキナーゼの間のこの一次配列の比較に基づく
ならば、本発明でのこれら酵素は、HRR25プロテインキ
ナーゼのイソ体である。
実施例９ カゼインキナーゼとのHRR25の比較 試験した全ての真核生物において、主要なプロテイン
キナーゼの２つは、カゼインキナーゼＩおよびII（それ
ぞれ、CK I およびCK II）である。これらの酵素は試験
した全ての細胞型および種に認められた。両方の酵素は
基質中の酸性環境中のSer/Thr残基を認識する。これら
２つのプロテインキナーゼは、細胞全体に認められ、そ
の活性は、細胞質画分、膜、核、ミトコンドリアおよび
細胞骨格から精製されるか、またはこれらと共存してい
る。CK IIは、一般的に核酵素であるが、同様の試験がC
K Iについても行う必要がある。
HRR25遺伝子生成物が、カゼインキナーゼとして機能
するかどうかを測定するために、HRR25含有免疫沈降物
質がカゼインを燐酸化する能力を調べた。酵母由来のHR
R25含有免疫沈降物質を、カゼインと共にインキュベー
トし、燐酸化されたプロテインを検査した。
酵母抽出物を、物理的破壊により調製した。等量の細
胞を溶解緩衝液に懸濁し、酸洗浄した0.5mmのビーズを
混合し、氷上で１分の間隔で、30秒間の衝撃与え、破壊
の程度を顕微鏡で観察した。溶解緩衝液は、10mMリン酸
ナトリウム（pH7.2）、150mM NaCl,1％Nonidet P−40、
１％Trasylol、1mM DTT、1Mmベンズアミジン、1Mmフェ
ニルメチルスルホニルフロリド、5mM EDTA、ペプスタチ
ン（1ug/ml）、ペプスタチンＡ（2ug/ml）、ロイペプチ
ン（1ug/ml）、100mMナトリウムバナデートおよび50mM
NaFを含んでいた。抽出物を、30分間、100,000×ｇで遠
心分離することにより精製し、グリセロールで50％（v/
v）とし、液体窒素中で凍結し、−70℃で保存した。数
か月に渡り凍結した抽出物中で、プロテインキナーゼ活
性の損失は殆ど無かった。
免疫複合プロテインキナーゼ分析を、Lindberg et al
（Mol.Cell.Biol.10:6316,1991）の方法に従って行なっ
た。凍結した抽出物を溶解緩衝液を含有する25％グリセ
ロールで希釈するか、新しい抽出物を直接用いた。抽出
物を前免疫血清およびプロテインＡ−セファロースで前
浄化し、次に免疫血清（大腸菌由来HRR25型融合生成物
を用いたウサギの免疫処置により、実施例11に記載の通
り得た）で処理した。HRR25キナーゼ含有免疫複合体を
プロテインＡ−セファロースを用いて沈降させた。免疫
複合体を、溶解緩衝液で４回、15mM Hepes（pH7.4）、1
00mM NaClおよび10mM MgCl2を含有するキナーゼ緩衝液
で２回洗浄した。
HRR25免疫沈降物および熱処理済カゼイン（300ng/20u
l反応容量）の反応混合物を、５〜10分間、30℃で、イ
ンキュベートし、20ul反応容量あたり10uCiのガンマ32P
−ATPを添加した。SDSおよびEDTAを添加することにより
反応を停止し、SDS/PAGE試料緩衝液中で煮沸し、そして
10％ゲル中で分割した。ホスホアミノ酸分析を文献に従
って行なった（Hunter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
77:1311,1980）。
HRR＋株から得た免疫沈降物は、カゼインを燐酸化す
ることができた。適切なアミノ酸が燐酸化されたことを
評価するために、HRR25燐酸化カゼインのホスホアミノ
酸組成物をホスホアミノ酸分析により検査した。試料
を、pH1.9およびpH3.5の二次元電気泳動により分割し
た。哺乳類のCK I特異性と同様に、セリンおよびスレオ
ニン残基が燐酸化された。カゼイン上のHRR25燐酸化セ
リン残基は、スレオニン残基より３倍多かった。同様
に、in vitroの免疫複合体中HRR25の自動燐酸化は、セ
リンおよびスレオニン残基で起こった。高水準の配列の
同一性と組合せて考えると、これらの結果はHRR25がCK
Iイソ体であることを示唆している。
酵母由来のHRR25免疫沈降物が、カゼインを燐酸化で
きることを更に確認するために、いくつかの実験を行な
った。HRR25を発現する大腸菌から免疫沈降されたHRR25
（実施例11参照）もまた、カゼインキナーゼ活性を示
し、HRR25プロテインを欠く大腸菌抽出物は、カゼイン
を燐酸化しなかった。HRR25含有バキュロウイルス構築
物は、免疫沈降物中にカゼインキナーゼ活性をもたらし
た。野性型のバキュロウイルス感染細胞は、同様の条件
下で0.5％に満たないカゼインキナーゼ活性を示した。H
RR25プロテインを発現するS19細胞のプロテインキナー
ゼ活性は、酵母抽出物由来のHRR25プロテインの活性を
低下、あるいは不活性化させる同様の条件に対して感受
性を有していた。HRR25依存性のカゼインキナーゼ活性
が、野性型のHRR25を発現する大腸菌細胞の免疫沈降
物、HRR25含有バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、
および、hrr25△突然変異体ではない野性型に存在する
という観察結果は、HRR25遺伝子生成物が、カゼインキ
ナーゼとして機能することができ、そして、HRR25プロ
テイン含有免疫沈降物中のカゼインキナーゼ活性が、HR
R25遺伝子生成物によるものであることを示している。
実施例10 HRR25様プロテインのプロテインキナーゼ活性の分析 大腸菌にて最も多いプロテインキナーゼ活性は、セリ
ン／スレオニンまたはチロシンキナーゼではなく、ヒス
チジンキナーゼであるため、これら原核細胞は、内因性
のキナーゼの存在により相殺されないHRR25様プロテイ
ンキナーゼ活性の検定のためのシステムを提供する。従
って、HRR25およびHhp1＋DNAの双方とも、IPTG誘導性T7
RNAポリメラーゼおよびT7リゾチーム遺伝子を含有する
大腸菌株BL21（DE3）を用いて、IPTG誘導性T7遺伝子10
を基にした市販の発現系（invitrogen社、サンディエ
ゴ、カリフォルニア州）にて発現した。DeMaggio et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:7008−7012（1991）を
参照されたい。最初の一連の実験では、大腸菌分解物
は、２時間IPTGで中間対数期の細胞を誘導し、細胞を沈
殿させ、そしてDeMaggio et al（前出）の記載した緩衝
液を用いて凍結融解法により抽出して調製した。抽出物
を、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ナイロン基
材の支持膜に移行させ、ホスホチロシン（UBI社、レー
クプラシッド、ニューヨーク州）に対する抗体を用いた
ウエスターン分析によりプローブした。これらの方法に
よれば、HRR25およびHhp1＋発現細胞は対照群の細胞
（ベクターのみで形質転換されたものであるか、また
は、キナーゼ不活性突然変異体により形質転換されたも
の）では観察されなかった、新しいチロシン燐酸化プロ
テインを含有していた。第２の実験では、HRR25およびH
hp1＋含有大腸菌株のチロシン燐酸化プロテインについ
て、感度の高い正確な、放射標識およびホスホアミノ酸
操作により調べた。この実験を行なうために、細胞をIP
TGで誘導し、32Pオルトホスフェートの存在下に生育さ
せた。放射標識された抽出物を凍結融解法により調製
し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そしてゲル
をオートラジオグラフィー法により調べた。新しいリン
酸プロテインは、HRR25およびHhp1＋を発現する菌株に
は観察されたが、上記した対照群には観察されなかっ
た。リン酸プロテインは、標準的な方法（Boyle et a
l.,Meth.Enzymol. 201:110,1991）を用いて、ゲルから
プロテインを抽出し、加水分解することにより調べた。
これらの実験によれば、HRR25およびHhp1＋はプロテイ
ン基質上のチロシン、セリンおよびスレオニン残基を燐
酸化することが確認された。
実施例11 HRR25生成物の組換え発現およびそれに対する抗体の生
成 大腸菌でのHRR25DNAの発現のために、２種類の異るプ
ラスミド構築物を調製し、抗HRR25抗体の調製に有用な
免疫原を生成した。
第１のプラスミドの構築には、Koerner et al（Meth.
Enzymol.,194:477−491（1991）の方法に従って、プラ
スミドpATHを用いた。約［606］の塩基対のDNA断片を、
Bg III消化によりHRR25のオープン読み枠から単離し、
この断片（アミノ酸残基275〜476をコードする）をBamH
Iで消化しておいたpATHに連結した。得られたプラスミ
ドは、そのＮ末端で大腸菌TrpE遺伝子生成物を、Ｃ末端
でHRR25のＣ末端断片を有するような融合タンパク質を
コードしていた。
細胞封入体を、大腸菌DH5α（Bethesda Research Lab
oratories、ベセスダ、メリーランド州）宿主細胞から
単離し、Koerner et al（前出）の記載した溶解緩衝液
を用いて、プラスミドを形質転換し、そしてポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により精製した。次に、ゲル精製
物質を用いてHarlow et al.,（Antibodies:A Laborator
Manual,Cold spring Harbor Laboratory,コールドスプ
リングハーバー、ニューヨーク州（1988））の指示に従
って、皮下注射によりウサギを免疫化したが、その際、
第１回の注射では完全フロインドアジュバントを、そし
てその後の注射では不完全フロインドアジュバントと共
にゲル精製生成物を用いた。血清の反応性は、ゲル精製
抗原に対してウエスタンブロットで確認した。血清抗体
のアフィニティー精製は、ニトロセルロース膜支持体に
固定化した大腸菌生成物抗原を用いて行なった。
実施例12 CK I γ1HuおよびCK I γ2Huの単離 さらに、他のヒトHRR25様プロテインキナーゼをコー
ドするDNAを、DNA増幅法およびライブラリスクリーニン
グ法を組合せて単離した。HRR25様プロテインキナーゼ
における保存された領域に基づくオリゴヌクレオチドを
用いて、DNAセグメントを増幅し、ヒトcDNAライブラリ
をスクリーニングする際のプローブとして用いた。以下
の配列の重複オリゴヌクレオチド： ［式中、Ｇ、Ａ、ＴおよびＣは標準ヌクレオチド、そし
てＲ＝ＡおよびG;Y＝ＣおよびT;I＝イノシン;M＝Ａおよ
びC;およびＫ＝ＧおよびＴである］を用いてヒト胎児脳
cDNAライブラリー（Clonetech社）から得た約540個のヌ
クレオチドを増幅した。増幅条件は、200mMトリス塩酸
（pH8.2）、100mM KCl、60mM（NH4）2SO4、15mM MgC
l2、１％トリトンＸ−100、0.5μＭの各プライマー、10
0ngの鋳型DNAライブラリー、200μM dNTPおよび2.5Uの
ポリメラーゼとした。反応は、30サイクル行なった。反
応は、94℃で、４分間処理することにより開始し、全サ
イクルは、94℃で、１分間、５℃で、２分間のアニーリ
ング、そして72℃で、４分間の伸長とした。
増幅反応物は１％アガロースゲルを通して電気泳動
し、約540塩基対に相当する領域を切り出し、DNAをNa I
抽出およびガラス粉末結合を用いて溶出させた（GeneCl
ean社、Bio101、ラヨラ、カリフォルニア州）。ゲル精
製断片を、Sma I消化ブルースクリプトII SK（＋）に連
結したところ、得られたプラスミドはライブラリスクリ
ーニングのためのcDNAとして用いた、プロテインキナー
ゼ領域の一部を有していた。このプラスミド10μｇをEc
oR IおよびBamH Iで消化し、サブクローニング断片を遊
離させ、反応物を１％アガロースゲルに通して電気泳動
した。約540ヌクレオチドの断片が、ゲルより溶出し、
これを放射活性ヌクレオチドとして32P−dCTPを用いな
がらランダムプライムオリゴヌクレオチド指定標識（Am
ersham社、アーリントンハイツ、イリノイ州）により放
射標識した。放射活性プローブを用いて、以下のとおり
調製したファージクローニングベクターλgt10中に調製
したヒトManca B細胞リンパ腫ライブラリー［Wiman et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）81:6798−6082（198
4）］をスクリーニングした。ポリｄ（Ａ）+RNAはFast
Trackキット（Invitrogen社）を用いてＢ細胞リンパ腫M
anca細胞2.8×108個から調製した。cDNA合成システム
（Gibco BRL社、バーリントン、オンタリオ州、カナ
ダ）を用いてRNA5μｇからオリゴｄ（Ｔ）プライムcDNA
合成を行なった。得られたcDNAをアガロースゲル電気泳
動によりサイズ選択し、Ribo Cloneキット（Promega
社、マジソン、ウィスコンシン州）を用いてEcoR I受容
体に連結した。種々の量の受容体cDNAを、酵素と共に、
製造業者より供給された市販の緩衝液中でT4 DNAリガー
ゼ（Boehringer Mannheim社、インディアナポリス、イ
ンディアナ州）１単位を用いてEcoR I消化λgt10に連結
した。連結は、Gigapackパッケージング抽出液（Strata
gene社）と共にパッケージされており、得られたファー
ジプール（1.5×106ファージ）をC600Hf1株内で増幅し
た。合計で１×106個のファージプラークを、標準的な
ハイブリダイゼーション法（前出のManiatis et al）に
よりスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは６
×SSPE（20×SSPEは175.3g/l NaCl、27.6g/l NaH2PO4H2
O）、7.4g/l EDTA（pH7.4）、100ug/mlサケ精子担持DN
A、５×Denhardt試薬（50×Denhardt試薬は、５％ficol
l、５％ポリビニルピロリドン、５％ウシ血清アルブミ
ン）、0.1％SDSおよび５％デキストラン硫酸ナトリウム
中で、18時間、65℃で行なった。フィルターを、0.1×S
SPE、１％SDS中で４回洗浄した。洗浄は各々、30分間、
65℃で行なった。クローン５個を選択して、さらに分析
した。
これらのファージクローン由来のDNAを、Qiagenラム
ダDNA調製キット（Qiagen社、キャッツワース、カリフ
ォルニア州）を用いて調製し、ヒトcDNA挿入体を、EcoR
I消化により切り出した。これらの挿入体を、EcoR I消
化プラスミドブルースクリプトIISK（＋）（Stratagene
社）にサブクローニングし、挿入体の配列はABI 373A自
動DNA配列決定装置を用いて行なった。５個のcDNAの
内、２つはポリＡ末端およびプロテインキナーゼオープ
ン読み取り枠を有するほぼ全長のcDNAを含有していた。
これらのプロテインキナーゼは、カゼインキナーゼＩの
イソ体に最も緊密に菌連しており、これらをCK I γ1Hu
およびCK I γ2Huと命名した。CK I γ1HuおよびCK I
γ2HuのDNA配列をそれぞれ、配列番号:30および32に示
す。CK I γ1HuおよびCK I γ2Huの推定アミノ酸配列を
それぞれ、配列番号:31および33に示す。
実施例13 CK I δHuの単離 ヒトCK I δをサブクローニングするために、まず、
λZAP II（Stratagene社）中に構築したヒト胎児脳ライ
ブラリからヒト遺伝子を単離した。ラットCK I δを含
有する2.2KbのEcoR I断片を、１％アガロースでゲル精
製し、ガラス粉末を用いたNa I抽出（Bio101、ラヨラ、
カリフォルニア州）によりゲルから単離し、32P−dCTP
を用いてランダムプライマー法（Boehringer Mannheim
社）により放射標識した。このプローブを用いてヒト胎
児脳cDNAライブラリを含む１×106個のプラークをスク
リーニングした。プラークハイブリダイゼーションの条
件は、３×SSC、0.1％Sarkosyl、10×Denhardt試薬、50
μg/mlサケ精子DNA担体とした。ハイブリダイゼーショ
ンは、65℃で、18時間行い、その後、フィルターを２×
SSC、1.0％SDS中にて、65℃で、各々30分間、４回洗浄
した。陽性のクローンを増強スクリーンを用いて、−70
℃でオートラジオグラフィーを行うことにより同定し、
自動ABI373A DNA配列決定装置（Applied Biosystems、
フォスターシティー、カリフォルニア州）を用いて配列
決定した。
１個のクローンが、全長のCK I δイソ体をコードし
ていることが判明し、これをCK I δHuと命名した。CK
I δHuのヌクレオチド配列を、配列番号:34に示し、推
定アミノ酸配列を、配列番号:35に示す。
次に、CK I δHuイソ体の発現を、８種類の異るヒト
組織にて、プローブとして約1.2kbのEcoR I断片を用い
て調べた。CK I δHu mRNAの濃度は、腎臓、肝臓および
胎盤で最も高く、Graves et al（前出）により示され
た、ラットCK I δの精巣特異的な発現とは対照的であ
った。
実施例14 ヒトCK I遺伝子による酵母CK I突然変異体の相補 CK I γ1Huが、酵母HRR25様プロテインのイソ体であ
るか否か決定するために、遺伝子を、酵母プロテインキ
ナーゼ突然変異体中で発現させた。cDNAを、酵母GAL1プ
ロモーターの制御下で発現させた。発現プラスミドは、
酵母GAL1プロモーターを含むプラスミドpRS305（Strata
gene社）に由来するものである。GAL1プロモーターを有
する親プラスミドは、以前に記載されたものであり［Da
vis et al.,Cell 61:965−978（1990）］、これはGAL1
プロモーターに隣接するBgl II部位ならびにBgl II部位
に隣接するSac I部位を有していた。このプラスミド
を、部位特異的突然変異誘発物質により変性し、GAL1プ
ロモーターとBgl II部位との間に独特のNco I部位を有
するようにした。Nco I部位は、遺伝子要素の順番が、G
AL1プロモーター−Nco I−Bgl II−BamH I−Sac Iの順
番になるように、GAL1プロモーターに隣接している。部
位特異的突然変異誘発物質（MutaGeneキット、BioRad
社）は以下のオリゴヌクレオチド： を使用しており、独特のNco I部位（配列番号:36の下線
部）を発生させた。得られたプラスミドを、pRS305
（Ｎ）２μGAL1と命名した。
CK I γ1Huを、pRS305（Ｎ）２μGAL1にクローニング
するために、開始ATGにNco I部位を、そして３′未翻訳
領域にBamH I部位を導入するオリゴヌクレオチドを用い
て、cDNAからCK I γ1Hu cDNAを増幅した。アミノ末端
の突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドの配列を以下に
示す（Nco I部位は下線）。
Stratageneより購入したオリゴヌクレオチドM13rev（St
ratagene社、ラヨラ、カリフォルニア州）を用いて、
３′未翻訳領域にBamH I部位を導入した。増幅条件は、
200mMトリス塩酸（pH8.2）、100mM KCl、60mM（NH4）2S
O4、15mM MgCl2、１％トリトンＸ−100、0.5μＭの各プ
ライマー、100ngのテンプレート、200μM dNTPおよび2.
5Uのポリメラーゼとした。反応は、30サイクル行なっ
た。反応は、94℃で、４分間処理することにより開始
し、全サイクルは、94℃、１分間での変性、５℃、２分
間でのアニーリング、そして、72℃で、４分間での伸長
とした。増幅生成物を、Nco IおよびBamH Iで消化し、N
coO/BamH I消化pRS305（Ｎ）２μGAL1にクローニングし
た。
酵母CK I突然変異体の相補には、酵母株7D（hrr25
△、ura3−１、trp1−１、leu2−３、112、his3−11,1
5、can1−100、ade2−１）［前出のDeMaggio et al（19
92）］およびY1227（cki1D、cki2D、FOAR,ade2−１、ca
n1−100、his3−11,15、leu2−3,12、trp1−１、ura3−
１、,pRS415::Cki1ts）を用いた。菌株7Dは、酵母CK I
HRR25イソ体を欠いており、菌株YI227は、酵母CK I 1の
温度感受性対立遺伝子を含んでいた。酵母株を酢酸リチ
ウム媒介形質転換により形質転換し、形質転換体をSD−
ロイシン培地（Bio101）上で選択した。形質転換に対す
る対照群は、プラスミドpRS305（Ｎ）2ug GAL1単独、プ
ラスミドpRS315（Stratagene社）およびゲノムHRR25断
片においてSal I−EcoR Iゲノム断片を有するプラスミ
ドpRS315::HRR25（前出のHoekstra et al.,Science）と
した。プラスミドpRS315::HRR25は、HRR25のSal I/EcoR
Iゲノム断片を、Sal I/EcoR I消化したpRS315に連結す
ることにより構築した。HRR25およびCK I γ1Huは共
に、酵母突然変異体中で発現した場合、CK Iの温度感受
性生育欠損を完全に相補することができる。さらに、CK
I γ1Huは、HRR25突然変異体に伴う重度の生育速度欠
損を部分的に抑制した。CK I γ1HuによるHRR25生育欠
損の部分的抑制は、pRS305（Ｎ）２μGAL1と比較して10
〜20倍のプレート効率で検知された。
相補性分析を、他のCK I科の構成要素にまで進めるた
めに、他のヒトCK I α1HuおよびCK I δHu遺伝子が、H
RR25突然変異体欠損に対して相補性を示す能力について
調べた。ヒトCK I α1huをプラスミドpRS305（Ｎ）２μ
GAL1にサブクローニングするために、先ず、部位特異的
突然変異誘発により開始メチオニンでNco I部位を導入
した。突然変異誘発性のオリゴヌクレオチド（Nco I部
位は下線）は以下の配列： を有しており、突然変異誘発は、Mugageneキット（BioR
ad社）を用いて行なった。突然変異を誘発されたcDNA
を、Nco IおよびBgl IIで消化し、CK I α1Hu cDNA断片
pRS305（ｎ）２μGAL1に連結した。
CK I δHu cDNAを有する２つの構築物の相補性を調べ
た。プラスミドpEC7B（CK I δHu cDNAを含む）を部位
特異的突然変異誘発（MutaGene、BioRad社）のテンプレ
ートとして用いた。以下に示す突然変異誘発オリゴヌク
レオチド： を用いてCK I δHuの開始ATGにて、BGl II（配列番号:3
9の下線）およびNde I（配列番号:39のイタリック体）
を導入した。pRS305（CK I δ）を得るために、あるプ
ラスミド構築物に、Bgl II/Sac I消化したpRS305（Ｎ）
２μGAL1に連結した、突然変異を誘発したcDNA由来のBg
l II/Sac I消化したCK I DNAを採用した。pRS305（CK I
δ）を得るために、第２のプラスミド構築物に、Nco I
/Sac I消化したpRS305（Ｎ）２μGAL1に連結され、突然
変異を誘発されていないpEC7B cDNA由来のNco I/Sac I
で消化したCK I δHu cDNAを用いた。プラスミドpRS305
（CK I δ）は、GAL1プロモーターとCK I δの開始メチ
オニンとの間に、以下のヌクレオチド： を有していた。プラスミドpRS305（Ｎ）（CK I δ）
は、CK I δHuの開始メチオニンとGAL1の３′末端との
間にほぼ完全な融合体を有していた。ほぼ完全な融合体
とは、プロモーターと開始メチオニンコドンが介在する
核酸配列を殆ど、または、全く有しておらず、このため
ほぼ隣接していることを意味する。
CK I α1HuおよびCK I δHuを含むプラスミドを、酵
母株7DおよびYI227に形質転換し、その突然変異欠損に
対して相補性を示す能力について調べた。CK I γHuと
同様、CK I α1Huは、HRR25突然変異に関する生育欠損
に対し、部分的に相補性を示した。CK I δHuは、温度
依存性CK I菌株の生育欠損、HRR25突然変異体の生育欠
損、そして、HRR25のDNA修復欠損に対して相補性を示す
ことができた。CK I δHuが、これら酵母株における突
然変異欠損に対して相補性を示すことのできる能力は、
適切なプラスミド構築物を用いた場合にのみ、酵母HRR2
5またはCK I遺伝子と区別できなかった。プラスミドpRS
305（CK I δ）は、さらに21個の塩基を有しており、何
れの突然変異の表現型に対しても相補性を示すことがで
きなかったが、pRS305（Ｎ）（CK I δ）のほぼ完全な
融合体は完全に機能していた。この差は、酵母が伸長配
列および／またはCGを多く含むリーダー配列を翻訳する
能力に起因していた。
実施例15 モノクローナル抗体の生成 A.CK I αHuペプチド 以下に示すペプチドに対するモノクローナル抗体を作
成した。配列番号:41は、CK I α1Hu、CK I α2Huおよ
びCK I α3Huの共通のＮ末端から誘導し、配列番号:42
は、CK I α3Hu中の内部互換性切り出し領域から誘導
し、配列番号:54は、CK I δHuのアミノ末端領域から誘
導し、そして、配列番号:56は、CK I α2HuおよびCK I
α3Huの双方に共通するＣ末端領域から誘導した。
これらのペプチドをまず、各々ウシガンマグロブリン
（Sigma社、セントルイス、モンタナ州）と結合させ
た。マンマグロブリン5mgおよびペプチド5mgを、100mM
K2HPO4（pH7.2）0.4mlに再懸濁し、この混合物に予めK2
HPO4（pH7.2）50μｌに溶解した１−エチル−３（３−
ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド−HCl（ED
C、Pierce）35mgを添加した。反応を、４℃で、16時間
進行させ、2Mエタノールアミン0.25mlおよび酢酸0.25ml
を添加することにより反応停止した。次に、反応混合物
を最終容量2.5mlとなるまでPBSで希釈し、セファデック
スＧ−25M（Pharmacia社）クロマトグラフィーを用いて
脱塩した。タンパク含有画分を、遠心分離ミクロ濃縮
（Amicon社）により濃縮した。次に８か月の期間にわた
って、８〜12回、結合タンパク50μｇをマウスに注射し
た。産生した抗体を、対応するペプチドに対してELISA
で測定した。
融合は標準的な方法で行なった。簡単に記載すると、
単一細胞懸濁液を、2mML−グルタミン、1mMピルビン酸
ナトリウム、100単位/mlペニシリン、および100μg/ml
ストレプトマイシン（RPMI）（Gibco社）を添加した血
清非含有RPMI1640培地中に浸漬した２枚のガラス顕微鏡
用スライドの艶消しした末端の間で、脾臓を粉砕するこ
とにより調製した。細胞懸濁液を、滅菌70メッシュNite
x細胞ストレナー（Becton Dickinson社、パーシッパニ
ィー、ニュージャージー州）を通して濾過し、５分間、
200Gで遠心分離することにより２回洗浄し、そして、ペ
レットを血清非含有RPMI20ml中に再懸濁した。３匹の未
投薬のBalb/cマウスから得た胸腺細胞を同様の方法で調
製した。
融合前３日間、11％ウシ胎児血清（FBS）（Hyclone、
Laboratories社、ロガン、ユタ州）と共に、RPMI中に
て、対数期状態で保持したNS−１骨髄腫細胞を、５分
間、200gで遠心分離し、ペレットを上記した通り２回洗
浄した。洗浄後、各細胞懸濁液を血清非含有RPMI中10ml
の最終容量とし、10μｌを1:100に希釈した。各希釈液
から20μｌを取り除き、0.85％生理食塩水中の0.4％ト
リパンブルー染色液（Gibco）20μｌと混合し、血球計
（Baxter Healthcare社、デアーフィールド、イリノイ
州）に適用し、細胞を計数した。
約２×108個の脾細胞を４×107個のNS−１細胞と合わ
せ、遠心分離し、上澄みを吸引した。試験管を叩いて細
胞沈殿物を採取し、37℃のPEG5000（75mM Hepes中50
％、pH8.0）（Boehringer Mannheim）2mlを１分間かけ
て撹拌しながら添加し、次いで、７分間かけて血清非含
有RPMIの14mlを添加した。さらに、16mlのRPMIを添加
し、細胞を10分間200gで遠心分離した。上清を廃棄した
後、ペレットを15％FBS、100μＭナトリウムヒポキサン
チン、0.4μＭアミノプテリン、16μＭチミジン（HAT）
（Gibco社）、25単位/mlIL−６（Mallinckrodt社、セン
トルイス、モンタナ州）および1.5×106胸腺細胞/mlを
含むRPMI200ml中に再懸濁した。懸濁液を200μl/ウエル
で、96穴の平底組織培養プレート（Corning社、Essex
州、英国）に分注した。18ゲージの針（Becton Dickins
on社）で各ウェルから培地の約半量を吸引し、10単位ml
IL−６を含有し、胸腺細胞を含有しない以外は、上記し
たものと同様のプレート培地を再充填することにより、
融合とスクリーニングとの間に２〜３回、プレート中の
細胞に培地を供給した。
融合体は、細胞の生育が全面成長の60〜80％に達した
時点（通常は７〜９日間）でスクリーニングした。融合
体75は、共通するアミノ末端ペプチド（配列番号:41）
または内部ペプチド（配列番号:42）の何れかによりELI
SAでスクリーニングし、融合体80はアミノ末端ペプチド
（配列番号:41）のみでスクリーニングした。イムロン
４プレート（Dynatech社、ケンブリッジ、マサチューセ
ッツ州）を50mM炭酸塩緩衝液（pH9.6）中100ng/ウェル
のペプチドで、一夜、４℃でコーティングした。プレー
トを、0.05％ツィーン20を含有するPBS（PBST）で３回
洗浄し、培養上澄み50μｌを添加した。30分間、37℃で
培養し、上記した通り洗浄した後、PBST中にて1:3500に
希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤ
ギ抗マウスIgG（fc）（Jackson Immuno Research社、ウ
ェストグローブ、ペンシルバニア州）50μｌを添加し
た。プレートを上記した通りインキュベートし、PBSTで
４回洗浄し、そして、1mg/mlのｏ−フェニレンジアミン
（Sigma社）および100Mmクエン酸塩（pH4.5）中の0.1μ
l/mlの30％過酸化水素からなる基質100μｌを添加し
た。15％硫酸50μｌを添加することにより、５分以内に
呈色反応を停止した。490nmにおける吸光度を、プレー
トリーダー（Dynatech社）で読み取った。
各融合体から３ウェル（75D3G、75C10H、75C2G、80G1
0H、80H4Fおよび80J9Eと命名）をRPMI、15％FBS、100μ
Ｍナトリウムヒポキサンチン、16μＭチミジンおよび10
単位/mlIL−６中での２倍希釈により、順次２〜３回ク
ローニングした。クローンプレートのウェルを４日後、
目視により評価し、最も密度の低いウェル中のコロニー
の数を記録した。各クローニングの選択されたウェルを
上記した通りELISAで試験した。最終クローニングにお
いて、単一のコロニーを含む陽性ウェルを、11％FBSを
含むRPMI中で増殖させた。
３種類の抗体は、CK I αHuのアミノ末端に対して作
成したペプチド（80G101H11D、80H12F12Bおよび80J9E10
C）に対して反応性を有することが判明し、これらの抗
体は、CK I α3Huの内部断片に対して作成したペプチド
（75D3G10A、75C10H1Dおよび75C2G11F）と反応性を有し
ていた。クローン75D3G、75C10H、75C2Gおよび80G10H
は、IgG1、クローン80H4F IgG3および80J9E IgG2aのイ
ソタイプに分類された。ハイブリドーマ75C10Hと80J9E
をAmerican Type Culture collection（ATCC）に寄託さ
れ、受託Nos.BH 11800ならびに11802が付与された。
B.CK I Hu/チオレドキシン融合タンパク質 チオレドキシンとの融合タンパク質としてCK I Huイ
ソ体を発現するために、発現プラスミドを構築した。特
に、各イソ体のコード配列を、５′Xba I制限酵素切断
部位および３′BamH I部位をもたらすようなプライマー
を用いてPCRにより増幅した。CK I αHuイソ体のための
Xba I部位をもたらすために使用したプライマーを、配
列番号:43に示し、Xba I部位は下線で示した。
CK I α1Huコード配列中の３′BamH I部位を作成する
ために使用したプライマーを、配列番号:44に示し、Bam
H I部位は下線で示した。
CK I α2HuおよびCK I α3Huのコード配列中のBamH I
部位を作成するために使用したプライマーを、配列番
号:45に示し、BamH I部位は下線で示した。
Xba IおよびBamH I部位は、CK I δ1Huコード配列中
にて、それぞれ配列番号:46および47に示すプライマー
を用いて作成された。
CK I γHuイソ体のコード領域中にて、Xba IおよびBa
mH I部位を作成するために用いたプライマーを配列番
号:48および49に示す。
得られたPCR生成物を、Xba IおよびBamH Iで消化する
ことにより、プラスミドpTRXFUS中のチオレドキシンを
コードする配列のカルボキシ末端で、枠内に断片を方向
を定めてクローニングすることができたCLeVallie et a
l.,Nature/Biotechnology11:187−193（1993）］。得ら
れた発現構築物は、laqIq遺伝子を、その後にtac IIプ
ロモーター（プラスミドpMal−c2由来、New England Bi
olabs社、ビバリー、マサチューセッツ州）を有してお
り、これは、CK I 触媒領域のアミノ末端で融合した大
腸菌チオレドキシン遺伝子の発現を誘発する。
大腸菌XL−１ブルー細胞（Stratagene社）を標準的な
方法により個々の発現プラスミドを用いて形質転換し、
37℃で、中間対数期まで生育させた。試料を採取して未
誘発の細胞のための対照群とし、残りの細胞は、37℃
で、1mM IPTGで16時間誘発した。形質転換体は、OD600
が1.0になるまでLB培地にて生育させた。次に、20MmTri
s−HCl、pH7.0、1mM EDTA、100mM塩化ナトリウムを含む
溶解緩衝液に細胞を再懸濁し、そして、Frenchプレス器
（SLM Instruments社、ウルバナ、イリノイ州）を用い
て溶解した。不溶性抽出物中の細胞封入体を、20,000×
ｇで、30分間遠心分離してペレットととし、溶解緩衝液
で４回洗浄し、そして、10％グリセロールを含む溶液緩
衝液中で、−80℃で保存した。
組換えヒトCK I αHuおよびCK I δHuに対するモノク
ローナル抗体を先に記述したようにして作成した〔Anti
bodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lance,eds.,p
p.148−174,（1988）〕、二ヵ月の期間にわたって、50
μｇの組換えタンパク質を６度注射することで、マウス
を免疫処置した、脾臓をを取り出し、細胞をNS−１骨髄
腫細胞と融合した。融合体を、組換えCK Iイソ体に対す
る反応性に関してELISAでスクリーニングし、陽性ウェ
ルの細胞を限定希釈によってさらにクローニングした。
所望のモノクローナル抗体を含んだ細胞培養上清を調製
するために増量したクローンを用い、そして、プロテイ
ンＡセファロースクロマトグラフィーを用いてモノクロ
ーナル抗体を精製した。Isostrip（Boehringer Mannhei
m社）を用いて、抗体のイソ型を分類した。
クローン94A1D、94F4Aおよび94J11Cは、CK I α1Hu、
CK I α2HuおよびCK I α3Huイソ体の各々に特異的な免
疫反応性を示すモノクローナル抗体（イソタイプIgG1、
IgG1およびIgG2bそれぞれ）を産生した。クローン128A
は、CK I δに特異的な免疫反応性を示すモノクローナ
ル抗体（イソタイプIgG1）を産生した。ハイブリドーマ
94A1D、94F4A、94J11Cおよび128Aは、American Type Cu
lture Collectionに寄託され、受託Nos.HB 11804、HB 1
1803、HB 11805ならびに11801のそれぞれが付与され
た。
C.その他のCK Iペプチド 本実施例のセクションＡに記載のウシガンマグロブリ
ンに結合したその他のCK Iペプチドに対しても、モノク
ローナル抗体を作成した。CK I γHuイソ体のアミノ末
端から誘導したペプチドを、配列番号:50および51に示
す。ウシCK I β［前出のRowles et al］のアミノ末端
から誘導したペプチドを、配列番号:52および53に示
す。CK I δHuのアミノ末端およびカルボキシ末端から
誘導したペプチドを、それぞれ配列番号:54および55に
示す。CK I α2HuおよびCK I α3Huのカルボキシ末端か
ら誘導したペプチドを、配列番号:56に示す。全てのCK
I Huイソ体に共通するペプチドを、配列番号:57に示
す。配列番号:57に示した共通のCK I配列もウサギに注
射して、ポリクローナル抗血清を作成した。
８か月の期間に渡り、様々な予定を組んで、ペプチド
／ガンマグロブリン複合体50μｇをマウスに注射した。
実施例16 CK I δHuによるcisおよびtransチロシン燐酸化 少なくとも一つのヒトCK Iイソ体が、チロシン残基に
関して自己燐酸化される可能性を評価するために、燐酸
チロシン残基に特異的に免疫反応するモノクローナル抗
体を、固定化した組換えCK I δHuを用いたウェスター
ンブロットに適用した。
CK I δHuは、プラスミドpET−15b（Novagen社、マジ
ソン、ウィスコンシン州）を用いて、大腸菌にて、組換
えタンパク質として発現させた。pET−15bで発現したタ
ンパク質は、ベクターによってコードされた組換えタン
パク質の精製を促進するアミノ末端残基の六つの外因性
ヒスチジン残基を含んでいる。2mM IPTGを培地に添加す
ることで、CK I δHuの発現を誘発した。細胞を溶解
し、そして、ニッケル親和性クロマトグラフィー樹脂
（Novagen社）を用いて、製造業者の取扱い説明書に従
ってCK I δHuを精製した。組換えCK I δHuを、文献の
記載〔Harlow and Lane,（1988）、上掲〕にあるよう
に、SDS−PAGEおよびウェスターンブロッティングによ
って分析した。抗燐酸チロシン残基を、製造業者の取扱
い説明書に従って、抗燐酸化チロシンモノクローナル抗
体4G10（UBI、ロックビル、メリーランド州）を用いて
検出した。
オートラジオグラフィーによると、CK I δHuのcis体
が、燐酸化チロシン残基であることを示した。自己燐酸
化の化学量論が決定できなかったとしても、オートラジ
オグラフィー後のバンド強度は、自己燐酸化のレベルが
重要であることを示した。
少なくとも一つのヒトCK Iイソ体が、trans体にてチ
ロシン残基を燐酸化する能力も、CK I δHuを用いて決
定した。
CK I δHuは、プラスミドpET−15b（Novagen社、マジ
ソン、ウィスコンシン州）を用いて、大腸菌にて、組換
えタンパク質として発現させた。2mM IPTGを培地に添加
することで、CK I δHuの発現を誘発した。細胞を溶解
し、そして、細菌性タンパク質をSDS−PAGEで分離し
た。形質転換した大腸菌ならびに形質転換していない大
腸菌の双方から単離したタンパク質を用いて、文献の記
載〔Harlow and Lane,（1988）、上掲〕にあるようにし
て、ウェスターンブロッティングを行った。形質転換し
た細菌性タンパク質ならびに対照タンパク質でのチロシ
ン燐酸化パターンを、製造業者の取扱い説明書に従って
比較するために、抗燐酸化チロシンモノクローナル抗体
4G10（UBI、ロックビル、メリーランド州）を用いた。
CK I δHuで形質転換した細菌からのタンパク質にお
けるチロシン燐酸化は、対照細胞にて観察されたパター
ンとは明らかに別異のものであり、CK I δHuがtrans体
でのチロシン燐酸化を行うことが認められた。
実施例17 TNFαによるCK I δ活性の刺激 サイトカインによるCK Iイソ体の調節能力を評価する
ために、TNFαの有無によって、CK I δHuの活性を決定
した。この分析のために、実施例８にて実証したCK Iイ
ソ体の発現能力に鑑みてHeLa細胞を採用した。
10％ウシ胎児血清、100単位/mlのペニシリン、および
100μgs/mlのストレプトマイシンを補充した修正イーグ
ル培地αにて、HeLa細胞を維持した。培地と補充物をGi
bco社から調達した。細胞を1ng/mlのTNFα（Genzyme
社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）で５分間処理
し、対照用の細胞はTNFαで処理しなかった。細胞を冷
却したPBSで洗浄し、そして、50mM Tris−HCl、pH7.5、
150mM塩化ナトリウム、10mMフッ化ナトリウム、1mM EGT
A、0.2mM NaVO4、1mM PMSF、１％アプロチニン、および
１％NP40を含む１μＭペプスタインＡを含んだIPB中で
再懸濁した。超音波処理して細胞を溶解し、そして、不
溶性物質を遠心分離によって除去した。おおよそ（具体
的な数値）のマイクログラムのモノクローナル抗体128A
を上清に加え、そして、混合物を氷上で90分間保持し
た。プロテインＡセファロース（レプリジェン社、ケン
ブリッジ、マサチューセッツ州）を加え、４℃で、30分
間混合した。免疫沈降物をIPB中にてNP40を用いて三
度、そして、pH7.5の50mM Tris−HCl、150mM塩化ナトリ
ウム、12mM塩化マグネシウム、および0.2mM DTTを含む
キナーゼ緩衝液で一度洗浄した。CK I δHuの活性を測
定するために、24μｌのキナーゼ緩衝液、10μCiの32P
−ATP、30μＭのATPおよび20μｇのカゼインを混合し、
30℃で、10分間インキュベートした。反応を、SDS−PAG
Eならびにオートラジオグラフィーで分析した。
未処置の細胞は低レベルのCK I δHu活性を示した
が、TNFα処置した細胞ではサイトカイン処置して１分
以内に急速にCK I δHu活性が向上した。CK I δHu活性
は、細胞を処置している間にわたって向上し続け、未処
置細胞の約５倍の安定活性レベルにまで達した。約30分
間にわたって、その安定活性レベルは維持された。
1991年７月３日に米国特許出願07/728,783号を出願し
た後に、HRR25様プロテインをコードするDNAの単離に関
し、学術文献において多くの報告がなされている。例え
ば、Rowles et al（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9548−
9592（1991））は、ウシ胸腺カゼインキナーゼＩ（CK
I）酵素の精製を報告している。トリプシン断片の配列
決定により、酵素の一次配列のほぼ25％が判明した。PC
Rクローニングにより、CK I酵素単離物をコードするク
ローン部分、およびCK I δと称される相同性酵素が開
発された。そのクローン部分を用いたウシ脳ライブラリ
のスクリーニングにより、CK I単離物（CK I αと命
名）および２つのその他の相同体（CK I βおよびCK I
γ）に対する全長cDNAが得られた。ウシCK I αに対す
る推定配列は、Rowles et al（前出）によればその触媒
領域は、HRR25に対して60％が相同性であると報告され
ている。前に記載した通り、Rowles et alのウシCK I
α配列を、配列番号:7および８のヒトCK I α１配列と
比較した場合、触媒領域に100％の相同性があることが
うかがえる。
他の例としては、Robinson et al（Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,89:28−32（1992））が、酵母カゼインキナーゼ
Ｉ相同体をコードする２種類のサッカロマイセス・セレ
ビシアエ遺伝子、YCK1およびYCK2の単離について記載し
ており、また、ウサギ網状赤血球分解調製物由来のウサ
ギカゼインキナーゼＩの精製、および部分的配列決定に
ついて記載している。HRR25は、YCK1およびYCK2に対し
て50％の相同性、そしてウサギCK I部分の配列に対して
60％の相同性を有するとされている。さらに、別の例と
しては、Wang et al（Molecular Biology of the Cel
l、3:275−286（1992））は、S.cerevisiaeからの54kDa
のCK Iの単離、および、相同体カゼイインキナーゼＩ蛋
白CK I 1およびCK I 2をコードする２種類の酵母cDNAを
クローニングするために、得られたアミノ酸配列情報の
利用について記載している。CK I 1遺伝子によりコード
されるタンパク質の触媒領域の比較によれば、20〜25％
より大きい相同性を有する遺伝子対応が、ほとんど無い
ことが判明した。最も近似した符合は、HRR25（50〜56
％）との間、およびRowles et alの３種類のウシアイソ
ザイム（51〜56％）との間に認められた。Robinson et
alのYCK1配列は、Wang et alのCK I 2配列に相当し、YC
K2配列は、CK I 1に相当する。Brockman et al（Proc.N
atl.Acad.Sci.,USA,89:9454−9458（1992））は、ヒト
赤血球カゼインキナーゼＩの免疫精製および配列決定を
報告しており、HRR25に対する相同性は62％であると記
載している。最後の例として、Graves et al（J.Biol.C
hem.265:6394−6401（1993））はラット精巣由来カゼイ
ンキナーゼＩのクローニングおよび特徴付けを報告して
いる。このCK IはCK I δと命名されており、ウシ脳か
ら単離されたCK I αとはアミノ酸レベルにおいて、76
％の相同性、HRR25に対しては65％の相同性を有してい
た。
上記した説明のための実施例は、特に、HRR25−様プ
ロテインであるHRR25、Hhp1＋、Hhp2＋、CK I α1Hu、C
K I α2Hu、CK I α3Hu、CK I δHu、CK I γ1Huおよび
CK I γ2Huをコードする「全長」のポリヌクレオチドの
単離に関するものであり、本発明はこれらのポリヌクレ
オチドに限定されないことは容易に理解できる。HRR25
−様プロテインをコードする遺伝子クラス内に含まれ、
プロテインキナーゼ活性により特徴付けされ、そしてプ
ロテインキナーゼ触媒領域を通じてHRR25−プロテイン
との相同性が35％以上であることにより特徴付けられる
全てのポリヌクレオチドを意図するものである。例とし
て、HRR25のDNA配列に関する情報を用いることにより、
実施例７の方法を用いて、Arabidopsis thaliana、Dros
ophila melanogaster、Xenopusu、ニワトリ、マウス、
ラットおよびヒトに由来するcDNAライブラリから推定さ
れる長さのcDNAクローンを単離することが可能である。
これらの部分cDNAは、さらに、実施例６および７の方法
により、これらの種に由来するHRR25−様プロテインを
コードする全長DNAを単離するために使用してよい。こ
れら各々は、組み換え方法により相当するタンパク質の
大規模製造に用いることができ、また、アンチセンスRN
Aのような他の有用なポリヌクレオチドの生成のために
も用いれる。このようなHRR25−様DNAの組換え発現生成
物は、抗体の生成のため、そして、これら酵素のプロテ
インキナーゼおよび／または組換え／修復機能を調節す
る化合物を、スクリーニングする際に用いることができ
る。さらに、Rowles et al、Robinson et al、およびWa
ng et alの文献で示唆されるとおり、複数のHRR25−様
アイソザイムが種々の真核生物中に、膜結合状態および
細胞質タンパク質状態の双方の態様にて存在することが
予測される。多くの遺伝子および遺伝子生成物が、ヒト
に存在すると推定することは合理的であると考えられ、
これらの全てが相互に、そしてHRR25に機能的および構
造的に関連している。
本発明を以上の通り詳説したが、当業者であれば、本
発明の範疇内にて様々な変更と修正を行い得るのは明ら
かである。
配列の概要 配列番号:1は、本願発明の酵母由来プロテインキナー
ゼ、HRR25をコードするゲノミック断片の核酸配列およ
び推定アミノ酸配列である。
配列番号:2は、本願発明の酵母由来プロテインキナーゼ
HRR25の推定アミノ酸配列である。
配列番号:3は、本願発明のHhp1＋をコードするゲノミッ
ク断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号:4は、本願発明のHhp1＋の推定アミノ酸配列で
ある。
配列番号:5は、本願発明のHhp2＋をコードするゲノミッ
ク断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号:6は、本願発明のHhp2＋の推定アミノ酸配列で
ある。
配列番号:7は、本願発明のCK1α1Huをコードするゲノミ
ック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）であ
る。
配列番号:8は、本願発明のCK1α1Huの推定アミノ酸配列
である。
配列番号:9は、本願発明のCK1α2Huをコードするゲノミ
ック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）であ
る。
配列番号:10は、本願発明のCK1α2Huの推定アミノ酸配
列である。
配列番号:11は、本願発明のCK1α3Huをコードするゲノ
ミック断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）であ
る。
配列番号:12は、本願発明のCK1α3Huの推定アミノ酸配
列である。
配列番号:13は、HRR25の16〜23の残基をコードする先端
鎖DNAを表すプライマー4583である。
配列番号:14は、HRR25の126〜133の残基をコードする先
端鎖DNAを表すプライマー4582である。
配列番号:15は、HRR25の126〜133の残基をコードする末
端鎖DNAを表すプライマー4589である。
配列番号:16は、HRR25の194〜199の残基をコードする末
端鎖DNAを表すプライマー4590である。
配列番号:17は、47〜67のウシ先端鎖DNAを表すプライマ
ーJH21である。
配列番号:18は、223〜240のウシ先端鎖DNAを表すプライ
マーJH22である。
配列番号:19は、604〜623のウシ先端鎖DNAを表すプライ
マーJH29である。
配列番号:20は、623〜604のウシ末端鎖DNAを表すプライ
マーJH30である。
配列番号:21は、835〜817のウシ末端鎖DNAを表すプライ
マーJH31である。
配列番号:22は、第33頁の実施例３にて認められた変異
したHRR25キナーゼ領域プライマーである。
配列番号:23は、本願発明のNUF1をコードするゲノミッ
ク断片の核酸配列（および推定アミノ酸配列）である。
配列番号:24は、本願発明のNUF1の推定アミノ酸配列で
ある。
配列番号:25、26および27は、第18頁にて言及した保存
部分である。
配列番号:28および29は、ヒトcDNAライブラリーからプ
ローブを増幅するために用いたHRR25様タンパク質の保
存領域に基づいた重複オリゴヌクレオチドである。
配列番号:30は、CH I γ1Hu遺伝子のヌクレオチド配列
である。
配列番号:31は、CH I γ1Huタンパク質の推定アミノ酸
配列である。
配列番号:32は、CH I γ2Hu遺伝子のヌクレオチド配列
である。
配列番号:33は、CH I γ2Huタンパク質の推定アミノ酸
配列である。
配列番号:34は、CH I δHuの核酸配列である。
配列番号:35は、CH I δHuの推定アミノ酸配列である。
配列番号:36は、発現プラスミドpRS305のNco I制限部位
を作成するために用いた突然変異誘発性オリゴヌクレオ
チドである。
配列番号:37は、CK I γ１のNco I制限部位を作成する
ために用いた突然変異誘発性オリゴヌクレオチドであ
る。
配列番号:38は、ヒトCK I αＡのNco I制限部位を作成
するために用いた突然変異誘発性オリゴヌクレオチドで
ある。
配列番号:39は、ヒトCK I αのBg1 II制限部位を導入す
るために用いた突然変異誘発性オリゴヌクレオチドであ
る。
配列番号:40は、GAL1プロモーターとCK I α発現プラス
ミドの開始メチオニンコドンの間に介在する核酸配列で
ある。
配列番号:41および42は、モノクローナル抗体を作成す
るための、CK I αイソ体のアミノ末端と中間ペプチド
断片である。
配列番号:43は、CK I αHuコード配列にXba I制限部位
を作成するために用いたプライマーである。
配列番号:44は、CK I αHuコード配列にBamH I制限部位
を作成するために用いたプライマーである。
配列番号:45は、CK I α2HuおよびCK I α3Huコード配
列にBamH I制限部位を作成するために用いたプライマー
である。
配列番号:46は、CK I δHuコード配列にXba I制限部位
を作成するために用いたプライマーである。
配列番号:47は、CK I δHuコード配列にBamH I制限部位
を作成するために用いたプライマーである。
配列番号:48は、CK I γ1HuおよびCK I γ2Huコード配
列にXba I制限部位を作成するために用いたプライマー
である。
配列番号:49は、CK I γ1HuおよびCK I γ2Huコード配
列にBamH I制限部位を作成するために用いたプライマー
である。
配列番号:50は、マウスにてモノクローナル抗体を産生
するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCK I
γHuのアミノ末端ペプチド断片である。
配列番号:51は、マウスにてモノクローナル抗体を産生
するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCK I
γHuのアミノ末端ペプチド断片である。
配列番号:52は、マウスにてモノクローナル抗体を産生
するために用いた、ウシγグロブリンに結合したウシCK
I βのアミノ末端ペプチド断片である。
配列番号:53は、マウスにてモノクローナル抗体を産生
するために用いた、ウシγグロブリンに結合したウシCK
I βのアミノ末端ペプチド断片である。
配列番号:54は、マウスにてモノクローナル抗体を産生
するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCK I
δHuのアミノ末端ペプチド断片である。
配列番号:55は、マウスにてモノクローナル抗体を産生
するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCK I
δHuのカルボキシ末端ペプチド断片である。
配列番号:56は、マウスにてモノクローナル抗体を産生
するために用いた、ウシγグロブリンに結合したCK I
δ2HuおよびCK I δ3Huのカルボキシ末端ペプチド断片
である。
配列番号:57は、マウスにてモノクローナル抗体を産生
するために用いた、ウシγグロブリンに結合した、すべ
てのヒトCK Iイソ体に共通する中間ペプチド断片であ
る。
４
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ １１８０４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ １１８０５ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/40 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】CK I α3Huと反応性を有するモノクローナ
    ル抗体を産生する75C10Hと命名されたハイブリドーマ
    （A.T.C.C.受託番号HB11800）。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のハイブリドーマによって
    産生されたモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】CK I αHuと反応性を有するモノクローナ
    ル抗体を産生する80J9Eと命名されたハイブリドーマ
    （A.T.C.C.受託番号HB11802）。
  4. 【請求項４】請求項３に記載のハイブリドーマによって
    産生されたモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】CK I α1Huと反応性を有するモノクローナ
    ル抗体を産生する94A1Dと命名されたハイブリドーマ
    （A.T.C.C.受託番号HB11804）。
  6. 【請求項６】請求項５に記載のハイブリドーマによって
    産生されたモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】CK I α2Huと反応性を有するモノクローナ
    ル抗体を産生する94F4Aと命名されたハイブリドーマ
    （A.T.C.C.受託番号HB11803）。
  8. 【請求項８】請求項７に記載のハイブリドーマによって
    産生されたモノクローナル抗体。
  9. 【請求項９】CK I α3Huと反応性を有するモノクローナ
    ル抗体を産生する94J11Cと命名されたハイブリドーマ
    （A.T.C.C.受託番号HB11805）。
  10. 【請求項１０】請求項９に記載のハイブリドーマによっ
    て産生されたモノクローナル抗体。
  11. 【請求項１１】CK I δと反応性を有するモノクローナ
    ル抗体を産生する128Aと命名されたハイブリドーマ（A.
    T.C.C.受託番号HB11801）。
  12. 【請求項１２】請求項11に記載のハイブリドーマによっ
    て産生されたモノクローナル抗体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10917454B1 (en) 2019-08-01 2021-02-09 Rohde & Schwarz Gmbh & Co. Kg System and method for ATC voice quality assurance

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0963435B1 (en) 1997-01-08 2008-05-28 Invitrogen Corporation Methods for production of proteins
US6512102B1 (en) * 1998-12-31 2003-01-28 Chiron Corporation Compositions and methods of diagnosis and treatment using casein kinase I
US6570003B1 (en) * 2001-01-09 2003-05-27 Lexion Genetics Incorporated Human 7TM proteins and polynucleotides encoding the same
US6864079B2 (en) 2001-04-06 2005-03-08 Lexicon Genetics Incorporated Human kinase and polynucleotides encoding the same
US20080050809A1 (en) * 1999-09-28 2008-02-28 Alejandro Abuin Novel human kinases and polynucleotides encoding the same
US6797510B1 (en) * 2001-05-24 2004-09-28 Lexicon Genetics Incorporated Human kinases and polynucleotides encoding the same
US6841377B1 (en) * 2001-06-13 2005-01-11 Lexicon Genetics Incorporated Human kinase and polynucleotides encoding the same
WO2001029228A1 (fr) * 1999-10-18 2001-04-26 Shanghai Bio Road Gene Development Ltd. Nouveau polypeptide, caseine kinase humaine 48, et polynucleotide codant pour ce polypeptide
JP2004504804A (ja) * 2000-01-18 2004-02-19 レキシコン・ジェネティクス・インコーポレーテッド ヒト新規キナーゼタンパクおよびそれをコードするポリヌクレオチド
WO2001064905A2 (en) * 2000-02-29 2001-09-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 2504, 15977, and 14760, novel protein kinase family members and uses therefor
AU2001241961A1 (en) * 2000-03-06 2001-09-17 Sugen, Inc. Novel human protein kinases and protein kinase-like enzymes
DE10011530A1 (de) * 2000-03-13 2001-09-27 Robert Elez Hochwirksame Antisense-Oligodesoxynucleotide gegen Polio-like Kinasel
JP2004517622A (ja) 2000-12-11 2004-06-17 レキシコン・ジェネティクス・インコーポレーテッド 新規ヒトキナーゼ及び該キナーゼをコードするポリヌクレオチド
US6448057B1 (en) * 2001-03-22 2002-09-10 Applera Corporation Isolated human casein kinase proteins, nucleic acid molecules encoding human casein kinase proteins, and uses thereof
EP1383879A4 (en) * 2001-04-06 2005-05-11 Lexicon Genetics Inc HUMAN KINASES AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME
US6644173B2 (en) * 2001-04-11 2003-11-11 Keuring, Incorporated Beverage filter cartridge holder
CA2446967A1 (en) * 2001-05-09 2002-11-14 Lexicon Genetics Incorporated Novel human kinases and polynucleotides encoding the same
AU2003231244A1 (en) * 2002-05-02 2003-11-17 University Of North Carolina At Chapel Hill In vitro mutagenesis, phenotyping, and gene mapping
AU2003246391A1 (en) * 2002-07-08 2004-01-23 Bayer Healthcare Ag Regulation of human casein kinase i epsilon
JP2009544974A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 鮮明に分解する標識タンパク質分子量標準
ES2425179T3 (es) * 2006-10-25 2013-10-11 The Rockefeller University Métodos para el tratamiento de trastornos relacionados con beta-amiloide y composiciones para los mismos
ES2728932T3 (es) 2014-01-09 2019-10-29 Intra Cellular Therapies Inc Compuestos orgánicos
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11293029B2 (en) 2015-12-07 2022-04-05 Zymergen Inc. Promoters from Corynebacterium glutamicum
WO2017100377A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen, Inc. Microbial strain improvement by a htp genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US10544411B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
JP2019519242A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド 細菌ヘモグロビンライブラリーを生成するための方法およびその使用
CN110741091A (zh) 2017-05-19 2020-01-31 齐默尔根公司 增加nadph的生物合成途径的基因组工程化
KR20200014836A (ko) 2017-06-06 2020-02-11 지머젠 인코포레이티드 고 처리량 트랜스포존 돌연변이유발
WO2018226880A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving escherichia coli
KR20200026878A (ko) 2017-06-06 2020-03-11 지머젠 인코포레이티드 균류 균주를 개량하기 위한 htp 게놈 공학 플랫폼
US20200115705A1 (en) 2017-06-06 2020-04-16 Zymergen Inc. A high-throughput (htp) genomic engineering platform for improving saccharopolyspora spinosa
CN113017648B (zh) * 2021-03-18 2023-03-24 内蒙古工业大学 一种脑电信号识别方法和系统

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2572092A1 (fr) * 1984-10-19 1986-04-25 Pasteur Institut Anticorps monoclonaux specifiques de la proteine kinase humaine, p 72 k, associee a l'action de l'interferon, leur obtention, leur application a la determination de la p 72 k de l'interferon
IL79255A0 (en) * 1986-06-26 1986-09-30 Hadassah Med Org Composition for metastasis prevention
AU1992392A (en) * 1991-04-30 1992-12-21 Children's Hospital Of Los Angeles Monospecific antibodies and antisera to the regulatory subunit of proline-directed protein kinase
DE69231710T2 (de) * 1991-07-03 2001-09-20 The Salk Institute For Biological Studies, La Jolla Tyrosinkinase
EP0632832A1 (en) * 1993-01-21 1995-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Protein kinases

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10917454B1 (en) 2019-08-01 2021-02-09 Rohde & Schwarz Gmbh & Co. Kg System and method for ATC voice quality assurance

Also Published As

Publication number Publication date
ATE181559T1 (de) 1999-07-15
DE69510410T2 (de) 2000-01-20
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WO1995019993A1 (en) 1995-07-27
US5686412A (en) 1997-11-11
CA2158750A1 (en) 1995-07-27
JPH08509504A (ja) 1996-10-08
CA2158750C (en) 1999-04-13
EP0690876A1 (en) 1996-01-10
US6060296A (en) 2000-05-09
EP0690876B1 (en) 1999-06-23
DE69510410D1 (de) 1999-07-29

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