CN114106095A - 基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子探针领域，具体为基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针，所述探针的结构依次包括可靶向LC3分子的LC3蛋白靶向肽、能增加整体探针的水溶性及促进探针进入细胞的细胞穿透肽和可在与LC3结合运动受限时发出荧光的聚集诱导发光的四苯乙烯。本发明的分子探针具有细胞内化、与LC3的特异性相互作用、聚集诱导发光、无细胞毒性且自身不引起细胞自噬效应等特性，可在光学显微镜下直观地观察细胞自噬强弱的差异性；可借助流式细胞分析监测细胞自噬强弱差异；可从正常培养的细胞或原代细胞群体中分离获得自噬水平差异性的细胞亚群，揭示了在多种细胞类型中，基础自噬水平的普遍异质性。本发明还提供了所述分子探针的制备方法和应用。

Description

基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于分子探针技术领域，具体涉及一种基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
自噬是一种动态且保守的降解途径，其特征是一系列步骤，包括杯状吞噬体的出现、货物隔离、双膜自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬体以及货物降解。自噬的一个重要而复杂的作用已经在许多人类疾病的发展和治疗中得到充分证明，如癌症、神经退行性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和心血管疾病。人们普遍认为，基本上每一个哺乳动物细胞中都存在着低水平的自噬，以维持细胞的稳态和生存，并在许多生理过程中发挥着至关重要的作用。然而，间接证据表明，对于一种特定的细胞类型，不同细胞的基础自噬水平差异很大。文献显示，大约三分之一的老化造血干细胞表现出较高的自噬水平，以维持低代谢状态，并具有强大的长期再生潜力。细胞群体内的自噬变异通过选择性降解Fap-1决定细胞的命运。另一方面，细胞自噬在物理、化学或生物应激下经常被提升到高水平，这种增强的自噬与许多生理异常和病理条件密切相关。分离自噬水平不同的细胞亚群将大大有助于研究基础自噬或诱导自噬。然而，由于缺乏方便可靠的方法，这项工作受到阻碍。各种嗜酸染料，如吖啶橙、单丹酰尸体碱(MDC)和Cyto-ID，已显示出一定的监测自噬的能力。尤其是Cyto-ID已经被用于基于自噬的细胞分类,但这些探针的特异性值得怀疑，因为它们如何与自噬机制相互作用在很大程度上尚不清楚。更好的方法是利用一种自噬相关(Atg)蛋白，其中Atg8/LC3/GABARAP蛋白家族(统称为LC3，微管相关蛋白1轻链3的缩写)是最广泛使用的，因为脂化LC3(LC3-II)是唯一与完整自噬体可靠相关的蛋白质标记。由于LC3缺乏固有荧光且不易追踪，因此通常部署LC3与荧光蛋白(通常为GFP)融合的外源性表达。GFP-LC3的荧光在自噬体的酸性环境中被猝灭，因此具有高自噬通量的细胞将表现出减少的GFP荧光，并通过FACS分选从自噬低细胞亚群中分离出来。基于这一原则的方法已成功应用于上述示例性研究。除LC3外，自噬过程中特异性降解的蛋白分子，如p62和NBR1，也可用于融合GFP或HaloTag作为报告物后自噬的流式细胞术分析。然而，在上述所有情况下，对外来报告者的要求严重限制了其对难以转染的细胞系或原代细胞的适用性。此外，由于外来报告者的基因在不同的细胞个体的差异性表达也会影响自噬检测效果，如过度表达而产生的不良并发症。基于自噬特异性标记物，在不需要外源报告基因表达的情况下，分离出自噬水平不同的完全存活和功能活性细胞亚群是非常理想的，但目前还无法实现。
荧光材料中一项强有力的新兴技术是聚集诱导发光(aggregation-inducedemission,AIE)，它指的是一种独特的现象，即当分子溶解在溶液中时，一些具有扭曲构象和分子旋转子(或振动器)的氟化物具有弱发射性，但作为聚集体具有高荧光性。分子内运动受限(restriction of intramolecular motions,RIM)，包括分子内旋转的限制(Restriction of intramolecular rotation，RIR)和分子内振动的限制(Restriction ofintramolecules vibration,RIV)，被认为是聚集态AIE发光体(AIEgens)荧光增强的主要机制。近年来AIE研究的迅速发展极大地促进了AIEgens在生物医学领域的应用，尤其是在传感和成像方面。值得注意的是，具有溶酶体靶向和线粒体靶向AIE探针已分别用于可视化监测自噬和线粒体自噬，但这些探针主要靶向特定的细胞器，对自噬过程没有特异性，也没有用于基于自噬强弱的细胞分选。
发明内容
鉴于此，本发明针对上述问题提供一种基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针(LKT)，其结构依次包括LC3蛋白靶向肽、细胞穿透肽和具有聚集诱导发光(AIE)特性的四苯乙烯(TPE)。
进一步的，所述LC3蛋白靶向肽源自于p62/SQSTM1蛋白(p62)的LC3相互作用区(LIR)；所述的LC3包括LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP(GABA A型受体相关蛋白)和GABARAP L1/2。
进一步的，所述LC3蛋白靶向肽的序列为DDDWTHL(简写为L，SEQ ID NO.1)；所述细胞穿透肽的基序为KKKKKKKKK(简写为K，SEQ ID NO.2)；所述四苯乙烯为螺旋桨状四苯乙烯分子(1,1,2,2-Tetraphenylethylene，TPE)。
本发明的LKT分子结构(LKT分子模式见附图1)为一端是LC3靶向肽L，可以靶向LC3家族分子；另一端是聚集诱导发光分子TPE，可以在与LC3结合运动受限的情况下发出荧光；中间一段为K序列，能够增加整体探针的水溶性以及促进探针进入细胞。本发明的用于细胞自噬检测分子探针LKT将包含细胞内化、与LC3的特异性相互作用、聚集诱导发光、无细胞毒性且自身不引起细胞自噬效应等特性。与细胞共同孵育时，LKT分子能够在K的协助下穿过细胞膜，进入细胞，与游离的LC3结合，此时由于是单分子结合的状态，TPE分子发出较低荧光。当细胞诱导自噬后，LC3分子大量的聚集到自噬体膜上，形成聚集体，此时大量的TPE分子聚集到一起，发出强烈荧光。因此，LKT探针可用于细胞自噬的检测。
本发明的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的制备方法，包括：
分别称取包含了LC3蛋白靶向肽和细胞穿透肽序列的多肽粉末(叠氮修饰肽LK)以及带有单个炔基的四苯乙烯分子，将二者溶解于DMSO和水的混合溶液，混合均匀；
加入含有CuSO4和抗坏血酸钠的混合液，将所得反应溶液置于室温600rpm搅拌24小时，避光；
24小时后将反应完毕的溶液进行过滤，获得澄清液体；对得到的澄清液体进行分离操作，得到含有产物的液体；
去除所述的含有产物的液体中的有机相，将得到的溶液冻干处理，获得白色粉末，即为产物LKT。
进一步的，所述细胞穿透肽和LC3蛋白靶向肽的最佳摩尔比为1:1。
进一步的，所述DMSO和水的混合溶液中DMSO和水的体积比v/v＝8:2。
进一步的，在所述混合液中，所述抗坏血酸钠的终浓度为所述CuSO4的终浓度的2倍。
本发明的细胞自噬检测分子探针在细胞自噬的检测、不同自噬水平分选等领域的应用。
进一步的，本发明的细胞自噬检测分子探针LKT的应用浓度为5-10μM，最佳为5μM。
进一步的，本发明的细胞自噬检测分子探针LKT的应用处理时间为0-48小时，优选3-24小时。
本发明有益效果：
本发明鉴于细胞质LC3蛋白与自噬体膜的共价结合是自噬的特征性标志，验证并利用了具有特异性与LC3相互作用能力的AIE探针在结合到膜结合的LC3和游离LC3时，会显示足够的荧光强度差异这一原理，从而实现了促进不同自噬水平的细胞亚群的分类。
本发明的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针(LKT)，是一种工程分子探针。本发明的LKT分子结构为一端是LC3靶向肽L，可以靶向LC3分子，另一端是聚集诱导发光分子TPE，可以在与LC3结合运动受限的情况下发出荧光，中间一段为细胞穿透肽K序列，能够增加整体探针的水溶性以及促进探针进入细胞。可在光学显微镜下直观地观察细胞自噬强弱的差异性；可借助于流式细胞分析，监测细胞自噬强弱的差异；可从正常培养的细胞或原代细胞群体中分离获得自噬水平差异性的细胞亚群，揭示了在多种细胞类型中，基础自噬水平的普遍异质性。本发明的用于细胞自噬检测分子探针LKT具有细胞内化、与LC3的特异性相互作用、聚集诱导发光、无细胞毒性且自身不引起细胞自噬效应等特性。
具体的，本发明的LKT响应细胞自噬水平的差异，表现出“不发光/弱发光—增强发光”的特性。与细胞共同孵育时，LKT分子能够在K的协助下穿过细胞膜，进入细胞，与游离的LC3结合，此时由于是单分子结合的状态，TPE分子发出较低荧光。当细胞诱导自噬后，LC3分子大量的聚集到自噬体膜上，形成聚集体，此时大量的TPE分子聚集到一起，发出强烈荧光，实现细胞自噬的检测，更具有特异性。
细胞内化的LKT在诱导或阻断自噬时，特异性与LC3蛋白相互作用，形成荧光点，与GFP-LC3点共定位，其毒性小，本身无自噬调节活性。重要的是，LKT与膜偶联的LC3结合后荧光增强，但与游离的LC3结合并不会出现荧光明显增强。LKT可以实现通过靶向自噬特异性分子，不需要外源报告基因表达，只需要与细胞简单的孵育，分离自噬水平不同的活细胞和功能完善的细胞亚群。
附图说明
图1为本发明的细胞自噬检测分子探针LKT的结构示意图。
图2为本发明的细胞自噬检测分子探针LKT合成的反应原理示意图。
图3为LKT在280nm和350nm两个不同的吸收波长下的液相色谱行为；其中图3A波长为280nm，图3B波长为350nm。
图4LKT的质谱鉴定图谱。
图5为LKT的动态光散射分析结果图。
图6为紫外-可见光谱分析验证LKT结果图。
图7为紫外-可见光谱分析验证LKT在水中和薄膜上干态情况下的荧光情况对比结果图。
图8为紫外-可见光谱分析验证LKT和聚集的TPE的荧光对比结果图。
图9为表面等离子共振技术验证LKT与LC3蛋白的结合的结果图。
图10为LKT的光稳定分析结果图。
图11为LKT与LC3蛋白结合的荧光图像。
图12为LKT于细胞自噬中的光学成像。
图13为LKT结合流式细胞术用于细胞自噬的检测
图14中，图A和图B为在指定处理24小时后对MEF(图A)和THP-1(图B)细胞进行流式细胞术分析结果图(剂量：LKT：5μM；3-MA：2.5mM；海藻糖：0.1M；平均值±s.e.m.n＝3；**p<0.01，***p<0.001)。
图C和图D为在指定处理24小时后，MEF(图C)或THP-1(图D)细胞中LC3的蛋白质印迹结果图(剂量：LKT：5μM；3-MA：2.5mM；海藻糖：0.1M)。
图E为用PBS、雷帕霉素(Rap，1μM)或氯喹(CQ，10μM)处理的HeLa细胞中LC3的蛋白质印迹图。
图15为用PBS或LKT(5μM)处理24小时的Hela的细胞中LC3的蛋白质印迹图；以及细胞的活力结果，NS：不显著。
图16中，图A和图B为用PBS或LKT(5μM)处理24小时的MEF(图A)和THP-1(图B)细胞的活力结果，NS：不显著。
图C和图D为用PBS或LKT(5μM)处理24小时的MEF(图C)和THP-1(图D)细胞中LC3的蛋白质印迹图。
图17为LKT探针染色结合流式细胞分选技术从LC3-II表达差异的细胞群体中有效分离自噬不同水平的细胞的实验结果图。
图18为LKT探针染色结合流式细胞分选技术从正常贴壁培养的细胞群体中有效分离自噬水平不同的细胞的实验结果图。
图19为LKT探针染色结合流式细胞分选技术，将不同类型的细胞分为自噬水平不同的细胞亚群实验中的荧光细胞分布图。
图20为图19中F-high和F-low细胞的LC3蛋白质免疫印迹图。
图21为PMA分化的THP-1细胞经LKT结合流式细胞分选实验结果图。
图22为经处理的THP-1细胞的NLRP3蛋白印迹图。
图23中，图23A为经处理的THP-1细胞的IL-1β分泌统计图；图23B为经处理的THP-1细胞的LDH释放统计图。
图24为LKT孵育分选DCs细胞实验结果图。
图25为经处理的DCs细胞的细胞迁移实验结果图。
图26为经处理的DCs细胞的IL-12P70统计结果图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
实施例一 本发明的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针及其制备方法。
1.1LKT探针的分子模式。
用于自噬细胞分类的分子探针LKT具有细胞内化、与LC3的特异性相互作用、聚集诱导发光、无细胞毒性且自身不引起细胞自噬效应等特性。LKT包含细胞穿透基序K(序列为SEQ ID NO.2所示：KKKKKKKKK)、p62/SQSTM1蛋白(p62)的LC3相互作用区(LIR，简写为L，序列为SEQ ID NO.1所示：DDDWTHL)和螺旋桨状四苯乙烯分子(1,1,2,2-Tetraphenylethylene，TPE)。除了促进细胞摄取外，K基序还可增加LKT在水溶液中的溶解度。LKT分子模式见图1。
1.2.LKT的合成：
分别称取包含了LC3蛋白靶向肽和细胞穿透肽序列的融合肽LK(10mg,4.2μmol)的多肽粉末以及带有单个炔基的四苯乙烯分子(4.49mg,12.6μmoL)，将二者溶解于0.8mLDMSO和水的混合溶液(v/v＝8:2)，混合均匀后，加入0.2mL含有CuSO4(0.42mg,2.1μmol)和sodium ascorbate(0.83mg,4.2μmol)混合液。将该反应溶液置于室温600rpm搅拌24小时，避光。次日将反应完毕的溶液进行过滤，获得澄清液体，随后通过高效液相色谱进行分离操作。分离使用的是Agilent 1260Infinity LC系统(California,USA)，使用0.1％TFA/acetonitrile和0.1％TFA/H2O两种溶剂作为流动相，使用的层析柱型号为ZORBAX SB-C18,5mm(Agilent)，制备条件为：flow rate＝2mL min-1,0min:5％ACN,8min:50％ACN,15min:50％ACN,20min:95％ACN,25min:100％ACN。制备完毕后，得到含有产物的液体，将该液体置于旋蒸仪进行旋蒸去除有机相，剩余部分为水。将该溶液进行冷冻，后进行冻干，可获得白色粉末，即为产物LKT。称重后得到产物6.9mg，通过计算产率为55％。LKT的合成示意图见图2。
1.2.LKT的表征。
LKT高效液相色谱法分析：
配制l mg/mL的LKT水溶液，进行高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography，HPLC)分析，使用的机器为LC3000二元高压液相色谱仪(TongHeng,China)，设置280nm和350nm两个不同的吸收波长进行检测，得到的结果分别如图3(图3A波长为280nm，图3B波长为350nm)，可以得知制备的LKT产物在两个波长处都有明显的吸收，且无杂峰，显示产物纯度高。
LKT的质谱分析：
为检测我们获得的产物是否为LKT纯品，通过MS进行检测，使用的仪器为沃特斯ZQ2000质谱仪(Waters,USA)。配制1mg/mL的产物于50％的乙腈溶液中进行检测，获得的结果如图4所示。结果显示在913.19处有明显的出峰，离子流相对强度达到100％。通过计算，理论的[M+H]3+为913.09，MS结果为913.19，符合预期值。
LKT的动态光散射分析：
使用粒度分析仪(Litesizer 500，奥地利)进行动态光散射分析。二甲基亚砜/水(1:199V/v)混合溶液中TPE-yne、LKT和LK的动态光散射分析。结果如图5显示，LKT在水中未形成任何大小的颗粒，表明其为单分子存在状态，而TPE的聚集尺寸接近1000nm.显示LKT具有较好的水溶性。
LKT的光谱分析：
通过紫外-可见光谱分析验证LKT的特性(图6)，与预期的AIE特性一致，LKT在水中发出低荧光，但在薄膜上沉积时变得高荧光(如图7所示)，而聚集的TPE在水中已经具有高荧光(图8)。
表面等离子共振技术验证LKT与LC3蛋白的结合特异性：
GE BIAcore 8K仪器在25℃恒温下运行，本研究使用CM5传感器芯片(GEHealthcare)。每个CM5传感器芯片由8个相同的实验通道组成，每个通道分为两个流动单元。在我们的实验装置中，流动池1(Fc1)始终保持空白作为参考，而流动池2(Fc2)使用LC3功能化，用于与LKT的相互作用研究。具体而言，首先使用PBS-T缓冲液(20mM磷酸钠、150mM氯化钠和0.05％吐温20，pH 7.4)对系统进行平衡。用EDC(0.2M)和NHS(0.05M)的混合物激活传感器芯片6分钟。在Fc2中，随后在10mM醋酸盐缓冲液(pH 5.5)中注射40μM LC3 7分钟，同时在Fc1中注射PBS-T缓冲液。最后，将1M乙醇胺HCl溶液注射到Fc1和Fc2上以阻断残留的NHS酯基。在线监测传感器图，以确保LC3在Fc2上成功固定。正如预期的那样(图9)，LKT与纯化的LC3蛋白相互作用，Kd约为0.312±0.051μM，由表面等离子体共振测定。这种相互作用依赖于LIR基序，因为KT(含有K，TPE)探针，没有LIR，失去了与LC3结合的能力。
LKT的光稳定分析：
在细胞与LKT(5μM)孵育6h后，在405nm激发下，用5％激光功率对HeLa/GFP-LC3细胞中LKT的光稳定性进行50个周期的测量。如图10所示，结果显示LKT在内化到细胞内后也表现出良好的光稳定性，在反复激发后显示出最小程度的荧光减弱。
LKT与LC3蛋白的微孔板结合：
将纯化的LC3蛋白添加到PBS中的96孔板中，并在4℃下放置过夜。去除蛋白质溶液后，用牛血清白蛋白(BSA，0.05％w/v)清洗每个孔5次。将LKT(10μM)或KT(10μM)加入到37℃培养1h的LC3蛋白包被孔中。荧光图像(图11)由Nikon Ti-E显微镜使用DAPI通道进行观察和捕获。预包被LC3(而非BSA)能够“拉下”溶液中的LKT(而非KT)分子，表现出聚集诱导发光。这些结果证实LKT是一种AIE探针，与LC3具有相对较高的亲和力。
实施例二 本发明基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的应用
2.1LKT用于细胞自噬的光学观察和成像：
诱导和阻断自噬都会导致自噬体积累增加，从而增加LC3与自噬体膜的结合。事实上，自噬诱导剂雷帕霉素、海藻糖和阻断剂氯喹(CQ)，而不是抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)，在稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞HeLa/GFP-LC3中导致显著的绿色斑点形成(图12A)。这些细胞与LKT共同处理也产生蓝色点状点(图12A)，其与GFP-LC3点状点显著共定位，如雷帕霉素、海藻糖和CQ处理的Pearson相关系数(PCC)值分别为0.47、0.66和0.69所示(图12A)。此外，LKT点状结构形成的时间过程与CQ处理后GFP-LC3点状结构形成的时间过程吻合良好(图12B)。这些结果表明，LKT有可能取代GFP-LC3，成为监测自噬发生的更方便的报告者。应该指出的是，LKT的LIR基序来源于p62蛋白，除了GFP-LC3中LC3的形式LC3B外，还可以与LC3家族的不同成员相互作用，包括LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP(GABA A型受体相关蛋白)和GABARAP L1/2。因此，在理论上，LKT可以提供比GFP-LC3更广泛的自噬体可视化覆盖范围。
2.2LKT结合流式细胞术用于细胞自噬的检测：
与脂质体结合的LC3结合后发出增强荧光的能力表明，LKT在含有更多脂化LC3的细胞中显示出更高的荧光，无论是在自噬诱导还是阻断下都是如此。事实上，用海藻糖(自噬体形成的诱导剂)处理的HeLa细胞，如预期的那样增加了LC3转化(图13A)，并且在流式细胞仪分析下也显示出更高的LKT荧光(图13B)。相反，自噬体形成抑制剂3-MA显著降低了由海藻糖引起的LC3转化和LKT荧光增强(图13A和13B)。在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和非粘附性未分化THP-1细胞(分别图14A和14B)中观察到海藻糖对LKT荧光的类似增强和3-MA对LKT荧光的减弱作用，LC3 Western印迹证实了海藻糖和3-MA的自噬诱导和自噬抑制作用，分别见图14C和图14D。与HeLa细胞中的结果类似(见图15)，LKT在MEF和THP-1细胞中表现出最小的毒性和无自噬调节活性(图16，A至D)。值得注意的是，海藻糖处理后，在HeLa/GFP-LC3细胞中观察到LKT荧光增强，而非AIE探针LKR荧光增强(图13C)，这表明AIE特性对于LKT对自噬诱导的反应能力至关重要。与报告结果(Shvets,E.,Fass,E.&Elazar,Z.Utilizingflow cytometry to monitor autophagy in living mammalian cells.Autophagy 4,621-628,doi:10.4161/auto.5939(2008))基本一致，在海藻糖诱导的自噬中，GFP-LC3显示荧光减弱，尽管在我们的病例中仅观察到一个小的变化(图13C)，可能是因为实验室维持的HeLa/GFP-LC3细胞GFP-LC3表达水平的异质性。用CQ和雷帕霉素处理HeLa细胞后，也观察到显著的LKT荧光增加，CQ比雷帕霉素引起更深刻的增强(图13D和图14E)。为了排除LKT荧光增强是由于自噬调节剂诱导的LKT细胞内化增加的可能性，我们在去除培养基中的LKT后向LKT预处理的HeLa细胞添加CQ。在添加CQ后6小时，观察到LKT荧光增加，类似于LKT和CQ共处理下观察到的情况(图13E)，强烈认为增强的LKT荧光反映了LC3转化增加，但不是LKT细胞摄取。总之，这些结果表明，LKT由于其AIE特性，在细胞中表现出增强的荧光，同时由于自噬诱导或阻断，LC3脂质化增加。
2.3LKT探针染色结合流式细胞分选，可获得自噬水平差异的活细胞亚群。
将等量单独LKT处理24h的HeLa细胞和LKT+CQ处理24h的HeLa细胞混合后进行流式分选，如图17所示，F-high和F-low分别代表LKT荧光最高和最低的25％细胞，其中LKT浓度为5μM，CQ为10μM，右图为F-high和F-low细胞的LC3蛋白质免疫印迹。F-high细胞的LC3-Ⅱ含量明显高于F-low细胞，表明LKT能从LC3-II表达差异的细胞群体中有效分离自噬不同水平的细胞。
将等量单独LKT处理24h的HeLa细胞进行流式分选，如图18所示，F-high和F-low分别代表LKT荧光最高和最低的25％细胞，其中LKT浓度为5μM，右图为F-high和F-low细胞的LC3蛋白质免疫印迹。F-high细胞的LC3-Ⅱ含量明显高于F-low细胞，表明LKT从正常贴壁培养的细胞群体中有效分离自噬水平不同的细胞。
将LKT(5μM)孵育6小时后的MEF、THP-1(未分化)、MCF-7、BMDM细胞进行流式分选。如图19所示，F-high和F-low分别代表LKT荧光最强和最弱的25％的细胞片段。如图20为F-high和F-low细胞的LC3蛋白质免疫印迹。说明在培养的细胞中普遍存在基础自噬水平上的异质性，包括贴壁培养细胞，悬浮培养的细胞和原代细胞，并且LKT可靠地将不同类型的细胞分为自噬水平不同的细胞亚群。
2.4LKT探针孵育结合流式细胞分选，分离自噬高细胞和自噬低细胞亚群，揭示了基础自噬水平对THP-1细胞中NLRP3炎症体激活的显著影响。
LKT(5μM)孵育6小时后，PMA分化的THP-1细胞经LKT流式细胞仪分选。参见图21，F-high和F-low分别代表荧光最强和最弱的25％的细胞。右图为F-high和F-low的细胞LC3蛋白质免疫印迹。结果表明，PMA刺激分化的THP-1细胞中存在自噬水平差异。
根据图21分选出来的F-high和F-low的THP-1细胞，在经PBS或LPS(100ng/mL)处理3小时后，蛋白免疫印迹验证NLRP3蛋白水平，参见图22，发现自噬强的THP-1细胞NLRP3表达量更高。
分别用PBS、LPS处理3h或LPS处理3h后加尼日利亚霉素刺激0.5h处理F-high和F-low的THP-1细胞，随后收集上清，检测IL-1β分泌(图23A)和LDH释放(图23B)，F-high细胞的IL-1β释放量是F-low的3倍，LDH的释放是F-low的2.8倍。
2.5LKT探针孵育结合流式细胞分选，分离自噬高细胞和自噬低细胞亚群，揭示了基础自噬水平对人单核细胞来源的树突状细胞的功能的影响。
人单核细胞来源的树突状细胞(Dendritic cells，DCs)分化后的第6天的细胞，用LKT(5μM)孵育6h后分选。参见图24，F-high和F-low分别代表LKT荧光最高和最低的25％细胞。其中，右图为F-high和F-low细胞的LC3蛋白免疫印迹，结果显示这些细胞中也存在自噬差异。
人单核细胞来源的树突状细胞(Dendritic cells，DCs)分化后的第6天的细胞，用LKT(5μM)孵育6h后分选。F-high和F-low分别代表LKT荧光最高和最低的25％细胞。分别在LPS刺激24h小时后进行细胞迁移实验，参见图25，左图为显微镜下观察细胞迁移到孔板下方的细胞数目，右边的图显示了量化的细胞数量，F-high的细胞迁移能力明显低于F-low的细胞。
人单核细胞来源的树突状细胞(Dendritic cells，DCs)分化后的第6天的细胞，用LKT(5μM)孵育6h后分选。F-high和F-low分别代表LKT荧光最高和最低的25％细胞，分别在LPS刺激24h小时后离心，收集细胞上清，参见图26，ELISA检测IL-12P70浓度，F-high的细胞分泌IL-12P70的能力下降2.7倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Asp Asp Trp Thr His Leu
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5

Claims (10)

1.一种基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针，其特征在于，所述分子探针的结构依次包括LC3蛋白靶向肽、细胞穿透肽和四苯乙烯。
2.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针，其特征在于，所述LC3蛋白靶向肽源自于p62/SQSTM1蛋白的LC3相互作用区；所述的LC3包括LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP或GABARAP L1/2。
3.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针，其特征在于，所述LC3蛋白靶向肽的序列为SEQ ID NO.1所示；所述细胞穿透肽的基序为SEQ ID NO.2所示；所述四苯乙烯为螺旋桨状四苯乙烯分子。
4.权利要求1-3任意一项所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的制备方法，其特征在于，所述基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的制备方法包括：
分别称取包含了LC3蛋白靶向肽和细胞穿透肽序列的多肽粉末以及带有单个炔基的四苯乙烯分子，将二者溶解于DMSO和水的混合溶液，混合均匀；
加入含有CuSO4和抗坏血酸钠的混合液，将所得反应溶液置于室温600rpm搅拌24小时，避光；
将反应完毕的溶液进行过滤，获得澄清液体；对得到的澄清液体进行分离操作，得到含有产物的液体；
去除所述的含有产物的液体中的有机相，将得到的溶液冻干处理，获得白色粉末，即为基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针产物。
5.根据权利要求4所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的制备方法，其特征在于，所述多肽粉末中细胞穿透肽和LC3蛋白靶向肽的摩尔比为1:1。
6.根据权利要求4所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的制备方法，其特征在于，所述DMSO和水的混合溶液中DMSO和水的体积比v/v＝8：2。
7.根据权利要求4所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的制备方法，其特征在于，在所述混合液中，所述抗坏血酸钠的终浓度为所述CuSO4的终浓度的2倍。
8.权利要求1-3任意一项所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针在细胞自噬的检测或不同自噬水平分选中的应用。
9.权利要求8所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的应用，其特征在于，所述分子探针的应用浓度为5-10μM。
10.权利要求8所述的基于聚集诱导发光原理的细胞自噬检测分子探针的应用，其特征在于，所述分子探针的应用处理时间为0-48小时。
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