CN106470964A - 具有聚集诱导发光性质的聚合物和寡聚物在成像和成像引导的治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

描述了具有聚集诱导发光性质的分子或共轭聚合物于药物跟踪与递送、生物样品(例如：细胞、细胞的组成部分)鉴定与标记等领域的应用，以及用于成像和成像引导的光动力学治疗。

Description

具有聚集诱导发光性质的聚合物和寡聚物在成像和成像引导 的治疗中的应用
相关申请
该专利申请覆盖美国临时专利申请，申请号：61/984,459,提交于2014年四月25日。该专利的内容包括英文列于下方。
发明背景
近几十年来，荧光成像已经被广泛应用于生物科学研究的各种方向，例如程序性的细胞凋亡，细胞器成像，细胞谱系传递等。与其它的成像模式包括正电子发射成像(PET),核磁共振成像,单光子发射计算机断层扫描等相比，荧光成像利用现成生物相容性好的造影剂可以得到亚细胞水平的高信噪比的成像，从而可以研究细胞与细胞之间的相互作用以及进行免疫学研究。在这些生物成像研究中，在很长一段时间内实时非侵入性的荧光成像对于肿瘤和干细胞的位移和置换的研究是至关重要的。这些信息可以帮助我们理解肿瘤和干细胞的发展与转移，从而为肿瘤的基础研究以及临床治疗提供帮助。
绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物作为有效的细胞标记蛋白已经在细胞移植与跟踪等领域发挥主导作用。这种方法是通过细胞自身将报告基因转染为荧光蛋白实现的。虽然通过病毒将GFP基因转染到细胞可以获得稳定的GFP表达以及较长时间的细胞跟踪效果，但是由于是在整合位点中随机插入突变基因，此方法仍然面临着高成本和安全性的问题。因此，基于多种不同生物材料的非病毒性质粒转染被引入，此方法可以在细胞质内直接表达GFP蛋白，避免基因整合的安全性问题。然而，这种方法只能应用于几天内的细胞成像，因为质粒很容易丢失并导致GFP荧光衰减。另一方面，非病毒载体的转染效率一般较低并且对于不同的细胞系之间转染效率差别很大，种子细胞系和间充质干细胞都很难被转染GFP基因。此外，非病毒载体的转染需要经过费时的转录、翻译以及翻译后修饰的循环过程，并且会引起泛素化和蛋白酶体的降解，从而导致即使细胞内的质粒浓度很高也会得到不连续的或者较弱的荧光信号。
与GFP荧光形成鲜明对比的是利用有机或者无机纳米荧光材料作为细胞标记具有不依赖于细胞的基因编辑的优点。然而，现有的荧光探针也有一些严重不足的地方。例如，基于荧光量子点的细胞追踪试剂包含了较高毒性的重金属离子，荧光小分子具有较小的斯托克斯位移、快速的荧光淬灭以及细胞增殖过程中的细胞质泄漏等缺点。
近些年，一些融诊断与治疗为一体的纳米药物载药系统通过将前药与荧光分子键合实现了实时的检测前药在肿瘤组织的活化。这种方法主要依赖于药物释放的同时荧光也发生变化。已经报道的荧光探针主要集中于检测药物进入细胞后的活化，而且通常只能检测某一种药物。在肿瘤治疗中，使用单独的药物往往由于肿瘤细胞的耐药而无法完全消除肿瘤细胞。因此，非交叉抗肿瘤药物被广泛应用于肿瘤治疗中。二价顺铂和阿霉素是两个临床上广泛使用的化疗药物并被用来治疗多种实体肿瘤。另外，联合使用二价顺铂和阿霉素也被报道可以增强肿瘤治疗效果并且已经被应用于临床试验中。
两亲性聚合物在水溶液中自组装形成的纳米颗粒被广泛应用于药物输送等领域。这些纳米颗粒具有较好的动物体内分布、长循环、高效的治疗效果以及较低的副作用等优点，被广泛应用于化疗、基因治疗、光热治疗以及光动力学治疗等领域。其中，基于光敏剂在光照下产生具有毒性的单线态氧的光动力学治疗得到了越来越广泛的关注。通常情况下，光敏剂通过疏水相互作用包载在纳米载药系统中。然而，包载在纳米颗粒中的光敏剂由于π–π相互作用会发生聚集(例如被广泛应用的商用光敏剂卟啉)，从而导致产生单线态氧的能力大大减弱，最终影响光动力学治疗的效果。
发明内容
本发明涉及用于可视化的化合物，聚合物和探针生物学对象，例如细胞，光动力疗法，药物和基因递送；评估前药转化的方法，通过化疗和光动力治疗联合治疗癌症，以及设计和筛选光敏剂用作光动力治疗。本发明的化合物，用途和方法优于现有技术，因为它们提供了高效的场所实现药物和基因递送，以及允许选择性光激发用于感染成像的生物学目标。
实施例一中，本发明的示例性实施方案是荧光团具有式(I)的结构：
或者是药学上可接受的盐；
其中W代表共轭体系；
R1或者R2是H或者CH2X；
X是N3,NH2,COOH,-C≡CH,卤素,-SH,马来酰亚胺或者OH,以及可以进行进一步的化学与生物分子的修饰，该分子具有聚集诱导发光性质。
在例一的另一个实施方案中，共轭体系包含一个或多个芳环，一个或多个杂芳环，一个或多个烯烃，一个或多个包含p-轨道的杂原子，或其组合。
在例一的另一个实施方案中，本发明是荧光团具有式(II)的结构：
或者是药学上可接受的盐。
在例一的另一个实施方案中，本发明是荧光团具有式(III)的结构：
或者是药学上可接受的盐。
在例一的另一个实施方案中，本发明是荧光团具有式(VI)的结构：:
或者是药学上可接受的盐。
其中
Q是O,N(C1-C3)烷基,或者Si；
R3和R4是H，任选被一个或多个选择的取代基取代的(C1–C3)烷基卤素，氨基，N3或PPh3，5-10单元杂环基，-C(O)C2-C6炔基或
R5是或者
R6是C1-C6烷基链；
R7是(C1-C6)烷基或(C2-C6)烯基，各自任选被芳基或杂芳基取代进一步任选被-O-C1-C6)烷基氨基取代；并且荧光分子具有聚集诱导发光性质。
在例一的另一个实施方案中，本发明包括具有式(VI)的结构：
或者是药学上可接受的盐
其中
Q是O或者N(C1-C3)烷基；
R3与R4是H,(C1-C3)烷基或者被一个或多个氨基、叠氮、三苯基膦、5-10单元的杂环基团或者–C(O)C2-C6烷基链取代；
R5是
R6是C1-C6烷基；
R7是(C1-C6)烷基链或者(C2-C6)烯基,或者被芳基或者杂环基取代进一步任选被-O-C1-C6)烷基氨基取代，并且荧光分子具有聚集诱导发光性质。
在例一的另一个实施方案中，本发明不包含：
在例一的另一个实施方案中，本发明是荧光团具有式(VII)的结构：
或者是药学上可接受的盐。
在例一的另一个实施方案中，本发明是荧光团具有式(VIII)的结构：
在例一的另一个实施方案中，本发明是荧光团具有式(VIII)的结构：
或者是医药上可接受的盐。
在例一的另一个实施方案中，本发明是荧光团具有式(IX)的结构：
或者是医药上可接受的盐。
在例一的另一个实施方案中，本发明是荧光团具有式(X)的结构：
或者是医药上可接受的盐。
在例一的另一个实施方案中，将荧光团包封在生物相容性基质中；其中所述生物相容性基质包括脂质(例如DSPE-PEG)，聚乙二醇，壳聚糖，聚乙烯醇，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或牛血清白蛋白；其中聚乙二醇，壳聚糖，聚乙烯醇，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或牛血清白蛋白任选地通过一种或多种脂质，马来酰亚胺，羟基，胺，羧基，巯基或其组合官能化。
在例一的另一个实施方案中也包含荧光分子被包载于生物相容性的基质，其表面可以被修饰为细胞穿膜肽。包含以下序列Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys(序列1)；Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg(序列2)；Lys-Arg-Pro-Ala-Ala-Thr-Lys-Lys-Ala-Gly-Gln-Ala-Lys-Lys-Lys-Leu(序列3)；and Gly-Leu-Ala-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val(序列4)Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(序列5)；Val-His-Leu-Gly-Tyr-Ala-Thr(序列8)或者是医药上可接受的盐。
实施例二中，本专利包括利用上述任一荧光分子作为细胞或者细菌或者其它生物体的成像。
例二的一个实施方案中，本专利包括利用上述荧光分子进行光动力学治疗细胞或者细菌或者其它生物体。
例二的一个实施方案中，本专利包括利用上述任一荧光分子进行生物成像以及成像引导的光动力学治疗细胞或者细菌或者其它生物体。
例二的一个实施方案中，本专利包括利用上述任一荧光分子进行细胞器的成像。
例二的一个实施方案中，细胞器可以是线粒体。
实施例三中，本专利是一个化学复合物，包括：一个靶向基团，一个荧光分子，一个连接单元以及一个化疗药物，以上单元通过化学键以线性方式连接。靶向基团位于线性单元的末端，具有聚集诱导发光性质的荧光分子含有一个四苯乙烯核并可以被H,OH,或者O(C1-C6)烷基取代。
例三的另一个实施方案中，连接单元可以是前药、化学反应性基团、ROS反应性基团或pH反应性基团。连接部分在暴露于外部刺激时断裂。
例三的另一个实施方案中，前药是四价顺铂复合物。
例三的另一个实施方案中，靶向基团可以识别细胞表面的受体。
例三的另一个实施方案中，靶向基团是环(Arg-Gly-Asp)，可以特异性识别肿瘤细胞表面的αvβ3整合素。
例三的另一个实施方案中，靶向基团是Val-His-Leu-Gly-Tyr-Ala-Thr(序列8)可以特异性识别HT-29肿瘤细胞。
例三的另一个实施方案中，化疗药物是阿霉素。
例三的另一个实施方案中，复合物具有式(IV)的结构:
或者是医药上可接受的盐。
实施例四中，本专利报道的是将前药转化为活化药物的方法，其包括：a)将前药孵育在生物样品中形成混合物；b)监测混合物的的荧光变化，其中荧光的变化与未加生物样品的荧光值作为比较，从而可以检测前药的活化过程。
例四的另一个实施方案中，该方法可应用于活细胞。
例四的另一个实施方案中，孵育也包括生物样品与抗坏血酸或者谷胱甘肽的孵育。
实施例五中，本专利包括具有式(V)的共轭聚合物:
或者是含盐衍生物,其中：
U是(C1-C20)烷基或者(CH2CH2O)1-20；
R2是或者
V是O或者NH；
Y是或者
Z是H或者(C1-C6)烷基；
每个R3是单独的-COOH或者–CO-B；
B是一个化疗药物；
n是5-115的整数；以及
m是5-115的整数.
例五的一个实施方案中，至少一个R3是–CO-B.
例五的一个实施方案中，化疗药物是阿霉素、紫杉醇、美法仑、喜树碱或者吉西他滨。
例五的一个实施方案中，共轭聚合物可以是基于共轭聚合物的纳米颗粒。
例五的一个实施方案中，纳米颗粒的表面可以官能化为靶向识别基团。
例五的一个实施方案中，靶向基团对肿瘤细胞表面的受体具有特异性的识别作用。
例五的一个实施方案中，靶向识别基团是环(Arg-Gly-Asp)并对细胞表面的αvβ3整合素具有识别作用。
例五的一个实施方案中，R2是
例五的一个实施方案中，共轭聚合物可以是基于共轭聚合物的纳米颗粒。
例五的一个实施方案中，化疗药物可以包载于基于共轭聚合物的纳米颗粒。
例五的一个实施方案中，化疗药物可以是紫杉醇。
例五的一个实施方案中，纳米颗粒的表面可以修饰为靶向基团。
例五的一个实施方案中，靶向识别基团可以特异性的识别肿瘤细胞表面的受体。
例五的一个实施方案中，靶向识别基团是环(Arg-Gly-Asp)并对细胞表面的αvβ3整合素具有识别作用。
实施例六中，本专利利用上述基于共轭聚合物的纳米颗粒作为成像引导的化疗和光动力学治疗。
实施例七中，本专利报道一个联合化疗和光动力学治疗肿瘤的方法，包括：a)将含有肿瘤细胞的生物样品与基于共轭聚合物的纳米颗粒或者上述任一纳米颗粒进行共孵育，其中至少一个R3是–CO-B；以及b)对共孵育混合物进行充足光照，从而产生活性氧，活性氧与共轭聚合物反应活化化疗药物，同时产生活性氧的能力使得共轭聚合物可以作为光敏剂。
例七的一个实施方案中，该方法可以进一步延伸为通过荧光使得混合物可视化，其中荧光的变化与未加生物样品的荧光值作为比较，从而可以检测前药的活化过程。
例七的一个实施方案中，该方法可以进一步延伸为通过荧光监测基于共轭聚合物的纳米颗粒的细胞吞噬。
例七的一个实施方案中，通过荧光监测基于共轭聚合物的纳米颗粒的细胞吞噬是可定量的。
实施例八中，本专利可以是具有具有式(XI)结构的荧光分子:
或者是医药可接受的盐；
其中W是一个共轭体系；
R1和R2是H,OH,N(C1-C3)烷基或者O(C1-C6)烷基被一个或多个氨基、三苯基膦、5-10原子的杂环、叠氮、-C(O)(C2-C6)炔基或者X所取代；
R3是H，OH，任选被一个或多个取代的N(C1-C3)烷基或O(C1-C6)烷基任选被一个或者多个卤素，氨基，PPh3，5-10原子的杂环基，N3，-C(O)(C2-C6)炔基，X或W取代；
X是包含连接部分，多个亲水性肽，靶识别基序和任选的四苯乙烯的部分；并且荧光团表现出聚集诱导的发射性质。
例八的一个实施方案中，共轭体系包括一个或者多个苯环、杂芳环、烯烃、包含p-轨道的杂原子或者以上的组合。
例八的一个实施方案中，共轭体系是：
或者
R4是(C1-C6)烷基任选被N3，氨基，(C1-C3)炔基，-C(O)OH，卤素，SH马来酰亚胺或OH取代；
R5是芳环，杂芳环，(C1-C6)烷基或者(C2-C6)烯基任选被N3，氨基，(C1-C3)炔基，-C(O)OH，卤素，-SH，马来酰亚胺，OH，芳基(C1-C6)烷基或或杂芳基取代，各自进一步任选被-O-(C1-C6)烷基氨基取代；和
R6是芳基或者杂环芳基
例八的一个实施方案中，连接基团包括在暴露于外部刺激时断裂的化学键。例八的一个实施方案中，连接基团可以是。
例八的一个实施方案中，靶向基团可以特异性的识别生物靶标。
例八的一个实施方案中，靶向基团可以是是蛋白质，表面生物标志物，细胞表面标志物或细菌表面标志物。
例八的一个实施方案中，靶向识别基团是环(Arg-Gly-Asp)并对细胞表面的αvβ3整合素具有识别作用。
例八的一个实施方案中，共轭系统是
例八的一个实施方案中，荧光分子不包括：
实施例九中，本发明是用于使生物样品可视化的探针，所述探针包含荧光团，连接部分和多个肽，其中所述荧光团，所述连接部分和所述多个肽通过共价键连接在线性阵列；并且其中所述荧光团显示聚集诱导的发射性质并且包含四苯乙烯任选被H，OH，O(C1-C6)烷基，芳基，杂芳基或(C2-C6)烯基取代，进一步任选被CN取代。
例九的一个实施方案中，荧光探针具有式(VII)的结构：
或者是医药接受的盐。
例九的一个实施方案中，荧光探针具有式(VIII)的结构：
或者是医药接受的盐。
实施例十中，本发明是上述探针在生物样品的可视化中的用途，包括例如细胞或细菌。
例十的一个实施方案中，细胞是肿瘤细胞。
例十的一个实施方案中，细胞是HT-29细胞。
实施例十一中，本专利利用上述荧光探针研究细胞器成像。
例十一的一个实施方案中，细胞器是线粒体。
实施例十二中，本专利利用上述荧光探针进行成像引导的细胞光动力学治疗。
实施例十三中，本发明是包含荧光团、连接部分和低聚乙烯亚胺的聚合物，它们通过共价键以线性阵列连接；其中所述荧光团显示聚集诱导的发射性质，由任选被H，OH，O(C1-C6)烷基，芳基，杂芳基或进一步任选被-CN取代的(C2-C6)烯基取代的四苯基乙烯组成。
例十三的一个实施方案中，聚合物具有式(XII)的结构：
其中m是在1和200之间的整数，n是在5和400之间的整数，并且x+y+z是在5和10之间的整数。
实施例十四中，本专利提供一个基因输送到靶向细胞的方法，该方法包括：
a)使所述聚合物与所述目标剂在足以使所述目标剂接触的条件下形成试剂-聚合物颗粒；
b)在足够的条件下将细胞与试剂-聚合物颗粒孵育以形成孵育混合物；和
c)充足光照孵育的混合物，产生活性氧物质，其中所述活性氧物质与所述试剂聚合物反应以将目标试剂从试剂-聚合物颗粒中释放到细胞中。
例十四的一个实施方案中，所述试剂是DNA，RNA，SiRNA或药物。
实施例十五中，本专利报道一个设计与合成用于光动力学治疗的光敏剂的方法，包括：
a)选择包含供体部分和受体部分的一类化合物；；
b)对于该类化合物的多个成员，计算单重激发态和三重激发态(ΔEST)之间的能隙的值；
c)鉴定ΔEST小于或等于1的化合物类别的成员；；
d)光激发该类所选化合物以产生单线态氧；；
e)从步骤(d)的化合物中选择具有最高单线态氧量子产率的光敏剂化合物。
附图说明
根据如附图中所示，本发明的示例性实施例的具体描述如下：
图1指PPDC的合成步骤。
图2A指官能化的TPECM-2N3以及荧光探针TPECM-2GFLGD3-cRGD的合成步骤。
图2B指组织蛋白酶B引发的探针荧光的变化以及光学活性的活化以及光照下活性氧自由基的产生。
图3A-F是荧光探针(5μM)孵育4小时的A)MDA-MB-231细胞,B)MCF-7细胞,C)293T细胞,D)cRGD处理的MDA-MB-231细胞,E)CA-074-Me处理的MDA-MB-231细胞,以及F)cRGD和CA-074-Me处理的MDA-MB-231细胞的激光共聚焦照片。蓝色荧光是4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色的细胞核(DAPI；Ex＝405nm；Em＝430–470nm),红色荧光来自于荧光探针(Ex＝405nm；Em>560nm)。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。
图4A-C指本专利使用的TPE化合物的合成步骤。
图5指本专利使用的其它的TPE化合物的合成步骤。
图6指HeLa细胞与2μM的TPECM-1TPP(A-D),TPECM-2TPP(F-I)和TPECM-2Br(K-N)共孵育2h的激光共聚焦照片。HeLa细胞通过Mito-tracker green(100nM)共染。绿色荧光来自于Mito-tracker green,λex＝488nm andλem＝520nm±20nm,红色荧光来自于荧光探针,λex＝405nm,λem>560nm。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。TPECM-1TPP(E),TPECM-2TPP(J)和TPECM-2Br(O)的细胞线粒体共定位散点图。
图7指MDA-MB-231细胞线粒体形状共孵育TPECM-1TPP(5μM)在黑暗条件下(A–C)或者光照下(0.1W cm-2,8min)(D–F)的变化。A和D是Mito-tracker green的荧光照片,λex＝488nm；λem＝520nm±20nm.B和E是TPECM-1TPP的荧光照片,λex＝405nm；λex>560nm。C和F是Mito-tracker green与TPECM-1TPP的叠加图像。
图8是碘化丙啶染色的HeLa细胞的荧光图像(A,D,G和J),明场图像(B,E,H和K)以及荧光和明场图像的叠加(C,F,I and L)在未孵育TPECM-2TPP(A,B和C),或者在黑暗条件下孵育TPECM-2TPP(1μM)(D,E and F)或者TPECM-2TPP(1μM)3小时的荧光照片，并进行光照(8min,0.10W cm-2)以及进一步孵育 24h(G,H和I)或者在黑暗条件下孵育TPECM-2TPP(1μM)3h,并用维生素C预处理及进行光照并进一步孵育24h的荧光照片(J,K和L)。
图9是单线态氧敏感的聚合物的合成步骤。
图10A-F4是(A)HeLa细胞的共聚焦显微镜照片通过孵育S-NPs/DNA(A1,Ex:405nm,Em:>560nm)以及LysoTracker green(A2,Ex:488nm,Em:505-525nm)；(A3)照片A1与A2的叠加图片；(A4)特定区域的强度分布。(B)HeLa细胞的激光共聚焦显微镜通过孵育S-NPs/YOYO-1-DNA复合物(B1)黑暗条件下,光照(B2)2min,(B3)5min and(B4)5min以及含有维生素C.绿色荧光来自于YOYO-1(Ex:488nm；Em:505-525nm)；红色荧光来自于S-NPs(Ex:405nm；Em:>560nm).黄色荧光来自于红色和绿色图片的叠加。(C)不同处理条件下YOYO-1和S-NPs荧光的共定位比例的变化。(D,E)HeLa细胞的共聚焦照片通过孵育(D)S-NPs/YOYO-1-DNA及氯喹,(E)inS-NPs/YOYO-1-DNA在黑暗条件下(D1,E1)或者经过5min的光照(D2,E2).(F)激光共聚焦照片研究经过不同处理后YOYO-1-DNA的位置。S-NPs/DNA在黑暗条件下(F1),S-NPs/DNA在光照条件下(F2),S-NPs/DNA与维生素C在光照条件下(F3)以及inS-NPs/DNA在光照条件下(F4).绿色荧光来自于YOYO-1(Ex:488nm；Em:505-525nm)；红色荧光来自于DRAQ5染色的细胞核(Ex:633nm；Em:>650nm)；黄色荧光来自于绿色和红色荧光的叠加。所有图像具有相同的比例尺(10μm)。
图11是TPE-NLS的合成步骤。
图12是10μM TPE-NLS的DMSO和水(体积比为1/199)溶液中加入不同浓度的dsDNA(A),组蛋白(B)以及核裂解物(C)的荧光强度的变化.λex＝312nm,λem＝480nm.
图13A-B是双重靶向诊疗探针的设计。
图14是TPETP-NH2的合成步骤。
图15是TPETP-SS-DEVD-TPS-cRGD的还原性研究。(a)归一化的TPETP在DMSO和水(体积比为1/199)中紫外可见光谱以及荧光光谱。(b)TPETP在不同比例的DMSO和水中的荧光光谱。(c)TPETP以及荧光探针在DMSO和水(体积比为1/199)中的荧光光谱。插图：在365nm的UV灯的照射下拍摄的相应照片。(d)荧光探针(10μM)在谷胱甘肽GSH(0.1mM)作用下荧光随时间的变化。(e)DMSO和水(体积比为1/199)溶液中，不同浓度的荧光探针经过谷胱甘肽(0.1mM)处理75min后在650nm的荧光强度的变化。(f)探针(10μM)DMSO和水(体积比为1/199)溶液中经过谷氨酸、叶酸、溶菌酶、牛血清白蛋白、胃蛋白酶、抗坏血酸以及谷胱甘肽处理后的荧光强度的变化。激发波长为430nm。数据表示平均值±标准偏差，取三次平均值。
图16A-H是MDA-MB-231细胞(a-f),MCF-7细胞(g),293T细胞(h)或者cRGD预处理(e)、BSO预处理(f)的MDA-MB-231细胞通过孵育探针1h(a),2h(b),3h(c),4h(d-h)的激光共聚焦照片。蓝色荧光来自于Hoechst染色的细胞核(Ex:405nm；Em:430-470nm)；红色荧光来自于TPETP(Ex:405nm；Em:>560nm)。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。
图17A-H是细胞凋亡的实时成像。MDA-MB-231细胞(a-f),MCF-7细胞(g),293T细胞(h)以及cRGD(e)或者VC(f)预处理的MDA-MB-231细胞在通过孵育探针4h及光照1min(a),2min(b),4min(c),6min(d-h)的激光共聚焦照片。蓝色荧光来自于Hoechst染色的细胞核(Ex:405nm；Em:430-470nm)；绿色荧光来自于TPS(Ex:405nm；Em:505-525nm)。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。
图18是双重靶向前药作为实时监测药物跟踪及活化。
图19A-E是研究cRGD-TPE-Pt-DOX对不同细胞的靶向作用：MDA-MB-231细胞(A),MCF-7细胞(B)以及293T细胞(red)(C)在经过孵育cRGD-TPE-Pt-DOX探针2h(绿和红)的激光共聚焦照片。绿色代表cRGD-TPE-Pt-DOX中阿霉素的荧光(λex＝488nm)，红色代表DRAQ5染色的细胞核。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。(D)MDA-MB-231,MCF-7以及293T细胞孵育cRGD-TPE-Pt-DOX(λex＝488nm)不同时间后的相对荧光强度。(E)cRGD(50μM)预处理的MDA-MB-231,MCF-7以及293T细胞孵育cRGD-TPE-Pt-DOX(λex＝488nm)不同时间后的相对荧光强度。数据表示平均值±标准偏差，取三次平均值。
图20是MDA-MB-231细胞通过孵育DOX(A,6h,绿色),cRGD-TPE(B,6h,绿色和红色),以及cRGD-TPE-Pt-DOX 1h(C,绿色和红色),2h(D,绿色和红色),以及在新鲜培养基中再孵育4h(E)的激光共聚焦照片。蓝色荧光来自于TPE，绿色荧光来自于DOX，红色荧光来自于DRAQ5染色的细胞核。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。(F)是cRGD-TPE-Pt-DOX对抗MDA-MB-231细胞的治疗效果的组合指数，从75％到25％。
图21是cRGD-TPE-Pt-DOX的合成步骤。
图22是(A)前药TPECB-Pt-D5-cRGD的化学结构式；(B)TPECB-Pt-D5-cRGD作为顺铂活化的检测以及成像引导的光动力学治疗和化疗的联合对抗顺铂耐药细胞示意图。
图23是(A)TPECB和TPECB-Pt-D5-cRGD(10μM)在DMSO和PBS缓冲液(体积比为1/199)中的荧光图谱。插图：在365nm的UV灯的照射下拍摄的相应照片。(B)TPECB-Pt-D5-cRGD(10μM)与谷胱甘肽(100μM)共孵育不同时间的荧光光谱。(C)TPECB-Pt-D5-cRGD(10μM)与100μM不同的检测物共孵育后的荧光图谱。(D)9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸与谷胱甘肽预处理后的前药在不同时间的光照后紫外可见光谱的变化。VC代表活性氧自由基的吸收剂维生素C。数据表示平均值±标准偏差，取三次平均值。
图24是MDA-MB-231细胞(A-C,E,F),U87-MG细胞(D),MCF-7细胞(G),293T细胞(H)通过孵育前药不同时间的激光共聚焦照片。对于E和F,细胞经过cRGD或者丁硫氨酸亚磺酰亚胺预处理。红色荧光(图24B-G)来自于TPETB(Ex:405nm；Em:>560nm)；蓝色荧光来自于Hoechst染色的细胞核(Ex:405nm；Em:430-470nm)。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。
图25是TPECB-Pt-D5-cRGD的合成步骤。
图26是(A)PEG衍生化的聚前药PFVBT-g-PEG-DOX的化学结构式以及(B)光引发的活性氧自由基活化的药物释放作为化疗和光动力学治疗联合治疗的示意图。
图27是(A)利用高效液相色谱通过监测254nm的吸收研究N3-PEG-TK-DOX在活性氧自由基存在下的稳定性及降解性。(B)DOX,TCP NPs以及TCP-DOX NPs的归一化紫外可见光谱。(C)TCP-DOX NPs的尺寸分布和透射电子显微镜照片。(D)TCP-DOX NPs在水、PBS缓冲液或者DMEM细胞培养基中于37摄氏度培养7天的平均尺寸的变化。(插图表示TCP-DOX NPs分布于水、PBS缓冲液或者DMEM细胞培养基中的照片)。(E)在PBS,DOX,TCPDOX NPs和TCP NPs在经过光照后二氯荧光素在530nm出的荧光强度的变化。VC代表活性氧自由基消除剂维生素C。(F)TCPDOX NPs中阿霉素在有无光照情况下的累积释放量。数据表示平均值±标准偏差，取三次平均值。
图28是研究TCP-DOX NPs对于不同细胞系的靶向能力。(A)MDA-MB-231和MCF-7细胞在孵育TCP-DOX NPs 4h的激光共聚焦照片。蓝色荧光来自于Hoechst 33342染色的细胞核，红色荧光来自于PFVBT-g-PEG-DOX。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。(B)MDA-MB-231和MCF-7细胞孵育PFVBT-g-PEG-DOX不同时间后的相对荧光强度。(C)有无cRGD(50μM)预处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞孵育PFVBT-g-PEG-DOX不同时间后的相对荧光强度。数据表示平均值±标准偏差，取三次平均值。
图29是利用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)作为探针检测细胞在经过(A)DCF-DA；(B)TCP-DOX NPs；(C)TCP-DOX NPs和DCF-DA；(D)TCP-DOX NPs和DCFDA以及活性氧消除剂维生素C(50μM)处理后活性氧自由基的产生。绿色荧光来自于DCF(C和D)，红色荧光来自于PFVBT-g-PEG-DOX(B-D)。所有图像具有相同的比例尺(50μm)。
图30是PFVBT-g-PEG-DOX的合成步骤。
图31是研究TCP/PTX NPs对于不同细胞系的靶向能力。(A-B)激光共聚焦研究TCP/PTX NPs对于U87-MG(A)和MCF-7(B)细胞的吞噬能力，蓝色荧光来自于Hoechst 33342染色的细胞核，红色荧光来自于TCP/PTX(seen in图31A)。所有图像具有相同的比例尺(20μm)。(C)TCP/PTX NPs孵育U87-MG和MCF-7细胞不同时间后的荧光强度变化。(D)激光共聚焦研究cRGD(50μM)预处理的U87-MG细胞对于TCP/PTX NPs的细胞吞噬能力。(E)有无cRGD(50μM)预处理的U87-MG和MCF-7细胞对于TCP/PTX NPs吞噬能力的比较。数据表示平均值±标准偏差，取三次平均值。
图32是利用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)作为探针检测U87-MG细胞在经过(A)DCF-DA白光照射条件下；(B)TCP/PTX NPs光照条件下(绿)；(C)TCP/PTX NPs和DCF-DA在光照条件下(绿)；(D)TCP/PTX NPs和DCFDA以及活性氧消除剂维生素C(50μM)处理后活性氧自由基的产生。E-H所示为来自CP的荧光。所有图像具有相同的比例尺(50μm)。
图33是DPBA-TPE的合成步骤。
图34是FA-AIE-TPP纳米颗粒在a)不同粒子浓度下以及b)不同的光照强度下活性氧自由基的产生能力研究。.
图35是a)MCF-7细胞和b)NIH-3T3细胞在孵育AIE纳米颗粒以及MitoTrackerGreen后的激光共聚焦照片。红色荧光来自于AIE纳米颗粒:Ex:543nm,Em:>650nm；绿色荧光来自于MitoTracker Green:Ex＝488,Em＝505–525nm.c)AIE纳米颗粒和MitoTracker Green在MCF-7和NIH-3T3细胞中的Pearson系数。所有图像具有相同的比例尺(10μm)。
图36是MCF-7癌细胞和NIH-3T3正常细胞在孵育不同浓度的a)AIE-TPP,b)AIE-FA,c)FA-AIE-TPP纳米颗粒及经过光照后的细胞活性。d)和e)Annexin V标记的MCF-7细胞在经过共孵育FA-AIE-TPP纳米颗粒以及在光照前后的激光共聚焦照片。
图37是通过JC-1测试MCF-7细胞在孵育FA-AIE-TPP纳米颗粒然后经过a)0,b)5,and c)10min的光照后线粒体电势的变化。所有图像具有相同的比例尺(10μm)。绿色荧光来自于JC-1单体。红色荧光来自于JC-1聚集体。JC合并荧光图如下：(A)橙红色和绿色，(B)绿色，(C)绿色。
图38是a)FA-AIE-TPP纳米颗粒孵育的NIH-3T3和MCF-7细胞72小时后的明场照片。细胞是与FA-AIE-TPP dots(20μg/mL)孵育 4h后再经过白光光照(100mW/cm2)10min.b)AIE纳米颗粒处理的MCF-7细胞在光照前后的细胞迁移能力比较。
具体实施方式
以下是本发明的示例实施例的描述
定义
以下阐述的取代基的所有定义还适用于该术语与另一取代基结合使用。
“烷基”是指饱和脂族支链或直链一价烃基，例如C1-C10,优选C1-C6.“(C1-C6)烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链排列的基团。“(C1-C6)烷基”包括甲基，乙基，丙基，丁基，叔丁基，戊基和己基。
“亚烷基”是指饱和脂族直链二价烃基。因而，“(C1-C6)亚烷基”是指具有1-6个碳原子的直链排列的二价饱和脂族基团。“(C1-C6)亚烷基”包括甲基，乙基，丙基，丁基，叔丁基，戊基和己基。
“环烷基”指饱和脂族环烃环。因而，
“C3-C8环烷基”是指(3-8单元)饱和脂族环烃环.C3-C8环烷基包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。优先为环烷基是C3-C6环烷基。
“烷氧基”是指-O-烷基；“羟基烷基”是指被羟基取代的烷基；“芳烷基”是指被芳基取代的烷基；“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基；“烷基胺”是指被烷基取代的胺；“环烷基烷基”是指被环烷基取代的烷基；“二烷基胺”是指被两个烷基取代的胺；“烷基羰基”是指-C(O)-A*，其中A*是烷基；“烷氧基羰基”是指C(O)OA*，其中A*是烷基；并且其中烷基如上所定义。烷氧基优先为O(C1-C6)烷基并且包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，戊氧基和己氧基。
“环烷氧基”是指-O-环烷基，其中环烷基如上所定义。示例性(C3-C7)环烷氧基包括环丙氧基，环丁氧基，环戊氧基，环己氧基和环庚氧基。
单独使用或作为较大部分如“芳基烷基”，“芳基烷氧基”，“芳氧基”或“芳氧基烷基”的一部分使用的术语“芳基”是指碳环芳环。“碳环芳基”可与“芳基”，“芳基环”，“碳环芳环”，“芳基”和“碳环芳基”互换使用。芳环通常具有6-16个环原子。“取代的芳基”在任何一个或多个可取代的环原子上被取代。本文所用的术语“C6-C16芳基”是指含有6至16个碳原子的单环，双环或三环碳环系统，包括苯基(Ph)，萘基，蒽基，1,2-二氢萘基，1,2,3，4-四氢萘基，芴基，茚满基，茚基等。在具体的实施方案中，芳基是(C6-C10)芳基。(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基通过(C6-C10)芳基(C1-C6)烷基的(C1-C6)烷基部分连接到分子的其余部分。芳环包括单环和多环。
“杂”是指用至少一个选自N，S和O的杂原子取代环系中的至少一个碳原子成员。杂原子可任选携带电荷。当N是环系的杂原子时，其可以另外被一个或多个取代基取代，所述取代基包括H，OH，O-，烷基，芳基，杂环基，环烷基或亚烯基，其中烷基，芳基，杂环基，亚烯基可以任选和独立地被一个或多个选自卤素，氰基，硝基，羟基，磷酸根(PO4 3-)或磺酸根(SO3-)的取代基取代。
“杂环”是指含有一个氮原子和1个选自N，O或S的另外的杂原子的饱和或部分不饱和(3-7元)单环杂环。当一个杂原子是S时，它可以任选是单-或二氧化的(即，-S(O)-或S(O)2)。单环杂环的实例包括但不限于氮杂环丁烷，吡咯烷，哌啶，哌嗪，六氢嘧啶，四氢呋喃，四氢吡喃，吗啉，硫代吗啉，硫代吗啉1,1-二氧化物，四氢-2H-1,2-噻嗪，1,2-噻嗪1,1-二氧化物，异噻唑烷或异噻唑烷1,1-二氧化物。杂环可任选地与碳环稠合，例如吲哚中。
单独使用或作为较大部分如“杂芳基烷基”或“杂芳基烷氧基”的一部分使用的术语“杂芳基”，“杂芳族”，“杂芳基环”，“杂芳基基团”和“杂芳族基团”具有五至十四个选自碳和至少一个(通常1-4个，更典型地1或2个)杂原子(例如氧，氮或硫)的环原子的环基。它们包括单环杂环和多环，其中单环杂芳环与一个或多个其它碳环芳环或杂芳环稠合。通常，杂芳环包含5-14个总环原子。本文所用的术语“5-14元杂芳基”是指含有一个或两个芳环和5至14个总原子的单环，双环或三环环系，除非另有说明，其中一个，两个，三个，四个或五个(C3-C10)杂芳基包括呋喃基，噻吩基，吡啶基，吡咯基，咪唑基，并且在本发明的优选实施方案中，杂芳基是(C3-C10)杂芳基。
“卤素基”和“卤素”在本文中可互换使用，并且各自是指氟，氯，溴或碘。
“氰基”是指-C≡N。
“硝基”是指-NO2.
本文所用的氨基可以是伯(NH2)，仲(NHRx)或叔(NRxRy)，其中Rx和Ry可以是任何烷基，芳基，杂环基，环烷基或亚烯基，被一个或多个上述取代基取代。Rx和Ry取代基可以一起形成“环”，其中本文所用的“环”是环状氨基，例如哌啶和吡咯烷，并且可以包括杂原子，例如吗啉。
术语“卤代烷基”，“卤代环烷基”和“卤代烷氧基”是指被一个或多个卤素原子取代的烷基，环烷基或烷氧基，视情况而定。术语“卤素”是指F，Cl，Br或I。
术语“酰基”是指-C(O)A*，其中A*是任选取代的烷基或芳基(例如，任选取代的苯基)。
“亚烷基”由-[CH2]z表示，其中z为正整数，优选为1至8，更优先为1至4。
“亚烷基”是其中至少一对相邻的亚甲基被-CH＝CH替代的亚烷基。
术语苄基(Bn)是指-CH2Ph。
术语“烯基”是指包括至少一个双键的直链或支链烃基。(C6-C10)芳基(C2-C6)烯基通过(C6-C10)芳基(C2-C6)烯基的(C2-C6)烯基部分连接到分子的其余部分。
如本文所使用的“共轭系统”是具有具有离域电子的p-轨道的连接原子的系统。这种系统通常交替单键和多键(例如双键)，并且在某些实施方案中还包含具有孤对电子，自由基原子或碳鎓离子的原子。共轭系统可以是循环的或非循环的。萘是共轭体系的一个实例。
本发明还包括化合物的药学上可接受的盐。例如，含有胺或其它碱性基团的本发明化合物的酸式盐可通过使化合物与合适的有机或无机酸反应获得，得到药学上可接受的阴离子盐形式。阴离子盐的实例包括乙酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，碳酸氢盐，酒石酸氢盐，溴化物，乙二胺四乙酸钙，樟脑磺酸盐，碳酸盐，氯化物，柠檬酸盐，二盐酸盐，乙二胺四乙酸盐，乙二磺酸盐，月桂基硫酸盐，乙磺酸盐，富马酸盐，葡庚糖酸盐，葡萄糖酸盐，谷氨酸盐，乙醇酰胂酸盐，己基间苯二酚盐，氢溴酸盐，羟基萘甲酸盐，碘化物，羟乙基磺酸盐，乳酸盐，乳糖酸盐，苹果酸盐，马来酸盐，扁桃酸盐，甲磺酸盐，甲基硫酸盐，粘酸盐，萘磺酸盐，硝酸盐，双羟萘酸盐，泛酸盐，磷酸盐/二磷酸盐，聚半乳糖醛酸盐，水杨酸盐，，丹宁酸盐，酒石酸盐，茶氯酸盐，甲苯磺酸盐和三乙基碘盐。
含有羧酸或其它酸性官能团的本发明化合物的盐可以通过与合适的碱反应来制备。这种药学上可接受的盐可以用提供药学上可接受的阳离子的碱来制备，所述碱包括碱金属盐(特别是钠和钾)，碱土金属盐(特别是钙和镁)，铝盐和铵盐，以及由生理学上可接受的有机碱制备的盐，例如三甲胺，三乙胺，吗啉，吡啶，哌啶，甲基吡啶，二环己胺，N，N'-二苄基乙二胺，2-羟乙基胺，胺，普鲁卡因，二苄基哌啶，脱氢松香胺，N，N'-双脱氢松香胺，葡糖胺，N-甲基葡糖胺，可力丁，奎宁，喹啉和碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸。
“聚集诱导的发光”是指当分散在例如有机溶剂中时荧光团发射很少或不发光的性质。然而，当荧光团分子聚集时，例如处在固态或由于疏水性在水中处于聚集态，来自荧光团的光发射会显著增强。
本文所使用的“生物相容性基质”是化合物或聚合物的支架，其用于在特定应用中执行相应的功能，而不会在宿主系统中引起不适当或不期望的效应。生物相容性基质的实例包括聚(乙二醇)，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](DSPE-PEG)，聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)，壳聚糖，牛血清白蛋白和明胶。在某些实施方案中，聚乙二醇包含约5至约115个单体单元。在其它实施方案中，聚乙二醇包含约6至约113个单体单元。
本文所用的“脂质”是指疏水性或两亲性小分子。在某些实施方案中，脂质包括甾醇，脂肪族维生素，甘油酯，甘油二酯，甘油三酯，某些脂溶性维生素和磷脂。
本文所使用的“靶识别基团”是对生物靶标(例如蛋白质、肽或者细胞膜上的受体)具有亲和力的化学部分。靶识别基序可以包括对特定靶结构具有亲和力的肽，蛋白质，寡核苷酸或有机官能团。
本文所使用的“连接部分”是通过一个共价键或通过一系列共价键连接两个或多个基团的化学部分。示例性连接部分包括二硫化物基团，氨基，2-硝基苄基衍生物，砜，腙，连位二醇或简单的一个或多个共价键。连接部分的其它实例可见于Bioorg.Med.Chem.,2012,20,571–582中的表1，其在本文中的内容有参考引文。连接部分中的共价键在外部刺激时断裂。外部刺激的实例包括但不限于化学化合物、活性氧、特定波长的光、特定的pH值以及特定的作用力。
“化学响应性”连接部分是包含能够在暴露于特定化学组合物时断裂的化学键的连接部分。化学响应性连接部分的一个实例是二硫化物(-S-S-)。
“活性氧物质(ROS)”响应连接部分是在暴露于活性氧物质时可被切断的部分。活性氧响应性连接部分的实例包括：
“pH响应性”连接部分是在暴露于特定pH值或pH值范围时可被切断的部分。pH响应性连接部分的实例包括：
“光响应”连接部分是指暴露在特定波长或一定波长范围的光时可以裂解的部分。光响应性连接部分的实例包括：
本文所使用的，“光谱学”包括任何物质与激发能量作用的方法。这包括但不限于显微术，荧光显微术，紫外/可见光光谱学和流式细胞术。如本文所使用的“微板读取器”是指测量例如包含在微板中的样品的荧光，吸光度和发光的实验室仪器。
化疗药物包括有细胞毒性的抗肿瘤化合物和组合物。用作化疗药物的实例药物包括多柔比星，紫杉醇，美法仑，喜树碱和吉西他滨。
本文所用的“前体药物”是指通常以其无活性形式施用于受试者并在受试者体内转化为其活性形式的治疗性化合物。例如，前体药物包括可以转化为活性铂(II)[Pt(II)]络合物的铂(IV)[Pt(IV)]络合物。在一个示例性实施方案中，Pt(II)络合物是顺铂，并且前体Pt(IV)络合物是八面体络合物，其中xy平面包括氯和氨基配体，并且络合物进一步包括两个另外的轴向酯配体。在某些实施方案中，这种转化通过化学试剂还原而发生。在某些其它实施方案中，这种转化通过代谢过程发生。
四苯乙烯，或者TPE，指的是
本专利中所使用的“生物样本”包括细胞提取物、活性细胞和组织切片。细胞提取物是指用离心除掉不溶性成分的裂解的细胞。“活性细胞”指的是培养的用于体外分析的活细胞。活性细胞可以是一个细胞或者多个细胞。“组织切片”指的是适合于分析测试的一部分组织样本。组织切片可以是一个组织切片或者多个组织切片。
本专利中所使用的“光谱学”包括任何反映物质与激发能量作用的方法。这包括但不限于，显微术、荧光显微术、紫外/可见光光谱学、流式细胞术。
本专利中所使用的“荧光信号变化”，可以用来表示一个样品与另外一个生物样本孕孵之后产生的与基线相比的荧光强度变化。在一些特定的实施案例中，荧光强度变化指的是荧光强度的增加。或者，荧光的变化是指荧光颜色的变化。荧光颜色的变化可以是荧光色调的变化(例如，绿色对红色)，也可以是色彩或者饱和度的变化(例如，浅红色对深红色)。
本专利中所使用的“孕孵”，或者“正在孕孵”一个样品指的是使样品混合。或者，正在孕孵指的是使样品混合并加热。“混合”包括由扩散产生的混合或者由搅拌产生的混合。
在特定的实施例中，活细胞是处理或者治疗方案的对象。在一些的实施例中，活细胞是被前药靶向的肿瘤细胞。
本专利中所使用的“纳米粒”是一种在其传输和性质方面表现为单一单位的小物体。在特定的实施例中，纳米粒的大小在5纳米到5000纳米之间。在特定的实施例中，共轭高分子在溶液中自组装而形成纳米粒。
﹏表示两个原子之间的连接点。
本文所用的“药剂”是指可用于治疗方案的化学或生物材料。示例性试剂包括DNA、RNA、SiRNA、药品或药物。
例1
用于细胞示踪的聚集诱导发光染料
以使用AIE荧光剂4,7-双[4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基]苯并-2,1,3-噻二唑(BTPEBT)制备用于长期细胞示踪的表面官能化的绿色发射AIE点作为例子报道。BTPEBT是可以用于本专利的共轭体系的实例。选择脂质-聚(乙二醇)(PEG)和脂质-PEG-马来酰亚胺的混合物作为包封基质，将BTPEBT包入形成具有生物相容性和表面官能性的AIE点。将来源于转录蛋白(Tat)的HIV-1反式激活因子的细胞穿透肽进一步缀合至点表面，以产生具有高细胞内化效率的AIE-Tat点。AIE-Tat点显示在547nm处具有发射最大值，类似于GFP，具有63％的高量子产率，以及在不同pH值条件下或在缓冲溶液中长时间温育超过10天的稳定的绿色荧光。在相似的实验条件下，将体外研究中的AIE-Tat点的细胞标记性能与经典的磷酸钙介导的GFP转染方法进行比较。发现AIE-Tat点具有以高亮度和约100％标记效率标记所有测试的人细胞的能力，显著优于仅显示不同和相对低的GFP标记效率的GFP质粒转染方法。此外，在细胞追踪实验中，AIE-Tat点能够追踪HEK293T细胞的活动超过10天，而pMAX-GFP只能追踪相同的细胞群体最多3天。
BTPEBPT由以下结构式表示:
AIE-Tat点的制备和表征
通过Suzuki偶联反应合成所选择的AIE荧光团4,7-双[4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基]苯并-2,1,3-噻二唑(BTPEBT)，并用1H和13C NMR确认其结构。通过在具有不同水分数(fw)的四氢呋喃(THF)/水混合物中测量其光致发光(PL)光谱来研究BTPEBT的AIE效应。随着fw的增加，BTPEBT最初显示出荧光的淬灭，随后是荧光恢复。
为了制造超亮和生物相容的装载BTPEBT的AIE点，将1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基-(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)及其马来酰亚胺基团使用1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000-Mal)作为包封基质以包埋BTPEBT49,50,58。通过由溶剂的疏水性变化驱动的自组装形成AIE点。PEG壳的存在有助于提供用于进一步化学或生物修饰的官能团，并且最小化与生物物质的非特异性相互作用。在THF挥发后，衍生自转录蛋白的HIV-1反式激活因子(Tat)的细胞膜渗透肽(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys)(SEQ ID NO:1)通过表面马来酰亚胺和肽C-末端的硫醇基团之间的点击反应缀合到AIE点上。所产生的AIE-Tat点用0.2微米的过滤器进一步过滤并在4℃下储存。
AIE-Tat点具有以318和422nm为中心的两个吸收峰，基于点浓度计算，在422nm处的摩尔消光系数为5.9×107M-1cm-1。AIE-Tat点显示在547nm的发射最大，具有125nm的宽斯托克斯频移和63％的高荧光量子产率，荧光量子产率的计算中使用在甲醇中的罗丹明6G作为标准(量子产率＝93％)测量。
AIE-Tat点的体外细胞成像。
使用人胚肾293T(HEK293T)细胞作为模型来评价AIE-Tat点的体外细胞成像能力。通过将贴壁HEK293T细胞与不同浓度(0至2nM)的AIE-Tat点孵育，AIE-Tat点被动扩散到细胞中。在孵育2小时后，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)拍摄HEK293T细胞的荧光图像，激发光波长为488纳米，收集505纳米以上的发射光信号。随着AIE-Tat点孵育浓度的增加，细胞膜到细胞质的绿色荧光信号也逐渐增加。在50pM或更低的孵育浓度下，AIE-Tat点倾向于结合细胞膜表面，而从细胞质中检测到的荧光可以忽略不计。然而，在2nM的高孵育浓度下，可以清楚地观察到细胞质中绿色荧光的积累。
AIE-Tat点和GFP在体外细胞标记的比较
接下来，使用一组不同组织来源的人细胞进一步检查AIE-Tat点作为通用标记试剂的应用。被选择作为体外模型细胞系包括：人胚肾293T细胞(HEK293T)、人结肠腺癌SW480细胞(SW480)、人结肠腺癌DLD-1细胞(DLD-1)、正常人结肠粘膜上皮细胞(NCM460细胞)、正常人原代皮肤成纤维细胞(NHDF细胞)骨髓干细胞(BMSCs)。使用磷酸钙转染方法作为标准基准转染以让这些细胞表达GFP61。来自桡足类Pontellina p的驱动GFP表达pMAX-GFP质粒(5μg/孔)与细胞温育过夜。对于要通过AIE-Tat点(2nM)标记的细胞也重复类似的程序。GFP或AIE-Tat点的标记效率通过流式细胞术分析评估。在所有测试的细胞中，只有HEK293T细胞显示70％的高GFP表达，而只有0至30％的SW480，DLD-1，NCM460，NHDF和BMSC是GFP阳性的，但具有刚刚高于细胞自身荧光的极低的平均荧光。这些结果与文献报道相吻合，那就是，非病毒转染方法存在相对低效的和细胞类型依赖的特点。相反，AIE-Tat点对所有这些测试的细胞系显示出几乎100％的标记效率，与GFP标记的细胞相比，平均荧光强度超过100倍。该结果清楚地表明，相对于GFP，AIE-Tat点具有优异的细胞标记能力。类似的现象也被CLSM图像证实，CLSM图像显示GFP阳性细胞的数目不同细胞系中发生大范围内变化，进一步表明GFP转染方法在实际应用中的局限性。另一方面，尽管细胞类型不同，用AIE-Tat点处理的所有细胞显示亮绿色荧光。此外，AIE-Tat点在细胞内显示较高的光稳定性，连续激光扫描10分钟后，AIE-Tat标记的细胞的信号损失小于15％，而GFP转染的细胞信号损失40％。值得注意的是，AIE-Tat点直接标记的细胞可以通过CLSM和流式细胞术立即检测到荧光信号，而对于GFP转染，存在质粒导入和GFP表达之间存在几至24小时的滞后期。总的来说，实验研究结果表明AIE Tat点在多个方面胜过传统的基于荧光蛋白的活细胞标记，从而使它们成为细胞成像和追踪的有前途的选择。
AIE Tat点的合成
在使用微针探针超声波仪12W输出(XL2000，Misonix Incorporated，NY)超声处理下，将含有BTPEBT(0.5mg)、DSPE-PEG2000(0.5mg)和DSPE-PEG2000-Mal(0.5mg)的THF溶液(1mL)倒入水(10mL)中。将混合物进一步放置在通风橱中的，在600rpm搅拌下于黑暗中过夜，以便THF挥发。将AIE点(1.8mL)与HIV1-Tat肽(3×105M)进一步混合并反应。在室温下反应4小时后，将溶液用MilliQ水透析2天以除去过量的肽。AIE点悬浮液用0.2μm的过滤器过滤来进一步纯化。收集Tat-AIE点以便进一步使用。
用AIE-Tat点来细胞标记
人胚胎肾HEK293T细胞是在37℃的条件下在培养皿(LAB-TEK，ChamberedCoverglass System)中培养。在细胞丰度达到80％后，除去培养基，贴壁细胞用PBS(1×)缓冲液洗涤两次。然后将悬浮着不同浓度(1pM，5pM，10pM，200pM，1nM和2nM)的AIE-Tat点的细胞培养基加入到培养皿中，孵育2小时后，将细胞用PBS(1×)缓冲液洗涤两次后，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)立即成像。为与GFP转染方法比较，SW480、DLD-1、NCM460、正常人原发皮肤成纤维细胞(NHDF)和HEK293T细胞在6孔板中培养，在细胞丰度达到80％后，贴壁细胞用PBS(1×)洗涤两次，然后将悬浮着AIE-Tat点(2nM)的细胞培养基中加入到每个孔中，过夜温育后，用PBS(1×)缓冲液洗涤细胞两次和胰蛋白酶化，然后使用Cyan-LX(DakoCytomation)通过流式细胞术测量和通过计数10,000个细胞获得每个样品的直方图进行分析。
AIE-Tat点的细胞毒性
HEK293T细胞的代谢活性是用甲基噻唑基二苯基四唑溴化物(MTT)测定法来评价。将HEK293T细胞以4×104个细胞/mL的密度接种在96孔板(Costar，IL，USA)中。在孵育24小时后，用浓度为2、5和10nM的AIE-Tat点悬浮液替换旧培养基，然后将细胞分别孵育24小时和48小时。然后用1×PBS缓冲液洗涤孔，向每个孔中加入100μL新鲜制备的含有MTT(0.5mg/mL)的培养基溶液。孵育3小时后，小心地移除MTT培养基溶液。然后将过滤的DMSO(100μL)加入每个孔中，将微板在室温下轻轻摇动10分钟以溶解所有形成的沉淀。通过酶标仪(GeniosTecan)监测MTT在570nm的吸光度。细胞活力由用AIE-Tat点孵育的细胞的吸光度与仅用培养基孵育的细胞的吸光度的比率来表示。
四苯乙烯类AIE荧光染料
螺旋桨形荧光染料显示AIE性质，例如四苯乙烯(TPE)，它们在分子溶解状态下是非发射性的，但是在聚集态下发射强荧光。类似地，它们可以用于影像指导的光动力治疗。
PDT代表了一种已经建立的并逐渐扩大的治疗癌症的方法。它涉及到用特定波长的光来激发光敏剂，随后从其最低单重激发态(S1)到最低三重激发态(T1)的系间窜越(ISC)，随后是光敏剂的T1到基态氧(3O2)的能量转移而产生ROS(方案1)，并导致目标物的氧化损伤。
这种光动力过程中涉及的主要细胞毒性剂是单线态氧，其生成效率与敏化剂的ISC效率和激发态的浓度猝灭是习惯性相关的。
为了提高ISC效率，许多最近报道的光敏剂将重原子结合到其结构中以增强自旋轨道扰动。然而，掺入重原子如硒、碘、溴和某些镧系元素据报道通常会导致“暗毒性”的增加。因此，推出替代方法以实现强的ISC而不使用重原子以使暗毒性最小化是重要的。以前的研究已经表明ISC速率常数可以从方程1估计。这里，HSO是自旋轨道扰动(SOP)的哈密尔顿算子，ΔES1-T1(ΔEST)是S1和T1状态之间的能隙。ISC可以通过由SOP导致的T1与S1混合来建模。该等式表明通过在SOP的类似水平下减小ΔEST可以增强ISC的效率。
激发态的浓度猝灭是常规光敏剂(PS)的另一个常见问题，特别是对于广泛使用的卟啉衍生物，由于其刚性平面结构和疏水性质，它们倾向于通过π-π堆积聚集，从而导致聚集淬灭(ACQ)和显着降低ROS发生效率。当PS被包封到纳米载体中时，猝灭更严重，这导致它们的荧光和光动力学效率的显著降低。
AIEgen光敏剂的效率可以通过操纵HOMO-LUMO分布来提高，HOMO-LUMO的分布通过将电子给体和受体掺入π共轭体系中以控制ΔEST值来达到。因此，在本发明的另一个示例性实施方案中，一系列AIE活性的带有二氰基乙烯基电子受体和甲氧基电子受体的类似物被高效率合成和纯化。它们的ΔEST值通过HOMO-LUMO得到调控，并导致它们产生单线态氧的能力得到相应调制。这项工作第一次展示了理论引导激发态设计的实际例子，以实现用于光动力疗法的细胞毒性单线态氧的有效生成。
分子设计基于以下考虑：(1)四苯基乙烯(TPE)是AIE活性的，并且在化学改性后可以保留AIE特性；(2)小ΔEST值可以通过在含有空间分离的电子供体和受体部分的分子系统内的分子内电荷转移来实现；(3)苯环常常用作HOMO-LUMO调控的π桥；(4)相似的分子结构将会有相似水平的SOP，因此可以更好地理解ΔEST和ROS生成之间的关系。因此，基于TPE母体，一系列具有AIE活性的含有二氰基乙烯基电子受体和甲氧基电子给体的相似分子结构的材料(TPDC，TPPDC和PPDC)被高效率地合成和纯化。所有三种化合物的分子结构，HOMO和LUMO分布和ΔEST值显示在图1中。如由时间依赖的DFT(TD-DFT)所预测的，TPDC，TPPDC和PPDC的ΔEST分别为0.48,0.35和0.27eV。与据报道具有ΔEST≥1eV的大多数染料相比[13]，这些AIE荧光染料显示相对小的ΔEST，表明潜在的高ISC率和可能高效的ROS产生能力。
这些AIE光敏剂的实例包括
PPDC的合成路线如图1所示。TPDC和TPPDC的合成路线在下面两篇文献中有详细报道：Y.Yuan,C.J.Zhang,M.Gao,R.Zhang,B.Z.Tang,B.Liu,Angew.Chem.Int.Ed.,54(6):1780-86(2015)；and F.Hu,Y.Huang,G.Zhang,R.Zhao,H.Yang,D.Zhang,Anal.Chem.2014,86,7987–7995.
类似于上述共轭系统，这些AIE荧光染料可被1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-马来酰亚胺(聚乙二醇)-3000](DSPE-PEG3000-Mal)封装用于递送。
可用于本发明的AIE荧光染料的其它实例还包括：
上述结构的合成路线如图4A-C所示，具体的合成方法如下所示，化合物的数字与图4A-C中的数字对应：
将化合物3a(25mg，0.06mmol)，丙二腈(30mg，0.40mmol)和乙酸铵(43mg，0.56mmol)溶于二氯甲烷(5ml)和甲醇(1ml)的混合物中。然后向上述混合物中加入硅胶(580mg)。然后减压除去溶剂。将所得混合物在100℃加热4小时。将混合物冷却，随后用色谱法(己烷/乙酸乙酯＝20/1)分离，得到所需产物(15mg，53.6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(d,J＝8.0Hz,2H),7.13(m,5H),7.02(d,J＝6.0Hz,2H),6.93(m,4H),6.67(t,J＝8.8Hz,4H),3.75(s,3H),3.74(s,3H),2.57(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ174.4,158.6,158.4,149.3,143.3,142.5,137.5,135.5,135.4,132.6,132.5,131.9,131.3,128.0,126.9,126.5,113.3,113.0,55.1,23.8；MS(ESI)计算值[M-H]-:481.19,实测值:481.30.
将化合物3b(27mg，0.07mmol)，丙二腈(25mg，0.38mmol)和乙酸铵(30mg，0.38mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和甲醇(1mL)的混合物中。然后将硅胶(505mg)加入到上述混合物中，并在减压下除去溶剂。将所得混合物在100℃加热4小时。将混合物冷却，随后用色谱法(己烷/乙酸乙酯＝20/1)分离，得到4b，为黄色固体(6.0mg，16.8％产率)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.18-7.11(m,5H),7.07(d,J＝8.5Hz,2H),7.00(d,J＝7.0Hz,2H),6.90(d,J＝9.0Hz,2H),6.81(d,J＝9.0Hz,2H),6.71(d,J＝8.5Hz,2H),6.64(d,J＝8.5Hz,2H),3.68(s,3H),3.64(s,3H),3.26(m,1H),1.08(d,J＝6.5Hz,6H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ168.7,158.4,146.5,143.5,141.6,138.2,135.5,135.4,132.6,132.5,132.3,131.2,131.1,129.3,128.4,127.2,113.6,113.5,85.9,60.2,55.4,55.3,49.0,36.2,29.4,22.5,20.5,14.4；MS(ESI)计算值[M+Na]+:533.22,实测值:533.20.
将化合物3c(34mg，0.06mmol)，丙二腈(15mg，0.20mmol)和乙酸铵(30mg，0.38mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和甲醇(1mL)的混合物中。然后将硅胶(475mg)加入到上述混合物中，并在减压下除去溶剂。将所得混合物在100℃下加热7.5小时。将混合物冷却，随后用色谱法(己烷/乙酸乙酯＝20/1)分离，得到4c，为浅黄色固体(9.0mg，33.3％产率)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.17(m,2H),7.12(m,1H),7.03-7.07(m,4H),6.99(dd,J1＝1.5Hz,J2＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝9.0Hz,2H),6.80(d,J＝8.5Hz,2H),6.71(d,J＝9.0Hz,2H),6.61(d,J＝8.5Hz,2H),3.68(s,3H),3.64(s,3H),1.24(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ158.3,158.2,145.5,143.5,141.3,138.3,135.6,135.5,132.6,132.5,131.0,128.4,126.8,126.2,113.6,113.5,87.1,55.4,55.3,29.3；MS(ESI)计算值[M+Na]+:547.23,实测值:547.20.
向化合物2(87mg，0.2mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入丙二腈(25mg，0.8mmol)和三乙胺(10mg，0.1mmol)。将所得混合物在室温下搅拌4小时。然后减压除去溶剂。将期望的残余物用色谱法纯化，得到产物，为紫色固体(79mg，85.0％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.63(d,J＝8.4Hz,2H),7.57(s,1H),7.13-7.16(m,5H),7.01(m,2H),6.92-6.95(m,4H),6.63-6.68(m,4H),3.76(s,3H),3.74(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ159.0,158.8,158.6,152.0,143.5,143.1,137.4,135.4,135.3,132.7,132.6,132.5,131.3,130.3,128.5,128.0,126.7,114.1,113.4,113.0,112.9,80.8,55.1,55.0.
向化合物2(170mg，0.4mmol)在乙醇(8mL)中的溶液中加入丙二腈(54mg，0.8mmol)。将所得混合物回流12小时。然后减压除去溶剂。将期望的残余物用色谱法纯化，得到产物，为紫色固体(143mg，72.6％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.65(d,J＝8.8Hz,2H),7.60(s,1H),7.10-7.16(m,5H),7.04(m,2H),6.90(d,J1＝8.8Hz,J2＝2.0Hz,4H),6.48(m,4H),2.93(s,6H),2.90(s,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ159.1,153.5,149.5,149.2,145.3,144.3,134.9,132.8,132.7,132.6,131.6,131.0,130.3,127.9,127.8,126.1,114.4,113.2,111.3,111.0,79.6,40.2.
在0℃下向化合物2a(0.18g，0.34mmol)和丙二腈(30mg，0.45mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中缓慢加入四氯化钛(0.13mL，1.2mmol)。将反应混合物搅拌30分钟后，注射吡啶(0.10mL，1.2mmol)，再搅拌30分钟。然后将混合物在40℃加热4小时。将混合物冷却至室温后，通过水(10mL)淬灭反应，并将混合物用二氯甲烷萃取。将收集的有机层用盐水(20mL)洗涤，用MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝50/1-10/1)纯化所需残余物，得到所需产物，为红色固体(43mg，21.9％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49-7.66(m,4H),7.36(m,2H),7.27(m,2H),7.11-7.17(m,4H),6.99-7.05(m,4H),6.91-6.95(m,4H),6.80(d,J＝15.6Hz,1H),6.62-6.69(m,4H),3.73-3.77(m,6H).
向化合物4d(60mg，0.14mmol)在无水二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入丙炔酸(60mg，0.86mmol)，N，N'-二环己基碳二亚胺(64mg，0.32mmol)和二甲基氨基吡啶(36mg，0.3mmol)。将反应混合物在相同温度下搅拌1小时，然后在室温下搅拌1.5小时。将反应物过滤以除去未溶解的固体，并将滤液用水(20mL)洗涤两次，用盐水(20mL)洗涤一次，并用亚硫酸钠干燥。通过过滤收集有机相并在减压下浓缩。残余物用色谱法纯化，得到所需的产物3(15mg，19.2％)，为黄色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.33-7.35(m,2H),7.11-7.16(m,5H),6.98-7.05(m,6H),6.91-6.95(m,4H),3.06(s,1H),3.04(s,1H),2.58(s,3H)；HRMS(ESI)计算值[M+Na]+:581.1477,实测值:581.1483.
向化合物4c(40mg，0.083mmol)在异丙醇(5ml)中的溶液中加入化合物1(30mg，0.11mmol)和哌啶(0.68mg，0.008mmol)。将所得溶液回流24小时。然后减压除去溶剂。将期望的残余物用色谱法(己烷：乙酸乙酯＝5:1)纯化，得到红色油状物。将该油状物用二氯甲烷(5ml)和三氟乙酸(1ml)的混合物进一步处理8小时。减压除去溶剂。残余物用反相HPLC纯化，使用乙腈和水作为流动相，得到所需产物(黄色固体，12mg，23.0％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(brs,2H),7.63(d,J＝8.8Hz,2H),7.40(d,J＝15.2Hz,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.13-7.20(m,2H),7.15(m,3H),7.02-7.06(m,4H),6.87-6.92(m,4H),6.67-6.73(m,5H),4.16(d,J＝6.0Hz,2H),3.68(s,6H),2.95-3.00(m,2H),2.00-2.04(m,2H)；13CNMR(120MHz,DMSO-d6)δ170.8,161.3,157.9,148.5,146.8,142.9,141.4,137.8,135.2,135.0,132.2,132.0,131.0,130.8,130.7,128.6,128.0,126.9,126.5,121.9,115.3,113.2,113.1,79.2,65.0,54.9(d),26.7；MS(ESI)计算值[M+H]+:644.2913,实测值:644.2926.
向化合物4c(40mg，0.083mmol)在异丙醇(5ml)中的溶液中加入化合物1(30mg，0.11mmol)和哌啶(0.68mg，0.008mmol)。将所得溶液回流24小时。然后在减压下除去溶剂。将期望的残余物用色谱法(己烷：乙酸乙酯＝5:1)纯化，得到红色油状的产物(15mg，27.3％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.48(d,J＝9.0Hz,2H),7.42(d,J＝15.5Hz,1H),7.08-7.18(m,9H),6.91-6.98(m,6H),6.76(d,J＝15.5Hz,1H),6.69(d,J＝8.5Hz,2H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),4.12(t,J＝6.0Hz,2H),3.76(s,3H),3.75(s,3H),3.55(t,J＝6.5Hz,2H),2.08(m,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ171.2,161.6,158.5,158.4,148.8,148.7,143.2,142.0,138.0,135.7,135.5,132.7,132.5,131.7,131.3,130.8,128.4,127.9,127.4,126.5,122.3,115.1,113.2,113.0,80.1,64.8,55.2,55.1,48.0,28.6.
将化合物10(20mg，0.03mmol)，丙二腈(21mg，0.32mmol)和乙酸铵(36mg，0.46mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和甲醇(1mL)的混合物中。然后将硅胶(404mg)加入到上述混合物中，并在减压下除去溶剂。将所得混合物在100℃加热40分钟。将混合物冷却，随后用色谱法(己烷/乙酸乙酯(v/v)＝20/1)分离，得到所需产物，为橙色固体(16mg，74.0％产率)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.33(d,J＝8.5Hz,2H),7.14(m,5H),7.01(m,2H),6.92(dd,J1＝3.0Hz,J2＝8.5Hz,4H),6.64(d,J＝8.5Hz,2H),6.62(d,J＝9.0Hz,2H),3.93(q,J＝6.0Hz,4H),3.48(dt,J1＝3.0Hz,J2＝7.0Hz,4H),2.57(s,3H),2.01-2.05(m,4H),1.89-1.91(m,4H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ174.4,157.9,157.7,149.2,143.3,142.5,137.5,135.6,135.4,133.0,132.7,132.6,131.8,131.3,128.0,126.9,126.5,113.8,113.5,70.5,66.7,66.6,33.5,33.4,29.4,27.8,23.8；HRMS(ESI-)计算值[M-H]-:721.1071，实测值:721.1046.
向化合物11(16mg，0.022mmol)在乙腈(5mL)中的溶液中加入三苯基膦(64mg，0.24mmol)。将所得混合物回流48小时。然后减压除去溶剂。残余物用己烷(10mL)洗涤，剩余的残余物用HPLC纯化，得到产物12(3mg，橙色油),1H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ7.90(q,J＝7.0Hz,3H),7.81-7.71(m,12H),7.42(d,J＝8.5Hz,1H),7.36(d,J＝8.5Hz,1H),7.14(m,5H),7.01(d,J＝7.0Hz,1H),6.89-6.93(m,4H),6.60-6.68(m,4H),4.00(q,J＝5.5Hz,2H),3.94(m,2H),3.51(q,J＝7.0Hz,2H),3.44(m,2H),2.58(s,1.5H),2.55(s,1.5H),1.97-2.03(m,4H),1.88(m,4H)；HRMS(ESI)m/z:905.2900(Calcd for[M-Br]+:905.2866)；和产物13(5mg,橙色油)，1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.90(t,J＝7.5Hz,6H),7.80-7.71(m,24H),7.47(d,J＝8.5Hz,6H),7.06-7.17(m,3H),7.07(d,J＝8.0Hz,2H),6.98(d,J＝7.0Hz,2H),6.86(dd,J1＝2.5Hz,J2＝8.5Hz,4H),6.65(d,J＝8.0Hz,4H),3.95-3.90(m,4H),2.53(s,3H),1.86(m,4H),1.66(m,4H)；HRMS(ESI)m/z实测值:544.2281(计算值[M-2Br]2+:544.2294).
将化合物14(25mg，0.05mmol)，丙二腈(15mg，0.20mmol)和乙酸铵(20mg，0.26mmol)溶于二氯甲烷(5mL)和甲醇(1mL)的混合物中。然后向上述混合物中加入硅胶(300mg)。减压除去溶剂后，将所得混合物在100℃加热40分钟。将混合物冷却，随后用柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝20/1)分离，得到所需产物(19mg，61.2％产率)，为红橙色油状物。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.50(d,J＝8.5Hz,2H),7.09-7.19(m,5H),7.00(m,2H),6.89(dd,J1＝2.0Hz,J2＝8.5Hz,4H),6.70-6.73(m,4H),3.96(t,J＝6.0Hz,4H),3.49(dt,J1＝2.5Hz,J2＝6.5Hz,4H),2.56(s,3H),1.91-1.96(m,4H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ176.4,157.7,157.5,148.5,143.5,142.1,138.0,135.7,135.6,133.8,132.5,132.4,131.4,131.2,128.5,127.9,127.0,114,3,114.1,113.9,82.9,64.9,48.1,28.6,28.5,24.3；HRMS(EI)计算值[M]+:620.2648,实测值:620.2634.
在0℃下向化合物17(0.26g，0.52mmol)和丙二腈(45mg，0.68mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中缓慢加入四氯化钛(0.20mL，1.8mmol)。将反应混合物搅拌30分钟后，注射吡啶(0.15mL，1.8mmol)并再搅拌30分钟。然后将混合物在40℃加热4小时。将混合物冷却至室温后，通过水(10mL)淬灭反应，并将混合物用二氯甲烷萃取。将收集的有机层用盐水(20mL)洗涤，用MgSO 4干燥并在减压下浓缩。通过柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝50/1-10/1)纯化所需残余物，得到所需产物，为红色固体(230mg，81.0％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(dd,J1＝1.2Hz,J2＝5.2Hz,1H),7.73(dd,J1＝1.2Hz,J2＝5.2Hz,1H),7.13-7.22(m,8H),7.06(m,2H),8.91-8.98(m,4H),8.64-8.68(m,4H),3.75(s,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ164.8,158.6,158.4,148.7,143.2,142.4,138.7,137.7,136.1,135.7,135.5,133.5,132.6,132.5,131.5,131.3,129.1,128.8,127.9,126.5,114.5,113.8,113.2,113.0,55.1,55.0.MS(EI)计算值[M]+:550.1709,实测值:550.1708.
向化合物20(28mg，0.04mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入三氟乙酸(1mL)。将所得混合物在室温下搅拌6小时。然后将混合物减压浓缩，得到产物(10.0mg，红色固体，43.4％产率)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.27(dd,J1＝1.0Hz,J2＝5.0Hz,1H),7.77(brs,3H),7.67(dd,J1＝1.5Hz,J2＝4.0Hz,1H),7.38(dd,J1＝4.0Hz,J2＝5.0Hz,1H),7.35(m,2H),7.17-7.20(m,2H),7.10-7.14(m,3H),7.01-7.03(m,2H),6.84-6.90(m,4H),6.68-6.72(m,4H),3.96(t,J＝6.0Hz,2H),3.68(s,3H),2.95(m,2H),1.98(m,2H)；HRMS(ESI)计算值[M+H]+:594.2210,实测值:594.2215.
向化合物22(30mg，0.04mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入三氟乙酸(1mL)。将所得混合物在室温下搅拌6小时。然后将混合物减压浓缩，得到产物(17.0mg，红色固体，56.6％产率)。MS(ESI)计算值[M+H]+:633.24,实测值:634.20.
将化合物24(48mg，0.064mmol)溶解在甲苯(10mL)中。将所得溶液回流24小时。然后减压除去溶剂。将期望的残余物用色谱法(己烷/乙酸乙酯＝50/1-5/1)纯化，得到所需的产物，为红色固体(36mg，83.7％)。HRMS(ESI)计算值[M+Na]+:696.1927,实测值:696.1937。
单线态氧(1O2)量子产率的测定
用1O2敏感指示剂，9,10-蒽二基-双(亚甲基)二山梨酸(ABDA)作为1O2捕获剂，用玫瑰红(RB)作为标准光敏剂。在这些实验中，向1mL样品溶液中加入10μL ABDA溶液(2M)，并且使用功率密度为0.25W cm-2的白光(400-800nm)作为照射源。在不同的照射时间记录ABDA在378nm的吸光度，以获得光敏过程的衰减速率。使用以下公式计算PS在水中的1O2量子产率(ФPS)：
KPS和KRB分别是由光敏剂和玫瑰红引起的光敏过程的衰减速率。APS和ARB分别表示由光敏剂和玫瑰红所吸收的光，它们是通过计算光敏剂和玫瑰红吸收曲线下400-800nm下的积分而得到。ФRB是玫瑰红的1O2量子产率，它在水中为0.75。
为了评估PPDC，TPPDC和TPDC产生1O2的能力，使用商业的ABDA作为1O2的敏感指示剂，并且使用玫瑰红作为标准光敏剂(其在水中的1O2量子产率ФRB＝0.75)。在存在PS或RB的情况下和白光照射下，ABDA溶液在378nm的吸光度随着照射时间延长而降低，表明ABDA被PS产生的1O2降解。在这些化合物中，在白光区域具有最小的吸收积分面积(4.68)的PPDC表现出最大的ABDA降解率(0.0032)，而TPPDC和TPDC的降解率为0.0018和0.0013。因此，PPDC，TPPDC和TPDC的1O2量子产率分别计算为0.89,0.32和0.28。这些结果与基于eq(1)的预测相吻合。
光动力疗法
在黑暗条件下的低细胞毒性，但在暴露于光照射下的高毒性的纳米颗粒在光疗法中非常有用。TAT-TPDC NP和TAT-PPDC NP的治疗效果的定量评价通过标准的MTT来测定。首先评价HeLa细胞在与TAT-TPDC NP和TAT-PPDC NP在黑暗条件下温育时的细胞毒性。孵育24小时后，在黑暗中没有观察到显著的细胞毒性。然而，在暴露于光照射后，在HeLa细胞中观察到剂量依赖的细胞毒性。TAT-TPDC纳米颗粒和TAT-PPDC纳米颗粒对于HeLa细胞的半数最大抑制浓度(IC50)分别为3.44和1.28μg mL-1。相对于TAT-TPDC纳米颗粒，TAT-PPDC纳米颗粒的更低的IC50可以归因于光照射下更多ROS的产生。尽管该差异不如溶液研究中的显著，但是2.6倍低的IC50的差异在癌细胞抑制中已经相当大。此外，为了验证暴露时间和光功率依赖的PDT，TAT-TPDC纳米颗粒和TAT-PPDC的纳米颗粒培养的HeLa细胞用不同持续时间的或不同功率密度的光照射。对于两种纳米颗粒，更长的激光照射时间或更高的光功率密度会导致细胞活力抑制的增强。这些结果表明，光动力疗法的治疗效率可通过控制激光照射时间或光功率密度来调节。此外，在这两种情况下，TAT-PPDC纳米颗粒均显示出比TAT-TPDC纳米颗粒更强的细胞活力抑制。
然后通过用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的膜联蛋白V染色来研究用TAT-TPDC和TAT-PPDC纳米颗粒在光照后处理的HeLa细胞的凋亡途径。FITC标记的膜联蛋白V通常用来区分活细胞和凋亡的细胞，因为膜联蛋白V可以选择性地结合凋亡细胞的外部细胞质膜上的暴露的磷脂酰丝氨酸。在用TAT-TPDC纳米颗粒或TAT-PPDC纳米颗粒孵育HeLa细胞后并进行光照和FITC标记的膜联蛋白V染色，在细胞膜中可清楚地观察到归因于FITC的强绿色荧光，这表明细胞经历凋亡过程。另一方面，在黑暗条件下在相同的HeLa细胞中没有观察到绿色荧光信号，这表明TAT-TPDC纳米颗粒和TAT-PPDC纳米颗粒不引起可观察到的细胞毒性。
示例2
用于靶向和影像引导的癌细胞的光动力消除的具有AIE和可活化的光活性的特定点亮生物探针
在另一个示例性实施方案中，本发明是图2A所示的用于影像指导的光动力消除癌细胞的可活化光敏剂。图2A示出了可功能化的TPE衍生物TPECM-2N3和生物探针TPECM-2GFLGD3-cRGD的合成路线。
组织蛋白酶B是在许多类型的肿瘤中过表达的溶酶体蛋白酶。它可以特异性切割含有-Gly-Phe-Leu-Gly-(GFLG)肽序列的底物，并已用于酶响应药物输送。另一方面，可以选择性地与在癌细胞中过表达的avb3整合素相互作用的环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)已经用于靶向药物递送。
在一个示例性实施方案中，探针由四个部分组成：1)作为造影剂和光敏剂的具有橙色荧光的AIE荧光剂，2)响应组织蛋白酶B的GFLG肽底物，3)具有三个Asp(D)单元以增加探针的亲水性，和4)cRGD-靶向部分。该探针被称为荧光染料1。由于自由分子内运动消耗了激发态能量，探针几乎是无荧光发射的，在水性介质中具有非常低的ROS产生能力。被癌细胞摄取之后，组织蛋白酶B对GFLG底物的切割将导致增强的荧光信号输出，同时产生可用于影像引导的PDT的活化光活性。因此，探针设计提供了开发可激活的PS而不引入任何淬灭剂或能量受体的良好机会。然后在由肿瘤相关刺激激活时在聚集态中观察到增强的荧光和光毒性。图2B示出了被组织蛋白酶B激活的探针具有荧光“开启”和激活的光活性，从而在用光照射时产生活性氧族(ROS)。
荧光体1在聚集状态下显示橙红色发射，并且可以被405和457nm激发光激发。在光照射下，使用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)和2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFDA)作为ROS指示剂，研究了AIE荧光体1的ROS产生能力。DPBF可以容易地与ROS进行1,4-环加成反应，这导致在418nm处的吸光度降低，而DCFDA是非荧光的，但可以被ROS快速氧化为荧光分子二氯荧光素(DCF)。
为了证明细胞特异性点亮成像，将探针与过表达avb3整合素的MDA-MB-231细胞温育，并使用MCF-7和293T细胞作为阴性对照。与探针温育时，MDA-MB-231细胞中的红色荧光随着孵育时间增加而逐渐增强(如图3A所示)。探针在细胞中的特异性荧光点亮还通过流式细胞术分析得到了证实，揭示了MDA-MB-231细胞受体介导的探针摄取。此外，当探针在较高浓度下温育时，细胞中的荧光强度增强，因此表明可在细胞内半定量活化的AIE探针(如图3A-C所示)。
图3A-F是以下细胞的共聚焦图像：A)MDA-MB-231细胞(蓝色和红色)，B)MCF-7细胞(蓝色)，C)293T细胞(蓝色)，D)用游离的c-RGD预处理的细胞MDA-MB-231(蓝色和红色)，E)用CA-074-Me预处理的MDA-MB-231细胞(蓝色和红色)，和F)在探针(5mm)与细胞孵育4小时之前，用cRGD和CA-074-Me预处理细胞MDA-MB-231(蓝色)。蓝色荧光来自用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；激发光波长＝405nm；发射光波长＝430-470nm)染色的细胞核，红色荧光来自探针(激发光波长＝405nm；发射光波长>560nm)。所有图像有相同的比例尺(20μm)。
示例3
线粒体靶向的具有聚集诱导发光特点的分子探针介导的影像指导的化学疗法和光动力疗法的组合
在另一个示例性实施方案中，本发明是具有零个，一个或两个三苯基鏻配体的AIE探针，此探针能够选择性靶向线粒体。具有零个三苯基鏻配体的探针示例性实施方案是TPECM-2Br，其由以下结构表示：
TPECM-2Br
具有一个三苯基鏻配体的探针示例性实施方案是TPECM-1TPP，其由以下结构表示：
TPECM-1TPP
具有两个三苯基鏻配体的探针示例性实施方案是TPECM-1TPP，其由以下结构表示：
TPECM-2TPP
上述化合物的合成路线如图5所示。
选择亲脂性三苯基鏻作为线粒体靶向部分并与TPECM-2Br缀合，因为它具有离域正电荷并且可通过跨膜电位梯度选择性地累积在癌细胞线粒体中。所得到的TPECM-1TPP和TPECM-2TPP在水性介质中几乎不发光，但是它们在聚集状态下发射很强的红色荧光。TPECM-2TPP发现能够去线性线粒体膜电位并选择性地对癌细胞施加有力的化学细胞毒性。此外，探针在光照时可以有效地产生具有强光毒性的反应性单线态氧，进一步增强了它的抗癌效果。
TPECM-2Br，TPECM-1TPP和TPECM-2TPP探针的合成如图4C所示。两种不同的二苯甲酮衍生物在Zn和TiCl4的存在下反应得到1，产率为27.2％。随后1用n-BuLi和DMF处理，得到2，产率为59.7％。2首先与格氏试剂反应，所得的仲醇进一步氧化产生3，产率为61.5％。3随后用三溴化硼处理，随后与4-二溴丁烷反应得到4，产率为13.5％。吸附在硅胶上的4，乙酸铵和丙二腈的混合物在100℃下加热40分钟，得到TPECM-2Br，产率为74.0％。然后TPECM-2Br与三苯基膦反应，产生TPECM-1TPP，产率为13.8％，和TPECM-2TPP，产率为18.2％。纯化的中间体和产物通过NMR和质谱得到充分表征，结果证实了它们具有高纯度的正确结构。
TPECM-2Br的光物理性质如下。TPECM-2Br在DMSO/水(v/v＝1：199)中于410nm处具有最大吸收。TPECM-2Br的光致发光(PL)光谱是在具有不同水分数(fw)的DMSO/水混合物中研究的。TPECM-2Br在DMSO中发出微弱的荧光。然而，随着fw的逐渐增加，TPECM-2Br发出很强的荧光，其在628nm具有发射最大值，显示出经典的AIE现象。在DMSO/水(v/v＝1：199)中，TPECM-1TPP和TPECM-2TPP与TPECM-2Br具有类似的吸收曲线。然而，它们在水中的发射光谱确大不相同。为了测试TPECM-1TPP和TPECM-2TPP的AIE特性，己烷和异丙醇的混合溶液用来研究它们的荧光信号。当己烷的体积分数逐渐增加至大于80％时，TPECM-1TPP和TPECM-2TPP发出很强的荧光，并且激光散射(LLS)也证实纳米聚集体的形成。这些结果表明所有三种探针都具有AIE活性。
此外，TPECM-1TPP还发现能够显现由光照射诱导的高氧化应激下的线粒体形态变化。在黑暗条件下，TPECM-1TPP处理的细胞的线粒体是管状的。但在白光照射后，线粒体变为小圆形。线粒体肿胀是表明线粒体膜电位的去极化的另一个证据。因此，TPECM-1TPP不仅是良好的PS，而且是在PDT期间监测线粒体形态学变化的成像工具。
图6显示的是HeLa细胞与100nM的线粒体绿色跟踪剂和2μM的TPECM-1TPP(A-D)，TPECM-2TPP(F-I)和TPECM-2Br(K-N)孵育后的共聚焦图像。图6A，6F和6K中的绿色荧光来自线粒体绿色跟踪剂，λex＝488nm和λem＝520nm±20nm，图6B，6G和6L中的红色荧光来自不同的探针，λex＝405nm，λem>560nm长通滤波器。所有图像具有相同的比例尺20微米。在HeLa细胞线粒体中共定位散点图分别为TPECM-1TPP(E)，TPECM-2TPP(J)和TPECM-2Br(O)。
TPECM-2Br，TPECM-1TPP和TPECM-2TPP的细胞内定位
HeLa细胞在腔室(LAB-TEK，Chambered Coverglass System)中以5×105/mL的密度培养18小时。除去培养基，并用PBS冲洗细胞。HeLa细胞与TPECM-2Br(2μM)，TPECM-1TPP(1,2和5μM)，TPECM-2TPP(1,2和5μM)在37℃下孵育3小时。对于共定位研究，用PBS洗涤细胞，加入200nM线粒体绿色跟踪剂并在37℃孵育45分钟。用PBS洗涤3次后，将细胞置于冰上，并通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，Zeiss LSM 410，Jena，Germany)成像。对于TPECM-2Br，TPECM-1TPP和TPECM-2TPP，激发光波长为405nm，滤光片带宽为560nm；对于线粒体绿色示踪剂成像，激发光波长为488nm，发射光滤光片带宽为510-560nm。
为了研究光诱导的线粒体形态变化，MDA-MB-231细胞在腔室中以5×105/mL的密度培养18小时。细胞与5μM的TPECM-1TPP在黑暗中孵育3小时后，将细胞用0.25W cm-2的功率密度照8分钟。然后细胞用200nM线粒体绿色示踪剂在37℃染色45分钟，并通过共焦激光扫描显微镜(CLSM，Zeiss LSM 410，Jena，Germany)立即成像。
图7显示的是在黑暗条件下(A-C)或光照条件下(0.1W cm-2，8分钟)(D-F)下用TPECM-1TPP(5μM)处理后的MDA-MB-231细胞的线粒体形态学变化。图A和D是来自线粒体绿色跟踪剂的图像，λex＝488nm；λem＝520nm±20nm。图B和E是来自TPECM-1TPP的图像，λex＝405nm；λex>560nm长通滤光片(红色)。C和F是来自线粒体绿色跟踪剂和TPECM-1TPP的重叠图像(黄色)。
图8是HeLa细胞经过各种处理后的图像。图A，D，G和J是共聚焦荧光图像；图B，E，H和K是明场图像；图C，F，I和L是共聚焦荧光和明场重叠的图像；所用的HeLa细胞最后都经过PI染色；图A，B，C是HeLa细胞没有与TPECM-2TPP孕育24小时后的图像；图D，E，F是HeLa细胞与1μM的TPECM-2TPP在黑暗条件下孕育24小时后的图像；图G，H，I是HeLa细胞在经过如下处理后的图像，细胞首先与1μM的TPECM-2TPP在黑暗条件下孕育3小时后，洗掉探针并用白光照射(8分钟，0.10W cm-2)，之后孕育24小时；图J，K，L是HeLa细胞在经过如下处理后的图像，细胞与1μM的TPECM-2TPP在黑暗条件下孕育3小时后，洗掉探针且用维生素C预处理(100μM，15分钟)，之后用白光照射(8分钟，0.10W cm-2)，然后孕育24小时。
示例4
光激活的AIE聚合物：内含体/溶酶体逃逸和DNA拆包的并发
在另一个实施方案中，开发了一种用于影像引导的和时空控制的基因递送的ROS响应的聚合物。该聚合物含有通过ROS可裂解的氨基丙烯酸酯(AA)连接物与低聚乙烯亚胺(OEI)(800Da)共轭的AIE光敏剂。选择低分子量OEI作为聚合物嵌段，因为它们具有比高分子量的PEI更低的毒性，并且OEI缀合物显示出良好的DNA结合能力。PEG进一步接入以微调聚合物的水溶性。聚合物可以在水性介质中自组装成纳米颗粒(NP)而具有明亮的红色荧光，它能通过静电相互作用结合DNA。在单一光照射下，所产生的ROS可以通过破坏内吞/溶酶体的膜而促进载体从内吞/溶酶体中逃逸。同时，ROS也破坏聚合物而使高分子量复合物回复到它们低分子量的对应物，从而导致快速的DNA解包。这项工作表明了一个有前途的时空控制和影像引导的平台，其能做到内含体/溶酶体逃脱和DNA解包的并发，而这是有效的基因递送不可或缺的步骤。
图9显示的是并不是局限在理论上的ROS响应的聚合物的合成路线。在光照下，TPECM可以产生ROS以切割ROS响应性片段，导致聚合物的破坏。两亲性P(TPECM-AA-OEI)-g-mPEG可以在水性介质中自组装以形成ROS敏感的NP(表示为S-NP)，S-NP通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜得到研究。S-NP显示具有直径为134±12nm的球形形态。S-NP的吸收和发射光谱的峰值分别为410nm和615nm。没有ROS响应片段的对照聚合物P(TPECM-OEI)-g-mPEG也通过自组装合成，得到的纳米颗粒表示为S-NP。
光照射下S-NP和inS-NP产生ROS的能力通过二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)作为指示剂来评价。DCF-DA是非荧光的，但它可以被ROS快速氧化而产生荧光的二氯荧光素(DCF)。
图10A-F4是细胞的影像图片。(A)用S-NP/DNA(A1，Ex：405nm，Em：>560nm)和溶酶体绿色追踪剂(A2，Ex：488nm，Em：505-525nm)染色的HeLa细胞的共聚焦激光扫描显微镜的图像；(A3)图像A1和A2的重叠；(A4)感兴趣区域的强度分布(图像A3中的圆圈区域)。(B)用S-NP/YOYO-1-DNA复合物温育HeLa细胞的共聚焦激光扫描显微镜的图像，(B1)在黑暗条件下孕育；(B2)用光照射2分钟；(B3)用光照射5分钟；(B4)在VC存在下用光照射5分钟。绿色为YOYO-1的荧光(Ex：488nm；Em：505-525nm)；红色为S-NPs的荧光(Ex：405nm；Em：>560nm)。黄色为红色和绿色像素的共定位。(C)不同处理后YOYO-1和S-NPs的荧光的共定位比率的变化。(D)用氯喹(CQ)预处理后HeLa细胞与S-NPs/YOYO-1-DNA在黑暗中孕育(D1)或者光照5分钟(D2)后的共聚焦激光扫描显微镜的图像。(E)用氯喹(CQ)预处理后HeLa细胞与inS-NPs/YOYO-1-DNA在黑暗中孕育(E1)或者光照5分钟(E2)后的共聚焦激光扫描显微镜的图像。(F)在一下不同处理并进一步4小时孵育后显示YOYO-1-DNA在HeLa细胞中定位的共聚焦激光扫描显微镜的图像。F1，S-NPs/DNA在黑暗中与HeLa细胞孕育；F2，S-NPs/DNA在光照下与HeLa细胞孕育；F3，S-NPs/DNA在VC存在和光照下与HeLa细胞孕育；F4，inS-NPs/DNA在光照下与HeLa细胞孕育。绿色为YOYO-1荧光(Ex：488nm；Em：505-525nm)；红色为DRAQ5染色的细胞核(Ex：633nm；Em：>650nm)；黄色为红色和绿色像素的共定位。所有图像具有相同的10μm的比例尺。
随后通过共聚焦激光扫描显微术(CLSM)来评价S-NPs/DNA复合物的细胞内运输过程。将人宫颈癌HeLa细胞与S-NPs/DNA孵育4小时，并用内含体/溶酶体选择标记物溶酶体绿色追踪剂DND-26共染色。如图10A3和10A4所示，来自复合物的红色荧光与来自DND-26的绿色荧光良好地共定位，表明复合物被包埋在内含体/溶酶体中。
首先用DCF-DA作为指示剂证实S-NPs/DNA在HeLa细胞中能够产生ROS。当细胞与S-NPs/YOYO-1-DNA在黑暗中孵育时，S-NPs的红色荧光和YOYO-1标记的DNA的绿色荧光大部分重叠为黄色点(图10B1)。然而，在光照射下，细胞表现出绿色与红色荧光的分离(图10B)，这表明光诱导的细胞内的DNA释放。未包装的DNA扩散到整个细胞质，这表明其从内体/溶酶体中成功逃脱。
向化合物4e(上文)(0.054mmol)在THF(0.75mL)的溶液中加入4-哌啶甲醇(12.3mg，0.108mmol)。将混合物在室温下搅拌1小时，不经进一步纯化直接用于下一步骤。HRMS(ESI)计算值[M+Na]+：811.3472，实测值：811.3492。
聚合物P(TPECM-AA-OEI)-g-mPEG的合成
聚合物的制备根据之前报道的过程。将化合物4z(10mg，12.7μmol)和CDI(8.2mg，50.7μmol)溶于0.2mL无水DMF中。将混合物在室温下在氮气下搅拌1小时，然后在冷乙醚中沉淀两次。将所得产物离心，再溶解于1mL无水DMSO中，并在DIPEA(10μL)存在下在剧烈搅拌下迅速加入到OEI800(7.6mg，12.7μmol)在DMSO(1mL)中的溶液中。反应进行5小时后，在N2保护下加入无水DMSO(0.5mL)中的mPEG-NHS(12.7mg，6.3μmol)，将混合物在室温下搅拌24小时。反应后，将混合物用去离子(DI)水透析(截留分子量为8,000Da，SpectrumLaboratories，Rancho Dominguez，CA，USA)。冷冻干燥后得到聚合物P(TPECM-AA-OEI)-g-mPEG，为黄色粉末(13.3mg，43％)。Check CDI and DIPEA define according toProf.Liu’s advice
YOYO-1对S-NPs/DNA(N/P比20)中游离DNA的研究
首先染料YOYO-1的碘化物以1:50的染料/碱基比率在室温下与DNA孵育2小时以对DNA进行标记。4YOYO-1标记的DNA与纳米颗粒以N/P比为20形成复合物。然后复合物转移到石英比色皿中并用白光(50mW cm-2)照射特定时间。在488nm激发并在509nm收集发射，YOYO-1的荧光不同持续时间的光照射后得到测量。然后将光照射不同时间后S-NPs/DNA中YOYO-1的荧光与游离YOYO-1标记的DNA的荧光强度进行比较。
检测溶液中纳米颗粒产生的活性氧
根据文献报道，我们使用活性氧敏感指示剂二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)来检测光照射时活性氧的产生。5为了将DCF-DA转化为二氯荧光素，0.5毫升1毫摩尔的DCF-DA的乙醇溶液加入到2毫升的0.01N氢氧化钠中，并在室温下搅拌30分钟。随后，加入10毫升酸碱度(pH)为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中和水解产物，并储存在冰上直至使用。溶有纳米颗粒(0.1毫克每毫升)的上述溶液将被暴露在功率密度为50毫瓦每平方厘米的光下。在488纳米激发下，采集溶液中二氯荧光素的在500到600纳米范围内的荧光变化。将二氯荧光素在530nm处的荧光强度(λmax)随光照时间的变化作图。
共聚焦成像.
HeLa细胞在37℃下在8孔培养皿中培养。当细胞密度达到80％时，培养基被移除，并用1×PBS缓冲液洗涤细胞两次。随后将HeLa细胞在S-NPs和YOYO-1-DNA形成的复合物(N/P比20)中孵育4小时后，更新过新鲜培养基的细胞被暴露在功率密度为50毫瓦每平方厘米的光下，并照射不同的时间间隔。对于其中一些对照组，根据Biostatus标准用DRAQ5对细胞核进行活体染色。对于S-NPs检测，激发光为405nm，并且发射在560nm以上的荧光将被收集；对于YOYO-1检测，激发光为488nm，发射滤光片荧光收集范围为505-525nm；对于DRAQ5检测，激发光为633nm，发射荧光收集范围为650nm以上。对于溶酶体膜损伤研究，用S-NPs和未标记的DNA以上述完全相同的程序孵育HeLa细胞，并用吖啶橙(AO，5微摩)染色10分钟，然后用1x PBS洗涤两次。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM,Zeiss LSM 410,Jena,Germany)立即对细胞成像。激发为488nm，发射滤光片为505-525nm(绿色)和610-640nm(红色)。最后通过Image J 1.43程序(由NIH开发，http://rsbweb.nih.gov/ij/)分析图像。
脱氧核糖核酸转染.
将HeLa细胞以每孔5×104个细胞密度接种在24孔板上，并在转染研究前孵育24小时。然后用不含牛血清蛋白的DMEM培养基替换培养基，并向其中加入以带有编码eGFP的质粒脱氧核糖核酸(DNA)的S-NPs(N/P比为20，DNA密度为5微克每毫升)。对于PEI25K/DNA复合物，N/P比为10。在细胞孵育4小时后，将培养基更换为新鲜培养基，并且用白光(功率密度为50毫瓦每平方厘米)照射细胞5分钟。随后，将HeLa细胞在含有10％牛血清蛋白的新鲜培养基中再孵育44小时，然后使用流式细胞术(DakoCytomation)和共聚焦显微镜评估绿色荧光单板(GFP)的表达。对于流式细胞术，通过计数10,000个事件来测定平均荧光。
细胞毒性研究.
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)被用来评估HeLa细胞的代谢活性。将细胞以1×104个细胞每孔的密度接种在96孔板(Costar，IL，USA)中。在孵育24小时后，用N/P比率为20的S-NPs/DNA复合物或N/P比率为10的PEI25K/DNA复合物代替旧培养基。在37℃下孵育4小时后，用1×PBS洗涤细胞两次，然后将细胞暴露在功率密度为50毫瓦每平方厘米的光下照射5分钟。随后，将细胞进一步孵育44小时并用1×PBS洗涤细胞两次。紧接着向每个孔中加入含有100微升新鲜制备的MTT(0.5毫克每毫升)溶液的培养基。37℃下孵育HeLa细胞3小时后，小心除去MTT溶液，再向每个孔中加入100微升二甲基亚砜(DMSO)，轻轻晃动培养板使其溶解所有析出的沉淀。通过酶标仪(Genios Tecan)监测MTT在570nm的吸光度。通过用S-NPs/DNA孵育的细胞的吸光度与仅用培养基孵育的细胞的吸光度的比率来表示细胞活力。
案例5
基于聚集诱导发光的荧光响应探针在活细胞和细胞核成像以及细胞靶向成像中的应用
另一个发明是设计具有细胞核靶向能力的基于聚集诱导发光的荧光探针。具体而言，此探针能够选择性点亮HT-29细胞。作为概念的证明，我们选取了典型的聚集诱导发光分子TPE作为荧光信号源，并选取具有核定位信号(NLS)的水溶性细胞穿透多肽作为靶向集团。此多肽衍生自转录的反式激活因子(TAT)病毒蛋白，其肽序列为Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(SEQ ID NO:5)，富含带正电荷的精氨酸和组氨酸，有利于细胞吸收。此荧光探针具有良好的水溶性，并可以通过与核组分例如核酸和核蛋白结合而在细胞核中显示荧光信号响应。此外，通过与细胞靶向肽的结合也可用于设计特定类型细胞成像的点亮探针。
点击化学合成TPE-NLS分子探针.
将根据之前的报道成功制备的叠氮官能化的四苯乙烯(TPE-N3)(3.5mg，9μmol)和A-NLS(10mg，6.8μmol)溶于DMSO中。再将溶于Milli-Q水中的抗坏血酸钠(0.7mg，3μmol)和硫酸铜(0.3mg，1.5μmol)加入到DMSO混合物中以引发点击化学。此点击化学反应在室温下进行天，产物由高效液相色谱仪(HPLC)纯化，产率约50％，并通过LCMS-IT TOF和1H NMR表征。IT-TOF-MS:m/z[M+3H]3+calc.622.037,found 622.038.1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ:8.29(b,1H),8.15(b,2H)8.04–7.97(m,6H),7.85(s,1H),7.77–7.63(m,13H),7.43(s,1H),7.34(s,1H),7.13–7.08(m,12H),7.02-7.01(m,2H),6.96–6.91(m,9H),5.44(s,2H),4.24–4.14(m,11H),3.08–3.07(m,13H),2.73(b,4H),2.97(m,22H),1.64–1.22(m,34H).
细胞培养.
37摄氏度下在二氧化碳含量为5％的加湿环境下，用含有10％胎牛血清蛋白和1％青霉素链霉素的培养液孵育MCF-7乳腺癌细胞，U87MG脑肿瘤细胞和SKBR-3。在实验开始前，细胞将被孵育到饱和。
TPE-NLS探针对细胞核成分的滴定.
在微孔板孔中用1×PBS缓冲液稀释TPE-NLS DMSO储备溶液。在每个孔中加入不同量的滴定剂中，包括杂交的双链DNA(dsDNA)，组蛋白和细胞核裂解物加入到溶液中。TPE-NLS的最终浓度保持为10微摩。在312nm激发下，溶液在480nm处的荧光强度将被记录下来
TPE-NLS的细胞毒性检测.
甲基噻唑基二苯基四唑溴化物(MTT)被用来评价MCF-7乳腺癌细胞的代谢活性。将MCF-7乳腺癌细胞分别以4×104个细胞/毫升的密度接种在96孔板中。孵育24小时后，用含有TPE-NLS(50μM)的不含胎牛血清蛋白的培养基替换旧培养基，然后将细胞分别孵育4、12和24小时。孵育完后，用1时。孵育缓冲液洗涤细胞两次，每个孔中加入含100μL新鲜制备的MTT(0.5mg/mL)溶液的培养基。在培养箱中孵育3小时后小心地除去MTT培养基溶液。然后将过滤的DMSO(100μL)加入每个孔中，将板在室温下轻轻摇动10分钟以溶解所有形成的沉淀。通过酶标仪(Genios Tecan)监测MTT在570nm的吸光度。通过用TPE-NLS温育的细胞的吸光度与仅用培养基温育的细胞的吸光度的比率来表示细胞活力。
点击化学反应合成TPE-GVH以及TPE-D5G探针。
根据用于合成TPE-NLS的类似方案，通过TPE-N3(2mg，5.2μmol)和炔-(Gly-Val-His-Leu-Gly-Tyr-Ala-THr)(SEQ ID NO:6)(6.9mg，7.8μmol)反应合成TPE-GVH；TPE-N3(2mg,5.2μmol)与炔-(Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Val-His-Leu-Gly-Tyr-Ala-Thr)(SEQ IDNO:7)(11mg，7.8μmol)反应合成TPE-D5V探针。此反应在室温下振荡进行天。经过HPLC纯化后，以和的产率获得探针产物TPE-GVH和TPE-D5G。最终产物通过制备型HPLC纯化，并通过HR-MS表征:m/z[M+2H]2+calc.909.8843,found 909.8805.
靶向细胞荧光成像.
在37℃环境下，将HT-29癌细胞，HeLa癌细胞和NIH-3T3纤维细胞孵育在8孔板中。当细胞达到80％饱和后，除去培养基，并用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液洗涤贴壁细胞两次。然后将含有TPE-GVH或TPE-D5G探针(1μM)的无胎牛血清培养基加入到8孔板中。在孵育4小时后，分别对于这三种细胞系，用1×PBS缓冲液洗涤细胞两次，并用于共聚焦成像。激发光源为405nm，荧光信号收集区间为430到605nm。
通过带有叠氮的TPE和带有炔的NLS多肽(炔-(Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)(SEQ ID NO:5)，ANLS)反应合成TPE-NLS。该反应在DMSO/水混合物中在抗坏血酸钠和CuSO4的催化下进行，粗产物通过HPLC纯化，TPE-NLS的合成路线如图11。
通过测量它们在相同浓度下的吸收和发射来研究TPE-NLS及其前体TPE-N3的光学性质。TPE-NLS探针和TPE-N3的最大吸收峰都在300-320nm内并且最大发射峰均为480nm左右，这是由于它们都含有TPE结构。。与TPE-NLS相比，TPE-N3的最大吸收的轻微红移是由于聚集体形成。如我们所预期的，由于TPE-NLS良好的水溶性，它在DMSO/水混合物中几乎是没有任何荧光的。相比之下，TPE-N3在相同的溶剂中具有强烈发射，这是因为在聚集状态它们的自由分子旋转被限制，从而产生聚集诱导发光现象。
图12说明在DMSO/1×PBS(1:99v/v中加入不同浓度的细胞组分dsDNA(A)，组蛋白(B)和核裂解物(C)时TPE-NLS(10μM)的荧光强度。λ的荧＝312nm，λλ312度。的nm。
另一方面，将组蛋白添加到TPE-NLS中也能够诱导产生显著的荧光增强(图12B)。LLS测量所示，TPE-NLS探针/组蛋白复合物的平均有效直径为238.7±38nm，但获得的信号比TPE-NLS探针/dsDNA复合物的信号弱得多。由于蛋白质在PBS缓冲液中具有正净电荷因此组蛋白和探针之间的相互作用被估计为主要是疏水性的。因此，除了导致TPE-NLS聚集的弱静电相互作用之外，探针也可能被蛋白质的疏水口袋吞噬，其限制其分子运动以激活聚集诱导发光机制。
案例6
用于靶向和可激活的光动力治疗，具有敏化剂活化和治疗反应的实时原位相应的点亮探针
在另一个示例性实施方案中，本发明是用具有光敏剂活化和治疗反应的实时和原位自我响应的双靶向探针。该探针可通过单一波长激发而得到多重细胞成像并可追踪癌细胞消融。探针可被细胞内谷胱甘肽(GSH)切割，从而诱导激活光敏剂以及细胞监测的红色荧光开启，并同时释放凋亡传感器。活化的光敏剂可以在光照射时产生活性氧以诱导细胞凋亡和半胱天冬酶的活化，其可以通过具有绿色荧光开启的探针监测。
图13是双靶向治疗诊断探针的原理示意图。(a)探针的化学结构。探针包含具有聚集诱导发射(AIE)特性的光敏剂/显像剂和用于原位的光动力学治疗反应的非侵入性自我响应的内置点亮凋亡传感器。(b)探针在水性介质中是没有荧光的，但是在通过受体介导的胞吞作用被癌细胞摄取后(1)，二硫酸盐基团可被细胞内的谷胱甘肽(GSH)还原切割从而释放具有红色荧光的光敏剂，以及仍然保持为关闭状态的细胞凋亡传感器(2)。光照射后，活化的光敏剂产生的活性氧(ROS)可以激活半胱天冬酶(3)，其可以作用于凋亡传感器以开启绿色荧光(4)。红色荧光可以用于图像引导的光动力治疗，而绿色荧光可以用于治疗响应成像。
探针设计原理。已知AIE荧光分子在聚集态中有显著荧光发射，但在分子溶解状态下则弱得多。原理是AIE分子的螺旋桨状结构和苯环的自由旋转可以激活AIE分子在溶解状态下的非辐射跃迁通道。而在聚集状态下，AIE分子内的旋转受到限制，辐射衰减通道被激活从而导致荧光开启。在与亲水官能团连接之后，可以减少AIE的荧光，这提供了开发不含任何猝灭剂部分的点亮探针的新可能性。如图13所示，探针由五种组分组成：(1)具有AIE特征的双功能红色发射四苯乙烯(TPE)衍生物，用作显像剂和光敏剂；(2)可以被癌细胞中高浓度的GSH切割的二硫酸盐基团；(3)可以被胱天蛋白酶-3/-7特异性切割的高度水溶性DEVD底物；(4)用于检测caspase-3/-7的具有绿色发射的AIE荧光素和(5)用于靶向具有过表达αvβ3整联蛋白的癌细胞的亲水性环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)。探针具有良好的水溶性并且在水性介质中显示非常弱的荧光，这是由于通过活性分子内旋转消耗激子能量。假设但不限于理论：探针可以通过受体介导的胞吞作用被αvβ3整联蛋白过表达的癌细胞选择性摄取，通过胞内GSH的切割，具有红色荧光的AIE光敏剂被活化同时凋亡传感器被释放。通过光照射，产生的活性氧可以诱导细胞凋亡并激活caspase-3/-7，其可以切割DEVD底物并导致TPS的绿色荧光。绿色荧光开启可以用于光动力治疗的治疗反应的实时自我报告。
TPETP-NH2的合成和异构体的鉴定。异构体的合成步骤示于图14中。用正丁基锂，硼酸三甲酯和酸处理化合物1，得到具有硼酸官能团的化合物2，其与酰氯进行钯催化偶合，得到化合物3。用TiCl4和丙二腈处理3以产生化合物带有氰基乙烯基的化合物4。随后用BBr3处理4以产生具有一个游离羟基的5。5和3-(Boc-氨基)丙基溴之间的反应产生化合物6。化合物1-6通过1H NMR，13C NMR和质谱进行表征。6与三氟乙酸(TFA)反应以除去Boc基团，得到顺式和反式异构体的混合物。在冷冻干燥后，将两种异构体用制备型高效液相色谱(HPLC)作为红色粉末分离。
探针的合成。根据本领域已知的方法制备双官能化叠氮化物四苯基噻咯(TPS-2N3)。通过CuSO4/抗坏血酸钠在DMSO/水混合物(v/v＝10/1)中催化TPS-2N3和炔官能化的cRGD或DEVD之间的双重“点击”反应，此反应合成了细胞凋亡探针DEVD-TPS-cRGD、经过HPLC纯化后得到该探针，产率为42％。通过HPLC和质量表征良好地表征DEVD-TPS-cRGD的纯度和特性。此外，在N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)的存在下，二硫双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)与TPETP-NH2和胺官能化的DEVD-TPS-cRGD的不对称官能化提供最终的探针TPETP-SS-DEVD-TPS-CRGD，产率32％，为红色粉末。HPLC和质量表征证实了具有高纯度的探针的正确结构。
图15示出探针的还原响应。(a)TPETP在DMSO/水中的标准化UV-vis吸收和PL光谱(v/v＝1/199)。(b)TPETP在还有不同水分(fw)的DMSO/水混合物中的PL光谱。(c)TPETP和探针在DMSO/PBS混合物(v/v＝1/199)中的PL光谱。插图：在365nm UV灯照射下拍摄的相应照片。(d)用GSH(0.1mM)孵育的探针(10μM)的随时间变化的PL光谱。(e)溶在DMSO/PBS(v/v＝1/199)中的探针在650nm处的PL强度与随探针浓度变化图。(f)探针(10μM)对DMSO/PBS(v/v＝1/199)中的谷氨酸，叶酸，溶菌酶，牛血清白蛋白(BSA)，胃蛋白酶，抗坏血酸或谷胱甘肽的荧光响应。激发波长为430nm。数据表示平均值±标准偏差，n＝3。
探针的原型性质和GSH的活化。在DMSO/PBS(v/v＝1/199)缓冲液中的TPETP的UV-vis吸收和光致发光(PL)光谱示于图15a中。TPETP的UV-vis吸收在400-500nm的范围内，在430nm处具有最大吸收。发射光谱范围为550nm至850nm，最大值为640nm。为了研究TPETP是否保留其AIE性质，研究了TPETP在DMSO和具有不同水分数(fw)的水混合物中的PL强度。如图15b所示，TPETP在DMSO溶液(fw＝0)中几乎是没有荧光的，这应该是由于分子溶解状态的TPE苯基环的自由旋转消耗了激发态能量。然而，当fw增加时，TPETP的荧光强度稳定增加。TPETP在fw为99％时的荧光强度比其在DMSO中的荧光强度高120倍。这种荧光强度随着fw增加而增加是由于TPETP分子倾向于在不良溶剂中聚集并导致分子内运动的限制。上述结果清楚地表明TPETP保留其AIE特性。
在连接亲水性肽后，探针TPETP-SS-DEVD-TPS-cRGD在DMSO/PBS(v/v＝1/199)混合溶剂中几乎是没有荧光的。相反，TPETP在相同的混合溶剂中显示出强烈的红色荧光。含有二硫酸盐基团的探针和TPETP的显著的PL强度差异为癌细胞特异性点亮探针的发展提供了良好的机会，这是由于与正常细胞相比癌细胞内的GSH的高浓度所带来的。通过在DMSO/PBS(v/v＝1/199)中监测用GSH随时间孵育的探针的荧光强度变化来研究探针对GSH的响应。在将GSH加入探针溶液中后，观察到随时间的快速且稳定的红色荧光增加。荧光强度达到在90分钟孵育后的平台期，其比探针本身的固有荧光强度高14倍。在与GSH孵育后，逐渐的红色荧光强度增加应该是由于裂解的TPETP残基的量增加，并且在水性介质中形成聚集体，导致红色荧光开启。通过激光散射(LLS)测量来确认探针的分子溶解和TPETP残余物的聚集。没有在探针里检测到LLS信号，而在GSH处理后的TPETP残基倾向于聚集成具有148±12.2nm的平均直径的聚集体。聚集体的形成清楚地解释了与GSH孵育后的探针荧光开启。随后，将不同浓度的探针与GSH孵育90分钟，并记录相应的荧光变化。探针选择性研究显示探针荧光仅在还原剂存在下增加，而与其它生物酸和蛋白孵育的探针显示可忽略的荧光变化。这些结果表明，红色荧光开启归因于探针的二硫酸盐基团的遇到还原剂如GSH或抗坏血酸时释放还原而形成的TPETP残基。
在光照射光敏剂时产生活性氧是有效光动力疗法的关键步骤。通过测量探针和活性氧指示剂9,10-蒽二基-二(亚甲基)二山梨酸(ABDA)在DMSO/PBS(v/v＝1/199)中的混合物的吸光率降低来研究TPETP残基的活性氧产生。应当注意，由于其非常低的浓度，探针的吸光度对所测量的吸光度变化没有贡献。由于活性氧和ABDA之间的快速反应，导致ABDA在358、378和400nm处的吸收峰随着光照射逐渐降低。通过溶液的光照射12分钟，400nm处的吸收从其原始值的100％降低到22.4％，表明有效的活性氧产生。然而，当添加维生素C(VC，众所周知的活性氧清除剂)时，吸光度降低被显着抑制(在光照射12分钟后从100％降至93.8％)，进一步确认活性氧产生。
胱天蛋白酶-3/-7激活释放的细胞凋亡探针。TPS的吸收最大值为365nm，发射最大值为480nm。TPS在DMSO/水混合物中的不同fw的PL强度证明了TPS的AIE特征。与在DMSO/PBS(v/v＝1/199)中相同浓度的TPS相比，GSH预处理的探针和凋亡探针DEVD-TPS-cRGD显示有限的绿色荧光。这些结果表明，由GSH激活的细胞凋亡探针的释放不会产生TPS的明显荧光。然而，在用重组人胱天蛋白酶-3/-7进一步处理后，记录GSH预处理的探针(10μM)的TPS的荧光强度增加。由于胱天蛋白酶-3/-7可以特异性切割DEVD底物，这导致具有绿色荧光开启的疏水性TPS残基的释放。在胱天蛋白酶-3(100pM)处理60分钟后，TPS荧光强度达到平台期，其比经GSH预处理的探针的固有发射高18倍。然而，在一种高特异性半胱氨酸蛋白酶-3/-7,37抑制剂，5-[(S)-(+)-2-(甲氧基甲基)吡咯烷基]磺酰基靛红的存在下此探针的荧光强度没有变化。通过LLS研究凋亡探针的切割的TPS残基的聚集体的平均直径为134±14.6nm。caspase-3浓度依赖TPS荧光变化则被进一步监测，以检查是否可能通过荧光强度变化定量半胱天冬酶浓度。
通过将GSH预处理的探针与溶菌酶，胃蛋白酶和牛血清白蛋白(BSA)和其它半胱天冬酶孵育来研究凋亡探针的选择性。只有caspase-3/-7处理组显示显著的荧光强度增加，证实DEVD底物被胱天蛋白酶-3/-7特异性切割。由于细胞中存在多种酶，我们进一步将探针与正常和凋亡的MDA-MB-231癌细胞的细胞裂解物一起温育，所述细胞通过用星形孢菌素(STS，2μM)处理细胞获得，使用细胞凋亡诱导剂激活caspase-3/-7酶。正常和凋亡细胞的细胞裂解物与探针(10μM)直接孵育，并监测640和480nm的荧光强度随时间的变化。640nm处的荧光强度在正常细胞和凋亡细胞中快速增加。然而，480nm处的荧光仅在凋亡细胞中显示荧光增加，而在正常细胞裂解物中显示了最小的荧光变化。这些结果表明，TPETP的红色荧光可以被正常和凋亡细胞激活，而TPS的绿色荧光只能在凋亡细胞中被激活。
TPETP和探针在DMSO和磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)混合物(v/v＝1/199)中的PL光谱示于图15c中。在链接亲水性肽之后，探针TPETP-SS-DEVD-TPS-cRGD在DMSO/PBS(v/v＝1/199)中几乎是没有荧光的。相反，TPETP在相同的混合溶剂中显示出强烈的红色荧光。含有二硫酸盐基团的探针和TPETP的显著的PL强度差异为癌细胞特异性点亮探针的发展提供了良好的机会，这是由于与正常细胞相比癌细胞内的GSH的高浓度所带来的。
细胞内红色荧光开启。为了证明探针对αvβ3整联蛋白过表达的癌细胞光照成像的特异性，将探针与αvβ3整联蛋白过表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞和低αvβ3整联蛋白表达的MCF-7乳腺癌细胞以及293T正常细胞一起作为阴性控制。如图16A-H所示，在与探针一起温育时，MDA-MB-231细胞显著的红色荧光增强应归于与探针中释放的TPETP残基的着孵育时间的增加而逐渐增多。此外，在相同的实验条件下，MDA-MB-231中的红色荧光信号比MCF-7和293T细胞中的红色荧光信号强得多，这应该是由于后者细胞表面上的受体的较低密度。这通过在探针孵育之前用游离cRGD预处理MDA-MB-231细胞进一步证实，其也显示出显着降低的荧光强度。通过用g-谷氨酰半胱氨酸合成酶丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)抑制剂预处理MDA-MB-231细胞以抑制细胞合成GSH(其也显示非常弱的红色荧光强度)来证实TPETP残基的释放。这些特定的红色荧光在细胞中也通过流式细胞仪分析确认，结果很好地符合共聚焦图像。这些结果清楚地证明，探针可以通过受体介导的内吞作用被MDA-MB-231细胞特异性摄取，并且红细胞荧光可以在细胞内GSH的存在下开启，其可以用于监测光敏剂的激活和癌细胞的特异性成像。
图17A-H阐述实时细胞凋亡成像。MDA-MB-231细胞共聚焦成像(a-f)，MCF-7细胞(g)，293T细胞(h)或MDA-MB-231细胞用cRGD(e)或VC(f)处理并用探针温育4小时，随后光照射1分钟(a)，2分钟(b)，4分钟(c)，6分钟(d-h)。来自细胞核的蓝色荧光用Hoechst(Ex：405nm；Em：430-470nm)进行活体染色；绿色荧光来自TPS(Ex：405nm；Em：505-525nm)。所有图像共享相同的比例尺(20μm)。
通过“点击”反应合成胺官能化的DEVD-TPS-cRGD。将TPS-2N3(10.0mg，19.2μ9.2)，炔官能化的cRGD(10.8mg，19.2μ9.2)和炔官能化的DEVD(10.8mg，19.2μ9.2)溶解在DMSO/H2O溶液/1,2.0mL)。然后向上述混合物溶液中顺序加入CuSO 4(9.4mg，38.4μ8.4)和抗坏血酸钠(15.2mg，38.4μ8.4)。在搅拌下继续反应。使用制备型HPLC纯化后获得最终产物，并在真空下冻干，得到胺官能化DEVD-TPS-cRGD，为白色粉末，产率41％(13.1mg)。HPLC(λλPLC末nm)：纯度98.6％，保留时间11.2分钟。ESI-MS：m/z[M+H]+计算值1665.845，实测值1665.046。
探针TPETP-SS-DEVD-TPS-cRGD的合成。TPETP-NH2的合成和表征的详细描述可以在补充方法中找到。在DIPEA(1.0μL)存在下，将胺封端的DEVD-TPS-cRGD(10.0mg，6.0μmol)和TPETP-NH2(3.6mg，6.0μmol)溶于无水DMSO(1.0mL)中。将混合物在室温下搅拌10分钟。然后向上述溶液中快速加入在DMSO(0.5mL)中的二硫化双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP，2.4mg，6.0μmol)。在室温下继续搅拌反应24小时。使用制备型HPLC纯化后获得最终产物，并在真空下冻干，得到作为黄色粉末的探针TPETP-SS-DEVD-TPS-cRGD，产率为32％(4.7mg)。HPLC(λ＝320nm)：纯度97.3％，保留时间12.3分钟；ESI-MS:m/z[M+2H]2+计算值1216.945，实测值1215.916。
再次参考图14，合成方法在下面描述.
在-78℃下，向化合物1(7.7g，16.3mmol)的THF(150mL)溶液中加入正丁基锂(1.6M，在己烷中，16.0mL)。将混合物在相同温度下搅拌2小时。然后加入硼酸三甲酯(3.8mL，33.4mmol)。然后使反应混合物升温并在室温下搅拌3小时。通过加入HCl溶液(3M，45mL)淬灭反应，并将所得溶液在室温下搅拌5小时。然后将混合物用乙酸乙酯(100mL)和盐水(200mL)稀释。分离有机相，用盐水(100mL×2)洗涤，并用MgSO4干燥。将混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩。将所需的残余物进行快速色谱法(己烷/乙酸乙酯＝10/1—2/1)，得到化合物2，为白色固体(2.9g，40.8％产率)，其无需进一步纯化可直接用于下一步。
向化合物2(2.9g，6.5mmol)在甲苯(80mL)中的悬浮液中加入无水碳酸铯(5.3g，16.2mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(228mg，0.32mmol)。将噻吩-2-碳酰氯(2.0g，13.6mmol)加入到上述混合物中。然后将混合物在100℃下搅拌12小时。冷却至室温后，将混合物用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤并将滤液浓缩并通过色谱法(己烷/乙酸乙酯＝50/1—10/1)纯化，得到所需产物，为橙色固体(2.8g，85.8％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(dd,J1＝1.2Hz,J2＝4.8Hz,1H),7.64(m,2H),7.60(dd,J1＝1.2Hz,J2＝4.0Hz,1H),7.11-7.15(m,6H),7.05(m,2H),6.94-6.97(m,4H),6.63-6.67(m,4H),3.75(s,3H),3.74(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ187.0,158.4,158.3,143.7,143.6,141.8,138.1,135.8,135.7,135.4,134.3,133.7,132.6,132.5,131.4,131.3,128.8,127.8,127.7,126.4,113.2,113.0,55.1,55.0；HRMS(EI)[M]+:计算值502.1603，实测值502.1605。
在0℃下向化合物3(0.26g，0.52mmol)和丙二腈(45mg，0.68mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中缓慢加入四氯化钛(0.20mL，1.8mmol)。将反应混合物搅拌30分钟后，注射吡啶(0.15mL，1.8mmol)并再搅拌30分钟。然后将混合物在40℃加热4小时。将混合物冷却至室温后，通过水(10mL)淬灭反应，并将混合物用二氯甲烷萃取。将收集的有机层用盐水(20mL)洗涤，用MgSO 4干燥并在减压下浓缩。通过柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝50/1—10/1)纯化所需残余物，得到所需产物，为红色固体(230mg，81.0％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(dd,J1＝1.2Hz,J2＝5.2Hz,1H),7.73(dd,J1＝1.2Hz,J2＝5.2Hz,1H),7.13-7.22(m,8H),7.06(m,2H),8.91-8.98(m,4H),8.64-8.68(m,4H),3.75(s,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ164.8,158.6,158.4,148.7,143.2,142.4,138.7,137.7,136.1,135.7,135.5,133.5,132.6,132.5,131.5,131.3,129.1,128.8,127.9,126.5,114.5,113.8,113.2,113.0,55.1,55.0.MS(EI)[M]+:计算值550.1709，实测值550.1708。
在0℃下向化合物4(170mg，0.31mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入三溴化硼(1.0M的二氯甲烷溶液，0.50mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过在冰水浴下加入水(5mL)淬灭反应。取出有机层，用盐水(15mL)洗涤，用MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝20/1—5/1)纯化所需残余物，得到所需产物，为红色固体(43mg，25.8％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79-7.81(m,1H),7.71-7.73(m,1H),7.11-7.22(m,8H),7.06-7.08(m,2H),6.90-6.99(m,4H),6.64-6.68(m,2H),6.57-6.61(m,2H),3.75(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.2,164.9,158.5,158.4,154.9,154.7,148.9,148.7,143.1,142.5,142.3,138.7,138.6,137.7,137.6,136.4,136.2,136.1,135.9,135.5,135.4,135.3,133.5,133.4,132.8,132.7,132.6,132.5,131.5,131.3,129.1,128.9,128.8,127.9,126.5,114.9,114.6,114.4,113.8,113.7,113.2,113.0,55.1,55.0；HRMS(EI)[M]+:计算值536.1658，实测值536.1654。
向化合物5(40mg，0.075mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入3-(Boc-氨基)丙基溴(35mg，0.15mmol)和碳酸铯(50mg，0.15mmol)。将混合物在室温下搅拌6小时。然后向反应混合物中加入乙酸乙酯(50mL)和盐水(50mL)。取出有机层，用盐水(50mL×4)洗涤，用MgSO4干燥并在减压下浓缩。通过柱色谱法(己烷/乙酸乙酯＝30/1—8/1)纯化所需残余物，得到所需产物，为红色固体(28mg，53.3％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(dd,J1＝1.2Hz,J2＝5.2Hz,0.5H),7.80(dd,J1＝1.2Hz,J2＝5.2Hz,0.5H),7.71-7.73(m,1H),7.12-7.22(m,8H),7.05-7.07(m,2H),6.89-6.98(m,4H),6.62-6.67(m,4H),3.96(t,d＝6.0Hz,2H),3.74(s,3H),3.32(m,2H),1.94(m,2H),1.44(s,4.5H),1.43(s,4.5H)；HRMS(ESI)[M+H]+:计算值694.2734，实测值694.2731。
向化合物6(28mg，0.04mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入三氟乙酸(1mL)。将所得混合物在室温下搅拌6小时。然后将混合物减压浓缩。通过高效液相色谱(HPLC)，使用乙腈和水作为梯度洗脱缓冲液分离所需的油相，得到7-顺(10.0mg，红色固体，43.4％产率)：1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.27(dd,J1＝1.0Hz,J2＝5.0Hz,1H),7.77(brs,3H),7.67(dd,J1＝1.5Hz,J2＝4.0Hz,1H),7.38(dd,J1＝4.0Hz,J2＝5.0Hz,1H),7.35(m,2H),7.17-7.20(m,2H),7.10-7.14(m,3H),7.01-7.03(m,2H),6.84-6.90(m,4H),6.68-6.72(m,4H),3.96(t,J＝6.0Hz,2H),3.68(s,3H),2.95(m,2H),1.98(m,2H)；HRMS(ESI)[M+H]+:计算值594.2210，测试值594.2215；7-trans(8.0mg as red solid,34.8％yield):1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.27(dd,J1＝1.0Hz,J2＝5.0Hz,1H),7.73(brs,3H),7.66(dd,J1＝1.0Hz,J2＝4.0Hz,1H),7.38(dd,J1＝4.0Hz,J2＝5.0Hz,1H),7.35(m,2H),7.18-7.21(m,2H),7.09-7.15(m,3H),7.02-7.04(m,2H),6.92(m,2H),6.85(m,2H),6.68-6.73(m,4H),3.98(t,J＝6.0Hz,2H),3.67(s,3H),2.96(m,2H),1.98(m,2H)；HRMS(ESI)[M+H]+:计算值594.2210，测试值594.2212。
案例7
聚集诱导发光分子用于药物传输和追踪
在另一个示例性实施方案中，本发明是一种含有两种前药的简单的靶向治疗剂递送系统，其可用于前药跟踪，具有减少的副作用和增强的治疗效率。前药由作为能量供体的具有AIE特征的发光物四亚苯(TPE)和作为能量受体的荧光抗癌药物多柔比星(DOX)组成，使用化学治疗性Pt(IV)前药作为连接体。前药可以优先积聚在具有过表达的αvβ3整联蛋白的癌细胞中，并且在细胞内还原时同时释放活性药物Pt(II)(顺铂)和DOX，用于它们各自的生物作用。图18示出了用于实时药物追踪和激活监测的靶向双重作用前药。
首先根据本领域技术人员已知的方法合成双官能化叠氮化物四苯乙烯。在DMSO/水(v/v＝1/1)中使用CuSO 4/抗坏血酸钠作为催化剂的TPE-2N3与炔官能化的cRGD和炔丙胺的两个连续“点击”反应提供了cRGD-TPE，在HPLC纯化后产率为53％。
市场上销售的抗癌药物顺铂被修饰以作为cRGD-TPE和多柔比星(DOX)之间的连接体。制备N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的顺式，顺式，反式二氨基二氯二琥珀酸合铂(IV)络合物(NHS-Pt-NHS)作为接头。在N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)存在下，在无水DMSO中，用cRGD-TPE和DOX不对称官能化活化的Pt(IV)连接物，在HPLC纯化后得到cRGD-TPE-Pt-DOX，产率为36％。
癌靶向药物递送可以增加靶组织中的药物积累。为了证明实现癌症靶向递送前药的可行性，将cRGD-TPE-Pt-DOX与MDA-MB-231，MCF-7乳腺癌细胞和正常293T细胞温育。选择具有在细胞膜上过表达的整联蛋白αvβ3的MDA-MB-231细胞作为靶向癌细胞，而具有低αvβ3的整联蛋白表达的MCF-7和293T细胞用作阴性对照。共焦成像结果示于图19中。在2小时孵育后，在MDA-MB-231细胞中观察到来自细胞质中的cRGD-TPE-Pt-DOX的强荧光(着色为绿色)(图19A)，其比MCF-7(图19B)和293T细胞(图19C)强很多。在不同的孵育时间点监测这些细胞中cRGD-TPEPt-DOX的半定量荧光强度分析(图19D)。
图19A-E是cRGD-TPE-Pt-DOX对不同细胞的靶向效应的评价：MDA-MB-231(A)，MCF-7(B)癌细胞和293T在含有cRGD-TPE-Pt-DOX的培养基中孵育2小时。绿色代表来自cRGD-TPE-Pt-DOX(λex＝488nm)的荧光，红色代表来自由DRAQ5染色的细胞核的荧光。所有图像共享相同的比例尺(20μ0)。(D)在不同孵育时间下的在MDA-MB-231，MCF-7和293T细胞中测定的cRGD-TPE-Pt-DOX(λλGD-TPE nm)的相对荧光强度。(E)在具有和不具有cRGD(50μ0)预处理的MDA-MB-231，MCF-7和293T细胞中测定的cRGD-TPE-Pt-DOX的相对荧光强度。误差是平均值的标准偏差(n＝3，*是P<0.05)。
随后，将cRGD-TPE，游离DOX和cRGD-TPE-Pt-DOX与MDAMB-231乳腺癌细胞温育，并通过CLSM研究药物活化。如图20A所示，游离DOX和琥珀酸修饰的DOX(“绿色”颜色)可快速扩散至细胞核，其中其抗癌功能在6小时孵育后展现，其与DRAQ5染色的细胞核(“红色”颜色)具有良好的一致性。研究了cRGD-TPE-Pt-DOX孵育的MDA-MB-231细胞在不同孵育时间的CLSM图像。如图20C所示，孵育1小时后，可以清楚地观察到DOX荧光(“绿色”)，这表明前体药物的细胞摄取有效。同时，由于细胞中的初始药物活化，检测到TPE的弱“蓝色”荧光。
图20显示在与cRGD-TPE(A)，顺铂(B)，DOX(C)和cRGD-TPE-Pt-DOX(D)孵育72小时后的MDA-MB-231细胞的CLSM图像。活细胞用钙黄绿素-AM染成绿色，死细胞用PI染成红色。所有图像共享相同的比例尺(50μ0)。(E)与顺铂，DOX和cRGD-TPE-Pt-DOX孵育72小时后的MDA-MB-231乳腺癌细胞的剂量效应谱。(F)cRGD-TPE-Pt-DOX对不同药物效应水平的MDA-MB-231细胞的组合指数(CI)图。
使用MDA-MB-231，MCF-7和293T细胞作为实例研究了cRGD-TPE-Pt-DOX对不同细胞的毒性。经过cRGD-TPE-Pt-DOX孵育6小时后，细胞用膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)染色。只有MDA-MB-231细胞显示出强烈的凋亡荧光，而来自MCF-7和293T细胞的凋亡荧光是可忽略的，这表明cRGD-TPE-Pt-DOX能够选择性地杀死整合素过表达的癌细胞。这应该归因于整合素介导的胞吞作用，其导致前药cRGD-TPE-Pt-DOX的选择性细胞摄取。
为了证实cRGD-TPE-Pt-DOX中的药物协同作用，计算组合指数(C.I.)。其中C.I。低于，等于或高于1的值分别表示协同作用，加和作用或拮抗作用。如图20F所示，在75％至25％范围的药物效应水平下cRGD-TPE-Pt-DOX对MDA-MB-231细胞的治疗具有协同效应。这些结果证明在cRGD-TPE-Pt-DOX中以前药形式的顺铂和DOX的递送导致增强的癌细胞杀伤作用。
上述化合物的合成路线展示在图21中。
通过两个连续的“点击”反应合成胺官能化的cRGD-TP.
将TPE-2N3(15mg，34μmol)和炔官能化的cRGD(19.4mg，34μmol)溶解在DMSO/H2O溶液(v/v＝1/1，2.0mL)的混合物中。通过顺序加入CuSO4(19.2mg，12μmol)和抗坏血酸钠(4.8mg，24μmol)引发“点击”反应。在室温下振荡反应12小时。然后依次加入炔丙胺(4.4μL，68μmol)，CuSO4(19.2mg，12μmol)，抗坏血酸钠(4.8mg，24μmol)并在室温下再反应24小时。最终产物通过制备型HPLC纯化，并在真空下冻干，得到胺官能化的cRGD-TPE，为白色粉末，产率53％(19.2mg)。HPLC(λ＝320nm)：纯度98.6％，保留时间10.3分钟。1H NMR(DMSO–d6,400MHz),δ(TMS,ppm):12.24(s,1H),8.22(m,3H),8.01(m,2H),7.78(s,2H),7.10(m,11H),6.94(m,12H),5.43(m,4H),4.62(t,1H),4.41(m,2H),4.10(m,2H),3.13(m,4H),2.90(m,3H),2.65(m,2H),2.38–2.27(m,2H),1.75(m,1H),1.46(m,2H),1.35(m,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+计算值1068.495，实测值1068.806。
合成诊疗双响应的前药cRGD-TPE-Pt-DOX。
将胺封端的cRGD-TPE(10.7mg，10μ0.7)和盐酸多柔比星(5.8mg，10μ08酸)溶于具有催化量的DIPEA(1.0μ.)的无水DMSO(1.0mL)中。将混合物在室温下搅拌10分钟。然后将N-羟基琥珀酰亚胺活化的铂(IV)络合物(7.3mg，10μ03物)在DMSO(0.5mL)中的溶液快速加入到上述混合物中。在室温下继续搅拌反应24小时。最终产物通过制备型HPLC纯化，并在真空下冻干，得到前药cRGD-TPE-Pt-DOX，为红色粉末，产率为36％(7.6mg)。HPLC(λλPLC末nm)：纯度97.3％，保留时间17.2分钟。1H NMR(DMSO–d6,400MHz):12.24(s,1H),8.38(t,1H),8.24(m,3H),8.08–7.88(m,4H),7.72(m,1H),7.57(d,1H),7.20–6.98(m,12H),6.96–6.79(m,12H),6.46(m,6H),5.43(m,4H),5.24(s,1H),4.93(m,1H),4.57–4.68(m,2H),4.30–4.51(m,4H),4.15–4.07(m,1H),4.07(m,2H),3.97(s,3H),3.79(m,1H),3.62–3.53(m,3H),3.15(m,2H),2.95(m,2H),2.84(m,2H),2.65(m,3H),2.12(m,2H),2.35–2.27(m,2H),1.83(d,1H),1.77–1.65(m,3H),1.60–1.36(m,4H),1.13(m,3H)；ESI-MS:m/z[M+H]+计算值2109.642，实测值2109.698。
组合指数(C.I.)的测定
通过组合指数(C.I.)分析评价顺铂和DOX对MDA-MB-231细胞的联合治疗。C.I.计算如下：C.I.＝D1/Df1+D2/Df2+D1D2/Df1Df2。其中Df1是单独产生x％效应所需的药物-1的剂量，D1是与药物-2组合产生相同x百分比效应所需的药物-1的剂量；类似地，Df2是单独产生x百分比效应所需的药物-2的剂量，D2是与药物-1组合产生相同x百分比效应所需的药物-2的剂量。理论上，C.I.是组合剂量与等效有效水平的单一药物剂量的总和的比率。因此，C.I.值<1表示协同作用，值>1表示拮抗作用，值＝1表示加性效应。
统计分析：使用Student's t-检验进行样品的统计分析，p-值<0.05被认为是统计学显着的。除非另有说明，报告的所有数据均为平均值±标准偏差。
案例8
Platinum前药与AIE光敏剂的结合体在药物激活检测和光动力与化学疗法的组合疗法中的应用
开发了与单官能化AIE光敏剂缀合的靶向铂(IV)前药，用于原位选择性和实时监测药物活化以及针对顺铂耐药性癌细胞的组合光动力和化学疗法。铂(IV)前药的两个轴向位置用分别连接了AIE光敏剂和亲水性肽修饰以赋予此前药的靶向能力和水溶性(图22)。图22(A)显示了前药TPECB-Pt-D5-cRGD的化学结构。(B)用TPECB-Pt-D5-cRGD于顺铂激活监测和图像引导的组合光动力疗法和用于顺铂耐药癌细胞消融的化疗的的示意图。
前药在水性介质中是没有荧光的，并且可以被αvβ3整联蛋白过表达的癌细胞通过受体介导的胞吞作用被摄取。然后，前药可以通过胞内谷胱甘肽(GSH)切割，从而释放的AIE光敏剂并激活光敏剂的荧光，其可以用于药物激活监测和癌细胞成像。在图像引导光照射下，AIE光敏剂可以有效地产生活性氧用于光动力治疗。因此，我们的前药设计为前列腺激活监测和顺铂抗性癌细胞的图像引导化学-光动力学联合治疗提供了良好的机会。
图23示出了TPECB和TPECB-Pt-D5-cRGD(10μ0)在DMSO/PBS(v/v＝1/199)中的荧光光谱。插图显示在手持365nm灯下拍摄的照片。(B)在DMSO/PBS(v/v＝1/199)中用GSH(100μ0)孵育TPECB-Pt-D5-cRGD(10μ0)不同时间后的荧光光谱。(C)TPECB-Pt-D5-cRGD(10μ0)对在DMSO/PBS(v/v＝1/199)中的100μ0不同分析物的荧光响应。(D)与GSH预处理的前药混合的活性氧指示剂9,10-蒽二基-双(亚甲基)二元酸(ABDA)在光照射的不同持续时间的UV-vis吸收变化。VC代表活性氧清除维生素C.数据代表平均值±标准偏差，n＝3。通过监测荧光变化来研究TPECB-Pt-D5-cRGD对其他生物相关分析物的选择性。如图23C所示，仅当前药与还原剂(GSH或抗坏血酸)孵育时才能观察到强烈的荧光增加，表明前药的高选择性。
通过测量在DMSO/PBS中的TPECB-Pt-D5-cRGD和ABDA的混合物的吸收光谱来研究AIE残基的活性氧生成(v/v＝1/199)。应当注意，TPECB-Pt-D5-cRGD的吸光度低，并且不会干扰ABDA的吸光度变化。如图23D所示，ABDA在358、378和400nm处的吸收峰在光照射时逐渐降低。这是由于ABDA可以快速有效地捕获与活性氧进行反应。在光照射12分钟(0.25瓦每平方厘米)后，400nm处的吸光率从其原始值的100％显着降低至其原始值的24.1％。
通过将前药与αvβ3整联蛋白过表达的MDA-MB-231和U87-MG癌细胞，和低表达的MCF-7癌细胞293T正常细胞作为阴性对照来研究细胞中TPECB-Pt-D5-cRGD的药物活化。图24显示了不同前药孵育时间的MDA-MB-231细胞(A-C，E，F)，U87-MG细胞(D)，MCF-7细胞(G)，293T细胞(H)。对于E和F，细胞分别用游离cRGD或丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)预处理。红色荧光来自TPETB(Ex：405nm；Em：>560nm)；蓝色荧光来自用Hoechst染色的细胞核(Ex：405nm；Em：430-470nm)。所有图像共享相同的比例尺(20μ0)。
如图24所示，在前药孵育的MDA-MB-231细胞中，切割的AIE残基的红色荧光属性随孵育时间逐渐增加，这也通过流式细胞术研究证实。然而，当前药与cRGD预处理的MDA-MB-231细胞孵育时，4小时孵育后红色荧光信号非常弱，通过受体介导的胞吞作用摄取。当用丁硫堇磺酰亚胺(BSO)预处理MDA-MB-231细胞以抑制细胞中的GSH合成时，荧光也显着降低。结果表明，荧光与细胞内GSH浓度直接相关，细胞内GSH浓度是药物活化的主要还原剂。U87-MG细胞在孵育4小时后也显示强烈的红色荧光。在4小时孵育后可以检测到在MCF-7和293T细胞中仅有微弱的荧光信号，这应该是由于在此两种细胞表面上低αvβ3整联蛋白表达。流式细胞术研究还证实，与MCF-7和293T细胞相比，MDA-MB-231细胞的前药摄取更多。
在光照射下，使用细胞可渗透的荧光活性氧指示剂2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCF-DA)研究细胞中AIE残基的活性氧产生。DCF-DA本身没有荧光，但可以容易地被活性氧氧化成高度荧光产物二氯荧光素(DCF)。当加入维生素C时，DCF的荧光信号显着降低，进一步证实了在光照射下活性氧的产生。
在光照下，研究了TPECB-Pt-D5-cRGD对MDA-MB-231，U87-MG，MCF-7和293T细胞的毒性。在将前药与细胞温育4小时后，通过用新鲜培养基洗涤除去前药，并进一步用光照射暴露，并用FITC标记的膜联蛋白V染色，所述膜联蛋白V是荧光指示剂，以区分凋亡细胞和活细胞。MDA-MB-231和U87-MG细胞显示来自FITC的强绿色荧光，表明MDA-MB-231和U87-MG细胞正在经历凋亡过程。
随后，通过MTT测定评估TPECB-Pt-D5-cRGD对MDA-MB-231细胞，U87-MG细胞，MCF-7细胞和293T细胞的毒性。MDA-MB-231细胞是顺铂抗性的，而U87-MG细胞是顺铂敏感的。这也通过顺铂对MDA-MB-231细胞的半最大抑制浓度(IC 50)为33.4μ3来证明，其与顺铂抗性癌细胞的半最大抑制浓度相当。相比之下，顺铂对U87-MG细胞的IC 50值低得多(5.4μ.)。应当注意，顺铂对两种细胞的细胞毒性不受光照射的影响。前药TPECB-Pt-D5-cRGD在黑暗条件(37.1μ7)下显示出与顺铂对MDA-MB-231细胞类似的细胞毒性，但其光毒性则显着增强(IC50＝4.2μ＝)。这些结果清楚地表明，TPECB-Pt-D5-cRGD对抗顺铂抗性的MDA-MB-231癌细胞的抗增殖作用可以通过化学疗法和光动力疗法两者实现的协同效应而大大增强。相比之下，前药在黑暗中或在光照射下显示对MCF-7和293T细胞的非常小的细胞毒性.
合成路线在图25
化合物1的合成
向4-羟基苯甲醛(360mg，2.95mmol)的乙腈(10mL)溶液中加入N-(3-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯980mg(4.11mmol)和K2CO3(480mg，3.48mmol)。将所得混合物在回流下搅拌过夜。将混合物冷却至室温后，过滤混合物，浓缩滤液，用色谱法(己烷：乙酸乙酯v/v＝3:1)纯化，得到所需产物(无色油状物，390mg，47.4％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.85(s,1H),7.81(dd,J1＝1.6Hz,J2＝5.6Hz,2H),6.98(dd,J1＝1.6Hz,J2＝5.6Hz,2H),4.78(brs,1H),4.08(t,J＝4.8Hz,2H),3.32(m,2H),2.02(m,2H),1.41(s,9H).
TPECB-NH2的合成
向化合物2(40mg，0.083mmol)在异丙醇(5mL)中的溶液中加入化合物1(30mg，0.11mmol)和哌啶(0.68mg，0.008mmol)。将所得溶液回流24小时。然后减压除去溶剂。残余物用色谱法(己烷：乙酸乙酯v/v＝5：1)纯化，得到红色油状物。将该油状物用二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(1mL)的混合物进一步处理8小时再减压除去溶剂。残余物用反相HPLC纯化，使用乙腈和水作为流动相，得到所需产物(黄色固体，12mg，23.0％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(brs,2H),7.63(d,J＝8.8Hz,2H),7.40(d,J＝15.2Hz,1H),7.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.13-7.20(m,2H),7.15(m,3H),7.02-7.06(m,4H),6.87-6.92(m,4H),6.67-6.73(m,5H),4.16(d,J＝6.0Hz,2H),3.68(s,6H),2.95-3.00(m,2H),2.00-2.04(m,2H).MS(ESI)[M+H]+:计算值644.2913，实测值644.2926.
前药TPECB-Pt-D5-cRGD的合成和纯化
将TPECB-NH2(5.0mg，7.8μmol)和胺官能化的D5-cRGD(9.2mg，7.8μmol)溶于已加入DIPEA(1.0μL)的无水DMSO(0.5mL)中，混合物在室温下搅拌10分钟然后加入NHS-Pt-NHS(5.6mg，7.8μmol)的无水DMSO(0.5mL)溶液。反应液在室温下继续搅拌反应24小时。最终产物通过制备型HPLC纯化(溶剂A：含0.1％TFA的水，溶剂B：含0.1％TFA的CH3CN，并在真空下冻干，得到前药，为黄色粉末，产率为38％(6.6mg)。
药物活化监测的一般程序。将TPECB-Pt-D5-cRGD的DMSO储备液(1mM)稀释到DMSO和PBS的混合溶剂(v/v＝1/199)中。然后将前药与GSH在室温下孵育并研究荧光变化。激发波长采用405nm并从525至775nm收集发射。
实例9
光捕获共轭聚电解质(CPEs)
这个实例是关于开发可应用于靶向细胞成像引导按需光动力学治疗和化学治疗的共轭电解质-多柔比星(DOX)聚合物前药。抗癌药物DOX通过ROS可切割接头共价缀合到聚乙二醇化聚合物光敏剂CPE。图26是(A)PEG化聚脯氨酸药物PFVBT-g-PEG-DOX的化学结构和(B)光调节ROS激活的按需药物释放和组合的化学光动力学治疗的示意图。所得的聚合物前药可以在水性介质中自组装成纳米颗粒(NP)，纳米颗粒表面进行cRGD官能团化，从而可靶向αvβ3蛋白过度表达的癌细胞。在白光照射下，这些NP可以有效地产生用于光动力治疗的ROS。同时，在NP周围产生的ROS可以快速切割与化学治疗药物共价连接的接头，用于特定的按需药物释放。与现有系统相比，我们基于单一CPE的“一体化”多药物药物包含了用于成像，治疗和按需药物释放的所有功能。它具有以下优点：(1)是一种载药聚合物光敏剂的巧妙设计，(2)可用于靶向癌细胞成像引导治疗，(3)高效的ROS产生，(4)按需药物释放，(5)用于有效癌症治疗的单光控制化学和光动力组合疗法。
PFVBT-g-PEG-DOX的合成如下。首先，制备ROS可裂解硫缩酮(TK)接头，其羧基之一与双官能聚(乙二醇)(N3-PEG-NH2)的胺基反应，得到N3-PEG-TK。N3-PEG-TK的羧基进一步与DOX的氨基反应。反应后，将混合物透析并冷冻干燥，得到产物N3-PEG-TK-DOX。然后使用等摩尔量的N3-PEG-TK和DOX进行缀合，NMR结果显示约70％的羧基被反应。未反应的羧基将在聚合物自组装之后进一步反应。另一方面，聚【9,9-双(N-(丁-3'-炔基)-N，N-二甲基氨基)己基)芴基二亚乙烯基-4,7-(2'，1'，3'，-苯并噻二唑)二溴化物】(PFVBT)与炔烃侧基的合成。该聚合物随后与叠氮化物官能化的N3-PEG-TK-DOX的点击反应，得到共聚物PFVBT-g-PEG-DOX。根据在3.62ppm(归属于PEG的亚甲基质子)处的峰与在0.56ppm处的峰(归属于芴间位的亚甲基质子)之间的积分面积计算出缀合物中的DOX含量为12.3wt％。同样也得到无DOX缀合的产物PFVBT-g-PEG。
使用高效液相色谱(HPLC)监测ROS存在下N3-PEG-TK-DOX的药物释放。ROS由双氧水和Fe2+的反应得到。N3-PEG-TK-DOX在3.5分钟的洗脱时间显示单峰。由于HPLC的洗脱具有0.1％三氟乙酸，我们还将N3-PEG-TK-DOX在pH1.0的水中孵育6小时，结果显示化合物没有降解，表明硫缩酮连接体在酸性条件下的良好稳定性。用ROS处理N3-PEG-TK-DOX完全降解硫缩酮接头，得到洗脱时间为4.9分钟的单峰，其显示出从ESI-MS确定的质荷比(m/z)为632.266，和巯基改性的多柔比星刚好对应上。虽然药物释放后DOX上连有短硫醇配体(3-巯基-丙酮)，根据以往的报道该类DOX衍生物药效不会降低。
PFVBT-g-PEG-DOX可以通过透析法(表示为CP-DOX NPs)自组装成胶束NP。由于羧基位于亲水性PEG侧链的末端，所以在成球时，羧基应当存在于NP表面上，使得它们可以被应用于表面化学。NPs可以进一步用环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)三肽功能化，用于靶向整合素αvβ3过表达的癌细胞以实现癌靶向药物递送。靶向后的CP-DOX NPs表示为TCP-DOXNPs。从PFVBT-g-PEG自组装的NPs，表示为TCP NPs。TCP-DOX NPs的最大吸收和最大发射分别在502nm和598nm，在斯托克斯位移大约96nm。激光散射(LLS)研究结果显示TCP-DOX NPs的体积平均流体动力学直径为120±11nm。
图27是(A)N3-PEG-TK-DOX在ROS存在下的稳定性分析(基于HPLC在254nm的吸光)。(B)DOX，TCP NP和TCP-DOX NP的标准化UV-vis吸收光谱。(C)TCP-DOX NPs的尺寸分布和TEM图像(插图)。(D)在37℃下孵育7天时TCP-DOX NP的平均流体动力学直径变化(插图数码照片显示分散在水中的TCP-DOX NP，PBS缓冲液或DMEM，表明分散性良好)。(E)在光照射不同时间后PBS，DOX，TCPDOX NP和TCP NP中二氯荧光素(DCF)荧光强度(530nm)。VC代表ROS清除剂维生素C。(F)没有和具有光照射下TCPDOX NPs的DOX的累积释放曲线。误差棒为三个平行实验的标准偏差。
通过ROS敏感探针二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)的荧光信号测定ROS的产生。DCF-DA是非荧光的，但它可以被ROS快速氧化成荧光分子(二氯荧光素，DCF)。由于PFVBT具有宽的吸收光谱，因此白光能够诱导ROS的产生。随着功率密度的增加，ROS的产生效率变高。当以0.1W cm-2的功率密度照射TCP-DOX NP 5分钟时，在530nm检测到的DCF的荧光强度的是原来的11.5倍，而没有NP的对照组保持在原始水平。当添加维生素C(VC，众所周知的ROS清除剂)时，DCF的荧光被显著抑制，进一步确认光照射后的ROS产生。
为了验证靶向递送DOX的能力，将TCP-DOX NP与αvβ3整联蛋白受体表达不同水平的MDA-MB-231和MCF-7癌细胞分别孵育，并且对PFVBT-g-PEGDOX的荧光在不同的孵育时间点进行监测。选择具有在细胞膜上过表达的整联蛋白αvβ3的MDAMB-231细胞作为整合素阳性癌细胞，而具有低αvβ3整联蛋白表达的MCF-7细胞用作阴性对照。图28的共聚焦成像是TCP-DOXNP对不同癌细胞的靶向效应的评价：(A)与NP孵育4小时后MDA-MB-231和MCF-7细胞的共聚焦显微镜图像。蓝色荧光来自Hoechst 33342染色的细胞核，红色荧光来自PFVBT-g-PEG-DOX。所有图像保持相同的比例尺(20μm)；(B)在不同孵育时间下在MDA-MB-231和MCF-7细胞中测定的PFVBT-g-PEG-DOX的整合荧光强度；(C)在具有和没有cRGD(50μM)预处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞中测定的PFVBT-g-PEG-DOX的荧光强度。误差为平均值的标准偏差(n＝3，*是P<0.05)。
在4小时孵育后，在MDA-MB-231细胞中观察到细胞质中的PFVBT-g-PEG-DOX的红色荧光和细胞核中的Hoechst的蓝色发射，其比MCF-7细胞中的亮度更亮。在这些细胞中的红色荧光的半定量荧光强度分析证实，在MDA-MB-231细胞中cRGD修饰的NP的摄取比在MCF-7细胞中的摄取高2.9倍(图28B)。我们还注意到，两个细胞的荧光强度随着孵育时间的增加逐渐增强，并且在每个时间点，在MDA-MB-231细胞中观察到更高的荧光。图28C显示当整合素最初被过量cRGD阻断时，MDA-MB-231细胞中的荧光信号显着降低。在MDA-MB-231细胞中的半定量荧光分析证明当整联蛋白被阻断时，TCP-DOX NP的细胞摄取存在显着差异(p<0.05)，表明αvβ3整联蛋白受体介导的细胞摄取。在光照下，使用细胞可透过的荧光染料DCF-DA研究癌细胞内的TCP-DOX NP的ROS产生。当细胞装载有TCP-DOX NP时和在光照射后观察到DCF的强绿色荧光。当添加ROS清除剂VC(50μM)时，DCF的荧光信号显着降低，这进一步证实在光照射期间细胞内ROS的产生。
图29是MDA-MB-231细胞分别在以下不同条件下孵育后用DCF-DA染色的细胞内活性氧(ROS)产生检测：(A)DCF-DA；(B)TCP-DOX NP；(C)TCP-DOX NP和DCF-DA；(D)TCP-DOX NP和DCFDA带ROS清除剂(VC，50μM)。绿色：ROS指示剂DCF；红色：PFVBT-g-PEG-DOX荧光。所有图像使用相同的比例尺(50μm)。
图30是PFVBT-g-PEG-DOX的合成方案。
ROS可切割硫代缩酮连接基团(TK)
无水3-巯基丙酸(5.2g，49.1mmol)和无水丙酮(5.8g，98.2mmol)的混合物用无水氯化氢饱和并在室温下搅拌6小时。反应后，塞住烧瓶并在冰-盐混合物中冷却，直到结晶完全。过滤晶体，用己烷和冷水洗涤，在真空干燥器(80％)中干燥后得到产物。1H NMR(400MHz,CD3OD,δ):2.85(t,4H),2.58(t,4H),1.58(s,6H).ESI-MS(m/z):[M+H]+calcd,252.049；found,252.140.
N3-PEG-TK缀合物的合成
将N3-PEG-NH2(205.9mg，0.1mmol)和TK(252.1mg，1.0mmol)在无水DMF(2mL)中的混合物在室温下搅拌10分钟。然后在氮气氛下将EDC(57.3mg，0.3mmol)和溶于无水DMF(1mL)中的NHS(34.5mg，0.3mmol)加入到上述溶液中，反应在氮气氛下在室温下进行24小时。反应结合后将混合物用去离子水充分透析(SpectraPor6，分子量截止值为1,000)以除去EDC和NHS。在真空下冷冻干燥后得到白色粉末的聚合物。然后将粗产物再溶解于DMF(1mL)中并在搅拌下滴入100mL冷乙醚中以沉淀N3-PEG-TK缀合物。再次重复该步骤一次，真空干燥(75％)后得到最终产物。1H NMR(400MHz,CDCl3,δ):3.58-3.72(m,160H),2.87(t,4H),2.63(t,2H),2.54(t,2H),1.58(s,6H).
N3-PEG-TK-DOX缀合物的制备
在EDC和NHS的催化下对N3-PEG-TK的羧基与DOX的胺基缀合。类似地，将N3-PEG-TK(112.1mg，48.7μmol)，多柔比星(28.2mg，48.7μmol)和三乙胺(14.1μL，97.4μmol)在无水DMF(1mL)中的混合物在室温下搅拌10分钟以获得澄清溶液。然后在氮气氛下向上述溶液中加入溶解在无水DMF(1mL)中的EDC(18.6mg，97.4μmol)和NHS(11.2mg，97.4μmol)。反应在氮气氛下在室温下进行24小时。之后，通过对DMSO(SpectraPor 6，分子量截留值＝1,000)进一步对Milli-Q水进行超滤并对其进行透析，除去未反应的DOX，并在真空下冷冻干燥，得到N3-PEG-TK-DOX缀合物。
PFVBT-g-PEG-DOX的合成
将PFVBT(6mg，10μmol炔烃)和N3-PEG-TK-DOX(56.6mg，20μmol)溶于DMF(5mL)中。将混合物脱气，然后加入N，N，N'，N“，N”'-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)(3.5mg，20μmol)和CuBr(2.9mg，20μmol)。在65℃下在氮气下反应24小时后，将反应混合物冷却至室温，并通过0.45μm注射器驱动的过滤器过滤。滤液在甲醇和乙醚(v/v＝1/5)的混合物中沉淀三次，得到红色粉末。将粗产物再溶解于DMF中，并使用Spectra/Por透析管(截留分子量为12,000Da，Spectrum Laboratories，Rancho Dominguez，CA，United States)对蒸馏水透析48小时，用水变化进一步纯化。冷冻干燥后，得到红色粉末状的PFVBT-g-PEG-DOX(30.1mg，48％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ):8.35-7.65(m,18H),5.20(s,0.9H),5.02(m,0.9H),4.58(d,0.9H),4.15–4.09(m,0.9H),3.97(s,2H),3.78-3.46(m,120H),2.96(m,10H),2.84-2.56(m,5H),2.24-2.12(m,2H),1.58(s,3.5H),1.29-0.95(m,12H).0.92–0.78(m,6H),0.56(br,4H).
纳米颗粒(NPs)的制备.
透析法制备刷状共聚物的纳米颗粒。在典型的方法中，将2mg刷状共聚物溶解在2mL DMSO中。在适度搅拌下，缓慢加入预定体积(3mL)的超纯水(Millipore，18.2MΩ)。将混合物再搅拌3小时。然后通过对Milli-Q水进行透析(分子量截留值为3,500Da，SpectrumLaboratories，Rancho Dominguez，CA，USA)除去溶剂以获得纳米颗粒。通过超滤(MWCO＝20,000，Amicon，Millipore Corporation，Bedford，USA)将最终体积调节至2mL用于进一步实验。
cRGD与纳米颗粒的结合
用EDC/磺基-NHS技术将氨基功能化的cRGD缀合到CP-DOX NP的表面。将纳米颗粒悬浮在去离子水(0.2mg mL-1)中，并与过量的EDC(10mM)和Sulfo-NHS(5mM)在室温下孵育30分钟。通过超滤(MWCO＝20,000，Amicon，Millipore Corporation，Bedford，USA)用Milli-Q水(3mL×3次)洗涤所得的磺基-NHS活化的纳米颗粒，以除去残留的EDC和磺基-NHS。使活化的纳米颗粒与氨基功能化的cRGD(0.1mg mL-1在Milli-Q水中)在磁力搅拌下反应4小时。通过超滤(20,000MWCO，Amicon，Millipore Corporation，Bedford，USA)用Milli-Q水(3mL×3次)洗涤cRGD功能化的纳米颗粒，重新悬浮于Milli-Q水中，并在4℃下储存备用。
实例10
基于聚乙二醇化CPE的自组装诊疗平台
在另一个示例性实施方案中，本发明是基于聚乙二醇化CPE的多功能纳米颗粒作为化疗药物载体,并用于靶向癌细胞成像、化疗和光动力治疗。聚乙二醇化的CPE可以在水介质中容易地自组装成纳米颗粒，其可以通过疏水-疏水相互作用包封常用的疏水化疗药物，如紫杉醇(PTX)。此外，聚合物基质本身还可以作为光敏单元用于成像和光动力治疗。为了提高系统的特异性，将具有靶向整合素αvβ3过表达的癌细胞功能的识别元件环状精氨酸甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)三肽引入自组装的NP中用于靶向癌症治疗。通过整合这些功能，载药的聚乙二醇化CPE平台具有以下明显的优点：1)容易合成；2)成像引导治疗；3)双重治疗(光动力学治疗和化疗)和4)靶向能力。
具有炔烃侧链的聚【9,9-双(N-(丁基-3'-炔基)-N，N-二甲基氨基)己基))芴基二亚乙烯基-alt-4,7-(2'，1'，3'-苯并噻二唑)二溴化物】(PFVBT)是据已知的方法合成。随后以溴化铜(I)(CuBr)和N，N，N'，N“，N'，N'-四甲基乙二胺(PMDETA)为催化剂使聚合物与α-叠氮化物-ω-羧酸基-聚(乙二醇)(N3-PEG-COOH)发生点击化学反应，得到PFVBT-g-PEG的聚乙二醇化刷状共聚物，其结构如下：
具有疏水主链和亲水性PEG侧链的PFVBT-g-PEG可以在水溶液中自组装成NP。通过透析法制备包封疏水性抗癌药物紫杉醇(PTX)的NP，CP/PTX NPs。因为羧基位于亲水性PEG嵌段的末端；在NP一旦形成，羧基应裸露在表面并用于随后的表面修饰。这些纳米颗粒还可以修饰上用具有靶向αvβ3过表达的癌细胞功能的cRGD三肽(所得纳米粒子表示为TCP/PTXNPs)，以实现靶向药物递送。未装载PTX的靶向NPs表示为TCP NPs。
图31展现出了TCP/PTX NPs对不同癌细胞的靶向效应：(A-B)具有受体过表达的U87-MG细胞(A)和受体阴性MCF-7细胞(B)中NPs摄取的共聚焦显微镜图像。这些图像中分别为细胞核的蓝色荧光来自Hoechst 33342染色，红色荧光来自TCP/PTX NPs的红色荧光和上述合并的图像。所有图像使用相同的比例尺(20μm)；(C)在不同孵育时间点在U87-MG和MCF-7细胞中测定的TCP/PTX NPs的动态荧光强度；(D)在cRGD(50μM)预处理的U87-MG细胞中TCP/PTX NPs摄取的共聚焦显微镜图像和(E)在具有受体阻断或非阻滞的U87-MG和MCF-7细胞中测定的TCP/PTX NPs的平均荧光强度4小时孵育。误差是平均值的标准偏差(n＝3，*P<0.05)。
图32说明通过DCF-DA染色的U87-MG细胞中检测细胞内活性氧产生(ROS)用(A)DCF-DA与光激发孵育的；(B)具有光激发的TCP/PTX NPs孵育的；(C)具有光激发的TCP/PTXNPs和DCF-DA孵育的；(D)TCP/PTX NPs和DCF-DA在存在ROS清除剂(维生素C，50μM)与光激发孵育的。E-H表示相应的CP荧光。所有图像使用相同的比例尺(50μM)。
为了评估在癌细胞摄取TCP/PTX NPs后ROS的产生，我们使用细胞可渗透荧光染料二氯荧光素二乙酸酯(DCF-DA)在光照下检测ROS产生。如图32所示，在光照条件下，当细胞仅装载有DCF-DA或TCP/PTX NPs时，即可探测不到荧光背景。然而，当细胞装载有DCF-DA和TCP/PTX NPs时，在光照射后，在细胞内观察到DCF的强绿色荧光，证明TCP/PTX NPs可有效的产生ROS。然而，当添加ROS清除剂维生素C(50μM)时，DCF的荧光信号显著降低(图32D)，进一步确认在光照射过程中细胞内产生ROS。
药物递送系统的生物相容性对于生物医学应用是至关重要的。我们首先测试了在黑暗中没有PTX负载(TCP NPs)的PFVBT-g-PEG纳米颗粒的体外毒性。首先通过标准的甲基噻唑基四唑(MTT)实验以确定U87-MG和MCF-7细胞在不同浓度的TCP NPs一起孵育24小时和48小时后的相对存活力。即使在高达0.2mg mL-1的高浓度下，对于两种细胞也未观察到TCPNPs的显著细胞毒性。为了进一步寻找由TCP NPs引起的任何潜在的细胞损伤，还检查了乳酸脱氢酶(LDH)的释放，乳酸脱氢酶(LDH)是细胞膜损伤的指示剂。将使用1％Triton X-100裂解的细胞用作阳性对照。
实例11
细胞和线粒体双靶向AIE特性有机点成像引导光动力疗法
在另一个示例性实施方案中，本发明将治疗剂靶向递送至靶向癌细胞的细胞器。在另一个实施方案中，细胞器是线粒体。本文中，报道了基于具有聚集诱导发光特性的荧光(AIEgen)的用于成像引导的PDT的细胞和线粒体双靶有机点。合成的AIEgen具有增强的红色荧光和改善的聚集状态下的ROS产生。所得的AIE点用叶酸和三苯基膦(TPP)在表面官能化，其能够选择性地内化成叶酸受体(FR)阳性癌细胞，并随后在线粒体中积累。与在细胞质中随机产生的ROS相比，发现在线粒体处的直接ROS生成使线粒体膜去极化，影响细胞迁移，并导致细胞凋亡和死亡，具有增强的PDT效应。该报告展示了用于细胞和线粒体双靶向PDT的简单且通用的纳米载体方法，其为双靶向递送和治疗打开了新的机会。
新的AIEgen，DPBA-TPE，显示出特征性的AIE特征。在光照下，分子发射强烈的红色荧光并且可以有效地在聚集体中产生ROS。然后以脂质-PEG作为包封基质并用改进的纳米沉淀法制造相应的AIE点。在表面携带叶酸和TPP靶向配体，产生的FA-AIE-TPP点能够选择性地内化入叶酸受体(FR)阳性癌细胞而不是其他细胞，并随后在线粒体中累积。与单独的细胞靶向或线粒体靶向AIE点相比，双靶向FA-AIE-TPP点显示增强的PDT效应。因此，这中NP制备代表了一中用于靶向细胞和亚细胞递送的更简单和通用的策略。
图33为制备DPBA-TPE的合成途径。
为了证明AIE点对于细胞和线粒体双靶向图像引导的PDT的潜力，我们合成了新的AIEgen，DPBA-TPE(图33)。通过Knoevenagel反应在碱性条件下由2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛((1R，2S)-2,3-二甲氧基苯-1,4-二醛)(3)和溴苯基乙腈(4)制备3,3'-(2,5-二甲氧基-1,4-亚苯基)双(2-(4-溴苯基)丙烯腈)(5)。在钯催化剂存在和碱性条件下，中间体(5)和芳基胺(10)以令人满意的产率获得最终产物。
使用改进的纳米沉淀方法制备双靶向AIE点。由于它们的高负载效率、优异的胶体稳定性以及引入表面官能团的能力，具有不同端基的脂质-PEG的生物相容性嵌段共聚物(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000])(DPSE-PEG-NH 2)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000])(DSPE-PEG-FA)被选作包封基质。为了形成AIE点，将含有分子溶解的DPBA-TPE、DPSE-PEG-NH 2和DSPE-PEG-FA的THF溶液稀释到MilliQ水中，随后立即使用微尖超声波发生器以12W的功率输出超声波处理120s。在混合和超声处理期间，疏水性DSPE嵌段和DPBA-TPE相互作用并缠结以形成核心，而亲水性PEG嵌段将向外延伸至水相以形成保护壳。PEG壳的存在不仅可以稳定AIE点，而且提供表面氨基用于进一步结合。为了使AIE点到线粒体，能够在线粒体中响应于高线粒体膜电位(MMP)积聚的阳离子TPP然后与AIE点悬浮液反应以产生FA-AIE-TPP点。反应后，使用6至8kDa膜对FA-AIE-TPP点悬浮液对水进行透析以除去过量的TPP。应用类似的程序来制备叶酸单官能化AIE点(AIE-FA)和TPP单官能化AIE点(AIE-TPP)。
图34为FA-AIE-TPP点在a)不同点浓度下的水溶液中和b)不同光功率在照射300秒时ROS产生。
通过在使用DCFH作为指示剂的光照射下测量ROS产生效率，进一步研究了AIE点的PDT效应。如图所示，如图34所示，FA-AIE-TPP点悬浮液能够在白光照射下非常快速和有效地产生ROS，这通过在530nm下DCFH荧光强度的快速增加来证明。而且，增加光照时间、AIE点浓度或光功率也会增加ROS的产生(图34)，表明AIE点的ROS产生是与时间、浓度和功率相关的。这种有效的ROS产生能力使得AIE点成为成像引导PDT的一个好的备选。
图35展现出了与AIE点和MitoTracker Green孵育后的a)MCF-7癌细胞和b)NIH-3T3正常细胞的CLSM图像。AIE点：Ex：543nm，Em：>650nm；MitoTracker Green：Ex＝488，Em＝505-525nm。c)在MCF-7和NIH-3T3细胞内的AIE点和MitoTracker Green之间的Pearson系数。所有图像的比例尺大小为10μm。
通过荧光成像研究了三个AIE点的细胞靶向和线粒体靶向的能力。选择FR阳性的MCF-7乳腺癌细胞作为靶标，用FR阴性的NIH-3T3成纤维细胞作为对照。在以基于DPBA-TPE质量浓度为20μg/mL的三个AIE点孵育两个细胞4小时后，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)获取图像。图35显示这些AIE点在MCF-7或NIH-3T3细胞中的细胞内定位。对于FA-AIE-TPP或AIE-FA点培养的细胞，MCF-7细胞可以观察到比NIH-3T3细胞更强的红色荧光，揭示了叶酸修饰的AIE点具有对FR-阳性细胞的靶向能力。但是AIE-TPP点在两个细胞系内都显示出非常弱的荧光。
图36显示在与a)AIE-TPP、b)AIE-FA和c)不同浓度的FA-AIE-TPP点孵育后，接着进行白光照射的MCF-7癌细胞和NIH-3T3正常细胞的存活力。d)和e)膜联蛋白V标记的MCF-7细胞在没有(d)或(e)光照射的情况下与FA-AIE-TPP点孵育。d)和e)使用相同的比例尺。
通过MTT实验研究三个AIE点的PDT效应对NIH-3T3和MCF-7细胞的存活率的影响。当在黑暗中与三个AIE点孵育24小时时，即使在80μg/mL的高DPBA-TPE浓度下，NIH-3T3和MCF-7细胞都表现出高于90％的高细胞存活率，表明AIE点的低细胞毒性。在平行实验中，将两个细胞系与AIE点孵育4小时，随后用光照射(100mWcm-2)10分钟导致较大的细胞存活率的差异(图36a-c)。所有三个AIE点显示对NIH-3T3细胞的非常低的光毒性，这应该是由于较差的细胞摄取。对于MCF-7细胞，在80μg/mL的DPBA-TPE浓度下，FA-AIE-TPP点在光照射下显示出最有效的杀伤效率，细胞存活率小于10％。在相同条件下，AIE-TPP和AIE-FA点处理的MCF-7细胞分别显示和的细胞活率。半最大抑制浓度(IC50)以在光照射下被用来量化三个点的抗癌效率。AIE-TPP，AIE-FA和FA-AIE-TPP点的IC50值分别为>80，和由于CLSM和流式细胞术显示几乎相同量的AIE-FA和FA-AIE-TPP点被内化到MCF-7细胞中(图35)，FA-AIE-TPP点的较低的IC50清楚地表明定位PS线粒体中负载的纳米载体有助于增强PDT的抗癌作用。AIE-TPP和FA-AIE-TPP点之间的比较还揭示，增加的细胞摄取也有助于增加具有增强的PDT在线粒体中积累的NP的量。此外，FA-AIE-TPP点对MCF-7细胞的杀伤效率也随着暴露时间和光功率而增加。PDT触发的细胞死亡通常破坏线粒体膜并触发细胞色素的释放，导致凋亡过程。我们使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V来区分凋亡细胞和活细胞。如图36d和e所示，观察到MCF-7细胞与FA-AIE-TPP点在黑暗中几乎没有膜联蛋白V的绿色荧光，而在光照射下，可以从细胞膜观察到膜联蛋白V的亮绿色荧光，表明MCF-7细胞在FA-AIE-TPP点和光照射的存在下经历细胞凋亡过程。
图37说明在a)0，b)5和c)10分钟的光照射后，通过JC1测量的FA-AIE-TPP点处理的MCF-7癌细胞的线粒体电位变化。所有图像使用相同的比例尺。
对线粒体的PDT处理可引起线粒体损伤，导致细胞凋亡和死亡。线粒体损伤或功能障碍的特定现象之一是线粒体膜电位(MMP)的丧失，其将在细胞凋亡的早期触发细胞色素的释放。使用在PDT治疗期间监测MMPs变化的膜可渗透的JC-1染料。JC-1染料在其聚集和单体状态之间经历可逆的荧光变化。在高MMP水平下，JC-1在正常线粒体上形成红色发射性荧光聚集体，而在具有低MMP的去极化线粒体上转移到绿色发射单体。图37显示JC-1测定的代表性共聚焦图像，绿色/红色(G/R)比有助于量化PDT期间MCF-7细胞的MMP损失。在黑暗中线粒体中FA-AIE-TPP点的积累不使线粒体膜去极化，如JC-1染料的暗绿色荧光和亮红色荧光所证明的。当暴露于白光时，JC-1染色改变，其中绿色荧光以红色荧光(G/R比率从0.46至3.59和4.37变化)为代价增加，表明MMP的损失和光照射下线粒体的损伤。应当注意，在PDT处理期间仍然可以观察到从FA-AIE-TPP点发射的红色荧光，这提供了在光照射后线状体从特征管状结构到点状结构的形态学变化的可视化。
图38示出了a)在72小时培养之前(上)和之后(下)，FA-AIE-TPP点处理的NIH-3T3和MCF-7细胞的明场图像。将细胞与FA-AIE-TPP点(基于DPBA-TPE质量浓度为20μg/mL)孵育4小时，随后暴露(100mW/cm2)10分钟。b)AIE点处理对有和没有光照射的MCF-7细胞迁移的影响。
线粒体是癌细胞活动(包括增殖、迁移和转移)主要能量来源。在这里一个基本假设是线粒体的功能障碍高度影响ATP产生，从而高度影响癌细胞的迁移。细胞刮擦刮刀法用于研究AIE点对光照射之前和之后的细胞迁移的影响。在与这三个AIE点(基于DPBA-TPE质量浓度为20μg/mL)和光照射(100mWcm-2，10分钟)孵育4小时之前，对细胞单层施加划痕。迁移率通过在PDT处理后迁移至伤口区域的细胞数目与没有AIE点处理的对照细胞的数目以及培养72小时后的光照射(图38)来确定。AIE点和光照射不影响NIH-3T3细胞的迁移能力，因为NIH-3T3细胞迁移到具有 的非常高的迁移率的伤口区域中。另一方面，黑暗中的AIE点不影响MCF-7细胞的迁移能力，但是进一步的光照射抑制了AIE点处理的MCF-7细胞的伤口闭合，迁移率为74.2％，54.1％和6.8％的AIE-TPP，AIE-FA和FA-AIE-TPP点(图38b)。由于癌细胞是高度转移的，所以迁移的抑制也应该有助于抗癌治疗。
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本发明引用的所有专利，公开申请和参考文献教学式整体并入。
虽然本发明参照具体实施示例描述了本发明，但是可以理解的是本领域的技术人员仍可在不脱离本发明所附权利要求涵盖范围内在形式可和细节上进行各种改变。
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<400> 8
Val His Leu Gly Tyr Ala Thr
1 5

Claims (57)

1.具有(XI)结构的荧光团：
或其药学上可接受的盐；
其中W是共轭体系；
R1和R2是H，OH，N(C1–C3)烷基或O(C1-C6)烷基被一个或多个卤素、氨基、PPh3、5-10原子杂环基、N3，-C(O)(C2-C6)炔基或X取代产物。
R3是H，OH，N(C1–C3)烷基或O(C1-C6)烷基被一个或多个选自卤素、氨基、PPh3、5-10原子的杂环基、N3、-C(O)(C2-C6)C6)炔基、X或W取代基取代后的产物；
X是包含连接部分、多个亲水性肽、靶识别基序和任意TPE2的部分；同时，荧光团具有聚集诱导发光性质。
2.权利要求1的荧光团，其中所述共轭体系包括一个或多个芳环、一个或多个杂芳环、一个或多个烯烃、一个或多个包含p-轨道的杂原子，或其组合。
3.权利要求1或2的荧光团，其中所述共轭体系是：
R4是任选被N3、氨基、(C1-C3)炔基、-C(O)OH、卤素、-SH、马来酰亚胺或OH取代的C1-C6的烷基链；
R5是任选被N3、氨基、(C1-C3)炔基、-C(O)OH、卤素、-SH、马来酰亚胺、OH、芳基或杂芳基取代的芳基、杂芳基、(C1-C6)烷基或(C2-C6)烯基，其中每个取代基仍然可没-O-(C1-C6)烷基氨基取代；和
R6是芳基或杂芳基。
4.权利要求1-3中任一项所述的荧光团，其中所述连接部分包含在外部刺激时可断裂的化学键。
5.权利要求1-4中任一项的荧光团，其中所述连接体是
6.根据权利要求1-5中任一项所述的荧光团，其中所述靶识别基序特异性结合生物靶标。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的荧光团，其中所述生物靶标是蛋白质表面生物标志物、细胞表面标志物或细菌表面标志物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的荧光团，其中所述靶识别基序是对整联蛋白αvβ3具有亲和力的环状(Arg-Gly-Asp)残基。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的荧光团，其中X为：
10.权利要求1或权利要求2的荧光团，具有(II)的结构：
或其药学上可接受的盐。
11.权利要求1或权利要求2的荧光团，具有(III)的结构：
或其药学上可接受的盐。
12.权利要求1或权利要求2的荧光团，具有(X)的结构：
或其药学上可接受的盐。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的荧光团，其中所述荧光团被封装在生物相容性基质中；
其中所述基质包括脂质、聚乙二醇、壳聚糖、聚乙烯醇、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或牛血清白蛋白；
其中聚乙二醇、壳聚糖、聚乙烯醇、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或牛血清白蛋白任选地通过一种或多种脂质，马来酰亚胺、羟基、胺、羧基、巯基或其组合官能化。
14.根据权利要求13所述的荧光团，其中所述生物相容性基质的外表面用包含Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys的氨基酸残基序列的细胞穿透肽SEQ ID NO:1)，Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg(SEQ ID NO:2)，Lys-Arg-Pro-Ala-Ala-Thr-Lys-Lys-Ala-Gly-Gln-Ala-Lys-Lys-Lys-Leu(SEQ ID NO:3)和Gly-Leu-Ala-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser-Thr-Met-Gly-Ala-Trp-Ser-Gln-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val(SEQ ID NO:4)或Val-His-Leu-Gly-Tyr-Ala-Thr(SEQ ID NO:8)，
或其药学上可接受的盐。
15.权利要求1-14中任一项的荧光团在生物对象例如细胞的可视化中的用途或用于成像引导的光动力学治疗的用途。
16.一种化学组合物，其包含：靶向识别基序、荧光团、连接部分和化疗药物，其中所述靶向识别基序、所述荧光团、所述连接部分和所述化疗药物通过共价键以线性阵列连接；所述靶向识别基序在所述线性阵列的末端；所述荧光团具有聚集诱导发光性质，以及包含任意被H、OH、O(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基取代的四苯乙烯基、或者被-CN取代的(C2-C6)烯基。
17.权利要求16的组合物，其中所述连接部分是前药。
18.权利要求17的组合物，其中所述前药是铂(IV)络合物。
19.权利要求16-18中任一项的组合物，其中所述靶识别基序对细胞膜受体具有亲合力。
20.权利要求16-19中任一项的组合物，其中所述靶识别基序是对整联蛋白αvβ3具有亲和力的环状(Arg-Gly-Asp)残基。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的组合物，其中所述化疗药物是多柔比星。
22.权利要求16-21中任一项的组合物具有(IV)的结构：
或其药学上可接受的盐。
23.权利要求16-22中任一项组合物具有(IX)的结构：
或其药学上可接受的盐。
24.一种评估前药转化成其活性形式方法，包括：
a)在足以形成孵育的混合物的条件下将生物样品与权利要求16-23中任一项组合物一起孵育；
b)分析a)所得的孵育混合物的荧光，对比权利要求16-23中任组合物在加入生物样品前后荧光信号变化，荧光信号的变化指示转化的前药转化为其活性形式。
25.权利要求24的方法，其中所述方法在活的生物体例如细胞中进行。
26.权利要求24或权利要求25的方法，其中所述孵育步骤还包括用抗坏血酸或谷胱甘肽孵育所述生物样品。
27.共轭聚合物(V)：
或其盐，其中：
U是(C1-C20)烷基链或(CH2CH2O)1-20；
R2是
V是O或NH或Si；
Y是
Z是H或(C1-C6)烷基链；
每个R3都是独立的-COOH or–CO-B；
B是化疗药物；n为5-115的整数；m是5-115的整数。
28.权利要求27的共轭聚合物，其中至少一个R3是-CO-B。
29.权利要求27或权利要求28的共轭聚合物，其中所述化疗药物是多柔比星、紫杉醇、美法仑、喜树碱或吉西他滨。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的共轭聚合物，其中所述共轭聚合物是基于共轭聚合物的纳米颗粒。
31.权利要求30的共轭聚合物，其中所述纳米颗粒的外表面通过靶识别基序功能化。
32.权利要求31的共轭聚合物，其中所述靶识别基序对细胞膜受体具有亲合力。
33.权利要求32的共轭聚合物，其中所述靶识别基序是对整联蛋白αvβ3具有亲和力的环状(Arg-Gly-Asp)残基。
34.一种结合化疗和光动力治疗来治疗癌症的方法，包括：
a)在足以形成孵育混合物的条件下，对含有癌细胞的生物样品和权利要求30-33中任一共轭聚合物纳米颗粒进行孵育，其中至少一个R3是-CO-B；
b)用足以产生活性氧物质的波长的光照射孵育的混合物，其中活性氧物质与共轭聚合物反应以将化疗药物转化为活性形式，并且进一步其中活性氧物种活化共轭聚合物以用作光敏剂。
35.根据权利要求34所述的方法，其还包括通过荧光观察所述经照射的混合物，其中与根据权利要求30-33中任一项所述的基于共轭聚合物的纳米颗粒的荧光信号相比，所述经照射的混合物的荧光信号的变化，孵育指示化学治疗药物转化为活性形式。
36.权利要求35的方法，还包括通过荧光成像确定共轭聚合物基纳米颗粒的细胞摄取。
37.如权利要求36所述的方法，其中确定所述基于共轭聚合物的纳米颗粒的细胞摄取的步骤是定量的。
38.权利要求27的共轭聚合物，其中R2是
39.根据权利要求38所述的共轭聚合物，其中所述共轭聚合物是基于共轭聚合物的纳米颗粒。
40.权利要求39的共轭聚合物，其中化学治疗药物包封在所述基于共轭聚合物的纳米颗粒中。
41.权利要求40的共轭聚合物，其中所述化疗药物是紫杉醇。
42.权利要求39-41中任一共轭聚合物所对应纳米颗粒外表面进行靶识别基序修饰。
43.权利要求42的共轭聚合物，其中所述靶识别基序对细胞膜受体具有亲合力。
44.权利要求43所述共轭聚合物的靶向识别基序是对整联蛋白αvβ3具有亲和力的环状(Arg-Gly-Asp)残基。
45.根据权利要求30-33或38-44中任一基于共轭聚合物的纳米颗粒在成像引导化疗和光动力治疗中的用途。
46.一种用于显现生物样品的探针，所述探针包含荧光团，连接部分和多个肽，
其中所述荧光团，所述连接部分和所述多个肽通过共价键以线性阵列连接；所采用荧光团具有聚集诱导发光性质，以及包含任意被H、OH、O(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基取代的四苯乙烯基，或者被-CN取代的(C2-C6)烯基。
47.根据权利要求46中任一所述的探针，具有式(VII)的结构：
或其药学上可接受的盐。
48.权利要求46的探针，具有式(VIII)的结构：
或其药学上可接受的盐。
49.权利要求46-48中任一探针在细胞或者细菌可视化中的用途。
50.权利要求46-48中任一探针在细胞器可视化中的用途。
51.权利要求50的用途，其中所述细胞器是线粒体或者细胞核。
52.权利要求46-48中任一项的探针在成像引导光动力治疗细胞中的用途。
53.一种包含荧光团，连接部分和低聚乙烯亚胺的聚合物，其中所述荧光团，所述连接部分和所述低聚乙烯亚胺通过共价键以线性阵列连接；所采用荧光团具有聚集诱导发光性质，如H，OH，O(C1-C6)烷基、芳基、杂芳基取代的四苯乙烯基，或者-CN取代的(C2-C6)烯基。
54.权利要求53的聚合物，其具有式(XII)的结构
其中m是1至200之间的整数，n是5至400之间的整数，而x+y+z是5和10之间的整数。
55.一种将靶向试剂递送至细胞的方法，所述方法包括：
a)在足以形成试剂-聚合物颗粒的条件下，权利53-54要求中的任意一种聚合物与靶向试剂结合；
b)在足以形成孵育混合物的条件下，将所述试剂-聚合物颗粒将细胞孵育；和
c)用足以产生活性氧物质的波长的光照射所述孵育的混合物，其中所述活性氧物质与所述物质聚合物颗粒反应以将所述试剂从所述物质-聚合物颗粒释放到细胞中。
56.权利要求55的方法中所述试剂是DNA，RNA，SiRNA或药物。
57.一种用于设计和筛选用于光动力治疗的光敏剂化合物的方法，包括：
a)选择包含供体-受体结构的一类化合物；
b)对多个该类化合物进行单重激发态和三重激发态之间的能隙值(ΔEST)的计算；
c)鉴定ΔEST小于或等于1的化合物；
d)鉴定化合物产生单线态氧的能力；
e)从步骤(d)中具有最高单线态氧量子产率的的化合物中选择光敏剂化合物。
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