CN111840552A - 一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法及应用 - Google Patents

一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法，步骤为：将叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点溶于双蒸水中，加入还原剂溶液和铜源溶液，静置反应后离心保留沉淀，再用双蒸水和无水乙醇洗涤并干燥，得棕色粉末即为共价交联碳纳米点自组装材料。本发明采用生物正交“点击”反应，构建共价交联的CND自组装材料，用共价键代替非共价键，将游离的CND颗粒共价交联形成有序的组装材料，从而稳定颗粒间的电荷密度分布和电子跃迁过程，维持增强的近红外光吸收能力和光热转换性能，制备出的自组装材料粒径为5‑15nm，在808nm光照条件下，其光热转换效率达到46％‑53％，对耐万古霉素肠球菌的光热和光动力灭菌治疗效果明显。

Description

一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及纳米技术领域，尤其涉及一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法及应用。
背景技术
碳纳米点(Carbon nanodots,CND)，又叫碳量子点(Carbon quantum dots,CQD)，作为一种新型的碳基零维纳米材料，具有体积小、成本低、水溶性好、毒性小、可生物降解和免疫原性低等优点，已广泛用于生物材料的荧光标识和诊断检测。虽然CND良好的生物相容性为耐药菌的诊疗提供了有效的生物安全保障，但是CND在近红外区的光吸收能力较弱，光热转换性能不佳，限制了其在光声成像和光热治疗领域的应用。为此，研究人员借助自组装技术设计合成了CND自组装材料，有效改善了近红外区的光吸收能力，提高光热转换效率，并成功用于肿瘤组织的光声成像和光热治疗，实现了肿瘤的诊疗一体化应用。虽然CND自组装材料在光热治疗领域显示出独特的优势，已成为诊疗一体化应用领域的前沿热点材料。但是，该材料仍面临稳定性差的问题，限制了诊疗一体化的临床应用。如何优化CND自组装材料的稳定性，改善耐药菌光热治疗效果，是耐药菌治疗领域亟待解决的核心科学问题。
区别于分散的CND颗粒，CND自组装材料具有显著增强的近红外光吸收能力和光热转换性能。产生这种差异的主要原因在于非共价键(氢键和静电引力)介导的颗粒组装效应。组装前的CND颗粒电荷密度分布处于空间分离状态，无法完成从高能量分子轨道(HOMO)到低能量分子轨道(LOMO)电子跃迁过程，表现出较低的近红外光吸收能力和光热转换性能。然而，借助非共价键作用形成组装材料后，CND颗粒紧密聚集促使电荷密度分布产生部分重合，从HOMO到LOMO的电子跃迁得以顺利进行，从而表现出近红外光区(700nm)光吸收能力和光热转换性能的显著增强。然而，非共价键介导的组装效应极易受到溶剂、浓度和环境因素的影响，在一定程度上限制了CND自组装材料的诊疗一体化应用。因此，有必要设计合成一种新型的碳纳米点自组装材料，以有效维持CND颗粒的组装效应，提高自组装材料的稳定性。
生物正交“点击”反应指的是能够在活体细胞或组织中进行的一类高效的共价偶联反应，它们不会干扰生物体自身的生化反应，具有选择性好、产率高、无有毒副产物、反应原料易得等优点。目前，这些反应已被广泛用于耐药菌的诊疗研究。例如，美国麻省总医院的Weissleder教授利用四嗪/反式环辛烯间的“点击”反应检测VRE耐药菌。美国劳伦斯伯克利国家实验室的Northen教授也借助生物正交“点击”反应进行土壤微生物的标记和分类。
发明内容
本发明针对现有碳纳米点自组装材料稳定性不足的问题，提供一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法，其操作为：将叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点溶于双蒸水中，加入还原剂溶液和铜源溶液，静置反应后离心保留沉淀，再用双蒸水和无水乙醇洗涤并干燥，得棕色粉末即为共价交联碳纳米点自组装材料。
本发明方法采用的叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点可采用以下方法制得：将无水柠檬酸颗粒放置于圆底烧瓶中，180-240℃油浴加热，加热时间为2-3h，变为棕色粉末，制得碳纳米点颗粒，将所得碳纳米点颗粒和11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺按质量比1:(5-25)加入无水DMF中搅拌12-24h，将混合物进行透析，截留分子量大于500Da的固体，再经孔径为0.22μm的滤膜过滤，冷冻干燥后制得叠氮修饰的碳纳米点；将11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺替换为炔丙胺，其他操作不变，即制得炔基修饰的碳纳米点。透析时使用的透析液种类、透析时间和透析顺序为第一次DMF透析30分钟-1小时，第二次双蒸水透析1-4小时，第三次5％盐酸溶液透析3-6小时，第四次双蒸水透析1-3小时，第五次1mol/L氢氧化钠溶液透析3-6小时，第六次双蒸水透析12-24小时。
本发明控制叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点的浓度在1-10mg/mL范围内，且控制二者的质量比为2:1，可获得粒径在5-15nm的颗粒材料。本发明所用还原剂为抗坏血酸类还原剂，具体为抗坏血酸或者抗坏血酸钠，浓度为20-60mmol/L。所用铜源为常见可溶铜盐，不限于选自硫酸铜、氯化铜或者硝酸铜，浓度为1-6mmol/L。
本发明采用生物正交“点击”反应，构建了共价交联的碳纳米点自组装材料，用共价键代替原有的非共价键，将游离的碳纳米点颗粒共价交联形成有序的组装材料，从而稳定颗粒间的电荷密度分布和电子跃迁过程，维持增强的近红外光吸收能力和光热转换性能，制备出的共价交联的碳纳米点自组装材料粒径为5-15nm，作为光热转换材料，在808nm光照条件下，其光热转换效率达到46％-53％，具有对耐药菌的抑制能力，尤其对耐万古霉素肠球菌的光热和光动力灭菌治疗效果明显。
附图说明
图1为实施例1合成的碳纳米点和共价交联的碳纳米点自组装材料的透射电镜图；(a)碳纳米点(CND)；(b)共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)。
图2为实施例1合成的碳纳米点(CND)和共价交联的碳纳米点自组装材料(CNDassembly)的表征；(a)为傅里叶红外图谱(FTIR)；(b)X射线能谱仪成分析图(EDS)。
图3为实施例1合成的碳纳米点和共价交联的碳纳米点自组装材料(CNDassembly)的Zeta电位分析图。
图4为实施例1合成的碳纳米点(CND)和共价交联的碳纳米点自组装材料(CNDassembly)的光谱表征。(a)紫外可见分光光谱图；(b)荧光光谱图。
图5为实施例1合成的碳纳米点(CND)和共价交联的碳纳米点自组装材料(CNDassembly)的稳定性测试。
图6为实施例1合成的碳纳米点(CND)和共价交联的碳纳米点自组装材料(CNDassembly)的体外光热转换性能测试结果。
图7为实施例1合成的共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)用于两种耐万古霉素场球菌的体外光热抑菌治疗后的荧光染色分析图。
图8为实施例1合成的共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)用于耐万古霉素场球菌的体外光热和光动力抑菌治疗后的荧光染色分析。
图9为实施例1合成的共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)对耐万古霉素场球菌的光热和光动力灭菌治疗的定性结果。
图10为实施例1合成的共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)对耐万古霉素场球菌的光热和光动力灭菌治疗的定量结果。
图11为本发明共价交联碳纳米点自组装材料应用于耐万古霉素肠球菌的灭菌治疗的示意图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一、制备
1、制备碳纳米点颗粒
将10g无水柠檬酸放置于100mL圆底烧瓶中180℃油浴加热2小时，当加热30min后，粉末溶解后的溶液由无色变为淡黄色，然后变为橙色，继续加热到2小时，终止反应，圆底烧瓶底部即为CND颗粒，产物不需要进一步提纯。
2、制备叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点
取两个0.05g上述CND颗粒分别与0.98g 11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺和55μL炔丙胺混合后，置入两个0.5mL无水DMF中，均磁搅拌16小时，然后将反应物放入透析袋中，先在DMF中透析1小时，再转移到双蒸水中透析1小时，然后转移到用5％盐酸溶液透析3小时，再转移到双蒸水透析1小时，再转移到1mol/L氢氧化钠溶液透析3小时，最后转移到双蒸水透析12小时，再分别经过0.22μm滤膜过滤，并冷冻干燥得到两种黄色粉末，即得叠氮修饰的碳纳米点(CND@N3)和炔基修饰的碳纳米点(CND@C≡C)。
实施例1
一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法，步骤如下：将上述所得叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点分别配置成1mg/mL和2mg/mL的溶液，与浓度为60mmol/L的抗坏血酸溶液以及浓度为6mmol/L的硫酸铜溶液按体积比1:1:0.5:0.025混合均匀，静置反应后离心保留沉淀，再用双蒸水和无水乙醇洗涤并干燥，得棕色粉末共价交联碳纳米点自组装材料(CND assembly)。
实施例2
一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法，步骤如下：将上述所得叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点分别配置成5mg/mL和5mg/mL的溶液，与浓度为40mmol/L的抗坏血酸溶液以及浓度为3.5mmol/L的硫酸铜溶液按体积比2:1:1:0.05混合均匀，静置反应后离心保留沉淀，再用双蒸水和无水乙醇洗涤并干燥，得棕色粉末共价交联碳纳米点自组装材料(CND assembly)。
实施例3
一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法，步骤如下：将上述所得叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点分别配置成10mg/mL和10mg/mL的溶液，与浓度为20mmol/L的抗坏血酸溶液以及浓度为1mmol/L的硫酸铜溶液按体积比1:1:0.75:0.0375混合均匀，静置反应后离心保留沉淀，再用双蒸水和无水乙醇洗涤并干燥，得棕色粉末共价交联碳纳米点自组装材料(CND assembly)。
图1(a)为本实施例合成的游离碳纳米点(CND)的透射电镜图。图(b)为共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)的透射电镜图。
由图1可以看出游离碳纳米点的颗粒大小为2-3nm，而共价交联后的碳纳米点自组装材料的颗粒大小为5-15nm。
图2(a)为本实施例合成的游离碳纳米点(CND)和共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)的傅里叶红外图谱。图2(b)为游离碳纳米点(CND@C≡C和CND@N3)和共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)的X射线能谱仪成分析图。
由图2(a)可以看出，游离的CND经过化学修饰后，CND@C≡C在2080处出现了C≡C的红外吸收峰，CND@N3在2100处有明显的N3的红外吸收峰，表明CND表面分别成功修饰上了C≡C和N3功能团。共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)中C≡C和N3的特征峰消失，且在990cm-1和1050cm-1处出现了明显的C-N峰，表明了C≡C和N3间发生了点击反应，形成共价键，碳纳米点共价交联形成自组装材料。由图2(b)可以看出，游离的CND经过化学修饰后，CND@N3出现N元素峰，表明CND表面分别成功修饰上了N3功能团。共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)除了保留N元素峰外，还增加了Cu元素峰，表明一价Cu离子催化C≡C和N3间发生点击反应形成共价键，进一步证实碳纳米点通过共价交联形成自组装材料。
图3实施例1合成的碳纳米点(CND)和共价交联的碳纳米点自组装材料(CNDassembly)的Zeta电位分析图。
由图3可以看出，游离的CND经过化学修饰后，CND@C≡C和CND@N3的电位从-8mV变为-45mV，证实C≡C和N3成功修饰到CND表面。而共价交联的碳纳米点自组装材料的电位又变回-8mV，表明C≡C和N3间发生点击反应形成共价键，成功形成共价交联的碳纳米点自组装材料。
图4实施例1合成的碳纳米点(CND)和共价交联的碳纳米点自组装材料(CNDassembly)的光谱表征。(a)紫外可见分光光谱图；(b)荧光光谱图。
由图4(a)可以看出，化学修饰后的CND@C≡C和CND@N3的溶液颜色和紫外可见吸收峰与CND类似，它们的吸收峰主要位于200nm-400nm，近红外吸收性能却非常低。然而，共价交联后形成的自组装材料的颜色由原来的淡黄色变为棕灰色。并且，组装后的材料在红外和近红外区(600nm-1100nm)的吸收性能显著增加，为后续的近红外光热和光动力性能的增强奠定基础由图4(b)可以看出，CND、CND@N3和CND@C≡C均有明显的荧光信号，而共价交联后的碳纳米点自组装材料(CND assembly)却出现明显的荧光猝灭现象，荧光信号显著降低。
图5实施例1合成的共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)的稳定性测试。
由图5所示，共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)的紫外可见吸收光谱在30天内并未发生明显的变化，证实该自组装材料具有良好的稳定性。
二、检测
1、共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)的体外光热转换性能测试
取实施例1制得的500μL CND assembly于比色皿中，使用808nm、2W/cm2的激光照射，记录随照射时间增加，溶液温度的变化。且经过反复多次的光热转换性能测试。
图6(a)为光照条件下CND assembly的溶液温度随时间的变化曲线。由图6(a)可以看出，在10分钟的照射时间内，2mg/mL的CND assembly溶液中温度差可高达到约40℃。
图6(b)为CND assembly与游离CND的光热图片对比。由图6(b)可以看出，CNDassembly溶液的温度随着照射时间的增加而显著升高。而CND对照组却未见明显的温升。这一结果进一步证实了近红外光照射下CND assembly具有良好的光热性能。
图6(c)为不同浓度的CND assembly在照射下，其溶液温度随时间的变化曲线。由图6(c)可以看出，随着CND assembly浓度和照射时间的增加，CND assembly溶液的温度迅速升高。
图6(d)为CND assembly(2mg/mL)在808nm激光(2W/cm2)照射及关闭条件下，其溶液温度随时间的变化曲线。由图6(d)可以看出，CND assembly的开-关温度曲线随着光照次数的增加没有发生明显的变化，这进一步证实了CND assembly具有良好且稳定的光热性能，可循环使用，重复使用，进而保证了光热治疗应用期间的治疗效果。
2、共价交联的碳纳米点自组装体(CND assembly)的体外光动力学测试
将游离CND和CND assembly与15μMN,N-二甲基-4-亚硝基苯胺(RNO)溶液、15μM咪唑溶液、pH 7.410mM的PBS缓冲液，按照体比1:1:1:1均匀混合于比色皿中，用808nm 2W/cm2的激光照射2min、4min、6min、8min、10min，立即测定440nm的吸光值，在440nm处衰减的RNO可以反映活性氧的变化。
图7(a)为CND assembly(1mg/mL)在808nm激光(2W/cm2)照射10min时，其紫外可见风光光谱的照射前后变化。由图7(a)可以看出，光照后，游离CND的光谱没有明显的变化，也就是说，游离CND不能产生活性氧，其光动力性能较差。而CND assembly在440nm处的吸收峰明显下降，证实了CND assembly能产生明显的活性氧，且聚集后的CND的光动力性能明显好于游离的CND。
图7(b)为CND assembly(1mg/mL)在808nm激光(2W/cm2)照射时，其440nm处吸光值减少量与照射时间的关系。由图7(b)可以看出，与游离CND相比，440nm处吸光值的减少量随着照射时间的增加而增加，证实CND assembly产生的活性氧含量与照射时间成正比例关系。
3、共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)用于耐万古霉素场球菌的体外光热和光动力抑菌治疗后的荧光染色分析
从LB平板上挑取单克隆菌株到5mL LB培养液中，37℃过夜培养。4000rpm离心收集细菌，并用无菌PBS缓冲液洗涤3次后，用PBS缓冲液重悬细菌沉淀后调节OD600为0.5，然后取250μL菌液与250μL、1.0mg/mL、的CND assembly溶液混合后，于37℃培养箱中放置15min后，进行光照或者非光照处理，所有光照实验均采用激光(808nm，2W/cm2)照射10min，向500μL处理后的菌液中加入2μL的SYTO-9/PI混合染料，孵育15min后于荧光显微镜观察并拍照。
图8为耐万古霉素肠球菌Enterococcus Faecalis(ATCC 51299,Van B)分别经PBS缓冲液、CND和CND assembly非光照或光照处理后的SYTO-9/PI荧光染色结果。其中，SYTO9可以穿过活细菌的细胞壁与DNA结合使其显示绿色，而PI只能穿过死细菌不完整的细胞壁，使死的细菌被染成红色。从图中可以看出，图8(a)和(d)中的细菌均显示明显的绿色，说明经过PBS缓冲液处理的两种细菌都是活的。而图8(b)和(e)中的细菌也显示为绿色，即均为活菌，说明游离的CND在光照和非光照条件下对细菌都不具有显著的杀灭作用。图(c)中的细菌大部分为绿色，说明CND assembly本身对细菌没有杀灭作用。而图(f)中的细菌却全部变成红色，说明在CND assembly在NIR光照处理后，大部分细菌均死亡，表明CND assembly具有良好的光热和光动力杀灭作用。
4、共价交联的碳纳米点自组装材料(CND assembly)用于耐万古霉素场球菌的体外光热和光动力抑菌治疗
从LB平板上挑取单克隆菌株到5mL LB培养液中，37℃过夜培养。4000rpm离心收集细菌，并用无菌PBS缓冲液洗涤3次后，用PBS缓冲液重悬细菌沉淀后调节OD600为0.5。然后取250μL菌液与不同浓度250μL的CND assembly混合后，于37℃培养箱中放置15min后，进行光照或者非光照处理。所有光照实验均采用激光(808nm，2W/cm2)照射10min。然后将菌液稀释100倍后，取50μL加到LB固体培养基上，涂匀后放于37℃过夜培养，记录平板菌落数量。
图9是CND assembly对耐万古霉素场球菌Enterococcus facecium(ATCC 51299，VanB)的光热和光动力灭菌治疗的定性结果；由图9(b)、(e)可以看出，与PBS对照组相比，在0.5mg/mL浓度条件下，游离的CND在光照和非光照条件下对VanB细菌均无明显杀灭作用。由图9(c)、(f)可以看出，CND assembly在非光照条件下，未表现出明显的杀菌性能。而在808nm激光照射10分钟后，0.5mg/mL CND assembly几乎完全杀灭VanB细菌，这与上述CNDassembly的高效光热转化性能以及与其活/死细菌荧光染色的结果高度一致。所有这些数据表明，CND assembly具有良好的光热杀菌性能。
图10是CND assembly对耐万古霉素场球菌Enterococcus facecium(ATCC 51299，VanB)的光热和光动力灭菌治疗的定量结果。由图10可以看出，CND assembly的光热和光动力灭菌性能随着浓度的升高显著增强。当CND assembly的浓度达到200μg/mL时，VanB细菌的死亡率能够达到99.99％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种共价交联碳纳米点自组装材料的制备方法，其特征在于，步骤为：将叠氮修饰的碳纳米点和炔基修饰的碳纳米点溶于双蒸水中，加入还原剂溶液和铜源溶液，静置反应后离心保留沉淀，再用双蒸水和无水乙醇洗涤并干燥，得棕色粉末即为共价交联碳纳米点自组装材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叠氮修饰的碳纳米点的制备方法为：将无水柠檬酸颗粒放置于圆底烧瓶中，180-240℃油浴加热，加热时间为2-3h，变为棕色粉末，制得碳纳米点颗粒，将所得碳纳米点颗粒和11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺按质量比1:(5-25)加入无水DMF中搅拌12-24h，将混合物进行透析，截留分子量大于500Da的固体，再经孔径为0.22μm的滤膜过滤，冷冻干燥后制得叠氮修饰的碳纳米点；所述炔基修饰的碳纳米点的制备方法为：将11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺替换为炔丙胺，其他操作不变，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述叠氮修饰的碳纳米点和所述炔基修饰的碳纳米点的浓度为1-10mg/mL，所述还原剂的浓度为20-60mmol/L，所述铜源的浓度为1-6mmol/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述还原剂为抗坏血酸或者抗坏血酸钠。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述铜源为硫酸铜、氯化铜或者硝酸铜之一。
6.一种如权利要求1-5任一项所述方法制备的共价交联碳纳米点自组装材料，其特征在于，所述共价交联碳纳米点自组装材料应用于耐万古霉素肠球菌的灭菌治疗。
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