IT202000028445A1 - Nanosistema per la diagnosi ed il trattamento fototermico di tumori - Google Patents

Description

TITOLO

Nanosistema per la diagnosi ed il trattamento fototermico di tumori

Nanosystem for diagnosis and photothermal treatment of tumors

Campo tecnico

La presente invenzione ? relativa ad un nanosistema per la diagnosi, il trattamento di tumori guidato da immagini ed il monitoraggio del microambiente tumorale. Il nanosistema ? un mezzo di contrasto comprendente uno shell polimerico a base di un nanogel di acido ialuronico e nanoparticelle super-paramagnetiche a base di ossido di ferro (nel seguito indicate come SPIONs - Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles) e nanoparticelle di carbonio (nel seguito indicate come CDs ? Carbon Dots).

Pi? in particolare l?invenzione si riferisce ad un nanosistema che si innesta in due grandi aree di ricerca.

La prima ? quella che descrive l?utilizzo di nanotecnologie per il sensing molecolare, utili nella medicina di precisione. Quest?area di ricerca si occupa di sviluppare nanotecnologie che rispondono a stimoli endogeni o esogeni ben precisi per potere monitorare dei cambiamenti fisiopatologici che indicano il decorso di una patologia.

La seconda ? relativa allo sviluppo e produzione di nanomedicine con azione teranostica (dall?unione di terapia e diagnostica) multieffetto (effetti terapeutici sinergici) e multimodale (diagnosi combinata) per la diagnosi ed il monitoraggio di masse tumorali ed il loro simultaneo trattamento terapeutico. Pi? nel dettaglio, si tratta di un?area di ricerca volta allo sviluppo di nanotecnologie avanzate con propriet? terapeutiche multiple, tra cui il rilascio controllato e on-demand di molecole bioattive e il trattamento fototermico indotto da laser a infrarossi, e con propriet? di contrasto multimodali (solitamente risonanza magnetica e imaging a fluorescenza).

Arte nota

Attualmente la terapia antitumorale per i tumori solidi prevede la resezione chirurgica seguita da cicli di chemioterapia o radioterapia o una combinazione di esse. Recentemente, trova posto anche l?immunoterapia, che sembra promettere un buon successo terapeutico in molti campi dell?oncologia ma che tuttavia ha costi elevati quasi inaccessibili per la sanit? pubblica.

Di recente, la tendenza della medicina a intraprendere percorsi terapeutici personalizzati rende necessario l?utilizzo di diagnosi pi? avanzate e in realtime, con lo scopo di identificare in maniera precisa la massa tumorale da trattare e di verificarne tutte le trasformazioni anatomo-patologiche subite dalla stessa durante il trattamento farmacologico. In questo modo ? possibile in linea di principio adattare la terapia farmacologica pi? adatta al paziente in esame, sia in termini di efficacia terapeutica che in termini di effetti avversi.

E? sempre pi? sviluppata la convinzione che l?utilizzo di nanosistemi con attivit? diagnostica e terapeutica combinata (teranostica) nella medicina antitumorale di precisione rappresenter? il futuro del trattamento clinico di elezione nei tumori complessi metastatici e delle condizioni correlate a crescita cellulare incontrollata, come ad esempio: PIK3CA-related overgrowth spectrum ? PROS ? o nelle iperplasie benigne. Affinch? ci? possa avvenire, lo sviluppo di nanotecnologie, pi? precisamente di nanomedicine con azione teranostica, dovr? andare di pari passo con le innovazioni in campo biotecnologico in modo da permettere il riconoscimento molecolare di specifici citotipi tumorali e non, il loro inquadramento prognostico in maniera dinamica prima e durante il trattamento terapeutico, e l?eradicazione selettiva dei citotipi patologicamente rilevanti.

Sono ad oggi in uso molte terapie che hanno gi? ampiamente dimostrato come l?utilizzo di nanomedicine possa modificare il profilo di biodistribuzione di farmaci antitumorali, migliorando cos? gli effetti farmacologici degli stessi e diminuendo gli effetti off-target. Esempi concreti sono il caso del Doxil?, Zinostatin?, Myocet? e Nanotherm?.

Tuttavia, ad oggi non ci sono nanomedicine antitumorali in uso con azione teranostica multimodale, capaci di rilevare modificazioni del microambiente tumorale nel corso del trattamento, e che permettano simultaneamente il trattamento fototermico mirato.

Alcune nanomedicine in fase di studio clinico sono ad esempio il CriPec?, che combina l?azione di docetaxel con Zirconio-89 come agente di imaging in PET imaging e il nanosistema NBTXR3<?>, costituito da nanoparticelle di afnio come enhancer di radiazioni ionizzanti.

Oggi l?imaging di risonanza magnetica (RM) rappresenta lo strumento di diagnostica per immagini pi? diffuso e sensibile per la diagnosi e la caratterizzazione di diversi quadri patologici. Tramite l?imaging a RM ? possibile acquisire immagini morfologiche ad alta risoluzione (spaziale e di contrasto) oltre che informazioni di natura ultrastrutturale, metabolica e funzionale (Chen L.Q. et al., Evaluating pH in the Ectracellular Tumor Microenviroment Using CEST MRI and Other Imaging Methods, Adv in Radiology, 2015:206405).

L?utilizzo di mezzi di contrasto paramagnetici consente di migliorare ulteriormente le performance della diagnostica per immagini mediante RM. I mezzi di contrasto pi? comunemente oggi utilizzati in quest?ambito sono chelati del gadolinio in grado di determinare una netta riduzione dei tempi di rilassamento T1 risultando in un aumento del segnale RM in tutte quelle aree tissutali dove il gadolinio si ? depositato (mezzi di contrasto ?positivi?). Questi mezzi di contrasto sono solitamente somministrati per via endovenosa per migliorare l?identificazione di tessuti patologici o per rilevare quadri scarsamente apprezzabili utilizzando le sole sequenze RM acquisite senza mezzo di contrasto (ad esempio meningiti o leptomeningiti).

Specie in ambito oncologico, l?imaging multiparametrico mediante RM ad alto campo (?1.5T) ? un prerequisito obbligatorio per qualsiasi percorso diagnostico-terapeutico. In letteratura vi sono gi? evidenze sperimentali di mezzi di contrasto super-paramagnetici basati su SPIONs (Dulinska-Litewka, J. Et al., Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles ? Current and Prospective Medical Applications. Materials 2019, 12, 617). Questa famiglia di mezzi di contrasto trova applicazione in virt? della capacit? di determinare un decremento del segnale pesato in T2 e T2* rispettivamente in sequenze Spin Echo (SE) e Gradient Echo (GRE) con iniziali evidenze in sequenze inversion recovery pesate in T2 per eliminare il segnale proveniente dai fluidi (Fluid Attenuated Inversion Recovery, FLAIR). Le attuali evidenze scientifiche identificano le SPIONs come possibili mezzi di contrasto in RM ad uso diagnostico per valutare ? tra gli altri ? processi infiammatori, oncologici, di angiogenesi, di espressione genica, di aterosclerosi o di ?stem cell tracking? (Zachary, R.S. et al., Magnetite Nanoparticles for Medical MR Imaging. Mater Today 2011, 14, 330-338). Bench? le applicazioni in ambito diagnostico siano estremamente promettenti le SPIONs posso essere utilizzate anche in ambito terapeutico per ?targeted drug delivery? se legati ad agenti chemioterapici, anti-infiammatori, anti-infettivi, radioattivi o ancora per terapia ipertemica (Swati Kaushik et al., In Situ Biosynthesized Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles (SPIONS) Induce Efficient Hyperthermia in Cancer Cells, ACS Appl Biomat 2020, 3, 779-788).

Le SPIONs non permettono tuttavia di identificare i cambiamenti del microambiente tumorale in risposta ad un trattamento terapeutico, poich? non possiedono propriet? di sensing di pH, temperatura, tutti parametri che subiscono variazioni sostanziali durante il processo di guarigione. Pi? nel dettaglio, le SPIONs non cambiano le propriet? di contrasto in RM in base a variazioni di pH e temperatura. ? noto che a seguito dei processi di guarigione di tumori il pH del microambiente tumorale tende a passare da una condizione debolmente acida (pH 5.5 < pH < 6.4) ad una fisiologica (pH 7.4). Pertanto, se si avesse un sistema in grado di rimarcare queste differenze e che fosse in grado di rispondere a variazioni di pH in questo preciso range (5.5 ? 7.4) potrebbe essere utilizzato per monitorare il processo di guarigione in pazienti in maniera non invasiva e, di conseguenza, permettere di personalizzare le cure per ogni tipologia di paziente. Inoltre, le SPIONs non possono essere utilizzate come sensori di temperatura locale in RM e quindi in applicazioni terapeutiche avanzate come la fototerapia guidata da immagini. Infatti, in fototerapia ? fondamentale conoscere le temperature locali dei tessuti da eradicare mediante ipertermia, poich? le cellule tumorali subiscono un processo di morte cellulare selettivo a temperature comprese tra 41-43 ?C, ma temperature pi? elevate provocano danni collaterali ai tessuti normali circostanti.

Le SPIONs sono inoltre utilizzate per incrementare la sensibilit? ai trattamenti radioterapici con fasci di fotoni. Dopo l?irraggiamento, la quantit? di specie ossigenate reattive (ROS) tossiche nelle cellule tumorali che hanno inglobato le SPIONs viene significativamente aumentata (Klein S, et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as novel X-ray enhancer for low-dose radiation therapy. J Phys Chem B. 2014 Jun 12; 118(23):6159-66.). Recentemente, ? stato inoltre verificato che le SPIONs possono indurre effetti di radiosensibilizzazione su cellule di carcinoma del colon umano (HCT 116) irradiate con fasci di protoni clinici da 150 MeV. La riduzione della sopravvivenza cellulare corrisponde principalmente all'alto livello di ROS generato dalle SPIONs che quindi possono aumentare gli effetti terapeutici del trattamento del cancro tramite fasci di protoni (R. A. Rashid, et al. Radiosensitization effects and ROS generation by high Z metallic nanoparticles on human colon carcinoma cell (HCT116) irradiated under 150MeV proton beam, OpenNano, (2019) 4, 100027).

Inoltre, i trattamenti radioterapici possono essere resi pi? efficaci tramite l?ipertermia realizzata grazie all?utilizzo delle SPIONS. Infatti, i nuclei tumorali scarsamente perfusi sono sensibili all'ipertermia ma resistenti alle radiazioni ionizzanti che dipende dalla formazione di radicali tossici dell'ossigeno in aree ben perfuse. Inoltre, nella fase S del ciclo cellulare, le cellule tumorali mostrano radioresistenza, ma sono altamente sensibili al calore. Pertanto, l'ipertermia generata grazie alle SPIONs pu? agire come radiosensibilizzatore per le cellule tumorali radioresistenti (Chatterjee DK et al., Nanoparticle-mediated hyperthermia in cancer therapy. Ther Deliv. (2011) 2:1001?14).

I Carbon Dots (CDs) sono una famiglia di materiali a base di carbonio che stanno riscontrando notevole interesse in diversi campi di applicazione (optoelettronica, imaging, nanomedicina, energia alternativa, etc.) e in ricerca di base. Le loro caratteristiche chimico-fisiche e le propriet? macroscopiche che ne derivano sono fortemente influenzate dal modo in cui vengono sintetizzati, ma in linea di massima possono essere descritti come nanoparticelle con un core carbonioso cristallino o amorfo, di dimensioni che vanno da 0.5 a 10 nm, stocasticamente funzionalizzate in superficie con una variet? di gruppi funzionali polari (carbossilici, idrossilici, ammidici, etc.). Grazie all?elevata polarit? della loro superficie i CDs sono stabili in ambiente acquoso e sono altamente biocompatibili, come dimostrato da innumerevoli studi in vivo ed in vitro.

Le propriet? pi? importanti dei CDs in termini applicativi sono ascrivibili alle loro propriet? ottiche straordinarie, sia in termini di fluorescenza che di propriet? fototermiche nel vicino infrarosso (NIR) indotte. Infatti, possono emettere luce nel visibile, ed in particolare nella zona biologicamente trasparente (600-900 nm), con un?ottima resa quantica e, al contempo, possono essere sfruttati per produrre calore altamente localizzato a seguito di stimolazione con luce infrarossa.

Proprio grazie a queste propriet? i CDs sono stati di recente oggetto di intenso studio nel campo della nanomedicina per il trattamento di tumori solidi, con particolare riferimento ad applicazioni in teranostica. In particolare, sono stati sfruttati come agenti di contrasto in imaging a fluorescenza, combinando questa propriet? con la terapia fototermica indotta da laser a infrarossi. In particolare, ? stato gi? dimostrato che ? possibile produrre CDs emettenti sia nel rosso che nel NIR, in modo tale da ottenere immagini ad alta risoluzione di tumori in modelli xenograft murini tramite tecniche di imaging a fluorescenza.

Inoltre, grazie alle loro propriet? fototermiche ? stato possibile ottenere effetti terapeutici positivi mediante la combinazione di fototerapia e rilascio localizzato e controllato di farmaci antitumorali.

Il vantaggio dei CDs rispetto ad altri mezzi di contrasto utilizzati in fluorescenza, tra cui anche i quantum dots, ? la loro stabilit?, l?elevata efficienza di assorbimento e la possibilit? di renderli specifici per il tessuto da visualizzare; per esempio funzionalizzandoli in superficie con agenti di targeting specifici, tra cui la biotina, l?acido folico o anticorpi monoclonali. Inoltre, alcuni CDs sono dotati di elevata sensibilit? nei confronti dell?ambiente in cui si trovano (temperatura, forza ionica, presenza di ioni metallici, etc.) che ? possibile sfruttare per applicazioni di bio-sensing.

I Carbon dots (CDs) si sono dimostrati potenziali strumenti di conversione nel vicino infrarosso per produrre calore locale utile nella teranostica tumorale. Inoltre, i CDs sembrano molto interessanti per le applicazioni cliniche che combinano ipertermia, imaging e somministrazione di farmaci in un'unica piattaforma in grado di colpire selettivamente le cellule tumorali.

In C. Scialabba, et al. ?Highly Homogeneous Biotinylated Carbon Nanodots: Red-Emitting Nanoheaters as Theranostic Agents toward Precision Cancer Medicine? ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 22, 19854-19866 ? riportata la sintesi di CD derivatizzati con biotina aventi una distribuzione monodispersa, spessore polimerico e grado di funzionalizzazione superficiale ben definiti, dotati di forte luminescenza rossa e capacit? di convertire la luce NIR in calore. Questi CD, chiamati CD-PEG-BT, sono costituiti da un nucleo carbonaceo passivato con catene di PEG2000 terminate con biotina. Essi costituiscono i gruppi target attivi per riconoscere le cellule tumorali e sono progettati per incorporare in modo efficiente un'elevata quantit? di farmaci antitumorali come l'irinotecano (16-28%) e per agire come nano-riscaldatori attivati dalla luce NIR in grado di innescare ipertermia locale e rilascio massiccio di farmaci all'interno dei tumori, provocando cos? morte tumorale efficiente. Il potenziale dei CD-PEG-BT caricati con irinotecan nell'imaging a fluorescenza ? stato studiato su colture 2D e su sferoidi 3D complessi che imitano architetture tumorali in vivo, mostrando la loro capacit? di entrare selettivamente nelle cellule tumorali attraverso i recettori per la biotina che sono sovraespressi nelle membrane cellulari delle cellule tumorali.

Nonostante le loro potenzialit?, tuttavia, i CDs attualmente studiati non sono in grado di restituire informazioni utili per il monitoraggio di parametri fisiopatologici che indicano l?efficacia terapeutica di un trattamento antitumorale. Uno di questi potrebbe essere il monitoraggio del pH nel range 5.5-7.4. Questo range ? tipico del microambiente tumorale (acido = tessuto patologico, 7.4 = tessuto fisiologico), il che implica che, in linea di principio, sarebbe possibile capire lo stato d?avanzamento di una terapia antitumorale monitorando i cambiamenti di pH della stessa durante il trattamento.

Nanogeli a base di acido ialuronico e il relativo processo di produzione sono descritti nella domanda di brevetto WO 2010/061005.

Con riferimento al quadro dell?arte nota delineato sopra, risulta sentita l?esigenza di avere a disposizione particelle che abbiano al contempo la caratteristica di modificare le propriet? di contrasto in RM in base a variazioni di pH e temperatura.

E? inoltre sentita la necessit? di avere a disposizione un sistema in grado di rispondere a variazioni di pH e rimarcarle nell?intervallo di pH 5.5 ? 7.4 da utilizzare nel monitoraggio dei processi di guarigione in maniera non invasiva, permettendo cos? di personalizzare le cure per ogni tipologia di paziente.

E? altres? sentita la necessit? di avere a disposizione particelle che siano in grado di riconoscere le cellule tumorali e di accumularsi al loro interno permettendone il monitoraggio mediante la combinazione di diverse tecniche di imaging quali RM e FL, cos? da ottenere informazioni sul microambiente tumorale mediante tecniche di contrasto multimodali a maggiore risoluzione.

? sentita anche la necessit? di avere a disposizione particelle che permettano la simultanea identificazione di masse tumorali mediante tecniche di imaging multimodali come RM e FL (diagnosi) e la rimozione delle masse tumorali mediante lo sviluppo di calore locale dovuto all?assorbimento di luce infrarossa (terapia), cos? da ottenere un sistema utilizzabile per l?ablazione fototermica di tumori guidata da immagini. ? altres? sentita la necessit? di avere a disposizione particelle in grado di veicolare e rilasciare al bisogno all?interno dei tumori farmaci antitumorali.

E? altres? sentita la necessit? di avere a disposizione particelle che possano essere utilizzate in maniera efficace come sensori di temperatura locale in imaging a fluorescenza e quindi in applicazioni terapeutiche avanzate come la fototerapia guidata da immagini. In particolare, esiste la necessit? di avere a disposizione un sistema in grado di individuare le temperature locali dei tessuti da eradicare mediante ipertermia, e in grado di monitorare variazioni di temperature comprese nell?intervallo 41-43?C, senza peraltro superare detti limiti, in quanto temperature pi? elevate potrebbero provocare danni collaterali ai tessuti normali circostanti.

? inoltre sentita la necessit? di avere a disposizione particelle che possano essere utilizzate simultaneamente ed in maniera modulabile sulla base delle necessit? cliniche nella diagnosi e nella terapia di tumori mediante un approccio personalizzato e di precisione, con la possibilit? di ottenere con una singola medicina sia propriet? di contrasto in RM ed FL, il primo utile nel caso di diagnosi e monitoraggio dei tumori su scala millimetrica ed il secondo nel caso di monitoraggio ottico di masse tumorali e di piccole metastasi anche di pochi micrometri, che sia propriet? terapeutiche quali la chemioterapia mirata (drug delivery locale) e fototerapia a infrarossi.

Se non specificatamente escluso nella descrizione di dettaglio che segue, quanto descritto nel presente capitolo ? da considerarsi come parte integrante della descrizione dettagliata dell?invenzione.

Sommario dell'invenzione

L'invenzione si prefigge di risolvere i problemi tecnici evidenziati dall?arte nota.

Costituisce pertanto uno scopo dell?invenzione la messa a punto di un mezzo di contrasto comprendente uno shell polimerico a base di un nanogel di acido ialuronico e nanoparticelle super-paramagnetiche a base di ossido di ferro (nel seguito indicate come SPIONs - Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles). Pi? in particolare il nanosistema ? formato da un derivato anfifilico dell?acido ialuronico (HA-DA-Cn,Cm) (preferibilmente HA-EDA-Cn,Cm) portante pendenti amminici (DA = diammina con atomi di carbonio da 2 a 22), alchilici (Cn = da 8 a 22) e alchinici (Cm = da 3 a 22) in catena laterale, reticolato con nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIONs-N3) e nanoparticelle di carbonio (CDs-N3), entrambe funzionalizzate in superficie con gruppi azidici.

Le catene Cn servono per idrofobizzare l?acido ialuronico in modo tale da ottenere un copolimero random che d? luogo alla formazione di tasche idrofobiche termosensibili e capaci di incorporare farmaci idrofobici. Questo effetto si ha quando la catena alchilica ? maggiore di C8.

Le catene Cm servono come spacer del gruppo alchinico per potere successivamente reticolare il copolimero in presenza delle nanoparticelle multifunzionali di CDs e SPIONs. Pertanto la lunghezza delle catene Cm pu? essere da C3 in su, con la precisazione che non converr? comunque superare C22 perch? altrimenti il materiale diventa troppo idrofobico.

Il nanosistema ? caratterizzato da legami idrofobici sensibili alle variazioni di temperatura e di pH. Pertanto, ogni variazione di pH che comporta la protonazione/deprotonazione del derivato dell?acido ialuronico ed ogni variazione di temperatura che comporta la formazione/rottura di legami idrofobici del derivato dell?acido ialuronico implica una variazione del grado di rigonfiamento del nanosistema in mezzo acquoso, accompagnato da una variazione delle distanze medie tra le componenti CDs (fluorescenti) e SPIONs (magnetiche), con conseguente variazione delle propriet? di fluorescenza e di contrasto in Risonanza Magnetica (RM).

Altro scopo dell?invenzione ? la messa a punto di un nanosistema da impiegare per la diagnosi ed il trattamento di tumori, nonch? per il monitoraggio del pH del microambiente tumorale tramite risonanza magnetica (RM) e imaging a fluorescenza (FL).

Ancora altro scopo dell?invenzione ? la messa a punto di un nanosistema capace di convertire luce infrarossa di frequenza compresa tra 750 a 900 nm (NIR) in calore locale direttamente utilizzabile in terapia antitumorale fototermica guidata da immagini.

Ancora ulteriore scopo dell?invenzione ? la messa a punto di un nanosistema che permetta la misurazione della temperatura del microambiente in cui si trova una massa tumorale (per microambiente tumorale si intende tutto il complesso della massa tumorale costituito da fibroblasti, macrofagi, neutrofili, periciti, liquido extracellulare e matrice extracellulare), mediante imaging a fluorescenza.

Ulteriore scopo dell?invenzione ? quello di ottenere un nanosistema in grado di monitorare le temperature locali tramite variazioni di intensit? della fluorescenza, cos? permettendo terapie ipertermiche fotoindotte altamente controllabili da remoto mediante misure non invasive con tecniche di imaging a fluorescenza.

Ulteriore scopo dell?invenzione ? la messa a punto di un processo per la sintesi del nanosistema sopra definito. Il processo comprende uno stadio di miscelazione dell?HA-DA-Cn,Cm, preferibilmente HA-EDA-Cn,Cm, con le nanoparticelle SPIONs-N3 e CDs-N3 e la successiva reticolazione chimica tra le catene polimeriche e le nanoparticelle SPIONs-N3 e CDs-N3 tramite cicloaddizione di Huisgen azide-alchino catalizzata con Cu(I) o catalizzata termicamente senza l?uso di catalizzatori metallici.

Ulteriori scopi dell?invenzione sono i composti intermedi che, attraverso il processo dell?invenzione portano all?ottenimento del nanosistema di formula generale HA-DA-Cn,Cm. Gli intermedi sono, in particolare, HA funzionalizzato con catene alchiliche alchino-terminali, le SPIONs-N3 e i CDs-N3. Ancora ulteriore scopo dell?invenzione sono le composizioni farmaceutiche comprendenti il nanosistema per usi teranostici in ambito tumorale, sia per il trattamento dei tumori, sia delle recidive e delle metastasi.

Ulteriori scopi e vantaggi risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata dell?invenzione che segue, inoltre le rivendicazioni descrivono varianti preferite dell?invenzione, formando parte integrante della presente descrizione.

Breve descrizione delle Figure

Ulteriori scopi e vantaggi della presente invenzione risulteranno chiari dalla descrizione particolareggiata che segue di un esempio di realizzazione della stessa (e di sue varianti) e dai disegni annessi dati a puro titolo esplicativo e non limitativo, in cui:

Figura 1 mostra lo spettro di emissione (linea a punti) di una dispersione di CDs (0.1 mg/ml) in acqua ed in presenza di SPIONs (0.1 mg/ml) e lo spettro di emissione (linea continua) del coniugato covalente CDs-PEG2k-SPIONs. Si nota che a seguito di coniugazione chimica dei CDs con le SPIONs a distanza di legame al di sotto di 4 nm i CDs non emettono pi? luce da 600 a 750 nm;

Figura 2 mostra lo spettro IR del nanosistema dell?invenzione, reticolato tramite cicloaddizione azide-alchino comparato con il composto HA-EDA-C18,C5. La scomparsa dei tripli legami sottolinea che la conversione dei gruppi alchinici C5 in 1,2,3,-triazolo ? completa, sottolineando che la funzionalizzazione ? efficiente ed esaustiva;

Figura 3 mostra la caratterizzazione morfologica, strutturale e distribuzione del diametro del nanosistema HA-C18,C5 reticolato con CDs-N3 e SPIONs-N3 ottenuta mediante microscopia a trasmissione elettronica ad alta risoluzione - HR TEM (a-a??), microscopia a forza atomica - AFM (b) e dynamic light scattering - DLS (c);

Figura 4 indica la variazione del volume medio del nanosistema dell?invenzione al variare della temperatura (a) e del pH del medium (b). Come si vede chiaramente, le dimensioni del nanosistema aumentano all?aumentare della temperatura e del pH;

Figura 5 mostra la dipendenza della fluorescenza dal pH (a) e dalla temperatura (b) del campione: nell?inserto ? riportato anche il quantum yield al variare della temperatura;

Figura 6 mostra la dipendenza di T1 (a) e T2 (b) dal pH e dalla concentrazione;

Figura 7 mostra le misure di microscopia confocale di organoide di HDFa/MDA-MB-231 trattato con il nanosistema dell?invenzione alla concentrazione di 0.25 mg/ml per 2 e 24 ore. Fluorescenza rossa (a-b), nuclei con DAPI (a?-b?) e sovrapposizione (a??-b??). E? possibile vedere che il nanosistema si accumula al centro della sezione dell?organoide, dove sono presenti le cellule tumorali e che lo stesso ? visibile poich? emette luce rossa;

Figura 8 illustra la vitalit? cellulare di organoidi di HDFa/MDA-MB-231 trattati con il nanosistema dell?invenzione alla concentrazione di 0.25 mg/ml per 24 ore e seguito da trattamento fototermico con laser a diodi a 810 nm per 1, 2 o 3 cicli di trattamento consecutivo. Temperatura dei pozzetti trattati fototermicamente. E? possibile vedere che la vitalit? decresce all?aumentare della temperatura raggiunta come effetto diretto dell?ipersensibilit? delle cellule tumorali ad alte temperature. A temperature oltre i 60 gradi si ottiene l?ablazione fototermica totale dell?organoide;

Figura 9 illustra lo Schema 1. della sintesi del derivato anfifilico dell?acido ialuronico HA-EDA-C18-C5 (? il precursore che si usa per fare il nanosistema);

Figura 10 illustra lo Schema 2. della sintesi dei CDs funzionalizzati con gruppi azidici di superficie;

Figura11 illustra lo Schema 3. della sintesi delle SPIONs funzionalizzate con gruppi azidici di superficie;

Figura 12 illustra lo Schema 4. della sintesi del nanosistema ottenuto tramite cicloaddizione 1,3-dipolare azide-alchino tra i derivati HA-EDA-C18-C5, CDs-N3 e SPIONs-N3: la reazione avviene tra i gruppi alchinici ed azidici in maniera selettiva, rapida ed esaustiva.

Descrizione dettagliata

Nell?ambito della presente invenzione:

- con il termine ?nanosistema? si intende il composto dell?invenzione, formato da un derivato anfifilico dell?acido ialuronico HA, reticolato con nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIONs-N3) e nanoparticelle di carbonio (CDs-N3), entrambe funzionalizzate in superficie con gruppi azidici;

- con la sigla HA si intende un acido ialuronico con peso molecolare medio ponderale compreso fra 5.000 e 500.000 Da;

- con le sigle HA-DA-Cn,Cm e HA-EDA-Cn,Cm si intende un acido ialuronico portante pendenti amminici, alchilici e alchinici, i pendenti amminici essendo costituiti da catene alchiliche lineari, ramificate o cicliche DA con atomi di carbonio da 2 a 20 recanti gruppi amminici terminali, i pendenti alchilici essendo costituiti da catene alchiliche lineari, ramificate o cicliche Cn con n = da 8 a 22, i pendenti alchinici essendo costituiti da catene alchiliche lineari, ramificate o cicliche Cm con m = da 3 a 22 recanti gruppi alchinici terminali. In particolare la sigla HA-DA-Cn,Cm individua un derivato dell?acido ialuronico contenente catene laterali derivanti dalla combinazione con una diammina (DA) e HA-EDA-Cn,Cm individua un derivato dell?acido ialuronico contenente catene laterali derivanti dalla combinazione con etilendiammina (EDA);

- Il termine "alchile", indica, se non diversamente specificato, un radicale idrocarburico a catena lineare, ramificata o ciclica, completamente saturo, o una combinazione di radicali aventi il numero di atomi di carbonio designato (ad esempio, Cm indica una catena alchilica C3-C22 con da 3 a 22 atomi di carbonio, estremi inclusi). Esempi di gruppi alchilici includono, senza limitazione, metile, etile, n-propile, isopropile, n-butile, t-butile, isobutile, secbutile, cicloesile, (cicloesil)-etile, ciclopropil-metile e omologhi e loro isomeri, per esempio, n-pentile, n-esile, n-eptile, n-ottile e simili;

<- >Il termine "alchilene" indica un radicale bivalente derivato da un gruppo alchile, come esemplificato da -CH2CH2CH2CH2-;

- con la dicitura -CO-NH-Cn,Cm si intendono catene laterali dell?acido ialuronico contenenti il gruppo ammidico -CO-NH- legato a sostituenti alchilici Cn o alchinici Cm come sopra definiti;

- con la sigla CDs si intendono carbon nanodots con struttura cristallina a base di carbonio in cui atomi di carbonio sono occasionalmente sostituititi con atomi di azoto, dotati di emissione nel range 500 ? 700 nm e di dimensioni comprese tra 1 e 8 nm (ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 22, 19854?19866; ACS Applied Nano Materials 2020, 3, 7, 6925-6934);

- con la sigla SPIONs si intendono nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro con diametro compreso tra 5 e 45 nm e con gruppi carbossilici di superficie (Prodotto commercialmente disponibile presso MERCK n. 747335 ? NACRES NA. 23);

- con la sigla CDs-N3 si intendono carbon nanodots derivanti dai CDs sopra descritti e funzionalizzati con gruppi azidici di superficie come esemplificato nello schema 2 di figura 10;

- con la sigla SPIONs-N3 si intendono nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro derivanti dalle SPIONs e funzionalizzate con gruppi azidici di superficie come esemplificato nello schema 3 di figura 11;

- con la dicitura ?propriet? di contrasto? in RM e FL si intende la capacit? delle nanoparticelle dell?invenzione di modificare il modo in cui il mezzo acquoso in cui queste sono disperse appare in un?immagine medica di risonanza magnetica (RM) e in una immagine a fluorescenza (FLI). Specificatamente, questa propriet? permette di modificare il modo in cui la regione in cui si accumulano le nanoparticelle appare in un?immagine medica, cos? permettendo lo studio di alterazioni di un organo, lesione o tessuto rispetto a ci? che li circonda;

- con la dicitura ?propriet? di sensing molecolare? in RM e FL si intende la capacit? delle nanoparticelle dell?invenzione di modificare le propriet? di contrasto (accentuandolo o attenuandolo) in virt? della loro presenza nel mezzo disperdente (per esempio il pH);

- con la dicitura ?agente di contrasto in imaging a fluorescenza (FLI)? ci si riferisce alle nanoparticelle dell?invenzione che hanno le propriet? di contrasto sopra definite;

- con la dicitura ?agente fototermico per fototerapia guidata da immagini? si intende genericamente un nanosistema o una molecola in grado simultaneamente di generare calore se eccitato/i con un laser a infrarossi, cos? da permettere il raggiungimento di temperature locali oltre i 41?C, e di emettere luce tra 500 e 1000 nm se eccitato/i con una sorgente luminosa di appropriata lunghezza d?onda (tra 500 e 900 nm). Le nanoparticelle dell?invenzione hanno le propriet? per poter essere definite agenti fototermici per fototerapia guidata da immagini;

- con il termine ?paziente? si intende un soggetto umano o animale che ottiene un miglioramento delle sue condizioni quando gli venga somministrato il nanosistema dell?invenzione, in particolare il soggetto umano o animale ? un mammifero, pi? in particolare ? un soggetto umano di qualunque et?, compresi gli anziani, i bambini ed i neonati.

Nel seguito i termini nanosistema e device sono da considerare sinonimi.

La presente invenzione si propone lo scopo di fornire un nuovo metodo per produrre nanosistemi a base di HA, SPIONs e CDs che possono essere impiegati direttamente per la diagnosi ed il trattamento di tumori, nonch? per il monitoraggio del pH del microambiente tumorale tramite risonanza magnetica (RM) e imaging a fluorescenza (FL).

Un ulteriore scopo della presente invenzione ? quello di ottenere un nanosistema capace di convertire luce infrarossa di frequenza compresa tra 750 a 900 nm (NIR) in calore locale direttamente utilizzabile in terapia antitumorale fototermica guidata da immagini. Inoltre, il nanosistema oggetto della presente invenzione ? progettato per permettere la misurazione della temperatura del microambiente tumorale, mediante imaging a fluorescenza, per microambiente tumorale intendendosi tutto l?amplesso della massa tumorale che comprende fibroblasti, macrofagi, neutrofili, periciti, liquido extracellulare e matrice extracellulare.

Pi? nel dettaglio, il nanosistema ? costituito da un derivato anfifilico dell?HA, ottenuto per reticolazione covalente in un solvente polare, sia organico che acquoso, tramite un processo di funzionalizzazione con SPIONs e CDs multifunzionali, come verr? dettagliatamente spiegato appresso.

La presenza di gruppi funzionali acidi dell?HA, quali i gruppi carbossilici, e di gruppi idrofobici come le catene alchiliche Cn permette di ottenere nanosistemi in grado di rigonfiare o contrarsi rispettivamente in risposta a variazioni di pH o temperatura, cos? provocando variazioni significative ed apprezzabili dell?intensit? di fluorescenza (FL) nell?intervallo da 590 a 650 nm e di contrasto in risonanza magnetica (RM).

In particolare, ? possibile misurare tramite FL ed RM variazioni di pH compresi tra 5.5 e 7.4, tipicamente caratterizzanti i tessuti tumorali e fisiologici, cos? permettendo la diagnosi di tumori ed il monitoraggio strumentale e non invasivo del processo di guarigione.

Inoltre, il nanosistema dell?invenzione ? progettato per rispondere a stimoli luminosi (come ad esempio laser a diodi con lunghezza d?onda che pu? essere da 700 a 900 nm o LED o altre analoghe sorgenti luminose) emettendo calore locale, cos? generando ipertermia (tipicamente 43 ? 50?C) nel sito tumorale. Questo processo ? utilizzabile per eliminare masse tumorali di norma ipersensibili ad aumenti di calore localizzato (Hyperthermia: Cancer Treatment and Beyond Intech Open, DOI: 10.5772/55795).

La presente invenzione si propone inoltre lo scopo di permettere il monitoraggio delle temperature locali tramite variazioni di intensit? della fluorescenza, cos? permettendo terapie ipertermiche fotoindotte altamente controllabili da remoto mediante misure non invasive con tecniche di imaging a fluorescenza.

Infatti, il nanosistema contiene catene idrofobiche che tendono a formare tra loro legami di Van der Waals termoreversibili. Pertanto, a seguito del riscaldamento del nanosistema nel range 37 - 50?C si ottiene la rottura di tali legami ed un conseguente aumento del volume del nanosistema, accompagnato dall?allontanamento delle componenti metalliche e carboniose, che causa un aumento della fluorescenza rossa. In questo modo ? possibile calibrare il nanosistema mediante misure di intensit? di fluorescenza, ottenendo informazioni sulle temperature locali sviluppate durante la fototerapia antitumorale. Questo processo permette il raggiungimento di temperature terapeutiche efficaci, personalizzate e allo stesso tempo biocompatibili.

La metodologia di preparazione dei nanosistemi dell?invenzione ? basata su un procedimento in quattro fasi, in cui:

- la prima fase consiste nella produzione di un derivato anfifilico dell?HA portante una miscela di catene alchiliche Cn e Cm sia sature che con terminali insaturi di tipo alchinico, a dare un intermedio polimerico che ? in grado di reticolare mediante cicloaddizione 1,3-dipolare azidealchino,

- la seconda fase consiste nella preparazione di SPIONs funzionalizzate in superficie con gruppi azidici, cos? da permettere la reticolazione del polimero ottenuto nella prima fase mediante cicloaddizione 1,3-dipolare azide-alchino, e

- la terza fase consiste nella sintesi di CDs funzionalizzati in superficie con gruppi azidici cos? da permettere la reticolazione del derivato polimerico ottenuto nella prima fase senza per? reagire direttamente con le componenti SPIONs ottenute nella seconda fase,

- infine, nella quarta fase si miscelano i prodotti ottenuti nelle fasi precedenti in presenza di Cu (I) (tipicamente 10 % p/p) o a temperature comprese tra 60 e 80?C per 2 ? 6 ore, portando alla formazione di nanosistemi reticolati in cui le componenti CDs e SPIONs sono indirettamente interconnesse tramite il derivato dell?HA preparato nella prima fase.

In tal modo si ottiene un nanosistema sensibile a variazioni termiche e di pH, che ? anche in grado di veicolare farmaci. Pertanto, ogni variazione di pH che comporta la protonazione/deprotonazione del derivato HA ed ogni variazione di temperatura che comporta la formazione/rottura di legami idrofobici del derivato HA implica una variazione del grado di rigonfiamento del nanosistema in mezzo acquoso accompagnato da una variazione delle distanze medie tra le componenti CDs (fluorescenti) e SPIONs (magnetiche), con conseguente variazione delle propriet? di fluorescenza e di contrasto in RM.

Le varie fasi di processo vengono appresso maggiormente dettagliate.

FASE 1

In modo specifico, nella prima fase di preparazione del derivato anfifilico dell?HA (di formula generale HA-DA-Cn,Cm), l?HA di peso molecolare compreso tra 5 e 500 kDa, salificato con 1 equivalente di bromuro di tetrabutilammonio (TBA), ? stato attivato con bis(4-nitrofenilcarbonato) (4-NPBC), commercialmente disponibile, o con cloronitrofenilcarbonato per indurre la formazione di gruppi nitrofenossicarbonilici (NO2-Ph-O-CO-) su uno o pi? gruppi ossidrilici dell?HA. Questa sintesi ? descritta in PCT/EP2009/066060. In accordo con la sintesi descritta, lo step di attivazione si pu? ottenere in solventi quali dimetilsolfossido, dimetilformammide, dimetilacetammide e loro miscele a temperature comprese tra 10 e 60?C. La reazione pu? essere condotta per un periodo compreso tra 2 e 6 ore. Il grado di funzionalizzazione, il cui controllo ? alla portata del tecnico del ramo, dipende dal tempo e dalla stechiometria di reazione del derivato dell?HA attivato, dalla quantit? di agente carbonatante utilizzato, dal tempo di reazione e dalla temperatura. Preferibilmente il grado di funzionalizzazione ? compreso tra 10 e 95%, molto pi? preferibile ? l?intervallo 30 e 70%.

Successivamente il gruppo uscente nitrofenossicarbonilico (NO2-Ph-O-) viene sostituito con una miscela di gruppi nucleofili, tipicamente recanti terminali NH2, di formula generale CnNH2, e CmNH2 dove Cn e Cm hanno i significati sopra detti. In particolare, all?HA attivato nello step precedente e senza isolamento dell?intermedio si aggiungono:

- il derivato CnNH2 in forma liquida che si fa reagire preferibilmente ad una temperatura in cui la monoammina ? in forma liquida per un tempo compreso tra 2 e 6 ore, cos? da ottenere la sostituzione nucleofila del gruppo uscente nitrofenossicarbonilico con una monoammina lipofila, e successivamente,

- il derivato CmNH2 in forma liquida che si fa reagire ad una temperatura in cui la monoammina ? in forma liquida per un tempo compreso tra 4 e 24 ore, cos? ottenendo la sostituzione del gruppo uscente nitrofenossicarbonilico con una monoammina contenente un gruppo alchinico come terminale di catena.

Seguendo queste procedure entrambe le monoammine vengono legate covalentemente all?HA mediante legame uretanico ed il grado di funzionalizzazione dipende dalla quantit? di ammine utilizzate, dalla temperatura e dal tempo di reazione, condizioni che vengono agevolmente gestite dal tecnico del ramo. Preferibilmente il grado di funzionalizzazione in CnNH2 ? compreso tra 30 e 65 % mol/mol rispetto il totale delle unit? ripetitive di HA e in CmNH2 ? compreso tra 2 e 30 % mol/mol.

Successivamente, alla dispersione ottenuta precedentemente si aggiunge una diammina di struttura generale NH2-R?x-NH2 con R? = catena alchilica lineare, ramificata o ciclica dove x = numero intero che varia da 2 a 10, preferita ? l?etilendiammina. La reazione di sostituzione nucleofila tra la diammina di struttura generale NH2-R?x-NH2 e i gruppi nitrofenossicarbonilici ? condotta ad una temperatura non superiore ai 40?C e utilizzando un largo eccesso di diammina per evitare la reticolazione del copolimero a seguito della reazione di entrambi i lati della diammina. Infatti, in questa reazione lo scopo ? quello di fare in modo che uno dei due gruppi amminici rimanga primario e disponibile per ulteriori eventuali reazioni in catena laterale. In questo step i rimanenti gruppi uscenti nitrofenossicarbonilici vengono sostituiti con una diammina (DA) in forma liquida per un tempo di reazione compreso tra 2 e 4 ore, cos? ottenendo la formazione di legami uretanici come precedentemente descritto per le monoammine. La funzionalizzazione in DA dipende dalla quantit? di gruppi nitrofenossicarbonilici residui e preferibilmente ? compresa tra il 4 e il 10 % mo/mol rispetto alle unit? ripetitive di HA totali.

Infine, per ottenere un HA privo di TBA si opera uno scambio ionico tra il TBA e un catione opportuno, come ad esempio un catione di metallo alcalino o alcalino-terroso, aggiungendo una soluzione satura di un sale, come il cloruro di sodio o di potassio, alla soluzione di copolimero e allontanando il prodotto mediante precipitazione in opportuna miscela di non-solventi, tipicamente dietil-etere/cloroformio 1:1.

Il prodotto cos? ottenuto viene purificato mediante lavaggi a caldo ripetuti (da 4 a 10 lavaggi) con una miscela di etanolo/acqua 8:2 fino a che il prodotto non appare giallo paglierino. Infine, si ottiene un solido biancastro puro dopo lavaggio con acetone, seguito da dialisi esaustiva utilizzando una membrana con cut-off compreso tra 5 e 100.000 kDa e liofilizzazione. Come esemplificato in Figura 9, il prodotto finale ? un copolimero a blocchi costituito dai seguenti blocchi (unit? ripetitive):

(a) unit? di acido ialuronico (subunit? di acido D-glucuronico e subunit? di N-acetilglucosammina)

(b) unit? contenenti terminali CnNH-CO-OHA

(c) unit? contenenti terminali CmNH-CO-OHA

(d) unit? contenenti terminali NH2-R?x-NH-CO-OHA

Il rapporto stechiometrico tra le unit? ripetitive (a), (b), (c), (d) di HA ? pari a:

(a) da 20 a 40 %, (b) da 30 a 70 %, (c) da 2 a 10 %, (d) da 2 a 30 %.

Il prodotto ottenuto ? indicato nella seguente formula generale (I) ed una esemplificazione della fase 1 ? rappresentata schematicamente nello Schema 1 di Figura 9.

Formula (I)

Questa reazione porta alla formazione di legami carbammici stabili e quindi ad un HA anfifilico ed anfotero, capace di rispondere a variazione di pH tramite la formazione di legami ionici e legami a idrogeno e di rispondere a variazioni di temperatura tramite la formazione di legami idrofobici tra le catene laterali -CO-NH-Cn,Cm -, dove Cn e Cm hanno il significato sopra indicato.

Inoltre, le catene -CO-NH-Cm contenenti gruppi alchinici terminali, possono permettere la reticolazione istantanea del polimero con le nanoparticelle (CDs, SPIONs) contenenti gruppi azidici tramite reazione click azide-alchino, cos? formando nanosistemi tridimensionali pH/termosensibili a base di HA, come appresso dettagliato.

Il prodotto che si ottiene nella prima fase ha la formula generale HA-DA-Cn,Cm

FASE 2

Nella seconda fase di reazione si preparano nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIONs) che possono avere diametro compreso tra 5 e 45 nm, funzionalizzate con gruppi azidici di superficie indicati come SPIONs-N3. Si usano dei precursori disponibili commercialmente, come per esempio le SPIONs-COOH disponibili presso MERK n.747335 ? NACRES NA.23, che vengono funzionalizzate in modo da contenere gruppi di superficie azidici.

Le nanoparticelle superparamagnetiche SPIONs-N3 si possono ottenere mediante processi di funzionalizzazione di SPIONs commerciali per funzionalizzazione dei gruppi reattivi possibilmente presenti nelle SPIONs commerciali (tra cui alcoli, acidi carbossilici, ammine o tioli) e il coupling covalente con molecole eterobifunzionali portanti un gruppo azidico e un gruppo reattivo capace di reagire con le funzioni presenti sulle SPIONs commerciali selezionate (ammina, alchene, acrilammide, tiolo, acido carbossilico) mediante attivazione con carbodiimmidi (DCC, EDC, etc.) ed N-idrossi-succinimmide (NHS) o attivanti simili in solventi acquosi (Po-Chiao Lin et al. Surface Modification of Magnetic Nanoparticle via Cu(I)Catalyzed Alkyne-azide [2 3] Cycloaddition, Org. Lett. 2007, 9, 11, 2131?2134) oppure tramite conversione diretta dei gruppi alcolici presenti sulle SPIONs commerciali in azide utilizzando trifenilfosfina come attivante e sodio azide come agente nucelofilo (Lalthazuala Rokhum and Ghanashyam Bez, A practical one-pot synthesis of azides directly from alcohols, J. Chem. Sci. Vol.124, No.3, May 2012, pp.687?691). Pi? nel dettaglio, sono preferibili precursori commerciali di SPIONs recanti gruppi carbossilici di superficie (SPIONs-COOH), i quali possono essere attivati con carbodiimmidi (ad esempio N,N'-dicicloesilcarbodiimmidecarbodiimmide - DCC, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide -EDC, etc.) ed N-idrossi-uccinimmide (NHS) per indurre la formazione di succinimidil-esteri su uno o pi? gruppi reattivi di superficie che sono, a loro volta, in grado di subire sostituzione nucleofila in presenza di monoammine terminate con gruppi azidici di formula generale NH2-Ry???-N3, dove Ry??? pu? essere una catena alchilenica o arilalchilenica lineare, ramificata o ciclica con y = numero intero da 2 a 22. ? preferibile condurre la reazione in ambiente acquoso a pH compreso tra 5.5 e 7.5 per un tempo di reazione che va da 4 a 24 ore. In questo modo il gruppo uscente N-idrossisuccinimmidico viene sostituito dalla monoammina formando un legame covalente ammidico (SPIONs-CO-NHRy???-N3) e funzionalizzando le SPIONs con dei gruppi azidici terminali.

Il grado di funzionalizzazione in gruppi azidici dipende dal rapporto stechiometrico tra le SPIONs e il derivato NH2-Ry???-N3 utilizzato. Preferibilmente si utilizza un rapporto mol/mol tra le ammine presenti nel derivato NH2-Ry???-N3 e i gruppi carbossilici contenuti sulle SPIONs e che va da 0.4 a 2, in modo da ottenere un grado di funzionalizzazione superficiale che va dal 35 al 100 % rispetto ai gruppi carbossilici presenti originariamente sulle SPIONs.

La quantit? di gruppi azidici di superficie, determinata potenziometricamente mediante titolazione dei gruppi carbossilici residui a seguito dei processi di funzionalizzazione con il gruppo funzionale NH2-Ry???-N3 come descritto nell?Esempio 1, si pu? modulare variando la quantit? di ammina utilizzata ed il tempo di reazione e pu? variare tra 0.25 a 2.10 meq/mg di prodotto.

Il prodotto puro denominato SPIONs-N3 si ottiene dopo purificazione mediante cromatografia ad esclusione sterica utilizzando Sephadex G10 o G15 o G25 come fase stazionaria e acqua come eluente. Si ottiene un solido violaceo dopo la liofilizzazione del campione acquoso puro. Una esemplificazione della fase 2 ? rappresentata schematicamente nello Schema 2 di Figura 10.

FASE 3

Nella terza fase i CDs sono funzionalizzati con gruppi azidici terminali e nella presente invenzione i CDs-N3 cos? ottenuti sono utilizzati:

- come agenti di contrasto in FL imaging, considerato che emettono luce nella finestra biologicamente trasparente (600-1100 nm) e che quindi possono permettere l?ottenimento di immagini in vivo, e

- come agenti ipertemici capaci di generare calore locale una volta eccitati, ad esempio con un laser a diodi a 810 nm con potenza compresa tra 2 e 14 W/cm<2 >(Scialabba et al., Highly Homogeneous Biotinylated Carbon Nanodots: Red-Emitting Nanoheaters as Theranostic Agents toward Precision Cancer Medicine, ACS Applied Materials & Interfaces, 2019 Jun 5;11(22):19854-19866).

La terza fase prevede la preparazione di nanoparticelle di carbonio gi? note (Scialabba et al., Highly Homogeneous Biotinylated Carbon Nanodots: Red-Emitting Nanoheaters as Theranostic Agents toward Precision Cancer Medicine, ACS Applied Materials & Interfaces, 2019 Jun 5;11(22):19854-19866), denominate carbon nanodots (CDs), con diametro che pu? essere da 1.5 a 10 nm e dotate di fluorescenza tra 500 e 750 nm e capacit? di conversione di luce NIR (700-900 nm) in calore (capacit? fototermica), utilizzate come precursori per ottenere carbon nanodots funzionalizzati con gruppi azidici di superficie. Pi? nel dettaglio, i CDs possono essere preparati tramite reazione solvotermale miscelando acido citrico e urea in solventi polari (preferibilmente dimetilformammide o dimetilsolfossido) e utilizzando pressioni di esercizio comprese tra 8 e 100 bar e temperature comprese tra 160 e 300?C (Scialabba et al., Highly Homogeneous Biotinylated Carbon Nanodots: Red-Emitting Nanoheaters as Theranostic Agents toward Precision Cancer Medicine, ACS Applied Materials & Interfaces, 2019 Jun 5;11(22):19854-19866). In queste condizioni si ottengono CDs con un core cristallino di tipo ?-C3N4, che pu? essere eccitato da 400 a 600 nm e che emette luce rossa da 610 a 750 nm e che assorbe luce nel vicino infrarosso (NIR) trasformandola in calore, caratterizzato dalla presenza di funzioni carbossiliche, alcoliche e amminiche di superficie, le quali possono essere utilizzate per ulteriori funzionalizzazioni di superficie (Scialabba et al., Highly Homogeneous Biotinylated Carbon Nanodots: Red-Emitting Nanoheaters as Theranostic Agents toward Precision Cancer Medicine, ACS Applied Materials & Interfaces, 2019 Jun 5;11(22):19854-19866).

I CDs cos? ottenuti possono essere funzionalizzati con gruppi azidici di superficie mediante attivazione dei gruppi carbossilici di superficie presenti sui CDs con carbodiimmidi (dicicloesilurea ? DCC ? oppure N?-etilcarbodiimmide cloridrato ? EDC -, etc.) ed N-idrossi-succinimmide (NHS) portando alla formazione di succinimidil esteri di superficie che vengono sostituiti mediante una reazione di sostituzione nucleofila dei gruppi attivati (N-idrossi-succinimidil-estere) con ammine alifatiche di struttura NH2-Rz?-N3 terminate con gruppi azidici, dove il gruppo R? pu? essere una catena alchilenica o arilalchilenica lineare, ramificata o ciclica e z = numero intero da 2 a 22.

La reazione di attivazione e sostituzione nucleofila ? eseguita in situ disperdendo i CDs in solventi acquosi a concentrazione compresa tra 0.1 e 10 mg/ml e un pH compreso tra 5.5 e 7.5 per un tempo di reazione compreso tra 4 e 24 ore. Il grado di funzionalizzazione in gruppi azidici dipende dal rapporto stechiometrico tra il derivato NH2-R?-N3 utilizzato e i gruppi carbossilici presenti sui CDs, preferibilmente compreso tra 3 e 0.5, il pH della reazione e il tempo di reazione. ? preferibile il derivato con un grado di funzionalizzazione in gruppi azidici che va da 70 a 100 %, ottenuto con un rapporto stechiometrico compreso tra 1 e 2, a pH preferibilmente compreso tra 6.4 e 6.8 e per un tempo di reazione compreso tra 6 e 24 ore. Il prodotto ? purificato mediante cromatografia a esclusione sterica, utilizzando Sephadex G10 o G15 o G25 come fase stazionaria e acqua come eluente. Si ottiene il prodotto solido e di colore scuro dopo l?allontanamento dell?acqua mediante liofilizzazione.

Una esemplificazione della fase 3 ? rappresentata schematicamente nello Schema 3 di Figura 11.

FASE 4

Nella quarta fase si miscelano i prodotti solidi ottenuti nelle varie fasi: fase (1) (HA-DA-Cn,Cm), fase (2) (SPIONs-N3) e fase (3) (CDs-N3) precedentemente descritte. La miscelazione ? in genere eseguita in un rapporto di composizione in peso che varia rispettivamente da 80 a 95 %, da 0.1 a 5 % e da 0.1 a 5 %, e si ottiene una dispersione colloidale violacea in una miscela di acqua ultrapura e tetraidrofurano, preferibilmente 80:20, ad una concentrazione che varia da 0.1 a 10 mg/ml. La dispersione delle tre componenti viene quindi fatta reagire in presenza di Cu(I) (da 1 a 20 % p/p), direttamente addizionato come sale rameoso (ad esempio alogenuro rameoso, tipicamente BrCu) oppure generato in situ aggiungendo solfato di rame e un agente riducente, come ad esempio acido ascorbico, in eccesso, per 2 ? 6 ore, in atmosfera inerte insufflando azoto o argon o altro gas inerte, portando alla formazione di nanosistemi reticolati in cui le componenti CDs-N3 e SPIONs-N3 sono indirettamente interconnesse tramite il derivato HA-DA-Cn,Cm mediante legame 1-2-3 triazolico. La stessa reazione, anche se non ? preferibile per via dell?assenza di regioselettivit? e per la formazione di nanosistemi parzialmente degradati, ? possibile farla in assenza di catalizzatore rameoso, ma catalizzata termicamente a temperature comprese tra 60 e 80?C. A tal fine ? necessario che durante la formazione dei legami covalenti necessari per l?ottenimento del nanosistema, nella fase 4 le nanoparticelle CDs-N3 e SPIONs-N3 non abbiano la possibilit? di formare legami covalenti reciproci, poich? questi spegnerebbero la fluorescenza intrinseca delle CDs e non permetterebbero i meccanismi di fluorescenza pH-dipendente. Per questa ragione nella fase 4 si utilizzano le CDs-N3 (da 0.1 a 5% p/p rispetto al totale delle componenti) e le SPIONs-N3 (da 0.1 a 5% p/p rispetto al totale delle componenti), in dispersione colloidale ed in modo tale da raggiungere un rapporto di composizione, espresso come rapporto in peso tra le CDs-N3 e le SPIONs-N3, che pu? andare da 0.1 a 0.4, in quanto i gruppi azidici della stessa natura presenti sulle nanoparticelle possono reagire con i gruppi alchino presenti sul derivato di acido ialuronico dell?HA-DA-Cn,Cm (ottenuto nella fase 1) solo se attivati ad alte temperature (T > 60?C) o da ioni Cu (I).

I gruppi alchino dell?HA-DA-Cn,Cm sono capaci di reagire regioselettivamente con le superfici delle nanoparticelle in esso disperse solo nelle condizioni indicate sopra.

In questo modo si ottengono nanosistemi costituiti dal derivato anfifilico dell?HA reticolato con nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIONs-N3) e nanoparticelle di carbonio (CDs-N3) tramite legami di tipo 1,3-triazolico ottenuti per reazione catalizzata da Cu(I) dei tripli legami -C?C- presenti sulla catena dell?acido ialuronico con i gruppi azidici di SPIONs-N3 e CDs-N3.

Questo processo sintetico ? molto efficiente e permette una conversione di oltre il 99% dei gruppi convolti nella reticolazione, in maniera rapida ed esaustiva (Figura 2).

Il prodotto finale che si ottiene ? un nanogel che pu? essere impiegato per usi farmacologici, come appresso indicato.

Pi? nel dettaglio, il processo comprende la miscelazione dell?HA-DA-Cn,Cm con le nanoparticelle SPIONs-N3 e CDs-N3 e la successiva reticolazione chimica delle catene polimeriche e le nanoparticelle tramite cicloaddizione di Huisgen azide-alchino catalizzata con Cu(I) (Huisgen, R. (1961). "Centenary Lecture - 1,3-Dipolar Cycloadditions". Proceedings of the Chemical Society of London: 357. doi:10.1039/PS9610000357) o catalizzata termicamente senza l?uso di catalizzatori metallici.

In questo modo si ottengono nanosistemi compositi con diametro medio di circa 95 nm (Figura 3), come si evince dalle misure di microscopia a forza atomica AFM e dynamic light scattering DLS. Si possono ottenere nanosistemi con diverso diametro medio (da 80 a 200 nm), semplicemente aumentando o diminuendo la concentrazione della miscela di reazione costituita da HA-DA-Cn,Cm (da 90 a 95 % w/w sul totale delle componenti), SPIONs-N3 (da 1 a 5 % w/w sul totale delle componenti) e CDs-N3 (da 1 a 5 % w/w sul totale delle componenti). La miscela di reazione pu? avere una concentrazione compresa tra 0.1 a 10 mg/ml e il diametro medio del nanosistema aumenta all?aumentare della concentrazione. Inoltre, il diametro medio del nanosistema pu? essere modulato sottoponendo la miscela di reazione a cicli di sonicazione dopo l?aggiunta del catalizzatore. Si possono ottenere nanosistemi con diametro medio compreso tra 80 e 120 nm modulando i cicli di sonicazione durante la reazione da 5 cicli di 5 secondi per minuto a 10 cicli di 5 secondi per minuto, ottenendo nanosistemi pi? piccoli all?aumentare dei cicli, come noto all?esperto del ramo.

Una esemplificazione della fase 4 ? rappresentata schematicamente nello Schema 4 di Figura 12.

Pi? nel dettaglio, nei nanosistemi della presente invenzione i CDs sono utilizzanti anche come sensori di pH, considerato che quando i CDs sono posti a stretto contatto (distanza compresa tra 1 e 3 nm) con nanoparticelle magnetiche come le SPIONs subiscono una riduzione significativa della fluorescenza a 600 - 750 nm (Figura 1). In questo modo ? possibile intrappolare le due nanoparticelle in un network polimerico pH-sensibile che cambia conformazione in virt? dei cambiamenti di pH nel range 5-7.4 e che quindi determina un avvicinamento o allontanamento delle due nanoparticelle in funzione del pH, con conseguente variazione dell?intensit? di fluorescenza del segnale. La distanza non ? misurabile, ma gli inventori hanno condotto un esperimento preliminare, riportato nella figura 1, che fa vedere sperimentalmente che quando si lega una SPION con un CDs fluorescente mediante uno spaziatore di PEG di dimensioni di circa 3 nm la fluorescenza si spegne. In sostanza ? riportato un dato empirico.

Allo stesso modo, utilizzando il derivato anfifilico dell?HA ? possibile ottenere un nanosistema che varia la conformazione del network polimerico in dipendenza delle temperature nel range 37 ? 45?C, con la possibilit? di far collassare o rigonfiare la nanostruttura variando la temperatura, determinando rispettivamente una diminuzione o un aumento del segnale di fluorescenza.

I nanosistemi cos? ottenuti posseggono un contenuto in ferro variabile che va dal 2 al 4 % p/p, calcolabile tramite saggio colorimetrico (rossoalizarina). (Scialabba Cinzia et al., Inulin-based polymer coated SPIONs as potential drug delivery systems for targeted cancer therapy. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 88(3), pp.695-705).

Grazie alla struttura peculiare del network polimero di cui ? costituito il nanosistema, esso ? capace di rispondere a variazioni di pH aumentando il volume idrodinamico all?aumentare del pH. Infatti, i gruppi carbossilici del network polimerico sono completamente deprotonati a pH fisiologico (7.4), permettendo una maggiore repulsione elettrostatica ed il rigonfiamento del nanosistema grazie al richiamo di acqua dall?ambiente esterno. Di contro, a pH debolmente acidi (5.5) gli stessi sono parzialmente protonati, causando l?espulsione di acqua, la formazione di domini idrofobici ed il collasso della struttura. Il risultato ? che il volume del nanosistema diminuisce di circa 11 volte a pH debolmente acido, tipico del microambiente tumorale (Figura 4b).

Sempre grazie alla rottura di domini idrofobici dovuti alle catene alifatiche a lunga catena presenti nel network polimerico, il nanosistema risponde inoltre a variazioni di temperatura, diminuendo il proprio volume di circa 3 volte se riscaldato da 37?C a 45?C (Figura 4a).

La variazione del grado di rigonfiamento del nanosistema in dipendenza della temperatura e del pH del microambiente determinano variazioni significative dell?intensit? di fluorescenza e delle propriet? di contrasto in RM del nanosistema.

Pi? nel dettaglio, il quantum yield (QY) del nanosistema, misurato comparando l?emissione di una soluzione di CDs in acqua a pH 5.5 o 7.4 con assorbimento pari a 0.2 e una soluzione di riferimento di rodamina 6G a pH 13 con medesimo assorbimento (Julien Laverdant et al., Experimental Determination of the Fluorescence Quantum Yield of Semiconductor Nanocrystals. Materials 2011, 4, 1182-1193), varia dal 2% a pH 5.5 a 11.7% a pH 7.4, sottolineando la possibilit? di usare questo nanosistema come sensore di pH (Figura 5a).

Allo stesso modo, la variazione di diametro del nanosistema causata dal riscaldamento ? alla base del fenomeno del quenching della fluorescenza osservato passando da 43 a 25?C, dove il QY passa da 19 a 13 %, sottolineando che il nanosistema pu? essere usato anche come sensore di temperatura (Figura 5b).

In particolare, lo stesso pu? essere utilizzato per ottenere informazioni sulla temperatura locale in seguito al riscaldamento del nanosistema con laser a diodi di lunghezza d?onda compresa tra 750 e 900 nm. Questo pu? essere di notevole interesse per ottenere un?ipertemia localmente controllata e per raggiungere livelli terapeutici altamente selettivi e non invasivi.

Il nanosistema oggetto della presente invenzione pu? essere formulato sia come preparazione iniettabile che come compresse, capsule o preparazione per uso topico. Nel primo caso ? possibile preparare formulazioni per uso parenterale (sia intramuscolare che in bolo) utilizzando acqua per preparati iniettabili come fase disperdente, isotonizzanti come il cloruro di sodio o il glucosio, tampone fosfato pH 7.4 e la quantit? opportuna di nanosistema disperso a livello colloidale. Per i contenitori monodose si pu? ottenere la formulazione liofilizzata unitamente alla quantit? di acqua per preparati iniettabili utile per la ricostituzione della sospensione colloidale. Per preparazioni multidose ? opportuno introdurre un adatto antimicrobico a scelta tra sodio metabisolfito, fenolo, cresolo, metil p-idrossibenzoato, alcol benzilico o altri simili.

Il nanosistema pu? essere inoltre formulato come capsule e compresse per somministrazione orale. Nel caso delle compresse, la quantit? opportuna di nanosistema pu? essere diluita in una polvere diluente idonea come il carbonato di calcio o la cellulosa microcristallina, possono essere aggiunti glidanti (0.5-3 %) come lo stearato di magnesio o il talco, disaggreganti come l?amido di mais (5-10 %) e superdisaggreganti come la croscarmellosa sodica (1-2 %). Nel caso delle capsule il nanosistema liofilizzato pu? essere aggiunto ad un diluente come l?amido di mais in presenza di un agente glidante come il talco (1-4%) e la formulazione solida pu? essere utilizzata per riempire le capsule rigide di gelatina. Il nanosistema pu? essere inoltre formulato come capsule molli contenenti un gel o sol in cui ? disperso il nanosistema. In quest?ultimo caso il nanosistema ? disperso in acqua purificata alla concentrazione opportuna e si aggiungono agenti gelificanti come l'idrossietilcellulosa (1-5%) o il carbopol (1-4%) in presenza di opportuna base come l?idrossido di sodio; il risultante gel pu? essere utilizzato come riempimento di capsule molli a base di gelatina. ? possibile formulare il nanosistema come emulsione, sospensione o gel per applicazioni topiche, come nel caso del tumore alla pelle.

Il nanosistema oggetto della presente invenzione ? versatile e si pu? usare in campo medico per diverse tipologie di applicazioni, sia in campo diagnostico che terapeutico. Pi? nel dettaglio, il nanosistema pu? essere utilizzato come agente di contrasto in RM per la valutazione di lesioni cancerose e per il monitoraggio del progresso della patologia, sia a seguito di un trattamento terapeutico che durante il follow up del paziente. In questo senso la formulazione iniettabile andrebbe iniettata al paziente durante la scansione RM per permettere l?acquisizione di sequenze RM con un contrasto differente dal normale che permette la visualizzazione di lesioni e dettagli anatomo-patologici non facilmente visibili in assenza di un agente di contrasto. Inoltre, sempre mediante la medesima modalit? ? possibile monitorare le variazioni di pH del microambiente tumorale che di norma danno informazioni sul processo di guarigione.

Un secondo ambito di applicazione ? la possibilit? di usare il nanosistema come agente fototermico per l?ablazione fototermica di tumori solidi. In questo caso il nanosistema si pu? iniettare per poi eradicare il tumore in maniera selettiva mediante l?applicazione di un laser a infrarossi (700-1100 nm). Il surriscaldamento del tumore avviene in maniera selettiva poich? i nanosistemi sono in grado di riconoscere le cellule tumorali e di accumularsi di norma nei tessuti tumorali. Inoltre, il medico decide dove direzionare la sorgente laser tramite una fibra ottica e quindi l?intervento ? per sua natura altamente selettivo. Nel caso di tumori in tessuti molli e profondi ? possibile combinare l?azione fototermica e quella diagnostica operando un?ablazione fototermica guidata da immagini RM. In questo caso il medico decide dove applicare la sorgente laser in maniera non invasiva tramite le immagini prodotte on line da un?apparecchiatura a RM per uso clinico.

Per tumori superficiali o anche in tessuti profondi accessibili per via laparoscopica ? possibile combinare l?azione diagnostica della RM a quella della fluorescenza. Infatti, ? possibile ottenere immagini ad alta risoluzione mediante l?applicazione di una ulteriore fibra ottica che permette la colorazione del tumore in cui il nanosistema ? accumulato. In questo caso si possono combinare due tecniche di imaging differente (FL e RM) per ottenere informazioni pi? dettagliate della massa tumorale da eradicare e di eventuali linfonodi sentinella in cui le cellule tumorali sono gi? presenti.

Un altro campo di applicazione ? quello dell?incremento della radiosensibilizzazione delle cellule tumorali ai fasci di radiazione radioterapici di varia natura (fotoni, elettroni, protoni, ioni, neutroni, etc). E? noto infatti che le SPIONs posso essere utilizzate per incrementare la produzione di specie ossigenate reattive (ROS) tossiche nelle cellule tumorali (C Janko et al. Functionalized Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles (SPIONs) as Platform for the Targeted Multimodal Tumor Therapy. Front Oncol. 2019; 9: 59.). Inoltre, l?ipertermia che pu? essere realizzata grazie all?utilizzo delle SPIONS pu? permettere di aumentare l?efficacia della radioterapia nei tessuti tumorali scarsamente perfusi (Chatterjee DK et al., Nanoparticle-mediated hyperthermia in cancer therapy. Ther Deliv. (2011) 2:1001?14).

? assolutamente possibile che le stesse propriet? possono essere utilizzate allo stesso modo anche se le SPIONs sono introdotte in una struttura pi? complessa come nel caso del nanosistema descritto nella presente invenzione e quindi queste caratteristiche possano essere sfruttate come sensibilizzatore in tratamenti radioterapici.

Un altro campo d?applicazione ? quello del rilascio locale di farmaci antitumorali incorporanti nel nanosistema eventualmente anche in combinazione con tutte le tecniche sopra riportate. Infatti, il nanosistema pu? incorporare farmaci antitumorali per rilasciarli nel sito d?azione a seguito del suo riscaldamento mediante una fibra ottica a infrarossi (Scialabba et al., Highly Homogeneous Biotinylated Carbon Nanodots: Red-Emitting Nanoheaters as Theranostic Agents toward Precision Cancer Medicine, ACS Applied Materials & Interfaces, 2019 Jun 5;11(22):19854-19866).

Secondo gli inventori iI nanosistema oggetto dell?invenzione possiede delle caratteristiche distintive non presenti in letteratura e che sono qui evidenziate:

1. Il nanosistema oggetto della presente invenzione ? ritenuto una nuova entit? chimica, costituita da un biopolimero (a base di acido ialuronico funzionalizzato) reticolato tramite legami covalenti con reticolanti a base di carbonio (CDs) e nanoparticelle di ossido di ferro (SPIONs), che pu? essere impiegato in campo diagnostico e in terapia fototermica.

2. L?intensit? di fluorescenza nel rosso e la sensibilit? al pH, la capacit? di trasformare luce nel vicino infrarosso (NIR) in calore e le propriet? di contrasto in risonanza magnetica del nanosistema non sono la mera somma delle singole propriet? delle componenti isolate, ma risultano pi? accentuate (il QY dei CDs da soli ? 4% e non risulta pH dipendente, come riportato in letteratura Scialabba C. et al. ACS Applied Material & Inter.

2019 e il QY dei CDs-N3 da soli ? 2%. Quindi ci sembra evidente che il QY del nanosistema, che arriva fino a 13% ed ? pH dipendente, risulta incrementato sinergicamente in maniera inaspettata - Figura 5b) e risponde al cambiamento di pH e della temperatura del mezzo in cui ? disperso il nanosistema, che pu? essere qualsiasi mezzo acquoso tra cui: DMEM, acqua e, conformemente alla presente invenzione, fluidi fisiologici in cui ? disperso il nanosistema.

3. Diversamente dalle nanoparticelle super-paramagnetiche (SPIONs) isolate, le propriet? di contrasto in risonanza magnetica (RM) del nanosistema permettono di misurare cambiamenti di pH nel range 7.4 ? 5 consentendo di monitorare un intervallo di pH del tutto comparabile a quello osservato nel microambiente tumorale durante il processo di guarigione (Arig Ibrahim Hashim et al., NMR Biomed.2011; 24: 582?591). Tramite opportuna calibrazione ? possibile trasformare i segnali di fluorescenza e di contrasto in RM in valori di pH del mezzo in cui ? disperso il nanosistema, cos? permettendo in principio la diagnosi di masse tumorali e linfonodi acidi ed il monitoraggio dei processi di guarigione. La calibrazione ? una metodologia alla portata dell?esperto del ramo e pu? essere effettuata facendo delle misure di intensit? di fluorescenza e/o segnale RM al variare del pH e plottando poi i dati in un foglio di calcolo. A questo punto, avendo un coefficiente di correlazione tra fluorescenza o segnale RM e pH si pu? misurare il pH da una misura qualsiasi di fluorescenza e/o RM).

4. Diversamente dalle nanoparticelle di carbonio e dalle nanoparticelle super-paramagnetiche isolate, il nanosistema permette la combinazione di imaging RM e ablazione fototermica NIR-indotta RM guidata. In linea di massima esistono gi? strumenti che permettono di fare Terapia Fototermica Guidata da RM. Un esempio ? il Visualase Thermal Therapy System della Medtronic (https://www.medtronic.com/it-it/operatorisanitari/products/neurological/laser-ablation/visualase.html) per ablazione laser guidata da immagini RM. Questo sistema pu? essere utilizzato a seguito della somministrazione sistemica o topica del nanosistema e dopo avere verificato l?effettiva biodistribuzione nel sito tumorale. Tuttavia, si possono anche utilizzare combinazioni di strumenti gi? di ampio uso come: 1) RM per uso clinico, 2) fibra ottica guidata con catetere per arrivare per via laparoscopica fino alla sede tumorale. Se si devono trattare tumori superficiali, come tumori alla pelle o nell?apparato digerente, si pu? utilizzare la fibra ottica applicandola direttamente nel sito tumorale. Nel caso dei tumori del tratto digerente ? necessario l?uso di un endoscopio. Inoltre, a differenza delle singole componenti isolate ? possibile combinare diverse modalit? di imaging, come fluorescenza e RM, cos? ottenendo informazioni pi? dettagliate dei cambiamenti del microambiente tumorale durante il trattamento terapeutico.

Nel complesso, il nanosistema oggetto della presente invenzione ? da intendersi come una struttura nanocomposita di dimensioni nanometriche (80-180 nm) (?100 nm) comprendente o costituita da una matrice polimerica anfifilica, una carica di nanoparticelle super-paramagnetiche (SPIONs), con propriet? di targeting magnetico e contrasto in risonanza magnetica (RM), e una carica di nanoparticelle di carbonio fluorescenti (CDs), con propriet? fototermiche e di fotoluminescenza (FL), interconnesse covalentemente.

Il nanosistema ? stato razionalizzato per raggruppare in un?unica struttura tridimensionale di dimensioni nanometriche propriet? di contrasto e di sensing molecolare in RM e FL utili per l?identificazione e la caratterizzazione anatomopatologica di masse tumorali in maniera non invasiva, e propriet? fototermiche e di rilascio controllato e selettivo (per selettivo si intende che viene rilasciato localmente nella massa tumorale e quindi evitando i fenomeni di tossicit? in tessuti da non trattare ed organi altamente irrorati). L?innesco del rilascio ? l?eccitazione con un laser da 700 a 900 nm che pu? essere effettuato on demand dal medico solo nel sito d?azione) di farmaci per l?eradicazione di masse tumorali guidate da immagini. Quindi in nanosistema dell?invenzione pu? essere usato in terapia, in particolare per il trattamento dei tumori, linfonosi e relative metastasi e recidive.

Pi? nel dettaglio, il nanosistema oggetto dell?invenzione risulta essere costituito da:

- Una matrice polimerica pH/Termo-sensibile a base di un derivato polimerico anfifilico di natura semisintetica, ottenuto tramite un processo di reticolazione chimica (NETWORK POLIMERICO). Il Network Polimerico ha una duplice funzione, oltre che essere stato scelto per l?elevata biocompatibilit? e perch? ? tipicamente riconosciuto dalle cellule tumorali che sovraesprimono il recettore CD44 (targeting attivo) (George Mattheolabakis et al., Hyaluronic acid targeting of CD44 for cancer therapy: from receptor biology to nanomedicine, J Drug Target 2015;23(7-8):605-18), ? in grado di modificare la sua conformazione tridimensionale in dipendenza di stimoli esterni quali: pH, temperatura, forza ionica, etc. etc. In questo modo ? possibile ottenere strutture polimeriche assimilabili a molle, le quali si ?accorciano? in ambiente tumorale e si ?distendono? nei fluidi fisiologici, che in virt? del loro rilassamento possono influenzare le propriet? della superstruttura nel complesso. Questo comportamento ? ottenuto sfruttando dei gruppi ionizzabili presenti nel Network Polimerico e introducendo funzioni che tendono a formare domini idrofobici che possono destrutturarsi a temperature pi? elevate. Inoltre, la presenza dei domini idrofobici permette l?incorporazione di farmaci antitumorali che possono essere rilasciati a seguito dell?aumento della temperatura locale. Quindi il network polimerico pu? essere assimilato ad un interruttore che pu? spegnere o accendere le propriet? tipiche della superstruttura ibrida che costituisce l?oggetto della presente invenzione o che, al bisogno, pu? determinare il rilascio di agenti chemioterapici direttamente nel sito d?azione;

- All?interno del Network Polimerico ? dispersa una carica di nanoparticelle super-paramagnetiche (SPIONs) che agisce da reticolante e agente di contrasto in risonanza magnetica (RM), ottenute tramite coupling di superficie con comuni agenti attivanti (carbonil diimidazolo, 1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimide, N-idrossisuccinimmide e altri simili, che sono gruppi attivanti (gruppi uscenti) che poi non faranno parte della struttura;

- Sempre all?interno del Network Polimerico ? dispersa una carica di nanoparticelle a base di carbonio (CDs) che agisce come reticolante, agente di contrasto in imaging a fluorescenza (FLI) e agente fototermico per fototerapia guidata da immagini, ottenute tramite processi solvolitici e coupling di superficie tramite comuni agenti attivanti (carbonil diimidazolo, EDC, NHS, e reagenti correlati);

- Le propriet? magnetiche e di fluorescenza delle nanostrutture presenti nel nanosistema sono fortemente influenzate dalla distanza media a cui si trovano fra di esse. Pi? nel dettaglio, la fluorescenza dei CDs ? impedita quando si trova ad una distanza media con le SPIONs al di sotto di 0.8 nm mentre aumenta progressivamente al di sopra di questa distanza. Ad esempio, coniugando le SPIONs direttamente ai CDs tramite uno spaziatore di PEG2000, tipicamente di 2.5 nm di diametro, si spegne la fluorescenza. Pertanto, ogni variazione del microambiente in cui sono disperse le particelle del nanosistema dell?invenzione che cambia questo parametro, ne modifica le propriet? di contrasto sia in FL che in RM. In particolare, il Network Polimerico permette di rispondere a variazioni di pH e temperatura, determinando una variazione di volume idrodinamico significativa che, come ultima conseguenza, determina una variazione delle distanze medie di legame particella-particella (sopra abbiamo quantificato la variazione di volume idrodinamico, non ? possibile fare stime precise della distanza particella-particella nel mezzo) cos? inducendo modificazioni rilevabili delle propriet? di contrasto. Nella fattispecie, si osserva che a pH tipicamente tumorali si ha una forte diminuzione della fluorescenza (basso contrasto) e un incremento del contrasto in RM; mentre a pH fisiologico si ha un aumento della fluorescenza (alto contrasto) e una riduzione del contrasto in RM. Pertanto, il nanosistema pu? essere usato come sensore multimodale di pH per rimarcare variazioni del microambiente tumorale in risposta ad uno specifico trattamento terapeutico, cos? permettendo la personalizzazione della terapia in base alle risposte individuali di ogni singolo paziente. Infatti ? da notare che il pH della massa tumorale tende ad aumentare (da pH 6 a pH 7.4) in risposta a un effetto terapeutico ottimale.

- La presenza di CDs nel nanosistema ibrido conferisce anche propriet? fototermiche, permettendo la trasformazione di luce NIR in calore locale, il quale pu? essere sfruttato per l?eradicazione termica di masse tumorali o per il rilascio on-demand di farmaci antitumorali direttamente nel sito d?azione. Anche questa propriet? ? fortemente influenzata dal pH del microambiente in cui si trova la superstruttura, migliorando le prestazioni fototermiche in microambienti pi? tipicamente tumorali (pH 5.5). Questo garantisce maggiore selettivit? d?azione e minori effetti collaterali indesiderati.

- La presenza delle SPIONs, invece, da un lato permette di ottenere immagini RM di piccole aree e di monitorarne il pH del mezzo in cui sono disperse, dall?altro permette il targeting magnetico a seguito dell?applicazione di un campo magnetico statico esterno applicato nella massa tumorale, cos? aumentando la biodisponibilit? della nanomedicina nel sito d?azione.

- Oltre alle applicazioni di sensing molecolare, la combinazione dei segnali di fluorescenza e risonanza magnetica potrebbe essere utilizzata per l?ablazione fototermica selettiva della massa tumorale e delle metastasi e recidive tramite procedure terapeutiche guidate da immagini. Nella fattispecie, l?identificazione estemporanea delle masse tumorali tramite risonanza magnetica e fluorescenza pu? essere sfruttata per eradicare le masse tumorali durante il trattamento terapeutico mediante l?applicazione di un laser a infrarossi, che ? in grado di riscaldare la nanomedicina presente all?interno della massa da trattare sfruttando le sue propriet? fototermiche.

- La super-struttura oggetto della presente invenzione ? in grado di rispondere anche a stimoli termici, emettendo pi? fotoni all?aumentare della temperatura. In linea di principio, l?incremento di temperatura pu? essere quindi monitorato mediante tecniche di imaging a fluorescenza. Pertanto questa propriet?, unitamente alle propriet? di contrasto e fototermiche, pu? essere sfruttata in applicazioni di ablazione fototermica di tumori solidi guidate da immagini come sensore per raggiungere temperature desiderate nel sito d?azione.

La caratteristica distintiva del nanosistema oggetto della presente invenzione ? che la combinazione delle propriet? di contrasto in RM e FL, delle propriet? fototermiche e magnetiche sopra elencate non ? presente in nessuna delle singole componenti isolate che costituiscono il nanosistema stesso. Ad oggi, secondo gli inventori, non ? noto un nanosistema con simili caratteristiche.

Molti dei device teranostici attualmente proposti per il trattamento fototermico guidato da immagini di tumori solidi, sia in campo sperimentale che clinico, non consentono di monitorare i cambiamenti di pH tipici del microambiente tumorale tramite tecniche di imaging multimodale. Questo preclude la possibilit? di usare i dispositivi in medicina di precisione. Nella fattispecie, il device proposto in questa invenzione pu? permettere di identificare variazioni di pH del microambiente tumorale sia con tecniche di imaging a fluorescenza che con risonanza magnetica in diverse modalit? di acquisizione.

Questo comporta che ? possibile individuare lo stato d?avanzamento del tumore prima e durante il trattamento terapeutico, in modo tale da identificare in maniera personalizzata e mirata il percorso terapeutico pi? adatto al paziente, nonch? di adattare la terapia in maniera non invasiva durante le fasi di monitoraggio. Inoltre, grazie alla spiccata azione fototermica indotta da laser a infrarossi a bassa potenza, ? possibile fotoattivare il nanosistema accumulato nel sito d?azione, eliminando la massa tumorale ed eventuali metastasi in maniera selettiva e mininvasiva. Si aggiunge anche la possibilit? di rilasciare farmaci antitumorali nel sito d?azione dopo fotoattivazione con una sorgente laser esterna, cos? garantendo un effetto chemioterapico altamente localizzato.

L?ingente quantit? di farmaci antitumorali rilasciata in situ solitamente aumenta l?efficacia terapeutica del trattamento e diminuisce gli effetti avversi indesiderati. Infine, grazie alle propriet? magnetiche del nanosistema, ? possibile farle accumulare miratamente nel sito d?azione tramite l?applicazione di un campo magnetico statico esterno.

In definitiva, il vantaggio della presente invenzione ? quello di avere un nanosistema in grado di 1) accumularsi nel sito d?azione magneticamente e attivamente, 2) agire da agente di contrasto e sensing in risonanza magnetica e fluorescenza, 3) determinare la morte delle cellule tumorali fototermicamente, 4) rilasciare in situ e al bisogno ingenti quantit? di farmaci antitumorali.

Le componenti che costituiscono la presente invenzione sono tutte bioeliminabili tal quali o previa degradazione. Altri device simili come le nanoparticelle colloidali di oro o i nanotubi di carbonio, oltre che non possedere tutte le funzioni qui descritte, sono invece progettati in maniera tale da consentire la sola eradicazione fototermica della massa tumorale (senza accumulo magnetico, senza imaging multimodale pH/termo sensibile). Nella maggior parte dei casi queste nanoparticelle non sono biodegradabili, poich? inerti chimicamente, e non sono bioeliminabili a causa delle loro dimensioni al di sopra del cut-off di escrezione renale (> 5 nm), costituendo di fatto un limite in applicazioni biomediche. L?innovazione rappresentata dal nanosistema oggetto della presente invenzione risiede nella possibilit? di indurre il rilascio di calore citotossico in situ ed eventualmente di farmaci antitumorali e, al contempo, di verificarne l?efficacia terapeutica strumentalmente in maniera non invasiva e in tempo reale. Questo trattamento potrebbe essere facilmente condotto in vivo in qualsiasi sede accessibile chirurgicamente o altamente irrorata, senza indurre effetti avversi dovuti al trattamento off-target.

Il nanosistema proposto nella presente invenzione rappresenta un notevole avanzamento dello stato dell?arte, considerato che permette di integrare le propriet? dei CDs in un nanosistema versatile e multifunzionale che permette di rispondere a piccole variazioni di pH e temperatura in modo tale da monitorare le variazioni del microambiente in cui sono disperse. Infatti, a differenza dei CDs gi? riportati in letteratura, che tipicamente rispondo a variazioni di pH e temperatura molto ampi, la risposta della super-struttura proposta ? molto sensibile a variazioni molto piccole di pH e temperatura in un intervallo fisiologico (6.9-7.5) individuando gli stati patologici (pH 5.5-6.9).

Abbiamo usato dei CDs emettenti nel rosso precedentemente sviluppati e SPIONs, opportunamente funzionalizzati in superficie, e li abbiamo usati come building blocks di una superstruttura stimolo-sensibile in grado di modificare le propriet? ottiche e magnetiche in virt? del pH in cui si trova. In questo modo ? possibile verificare strumentalmente (in modo non invasivo), sia tramite RM che fluorescenza, il pH del mezzo in cui si trovano.

L?architettura molecolare delle super-strutture ottenute ? concepita per amplificare la sensibilit? dei CDs nei confronti dell?intorno chimico in cui si trovano, in particolare in risposta a variazioni di pH e temperatura, e nel contempo per combinare le propriet? ottiche dei CDs con quelle magnetiche delle SPIONs.

Grazie al peculiare design di questo nanosistema si ottengono inusuali propriet?:

- pu? essere usato in applicazioni di imaging multimodale (RM fluorescenza),

- pu? essere indirizzato nel sito d?azione attraverso targerting attivo di tipo magnetico applicando un campo magnetico statico sulla zona da trattare oppure di tipo biochimico tramite i recettori CD44 per cui lo shell polimerico di rivestimento ha un?eccellente affinit?,

- pu? essere utilizzato in terapia fototermica poich? sviluppa calore a seguito di opportuna stimolazione con laser NIR,

- pu? essere utilizzato come agente di contrasto in terapia guidata da immagini e allo stesso tempo come sensore di pH e temperatura per il monitoraggio del trattamento fototermico di masse tumorali in vivo.

In questo scenario, l?innovazione ? costituita dall?avere un unico nanosistema nanocomposito e multicomponente dotato di una molteplicit? di funzioni utilizzabili in oncologia, sia a scopo terapeutico che diagnostico. Si sta infatti registrando un trend in continuo aumento di procedure terapeutiche imaging guidate (image-guided therapy, IGT) che rispondono alla crescente predilezione da parte dei pazienti di approcci mini- o noninvasivi da una parte, e alla ricerca di opzioni chirurgiche sempre pi? personalizzate (?tailored surgery?) da parte degli Specialisti di diverse branche. In questo contesto, negli ultimi due lustri si ? ad esempio assistito ad una grande diffusione della terapia mediante ultrasuoni focalizzati ad alta intensit? guidati da RM (Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound Surgery, MRgFUS) che risponde a pieno ai punti di cui sopra trattandosi di una metodica mini- o non-invasiva, che prevede una pianificazione di trattamento estremamente personalizzata basata su immagini RM acquisite in fase di screening e che utilizza l?imaging RM intraoperatorio (?live?) per guidare e monitorare la procedura terapeutica risultando in un altissimo profilo di sicurezza con altrettanto elevata efficacia terapeutica gi? dimostrata in letteratura in diversi ambiti (ginecologico, urologico, senologico, muscoloscheletrico e, pi? recentemente, neurologico).

? questo un esempio di come il nuovo agente di contrasto in RM che costituisce oggetto della presente invenzione possa migliorare le performance diagnostiche dell?imaging RM per l?identificazione di un tessuto patologico depositandosi nello stesso e, contemporaneamente, essere sfruttato come catalizzatore per una procedura IGT (termoterapia, ablazione termica, drug delivery controllato).

Inoltre, il device dell?invenzione pu? essere utilizzato con alta versatilit? nell?individuare terapie personalizzate, monitorando l?effetto terapeutico del trattamento selezionato per il singolo paziente e valutando in tempo reale ed in maniera non invasiva i cambiamenti di pH del microambiente tumorale tipicamente riscontrabili nel processo di guarigione.

Infatti il device proposto nella presente invenzione si colloca all?interno di almeno tre segmenti fondamentali della terapia antitumorale:

- quello diagnostico, essendo un ottimo mezzo di contrasto in risonanza magnetica e in imaging a fluorescenza,

- quello chirurgico, costituendo la presente invenzione un tool da poter usare nella resezione chirurgica laser-indotta guidata da immagini, e

- quello chemioterapeutico, considerato che ? possibile il trattamento fototermico di piccoli aggregati cellulari tramite l?applicazione di un laser ad infrarossi e che ? altres? possibile incorporare farmaci antitumorali (doxorubicina, danaurobicina, dacarbazina, irinotecano, topotecano, paclitaxel, docetaxel, desametasone, sorafenib, imatinib, gefitinib, sirolimus, nutlina, mecloretamina, ciclofosfamide, cisplatino, crboplatino, metotrexato, fluorouracile, capecitabina, gemcitabina, asparaginasi, axitinib, bosutinib, cabazitaxel, cetuximab, ciclofosfamide, dactinomicina, dasatinib, interleuchina-2, interferone alfa-2, lapatinib, lomustina, leuprorelina, letrozolo, lenogastrim, mitotano, mitoxantrone, omacetaxina, raloxifene, semustina, sunitinib, vinblastina, vemurafenib, triptorelina, trastuzumab, topotecano, tioguanina, teniposide temsirolimus, tamoxifene, vincristina, trametinib, procarbazina, plicamicina, pazoipanib, leuprolide, enzalutamide, exemestano, floxuridina, fludarabina, goserelina e loro Sali e relative combinazioni) da rilasciare on-demand nel sito d?azione minimizzando gli effetti indesiderati e i fenomeni di farmacoresistenza.

Rispetto alle SPIONs riportate in letteratura, quelle incorporate nel nanosistema che costituisce la presente invenzione hanno propriet? uniche: possono modificare i valori di T2 in virt? di variazioni apprezzabili del microambiente che li circonda, costituendo di fatti un potenziale strumento per una valutazione prognostica del trattamento chemioterapeutico. L?innovazione sta nel fatto che l?incorporazione delle SPIONs in una matrice polimerica sensibile agli stimoli esterni, di cui comunque ? parte integrante tramite legami covalenti, determina modificazioni delle distanze particella-particella in dipendenza del microambiente che le circonda, cos? influenzando i fenomeni di superficie sia di natura elettromagnetica che elettronica (fluorescenza).

E? possibile attribuire allo stesso principio il fenomeno di diminuzione della fluorescenza a bassi valori di pH, osservato nei CDs incorporati nella matrice polimerica. Questo fenomeno, da solo o in combinazione con tecniche RM, pu? permettere il riconoscimento di variazioni di pH tipicamente caratterizzanti il microambiente tumorale durante il decorso della malattia e/o del trattamento terapeutico (Chen L.Q. and Pagel M.D., Evaluating pH in the Ectracellular Tumor Microenviroment Using CEST RM and Other Imaging Methods, Adv in Radiology, 2015:206405).

Anche in questo caso, il fenomeno del quenching dei CDs in risposta ai cambiamenti strutturali della superstruttura in cui sono dispersi non ? mai stato descritto in precedenza.

Il nanosistema oggetto della presente invenzione rappresenta un tool terapeutico e diagnostico con prestazioni notevolmente pi? avanzate se confrontate con gli attuali agenti terapeutici e diagnostici presenti in clinica. Infatti, ? progettato per essere sfruttato come agente terapeutico e diagnostico multimodale, le cui potenzialit? possono essere sfruttate anche solo parzialmente ed adattate all?applicazione e al paziente specifici.

Pu? essere adottato come semplice mezzo di contrasto multimodale altamente biocompatibile e bioeliminabile, senza potenziali accumuli nel corpo umano, oppure pu? essere utilizzato per applicazioni chirurgiche mini-invasive come la terapia fototermica o a ultrasuoni focalizzati guidata da immagine, o ancora pu? essere utilizzato per il rilascio on-demand fotoindotto di farmaci in specifici distretti in cui ? presente un tumore o una metastasi. Inoltre pu? essere impiegato per il monitoraggio strumentale del decorso della patologia in seguito a specifici trattamenti terapeutici.

Da questa semplice analisi ? possibile capire che la presente invenzione apre un ventaglio di possibilit? terapeutiche personalizzate con abbattimento dei costi, poich? ? possibile ottenere molteplici effetti ed informazioni diagnostiche con un singolo nanosistema medico.

Questo nanosistema offre la possibilit? di estendere il mercato alle terapie di precisione altamente personalizzate, immaginando di potere produrre al bisogno lo stesso nanosistema carico di una combinazione di farmaci antitumorali specifici per il singolo paziente.

Oggi ? possibile scegliere gli agenti terapeutici pi? efficaci a seguito di una valutazione dell?efficacia terapeutica su organoidi derivanti da biopsie dei pazienti da trattare. Infatti, il nanosistema pu? essere utilizzato su materiale biologico escisso dal corpo del paziente. In questo modo ? possibile richiedere il nanosistema che ? in grado di rilasciare una specifica combinazione di agenti chemioterapici, cos? da massimizzare l?effetto terapeutico. Questo genere di trattamenti altamente personalizzati, che nei paesi che prevedono la copertura assicurativa potrebbero essere supportati opzionalmente, costituiscono un mercato in espansione e potenzialmente con molto margine di profitto.

Dalla descrizione sopra riportata il tecnico del ramo ? in grado di realizzare l?oggetto dell?invenzione e gli esempi seguenti sono forniti ad illustrazione dell?invenzione e non sono da considerare limitativi della relativa portata.

ESEMPI

ESEMPIO 1

Preparazione del nanosistema.

Il derivato HA-EDA-C18-C5 ? stato sintetizzato utilizzando un protocollo simile precedentemente descritto (F.S. Palumbo et al., RSC Adv.2015, 5, 61440). Brevemente, 1 g del sale tetrabutilammonico dell?HA (HA-TBA) preparato attraverso la neutralizzazione con idrossido di tetrabutilammonio di una soluzione di HA nella sua forma acida sono stati solubilizzati in 88 ml di dimetilsolfossido anidro (peso molecolare dell?acido ialuronico 105 kDa). La quantit? opportuna di bis(4-nitrofenilcarbonato) (4-NPBC) scelta in maniera tale da ottenere un rapporto moli 4-NPBC/moli unit? ripetitive HA-TBA pari rispettivamente a 0,7 ? stata solubilizzata in 12 ml di dimetilsolfossido anidro; tale soluzione ? stata aggiunta goccia a goccia alla soluzione di HA-TBA ad una temperatura di 40?C sotto costante agitazione e la reazione ? stata mantenuta per 4 ore. Dopo tale tempo la reazione ? stata portata a 60 ?C e quantit? opportune di l?octadecilammina (C18) in maniera tale da ottenere un rapporto moli C18/moli 4-NPBC pari a 0.5 sono stati aggiunti e lasciati reagire per 4 ore. Quindi, quantit? opportune di 4-pentin-1-ammina (C5) in modo tale da raggiungere un rapporto moli C5/moli 4-NPBC pari a 0.2 sono stati aggiunti e lasciati reagire per 24 ore. Successivamente la reazione ? stata riportata a 40?C e un eccesso di etilendiammina (EDA) ? stato aggiunto in modo tale da raggiungere un rapporto moli EDA/moli 4-NPBC pari a 10. Dopo 3 ore la reazione ? stata filtrata per allontanare le ammine non reagite e il sale TBA ? stato scambiato con 1 mL di cloruro di sodio al 30% p/v per 30 minuti e la reazione ? stata interrotta precipitando in dietiletere/clorofomio 50:50. Il solido precipitato ? stato quindi recuperato filtrando su setto poroso. Il solido ? stato lavato ripetutamente utilizzando la miscela solvente a caldo ed infine ? stato lavato con etanolo/acqua 80:20. Il solido cos? ottenuto ? stato caratterizzato mediante <1>H NMR in D2O/THF-d8 66:24, paragonando gli integrali dei picchi a ? 0.99 (CH3 del gruppo C18) e di quelli a ? 1.72 (CH del gruppo C5) con quelli a ? 1.9 (CH3 del HA). Mentre il quantitativo di funzioni amminiche dovute alle catene di EDA libere sono stati caratterizzati tramite saggio TNBS utilizzando t-butilcarbazato come standard. Il grado di funzionalizzazione ? stato espresso come moli di porzione etilendiamminica, oppure C5 oppure C18 introdotti per moli di unit? ripetitive dell?HA.

La Tabella 1 seguente riporta come esempio l?entit? di funzionalizzazione molare ottenuta in gruppi C5, C18 ed etilendiamminici legati all?acido ialuronico, per una tipica reazione.

Tabella 1

Il composto ottenuto aveva l?aspetto e la consistenza di un gel.

Parallelamente sono stati sintetizzati dei CDs con diametro di 1.5 nm ed emettenti nel rosso come precedentemente descritto (Scialabba et al., Highly Homogeneous Biotinylated Carbon Nanodots: Red-Emitting Nanoheaters as Theranostic Agents toward Precision Cancer Medicine, ACS Applied Materials & Interfaces, 2019 Jun 5;11(22):19854-19866). Successivamente 10 mg di CDs sono stati dispersi in 4 ml di tampone fosfato a pH 6.4 e sono stati aggiunti 5 mg di EDC e 4.2 mg di NHS sotto agitazione. Dopo 15 minuti e stata aggiunta una quantit? opportuna di 3-azido-1-propilammina scelta in maniera tale da ottenere un rapporto moli 3-azido-1-propilammina/moli NHS pari a 1. La reazione ? stata mantenuta a temperatura ambiente per 18 ore e dopo tale tempo i carbon nanodots puri funzionalizzati con gruppi azidici in superficie (CDs-N3) sono stati ottenuti mediante cromatografia ad esclusione sterica utilizzando sephadex G15 come fase stazionaria e acqua come eluente. La presenza di gruppi azidici, dovuti alla formazione del legame ammidico tra l?ammina della 3-azido-1-propilammina e i gruppi carbossilici di superficie presenti nei CDs, ? stata valutata tramite spettroscopia infrarossa. Pi? nel dettaglio, la presenza di un picco a 2100 cm<-1 >ha permesso di evidenziare la presenza di gruppi azidici di superficie. La distribuzione dimensionale dei CDs-N3 ? stata ottenuta mediante AFM, confermando che le dimensioni del derivato sono quasi sovrapponibili ai CDs non funzionalizzati (1.65 ? 0.4 nm).

Sempre separatamente, sono state preparate delle SPIONs derivatizzate con gruppi azidici di superficie (SPIONs-N3) utilizzando SPIONs commercialmente disponibili di diametro di circa 20 nm e contenenti gruppi carbossilici di superficie. Analogamente a quanto previsto per la preparazione delle CDs-N3, 10 mg di SPIONs-COOH sono stati dispersi in 4 ml di tampone fosfato a pH 6.4 e la funzionalizzazione ? stata eseguita utilizzando lo stesso protocollo descritto sopra per le CDs-N3. L?avvenuta funzionalizzazione della superficie ? stata confermata sempre tramite spettroscopia IR, evidenziata dalla presenza della vibrazione a 2100 cm-1, tipica delle azidi. Anche in questo caso, come evidenziato dalle analisi AFM, le dimensioni delle SPIONs-N3 sono del tutto sovrapponibili alle nanoparticelle di partenza (21.2 ? 1.1 nm). La valutazione del grado di funzionalizzazione in gruppi azidici ? stato valutato mediante titolazione potenziometrica, titolando una dispersione di SPIONs-N3 in acqua con una soluzione standard di idrossido di sodio 0.025 M e comparando i meq di base necessari per raggiungere il punto di fine titolazione con quelli necessari per titolare una dispersione di SPIONs-COOH. La deplezione di gruppi carbossilici dovuta alla funzionalizzazione con gruppi azidici mediante legame ammidico ? stata valutata per differenza ed ? risultata essere compresa tra 0.25 e 2.10 meq/mg di SPIONs-N3.

Il nanosistema finale ? stato ottenuto tramite la reticolazione chimica del derivato HA-EDA-C18-C5 in presenza dei due agenti reticolanti SPIONs-N3 e CDs-N3. In particolare, 20 mg di HA-EDA-C18-C5 sono stati solubilizzati in 20 ml di acqua ultrapura e 4 ml di THF a 40 ?C. Dopo di che 0.35 mg di CDs-N3, 1 mg di SPIONs-N3 e 1 mg di solfato di rameico sono stati dispersi nella miscela di reazione sotto sonicazione per 20 minuti. La miscela ? stata mantenuta in atmosfera di azoto a 10 ?C e sotto continua sonicazione. A questa sono stati aggiunti 5 mg di acido citrico solubilizzati in 1 ml di acqua. Dopo 120 minuti la reazione ? stata interrotta insufflando aria per 10 minuti e purificando il nanosistema reticolato tramite dialisi esaustiva per 4 giorni. La Figura 2 mostra che dopo 120 minuti tutti i gruppi alchino del derivato HA-EDA-C18-C5 sono stati convertiti in 1,2,3-triazolo, dimostrando l?effettiva reticolazione chimica del polimero mediante reazione di click-chemistry azide-alchino. La reazione ? stata anche confermata tramite analisi termica a scansione differenziale (DSC), che evidenzia la scomparsa del tipico picco di decomposizione endotermico dell?HA-EDA-C18-C5 a 350?C a seguito della reticolazione con i filler nanoparticellari. Inoltre si evidenzia un picco endotermico netto a circa 200?C, assimilabile alla fusione di domini cristallini presenti nel nanosistema a seguito del processo di reticolazione. Il quantitativo di SPIONs incorporate nel nanosistema ? stato calcolato tramite il saggio con rosso alizarina, evidenziando la presenza di 2.2 % p/p di ferro elementare, compatibile con 0.046 mg di SPIONs per mg di nanosistema (99.8 % resa).

La formazione di nanosistemi di dimensioni nanometrici ? stata confermata trami HR TEM (Figura 3a), AFM (Figura 3b) e DLS (Figura 3c) e misure di potenziale-Z. A seguito della formazione del nanosistema si osserva un aumento significativo del potenziale-Z, da -17 a -34 mV, compatibile con la formazione di una nanostruttura costituita da un core di nanoparticelle negative ricoperto da uno shell di acido ialuronico. L?analisi DLS riportata in Figura 3c mostra nanoparticelle che in acqua pH 6 posseggono dimensioni di circa 95 nm; mentre le immagini AFM e HR TEM mostrate in Figura 3 a-b evidenziano nanosistemi di circa 90 nm caratterizzati dalla presenza di uno shell polimerico che riveste nanoparticelle con caratteristiche strutturali del tutto sovrapponibili alle SPIONs e i CDs di partenza. Infatti ? chiaramente visibile la presenza di nanoparticelle ben separate con d-spacing di 4.852 ? e altre di circa 1.5 nm con d-spacing di circa 2.252 ? (Figura 3 a). Inoltre si pu? osservare la formazione di una struttura in cui le due tipologie di nanoparticelle non sono mai a stretto contatto, confermando che le due nanoparticelle non possono reagire ed interagire le une con le altre, sia per effetto della repulsione elettrostatica che per la reattivit? ortogonale che le caratterizza.

Il nanosistema cos? ottenuto ? in forma di nanogel.

ESEMPIO 2

Distribuzione dimensionale al variare del pH e della temperatura La distribuzione dimensionale del nanosistema ? stata valutata in diversi medium al variare della temperatura e del pH. Per le misure al variare della temperatura, una dispersione di nanosistema in PBS pH 7.4 alla concentrazione di 0.1 mg/ml ? stata posta in una cuvetta per misure DLS e la distribuzione dimensionale ? stata ottenuta a diverse temperature tramite analisi DLS, utilizzando un Malvern Zetasizer Nano ZS con angolo di scattering a 173?. Il campione ? stato equilibrato ad ogni temperatura per 120 secondi. Il volume medio delle nanoparticelle ? stato calcolando approssimandolo al volume di una sfera perfetta e utilizzando lo Z-average come diametro. Come si vede in Figura 4a il volume delle particelle aumenta di circa tre volte passando da 25 a 45 ?C, sottolineando la rimarcata dipendenza dalla temperatura del mezzo disperdente. Risultati simili sono stati ottenuto valutando il volume delle nanoparticelle poste a parit? di concentrazione e variando il pH. In particolare ? stato misurato in tampone fosfato 0.15 mM pH 7.4, tampone fosfato 0.15 mM pH 6.4 e tampone acetato 0.15 mM pH 5.5. Come si vede in Figura 4b il volume del nanosistema aumenta di circa dieci volte passando da pH 5.5 a pH 7.4. La variazione di volume ? accompagnata da una variazione delle distanze medie tra le particelle CDs e SPIONs disperse nel nanosistema.

ESEMPIO 3

Cinetica ipertermica al variare dell?esposizione di laser NIR.

La capacit? del nanosistema di trasformare stimoli luminosi di frequenza NIR in calore ? stata valutata al variare del pH e utilizzando un laser a diodi con lunghezza d?onda di 810. Pi? in dettaglio ? stata utilizzata una dispersione di nanosistema di concentrazione paria a 0.25 mg/ml o in tampone fosfato 0.15 mM pH 7.4 o tampone fosfato 0.15 mM pH 6.4 oppure in tampone acetato 0.15 mM pH 5.5. 0.2 ml della dispersione ? stata posta in una multiwell da 96 pozzetti e ogni pozzetto ? stato trattato con il laser con potenza di 5 W/cm<2 >fino a 200 secondi. La temperatura ? stata registrata sia mediante una termocamera posta al di sopra dei pozzetti che tramite un sensore ottico a infrarossi. L?acqua ? stata usata come controllo negativo. Mentre l?acqua ha subito un aumento di temperatura di circa 4?C, i pozzetti contenenti il nanosistema hanno mostrato un aumento di temperatura fino a 40 ?C. Inoltre, ? stato registra un andamento pH sensibile, con un aumento leggermente pi? rimarcato a pH acido (pH del microambiente tumorale). Questo esperimento mostra che il nanosistema ha la tendenza a far aumentare la temperatura in maniera pi? repentina quando si trova a pH pi? simili a quelli patologici.

ESEMPIO 4

Misure di fluorescenza al variare del pH.

Gli spettri di emissione di una soluzione acquosa dei nanogeli dell?Esempio 1 sono stati registrati con uno spettrofluorimetro JASCO FP-6500 con risoluzione spettrale di 3 nm. La soluzione ? stata posta in una cuvette da 1 cm. Il pH della soluzione ? stato controllato tramite diverse soluzioni tampone a pH controllato di 5.5, 6.2 e 7.5.

L?efficienza di emissione ? stata stimata tramite un confronto con un campione di riferimento (rodamina 101 in etanolo) nelle stesse condizioni sperimentali. In Figura 5a sono mostrati gli spettri di emissione del nanogelo al variare del pH della soluzione. Si osserva che l?emissione ? molto sensibile a piccole variazioni del pH, in particolare l?efficienza della fluorescenza aumenta di un fattore 6 passando dal valore di pH=5.5 a pH=7.5, quindi da un pH tipico di ambienti tumorali ad un pH fisiologico. Queste modifiche della luminescenza dimostrano come l?emissione dei carbon dots venga modificata dalla presenza delle SPIONS. In particolare, quando i carbon dots sono vicini alle SPIONS (pH=5.5) l?emissione ? accompagnata da una bassa efficienza (circa 2%), all?aumentare del pH dell?ambiente, aumenta la distanza tra carbon dots e SPIONS, e questo causa un aumento dell?efficienza di emissione fino al 12%.

ESEMPIO 5

Misure di fluorescenza al variare della temperatura.

Gli spettri di emissione di una soluzione acquosa dei nanogeli dell?Esempio 1 sono stati registrati con uno spettrofluorimetro JASCO FP-6500 con risoluzione spettrale di 3 nm. La soluzione ? stata inserita in una cuvette da 1 cm e posta a contatto con un raffreddatore termoelettrico. Quest?ultimo ha un?accuratezza di 0.1?C. In Figura 5b ? mostrato il comportamento dell?emissione dei nanogeli al variare della temperatura. La fluorescenza del composito si modifica al variare della temperatura esterna in un range 25-43?C. In particolare, l?efficienza di emissione aumenta all?aumentare della temperatura fino ad arrivare ad un?efficienza di circa il 20%. Anche in questo caso, la fluorescenza viene incrementata a causa dell?aumento delle dimensioni del sistema e quindi a causa dell?allontanamento tra carbon dots e SPIONs.

ESEMPIO 6

Misure di contrasto in risonanza magnetica (RM).

Le acquisizioni di imaging di risonanza magnetica (RM) sono state effettuate tramite uno scanner clinico Philips Achieva con campo magnetico da 1.5T (con bobina head) utilizzato per esami diagnostici su pazienti.

Le indagini RM sono state realizzate su campioni di soluzioni acquose con SPIONS ?libere?, campioni di nanosistema contenenti quantit? equivalenti di SPIONs preparati a vari valori di pH. Per avere dei termini di paragone sono stati acquisiti anche i segnali di campioni di acqua distillata e di un campione di soluzione di mezzo di contrasto con Gd (alla concentrazione 1 mM, solitamente utilizzata in diagnostica clinica). Tutti i campioni allo stato liquido sono stati posti in contenitori falcon.

Sono state effettuate acquisizioni di: immagini pesate in tempo di rilassamento longitudinale T1 tramite sequenza inversion recovery con tempo di ripetizione TR =2500 ms, tempo di eco TE=15 ms e tempi di inversione TI che variano tra 75 ms e 2250 ms; immagini pesate in tempo di rilassamento trasversale T2 tramite sequenza turbo spin echo con tempo di ripetizione TR ottimizzato dallo scanner e comunque maggiore di 5000 ms, tempi di eco TE che variano tra 100 ms e 1000 ms. In entrambi i casi la matrice di ricostruzione sul piano ? 256?256 e le dimensioni dei voxels sono 1.0?1.0?2.5 mm<3>. Le acquisizioni sono state effettuate in condizioni controllate di temperatura e umidit? (T=22?C e HU=50%). Per poter effettuare un?analisi quantitativa sono state considerate le regioni di interesse (ROI posizionate nella zona centrale del campione e caratterizzate da forma cubica con volume pari a 27 voxels) all?interno di ciascun campione ed ? stato ricavato il valore medio e la corrispondente deviazione standard del segnale dei voxels nella ROI.

Per ciascuno dei campioni investigati con sequenze inversion recovery ? stato ricavato l?andamento del segnale RM in funzione del tempo di inversione TI. Da questi dati sono stati estratti i valori del tempo di rilassamento T1 per le varie ROI presenti all?interno dei vari campioni tramite un?opportuna procedura di fitting numerico con una funzione esponenziale a saturazione.

Per i campioni analizzati (tranne che per SPIONS-sol con concentrazioni di 5.5 e 11 ug/ml) si osserva una riduzione del tempo T1 (che oscilla tra lo 0.7% e il 15%) rispetto al valore osservato in campioni di acqua distillata (Figura 6 a).

Come si osserva dalla Figura il valore di T1 tende a crescere con il valore di pH. Gli stessi dati possono essere riportati in funzione della concentrazione di SPIONS al variare del pH. Si osserva che al crescere della concentrazione di SPIONs i tempi di rilassamento T1 diminuiscono. L?effetto ? tanto maggiore quanto maggiore ? la concentrazione di SPIONs nel nanosistema. Bisogna comunque sottolineare che la massima variazione del T1 ? comunque ridotta (circa il 15% inferiore rispetto al valore dell?acqua distillata).

Per analizzare l?effetto sui tempi di rilassamento trasversale sono state acquisite varie immagini con sequenza Turbo Spin Echo e per ciascuno dei campioni investigati ? stato ricavato l?andamento del segnale RM in funzione del TE. Da un?analisi del segnale all?interno delle ROI di ciascun campione ? stato possibile estrarre i valori del tempo di rilassamento trasversale T2. tramite un?opportuna procedura di fitting numerico con una funzione esponenziale decrescente.

Nei nanosistemi il processo di rilassamento trasversale ? molto pi? rapido che per i campioni di acqua. I campioni con i maggiori tempi di rilassamento sono quelli di acqua distillata e di SPIONs libere in soluzione alle concentrazioni di 0.25 e 0.5 mg/ml.

Comunque, si pu? osservare che, rispetto ai campioni di acqua distillata (che hanno tempi di rilassamento di circa 3 s), i campioni di nanosistema hanno tempi di rilassamento trasversale di circa un ordine di grandezza inferiore (tra i 250 e i 500 ms). Pertanto, l?effetto del nanosistema ? notevole e agisce come mezzo di contrasto negativo perch? riduce l?intensit? del segnale pesato in T2 nelle regioni in cui si concentra.

Come si osserva dalla Figura 6b per valori di concentrazione di 1 mg/ml di nanosistema l?andamento risulta essere monotono crescente e quindi il tempo di rilassamento trasversale T2 cresce con il pH. Gli stessi dati sono riportati in funzione della concentrazione di SPIONS al variare del pH. Si osserva che, per il valore pi? basso di pH (5.5), al crescere della concentrazione di SPIONs i tempi di rilassamento T2 tendono a diminuire. Pertanto, l?effetto delle SPIONS presenti nel nanosistema ? evidente e pH-dipendente sull?intensit? del segnale pesato in T2 nelle regioni in cui si concentra. L?effetto sui tempi di rilassamento longitudinale T1 ? di minore importanza (come detto sopra la massima riduzione indotta ? dell?ordine del 15%).

ESEMPIO 7

Misure di contrasto in imaging a fluorescenza tramite microscopia confocale (FLI).

La capacit? del nanosistema di penetrare nella massa tumorale e generare immagini dettagliate del microambiente tumorale ? stata valutata mediante microscopia confocale, utilizzando l?autofluorescenza rossa del nanosistema dovuta alla presenza dei CDs e marcando i nuclei delle cellule che costituisco l?organoide con DAPI. Per i test sono stati utilizzati organoidi tridimensionali costituiti da un core di cellule di carcinoma mammario MDA-MB-231 e uno shell di fibroblasti umani HDFa incubati con il nanosistema alla concentrazione di 0.25 mg/ml. Dopo l?incubazione gli organoidi sono stati lavati con DPBS tre volte e posti in un vetrino per confocale. I nuclei sono stati marcati con DAPI per 10 minuti prima e gli organoidi sono stati rilavati 5 volte con DPBS prima dell?osservazione. Questo modello mima il microambiente di una massa tumorale e tipicamente lo stroma, costituito da una capsula densa di fibroblasti associati al tumore, ed il parenchima tumorale costituito da cellule neotrasformate. Dalla Figura 7 ? possibile notare che il nanosistema risulta francamente visibile al confocale e che gi? dopo 2 ore ? in grado di penetrare l?organoide ed accumularsi preferenzialmente nel parenchima tumorale. Questo effetto ? ascrivibile allo shell di acido ialuronico che permette il riconoscimento selettivo delle cellule tumorali presenti nel core dell?organoide. Lo stesso effetto, seppur pi? rimarcato, si osserva dopo 24 ore di incubazione.

ESEMPIO 8

Ablazione fototermica di organoidi di tumore al seno tramite laser NIR Preliminarmente ? stato effettuato un test di citocompatibilit? su cellule di carcinoma mammario MDA-MB-231 e fibroblasti HDFa. In particolare le cellule sono state seminate in multiwell da 96 pozzetti alla densit? di 20000 cellule per pozzetto. Dopo 24 ore di incubazione in DMEM il mezzo ? stato eliminato e le cellule sono state incubate con concentrazioni crescenti di nanosistema in DMEM, fino a 1 mg/ml. Dopo 24 ore di incubazione il mezzo ? stato sostituito con DPBS fresco e le cellule sono state lavate con 0.2 ml di DPBS per tre volte. Quindi, la vitalit? cellulare ? stata valutata mediante saggio MTS ed esperimento la percentuale di vitalit? rispetto al controllo non trattato. Il nanosistema ? risultato citocompatibile in tutto l?intervallo di concentrazione studiato.

Successivamente sono stati ottenuti organoidi tridimensionali di carcinoma mammario come sopra descritto. Questi sono stati incubati con il nanosistema in DMEM per 48 ore alla concentrazione di 0.25 mg/ml. Dopo tale tempo, il mezzo di coltura ? stato sostituito con DMEM fresco e gli organoidi sono stati trattati con un laser a 810 nm per 300 secondi. La vitalit? cellulare ? stata valutando trasferendo l?organoide trattato in una multiwell da 96 pozzetti e mediante test MTS. La vitalit? ? stata riportata paragonando i risultati con organoidi non trattati. L?esperimento ? stato ripetuto applicando pi? cicli di trattamento (fino a tre) per dimostrare che ? possibile aumentare la potenza del trattamento all?aumentare dei cicli di ipertermia applicati. In Figura 8 si osserva che dopo 300 secondo e un ciclo di fototerapia si assiste alla quasi completa morte dell?intero organoide. All?aumentare dei cicli di ipertermia si osserva un aumento di potenza e la completa ablazione dell?organoide gi? dopo due cicli e 250 secondi di esposizione a 2 W/cm<2>. Tale effetto ? ancora pi? evidente dopo tre cicli di fototerapia, dove si osserva la completa ablazione dell?organoide dopo circa 225 secondi di esposizione.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e riportati come media dei valori.

Claims (54)

1. RIVENDICAZIONI 1. Nanosistema comprendente: i) nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIONs); ii) nanoparticelle di carbonio (CDs); iii) un derivato funzionalizzato dell?acido ialuronico comprendente: a) unit? di acido ialuronico costituite da subunit? di acido D-glucuronico e subunit? di N-acetilglucosammina b) unit? di acido ialuronico contenenti terminali CnNH-CO-O- c) unit? di acido ialuronico contenenti terminali CmNH-CO-O- d) unit? di acido ialuronico contenenti terminali NH2-R?x-NH-CO-O- in cui: Cn=catena alchilica lineare, ramificata o ciclica con n=numero intero da 8 a 22; Cm=catena alchilica lineare, ramificata o ciclica con m=numero intero da 3 a 22 recante un terminale alchinico; R?x=catena alchilica lineare, ramificata o ciclica con x=numero intero da 2 a 10; detto derivato essendo covalentemente legato alle nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIONs) e alle nanoparticelle di carbonio (CDs) tramite legami 1,3 triazolici.
2. 2. Nanosistema secondo la rivendicazione 1 in cui il rapporto stechiometrico tra le unit? (a), (b), (c), (d) ? pari a: (a) da 20 a 40% mol/mol, (b) da 30 a 70% mol/mol, (c) da 2 a 10% mol/mol, (d) da 2 a 30% mol/mol.
3. 3. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti in cui R?x ? una catena alchilica lineare con x=2.
4. 4. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti ulteriormente comprendente almeno un farmaco antitumorale scelto fra: doxorubicina, danaurobicina, dacarbazina, irinotecano, topotecano, paclitaxel, docetaxel, desametasone, sorafenib, imatinib, gefitinib, sirolimus, nutlina, mecloretamina, ciclofosfamide, cisplatino, carboplatino, metotrexato, fluorouracile, capecitabina, gemcitabina, asparaginasi, axitinib, bosutinib, cabazitaxel, cetuximab, ciclofosfamide, dactinomicina, dasatinib, interleuchina-2, interferone alfa-2, lapatinib, lomustina, leuprorelina, letrozolo, lenogastrim, mitotano, mitoxantrone, omacetaxina, raloxifene, semustina, sunitinib, vinblastina, vemurafenib, triptorelina, trastuzumab, topotecano, tioguanina, teniposide temsirolimus, tamoxifene, vincristina, trametinib, procarbazina, plicamicina, pazoipanib, leuprolide, enzalutamide, exemestano, floxuridina, fludarabina, goserelina e loro sali e relative combinazioni.
5. 5. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti, in cui variazioni di temperatura nell?intervallo 35?- 45?C e di pH nell?intervallo 5.0-7.4 in un mezzo acquoso producono un rigonfiamento del nanosistema, accompagnato da una variazione delle distanze medie tra le componenti CDs (fluorescenti) e SPIONs (magnetiche), con conseguente variazione dell?intensit? di fluorescenza nell?intervallo da 590 a 650 nm e delle propriet? di contrasto in Risonanza Magnetica (RM).
6. 6. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per uso in campo diagnostico.
7. 7. Nanosistema secondo la rivendicazione precedente per l?uso come mezzo di contrasto.
8. 8. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per uso in campo medico.
9. 9. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per uso in campo teranostico.
10. 10. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per uso in termoterapia, fototerapia e/o radioterapia.
11. 11. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per uso nell?ablazione fototermica di tumori solidi.
12. 12. Nanosistema secondo una delle rivendicazioni 10-11 in cui la fototerapia, la termoterapia, la radioterapia e l?ablazione termica sono guidate da immagini.
13. 13. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per uso nel trattamento dei tumori, recidive e metastasi tumorali.
14. 14. Nanosistema secondo la rivendicazione precedente in cui il trattamento ? guidato da immagini.
15. 15. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per uso nel monitoraggio del pH e della temperatura del microambiente tumorale preferibilmente tramite risonanza magnetica (RM) e imaging a fluorescenza (FL).
16. 16. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per l?uso in un metodo di trattamento dei tumori, recidive e metastasi tumorali in cui il nanosistema quando eccitato con una sorgente luminosa di lunghezza d?onda compresa tra 500 e 1100 nm, preferibilmente 500-900 nm, pi? preferibilmente 590-650 nm o 750-900 nm genera ipertermia locale nell?intervallo 43-50?C.
17. 17. Nanosistema per l?uso secondo la rivendicazione precedente in cui la sorgente di eccitazione ? scelta fra una sorgente a LED ed un laser a diodi con lunghezza d?onda compresa tra 700 e 1100 nm, preferibilmente tra 750 e 900 nm.
18. 18. Nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per l?uso in un metodo di rilascio locale di farmaci antitumorali incorporati nel nanosistema stesso.
19. 19. Nanosistema per l?uso secondo la rivendicazione precedente in cui il metodo ? attuato in combinazione con tecniche di imaging a fluorescenza e RM.
20. 20. Composizione comprendente il nanosistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 e adiuvanti farmaceuticamente accettabili per uso in medicina e/o in diagnostica.
21. 21. Composizione secondo la rivendicazione 20 comprendente ulteriormente uno o pi? farmaci antitumorali scelti fra: doxorubicina, danaurobicina, dacarbazina, irinotecano, topotecano, paclitaxel, docetaxel, desametasone, sorafenib, imatinib, gefitinib, sirolimus, nutlina, mecloretamina, ciclofosfamide, cisplatino, carboplatino, metotrexato, fluorouracile, capecitabina, gemcitabina, asparaginasi, axitinib, bosutinib, cabazitaxel, cetuximab, ciclofosfamide, dactinomicina, dasatinib, interleuchina-2, interferone alfa-2, lapatinib, lomustina, leuprorelina, letrozolo, lenogastrim, mitotano, mitoxantrone, omacetaxina, raloxifene, semustina, sunitinib, vinblastina, vemurafenib, triptorelina, trastuzumab, topotecano, tioguanina, teniposide temsirolimus, tamoxifene, vincristina, trametinib, procarbazina, plicamicina, pazoipanib, leuprolide, enzalutamide, exemestano, floxuridina, fludarabina, goserelina e loro sali e relative combinazioni.
22. 22. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 20-21 formulata in forma liquida, come preparazione iniettabile o in forma solida come capsule, capsule molli e compresse per somministrazione orale, o in forma semisolida come emulsione, sospensione, crema o gel per applicazioni topiche o in formulazione liofilizzata unitamente alla quantit? di acqua utile per la ricostituzione.
23. 23. Composizione secondo le rivendicazioni 20-22 per uso in campo diagnostico.
24. 24. Composizione secondo la rivendicazione precedente per l?uso come mezzo di contrasto.
25. 25. Composizione secondo le rivendicazioni 20-22 per uso in campo medico.
26. 26. Composizione secondo le rivendicazioni 20-22 per uso in campo teranostico.
27. 27. Composizione secondo le rivendicazioni 20-22 per uso in termoterapia, fototerapia e/o radioterapia.
28. 28. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti per uso nell?ablazione fototermica di tumori solidi.
29. 29. Composizione secondo una delle rivendicazioni 27-28 in cui la fototerapia, la termoterapia, la radioterapia e l?ablazione termica sono guidate da immagini.
30. 30. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti per uso nel trattamento dei tumori, recidive e metastasi tumorali
31. 31. Composizione secondo la rivendicazione precedente in cui il trattamento ? guidato da immagini
32. 32. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti per uso nel monitoraggio del pH e della temperatura del microambiente tumorale preferibilmente tramite risonanza magnetica (RM) e imaging a fluorescenza (FL).
33. 33. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti per l?uso in un metodo di trattamento dei tumori, recidive e metastasi tumorali in cui il nanosistema della composizione quando eccitato con una sorgente luminosa di lunghezza d?onda compresa tra 500 e 1100 nm, preferibilmente 500-900 nm, pi? preferibilmente 590-650 nm o 750-900 nm genera ipertermia locale nell?intervallo 43?50?C.
34. 34. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione precedente in cui la sorgente di eccitazione ? scelta fra una sorgente a LED ed un laser a diodi con lunghezza d?onda compresa tra 700 e 1100nm, preferibilmente tra 750 e 900 nm.
35. 35. Composizione secondo le rivendicazioni precedenti per l?uso in un metodo di rilascio locale di farmaci antitumorali incorporati nel nanosistema.
36. 36. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione precedente in cui il metodo ? attuato in combinazione con tecniche di imaging a fluorescenza a RM.
37. 37. Composizione o nanosistema secondo le rivendicazioni precedenti per l?uso in combinazione con uno o pi? strumenti scelti fra: dispositivi di imaging, apparecchiature di RM per uso clinico; fibra ottica; fibra ottica guidata con catetere; endoscopio; apparecchiature per fluorescenza, e relative combinazioni.
38. 38. Strumentazione medica scelta fra dispositivi di imaging, apparecchiature di RM per uso clinico; fibra ottica; fibra ottica guidata con catetere; endoscopio; apparecchiature per fluorescenza, e relative combinazioni da usare in combinazioni con il nanosistema o la composizione secondo le rivendicazioni precedenti.
39. 39. Processo per la sintesi del nanosistema secondo le rivendicazioni 1-5 che comprende le fasi fondamentali di: ? una prima fase comprendente la preparazione di un derivato anfifilico dell?acido ialuronico portante una miscela di catene alchiliche Cn e Cm a dare un intermedio polimerico che ? in grado di reticolare mediante cicloaddizione 1,3-dipolare azide-alchino, al fine di produrre un derivato di acido ialuronico di formula generale HA-DA-Cn,Cm, ? una seconda fase comprendente la preparazione di SPIONs funzionalizzate in superficie con gruppi azidici (SPIONs-N3), cos? da permettere la reticolazione del polimero ottenuto nella prima fase mediante cicloaddizione 1,3-dipolare azide-alchino, ? una terza fase comprendente la sintesi di CDs funzionalizzati in superficie con gruppi azidici (CDs-N3) cos? da permettere la reticolazione del derivato polimerico ottenuto nella prima fase mediante cicloaddizione 1,3-dipolare azide-alchino, ? una quarta fase comprendente la miscelazione dei prodotti ottenuti nelle fasi precedenti in presenza di Cu(I) o a temperature comprese tra 60 e 80?C per 2?6 ore, per ottenere nanosistemi reticolati in cui le componenti CDs e SPIONs sono indirettamente interconnesse tramite legami 1,3-diazidici al derivato dell?acido ialuronico preparato nella prima fase.
40. 40. Processo secondo la rivendicazione 39 in cui nella prima fase si impiega acido ialuronico di peso molecolare compreso tra 5 e 500 kDa.
41. 41. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 39-40 in cui nella prima fase l?acido ialuronico ? salificato con bromuro di tetrabutilammonio (TBA), ? attivato con bis(4-nitrofenilcarbonato) (4-NPBC) o con cloronitrofenilcarbonato per indurre la formazione di gruppi nitrofenossicarbonilici (NO2-Ph-O-CO-) su uno o pi? gruppi ossidrilici dell?acido ialuronico, e i gruppi nitrofenossicarbonilici (NO2-Ph-O-) vengono sostituiti con derivati nucleofili recanti terminali NH2 di formula generale CnNH2, CmNH2 ed NH2-R?x-NH2, i derivati CnNH2 essendo aggiunti in forma liquida e lasciati reagire per un tempo compreso tra 2 e 6 ore, i derivati CmNH2 essendo successivamente aggiunti in forma liquida e lasciati reagire per un tempo compreso tra 4 e 24 ore, la diammina NH2-R?x-NH2 essendo lasciata reagire per un tempo compreso tra 2 e 4 ore ad una temperatura non superiore ai 40?C e utilizzando un largo eccesso di diammina.
42. 42. Processo secondo la rivendicazione precedente in cui la diammina di formula NH2-R?x-NH2 ? l?etilendiammina.
43. 43. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 39-42 in cui, per ottenere un acido ialuronico privo di TBA si opera uno scambio ionico tra il TBA e un catione aggiungendo una soluzione satura di un sale, come il cloruro di sodio o di potassio, alla soluzione di copolimero e allontanando il prodotto mediante precipitazione in opportuna miscela di non-solventi, tipicamente dietil-etere/cloroformio 1:1; il prodotto cos? ottenuto essendo poi purificato ed eventualmente sottoposto a liofilizzazione.
44. 44. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 39-43 in cui nella seconda fase di reazione si preparano nanoparticelle superparamagnetiche di ossido di ferro (SPIONs) funzionalizzate con gruppi azidici terminali (SPIONs-N3) a partire da precursori commerciali di SPIONs recanti gruppi carbossilici di superficie (SPIONs-COOH), i quali sono attivati con carbodiimmidi ed N-idrossi-succinimmide (NHS) per indurre la formazione di succinimidil-esteri su uno o pi? gruppi reattivi di superficie che sono, a loro volta, sottoposti a sostituzione nucleofila in presenza di monoammine terminate con gruppi azidici di formula generale NH2-Ry???-N3, dove R??? ? una catena alchilica o arilalchilica lineare, ramificata o ciclica con y=numero intero da 2 a 22, la reazione essendo condotta in ambiente acquoso a pH compreso tra 5.5 e 7.5 per un tempo di reazione che va da 4 a 24 ore.
45. 45. Processo secondo la rivendicazione precedente in cui si utilizza un rapporto mol/mol tra le ammine del derivato NH2-Ry???-N3 e i gruppi carbossilici contenuti sulle SPIONs che va da 0.4 a 2, in modo da ottenere un grado di funzionalizzazione superficiale che va dal 35 al 100% mol/mol rispetto ai gruppi carbossilici presenti originariamente sulle SPIONs.
46. 46. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 39-45 in cui nella terza fase di reazione si preparano nanoparticelle di carbonio (CDs) funzionalizzate con gruppi azidici terminali (CDs-N3) a partire da nanoparticelle di carbonio note con un core cristallino di tipo ?-C3N4, caratterizzato dalla presenza di funzioni carbossiliche, funzionalizzate con gruppi azidici di superficie mediante attivazione con carbodiimmidi ed N-idrossi-succinimmide (NHS), portando alla formazione di succinimidil-esteri di superficie che vengono sostituiti mediante una reazione di sostituzione nucleofila dei gruppi attivati (N-idrossisuccinimidilestere) con ammine alifatiche di struttura NH2-R?z-N3 terminate con gruppi azidici, dove il gruppo R?z ? una catena alchilica o arilalchilica lineare, ramificata con z=numero intero da 2 a 22, detta reazione di attivazione e sostituzione nucleofila essendo eseguita disperdendo i CDs in solventi acquosi a concentrazione compresa tra 0.1 e 10 mg/ml e un pH compreso tra 5.5 e 7.5 per un tempo di reazione compreso tra 4 e 24 ore.
47. 47. Processo secondo la rivendicazione precedente in cui si utilizza un rapporto mol/mol tra le ammine del derivato NH2-R?z-N3 e i gruppi carbossilici contenuti sui CDs che va da 0.5 a 3, in modo da ottenere un grado di funzionalizzazione superficiale che va dal 70 al 100% mol/mol rispetto ai gruppi carbossilici presenti originariamente sul CDs.
48. 48. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 39-47 in cui nella quarta fase di reazione si miscelano i prodotti ottenuti nelle fasi prima, seconda e terza in un rapporto di composizione in peso che varia rispettivamente da 80 a 95% per HA-DA-Cn,Cm, da 0.1 a 5% per le SPIONs-N3 e da 0.1 a 5% per i CDs-N3, e si ottiene una dispersione colloidale in acqua, preferibilmente acqua e tetraidrofurano 80:20, ad una concentrazione che varia da 0.1 a 10 mg/ml; la dispersione essendo poi fatta reagire in presenza di Cu(I) (da 1 a 20% p/p), in atmosfera inerte portando alla formazione di nanosistemi reticolati in cui le componenti CDs-N3 e SPIONs-N3 sono interconnesse al derivato HA-DA-Cn,Cm mediante legame 1-2-3 triazolico.
49. 49. Processo secondo la rivendicazione precedente in cui il Cu(I) ? direttamente addizionato come sale rameoso, ad esempio BrCu, oppure generato in situ aggiungendo solfato di rame e acido ascorbico in eccesso.
50. 50. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 39-49 in cui nella quarta fase si utilizzano i CDs-N3 in quantit? da 0.1 a 5% p/p e le SPIONs-N3 in quantit? da 0.1 a 5% p/p, dispersi nella fase disperdente acquosa a livello colloidale ed in modo tale da raggiungere un rapporto di composizione espresso come rapporto in peso tra i CDs-N3 e le SPIONs-N3 pari a 0.3.
51. 51. Derivato funzionalizzato dell?acido ialuronico di formula generale (I):

    comprendente: ? unit? di acido ialuronico costituite da subunit? di acido D-glucuronico e subunit? di N-acetilglucosammina ? unit? di acido ialuronico contenenti terminali CnNH-CO-O- ? unit? di acido ialuronico contenenti terminali CmNH-CO-O- ? unit? di acido ialuronico contenenti terminali NH2-R?x-NH-CO-O in cui: ? Cn=catena alchilica lineare, ramificata o ciclica con n=numero intero da 8 a 22 ? Cm=catena alchilica lineare, ramificata o ciclica con m=numero intero da 3 a 22 recante un terminale alchinico; ? R?x=catena alchilica lineare, ramificata o ciclica con x=numero intero da 2 a 10.
52. 52. Derivato funzionalizzato secondo la rivendicazione precedente in cui il rapporto stechiometrico tra le unit? (a), (b), (c), (d) ? pari a: (a) da 20 a 40%, (b) da 30 a 70%, (c) da 2 a 10%, (d) da 2 a 30%.
53. 53. SPIONs-N3, con diametro compreso tra 5 e 30 nm e con un grado di funzionalizzazione in gruppi azidici di superficie compreso tra 3 e 50 funzioni per particella, permette di ottenere immagini RM di piccole aree e di monitorarne il pH del mezzo in cui sono disperse, permette il targeting magnetico a seguito dell?applicazione di un campo magnetico statico esterno applicato nella massa tumorale, cos? aumentando la biodisponibilit? della nanomedicina nel sito d?azione.
54. 54. CDs-N3 caratterizzati dal fatto che emettono luce nella finestra di 600-1100 nm e che emettono calore quando eccitati con luce laser.