JP2014185333A - 近赤外色素結合ヒアルロン酸誘導体およびそれを有する光イメージング用造影剤 - Google Patents
近赤外色素結合ヒアルロン酸誘導体およびそれを有する光イメージング用造影剤 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ポリエチレングリコールとICG誘導体が結合したヒアルロン酸誘導体を提供する。
【選択図】なし
Description
上記一般式(3)においてR2はH、OH、OMe、NH2、およびCOOHのいずれかであり、kは20以上200以下の整数である。
上記一般式(3)においてR2はH、OH、OMe、NH2、およびCOOHのいずれかであり、kは20以上200以下の整数である。
また、一般式(2)、(3)および(25)におけるリンカーLは、各々同じであってもよいし、異なってもよい。リンカーLの例として、置換されていてもよい炭素数1乃至10の直鎖又は分岐のアルキル基や、下記一般式(22)乃至(24)で示される構造が挙げられる。アルキル基の置換基として炭素数1以上3以下のアルキル基やハロゲン原子、アミノ基が挙げられる。
0.13<x/N≦0.78 …式(i)
また、R1として一般式(3)を有する単位の数をy、重合体の全単位の数をNとしたときに、y,Nが下記式(iii)を満たすことが望ましい。
0.22<y/N≦0.99 …式(iii)
0.13<x/(x+y+z)≦0.78 …式(ii)
また、下記式(iii)を満たすことが望ましい。
0.22<y/(x+y+z)≦0.99 …式(iii)
0.13<x/(x+y+z)≦0.78 式(ii)
また、下記式(iii)を満たすことが好ましい。
0.22<y/(x+y+z)≦0.99 式(iii)
0.13<x/N≦0.78…式(1)
本発明の実施形態に係る粒子は、本発明の実施形態に係る化合物が複数集まり、主に、色素部分(ICG誘導体)が粒子の内側、PEG部分が粒子の外側に位置するようにして、粒子状になっていると考えられる。
上記一般式(31)において、RGDは、下記一般式(32)である。
本実施形態に係る化合物は、ヒアルロン酸を骨格としている。様々な分子量のヒアルロン酸を利用でき、分子量2500から11万の範囲が好ましく、5000から25000が特に好ましい。50000以上の分子量では粘性が高いことや溶媒への溶解性低下により、低分子化されたヒアルロン酸が好適に用いられる。合成の再現性の観点からは、分子量5000から8000のものが特に好適に用いられる。
本実施形態に係る化合物は、ヒアルロン酸にICG誘導体が結合している。近赤外色素であるICG誘導体は、本明細書では、トリカルボシアニン系の化合物のことをいう。本実施形態において、トリカルボシアニン系の化合物の構造は、例えば、一般式(17)で表される。
本実施形態に係る化合物は、ヒアルロン酸にPEGが結合している。本実施形態に係る化合物を調製するために用いるPEGは、水溶性の高分子であり、タンパク質の血清半減期の増加や免疫原性の低下などの効果を奏する。本実施形態において、アジド基を有するヒアルロン酸誘導体へPEGを結合させるために、アルキンを有するPEG誘導体を利用することができる。たとえば、下記一般式(20)に示される化合物を用いることができる。式(20)中のkはPEGの繰り返し単位数を表しており、特に制限されないが、20から1000の範囲のものを用いることができる。特に50〜125程度が好ましい。つまり、PEGの分子量として、およそ1000から40000の範囲であり、特に2000〜5000が好ましい。
また、本実施形態に係る化合物は、標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有していてもよい。本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、核酸、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された本実施形態に係る化合物を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
本実施形態における化合物は、PEGならびにICG誘導体を、ヒアルロン酸誘導体の官能基を介して公知のカップリング反応によって結合することによって調製することができる。たとえば、PEGならびにICG誘導体を、ヒアルロン酸誘導体のアジド基を介してクリック反応によって結合することによって調製することができる。具体的には、アルキン化されたICG誘導体、ならびにPEG誘導体を、ヒアルロン酸に予め修飾しておいたアジド基とクリック反応させる。反応は、ICG含率を高めるために、アルキン化ICG誘導体とアルキン化PEG誘導体を同時に反応させることが好ましい。アルキン化ICG誘導体とアルキン化PEG誘導体に加え、アルキン化捕捉分子を反応させることで、補足分子を結合させたICGとPEGを結合したヒアルロン酸誘導体を得ることができる。ICGとPEGを結合したヒアルロン酸誘導体は、透析法、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法等の公知の精製法により洗浄、精製することができる。ICG誘導体、PEG、ならびに捕捉分子とヒアルロン酸との結合は、種々の架橋剤(クロスリンカー)を介して結合されていても良い。たとえば、ヒアルロン酸への捕捉分子の結合のために、PEG分子を介して結合させることができる。
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、本実施形態に係る化合物と、分散媒とを有する。また、本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、必要に応じて本実施形態に係る化合物の他に薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。
生体内に投与された本実施形態に係る化合物を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る化合物を検出する方法は以下の(a)、(b)の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
(a)本実施形態に係る化合物が投与された検体に600nm乃至1300nmの波長領域の光を照射する工程
(b)前記検体内に存在する前記化合物から発生する音響波を検出する工程
また、本実施形態に係る化合物を検出する方法は、前記(b)で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記(b)の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に3次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば3次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなものでも構わないし、2次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響信号の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
上記(b)の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し600nm乃至1300nmの範囲から選択される少なくとも1つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー(LT−2211−PC、Lotis社製)、OPOレーザー(LT−2214 OPO、Lotis社製)、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
本実施形態における、ヒアルロン酸誘導体の製造方法は、両親媒性分子の存在下で、ICG誘導体とヒアルロン酸を反応させることを特徴とする。両親媒性分子としてポリエチレングリコールが好ましい。
ICG類縁体をヒアルロン酸に結合させるときに、両親媒性分子が存在することで、ヒアルロン酸の凝集が抑制される。その結果、ICG誘導体がヒアルロン酸に多く結合する。
ヒアルロン酸誘導体として、1および2を以下のスキームで合成した(図1(a))。原料として、分子量の異なる6種類の低分子量ヒアルロン酸ナトリウム塩(HA−Na)を用いた(分子量MW(HA−Na)=2.5K、5K、8K、25K、50K、110K)。なお、分子量2.5K、110KのHA−Naは、キッコーマンバイオケミファ株式会社製マイクロヒアルロン酸FCHおよびキッコーマンバイオケミファ株式会社製ヒアルロン酸FCHを利用した。また、分子量5K、8K、25K、50KのHA−Naは、既知の手法(特許文献3)を用いてヒアルロン酸FCH(分子量110K)を低分子量化し、原料として用いた。
ヒアルロン酸の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した。測定条件は以下の通り。溶離液:0.2M NaCl水溶液、流速:0.5ml/min、カラム:Shodex SB−803 HQ(昭和電工株式会社製)、標準物質:プルラン(昭和電工株式会社製STD−Pシリーズ)。なお、キッコーマンバイオケミファ株式会社から購入の低分子ヒアルロン酸(FCH−SU、分子量110K)およびマイクロヒアルロン酸FCH(分子量2.5K)は、上記条件下でいずれも対応する数平均分子量を示した。
近赤外発光性化合物ICG−alkyneの合成スキームを図1(b)に示す。詳細は以下の通りである。50ml一つ口ナス型フラスコに、既知のインドシアニングリーン誘導体ICG−ATT(非特許文献3)0.10g(0.32mmol)を入れ、アセトニトリル2mlに溶解させた。ここにプロパルギルアミン(25μL,0.39mmol)を0℃で加え、2時間攪拌した。この溶液に0.1N塩酸10mlを加え、水層をCH2Cl2で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた濃緑色固体を遠心沈降(CH2Cl2/Et2O)により精製した。濃緑色固体を少量の酢酸エチルで洗浄し、減圧乾燥後、ICG−alkyneを濃緑色固体82mg(82%)として得た。同定は1H−NMR、FAB−MSにより行った。結果は、次の通りであった。1H−NMR(400MHz、CDCl3、25℃、TMS)δ/ppm;1.47(t,J=6.9Hz,3H),1.57−1.70(m,2H),1.78−1.86(m,2H),1.86−1.96(m,2H),1.96(s,6H),2.00(s,6H),2.15(t,J=2.4Hz,1H),2.42(t,J=7.3Hz,2H),4.04(dd,J=2.4,5.4Hz,2H),4.10−4.28(m,4H),6.11−6.20(m,1H),6.40−6.58(m,1H),6.62−6.76(m,1H),6.85−6.96(m,1H),7.04−7.13(m,1H),7.31(d,J=8.8Hz,2H),7.39(d,J=8.8Hz,1H),7.43−7.49(m,2H),7.56−7.63(m,2H),7.88−7.97(m,6H),8.06−8.14(m,2H).FAB−HRMSm/e660.3964[M]+。なお、ICG−alkyneの近赤外領域における光吸収スペクトルは図1(c)に示すとおりである(溶媒:クロロホルム(1.0×10−6M))。802nmに吸収極大を有する。モル吸光係数は1.8×105(M−1cm−1)であった。
高分子量のHA−Naは有機溶媒への溶解度が低く、対応するアンモニウム塩に変換し、様々な変換反応に付される(非特許文献4、非特許文献5)。本発明で利用した低分子ヒアルロン酸ナトリウム塩HA−Naも有機溶媒に対し難溶であったため、同様にアンモニウム塩に変換し、縮合反応に利用した。ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩HA−NBu4の合成概略を以下に示す(図2)。100ml一つ口ナス型フラスコに、低分子ヒアルロン酸ナトリウム塩HA−Na 0.80g(MW(HA−Na)=8K、単位ユニット換算で2.0mmol)を入れ、水5mlに溶解させた。ここに、水酸化テトラブチルアンモニウムでカチオン交換されたカチオン交換樹脂DOWEX(1.9g、4.0mmol相当)を加え、室温で終夜攪拌した。グラスフィルターによりDOWEXを除去した後、凍結乾燥により、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩HA−NBu4を白色固体1.1g(85%)として得た。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR(400MHz、D2O、25℃)δ/ppm;0.81−0.85(br m,12H),1.22−1.27(br m,8H),1.53−1.54(br m,8H),1.88(s,3H),3.06−3.10(br m,8H),3.31−3.92(m,10H),4.45(br s,2H).)。
近赤外色素やPEG、GAなどを修飾する足場となるアジド基を有するヒアルロン酸誘導体3の合成を以下に示す(図3(a))。窒素雰囲気下、50mlシュレンク管にHA−NBu4 0.25g(MW(HA−Na)=8K、単位ユニット換算で0.40mmol)を入れ、無水DMSO 4.0mlに溶解させた。ここに(benzotriazol−1−yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate(PyBOP)1.7g(3.2mmol)と1−hydroxybenzotriazole(HOBt)0.43g(3.2mmol)を加えた後、3−azido−1−propylamine(非特許文献6)0.64g(6.4mmol)を加え、室温で20時間攪拌した。この溶液に水を加え、水層をCH2Cl2により洗浄し、水層を排除分子量3.5Kの透析膜を用いて、24時間透析した。続いて凍結乾燥を行い、アジド基を有するヒアルロン酸誘導体3を白色固体0.13g(70%)として得た。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR(400MHz、D2O、25℃)δ/ppm;1.67(s,2H),1.87(s,3H),3.05−3.80(m,14H),4.37(m,2H))。図12に3のNMRチャートを代表例として示した。
実施例1(3)で示すように、用いる3−azido−1−propylamineと縮合剤の当量数を各々16当量、8当量とすることで、ヒアルロン酸に含まれるカルボキシル基をほぼ完全に変換できる。一方、用いる3−azido−1−propylamineと縮合剤の当量数を減らすことで、3−azido−1−propylamineの導入効率を調節することが可能である(図3(b)および表1)。なお、図3(b)中の中括弧は、3−azido−1−propylamineがランダムに導入されていることを示す。3−azido−1−propylamineの導入効率は、ヒアルロン酸に含まれるN−アセチル基の3H(1.87ppm)と導入される3−azido−1−propylamineの2位の2H(1.67ppm)の比より算出した。また収率は、1H−NMRより求めた導入効率を基に算出される分子量を用いて決定した。
比較例としてのICGのみを有するヒアルロン酸誘導体HA−ICGの合成を以下に示す(図4(a))。窒素雰囲気下、25mlシュレンク管に3を41mg(MW(HA−Na)=8K、単位ユニット換算で0.10mmol、アジ化効率〜10%)入れ、無水DMF2mlに溶解させた。ここにICG−Alkyne 14mg(20μmol)を加えた後、CuI 3.8mg(20μmol)、1,8−diazabicyclo[5.4.0]undec−7−ene(DBU)3.0mg(20μmol)を加え、60°Cで終夜攪拌した。この溶液に水2mlを加え、これを排除分子量1Kの透析膜を用いて、24時間水に対し透析した。フィルター(細孔径:0.45μm)を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ICGを有するヒアルロン酸誘導体HA−ICG−a 22mg(51%)を淡緑色固体として得た。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR(400MHz、D2O、25℃)δ/ppm;1.60−1.70(m,0.23H),1.89(br s,3H),3.20−3.85(m,11H),4.30−4.50(m,2H))。
ヒアルロン酸誘導体が形成する自己集合体のDLSによる粒径の測定は、大塚電子株式会社製FPAR−1000を用い行った。サンプルはMilliQ水に溶解させ、測定前にPVDFフィルター(孔径0.45μm)を用い、ろ過した(サンプル濃度:1〜2g/L)。散乱角90°の散乱光測定を25℃で3分間行った。測定は各三回ずつ行い、再現性を確認している。ヒアルロン酸誘導体が形成する自己集合体の静的光散乱法(static light scattering:SLS)による臨界凝集濃度(critical aggregation concentration:cac)の決定は、大塚電子株式会社製SLS−6000を用いて行った。サンプルはMilliQ水に溶解させ、測定前にPVDFフィルター(孔径0.45μm)を用い、ろ過した。様々な濃度のヒアルロン酸誘導体水溶液の散乱角90°の散乱光測定を25℃で3分間ずつ行った。測定は各3回ずつ行い、再現性を確認している。代表的なSLS測定結果を図15に示す。
アジド基を有するヒアルロン酸誘導体3に対し、ICG−AlkyneとPEG−Alkyne(非特許文献7)を同時に作用させることで、ICGおよびPEGを有する様々なヒアルロン酸誘導体1を得ることができる(図4(b)および表2)。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、25mlシュレンク管に3 23mg(MW(HA−Na)=8K、単位ユニット換算で50μmol、アジ化効率>99%)を入れ、無水DMF2mlに溶解させた。ここにICG−Alkyne 8.8mg(13μmol)、PEG−Alkyne 0.18g(88μmol)を加えた後、CuI 2.9mg(15μmol)、DBU 2.3mg(15μmol)を加え、60℃で終夜攪拌した。この溶液に水2mlを加え、これを排除分子量25Kの透析膜を用いて、24時間水に対し透析した。フィルター(細孔径:0.45μm)を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ICGおよびPEGを有するヒアルロン酸誘導体1 48mg(60%)を深緑色固体として得た。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR(400MHz、D2O、25℃)δ/ppm;1.80−2.15(m,3H),3.10−3.90(m,183H),4.30−4.50(m,2H),7.93(br s,0.96H))。図13に1の1H−NMRチャートを代表例として示した。
アジド基を有するヒアルロン酸誘導体3に対し、ICG−Alkyne、PEG−AlkyneおよびGA−Alkyne(非特許文献8)を同時に作用させることで、ICG、PEGおよびGAを有する様々なヒアルロン酸誘導体2を得ることができる(図6および表4)。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、25mlシュレンク管に3 23mg(単位ユニット換算で50μmol、アジ化効率>99%)を入れ、無水DMF2mlに溶解させた。ここにICG−Alkyne 14mg(20μmol)、PEG−Alkyne 40mg(20μmol)、GA−alkyne 5.2mg(20μmol)を加えた後、CuI 2.9mg(15μmol)、DBU 2.3mg(15μmol)を加え、60℃で終夜攪拌した。この溶液に水2mlを加え、これを排除分子量25Kの透析膜を用いて、24時間水に対し透析した。フィルター(細孔径:0.45μm)を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ICG、PEGおよびGAを有するヒアルロン酸誘導体2 72mg(87%)を深緑色固体として得た。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR(300MHz、D2O、25℃)δ/ppm;1.75−2.15(m,3H),2.55(br s,0.38H),2.80−3.10(m,0.93H),3.10−4.00(m,102H),4.25−4.50(m,2.4H),7.68(s,0.38H),7.93(br s,0.58H))。図14に2a(GA)の1H−NMRチャートを示した。
アジド基を持つヒアルロン酸と末端アルキンを持つ誘導体との環化反応は、硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウムを組み合わせる水中での触媒系を利用することで進行することが報告されている(非特許文献9、非特許文献10)。これを踏まえ、アジド基を持つヒアルロン酸誘導体3に対して、ICG−alkyneとPEG−alkyneを硫酸銅とアスコルビン酸ナトリウムを組み合わせた触媒条件下反応を試みた。
上記で調製した化合物の血中滞留性を評価するために、雌の非近交系BALB/c Slc−nu/nuマウス(7〜9週齢、日本エスエルシー株式会社)に対して、各化合物を尾静脈に投与し、各時間における血中の色素残存率を測定した。投与1、3、9、24時間後にマウス尾静脈から血液を採取し、96ウェルプラスチックプレート内で血液、1%Triton、DMFを2:9:9で混合した。IVIS(登録商標)ImagingSystem 200 Series(XENOGEN社製)を用いて、96ウェルプラスチックプレート内の血液溶液の蛍光強度を測定することで血中の色素残存率を測定した。各時間における、投与量に対する色素残存率(%injected dose:%IDと略す)を図7に示した。1gについては、十分な蛍光強度が得られなかったため、評価できなかった。色素残存率の測定から、1a,1h〜1m,2a(GA)が24時間後においてもサンプルは血中に残存しており、血中滞留性に優れることが明らかとなった。一方、PEGを有さないICGのみ有するヒアルロン酸誘導体HA−ICG−a,HA−ICG−b,ならびにHA−ICG−c(比較例サンプル)は全て24時間後には血中には残存しておらず、血中滞留性は低いことがわかった。本結果より、ICGを有するヒアルロン酸誘導体について、ICG含率を高めるため、ならびに血中滞留性を高めるために、PEGを含有させることが必須であり、そのPEG含率により血中滞留性を制御できることが示された。
上記実施例1で得られた化合物の腫瘍造影能を評価した。腫瘍造影能の評価のために、ヒアルロン酸誘導体を投与した担癌マウスの蛍光イメージングを行った。蛍光イメージング実験においては、雌の非近交系BALB/c Slc−nu/nuマウス(購入時6週齢)(日本エスエルシー株式会社)を用いた。マウスに担癌させる前の1週間、京都大学医学部(京都府、日本)の動物施設で、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約1週間前に1×106個のcolon26マウス腸癌細胞(理研)を、マウスの肩と大腿部に皮下注射した。投与量はマウス当たり、色素量として0.25nmolであり、100μLのPBS溶液としてマウス尾静脈に注射した。ヒアルロン酸誘導体1a,1b,1c,1h,1i,1k,1l,2a(GA),2as(GAs),2b(GA2),2d(GA3),ならびに2c(GA4)を投与したマウスの全身蛍光像を、IVIS(登録商標)Imaging System 200 Series(XENOGEN)を用いて、投与24時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。図9は投与後24時間目のマウスの蛍光イメージである。図9中、白矢印で示される腫瘍部位での蛍光信号が認められた。この結果より、本発明のヒアルロン酸誘導体は腫瘍を造影することが可能であり、腫瘍の光イメージング用造影剤としての有効性が示された。
実施例3で実施した腫瘍造影実験のマウスの腫瘍中色素量を定量することで、ヒアルロン酸誘導体1a,1b,1c,1h,1i,1k,1l,2a(GA),2as(GAs),2b(GA2),2d(GA3),ならびに2c(GA4)の腫瘍集積性を評価した。腫瘍集積性は、腫瘍1gあたりの全投与量に対する腫瘍への移行率(%ID/g)で表わした。まず、投与24時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、腫瘍を外科的に摘出した。腫瘍をプラスチックチューブに移し、腫瘍重量に対し1.25倍量の1%Triton−X100水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いて破砕した。次いで、腫瘍組織重量の20.25倍量のジメチルホルムアミド(DMF)を加えた。IVIS(登録商標)Imaging System 200 Series(XENOGEN)を用いて、プラスチックチューブの状態で、腫瘍破砕溶液の蛍光強度を測定することで腫瘍中の色素量を定量した。その結果を図10(b)に示す。本発明に係るヒアルロン酸誘導体を投与した腫瘍では色素が検出され、腫瘍への集積が確認された。腫瘍集積性は4%から14%であり、1aでは最も高い腫瘍集積性14.8%ID/gを示した。図11に、腫瘍集積性と各サンプルのICG含率、PEG含率との関係を示した。PEG含率が大きくなるに従って、腫瘍集積性が高くなる傾向が見られた。一方、ICG含率では、15%程度で腫瘍集積性が高くなる傾向が見られた。ICG含率を20%以上にしても腫瘍集積性の低下は見られなかった結果より、ICGを高含率として、つまり感度を増強したまま腫瘍への集積性を維持できる化合物であることが示された。
上記実施例1で得られた化合物の光音響信号を測定した。比較例としてICG水溶液も同様に測定した。光音響信号の計測は、パルスレーザー光をサンプル水溶液に照射し、圧電素子を用いてサンプルから光音響信号を検出し,高速プリアンプで増幅後,デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザ(Lotis社製)を用いた。レーザー波長は720nmと790nm、比較のためのICG水溶液について、波長は710nmと780nmとした。これはサンプル水溶液の吸収帯が2つあり、例えば上記実施例1で得られた化合物では、720nmと790nmに吸収ピークが認められる。図16(a)に代表的なサンプル1a,1b,1c,2as(Gas)ならびに比較のためのICGの吸収スペクトルを示した。エネルギー密度は12mJ/cm2、パルス幅は20ナノ秒、パルス繰返しは10Hzの条件とした。超音波トランスデューサとしては、型式V303(Panametrics−NDT社製)を用いた。中心帯域は1MHz、エレメントサイズはφ0.5、測定距離は25mm(Non−focus)、アンプは+30dB(超音波プリアンプ Model 5682 オリンパス社製)の条件である。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長0.1cm、サンプル容量は約200μlであった。溶媒は水を用いた。計測器は、DPO4104(テクトロニクス社製)を用いて、トリガー:光音響光をフォトダイオードで検出、Data acquisition:128回(128パルス)平均の条件で測定を行った。図16(b)に、代表的なサンプル1aのレーザー波長790nmにおける光音響信号(電圧)の時間変化スペクトルを示す。また図17には本発明の化合物ならびに比較のためのICGの吸光度規格化した光音響信号の強度を示した。ここで、吸光度規格化とは、実際に得られた電圧値(V)を照射レーザー強度(J)ならびにレーザー波長におけるサンプルの吸光度で割ったものである。図17から明らかなように、全ての本発明の化合物において、光音響信号を発信することが可能であり、比較のICGと同等あるいはそれ以上の光音響信号強度を得ることが可能であることがわかった。ICGに比べて光音響信号が高くなる理由は、上記実施例1で得られた本発明の化合物は疎水性のICG誘導体を用いており、その色素自身の熱変換効率がICGに比べて高いことが考えられる。ほかの原因として、疎水性のため色素同士が強く凝集すること、あるいはヒアルロン酸で色素が媒体の水から覆われていることによる熱の閉じ込め効果が寄与している可能性が考えられる。本実施例の結果より、本発明の化合物は光音響造影剤として機能することが確認された。
スルホニル基を有する近赤外色素ICG−S−alkyneを使用した以外は、実施例1と同様のスキームでスルホニル基を有する近赤外色素含有ヒアルロン酸誘導体4を合成した。図21(a)にその構造式を示す。原料として、分子量5KのHA−Naを用いた。
近赤外色素ICG−S−alkyneの合成を図21(b)に示す。まず、50ml一つ口ナス型フラスコに、特開1997−124599号公報に開示されたインドシアニングリーン誘導体ICG−S−OSu 0.62g(0.75mmol)を入れ、アセトニトリル 2mlに溶解させた。ここにプロパルギルアミン(58μl,0.90mmol)を0℃で加え、2時間攪拌した。この溶液に0.1N塩酸10mlを加え、水層をCH2Cl2で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、得られた濃緑色固体を遠心沈降(CH2Cl2/Et2O)させ、精製した。濃緑色固体を少量の酢酸エチルで洗浄し、減圧乾燥後、ICG−S−alkyneを濃緑色固体 0.63g(93%)として得た。同定は1H−NMR、FAB−MSにより行った。
結果は以下の通りであった。(1H−NMR (400MHz,CD3OD、25℃,TMS) δ/ppm; 1.51(t,J=6.4Hz,2H),1.71(t,J=7.3Hz,2H),1.86(t,J=6.4Hz,2H),1.91−2.15(m,2H),2.00(s,12H),2.22(t,J=7.2Hz,2H),2.67(s,1H),2.91(t,J=6.0Hz,2H),3.40−3.57(m,2H),3.90(d,J=2.3Hz,2H),4.10−4.32(m,4H),6.21−6.36(m,1H),6.36−6.49(m,1H),6.53−6.76(m,2H),7.39−7.51(m,2H),7.54(d,J=8.7Hz,1H),7.57−7.78(m,3H),7.88−8.13(m,6H),8.13−8.38(m,2H).FAB−HRMS m/e 767.3757 [M]+。
ICG−S−alkyneの近赤外領域における光吸収スペクトル(クロロホルム中、色素濃度1.0×10−6M)吸収強度は図21(c)に示すとおりであり、804nmに吸収極大を有する。この最大吸収波長におけるモル吸光係数は1.2×105M−1×cm−1であった。
アジド基を有するヒアルロン酸類縁体3に対し、ICG−S−AlkyneとPEG−Alkyneを同時に作用させることで、ICG−SおよびPEGを有する様々なヒアルロン酸誘導体4を得ることができる(図22および表5)。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、25mlシュレンク管に3を23mg(MW(HA−Na)=5K、単位ユニット換算で50μmol、アジ化効率>99%)を入れ、無水DMF 2mlに溶解させた。ここにICG−S−Alkyne 38mg (50μmol)、PEG−Alkyne 0.10g(50μmol)を加えた後、CuI 2.9mg(15μmol)、DBU 2.3mg(15μmol)を加え、60℃で終夜攪拌した。この溶液に水2mlを加え、これを排除分子量25Kの透析膜を用いて、24時間水に対し透析した。フィルター(細孔径:0.45μm)を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ICG−SおよびPEGを有するヒアルロン酸誘導体4b 83mg(79%)を深緑色固体として得た。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR(400MHz、D2O、25℃) δ/ppm;1.80−2.16(m,3H),3.10−4.01(m,633H),4.25−4.60(m,1H),7.93(br s,0.98H))。
なお環化反応の転換率は、1H−NMRより3−azido−1−propylamineの2位の2H(1.67ppm)の減少率を基に算出した。ICG部位の導入率は、ICG−SおよびPEGを有するヒアルロン酸誘導体のDMF溶液のUVスペクトルを測定し、ICG−alkyneを標準物質として用い、最大吸収波長(790nm付近)の吸光度を基に決定した。PEG部位の導入率は、アジド基の転換率とICG−S部位の導入率から算出した。また収率は、ICG−SおよびPEG部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。
ヒアルロン酸誘導体4a、4b、4cのcacは、それぞれ、2.6、3.0、3.9(×10−4g/L)であった。
b 1H−NMRの積分値およびUV−vis測定における吸光度より算出.
c ポリマーを水に溶解させ、動的光散乱法により決定.
d ポリマーをDMFに溶解させ、等量の水と混合し、透析によりDMFを除去後、動的光散乱法により決定.
e 二種類の粒子の散乱強度比率は1:4.
分子量5KのPEG誘導体PEG−5K−alkyneを使用した以外は、実施例1(5)と同様のスキームで分子量5KのPEGを有するヒアルロン酸誘導体5(図23(a))を合成した。原料として、分子量5KのHA−Naを用いた。
PEG−5K−alkyneの合成を以下に示す(図23(b))。200ml二つ口ナス型フラスコに、市販のmPEG5000 10g(2.0mmol)を入れ、これを100℃で終夜減圧下乾燥させた。55℃まで放冷し、THF 80mlに溶解させた。ここに4−ペンチン酸(0.79g,8.0mmol)を加えた後、DCC 0.83g(4.0mmol)、DMAP 73mg(0.6mmol)を加え、55℃で終夜攪拌した。室温まで放冷した後、ガラスフィルターにより不溶の固体を除去した。濾液に過剰量のジエチルエーテルを加えることで、白色固体が生じた。ガラスフィルターを用いてこれをろ液と分離し、ジエチルエーテルで洗浄することで、PEG−5K−alkyne 8.1g(81%)を白色固体として得た。同定は1H−NMRにより行った。結果は(1H−NMR (400MHz,CDCl3、25℃,TMS) δ/ppm;1.97−2.01(m,1H),2.47−2.55(m,2H),2.55−2.64(m,2H),3.40−3.92(m,591H),4.26(t,J=5.0Hz,2H))であった。
アジド基を有するヒアルロン酸類縁体3に対し、ICG−AlkyneとPEG−5K−Alkyneを同時に作用させることで、ICGおよびPEG−5Kを有する様々なヒアルロン酸誘導体5を得ることができる(図24(a)および表6)。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、25mlシュレンク管に3を23 mg (MW(HA−Na)=5K、単位ユニット換算で50μmol、アジ化効率>99%)を入れ、無水DMF 2mlに溶解させた。ここにICG−Alkyne 26mg(38μmol)、PEG−5K−Alkyne 0.31g(63μmol)を加えた後、CuI 2.9mg(15μmol)、DBU 2.3mg(15μmol)を加え、60℃で終夜攪拌した。この溶液に水 2mlを加え、これを排除分子量25Kの透析膜を用いて、24時間水に対し透析した。フィルター(細孔径:0.45μm)を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ICGおよびPEG−5Kを有するヒアルロン酸誘導体5 0.27g(63%)を深緑色固体として得た。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR(400MHz、D2O、25℃)δ/ppm;1.65−2.10(m,3H),2.54(br s,0.6H),2.82−3.05(m,1.3H),3.15−4.00(m,395H),4.25−4.50(m,2H),7.72(s,0.65H),7.93(br s,0.15H))。
なお環化反応の転換率は、1H−NMRより3−azido−1−propylamineの2位の2H(1.67ppm)の減少率を基に算出した。ICG部位の導入率は、ICGおよびPEG−5Kを有するヒアルロン酸誘導体のDMF溶液のUVスペクトルを測定し、ICG−S−alkyneを標準物質として用い、最大吸収波長(790nm付近)の吸光度を基に決定した。PEG−5Kを結合したトリアゾール環のプロトンの化学シフト(7.72ppm)は、ICGを有するトリアゾール環のプロトンと化学シフト(7.93ppm)と異なって観測された。PEG部位の導入率は、アジド基の転換率とICG部位の導入率からも算出できるが、これを利用し、反応したアジド基のうちPEG−5Kを有するトリアゾール環に変換された比率とアジド基の転換率を基に算出することもできる。また収率は、ICGおよびPEG−5K部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。
ヒアルロン酸誘導体5a、5bのcacは、それぞれ、2.1、3.8 ( X 10−4g/L)であった。
b 1H−NMRの積分値およびUV−vis測定における吸光度より算出.
c ポリマーを水に溶解させ、動的光散乱法により決定.
原料として、分子量25KのHA−Naを用いた以外は、実施例1と同様のスキームで近赤外色素を有するヒアルロン酸誘導体6を合成した。
アジド基を有するヒアルロン酸類縁体3に対し、ICG−AlkyneとPEG−Alkyneを同時に作用させることで、ICGおよびPEGを有する高分子量ヒアルロン酸誘導体6を得ることができる(図24(b)および表7)。代表的な合成例を以下に示す。窒素雰囲気下、25mlシュレンク管に3を23mg(MW(HA−Na)=25K、単位ユニット換算で50μmol、アジ化効率>99%)を入れ、無水DMF 2mlに溶解させた。ここにICG−Alkyne 17mg(25μmol)、PEG−Alkyne 0.15g(75μmol)を加えた後、CuI 2.9mg(15μmol)、DBU 2.3mg(15μmol)を加え、60℃で終夜攪拌した。この溶液に水 2mlを加え、これを排除分子量25Kの透析膜を用いて、24時間水に対し透析した。フィルター(細孔径:0.45μm)を用いて得られた水溶液をろ過し、凍結乾燥することで、ICGおよびPEGを有するヒアルロン酸誘導体6 42mg(35%)を深緑色固体として得た。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR(400MHz、D2O、25℃)δ/ppm;1.71−2.13(m,3H),3.22−4.00(m,390H),4.30−4.53(m,2H),7.93(br s, 0.99H))。
本環化反応は再現性に乏しい。また用いたICGの量に対する導入量が低いことも特徴的である。
なお環化反応の転換率は、1H−NMRより3−azido−1−propylamineの2位の2H(1.67ppm)の減少率を基に算出した。ICG部位の導入率は、ICGおよびPEGを有するヒアルロン酸誘導体のDMF溶液のUVスペクトルを測定し、ICG−alkyneを標準物質として用い、最大吸収波長(790nm付近)の吸光度を基に決定した。PEG部位の導入率は、アジド基の転換率とICG部位の導入率から算出した。また収率は、ICGおよびPEG部位の導入率を基に算出される分子量を用いて決定した。
ヒアルロン酸誘導体6a、6bのcacは、それぞれ、14、18(×10−4g/L)であった。
b 1H−NMRの積分値およびUV−vis測定における吸光度より算出.
c ポリマーを水に溶解させ、動的光散乱法により決定.
d 二種類の粒子の散乱強度比率は1:2.
e ポリマーをDMFに溶解させ、等量の水と混合し、透析によりDMFを除去後、動的光散乱法により決定.
上記実施例6〜8で得られた化合物の腫瘍造影能を上記実施例3と同様の方法で評価した。ヒアルロン酸誘導体4a,4b,4c,5a,5b,ならびに6bを投与したマウスの全身蛍光像を、IVIS(登録商標)Imaging System 200 Series(XENOGEN)を用いて、投与24時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。投与量はマウス当たり、色素量として50nmolであり、100μLのPBS溶液としてマウス尾静脈に注射した。図25(a)は投与後24時間目のマウスの蛍光イメージである。全てのサンプルにおいて、図25(a)中、白矢印で示される腫瘍部位での蛍光信号が認められた。この結果より、本発明のヒアルロン酸誘導体は腫瘍を造影することが可能であり、腫瘍の光イメージング用造影剤としての有効性が示された。
図25(b)は、図25(a)で示される蛍光イメージングデータから、腫瘍部(計測面積0.5×0.5cm)の蛍光強度と足の付け根の蛍光強度(正常部位として選択、計測面積0.5×0.5cm)の比をとったものであり、SNR(signal−to−noise ratio)として数値化したものである。すなわちSNRは、それぞれの化合物の腫瘍描出力を示すパラメータであり、SNRが高いほど腫瘍の光イメージング用造影剤として有効であることになる。図25(b)より、全ての化合物のSNRは1.5以上であり、また4bや6bでは特にSNRが高く、腫瘍造影能に優れた化合物であることが示された。
実施例9で実施した腫瘍造影実験のマウスの腫瘍中色素量と血中色素量を定量することで、ヒアルロン酸誘導体4a,4b,4c,5a,5b,ならびに6bの腫瘍集積性と血中色素残存率を評価した。腫瘍集積性は実施例4と同じ方法で評価した。血中の色素残存率は、実施例2と同じ方法で評価した。その結果を図26(a)に示す。本発明に係るヒアルロン酸誘導体を投与した腫瘍では色素が検出され、腫瘍への集積が確認された。腫瘍集積性は1.7%から18.5%であり、6bでは最も高い腫瘍集積性18.5%ID/gを示した。ICG−SおよびPEGを有するヒアルロン酸誘導体4では、血中色素残存率が低いにもかかわらず、腫瘍集積性が比較的高いため、腫瘍選択性の高い化合物であることがわかった。ICG含率が高いと腫瘍集積性が低下する傾向が見られた。ICGおよびPEG−5Kを有するヒアルロン酸誘導体5では、PEG分子量2Kの化合物(例えば1i)と比べて、血中色素残存率が向上した一方で腫瘍集積性は低下した。近赤外色素を有する高分子量ヒアルロン酸誘導体6では、腫瘍集積性と血中濃度が高かった。血中滞留性が非常に高いため、腫瘍集積性も高くなったと思われる。
実施例5と同様にして、ヒアルロン酸誘導体4a,4b,4c,5a,5b,ならびに6bの光音響信号を測定した。比較例としてICG水溶液も同様に測定した。図26(b)にはICGの光音響信号強度に対する本発明の化合物の光音響信号の相対強度を示した。図26(b)から明らかなように、4a,4b,4c,5a,5b,ならびに6bは、光音響信号を発信することが可能であり、ICG以上の光音響信号強度を得ることが可能であることがわかった。特にICG−SおよびPEGを有するヒアルロン酸誘導体4において、ICGに比べて1.3〜1.4倍の光音響信号の増加が認められた。信号強度増加のメカニズムとしては、色素自身の熱変換効率がICGに比べて高いこと、色素同士が強く凝集し色素が媒体の水から覆われていることにより熱が閉じ込められることなどが考えられる。本実施例の結果より、本発明の化合物は光音響造影剤として機能することが確認された。
担ガンマウスの腫瘍部位からの光音響信号強度は以下のように計測した。市販の光音響イメージング装置(Nexus128,Endra.Inc.製)を用いた。レーザーの波長は790nmとした。本発明の化合物を投与する前、ならびに投与後24時間目において、それぞれ、腫瘍部の光音響信号を測定し、それぞれの3次元再構成データを得た。得られた3次元再構成データを用いてソフトウェア(GEHC MICROVIEW, GE Healthcare)により関心領域(ROI:Region of Interest)として全計測領域(2cmx2cmx2cm)の光音響強度を計測した。担ガンマウスは、実施例3に記載のマウスを用いた。本発明の実施例に係る化合物1a,1c,1i,2c,2g,4a,4b、ならびにコントロールとして生理食塩水を投与した。化合物の投与量は、ICG 50nmolをマウスに投与した。
表8には、投与前と投与後24時間目の腫瘍部の光音響信号の比を示したものである。全ての化合物において、コントロールと比較して、投与後における光音響信号の増加が認められた。この結果より、本発明の化合物は腫瘍の光音響イメージングが可能であることが示された。
実施例1(4)で得られた3−azido−1−propylamineをHAに部分的に導入したヒアルロン酸誘導体3(表1、エントリー3)に対し、未反応のHAのカルボキシル基部位に環状RGDペプチドを導入することでアジド基およびRGDを有するヒアルロン酸誘導体を合成し、次いで、これにICGとPEGを結合させた(図27)。具体例を以下に示す。
表1のエントリー番号3の条件で得られた、3−azido−1−propylamineを90%結合させたヒアルロン酸誘導体12mg(MW(HA−Na)=8K,単位ユニット換算で30μmol)を、実施例1(2)で示す反応に付し、カチオン交換を行った。続いて、窒素雰囲気下、25mLシュレンク管に得られた白色固体9.7mg(単位ユニット換算で20μmol)を入れ、無水DMSO 0.50mlに溶解させた。ここにPyBOP 9.5mg(18μmol)とHOBt 2.4mg(18μmol)を加えた後、環状RGDペプチド(RGD−NH2) 11mg(18μmol)のDMSO溶液1.1mlを加え、室温で18時間攪拌した。この溶液に水を加え、水層をCH2Cl2により洗浄し、水層を排除分子量3.5Kの透析膜を用いて、24時間透析した。凍結乾燥を行い、アジド基およびRGDの導入効率がそれぞれ90%および10%のヒアルロン酸誘導体を二段階で白色固体 6.5mg(43%)として得た。同定は1H−NMRにより行った。なお、RGDの導入効率は、ヒアルロン酸に含まれるN−アセチル(Ac)基の3H(1.87ppm)とRGDのフェニルアラニンに含まれるフェニル(Ph)基の5H(7.05−7.28ppm)の比より算出した。結果は(1H−NMR (400MHz,D2O,25℃)δ/ppm; 1.69(s,1.8H),1.88(s,3H),3.00−3.85(m,14H),4.39(m,2H),7.05−7.28(m,0.50H)であった。
次に、上記で得られたアジド基およびRGDを有するヒアルロン酸誘導体に対し、実施例1(5)と同様の反応条件でICG−alkyneおよびPEG−alkyneを作用させることで、ICG、PEGおよびRGDを有するヒアルロン酸誘導体7を収率53%で得た(図27)。ICG、PEG、RGDの導入率は17:73:10であった。同定は1H−NMRにより行った。(1H−NMR (400MHz,D2O,25℃)δ/ppm;1.70−2.15(m,3H),3.10−4.00(m,261H),4.25−4.50(m,2H),7.94(br s,0.89H))。なお環化反応の転換率は、本願明細書[0079]に示す手法で決定した。得られた化合物が水中で形成する自己集合体の粒径は、94±68nmであり、臨界凝集濃度は4.0×10−4g/lであった。
Claims (14)
- 下記一般式(1)で表される単位からなる重合体を含む化合物であって、
下記一般式(1)中、R1は、単位ごとにそれぞれ独立であって、
前記重合体中、一般式(1)におけるR1として下記一般式(2)または下記一般式(25)を有する単位、および下記一般式(3)を有する単位をそれぞれ1以上含むことを特徴とする化合物、
- 前記重合体中、R1として前記一般式(2)または前記一般式(25)を有する単位の数をx、前記重合体の全単位の数をNとしたときに、x,Nが下記式(1)の関係を満たすことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
0.13<x/N≦0.78 式(1) - 前記一般式(1)で表される単位からなる重合体を含む化合物であって、
前記一般式(1)中、R1は、単位ごとにそれぞれ独立であって、
R1は下記一般式(2)から(5)、下記一般式(25)及び一般式(29)より選ばれ、
前記重合体は、少なくとも一般式(2)または一般式(25)、および(3)をR1として有する単位をそれぞれ1以上含むことを特徴とする化合物、
一般式(3)においてR2はH、OH、OMe、NH2、およびCOOHのいずれかであり、kは20以上200以下の整数であり、
一般式(5)においてR3はN3、H、CH3、NH2、SH、COOHのいずれかである。 - 重合体中、一般式(2)または一般式(25)をR1として有する単位の数をx、一般式(3)をR1として有する単位の数をy、一般式(4)または一般式(29)をR1として有する単位の数をzとしたときに、x,y,zが下記式(2)の関係を満たすことを特徴とする請求項3に記載の化合物。
0.13<x/(x+y+z)≦0.78 式(2) - 重合体中、一般式(4)または一般式(29)をR1として有する単位を少なくとも1つ含むことを特徴とする請求項3または4のいずれかに記載の化合物。
- 一般式(6)から(9)一般式(28)及び(30)のいずれかで表わされる単位からなる重合体を含む化合物であって、前記重合体は一般式(6)または一般式(28)、および一般式(7)で表わされる単位をそれぞれ1以上含むことを特徴とする化合物、
- 前記重合体中、一般式(6)または一般式(28)で表わされる単位の数をx、一般式(7)で表わされる単位の数をy、一般式(8)または(9)または(30)で表わされる単位の数をzとしたときに、x、y、zが下記式(2)の関係を満たすことを特徴とする請求項6に記載の化合物。
0.13<x/(x+y+z)≦0.78 式(2) - 一般式(1)で表される単位からなる重合体を主鎖として有する化合物であって、
R1は単位ごとに独立であって、
R1として、ICG類縁体、または両親媒性分子が結合している化合物、
x,Nは下記式(1)の関係を満たす。
0.13<x/N≦0.78 …式(1) - 請求項1乃至8のいずれか1項に記載の化合物を有する粒子。
- 請求項1乃至8のいずれか1項に記載の化合物および分散媒を有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
- 粒子の平均粒径が10nm以上180nm以下であることを特徴とする請求項9に記載の粒子。
- 請求項9に記載の粒子と、粒子の分散媒とを有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
- 両親媒性分子の存在下で、ICG誘導体とヒアルロン酸を反応させることを特徴とするヒアルロン酸誘導体の製造方法。
- 前記両親媒性分子がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項13に記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法。
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