CN113171342A - 一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备和应用 - Google Patents

一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113171342A
CN113171342A CN202110537563.4A CN202110537563A CN113171342A CN 113171342 A CN113171342 A CN 113171342A CN 202110537563 A CN202110537563 A CN 202110537563A CN 113171342 A CN113171342 A CN 113171342A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
targeting
hyaluronic acid
micelle
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110537563.4A
Other languages
English (en)
Inventor
郭娜
罗艳霞
杨尧
郁彭
李九远
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN202110537563.4A priority Critical patent/CN113171342A/zh
Publication of CN113171342A publication Critical patent/CN113171342A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备方法与应用。本发明将E选择素肽配体与紫杉烷类、喜树碱类、鬼臼毒素等化疗药通过二硫键连接，然后将该偶联物连接至透明质酸的羧基上，形成的两亲性聚合物在水溶液中可自组装形成初级纳米靶向胶束，并可进一步载入其他功能分子，例如化疗药和/或光敏剂吲哚菁绿，形成多功能纳米胶束：该胶束分别具有透明质酸和肿瘤靶向肽介导的主动靶向肿瘤作用，以及纳米胶束EPR效应的被动靶向作用，且具有光热光动力与化疗协同作用特点，并可竞争抑制E选择素介导的血管内皮细胞与肿瘤细胞的黏附，从而具有抑制肿瘤细胞转移的潜力。上述多功能纳米胶束制备简单易行，适用范围广，具有重要的应用价值。

Description

一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及肿瘤靶向纳米胶束及其制备方法和应用。
背景技术
化疗药仍然是治疗肿瘤的重要手段，但传统化疗药有着明显的缺陷，如系统毒性强，缺乏靶向性、易耐药等。纳米制剂作为化疗药物的载体得到了越来越多的发展，但临床应用的纳米材料及纳米剂型种类较少且功能单一，缺乏具有良好靶向性、安全性并通过多种模式协同作用的纳米递送技术平台。
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种广泛存在于人类体内的糖胺聚糖。它是细胞外基质的主要成分，在人体中起着重要的生理作用。透明质酸具有优异的生物相容性和生物降解性，不具有免疫原性。HA有多个官能团用于各种修饰，并且其已被证实具有较高的肿瘤靶向能力，因为其可以与多种肿瘤细胞表面的CD44受体特异性结合。由于透明质酸的优异性能，使得它成为一种优良的载体材料。
E选择素是在活化的内皮细胞中特异性高表达的一种糖蛋白，研究表明多种类型的癌组织相比于正常组织其E-选择素表达量明显增高，其对肿瘤的扩散转移有重要的作用，可介导肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附并启动随后的随血迁移，因此E选择素是较理想的靶向肿瘤和抑制转移的靶标分子。
吲哚菁绿(Indocyanine green，ICG)是一种近红外染料，是FDA批准用于临床心脏造影和测定肝代谢的诊断试剂，安全性高。ICG在激光照射下，不仅可以产生单线态氧，也可以吸收激光能量产生热量，因此可作为产生光热和光动力作用的光敏剂。
光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是利用肿瘤细胞代谢活跃的特点，在注射药物(光敏剂)后，其肿瘤组织内浓度明显高于周围正常组织。在适当时间用特定波长的激光照射肿瘤组织，激活光敏剂，产生活性氧，特异性破坏肿瘤细胞及肿瘤新生血管。
光热疗法(Photothermal Therapy，PTT)是一种热疗介导的癌症治疗方法，它通过提高癌细胞的温度来消除肿瘤。
发明内容
为了开发具有优良靶向性、安全性并可通过多种模式协同抗肿瘤生长和转移的新型纳米递送系统用于化疗药的改良，本发明针对现有技术的不足，提供了一种基于透明质酸的多功能肿瘤靶向纳米胶束及其制备方法和应用，所述的肿瘤靶向纳米胶束的构成成分中的药-肽偶联物是化疗药与E选择素肽配体的偶联，中间是通过含二硫键的连接桥连接，使其具有谷胱甘肽响应性释放原药的能力，将该偶联物多价连接到透明质酸骨架上后，形成两亲性聚合物，该聚合物作为可作为靶向前药并可自聚为初级纳米胶束，进一步地，该聚合物还可作为递送载体在自聚的同时通过非共价疏水作用包载其他功能分子构成多功能纳米胶束。由于透明质酸和E-选择素肽配体都具有靶向肿瘤部位的能力，因此该肿瘤靶向胶束具有双重主动靶向能力，同时由于纳米胶束本身具有的EPR效应，使其还具有被动靶向肿瘤的能力，通过化疗药和光敏剂的共包载，使该胶束具有光热/光动力和化疗协同作用，改善抗癌药物的作用。
为达到发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于透明质酸骨架的多功能肿瘤靶向纳米胶束及，所述的方法，一方面是将肿瘤靶向肽以及疏水性抗肿瘤药物通过二硫键连接得到药-肽偶联物；另一方面是将透明质酸通过阳离子树脂用四丁基氢氧化铵改性，得到改性透明质酸；最后将药-肽偶联物和改性透明质酸连接得到两亲性聚合物，该聚合物在水溶液中自组装形成初级靶向纳米胶束，进一步再以透析法将光敏剂和化疗药载入胶束的疏水腔中，即得具有光热光动力和化疗协同作用的多功能靶向纳米胶束。
而且，所述的疏水性药物为紫杉醇类药物、喜树碱类药物或鬼臼毒素类药物。
而且，所述的疏水性药物为紫杉醇类药物、喜树碱类药物或鬼臼毒素类药物中的一种或多种。
而且，所述的光敏剂为吲哚菁绿(Indocyanine green ICG)、二氢卟吩e6(Ce6)、IR780；
优选地，所述的光敏剂为吲哚菁绿。
而且，所述的肿瘤靶向肽为CIELLQAR、IELLQARC、CRAQLLEI、RAQLLEIC、(D)-CIELLQAR、(D)-IELLQARC、(D)-CRAQLLEI或(D)-RAQLLEIC；
优选地，所述肿瘤靶向肽序列为CIELLQAR、IELLQARC、CRAQLLEI、RAQLLEIC；
优选地，所述的肿瘤靶向肽序列为CIELLQAR。
而且，所述的药-肽偶联物通过二硫键、酰胺键和酯键连接，优选为二硫键。
而且，所述的透明质酸分子量为2KDa～2000KDa。
而且，所述的药-肽偶联物在透明质酸上的修饰度为10％～100％，优选为10％～50％，进一步优选为10％～30％。
而且，肿瘤靶向纳米胶束中的药物含量质量分数为10％～50％，优选为10％～30％。
而且，所制备的肿瘤靶向纳米胶束的粒径为10-1000nm，优选为10-500nm，进一步优选为10-300nm。
如上所述的的纳米胶束在抗肿瘤药中的应用。
相对现有技术，本发明具有以下积极效果：
1、本发明所涉及的靶向纳米胶束具有三重肿瘤靶向能力。
2、本发明所涉及的靶向纳米胶束在靶向肿瘤和抑制肿瘤生长的同时还可以抑制肿瘤细胞的随血转移。
3、本发明通过在纳米胶束的疏水空腔中载入光敏剂，使胶束获得光热/光动力性能，与化疗药协同作用可增强抗肿瘤作用。
4、本发明所涉及的透明质酸是安全性非常高的载体材料，其偶联药-肽偶联物后得到的聚合物本身既具有抗肿瘤功能(前药)，又可作为药物递送载体进一步包载其他功能分子。
附图说明
图1为多西他赛中间体DTX-SS的1H-NMR图谱
图2为紫杉醇中间体PTX-SS的1H-NMR图谱
图3为鬼臼毒素中间体PODO-SS的1H-NMR图谱
图4为SN38中间体SN38-SS的1H-NMR图谱
图5为药-肽偶联物DTX-PEP的MALDI-TOF图谱
图6为改性透明质酸HA-TBA的1H-NMR图谱
图7为两亲性聚合物HA-PEP-DTX的1H-NMR图谱
图8为两亲性聚合物HA-PEP-PTX的1H-NMR图谱
图9为两亲性聚合物HA-PEP-PODO的1H-NMR图谱
图10为两亲性聚合物HA-PEP-SN38的1H-NMR图谱
图11为两亲性聚合物HA-PEP-DTX对HUVEC与THP-1细胞之间黏附的抑制作用
图12为HA-PEP-DTX自聚形成的肿瘤靶向纳米胶束的TEM图
图13为包载ICG和DTX的靶向纳米胶束DTX/ICG@HA-PEP-DTX的TEM图
图14为游离ICG和纳米胶束DTX/ICG@HA-PEP-DTX在激光照射下的温度变化
图15为游离ICG和纳米胶束DTX/ICG@HA-PEP-DTX在激光照射下ROS的生成情况(DPBF在414nm处的吸光度衰减情况为指标)
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明中使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：多西他赛中间体DTX-SS的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000041
将500mg多西他赛、160mg 3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸、23mg4-二甲氨基吡啶溶于24mL无水二氯甲烷中，充分溶解后，滴加134μL N，N-二异丙基碳二亚胺，在25℃的油浴中反应3小时。然后用50mL二氯甲烷稀释反应体系，以150mL NH4Cl水溶液萃取稀释后的体系两次，收集有机相，再以饱和NaCl水溶液萃取有机相，收集有机相，最后用无水Na2SO4干燥有机相，旋干，然后经柱层析纯化产物，最终的得到多西他赛中间体294mg。制得的多西他赛中间体1H-NMR图谱如图1所示。
实施例2：紫杉醇中间体PTX-SS的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000042
将100mg紫杉醇、30mg 3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸、催化量的4-二甲氨基吡啶溶于5mL无水二氯甲烷中，充分溶解后滴加30μL N，N′-二异丙基碳二亚胺，室温反应3h。体系用二氯甲烷稀释，饱和氯化铵萃取2次，饱和NaCl洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，用二氯甲烷/甲醇＝90/1，200-300目的硅胶进行柱层析纯化，得到100mg紫杉醇中间体。制得的紫杉醇中间体1H-NMR图谱如图2所示
实施例3：鬼臼毒素中间体PODO-SS的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000051
将200mg鬼臼毒素、160mg 3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸、70mg4-二甲氨基吡啶溶于5mL无水二氯甲烷中，充分溶解后滴加150μL N，N′-二异丙基碳二亚胺，室温反应50min。体系用二氯甲烷稀释，饱和氯化铵萃取2次，饱和NaCl洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，用石油醚/乙酸乙酯＝4/1，200-300目的硅胶进行柱层析纯化，得到230mg鬼臼毒素中间体。制得的鬼臼毒素中间体1H-NMR图谱如图3所示。
实施例4：SN38中间体SN38-SS的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000052
(1)化合物1的合成
称取100mg 7-乙基10-羟基喜树碱和130mg 3-(三苯甲硫基)丙酸溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺中，并加入少量面状分子筛，然后冰浴依次加入50mg 4-二甲氨基吡啶和0.1mL N，N-二异丙基乙胺，称取100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于3mL二氯甲烷中，然后将其缓慢滴入体系中，室温反应3.5小时。旋干体系，反应液用二氯甲烷稀释，0.5N HCl萃取3次，饱和碳酸氢钠萃取3次，有机相合并后用饱和NaCl洗涤一次，再用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，用二氯甲烷/甲醇＝300/1，200-300目的硅胶进行柱层析纯化，得到120mg淡黄色固体。
(2)SN38-SS的合成
称取120mg化合物1溶于3mL无水二氯甲烷中，滴加3mL三氟乙酸和0.17mL三异丙基硅烷，室温反应30min。旋干体系，用二氯甲烷溶解再旋干，重复两次。称取60mg 2，2′-二硫二吡啶溶于2mL无水二氯甲烷中，将上述产物用8mL无水二氯甲烷溶解后缓慢滴入体系，室温反应20min。体系加二氯甲烷稀释，用水萃取多次除去副产物，用无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，用二氯甲烷/甲醇＝150/1，200-300目的硅胶进行柱层析纯化，得到80mg SN38中间体。制得的SN38中间体1H-NMR图谱如图4所示。
实施例5：药-肽偶联物DTX-PEP的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000061
将122mg靶向肽CIELLQAR溶于2mL无水N，N-二甲基甲酰胺中；258mg多西他赛中间体溶于5mL无水N，N-二甲基甲酰胺中；然后将靶向肽溶液缓慢滴入多西他赛中间体溶液中，于室温下反应过夜，再然后将反应体系旋干使得产物在烧瓶壁上形成一层薄膜，然后用乙酸乙酯多次洗涤薄膜直至产物变成纯白色，旋干得到药-肽偶联物DTX-PEP 149mg。制得的药-肽偶联物的MALDI-TOF图谱如图5所示。
实施例6：药-肽偶联物PTX-PEP的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000071
将90mg靶向肽CIELLQAR溶于2mL无水N，N-二甲基甲酰胺中；198mg紫杉醇中间体溶于5mL无水N，N-二甲基甲酰胺中；然后将靶向肽溶液缓慢滴入紫杉醇中间体溶液中，于室温下反应过夜，再然后将反应体系旋干使得产物在烧瓶壁上形成一层薄膜，然后用乙酸乙酯多次洗涤薄膜直至产物变成纯白色，旋干得到药-肽偶联物PTX-PEP 110mg。
实施例7：药-肽偶联物PODO-PEP的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000081
将260mg靶向肽CIELLQAR溶于2mL无水N，N-二甲基甲酰胺中；330mg鬼臼毒素中间体溶于5mL无水N，N-二甲基甲酰胺中；然后将靶向肽溶液缓慢滴入鬼臼毒素中间体溶液中，于室温下反应过夜，再然后将反应体系旋干使得产物在烧瓶壁上形成一层薄膜，然后用乙酸乙酯多次洗涤薄膜直至产物变成纯白色，旋干得到药-肽偶联物PODO-PEP 300mg。
实施例8：药-肽偶联物SN38-PEP的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000091
将100mg靶向肽CIELLQAR溶于2mL无水N，N-二甲基甲酰胺中；120mg SN38中间体溶于5mL无水N，N-二甲基甲酰胺中；然后将靶向肽溶液缓慢滴入SN38中间体溶液中，于室温下反应过夜，再然后将反应体系旋干使得产物在烧瓶壁上形成一层薄膜，然后用乙酸乙酯多次洗涤薄膜直至产物变成纯白色，旋干得到药-肽偶联物SN38-PEP 60mg。
实施例9：改性透明质酸HA-TBA的合成
合成路线如下：
Figure BSA0000241670370000092
将3g阳离子交换树脂，以纯水洗涤三次，每次60mL，5分钟，然后将6mL四丁基氢氧化铵加入阳离子交换树脂中，混匀30分钟，过滤除去液体；将400mg透明质酸溶于40mL超纯水中，充分溶解后加入活化后的树脂，室温下混匀3小时，然后过滤收集滤液，将滤液冷冻干燥24小时得到改性透明质酸566mg。制得的改性透明质酸的1H-NMR图谱如图6所示。
实施例10：两亲性聚合物HA-PEP-DTX的合成
将88mg改性透明质酸溶于6mL二甲基亚砜中，完全溶解后，加入356mg 1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐室温下反应1小时；126mg药-肽偶联物DTX-PEP溶于3mL二甲基亚砜中，然后滴入上述反应体系中，再滴加113μL N，N-二异丙基乙胺，于37℃油浴中，反应24小时；加入反应液等体积的1mol/mL的NaCl溶液，再以1N HCl溶液调节pH至3，终止反应，然后以1N NaOH溶液调节pH至7；然后以截留分子量为3500Da的透析袋在0.3mol/mL的NaCl溶液、25％乙醇溶液、超纯水中透析纯化产物，然后经冷冻干燥48小时得到两亲性聚合物HA-PEP-DTX 65mg。制得的两亲性聚合物HA-PEP-DTX的1H-NMR图谱如图7所示。
实施例11：两亲性聚合物HA-PEP-PTX的合成
将80mg改性透明质酸溶于6mL二甲基亚砜中，完全溶解后，加入300mg 1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐室温下反应1小时；110mg药-肽偶联物PTX-PEP溶于3mL二甲基亚砜中，然后滴入上述反应体系中，再滴加70μL N，N-二异丙基乙胺，于37℃油浴中，反应24小时；加入反应液等体积的1mol/mL的NaCl溶液，再以1N HCl溶液调节pH至3，终止反应，然后以1N NaOH溶液调节pH至7；然后以截留分子量为3500Da的透析袋在0.3mol/mL的NaCl溶液、25％乙醇溶液、超纯水中透析纯化产物，然后经冷冻干燥48小时得到两亲性聚合物HA-PEP-PTX 110mg。制得的两亲性聚合物HA-PEP-PTX的1H-NMR图谱如图8所示。
实施例12：两亲性聚合物HA-PEP-PODO的合成
将180mg改性透明质酸溶于15mL二甲基亚砜中，完全溶解后，加入720mg 1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐室温下反应1小时；200mg药-肽偶联物PODO-PEP溶于10mL二甲基亚砜中，然后滴入上述反应体系中，再滴加230μL N，N-二异丙基乙胺，于37℃油浴中，反应24小时；加入反应液等体积的1mol/mL的NaCl溶液，再以1N HCl溶液调节pH至3，终止反应，然后以1N NaOH溶液调节pH至7；然后以截留分子量为3500Da的透析袋在0.3mol/mL的NaCl溶液、25％乙醇溶液、超纯水中透析纯化产物，然后经冷冻干燥48小时得到两亲性聚合物HA-PEP-PODO 210mg。制得的两亲性聚合物HA-PEP-PODO的1H-NMR图谱如图9所示。
实施例13：两亲性聚合物HA-PEP-SN38的合成
将130mg改性透明质酸溶于9mL二甲基亚砜中，完全溶解后，加入530mg 1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐室温下反应1小时；140mg药-肽偶联物SN38-PEP溶于4mL二甲基亚砜中，然后滴入上述反应体系中，再滴加170μL N，N-二异丙基乙胺，于37℃油浴中，反应24小时；加入反应液等体积的1mol/mL的NaCl溶液，再以1N HCl溶液调节pH至3，终止反应，然后以1N NaOH溶液调节pH至7；然后以截留分子量为3500Da的透析袋在0.3mol/mL的NaCl溶液、25％乙醇溶液、超纯水中透析纯化产物，然后经冷冻干燥48小时得到两亲性聚合物HA-PEP-SN38100mg。制得的两亲性聚合物HA-PEP-SN38的1H-NMR图谱如图10所示。
实施例14：两亲性聚合物HA-PEP-DTX中的多西他赛含量的测定
以紫外分光光度计测得多西他赛原料药在275nm处的吸光度-浓度标准曲线，求得线性回归方程为A＝0.0014C-0.0003，R2＝0.9999；然后称取三份两亲性聚合物，重量分别为1.3mg、1.3mg、1.6mg，每一份样品都以4mL乙腈：超纯水比例V/V为1/1溶解并超声10分钟，然后用紫外分光光度计测定吸光度，分别为0.119、0.120、0.150，代入回归方程得到多西他赛浓度分别为85.21、85.93、107.36μg/mL；经计算可知多西他赛的含量分别为26.22％、26.44％、26.83％，即多西他赛平均含量为26.5％。
实施例15：两亲性聚合物HA-PEP-PTX中紫杉醇含量的测定
由紫外分光光度计测得原料药PTX在227nm处的吸光度标准曲线，求得线性回归方程为A＝0.0307C+0.0105，R2＝0.9992；然后将偶联物所测得的吸光度值代入回归方程得到PTX浓度，再经计算得到PTX的含量分别为12.32％、22.15％、13.86％，最后即得偶联物HA-Pep-PTX中药物PTX平均含量为16.1％。
实施例16：两亲性聚合物HA-PEP-PODO中鬼臼毒素含量的测定
测定在292nm处对PODO吸光度的测定求得线性回归方程A＝0.0091C+0.0073，R2＝0.9996；然后通过数值代入和计算得到偶联物中药物的含量分别为14.86％、17.50％、13.79％，算得偶联物HA-Pep-PODO中药物PODO的平均含量为15.4％。
实施例17：两亲性聚合物HA-PEP-SN38中SN38含量的测定
在365nm处测试药物SN38的吸光度并绘制标准曲线，求得线性回归方程A＝0.0552C+0.018，R2＝0.9994；在回归方程中通过代入偶联物所测吸光度值求得到SN38浓度，之后经计算得到药物的含量分别为13.35％、15.23％、11.33％，最后求得HA-Pep-SN38中SN38的平均含量为13.3％。
实施例18：两亲性聚合物的体外细胞毒作用及代表性聚合物HA-PEP-DTX对肿瘤细胞与血管内皮细胞之间黏附作用的抑制作用
实施例中各聚合物体外细胞毒作用如下表，可以看出不同药物偶联物相对于原药的作用也不相同，但总体上偶联物体外48小时对细胞的毒性较原药显著降低，一方面说明其具有一定程度前药的特点，可发挥缓释作用；另一方面也说明其结构具有一定稳定性，可作为药物载体进一步包载其他功能分子。
表1.聚合物及原药(1μM)处理48h对细胞存活率(％)影响
Figure BSA0000241670370000121
利用HUVEC细胞和以calcein荧光标记的THP-1细胞建立的细胞黏附模型评价连有E选择素肽配体的聚合物对该黏附作用的抑制作用。THP-1细胞表面的E-选择素配体(SLEx)可与HUVEC细胞表面诱导表达的E-选择素特异性结合，因此，检测黏附在HUVEC细胞表面的calcein AM的荧光强度即可反映THP-1细胞与HUVEC细胞黏附作用的强弱。而本实验合成的含E-选择素肽配体(CIELLQAR)的化合物HA-PEP-DTX与THP-1细胞竞争性结合HUVEC表面的E-选择素，竞争能力与黏附在HUVEC表面的calcein AM荧光强度成反比关系，荧光值越低，化合物抑制肿瘤细胞与内皮细胞黏附的活性越好。
如附图11所示，与阳性组(TNF-α诱导E选择素高表达)相比，HA-PEP和HA-PEP-DTX组的荧光值都显著降低，且与阴性组的荧光值相当，表明这两个化合物都能够显著抑制THP-1细胞与HUVEC细胞的黏附。而HA-Cys-DTX的荧光值显著强于HA-PEP-DTX，即表明化合物的抗黏附能力来源于E-选择素肽配体(PEP)。
实施例19：肿瘤靶向纳米胶束的制备
将5mg两亲性聚合物HA-PEP-DTX溶于5mL超纯水中使成1mg/mL，然后将溶液于超声清洗器中超声10分钟，然后将溶液过0.22μm的水膜，得到5mL浓度为1mg/mL的靶向纳米胶束。制得的纳米胶束的TEM图如图12所示。
实施例20：具有协同光热光动力疗法的肿瘤靶向纳米胶束的制备
将5mg实例4制备的两亲性聚HA-PEP-DTX合物溶于2mL超纯水中，搅拌30分钟；将2mg多西他赛和1mg吲哚菁绿溶于2mL DMSO中超声1分钟。然后将DMSO相缓慢滴入水相中，搅拌1分钟，超声5分钟，然后以截留分子量为3500Da的透析袋在超纯水中透析24小时，然后将透析袋内的液体过0.45μm的膜，即得具有协同光热光动力疗法的肿瘤靶向纳米胶束8.1mL。制备的胶束的TEM图如图13所示。
实施例21：具有协同光热光动力疗法的肿瘤靶向纳米胶束的载药量以及包封率的测定
以HPLC测定多西他赛于230nm处的峰面积-浓度的标准曲线，求得线性回归方程为A＝20.814C-4.3855，R2＝1；以酶标仪测定吲哚菁绿于780nm处的吸光度-浓度标准曲线，求得线性回归方程为A＝0.0617C-0.0063，R2＝0.9996。取实施例7制备的胶束溶液500μL置于超滤离心管中，于8000r/min离心10分钟，滤液即为未包封游离药物样品；取100μL胶束溶液分别用乙腈和甲醇稀释100倍，即为总药含量测定样品。再分别以酶标仪和HPLC测定ICG和DTX的游离和总药含量，再代入公式计算包封率、载药量。结果为ICG的包封率为100％、载药量为16.7％；DTX的包封率为95.6％、载药量为16.3％。
实施例22：具有协同光热光动力疗法的肿瘤靶向纳米胶束的体外光热及光动力性能测试
为了评价所制备的胶束的体外PTT效果，采用1W/cm2808nm近红外激光照射不同ICG浓度的胶束，如图14所示，体系的温度的变化随着照射时间的增加而增大，并具有呈剂量依耐性质；从图可以看出，在相同浓度、同一照射时间下，胶束组的温度变化显著大于游离组，说明所制备的胶束相对于游离ICG可以增强光热转换性能，且最终能使体系的温度升高30℃以上。
为了评价制备的胶束的体外PDT性能，采用光漂白法检测胶束的ROS产生能力。选用1，3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为指示剂，DPBF作为一利ROS捕捉剂，其在410nm波长下有特征吸收峰，当DPBF与溶液中的ROS结合后，其在410nm处的吸光度值会降低，因此，可以根据DPBF在410nm处吸光度值的降低程度，间接反应溶液中ROS产生量。分别配置一定ICG浓度的胶束溶液和游离ICG溶液，采用1W/cm2 808nm近红外激光照射2、4、6、8、10min，然后以酶标仪扫描300-900nm的吸收，结果如图8、9、10所示，在相同照射时间内，胶束组的衰减要显著大于游离组，说明胶束组在溶液中的ROS的产生能力要显著强于游离组。这也说明了，将ICG包封在胶束内可以增强ICG的ROS产生能力，进而增强PDT治疗效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的纳米胶束及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Figure BSA0000241670370000151
Figure BSA0000241670370000161

Claims (7)

1.一种基于透明质酸多价修饰的两亲性聚合物及其自聚形成的胶束、非共价包载其他功能分子的胶束、聚合物及其胶束的制备方法及在光热光动力和化疗协同抑制肿瘤生长和转移的应用，其特征在于：将疏水性药物和肿瘤靶向肽通过含二硫键的连接桥连接，然后将药-肽偶联物与透明质酸连接，得到两亲性聚合物，该聚合物在水溶液中自组装形成初级纳米胶束，再以透析法在该胶束的疏水腔中载入游离化疗药物与光敏剂。
2.根据权利要求1所述的基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述的疏水性药物为紫杉醇类药物、喜树碱类药物、鬼臼毒素类等疏水性化疗药；所述的光敏剂为吲哚菁绿(Indocyanine green ICG)、二氢卟吩e6(Ce6)、IR780等常用光敏剂；
优选地，所述的光敏剂为ICG。
3.根据权利要求1-2任一项所述的基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述的肿瘤靶向肽为CIELLQAR、IELLQARC、CRAQLLEI、RAQLLEIC、(D)-CIELLQAR、(D)-IELLQARC、(D)-CRAQLLEI或(D)-RAQLLEIC；
优选地，所述肿瘤靶向肽序列为CIELLQAR。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述的药-肽偶联物通过二硫键、酰胺键或酯键连接，优选为二硫键。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述的透明质酸分子量为2KDa～2000KDa。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于：所制备的肿瘤靶向纳米胶束的粒径为10-1000nm，优选为10-500nm，进一步优选为10-300nm。
7.如权利要求1-6任一项所述的初级纳米胶束、多功能纳米胶束在靶向抗肿瘤药中的应用。
CN202110537563.4A 2021-05-18 2021-05-18 一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备和应用 Pending CN113171342A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110537563.4A CN113171342A (zh) 2021-05-18 2021-05-18 一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110537563.4A CN113171342A (zh) 2021-05-18 2021-05-18 一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113171342A true CN113171342A (zh) 2021-07-27

Family

ID=76929466

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110537563.4A Pending CN113171342A (zh) 2021-05-18 2021-05-18 一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113171342A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113750255A (zh) * 2021-09-30 2021-12-07 大连民族大学 环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其制备方法和应用
CN113797351A (zh) * 2021-09-30 2021-12-17 大连民族大学 一步法合成pH响应型的靶向透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其应用
CN113801129A (zh) * 2021-09-30 2021-12-17 大连民族大学 一种鬼臼毒素脂质衍生物、纳米载体及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用
CN114099701A (zh) * 2021-11-29 2022-03-01 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种自组装复合多肽及其制备方法和药物
CN114870031A (zh) * 2022-05-20 2022-08-09 四川大学 一种cd44靶向的紫杉烷类纳米晶体及其制备方法与应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130142734A1 (en) * 2010-01-12 2013-06-06 Ayelet David Targeted delivery systems for diagnostic applications
CN103751795A (zh) * 2013-05-20 2014-04-30 中国药科大学 透明质酸-抗肿瘤药偶联物及复合纳米粒组合物的制备和应用
CN106177977A (zh) * 2016-07-11 2016-12-07 天津科技大学 一种抗肿瘤药物三元偶联物及合成和应用
CN106727314A (zh) * 2017-01-13 2017-05-31 中国药科大学 一种基于透明质酸的光敏剂／抗肿瘤药物自组装纳米递药系统的制备与表征
CN107903389A (zh) * 2017-12-19 2018-04-13 天津科技大学 E选择素靶向的聚乙二醇两端双修饰抗肿瘤药物的合成及应用
CN108354901A (zh) * 2018-05-21 2018-08-03 中国医学科学院生物医学工程研究所 用于肿瘤化疗与光热联合治疗的pH/还原双重敏感多功能纳米胶束及其应用
CN110124052A (zh) * 2019-06-21 2019-08-16 天津科技大学 聚乙二醇单甲醚偶联e选择素肽配体和抗肿瘤药物的偶联物及应用
CN110314238A (zh) * 2018-03-30 2019-10-11 烟台药物研究所 一种肿瘤靶向的多肽药物偶联物及其制备方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130142734A1 (en) * 2010-01-12 2013-06-06 Ayelet David Targeted delivery systems for diagnostic applications
CN103751795A (zh) * 2013-05-20 2014-04-30 中国药科大学 透明质酸-抗肿瘤药偶联物及复合纳米粒组合物的制备和应用
CN106177977A (zh) * 2016-07-11 2016-12-07 天津科技大学 一种抗肿瘤药物三元偶联物及合成和应用
CN106727314A (zh) * 2017-01-13 2017-05-31 中国药科大学 一种基于透明质酸的光敏剂／抗肿瘤药物自组装纳米递药系统的制备与表征
CN107903389A (zh) * 2017-12-19 2018-04-13 天津科技大学 E选择素靶向的聚乙二醇两端双修饰抗肿瘤药物的合成及应用
CN110314238A (zh) * 2018-03-30 2019-10-11 烟台药物研究所 一种肿瘤靶向的多肽药物偶联物及其制备方法和应用
CN108354901A (zh) * 2018-05-21 2018-08-03 中国医学科学院生物医学工程研究所 用于肿瘤化疗与光热联合治疗的pH/还原双重敏感多功能纳米胶束及其应用
CN110124052A (zh) * 2019-06-21 2019-08-16 天津科技大学 聚乙二醇单甲醚偶联e选择素肽配体和抗肿瘤药物的偶联物及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴柏华等: "透明质酸修饰抗肿瘤药物的研究进展", 《化学世界》 *
张震等: "E-选择素肽配体及其与羟基喜树碱的偶联物合成与抗肿瘤活性评价", 《天津科技大学学报》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113750255A (zh) * 2021-09-30 2021-12-07 大连民族大学 环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其制备方法和应用
CN113797351A (zh) * 2021-09-30 2021-12-17 大连民族大学 一步法合成pH响应型的靶向透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其应用
CN113801129A (zh) * 2021-09-30 2021-12-17 大连民族大学 一种鬼臼毒素脂质衍生物、纳米载体及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用
CN113797351B (zh) * 2021-09-30 2023-10-27 大连民族大学 一步法合成pH响应型的靶向透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其应用
CN113750255B (zh) * 2021-09-30 2023-10-31 大连民族大学 环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其制备方法和应用
CN114099701A (zh) * 2021-11-29 2022-03-01 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种自组装复合多肽及其制备方法和药物
CN114099701B (zh) * 2021-11-29 2023-11-10 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种自组装复合多肽及其制备方法和药物
CN114870031A (zh) * 2022-05-20 2022-08-09 四川大学 一种cd44靶向的紫杉烷类纳米晶体及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113171342A (zh) 一种基于透明质酸的肿瘤靶向纳米胶束及其制备和应用
Hou et al. Copper sulfide nanoparticle-based localized drug delivery system as an effective cancer synergistic treatment and theranostic platform
Dong et al. Facile preparation of metal− organic frameworks-based hydrophobic anticancer drug delivery nanoplatform for targeted and enhanced cancer treatment
CN106727314B (zh) 一种基于透明质酸的光敏剂／抗肿瘤药物自组装纳米递药系统的制备与表征
JP6230443B2 (ja) 近赤外色素結合ヒアルロン酸誘導体およびそれを有する光イメージング用造影剤
CN101791411B (zh) 两亲性多糖偶联物及其药物组合物的制备和应用
Song et al. Dually folate/CD44 receptor-targeted self-assembled hyaluronic acid nanoparticles for dual-drug delivery and combination cancer therapy
CN103705940B (zh) 一种天然活性药物-多糖靶向复合物的制备及其抗肿瘤的应用
CN106995516B (zh) 肿瘤特异性富集的纳米载药体系及其制备方法
CN102060991A (zh) 7-乙基-10-羟基喜树碱的两亲性药物前体及其制备方法
CN106620717B (zh) 一种具有逆转肿瘤多药耐药性功能的两亲性缀合物抗肿瘤纳米药及其制备方法和应用
CN107158410B (zh) 一种具有肿瘤靶向性的叶酸-壳聚糖-Cy7聚合物及其制备方法
CN104758240A (zh) 一种装载紫杉醇的纳米药物复合体及其制备方法
CN106916236B (zh) 一种环糊精-喜树碱类超分子化疗药物及其制备和应用
CN113827567B (zh) 载小分子药聚合物囊泡在制备治疗急性淋系白血病药物中的应用
CN102051016B (zh) 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束及其制备方法和用途
Chen et al. Lactobionic acid-functionalized hollow mesoporous silica nanoparticles for cancer chemotherapy and phototherapy
Li et al. A glutathione-activated carrier-free nanodrug of triptolide as a trackable drug delivery system for monitoring and improving tumor therapy
CN113855813A (zh) 一种基于芬顿反应与aie效应的ros响应海洋岩藻多糖纳米载体制备方法及应用
CN110354276B (zh) 一种前药及其制备方法和应用
CN103083682B (zh) 叶酸修饰的壳聚糖季铵盐-紫杉醇聚合物药物及其制备方法和应用
Jeon et al. pH-Responsive hyaluronic acid-based nanocarrier for treatment of rheumatoid arthritis
CN108451906A (zh) 一种用于抗肿瘤和抗转移治疗的胆固醇－低分子量肝素的纳米制剂及制备方法
CN110179981B (zh) 一种线性-树状给药系统及其制备方法和用途
CN102266566A (zh) 一种磁性复合物及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210727