CN106620701B - 一种G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物的制备方法 - Google Patents

一种G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种G5‑MoS2/Bcl‑2siRNA复合物的制备方法，包括：将LA经过EDC·HCl和NHS活化，得到活化的LA；然后将活化的LA滴加到G5.NH2的溶液中，反应24h，透析，冷冻干燥，得到G5‑LA；将G5‑LA加入到MoS2溶液中，超声振荡，搅拌12h，离心，洗涤，得到G5‑MoS2纳米花；将G5‑MoS2纳米花与Bcl‑2 siRNA孵育20～30min，得到G5‑MoS2/Bcl‑2 siRNA复合物。本发明的方法具有工艺简单，易操作，光热转换效率高，转染条件简单，转染效率高等优点，在光热和基因双重治疗中有良好的应用前景。

Description

一种G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物的制备方法
技术领域
本发明属于光热和基因双重治疗中纳米材料的制备领域，特别涉及一种G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物的制备方法。
背景技术
癌症治疗方法的探索，是一个不断发展又不断遇到挑战的过程。传统的治疗方法比如外科手术，化学治疗和放射治疗存在着很多缺点，这些缺点体现在以下几个方面：第一，肿瘤部位不能完全被切除，可能导致肿瘤的再生和转移；第二，长期的化疗可能导致肿瘤的多重耐药性；第三，对正常的细胞也存在损伤，进而引发恶心，脱发和乏力等副作用。因此，开发一种新型的肿瘤治疗体系显得至关重要。这种体系需要对生物体友好，同时具有高效的肿瘤治疗效率和较低的副作用。近些年，光热治疗作为一种新型的，副作用少的，短期的治疗方法，吸引了很多研究者的关注。光热治疗是利用具有较高光热转换效率的材料，在外部光源(一般是近红外光)的照射下杀死癌细胞的一种治疗方法。在这种情况下，光热治疗剂能吸收光能并将光能转化为热能来产生较高的温度，从而导致癌细胞的死亡。
随着光热治疗方法的兴起，迄今已经发展了四代材料体系：第一种，具有高光热转换效率的贵金属纳米材料，比如金(Au)、银(Ag)、钯(Pd)等，但其价格昂贵限制其广泛运用；第二种，具有较大光热转换面积的碳类材料，包括石墨烯和碳纳米棒等，但是其亲水性和近红外吸收能力较差；第三种，有机染料，比如吲哚菁绿、普鲁士蓝等，虽然拥有较高的光热转换效率但容易被分解；第四种，金属和非金属化合物，例如硫化铜(CuS)和硫化锌(ZnS)，虽在光热治疗上具有较好的应用前景，但是却也存在着对组织和细胞潜在的慢性毒性。二硫化钼(MoS2)作为一种过渡金属二硫化物无机材料，具有独特的结构特点和近红外吸收能力，其良好的生物相容性和强的光热转换效率使其成为一种安全高效的新型光热剂。然而仅仅通过光热治疗并不能够保证将癌细胞完全的杀死，因此考虑通过协同治疗来实现癌症的治疗。
由小干扰RNA(siRNA)介导的基因治疗作为另一种有前景的治疗方法，已成为一种热点研究课题。siRNA通过在细胞内诱导特异性的基因沉默从而杀死癌细胞。然而，siRNA容易被细胞内的酶降解，而且由于其与细胞表面类似的电荷使其不易被细胞内吞。因此，摆在研究者面前的难题依旧是研发一种安全而高效的基因传递载体用于siRNA的传递。在前期的工作中，树状大分子包裹的金纳米颗粒和功能化的树状大分子包裹的金纳米颗粒都被证明是一种安全高效的基因传递载体。因此，将光热治疗和基因治疗结合在一起是一种合理的，并可执行的双重治疗方法。
检索国内外相关文献和专利结果表明：以第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼作为载体，实现光热和基因双重治疗的方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种G5-MoS2(第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼)/Bcl-2 siRNA复合物的制备方法，该方法具有工艺简单，易操作，光热转换效率高，转染条件简单，转染效率高等优点，在肿瘤的光热和基因双重治疗中有良好的应用前景；制备的第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼能实现癌细胞的光热治疗同时负载的Bcl-2 siRNA能诱导特异性癌细胞基因沉默。
本发明制备的G5-MoS2是一种良好的光热剂，较高的光热转换效率能将光能高效的转化为热能，同时它也是一种安全的基因载体，能够负载治疗性的Bcl-2 siRNA诱导特异性的基因沉默。
本发明的一种G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物的制备方法，包括：
(1)将硫辛酸LA经过EDC·HCl和NHS活化，得到活化的LA；然后将活化的LA滴加到第五代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2的溶液中，反应24h，透析，冷冻干燥，得到G5-LA；
(2)将步骤(1)中的G5-LA加入到MoS2溶液中，超声振荡，搅拌12h，离心，洗涤 (经多次水洗离心去除多余的G5-LA)，得到G5-MoS2纳米花；
(3)将步骤(2)中的G5-MoS2纳米花与Bcl-2 siRNA孵育20～30min，得到G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物。
所述步骤(1)中活化时LA、EDC·HCl与NHS的摩尔比为1：15：15；活化时的溶剂为DMSO；LA、EDC·HCl与NHS的质量分别为3.996，51.81mg，33.18mg。
所述步骤(1)中活化的具体过程为：将LA溶解在DMSO中，加入EDC·HCl和NHS 溶液，搅拌反应3h，得到活化的LA。
所述步骤(1)中G5.NH2与LA的摩尔比为1：10；其中，G5.NH2与LA的质量分别为 50mg和3.996mg。
所述步骤(1)中G5.NH2的溶液的溶剂为DMSO。
所述步骤(1)中透析的条件为：为用去离子水透析3d，每天3次，每次4L去离子水，其中；透析袋截留分子量为14000。
所述步骤(2)中G5-LA与MoS2的质量比为5：1；其中，G5-LA与MoS2的质量分别为54.00mg和10.80mg。
所述步骤(2)中MoS2的制备方法为：将(NH4)2MoS4溶解在去离子水中，加入(N2H4)·H2O，超声振荡(30min)，得到混合液，将得到的混合液倒进聚四氟乙烯内胆的反应釜中，然后在 200℃反应10h，冷却，得到黑色的溶液，离心清洗(用水洗和离心的方式对MoS2进行纯化，反复进行10次后)，得到MoS2(将纯化的MoS2溶解在去离子水中，在4℃保存备用)。
所述(NH4)2MoS4和(N2H4)·H2O的质量比为4.5：1；其中，(NH4)2MoS4和(N2H4)·H2O的质量分别为100mg和22.27mg。
所述步骤(2)中超声振荡的时间为30min。
所述步骤(2)中离心的转速为：10000rpm。
所述步骤(3)中Bcl-2 siRNA的规格为10OD。
所述步骤(3)中G5.NH2与Bcl-2 siRNA的N/P比为2.5：1～15：1；所述的N/P比为G5.NH2上的伯氨基与siRNA骨架上磷酸基团摩尔比。
所述步骤(3)中孵育的方法为：将G5-MoS2用无菌PBS稀释，然后用DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液稀释Bcl-2 siRNA，再将二者混合均匀后于37℃孵育30min，即可。
所述步骤(3)中G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物应用于光热和基因双重治疗中制剂的制备。
本发明中将表面拥有丰富氨基基团的第五代聚酰胺胺树状大分子修饰与含羧基的LA相连，合成了G5-LA聚合前体，随后通过巯基化学的方法将G5修饰到MoS2的表面，可以提高MoS2的表面电势，降低其水动力学直径，从而提高材料的生物相容性。而MoS2又可以为G5提供较强的光热转换效率，赋予其优秀的光热治疗效果。
本发明中将合成的G5-MoS2纳米花与Bcl-2 siRNA通过静电相互作用结合，能够安全有效的将siRNA传递到癌细胞中，实现对对基因的特异性沉默。
本发明合成的G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物，因同时具有光热转换性能和基因沉默能力，可以最终实现肿瘤的光热和基因双重治疗。
本发明采用水热法制备了MoS2，再合成G5-LA聚合前体，通过巯基化学反应制备了第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼(G5-MoS2)，将其与治疗性的Bcl-2 siRNA共同孵育。
本发明通过简单的化学反应制备一种类似纳米花结构的第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼。首先，将通过EDC·HCl和NHS活化的硫辛酸(LA)连接到树状大分子表面，获得G5-LA中间体，然后将G5-LA通过二硫键连接到MoS2表面。最后，将得到的G5-MoS2纳米花通过静电相互作用与Bcl-2 siRNA相结合，形成了G5-MoS2/siRNA复合物；形成的复合物具有良好的生物相容性和高的光热转换效率，同时诱导特异性基因沉默。
本发明以G5-MoS2纳米花为光热剂和基因载体，负载Bcl-2 siRNA，以4T1(小鼠乳腺癌细胞)细胞作为治疗细胞，实现对肿瘤的光热治疗和基因沉默。本发明通过核磁共振(1H NMR)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势及动态光散射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)和电场发射扫描电子显微镜(FESEM)等方法表征制备的G5-MoS2纳米花；并评价了该纳米材料作为光热治疗试剂在近红外激光照射下的升温效果；采用凝胶阻滞实验确定合适的N/P比；利用CCK-8 法来评价纳米材料的细胞毒性；利用流式细胞仪、共聚焦显微镜来评价该纳米材料的基因转染效率和胞内定位情况；最后采用Western Blot来评价Bcl-2 siRNA介导的基因沉默效果。
有益效果
(1)本发明的方法工艺简单，易操作，易于合成纯化，对环境和生物友好；
(2)本发明制备的第五代聚酰胺胺树状大分子修饰的二硫化钼(G5-MoS2)具有良好的分散性和生物相容性，在光热和基因双重治疗中具有潜在的应用价值；制备的得到的G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物具有较高的光热转换效率和基因转染效率，实现了对癌细胞和肿瘤的光热和基因双重治疗。
附图说明
图1为实施例2中G5-LA的核磁共振氢谱图；
图2为实施例2中MoS2和G5-MoS2的紫外吸收光谱图；
图3为实施例2中MoS2(a)和G5-MoS2(b)的高分辨透射电镜图；
图4为实施例2中MoS2(a)和G5-MoS2(b)的扫描电子显微镜图；
图5为实施例2中MoS2和G5-MoS2的热重分析图；
图6为实施例3中MoS2和G5-MoS2的水动力学粒径(a)和表面电势(b)图；
图7为实施例4中G5-MoS2在不同Mo浓度下经过近红外激光照射后的升温曲线图：(a)不同Mo浓度(0.1，0.5，1.0，1.5和2.0mg/mL)的G5-MoS2溶液，经808nm NIR(1.2W/cm2,5min)激光照射后的升温曲线；(b)不同Mo浓度的G5-MoS2溶液随水温变化情况；(c)同一Mo浓度(0.5mg/mL)下，G5-MoS2溶液，经激光“开关”循环照射5次的温度监控曲线；图8为实施例5中G5-MoS2的凝胶阻滞实验电泳图谱；其中，1～8分别对应N/P比为0，0.5， 1，2，3，4，5，6；
图9为实施例6中G5-MoS2/Bcl-2 siRNA的水动力学粒径(a)和表面电势(b)图；
图10为实施例7中通过CCK-8法测试在4T1细胞中经过PBS缓冲液(对照)和不同浓度的 G5-MoS2([Mo]＝0～500ug/mL)处理24h(24h仅为细胞和材料培养的时间)后的细胞存活率；
图11为实施例8中通过CCK-8法测试在4T1细胞中经过PBS缓冲液(对照)和不同浓度的 G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物([Mo]＝0～500ug/mL,1ug siRNA)处理24h(24h仅为细胞和材料培养的时间)后的细胞存活率；
图12为实施例9中通过CCK8法测试在4T1细胞中经过PBS缓冲液(对照)和不同浓度的 G5-MoS2([Mo]＝0～500ug/mL)处理24h(24h仅为细胞和材料培养的时间)后，经近红外激光照射5min前后的细胞存活率；
图13为实施例10中通过CCK8法测试在4T1细胞中经过PBS缓冲液，单独的Bcl-2siRNA， G5-MoS2，G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物处理48h(48h仅为细胞和材料培养的时间)后，经近红外激光照射5min前后的的细胞存活率；
图14为实施例11中G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物([Mo]＝0～500ug/mL,1ugsiRNA)在体外的血液相容性；
图15为实施例12中G5-MoS2/Cy3-Bcl-2 siRNA复合物在不同N/P下对4T1细胞的基因转染图；
图16为实施例13中G5-MoS2/Cy3-Bcl-2 siRNA复合物在不同N/P下对4T1细胞的激光共聚焦显微镜图；
图17为实施例14中G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物，在N/P＝10时，蛋白印记分析图；
图18为本发明中涉及的G5-MoS2的制备示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)称取100mg(NH4)2MoS4粉末，溶于20mL去离子水中，磁力搅拌20min，随后超声振荡10min直至粉末完全的溶解在水中。边搅拌边加入0.454mL的(N2H4)·H2O，超声振荡30min。将得到的混合液倒进一个50mL的聚四氟乙烯内胆的反应釜中，然后加热到200℃反应10h，取出反应釜自然冷却到室温，得到黑色的溶液。将上述黑色溶液在10000rpm离心5min收集产物，即为得到的MoS2。用水洗和离心的方式对MoS2进行纯化，反复进行10 次后，将纯化的MoS2溶解在10mL去离子水中，在4℃保存备用。
(2)将3.996mg LA溶解在5mL DMSO中，随后称取51.81mg EDC·HCl和33.18mgNHS，溶解到2mL DMSO溶液中，搅拌反应3h，得到活化的LA。随后称取50mg G5.NH2，溶解到3mL DMSO溶液中，将活化的LA逐滴的加入到上述含G5.NH2的DMSO溶液中，继续反应24h。将得到的产物转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天(4L×3)，然后进行冷冻干燥处理，最后得到干燥的G5-LA。
(3)将步骤(2)中得到的G5-LA溶解到步骤(1)制备的10mL MoS2溶液中，超声振荡30min，磁力搅拌12h。将上述溶液通过10000rpm离心收集得到G5-MoS2纳米花，经多次水洗离心去除多余的G5-LA，得到纯化的G5-MoS2纳米花，将其分散在10mL PBS中，在 4℃保存备用。
(4)将步骤(3)得到的G5-MoS2纳米花与1ug Bcl-2 siRNA(上海吉玛公司合成)按照不同的N/P比(2.5，5，10，15)孵育20～30min，得到G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物。
实施例2
对实施例1步骤(2)制备的G5-LA进行核磁表征，1HNMR表征结果如图1所示，在化学位移1.5～2.5ppm处有质子峰，它是LA分子结构中的特征基团质子峰，根据其和G5.NH2之间的积分面积比，可以计算得出每个G5.NH2上连接了11.4个LA分子。UV-vis结果如图 2所示，可以看出修饰G5.NH2前后，紫外吸收峰的吸收特性并没有发生明显的改变，说明了 G5.NH2的修饰并未改变MoS2的光吸收特性。TEM结果如图3所示，制备的MoS2(3a)呈现层面结构，而修饰了G5.NH2之后(3b)，G5-MoS2形成了一个聚合物，形状接近球形，形成的纳米花的粒径大约在100～200nm左右。FESEM结果如图4所示，也显示了G5-MoS2具有明显的纳米花结构，粒径也大约在150nm左右，这与TEM结构也是相符的。TGA结果如图5所示，从温度上升过程中的质量损失可以计算出，G5-LA在G5-MoS2体系中占的比例大约在8.5％。
实施例3
将实施例1的步骤(1)和步骤(3)的方法制备的MoS2和G5-MoS2用PBS进行稀释，得到浓度为0.1mg/mL的溶液，取1mL通过马尔文激光粒度仪(Malvern,ΜK，633nm激光) 进行水动力学直径(6a)和表面电势(6b)表征。结果如图6所示，未经修饰的MoS2具有较大的水动力学直径和负的表面电势，并不适合进行基因转染。而G5-MoS2的粒径明显减小，说明G5.NH2的修饰提高了材料的分散性。同时，G5-MoS2表面所携带的电荷也由负转正，更容易被细胞吞噬。
实施例4
将实施例1步骤(3)中制备的G5-MoS2用超纯水配置0.2mL Mo浓度分别为0.1，0.5，1.0，1.5和2.0mg/mL溶液用于检测制备的G5-MoS2在近红外激光照射下的升温效果，其中纯水作为对照。将上述配置的材料用808nm(1.2W/cm2，5min)激光进行照射，每隔5s 记录下G5-MoS2中温度的变化。结果如图7所示。结果表明，G5-MoS2溶液的温度随着浓度的增加而显著增加。在前120s的时候，温度变化趋势非常明显，随后趋于缓和。对于对照组， 5min的温度变化只有5.2℃，而在最高浓度为2.0mg/mL的G5-MoS2溶液中，温度从22.5 ℃升到了74℃，这体现了材料优秀的光热转换性能。
实施例5
将实施例1步骤(4)中制备的G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物进行凝胶阻滞实验。配制8 孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。siRNA 量为1μg/孔，按照不同N/P比0，0.5，1，2，3，4,5，6分别配制G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物，孵育30min，并以裸siRNA为对照。然后将对应的G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80V，时间30min。使用凝胶成像仪对siRNA在凝胶中的迁移进行分析。结果如图8所示。结果表明，在N/P比大于等于2的时候，G5-MoS2能够完全的将siRNA压缩，阻滞siRNA电迁移。
实施例6
将实施例1步骤(3)中制备的G5-MoS2在不同的N/P比条件下(2.5:1，5:1，10:1，和15:1)分别与5μg Bcl-2 siRNA通过静电作用形成G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物，使终体积固定在100μL，室温下孵育30min，然后加入900μL PBS。对其水动力学粒径和表面电势进行了表征，结果如图9所示。结果表明，随着在不同的N/P比条件下，复合物的水动力学粒径都大致在250～300nm左右；而复合物的表面电势都在20～30mV之间。这些说明材料有利于细胞的吸附和内吞，也就有利于载体对目的基因的传递。
实施例7
以4T1细胞作为模型细胞来检验G5-MoS2(实施例1中制备)在不同条件下的细胞毒性，以8×103/孔的密度将种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％ FBS的100μL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后将培养基换成10μL浓度分别为0,25,50,100,200,和500μg/mL G5-MoS2，随后加入90μL培养基，与细胞共培养24h。将培养液倒掉，加入含10μL CCK-8的100μL DMEM培养基溶液，继续培养4 h。用多功能酶标仪测试吸光值，测试波长450nm，结果如图10所示。结果表明，随着材料浓度的增加，细胞存活率下降，但是即使在浓度高达500μg/mL的情况下，细胞的存活率依然有80％以上，说明了材料良好的生物相容性。
实施例8
以4T1细胞作为模型细胞来检验G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物(实施例1中制备)在不同条件下的细胞毒性，以8×103/孔的密度将种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后将培养基换成10μL浓度分别为0,25,50,100,200,和500μg/mL G5-MoS2/Bcl-2 siRNA 复合物，随后加入90μL培养基，与细胞共培养24h。将培养液倒掉，加入含10μL CCK-8 的100μLDMEM培养基溶液，继续培养4h。结果如图11所示。结果表明，细胞毒性随着材料浓度的增加而增加，与图10相比，材料与Bcl-2 siRNA的复合后的毒性在一定程度上还有所降低，在高浓度的情况下([Mo]＝500μg/mL)，细胞存活率依旧在80％以上，验证了复合物良好的生物相容性。
实施例9
以4T1细胞作为模型细胞来检验G5-MoS2(实施例1中制备)在不同条件下的细胞毒性，以8×103/孔的密度将种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后将培养基换成10μL浓度分别为0,25,50,100,200,and 500μg/mL G5-MoS2，随后加入90μL培养基，与细胞共培养24h。将培养液倒掉，加入含10μL CCK-8的100μL DMEM培养基溶液，继续培养4h。随后将细胞分为两组，一组对其进行808nm(1.2W/cm2，5min)激光照射处理，另一组不做任何处理的细胞作为对照。结果如图12所示。结果表明，未经激光照射细胞的存活率明显的高于经激光照射的细胞，在浓度为500μg/mL的情况下，经激光照射的细胞存活率甚至只有34.5％，而未经激光照射的细胞存活率却达80％以上，这说明G5-MoS2纳米花具有良好的体外光热治疗效果，在一定程度上能很好的抑制肿瘤细胞的生长。
实施例10
以4T1细胞作为模型细胞来检验G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物(实施例1中制备)在不同条件下的细胞毒性，以8×103/孔的密度将种于96孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的100μL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后将细胞分成四组，分别加入10μL PBS,单独的Bcl-2 siRNA,G5-MoS2和G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物(1ug siRNA,N/P比为15)和90μL培养基，与细胞共培养24h。随后将再细胞分为两组，一组对其进行808nm(1.2W/cm2，5min)激光照射处理，另一组不做任何处理的细胞作为对照，继续培养24h。将培养液倒掉，加入含10μL CCK-8的100μL DMEM培养基溶液，继续培养4h。结果如图13所示。结果表明，对于PBS组和单独的Bcl-2 siRNA 组，激光照射对其几乎没有影响，而对于G5-MoS2组，激光照射后的细胞存活率从81.0％降到了45.8％，对于G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物组，激光照射后的细胞存活率从68.7％降到了21.02％。这证明了G5-MoS2纳米花良好的体外光热治疗效果，同时siRNA也具有一定的基因沉默效果，结合了光热处理和基因治疗的组合具有更强的癌细胞杀伤力。
实施例11
为了检测材料的体外溶血率，用含有肝素钠的采血管收集2mL小鼠新鲜血液，在4℃下以3000rpm离心10min以收集红细胞。弃上清，再用PBS反复清洗离心红细胞3～5次，再将收集到的红细胞溶解到5～10倍的PBS中储存备用。随后取200μL上述稀释过的红细胞，加入0.8mL Mo浓度分别为0～500μg/mL的G5-MoS2，混合均匀后于37℃放置3h，再取出10000rpm离心3分钟，拍照并对样品上清液的紫外吸收值进行检测，结果见图14。结果显示，G5-MoS2具有良好的血液相容性，即使在高浓度条件下(500μg/mL)，溶血率依然在4％以下。光学图片也同样证明，在给定的浓度范围内，红细胞都未见明显溶血现象。
实施例12
以带有cy3标记的Bcl-2 siRNA并以4T1细胞为模型细胞来研究G5-MoS2负载cy3标记的Bcl-2 siRNA后的基因转染效率。以1×105/孔的密度将4T1种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后按照N/P比为2.5:1，5:1，10:1和15:1，制备G5-MoS2/Bcl-2 siRNA 复合物(实施例1中制备)，其中每个孔的Bcl-2 siRNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS 的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。采用流式细胞仪对结果进行观察，结果见图15结果显示，对照组和单独的Bcl-2 siRNA组都未见明显荧光，对于材料组，胞内的荧光强度随着N/P比的增加而增强，在N/P比为10的时候，荧光强度最强，后随着N/P 增加到15，荧光强度反而有所降低，这可能是由于随着N/P比增加到一定程度，材料的毒性也随之增加，从而降低了基因的转染效率。
实施例13
以带有cy3标记的Bcl-2 siRNA并以4T1细胞为模型细胞来研究G5-MoS2负载cy3标记的Bcl-2 siRNA后的基因转染效率。以1×105/孔的密度将4T1种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后按照N/P比为2.5:1，5:1，10:1和15:1，制备G5-MoS2/Bcl-2 siRNA 复合物(实施例1中制备)，其中每个孔的Bcl-2 siRNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS 的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。采用共聚焦显微镜对结果进行观察，结果见图16。结果显示，对照组和单独的Bcl-2 siRNA组都未见明显红色荧光，对于材料组，胞内的荧光强度随着N/P比的增加而增强，在N/P比为10和15的时候，红色荧光强度明显强于N/P比为2.5和5的时候。而且部分荧光强度在细胞核内也得到检测，说明G5-MoS2成功将基因传递到了细胞质和细胞核中，从而实现后续的基因沉默，这与流式结果保持一致。
实施例14
以4T1细胞为模型细胞来检测G5-MoS2负载Bcl-2 siRNA后的基因沉默效率。以1×105/ 孔的密度将4T1种于12孔板中，培养于添加100U/mL青霉素，100U/mL链霉素和10％FBS的1mL DMEM培养液中，37℃，5％二氧化碳浓度下培养24h。随后按照N/P比为10:1，制备G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物(同实施例1中的制备方法)，其中每个孔的Bcl-2 siRNA的量为1μg。将培养基换成不含FBS的DMEM培养基，再加入上述复合物与细胞共培养4h。然后再更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基，继续培养48h，用细胞裂解液裂解细胞，释放出胞内蛋白。通过western blot来检测细胞内Bcl-2蛋白的表达水平，结果见图17。结果显示，未转染的细胞组和单独siRNA细胞组的细胞都有较高的Bcl-2蛋白的表达，而 G5-MoS2/Bcl-2 siRNA复合物组中的Bcl-2蛋白的表达量明显的降低，只有52.74％，与对照组相比具有显著性的差异，说明而G5-MoS2是一种优秀的基因载体，能够有效的负载Bcl-2 siRNA诱导4T1细胞特异性的基因沉默。

Claims (9)

1.一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，包括：
(1)将硫辛酸LA经过EDC·HCl和NHS活化，得到活化的LA；然后将活化的LA滴加到第五代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2的溶液中，反应24h，透析，冷冻干燥，得到G5-LA，其中G5.NH2与LA的摩尔比为1：10；
(2)将步骤(1)中的G5-LA加入到MoS2溶液中，超声振荡，搅拌12h，离心，洗涤，得到G5-MoS2纳米花；
(3)将步骤(2)中的G5-MoS2纳米花与Bcl-2siRNA孵育30min，得到G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物。
2.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中活化时LA、EDC·HCl与NHS的摩尔比为1：15：15；活化时的溶剂为DMSO。
3.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中G5-LA与MoS2的质量比为5：1。
4.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中MoS2的制备方法为：将(NH4)2MoS4溶解在去离子水中，加入(N2H4)·H2O，超声振荡，得到混合液，然后在200℃的条件下反应10h，冷却，离心清洗，得到MoS2。
5.根据权利要求4所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述(NH4)2MoS4和(N2H4)·H2O的质量比为4.5：1。
6.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中Bcl-2siRNA的规格为10OD。
7.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中G5.NH2与Bcl-2siRNA的N/P比为2.5：1～15：1。
8.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中孵育的方法为：将G5-MoS2用无菌PBS稀释，然后用DEPC水溶液稀释Bcl-2siRNA，再将二者混合均匀后于37℃孵育30min，即可。
9.根据权利要求1所述的一种G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中G5-MoS2/Bcl-2siRNA复合物应用于光热和基因双重治疗中制剂的制备。
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