CN114306598B - 一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法，借助酰氯介导的氨基羧基缩合反应，将万古霉素共价修饰到碳纳米点表面，形成万古霉素修饰的碳纳米点。本发明制备合成万古霉素修饰碳纳米点的合成步骤简单，反应产率高；获得的万古霉素修饰碳纳米点具有良好的靶向和pH敏感性，能够对细菌生物膜的酸性环境具有良好的聚集响应效应，从而提高近红外光区的吸收，优化光热转换性能，表现出显著增强的光热杀灭效果，能够用于革兰氏阳性耐药菌及其生物膜的光热治疗。
Description
技术领域
本发明属于纳米技术领域，尤其涉及一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法。
背景技术
细菌感染是导致人类死亡的主要原因之一，抗生素是目前治疗细菌感染的主要药物。然而，抗生素的过度使用导致多种细菌种出现耐药性，特别是革兰氏阳性耐药菌，如耐万古霉素肠球菌(Vancomycin resistant Enterococci,VRE)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，引起的感染疾病变得难以治疗；此外，耐药菌生物膜的出现也是感染难以治愈的另一大原因。耐药菌生物膜是为应对恶劣生存环境而在细菌表面生成的大量多糖分子，作为一种天然保护屏障，可以有效增强细菌对抗体和机体的免疫防御，同时也可有效阻止抗生素药物的杀灭作用。生物膜的包裹使得细菌内部环境急剧缺氧，释放出大量酸性物质，从而导致其所处环境的pH迅速降低，甚至低至5.5左右。
光热疗法是通过红光或近红外激光照射光热转换材料后，将光能转换成热能使局部温度升高，进而杀灭耐药菌的方法。与传统的抗生素疗法相比，光热疗法具有以下优点：第一，光热疗法的抑菌机理与抗生素有着显著的不同，属于物理抑菌方法。研究表明，光热后局部温度达到55℃，细菌会因体内蛋白质的变性而快速死亡。第二，没有特异性的靶向目标，不容易产生耐药性。第三，光热治疗中使用的近红外光波长在700nm到1400nm之间，既能够有效穿透哺乳动物的皮肤进入组织内部，又对健康组织的伤害极小。因此，光热治疗被认为是一种安全、高效且不引起新的耐药性的治疗方法。光热疗法在治疗耐药菌感染领域取得了一些重要进展，然而针对细菌生物膜的杀灭效果仍然有待进一步提高。因此，研发新的能够有效杀灭细菌生物膜的光热治疗策略对预防和控制革兰氏阳性耐药菌的感染和传播具有重要意义。
碳纳米点(Carbon nanodots,CNDs)，又叫碳量子点，是一种新型的零维碳基纳米材料，具有小体积、低成本、易溶于水、低毒性、生物降解高和免疫原性低等优点，在生物体系的荧光标识和诊断检测方面应用广泛。虽然CNDs具有良好的生物相容性，但是在近红外区的光吸收能力较弱，光热转换性能不佳，限制了其在光声成像和光热治疗领域的应用。因此，如何设计优化CNDs在近红外区的吸收性能，提高光热转换性能，是实现CNDs用于耐药菌光热治疗研究亟待解决的核心科学问题。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供了一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法，本发明的技术方案如下：
一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将柠檬酸加热，最终获得棕色粉末-碳纳米点(CNDs)；
步骤2：将步骤1获得的碳纳米点颗粒透析，得纯化的碳纳米点；
步骤3：将步骤2纯化的碳纳米点和氯化亚砜加热反应，获得酰氯修饰的碳纳米点；
步骤4：将万古霉素(Van)和三乙胺(TEA)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，搅拌得反应体系；
步骤5：将步骤3得到的酰氯修饰的碳纳米点在N，N-二甲基甲酰胺中溶解，再缓慢滴加到步骤4得到的反应体系中进行反应，得反应溶液；
步骤6：将步骤5得到的反应溶液，用洗涤溶液反复离心洗涤，真空干燥后得黑色粉末-万古霉素修饰碳纳米点(CNDs@Van)。
本发明采用上述技术特征具有如下技术效果：
本发明构建的一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点，借助酰氯介导的氨基羧基缩合反应，将万古霉素共价修饰到碳纳米点表面，形成万古霉素修饰碳纳米点。第一，碳纳米点表面修饰的万古霉素分子可作为靶向分子，将碳纳米点高效结合于革兰氏阳性耐药菌表面。第二，在形成万古霉素修饰碳纳米点时，万古霉素分子通过与碳点表面羧基进行共价修饰反应，减少了碳纳米点表面的羧基的含量。碳纳米点表面的羧基的含量减少，可使万古霉素修饰的碳纳米点在耐药菌生物膜产生的酸性环境中有效聚集。因此，万古霉素修饰的碳纳米点能够对细菌生物膜的酸性环境(pH5.5左右)具有良好的聚集响应效应，从而提高近红外光区的吸收，优化光热转换性能，表现出显著增强的光热杀灭效果，实现碳纳米点用于耐药菌光热治疗。
本技术方案还可以做如下改进：
进一步地，步骤1中所述加热的温度为180-240℃，所述加热的加热时间为2-3小时。
进一步地，步骤2中所述透析采用截留分子量为3500的透析袋；所述透析采用的透析液为双蒸水；所述透析的时间为12-24小时。
进一步地，步骤3中所述碳纳米点颗粒与氯化亚砜的质量比为1：(60-200)。
进一步地，步骤3中所述加热的温度为70-80℃；
进一步地，步骤4中所述Van和TEA的摩尔数比为1:(1-3)；所述Van的摩尔浓度为22-36mmol/L。
进一步地，步骤4中所述溶解的温度为20-40℃所述搅拌的时间为30min。
进一步地，步骤5中反应温度为20-40℃，反应时间为24-36小时。
进一步地，步骤6中洗涤试剂为无水乙醚和无水乙醇。
采用以上进一步技术特征具有如下技术效果：
通过以上技术方案的改进，进一步提高CNDs@Van的制备的效果，优化CNDs@Van的颗粒大小，提高CNDs@Van的产率及纯度。所得CNDs@Van的颗粒大小为3-5nm；CNDs@Van的产率为90-97.9％；CNDs@Van的光热转换效率达到23％-36％。
进一步地，上述CNDs@Van应用在革兰氏阳性耐药菌及其生物膜的光热抑菌治疗领域。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法，采用酰氯介导的氨基羧基缩合反应，合成CNDs@Van，合成步骤简单，反应产率高；获得的CNDs@Van具有良好的靶向和pH敏感性，能够对细菌生物膜的酸性环境具有良好的聚集响应效应，从而提高近红外光区的吸收，优化光热转换性能，表现出显著增强的光热杀灭效果，能够用于革兰氏阳性耐药菌等耐药菌及其生物膜的光热治疗。
附图说明
图1为本发明具体实施例合成的CNDs@Van的透射电镜图(TEM)；
图2为本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van的紫外可见分光光谱图；
图3为本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van以及Van的表征傅里叶红外图谱(FTIR)；
图4本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van的能谱成分分析图(EDS)；
图5为本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van在pH5.5和pH7.0时的粒径分布图(DLS)；
图6本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van在pH5.5和pH7.0时的Zeta电位分布图；
图7本发明具体实施例合成的CNDs@Van在pH5.5和pH7.0时的透射电镜图(TEM)；
(a)在pH7.0条件下的CNDs@Van的TEM图。
(b)在pH5.5条件下的CNDs@Van的TEM图。
图8本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van在pH5.5和pH7.0时的荧光光谱图；
图9为本发明具体实施例合成的CNDs@Van在不同pH环境下的紫外可见分光光谱图；
图10为本发明具体实施例合成的CNDs@Van的体外光热转换性能测试结果图；
图中标记说明：
(a)CNDs@Van分别在不同pH条件下光照，其溶液温度随光照时间的变化曲线图，光照条件为2.0W/cm2的808nm激光照射300s；
(b)CNDs@Van在pH5.5条件下，经不同光照强度照射后，其溶液温度随光照时间的变化曲线图；光照激光为808nm，照射时长为300s；
(c)CNDs@Van分别在pH5.5和pH7.0条件下的光热成像照片，光照条件为0.8W/cm2的808nm激光照射5min；
(d)pH5.5条件下CNDs@Van的光照开-关温度变化曲线图，光照条件为1.0W/cm2的808nm激光照射300s；
图11为经本发明实例1合成的CNDs和CNDs@Van光热处理后的VRE生物膜的荧光染色图；
图中标记说明：
(a)为VRE生物膜经PBS和非光照处理的荧光染色图；
(b)为VRE生物膜经CNDs和非光照处理的荧光染色图；
(c)为VRE生物膜经CNDs@Van和非光照处理的荧光染色图；
(d)为VRE生物膜经PBS和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理的荧光染色图；
(e)为VRE生物膜经CNDs和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理的荧光染色图；
(f)为VRE生物膜经CNDs@Van和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理的荧光染色图；
图12是经本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van光热处理后的VRE生物膜的标准平板菌落计数结果；
图中标记说明：
(a)-(c)分别为PBS、CNDs、CNDs@Van经非光照处理后的VRE生物膜的标准平板菌落照片；
(d)-(f)分别为PBS、CNDs、CNDs@Van经NIR光照处理(808nm，0.8W/cm2，10min)后的VRE生物膜的标准平板菌落照片；
图13是经本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van分别在非光照和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的VRE细菌存活率；
图14是经本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van分别在非光照和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的VRE细菌生长曲线图；
图15是经本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van光热处理后的MRSA生物膜的标准平板菌落计数结果；
图中标记说明：
(a)-(c)分别为PBS、CNDs、CNDs@Van经非光照处理后的MRSA生物膜的标准平板菌落照片；
(d)-(f)分别为PBS、CNDs、CNDs@Van经NIR光照处理(808nm，0.8W/cm2，10min)后的MRSA生物膜的标准平板菌落照片；
图16是经本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van分别在非光照和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的MRSA细菌存活率；
图17是经本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van分别在非光照和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的MRSA细菌生长曲线图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
具体实施例：
一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将10g无水柠檬酸放置于100mL圆底烧瓶中180℃加热2小时。当开始加热到30min时，无水柠檬酸颗粒逐渐由固体变为液体，颜色由无色变为淡黄色，然后变为橙色；继续加热到2小时，终止反应，圆底烧瓶底部最终获得棕色粉末即为合成好的碳纳米点(CNDs)；
步骤2：将步骤1获得的碳纳米点颗粒在截留分子量3500的透析袋中进行12小时透析处理，得到纯化的CNDs；
步骤3：将20mg步骤2纯化的碳纳米点和4mL氯化亚砜在80℃拌冷凝回流48小时进行反应，然后旋蒸去除未反应的氯化亚砜，获得酰氯修饰的碳纳米点；
步骤4：将100mg万古霉素(Van)和30μL的三乙胺(TEA)在3.5mL的无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，在20℃-40℃搅拌30min得反应体系；
步骤5：将步骤3得到的酰氯修饰的碳纳米点在300μL无水N，N-二甲基甲酰胺中溶解，再缓慢滴加到步骤4得到的反应体系中进行反应，在20℃-40℃，搅拌24小时，得反应溶液；
步骤6：将步骤5得到的反应溶液，用无水乙醚8000rpm，10min，4℃洗涤反应体系3次，再用无水乙醇同样条件下洗涤3次，洗涤后的产品放在真空干燥箱中真空干燥，得黑色粉末-万古霉素修饰碳纳米点(CNDs@Van)。
由图1本发明具体实施例合成的CNDs@Van的透射电镜图(TEM)，可以看出，所得CNDs@Van的颗粒大小为3-5nm。
由图2本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van的紫外可见分光光谱图，可以看出，修饰后的CNDs@Van的紫外可见吸收峰与CNDs类似，它们的吸收峰主要位于200nm-400nm，红外吸收性能却非常低。CNDs@Van在280nm处出现明显的吸收峰，该峰与Van在280nm处的特征峰相一致，说明Van成功修饰到碳点表面。
由图3本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van以及Van的表征傅里叶红外图谱(FTIR)，可以看出，游离的CNDs经过化学修饰后，CNDs@Van在900–1200cm-1处出现了C-O的红外吸收峰，在1480cm-1处出现了C-H的红外吸收峰，这些吸收峰与万古霉素的特性吸收峰一致，表明Van修饰到CNDs表面。
由图4本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van的能谱成分分析图(EDS)，可以看出，与CNDs相比，CNDs@Van具有显著的N元素峰，说明基于含有氮元素的万古霉素成功修饰到CNDs表面。
由图5本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van在pH5.5和pH7.0时的粒径分布图(DLS)，可以看出，CNDs在pH5.5和pH7.0时，粒径均较小且范围窄，说明CNDs的粒径大小和范围不会随着pH的变化而发生变化。但是，CNDs@Van在pH7.0时，粒径小且范围窄，而在pH5.5时粒径大小和范围均明显增大。CNDs@Van的粒径范围宽度的变化说明，当环境从pH7.0变成pH5.5时，表面COO-变成COOH，分子间静电斥力消失，CNDs@Van颗粒出现聚集，导致大的颗粒出现。
由图6本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van在pH5.5和pH7.0时的Zeta电位分布图，可以看出，游离的CNDs的外部环境从pH7.0变成pH5.5时，电位由-30mV变为-11mV，而CNDs@Van的外部环境从pH7.0变成pH5.5时，碳点颗粒表面的负电荷(电位为-25mV)消失，而出现少量的正电荷(电位为+5mV)。CNDs@Van的电位变化说明，当环境的pH从7.0变成5.5时，CNDs@Van表面的羧基会从COO-变为COOH，导致碳点表面的负电荷消失而处于接近等电点的状态，使得碳点自组装呈现出聚集状态。
由图7本发明具体实施例合成的CNDs@Van在pH5.5和pH7.0时的透射电镜图可知，当pH为7.0时，CND@Van呈分散状态，颗粒大小约为3nm-5nm；而pH为5.5时，CNDs@Van形成明显的聚集效应。(图片背景中的褶皱由样品所在缓冲液的盐离子造成。)
由图8本发明具体实施例合成的CNDs和CNDs@Van在pH5.5和pH7.0时的荧光光谱图，可以看出，CNDs在pH7.0和pH5.5环境时均有显著的荧光信号。而CNDs@Van在pH5.5时的荧光信号要显著低于其在pH7.0，即pH的降低会导致CNDs@Van出现明显的荧光猝灭现象，进一步证明了pH低至5.5时的CNDs@Van的聚集效应。
由图9为本发明具体实施例合成的CNDs@Van在不同pH环境下的紫外可见分光光谱，可以看出，CNDs@Van在pH6.0和pH7.0时，近红外区的吸光值较低，而在pH4.5、pH5.0、pH5.5的近红外区吸光值明显增加，由此可见，pH低至5.5时，CNDs@Van在近红外区的吸光值会显著增加。
本发明进行如下测试：
1、基于pH敏感的万古霉素修饰的碳纳米点的体外光热转换性能测试
取实施例中制得的500μL 0.5mg/mL CNDs@Van于比色皿中，使用808nm激光在不同强度下照射不同时间，记录随照射时间增加，溶液温度的变化。同时对该样品进行反复多次的光热转换性能测试。
图10为本发明具体实施例合成的CNDs@Van的体外光热转换性能测试结果图，由图10(a)在pH5.5和pH7.0条件下，CNDs@Van进行光照(808nm，2.0W/cm2)，溶液温度随时间变化的曲线图，可以看出，与H2O组和pH7.0组相比，pH5.5条件下CNDs@Van溶液的温度随着光照时间的延长显著升高，并在300秒的照射时间内，溶液的温差可高达到39℃远高于H2O组和pH7.0组的16℃。该结果充分说明，CNDs@Van在酸性环境(pH5.5)下表现出显著增强的光热转换性能。
由图10(b)pH5.5条件下CNDs@Van在不同光照强度照射下，溶液温度随时间的变化曲线图，可以看出，随着光照强度的增加，CNDs@Van溶液温度随着光照时间的延长逐渐升高，并在300秒的照射时间内，溶液温差达到39℃。
由图10(c)CNDs@Van分别在pH5.5和pH7.0条件下的光热图片，可以看出，pH7.0的CNDs@Van溶液随着光照(808nm，0.8W/cm2)时间的延长，溶液温度未见明显的升温。然而，pH5.5条件下的CNDs@Van溶液的温度随着光照时间的延长却显著升高。这一结果进一步证实了pH5.5条件下的CNDs@Van具有良好的近红外光热转换性能。
由图10(d)pH5.5条件下CNDs@Van的光照开-关温度曲线图，可以看出，CNDs@Van的开-关温度曲线随着光照次数的增加没有发生明显的变化，这进一步证实了CNDs@Van具有良好且稳定的光热转换性能，可循环、重复使用，保证了光热治疗应用期间的治疗效果。
2、基于pH敏感的万古霉素修饰的碳纳米点(CNDs@Van)用于耐万古霉素粪肠球菌(VRE)生物膜的体外光热抑菌治疗后的荧光染色分析
从TSB平板上挑取单克隆VRE菌株(Enterococcus faecalis，ATCC51299)到5mLTSB培养液中，37℃培养。取VRE菌液，用TSB培养液调节OD600为0.5后，6000rpm、10min离心浓缩10倍。然后在96孔板中，加入100μLVRE菌液与100μLTSB培养液。37℃24小时后，更换TSB培养液，再继续培养24小时，即得VRE细菌生物膜。取100μL、1.0mg/mL的CNDs@Van溶液加到VRE细菌生物膜后，进行光照或者非光照处理。所有光照实验均采用808nm激光，0.8W/cm2照射10min，所有非光照组室温孵育10min，向处理后的生物膜中加入2μL的SYTO-9/PI混合染料，孵育15min后于荧光显微镜观察并拍照。
图11为CNDs和CNDs@Van光热处理后的VRE生物膜的荧光染色图，图11(a)、(b)、(c)为VRE生物膜经PBS、CNDs及CNDs@Van和非光照处理后的荧光染色图，图10(d)、(e)、(f)为VRE生物膜经PBS、CNDs及CNDs@Van和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的荧光染色图。其中，SYTO-9可以穿过活细菌的细胞壁与DNA结合使其显示绿色，而PI只能穿过死细菌不完整的细胞壁，使死的细菌被染成红色。
因图片仅能为黑白色，特作如下解释：图(a)和(d)中的VRE细菌(白点部分)均显示明显的绿色，说明VRE生物膜经过PBS非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的细菌都是活的；而图11(b)和(e)中的VRE细菌(白点部分)显示为绿色，说明VRE生物膜经CNDs非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的VRE细菌都是活的，说明CNDs颗粒本身对VRE细菌不具有显著的杀灭作用；图11(c)中的VRE细菌大部分为绿色，即均为活菌，说明非光照下的CNDs@Van本身对VRE生物膜没有杀灭作用；而图(f)中的VRE细菌却全部变成红色，说明经CNDs@Van在光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后，大部分VRE细菌均死亡，表明CNDs@Van对VRE生物膜具有良好的光热杀灭作用。
3、基于pH敏感的万古霉素修饰的碳纳米点(CNDs@Van)用于耐万古霉素粪肠球菌(VRE)生物膜的体外光热抑菌治疗
从TSB平板上挑取单克隆VRE菌株到5mL TSB培养液中，37℃培养。取VRE菌液，用TSB培养液调节OD600为0.5后，6000rpm、10min离心浓缩10倍。然后在96孔板中，加入100μLVRE菌液与100μL TSB培养液。37℃24小时后，更换TSB培养液，再继续培养24小时，即得VRE细菌生物膜。取100μL、1.0mg/mL的CNDs@Van溶液加到VRE细菌生物膜后，进行光照或者非光照处理。所有光照实验均采用808nm激光，0.8W/cm2照射10min，所有非光照组室温孵育10min。取50μL加到TSB固体培养基上，涂匀后放于37℃培养，另按此步骤另做一组，同样取50μL，但加入30mL TSB液体培养基中，每小时记录OD600的数值。
图12是CNDs@Van对VRE生物膜的光热抑菌治疗的结果；图12(a)和(d)分别为VRE生物膜经PBS非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的光热抑菌治疗后的标准平板菌落照片；图12(b)和(e)为VRE生物膜经CNDs非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的光热抑菌治疗后的标准平板菌落照片；图(c)和(f)为VRE生物膜经CNDs@Van在非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的光热抑菌治疗后的标准平板菌落照片。其中PBS、CNDs在光照和非光照条件下对VRE生物膜均无明显杀灭作用。由图12可以看出，CNDs@Van在非光照条件下，未表现出对VRE生物膜明显的杀菌性能。然而，CNDs@Van经过光照后，对VRE生物膜表现出明显杀灭效果，这与上述CNDs@Van的高效光热转化性能以及与其活/死细菌荧光染色的结果高度一致。
由图13CNDs和CNDs@Van分别在非光照和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的VRE细菌存活率，可以看出，生物膜经PBS、CNDs在非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的VRE细菌存活率无明显差别。VRE生物膜经CNDs@Van在非光照处理后，细菌存活率未出现明显差别。而VRE生物膜经CNDs@Van光照(808nm，0.8W/cm2，10min)条件下处理后细菌存活率与其它处理组的细菌存活率相比，其统计学差异性可达到P<0.0001(用****表示)，说明VRE生物膜经CNDs@Van光照(808nm，0.8W/cm2，10min)条件下处理后细菌存活率与其它处理组细菌存活率差异极其显著。这些数据表明，VRE生物膜经CNDs@Van光照处理后，VRE细菌的死亡率能够达到99％以上。
由图14VRE生物膜经CNDs和CNDs@Van在非光照和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的细菌生长曲线图，可以看出，PBS、CNDs分别在非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)条件下均没有明显的抑菌效果。CNDs@Van在非光照条件下没有明显的抑菌效果，但经过808nm、0.8W/cm2照射10min后出现明显抑菌效果。所有数据表明，CNDs@Van对VRE生物膜具有良好的光热杀菌性能。
4、基于pH敏感的万古霉素修饰的碳纳米点(CNDs@Van)用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)生物膜的体外光热抑菌治疗
从TSB平板上挑取单克隆MRSA菌株(Staphylococcus aureu，ATCC700698)到5mLTSB培养液中，37℃培养。取MRSA菌液，用TSB培养液调节OD600为0.5后，6000rpm、10min离心浓缩10倍。然后在96孔板中，加入100mL MRSA菌液与100μL TSB培养液。37℃24小时后，更换TSB培养液，再继续培养24小时，即得MRSA细菌生物膜。取100μL、1.0mg/mL的CNDs@Van溶液加到MRSA细菌生物膜后，进行光照或者非光照处理。所有光照实验均采用808nm激光，0.8W/cm2照射10min，所有非光照组室温孵育10min。取50μL加到TSB固体培养基上，涂匀后放于37℃培养，另按此步骤另做一组，同样取50μL，加入30mLTSB液体培养基中，每小时记录OD600的数值。
从图15可以看出CNDs@Van对MRSA生物膜的光热抑菌治疗的结果；图15(a)和(d)为MRSA生物膜经PBS非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的光热抑菌治疗后的标准平板菌落照片；图15(b)和(e)为MRSA生物膜经CNDs非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的光热抑菌治疗后的标准平板菌落照片；图15(c)和(f)为MRSA生物膜经CNDs@Van在非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的光热抑菌治疗后的标准平板菌落照片。其中PBS、CNDs在光照和非光照条件下对MRSA生物膜均无明显杀灭作用。CNDs@Van在非光照条件下，未表现出对MRSA生物膜明显的杀菌性能。然而，CNDs@Van经过光照后，对MRSA生物膜表现出明显杀灭效果。
由图16CNDs和CNDs@Van分别在非光照和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的MRSA细菌存活率，可以看出，生物膜经PBS、CNDs在非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的MRSA细菌存活率无明显差别。MRSA生物膜经CNDs@Van在非光照处理后，细菌存活率未出现明显差别。而MRSA生物膜经CNDs@Van光照(808nm，0.8W/cm2，10min)条件下处理后细菌存活率与其它处理组的细菌存活率相比，其统计学差异性可达到P<0.0001(用****表示)，说明MRSA生物膜经CNDs@Van光照(808nm，0.8W/cm2，10min)条件下处理后细菌存活率与其它处理组细菌存活率差异极其显著。这些数据表明，MRSA生物膜经CNDs@Van光照处理后，MRSA细菌的死亡率能够达到99.99％以上。
由图17MRSA生物膜经CNDs和CNDs@Van在非光照和NIR光照(808nm，0.8W/cm2，10min)处理后的细菌生长曲线图，可以看出，PBS、CNDs分别在非光照和光照(808nm，0.8W/cm2，10min)条件下均没有明显的抑菌效果。CNDs@Van在非光照条件下没有明显的抑菌效果，但经过808nm、0.8W/cm2照射10min后出现明显抑菌效果。所有数据表明，CNDs@Van对MRSA生物膜具有良好的光热杀菌性能。
综上所述，本发明提供的一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法，采用酰氯介导的氨基羧基缩合反应，合成CNDs@Van，合成步骤简单，反应产率高；获得的CNDs@Van具有良好的靶向和pH敏感性，能够对细菌生物膜的酸性环境具有良好的聚集响应效应，从而提高近红外光区的吸收，优化光热转换性能，表现出显著增强的光热杀灭效果，能够用于革兰氏阳性耐药菌等耐药菌及其生物膜的光热治疗。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
Claims (6)
1.一种基于pH敏感的万古霉素修饰碳纳米点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将柠檬酸加热，所述加热的温度为180-240℃，所述加热的加热时间为2-3小时，最终获得棕色粉末，即碳纳米点；
步骤2：将步骤1获得的碳纳米点颗粒透析，得纯化的碳纳米点；
步骤3：将步骤2纯化的碳纳米点和氯化亚砜加热反应，获得酰氯修饰的碳纳米点，所述纯化的碳纳米点与氯化亚砜的质量比为1:(60-200)；
步骤4：将万古霉素(Van)和三乙胺(TEA)溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌反应，所述Van和TEA的摩尔数比为1:(1-3)；所述Van的摩尔浓度为22-36mmol/L；
步骤5：将步骤3得到的酰氯修饰的碳纳米点在N，N-二甲基甲酰胺中溶解，再缓慢滴加到步骤4的反应体系中得反应溶液；
步骤6：将步骤5得到的反应溶液，用洗涤溶液反复离心洗涤，真空干燥后得黑色粉末，即万古霉素修饰碳纳米点，
所述万古霉素修饰碳纳米点在革兰氏阳性耐药菌及其生物膜的光热抑菌治疗领域应用。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述透析采用截留分子量为3500的透析袋；所述透析采用的透析液为双蒸水；所述透析的时间为12-24小时。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述加热的温度为70-80℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述溶解的温度为20-40℃，所述搅拌的时间为30min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5中反应温度为20-40℃，反应时间为24-36小时。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤6中洗涤试剂为无水乙醚和无水乙醇。
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