CN115944745B - 一种具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系的制备方法，包括下述步骤：S1，4‑羟基四苯基乙烯的合成；S2，四苯乙烯衍生物的合成；S3，甲氧基聚乙二醇羧基的合成；S4，硫缩酮功能化的聚乙二醇的合成；S5，聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物的制备；S6，聚乙二醇和聚己内酯的共聚物的制备；S7，具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系的制备。本发明形成的聚合物分子可进行自发光，并且聚合物分子中具有AIE性质的分子四苯乙烯与抗癌药物阿霉素之间荧光共振能量转移效应效应可进行荧光成像，同时还能够有效控制抗癌药物阿霉素的释放。
Description
技术领域
本发明属于多功能纳米材料技术领域，具体涉及一种具有聚集诱导发光(AIE)性质的活性氧(ROS)响应型药物控释体系及其制备方法和应用。
背景技术
癌症在中国乃至全球都是一个主要的公共卫生问题，GLOBOCAN发布的全球癌症统计报告中指出，2020年全球约有1930万例新发癌症病例和近1000万例癌症死亡病例。针对癌症传统的治疗方式主要有化疗、手术切除等，手术切除不适用于恶性肿瘤，化疗具有很强的毒副作用。纳米药物利用增强渗透和滞留(EPR)效应将药物被动靶向到病灶部位，极大的提高了生物利用度并降低了毒副作用。2007年紫杉醇制剂Genexol-PM在韩国成功上市，用于乳腺癌和肺癌的治疗，实现了纳米药物向临床应用的转变，极大的鼓舞了研究者对于多功能纳米药物的探索。而目前的纳米药物都存在功能性单一以及靶向性不足的问题，因此迫切需要研发一种可实现多功能环境响应型抗癌药物的控制释放体系。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种具有聚集诱导发光(AIE)性质的活性氧(ROS)响应型药物控释体系及其制备方法和应用。
本发明提供一种具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系的制备方法，包括下述步骤：
S1，4-羟基四苯基乙烯TPE-OH的合成：用三氯化钛在四氢呋喃介质中还原，将二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮进行羰基缩合去氧得到4-羟基四苯基乙烯TPE-OH；
S2，四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br的合成：以步骤S1制备的4-羟基四苯基乙烯TPE-OH和1,6-二溴己烷为反应原料，在碱性环境下进行取代反应，得到四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br；
S3，甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH的合成：以聚乙二醇单甲醚mPEG-OH和丁二酸酐为反应原料，对mPEG-OH进行羧基化修饰，得到甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH；
S4，硫缩酮功能化的聚乙二醇mPEG-TK-OH的合成：以步骤S3制备的甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH和硫缩酮TK为反应原料，进行酯化反应，得到硫缩酮功能化的聚乙二醇mPEG-TK-OH；
S5，具有ROS响应的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH的制备：以步骤S4制备的mPEG-TK-OH和ε-己内酯ε-CL为反应原料，以Novozyme-435为催化剂，通过酶促法进行开环聚合，得到具有ROS响应的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH；
S6，具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE的制备：以步骤S2制备的四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br和步骤S5制备的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH为反应原料，NaH为催化剂，进行取代反应，得到具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE；
S7，具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系的制备：以盐酸阿霉素DOX·HCl和步骤6制备的聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE为原料，以三乙胺TEA为缚酸剂进行物理包埋，得到具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
作为优选，步骤S1中，所述二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮的摩尔比是1：1.1～2，优选摩尔比是1：1.5；和/或
在合成时，以锌粉作为催化剂；和/或
在合成时，保持惰性气体或氮气气体氛围。
作为优选，步骤S4中，所述甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH和硫缩酮TK的摩尔比为1：3.75-7.5，优选摩尔比为1：3.75；和/或
进行酯化反应时，加入酯化反应缩合剂；
作为进一步优选，所述酯化反应缩合剂为二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶。
二环己基碳二亚胺(DCC)上带孤对电子的N进攻羧基氢，获得氢后DCC中间C原子带正电，然后失去氢后的羧基氧负进攻DCC中间C，接着4-二甲氨基吡啶(DMAP)吡啶环上的N因为带有孤对电子，进攻羧基C，同时羧基另一个氧连在DCC上脱去，形成DCU，最后DMAP吡啶环上N进攻羟基氢，获得氢后离去，而失去氢的羟基氧负进攻羰基C，成酯。DCC参与反应，DMAP为催化剂。换句话说，DCC是二取代脲的失水产物，一个重要的失水剂，DMAP是一种“万能”的催化剂，由于氨基的给电子效应，DMAP中吡啶环的氮原子亲核能力更强。所以两者需要联合使用。摩尔比DCC：DMAP＝10～15：1。
作为优选，步骤S6中，所述四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br和聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH的摩尔比为7-21:6，优选摩尔比为7:6。
作为优选，步骤S7中，所述物理包埋的具体方法为：将盐酸阿霉素DOX·HCl和步骤6制备的聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE溶解于溶剂中，加入三乙胺于室温下搅拌以便使得盐酸阿霉素DOX·HCl完全包进聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE中，然后用蒸馏水透析，得到具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
作为优选，步骤S7中，所述DOX·HCl和PEG-TK-PCL-TPE质量比是1：10；和/或
所述溶剂为DMSO/H2O混合溶液，所述DMSO/H2O混合溶液中，水组分含量为0-90％。
本发明还提供具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系，是应用上述的方法制备得到的。
本发明还提供上述的具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系在控制阿霉素释放中的应用。
本发明还提供上述的具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系在追踪体内阿霉素给药中的应用。
作为优选，所述应用具体为用激光共聚焦显微镜观察在λex＝405nm处的蓝色荧光。
本发明制备的药物控释体系可在水溶液中自组装形成核-壳结构，在聚集状态下具有很好的自发光行为。该体系是基于肿瘤组织相对于正常组织具有过表达的ROS浓度，利用增强渗透和滞留(EPR)效应进行药物被动靶向释放的。形成的聚合物分子可进行自发光，并且聚合物分子中具有AIE性质的分子四苯乙烯(TPE)与抗癌药物阿霉素(DOX)之间荧光共振能量转移效应(FRET)效应可进行荧光成像。形成的聚合物分子还能够有效控制抗癌药物阿霉素(DOX)的释放。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为实施例1制备的载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX的透射电镜图。
图2为mPEG-TK-PCL-TPE分别溶解在不同水含量的DMSO/H2O混合溶液中，制备得到的载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX在480nm处的荧光强度。插入的图片分别为水组分体积百分含量为0％(左图)与体积百分90％(右图)时在紫外灯照射下拍摄的载药胶束的照片。
图3为mPEG-TK-PCL-TPE，mPEG-TK-PCL-TPE@DOX和DOX的荧光光谱。
图4为载药胶束Polymer-1、Polymer-2和Polymer-3在不同释放介质中的DOX体外药物释放图谱。
图5为共聚焦显微镜图像；其中，A图为mPEG-TK-PCL-TPE随时间变化的自发光情况，B图为mPEG-TK-PCL-TPE@DOX随时间变化的FRET效应(标尺：100μm)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明的一种具有AIE性质的ROS响应型药物控释体系的制备方法步骤如下：
步骤1、TPE-OH的合成(麦克默里反应，羰基缩合去氧得到烯烃)
在圆底三颈烧瓶中加入1g(5mmol)二苯甲酮、1.03g～1.87g(5.5～10mmol)4-羟基二苯甲酮和1.5g(22mmol)锌粉，抽真空通氮气，重复三次。在氮气氛围下加入150mL无水的四氢呋喃(THF)，在0℃下搅拌半小时，使体系温度处于低温环境。在0℃氮气氛围下逐滴滴加0.78g～1.40g(4～7mmol)TiCl4。室温搅拌半小时后，升高反应温度至80℃搅拌，整个反应过程中保持氮气氛围，通过薄层色谱法监测，原料二苯甲酮用尽，视为反应结束。反应完后，在剧烈搅拌下向反应体系中缓慢滴加10％～15％的K2CO3水溶液，对未反应完的酸进行中和，直至反应体系无冒泡现象。将反应体系进行过滤，将滤液用二氯甲烷萃取，反复三次。将萃取液用无水Na2SO4干燥后在20-50℃下进行旋转蒸发。粗产物通过柱色谱法进一步纯化，硅胶作为吸附相，石油醚/CH2Cl2(10：1，v/v)作为洗脱剂，得到产物4-羟基四苯基乙烯(TPE-OH)，为白色固体。
二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮是反应原料，锌粉是两者反应的催化剂。
二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮的投料摩尔比是1：1.1～2，即4-羟基二苯甲酮过量，因为需要以二苯甲酮为当量物质进行监测。
氮气氛围所有的目的都是惰性气体保护，为了隔绝空气，除水除氧，氮气作为一种气体保护的形式。
加入无水的四氢呋喃，也是为了除水，水的存在不利于反应的进行。
TiCl4是强酸，在0℃下加入是为了避免反应过于剧烈。
室温搅拌半小时后，升高反应温度至80℃，是为了在反应刚开始阶段让体系稳定，不至于太过于剧烈，然后升至80℃达到反应条件。
四氯化钛可与路易斯碱溶剂(如THF)发生放热反应，生成六配位的加合物。TiCl4和还原剂锌粉共同使用会更好。
步骤2、TPE-C6-Br的合成(取代反应，羟基和溴发生取代将TPE-OH进行烷基化修饰)
在三颈烧瓶中加入1g(2.9mmol)步骤1制备的4-羟基四苯基乙烯(TPE-OH)，1.5g～1.8g(6.1-7.3mmol)1,6-二溴己烷、0.4g～0.9g(2.9～6.5mmol)碳酸钾，抽真空通氮气，反复三次。在氮气氛围下加入50mL无水丙酮，80℃回流，通过薄层色谱法监测，原料4-羟基四苯基乙烯用尽，视为反应结束。反应完成后，过滤除去不溶物，收集滤液，将滤液用无水Na2SO4进行干燥后在20℃～50℃下进行旋转蒸发。粗产物通过柱色谱法进一步纯化，硅胶作为吸附相，石油醚/CH2Cl2(20:1，v/v)作为洗脱剂，得到四苯乙烯衍生物(TPE-C6-Br)。
其中，4-羟基四苯基乙烯(TPE-OH)和1,6-二溴己烷为反应原料，碳酸钾提供碱性环境，无水丙酮是溶剂。
4-羟基四苯基乙烯和1,6-二溴己烷的摩尔比为1：2.1～2.5，即1,6-二溴己烷过量，因为需要以4-羟基四苯基乙烯为当量物质进行监测。碳酸钾与1,6-二溴己烷的摩尔比为1：1，是为了保证反应完全。
步骤3、mPEG-COOH的合成(开环反应，对mPEG-OH羧基化修饰)
在50ml圆底烧瓶中加入5.0g(1mmol)聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH)、1.0g～2.0g(10～20mmol)丁二酸酐，抽真空通氮气，重复三次。在氮气氛围下加入20～30mL甲苯(溶剂)中，70℃～85℃下搅拌反应16～36h。待反应体系冷却至室温时，过滤浓缩，在无水乙醚中重沉淀，干燥后得到甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)。
其中，mPEG-OH、丁二酸酐是反应原料，甲苯是溶剂。mPEG-OH：丁二酸酐的摩尔比为1：10～20，是为了使mPEG-OH反应完全。
步骤4、mPEG-TK-OH的合成(酯化反应)
将步骤3制备的4.0g(0.8mmol)甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)和0.45g～0.9g
(3～6mmol)硫缩酮(TK)加入到100～150mL无水二氯甲烷(溶剂)中，25℃下搅拌；
待固体物质完全溶解后，继续加入0.74g～1.48g(3.6～7.2mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)和0.036g～0.072g(0.3～0.6mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温反应30～56h；过滤后浓缩，在乙醚中重沉淀，干燥后得到硫缩酮功能化的聚乙二醇(mPEG-TK-OH)(Mn＝5000)。
其中，mPEG-COOH和TK是反应原料，二氯甲烷是溶剂，DCC，DMAP是酯化缩合剂。mPEG-COOH和TK的摩尔比是1：3.75-7.5。
步骤5、mPEG-TK-PCL-OH的合成(开环聚合)
mPEG-TK-PCL-OH的合成以Novozyme-435为催化剂，mPEG-TK-OH(Mn＝5000)为大分子引发剂，通过酶促法进行开环聚合，合成了两亲性嵌段共聚物mPEG-TK-PCL-OH。以Novozyme-435为催化剂，进行酶促开环法开环聚合可加快反应速率并具有高度生物安全性。
将步骤4制备的1g(0.2mmol)硫缩酮功能化的聚乙二醇(mPEG-TK-OH)、0.5g～1.5g(4.4～13.2mmol)ε-己内酯(ε-CL)和0.15g～0.25g诺维信435脂肪酶(Novozyme-435)置于烧瓶中，加入3～6mL甲苯(溶剂)溶液，于70～85℃下搅拌反应4～7h。所得到的聚合产物溶液溶于二氯甲烷中，过滤除去酶，将滤液浓缩后溶于四氢呋喃溶液中，用无水乙醚进行重沉淀，得到具有ROS响应的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH。
其中，mPEG-TK-OH和ε-CL是反应原料，Novozyme-435是催化剂，甲苯是溶剂。
mPEG-TK-OH和ε-CL的摩尔比是1：22-66，因为亲疏水比是5：1。
步骤6、载药载体mPEG-TK-PCL-TPE的合成(取代反应)
在一个50ml圆底烧瓶中，依次加入步骤2制备的0.9～2.6g(0.7～2.1mmol)四苯乙烯衍生物(TPE-C6-Br)、步骤5制备的3.0g(0.6mmol)聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物(mPEG-TK-PCL-OH)和0.4～1.2g(1.7～5.1mmol)氢化钠(NaH)溶于10mL的无水DMF(溶剂，N,N-二甲基甲酰胺)中。在70～85℃下搅拌16～30h，过滤后收集滤液，在冰甲醇中进行重沉淀。沉淀后抽滤，真空干燥箱中静置48h后备用，得到具有AIE性质的ROS响应型聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE。
其中，TPE-C6-Br和mPEG-TK-PCL-OH是反应原料，NaH是催化剂，DMF是溶剂。
TPE-C6-Br和mPEG-TK-PCL-OH摩尔比是7-21:6，是为了使聚合物反应完全。
步骤7、载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX的合成(物理包埋)
采用透析法制备聚合物载药胶束，具体操作如下：将盐酸阿霉素(DOX·HCl(质量为mPEG-TK-PCL-TPE的10％))和10～500mg的mPEG-TK-PCL-TPE溶于3～30mL二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后加入100～800μL的三乙胺(TEA)，20～40℃搅拌4～8h。然后置于透析袋(MWCO 3500)中，在蒸馏水中透析16～48h，每2～6h换次水；冷冻干燥得到共聚物的载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
其中，DOX·HCl和mPEG-TK-PCL-TPE是原料，TEA是缚酸剂，DMSO是溶剂。
DOX·HCl和mPEG-TK-PCL-TPE质量比是1：10，药再多了会降低载药率。1:10是最佳载药率包封率。
上述搅拌4h是为了将药完全包进胶束中。
实施例1
本发明的一种具有AIE性质的ROS响应型药物控释体系的制备方法步骤如下：
步骤1、TPE-OH的合成(麦克默里反应，羰基缩合去氧得到烯烃)
在250mL的圆底三颈烧瓶中加入二苯甲酮(1g，5mmol)、4-羟基二苯甲酮(1.4g，7.5mmol)和锌粉(1.5g，22mmol)，抽真空通氮气，重复三次。在氮气氛围下加入无水的四氢呋喃(THF)(150mL)，在0℃下搅拌半小时，使体系温度处于低温环境。在0℃氮气氛围下逐滴滴加TiCl4(1.2g，0.63mmol)。室温搅拌半小时后，升高反应温度至80℃，搅拌24小时，整个反应过程中保持氮气氛围，通过薄层色谱法监测，原料二苯甲酮已经用尽，视为反应结束。反应完后，在剧烈搅拌下向反应体系中缓慢滴加10％的的K2CO3水溶液，直至反应体系无冒泡现象。将反应体系进行过滤，将滤液用二氯甲烷萃取，反复三次。将萃取液用Na2SO4干燥后在40℃下进行旋转蒸发。粗产物通过柱色谱法进一步纯化，硅胶作为吸附相，石油醚/CH2Cl2(10：1，v/v)作为洗脱剂。得到产物4-羟基四苯基乙烯(TPE-OH)为白色固体，产率为46.2％。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：7.13-7.07(m,9H),7.05-6.99(m,6H),6.91-6.87(m,2H),6.59-6.54(m,2H),3.88(m,2H,-OCH2-),3.42(m,2H,-OCH2-Br),1.95-1.85(m,2H,-CH2-),1.80-1.71(m,2H,-CH2-),1.50(m,4H,-CH2-)。
步骤2、TPE-C6-Br的合成(取代反应，羟基和溴发生取代将TPE-OH进行烷基化修饰)
在150mL的三颈烧瓶中加入步骤1制备的4-羟基四苯基乙烯(1g，2.9mmol)，1,6-二溴己烷(2.5mL，1.6g，6.5mmol)、碳酸钾(0.9g，6.5mmol)，抽真空通氮气，反复三次。在氮气氛围下加入无水丙酮(溶剂)50mL，80℃回流24小时，通过薄层色谱法监测，原料4-羟基四苯基乙烯用尽，视为反应结束。反应完成后，过滤除去不溶物，收集滤液，将滤液用无水Na2SO4进行干燥后在40℃下进行旋转蒸发。粗产物通过柱色谱法进一步纯化，硅胶作为吸附相，石油醚/CH2Cl2(20:1，v/v)作为洗脱剂，得到四苯乙烯衍生物(TPE-C6-Br)，产率为69％。
1H-NMR(CDCl3)δ(ppm)：8.26(s,1H,Ar-H),7.99(d,2H,Ar-H),7.13-7.00(m,31H),6.93(m,4H),6.63(m,4H),7.38(s,1H,-CHCH2),5.75(d,1H,-CHCH2),5.42(d,1H,-CHCH2),3.88(m,4H,-OCH2-),3.42(m,4H,-OCH2-),1.95-1.85(m,4H,-CH2-),1.80-1.71(m,4H,-CH2-),1.50(m,4H,-CH2-),1.77(m,4H,-CH2-)。
步骤3、mPEG-COOH的合成(开环反应，对mPEG-OH羧基化修饰)
在50ml圆底烧瓶中加入聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH)(5.0g，1mmol)、丁二酸酐(1.0g，10mmol)，抽真空通氮气，重复三次。在氮气氛围下加入20mL甲苯(溶剂)中，70℃下搅拌反应24h。待反应体系冷却至室温时，过滤浓缩，在无水乙醚中重沉淀，干燥后得到甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)，产率为80％。
1H-NMR(CDCl3)δ3.24(3H,CH3O-of PEG),δ3.26–3.63(196H,CH2–CH2–O of PEG)。
步骤4、mPEG-TK-OH的合成(酯化反应)
将步骤3制备的甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)(4.0g，0.8mmol)和硫缩酮(TK)(0.45g，3mmol)加入到100mL无水二氯甲烷(溶剂)中，25℃下搅拌；待固体物质完全溶解后，继续加入二环己基碳二亚胺(DCC)(0.741g，3.6mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.036g，0.3mmol)，室温反应48h；过滤后浓缩，在乙醚中重沉淀，干燥后得到mPEG-TK-OH(Mn＝5000)，产率为81％。
1H-NMR(CDCl3)δ3.24(3H,CH3O-of PEG),δ3.26–3.63(196H,s，CH2–CH2–Oof PEG),δ1.52(3H,s，CH3-of TK),δ2.59–2.63(m,2H,α-CH2-of TK),δ2.7–2.8(m,2H,β-CH2-of TK)。
步骤5、mPEG-TK-PCL-OH的合成(开环聚合)
mPEG-TK-PCL-OH的合成以Novozyme-435为催化剂，mPEG-TK-OH(Mn＝5000)为大分子引发剂，通过酶促法进行开环聚合，合成了两亲性嵌段共聚物mPEG-TK-PCL-OH。以Novozyme-435为催化剂，进行酶促开环法开环聚合可加快反应速率并具有高度生物安全性。
将步骤4制备的硫缩铜功能化的聚乙二醇(mPEG-TK-OH)(1g，0.2mmol)、ε-己内酯(ε-CL)(0.5g，4.4mmol)和诺维信435脂肪酶(Novozyme-435)(0.15g，催化剂)置于10mL烧瓶中，加入3mL甲苯(溶剂)溶液，于70℃下搅拌反应4h。所得到的聚合产物溶液溶于二氯甲烷中，过滤除去酶，将滤液浓缩后溶于四氢呋喃溶液中，用无水乙醚进行重沉淀，得到具有ROS响应的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH，产率72％。
1H-NMR(CDCl3)δ3.24(3H,CH3O-of PEG),δ3.26–3.63(196H,s，CH2–CH2–O of PEG),δ1.52(3H,s，CH3-of TK),δ2.59–2.63(m,2H,α-CH2-of TK),δ2.7–2.8(m,2H,β-CH2-ofTK)),δ1.3-1.4ppm(m,2H,-CH2-of PCL),δ1.6-1.7ppm(m,2H,-CH2-of PCL),δ2.3-2.4ppm(m,2H,-CH2C(O)-of PCL)δ4.0-4.1ppm(m,2H-OCH2 of PCL)。
步骤6、mPEG-TK-PCL-TPE的合成(取代反应)
在一个50ml圆底烧瓶中，依次加入步骤2制备的四苯乙烯衍生物(TPE-C6-Br)(0.86g，0.7mmol)、步骤5制备的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物(mPEG-TK-PCL-OH)(3.0g，0.6mmol)和氢化钠(NaH)(0.408g，1.7mmol)溶于10mL的无水DMF(溶剂，N,N-二甲基甲酰胺)中。在80℃下搅拌24h，过滤后收集滤液，在冰甲醇中进行重沉淀。沉淀后抽滤，真空干燥箱中静置48h后备用，得到具有AIE性质的ROS响应型聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE，产率83％。
1H-NMR(CDCl3)δ3.24(3H,CH3O-of PEG),δ3.26–3.63(196H,s，CH2–CH2–O of PEG),δ1.52(3H,s，CH3-of TK),δ2.59–2.63(m,2H,α-CH2-of TK),δ2.7–2.8(m,2H,β-CH2-ofTK)),δ1.3-1.4ppm(m,2H,-CH2-of PCL),δ1.6-1.7ppm(m,2H,-CH2-of PCL),δ2.3-2.4ppm(m,2H,-CH2C(O)-of PCL)δ4.0-4.1ppm(m,2H,-OCH2 of PCL)δ7.0-8.3(m,H of TPEbenzene)。
步骤7、载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX的合成(物理包埋)
采用透析法制备聚合物载药胶束，具体操作如下：将20mg的盐酸阿霉素(DOX·HCl)和200mg的mPEG-TK-PCL-TPE溶于10mL二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后加入200μL的三乙胺(TEA)，25℃搅拌4h。然后置于透析袋(MWCO 3500)中，在蒸馏水中透析24h，每4h换次水；冷冻干燥得到共聚物的载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
实施例2载药胶束PEG-TK-PCL-TPE@DOX的性能试验
1.胶束形态
胶束形貌通过透射电子显微镜(TEM)进行观察。
样品制备方法：将实施例1步骤7制备的干燥载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX的粉末称取2mg，溶于10mL去离子水中，得到载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX聚合物溶液。
将实施例1步骤6制备的聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE粉末称取2mg，溶于10mL去离子水中，得到空白聚合物溶液。
在铺有碳膜的铜网正面蘸取一滴载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX聚合物溶液或空白聚合物溶液(0.2mg/mL)，将聚合物溶液滴在铜网上静置5min后，漂浮在0.2％的磷钨酸溶液液滴上负染3min，红外灯烤干后上机观察。
图1为实施例1制备的载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX的透射电镜图。
2.体外聚合物的AIE效应与FRET效应
2.1mPEG-TK-PCL-TPE的AIE效应是通过逐渐改变有机溶剂中水的比例来验证的。
选用溶解性较好的DMSO/H2O混合溶液通过荧光分光光度计来验证聚合物的AIE性质，将mPEG-TK-PCL-TPE聚合物分别溶解在水的体积百分含量为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的DMSO/H2O混合溶液中，按照实施例1步骤7的方法制备载药胶束PEG-TK-PCL-TPE@DOX，最终浓度均为1mg/mL。
在365nm激发波长下，测量了上述每个载药胶束在480nm处的荧光强度。并在DMSO/H2O混合溶液中水含量分别为0％和90％时，在紫外灯照射下拍摄相应制备的载药胶束的照片。结果见图2。
图2为mPEG-TK-PCL-TPE分别溶解在不同水含量的DMSO/H2O混合溶液中，制备得到的载药胶束在480nm处的荧光强度。插入的图片分别为水组分体积百分含量为0％(左图)与水组分体积百分90％(右图)时在紫外灯照射下拍摄的载药胶束的照片。
由图2可以看出，随着水组分含量增加，荧光增强说明聚合物在聚集态时具有很好的自发光行为。
2.2对空白聚合物胶束(Ex＝365nm)、载药胶束(Ex＝365nm)以及DOX(Ex＝480nm)进行荧光光谱扫描，根据出峰位置变化来验证聚合物与DOX之间的FRET行为。结果见图3。
图3为mPEG-TK-PCL-TPE，mPEG-TK-PCL-TPE@DOX和DOX的荧光光谱。
DOX是一种抗肿瘤药物，具有荧光激发波长范围为475-485nm；TPE及其衍生物是一种具有AIE性质的分子，其荧光发射波长在450-550nm，所以当以365nm激发聚合物时，聚合物的发射波长会激发DOX与TPE及其衍生物之间形成FRET效应。用荧光分光光度计验证了这一猜想，当mPEG-TK-PCL-TPE@DOX在365nm被激发后，两个发射荧光光谱的峰出现。在450nm左右出现一个弱的发射峰归于mPEG-TK-PCL-TPE，在600nm左右出现另一个发射峰归于DOX。mPEG-TK-PCL-TPE首先在365nm激发，在450nm左右出现发射峰。这个发射峰作为DOX的激发光激活DOX，显示mPEG-TK-PCL-TPE与所负载DOX之间的FRET效应。
3.药物控制释放
3.1释放介质有三种：
(1)磷酸盐缓冲盐PBS溶液(pH 7.4)；
(2)醋酸盐缓冲液ABS溶液(pH 5.5)，离子强度为0.01M；
(3)添加10mM的H2O2的ABS溶液(pH 5.5)。
3.2定义空白胶束为：Polymer-1为mPEG-PCL，Polymer-2为mPEG-TK-PCL，Polymer-3为mPEG-TK-PCL-TPE。载药胶束为：Polymer-1@DOX为mPEG-PCL@DOX，Polymer-2@DOX为mPEG-TK-PCL@DOX，Polymer-3@DOX为mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
3.3将不同载药胶束(Polymer-1@DOX、Polymer-2@DOX、Polymer-3@DOX)溶液(2mg/mL)转移到不同透析袋(MWCO 3500)中，并分别浸泡在25mL不同的释放介质中，以120rpm和37℃持续振荡。使用移液器取出1mL释放外液，用等体积的新鲜释放介质替换。释放出的DOX用荧光光谱仪(F-7000)检测(λex＝480nm，λem＝550nm)。每组3个样品作为平行样，并给出了具有标准偏差的平均值。根据公式进行计算：
在此公式中，Ve表示每次取出的溶液体积，V0表示外液总体积，Ci表示在时间i时取出的溶液中DOX的浓度，m表示透析袋里载药胶束中DOX的质量，n表示取样时间。
图4为载药胶束Polymer-1@DOX、Polymer-2@DOX和Polymer-3@DOX在不同释放介质中的DOX体外药物释放图谱。
图4A显示了PBS(pH 7.4)中载药胶束Polymer-1@DOX、Polymer-2@DOX和Polymer-3@DOX药物释放曲线。从图中可知三种聚合物，pH 7.4条件下48h内的累积释放低于30％，无明显暴释现象；并且释放曲线差异很小，说明聚合物胶束具有很好的稳定性。
图4B显示了ABS(pH 5.5)中载药胶束Polymer-1@DOX、Polymer-2@DOX和Polymer-3@DOX药物释放曲线，从图中可知三种聚合物，48h内的累积释放均低于30％，无明显暴释现象；三种聚合物释放曲线变化很小，由于酸性环境可以破坏聚合物的结构，使得释放速度快于PBS环境中，但整体较为稳定。
图4C显示了有H2O2(10mM)的ABS(pH 5.5)中载药胶束Polymer-1@DOX、Polymer-2@DOX和Polymer-3@DOX的释放曲线，可以看出载药胶束Polymer-2@DOX和Polymer-3@DOX在48h累积释药分别为85.8％和88.9％，明显高于Polymer-1@DOX(29.5％)。这是由于硫缩酮键断裂，胶束结构完整性被破环，药物释放加快。在三种释放介质中，Polymer-3@DOX胶束在含H2O2(10mM)的ABS中的释药速率最快。以上研究显示，载药胶束Polymer-2@DOX和Polymer-3@DOX能够将有效包载抗癌药物长效平稳地释放，并且显示出ROS响应的释药性能，可在模拟肿瘤微环境(pH 5.5,10mM H2O2)中快速释放抗癌药物。
4.体内聚合物的AIE性质与FRET效应
用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察4T1细胞对载体或载药胶束的摄取情况(3h，6h和12h)。
将4T1细胞(1×105个/孔)孵育在培养皿(25mm)中，放在含有5％的CO2的培养箱中，37℃下培养12h，将培养液换成浓度为2.5μg/mL的载药胶束溶液或空白胶束溶液，再次在培养箱中将载药胶束或空白胶束与4T1共孵育(3h，6h和12h)；移出培养液后PBS多次洗涤细胞；将PBS吸干净后加入4％的多聚甲醛固定15min；移出多聚甲醛后PBS洗三次，分别在每个培养皿中加入1mL的PBS。用CLSM观察DOX(λex＝488nm)以及mPEG-TK-PCL-TPE(λex＝405nm)荧光，观察载体自发光情况以及载药胶束之间的FRET行为。
其中，空白胶束溶液是将实施例1步骤6制备的聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE粉末溶于1640培养液得到的。
载药胶束溶液是将实施例1制备的mPEG-TK-PCL-TPE@DOX粉末溶于1640培养液得到的。
图5为共聚焦显微镜图像；其中，A图为mPEG-TK-PCL-TPE随时间变化的自发光情况，B图为mPEG-TK-PCL-TPE@DOX随时间变化的FRET效应(标尺：100μm)。
其中，A图中，Bright field是明场，TPE是载体的荧光，Merge是前两个图整合。B图中，TPE是载体的荧光，DOX是药的荧光，Merge是整合在一起的。
具有AIE特性的纳米载体可用于监测细胞内药物的传递，并使这些载体可见。在本发明中，mPEG-TK-PCL-TPE@DOX胶束的TPE可用于追踪细胞内给药，进入肿瘤细胞后药物在肿瘤内部过表达的ROS环境下快速从载药胶束中释放，提高抗肿瘤疗效。
如图5A所示，随着时间的推移，TPE组蓝色荧光逐渐增强，说明mPEG-TK-PCL-TPE具有很好的自发光性能。
如图5B所示，蓝色的TPE荧光和红色DOX荧光已经很容易地观察到，胶束3h和红色与蓝色荧光几乎完全重叠，表明载药胶束可以迅速进入4T1细胞。此外，随着时间的推移6h时，红色荧光和蓝色荧光都变得更强，表明细胞吸收了更多的胶束。孵育12h后，蓝色的荧光仍分布在细胞质中，细胞核中出现红色的荧光，且蓝色荧光逐渐增强，说明载药胶束能迅速释放载物，释放的药物能从溶酶体逃逸到作用部位。以上结果说明，聚合物mPEG-TK-PCL-TPE可以有效的负载DOX，并完成运输到细胞中的使命。值得注意的是，随着时间延长，蓝色荧光逐渐增强，这是因为随着时间延长，DOX从载体中释放的越来越多，载体与DOX之间的FRET效应减弱，简单的说，载体的能量不再作为供体提供给DOX，所以自身荧光增强。结果表明载体与DOX之间具有很好的FRET效应，可以观测到药物递释情况，与体外结果一致。
实施例3
本发明的一种具有AIE性质的ROS响应型药物控释体系的制备方法步骤如下：
步骤1、TPE-OH的合成(麦克默里反应，羰基缩合去氧得到烯烃)
在250mL的圆底三颈烧瓶中加入二苯甲酮(1g，5mmol)、4-羟基二苯甲酮(1.03g，5.5mmol)和锌粉(1.5g，22mmol)，抽真空通氮气，重复三次。在氮气氛围下加入无水的四氢呋喃(THF)(150mL)，在0℃下搅拌半小时，使体系温度处于低温环境。在0℃氮气氛围下逐滴滴加TiCl4(1.40g，7mmol)。室温搅拌半小时后，升高反应温度至80℃，搅拌24小时，整个反应过程中保持氮气氛围，通过薄层色谱法监测，原料二苯甲酮已经用尽，视为反应结束。反应完后，在剧烈搅拌下向反应体系中缓慢滴加15％的的K2CO3水溶液，直至反应体系无冒泡现象。将反应体系进行过滤，将滤液用二氯甲烷萃取，反复三次。将萃取液用Na2SO4干燥后在20℃下进行旋转蒸发。粗产物通过柱色谱法进一步纯化，硅胶作为吸附相，石油醚/CH2Cl2(10：1，v/v)作为洗脱剂。得到产物4-羟基四苯基乙烯(TPE-OH)为白色固体。
步骤2、TPE-C6-Br的合成(取代反应，羟基和溴发生取代将TPE-OH进行烷基化修饰)
在150mL的三颈烧瓶中加入步骤1制备的4-羟基四苯基乙烯(1g，2.9mmol)，1,6-二溴己烷(1.5g，6.1mmol)、碳酸钾(0.4g，2.9mmol)，抽真空通氮气，反复三次。在氮气氛围下加入无水丙酮(溶剂)50mL，80℃回流24小时，通过薄层色谱法监测，原料4-羟基四苯基乙烯用尽，视为反应结束。反应完成后，过滤除去不溶物，收集滤液，将滤液用无水Na2SO4进行干燥后在50℃下进行旋转蒸发。粗产物通过柱色谱法进一步纯化，硅胶作为吸附相，石油醚/CH2Cl2(20:1，v/v)作为洗脱剂，得到四苯乙烯衍生物(TPE-C6-Br)。
步骤3、mPEG-COOH的合成(开环反应，对mPEG-OH羧基化修饰)
在50ml圆底烧瓶中加入聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH)(5.0g，1mmol)、丁二酸酐(1.5g，15mmol)，抽真空通氮气，重复三次。在氮气氛围下加入25mL甲苯(溶剂)中，75℃下搅拌反应36h。待反应体系冷却至室温时，过滤浓缩，在无水乙醚中重沉淀，干燥后得到甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)。
步骤4、mPEG-TK-OH的合成(酯化反应)
将步骤3制备的甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)(4.0g，0.8mmol)和硫缩酮(TK)(0.9g，6mmol)加入到150mL无水二氯甲烷(溶剂)中，25℃下搅拌；待固体物质完全溶解后，继续加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.48g，7.2mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.072g，0.6mmol)，室温反应30h；过滤后浓缩，在乙醚中重沉淀，干燥后得到mPEG-TK-OH(Mn＝5000)。
步骤5、mPEG-TK-PCL-OH的合成(开环聚合)
将步骤4制备的硫缩铜功能化的聚乙二醇(mPEG-TK-OH)(1g，0.2mmol)、ε-己内酯(ε-CL)(1.5g，13.2mmol)和诺维信435脂肪酶(Novozyme-435)(0.25g，催化剂)置于10mL烧瓶中，加入6mL甲苯(溶剂)溶液，于85℃下搅拌反应5h。所得到的聚合产物溶液溶于二氯甲烷中，过滤除去酶，将滤液浓缩后溶于四氢呋喃溶液中，用无水乙醚进行重沉淀，得到具有ROS响应的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH。
步骤6、mPEG-TK-PCL-TPE的合成(取代反应)
在一个50ml圆底烧瓶中，依次加入步骤2制备的四苯乙烯衍生物(TPE-C6-Br)(2.6g，2.1mmol)、步骤5制备的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物(mPEG-TK-PCL-OH)(3.0g，0.6mmol)和氢化钠(NaH)(1.2g，5.1mmol)溶于10mL的无水DMF(溶剂，N,N-二甲基甲酰胺)中。在70℃下搅拌30h，过滤后收集滤液，在冰甲醇中进行重沉淀。沉淀后抽滤，真空干燥箱中静置48h后备用，得到具有AIE性质的ROS响应型聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE。
步骤7、载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX的合成(物理包埋)
采用透析法制备聚合物载药胶束，具体操作如下：将20mg的盐酸阿霉素(DOX·HCl)和200mg的mPEG-TK-PCL-TPE溶于30mL二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后加入500μL的三乙胺(TEA)，20℃搅拌8h。然后置于透析袋(MWCO 3500)中，在蒸馏水中透析48h，每6h换次水；冷冻干燥得到共聚物的载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
实施例4
本发明的一种具有AIE性质的ROS响应型药物控释体系的制备方法步骤如下：
步骤1、TPE-OH的合成(麦克默里反应，羰基缩合去氧得到烯烃)
在250mL的圆底三颈烧瓶中加入二苯甲酮(1g，5mmol)、4-羟基二苯甲酮(1.87g，10mmol)和锌粉(1.5g，22mmol)，抽真空通氮气，重复三次。在氮气氛围下加入无水的四氢呋喃(THF)(150mL)，在0℃下搅拌半小时，使体系温度处于低温环境。在0℃氮气氛围下逐滴滴加TiCl4(0.78g，4mmol)。室温搅拌半小时后，升高反应温度至80℃，搅拌24小时，整个反应过程中保持氮气氛围，通过薄层色谱法监测，原料二苯甲酮已经用尽，视为反应结束。反应完后，在剧烈搅拌下向反应体系中缓慢滴加12％的的K2CO3水溶液，直至反应体系无冒泡现象。将反应体系进行过滤，将滤液用二氯甲烷萃取，反复三次。将萃取液用Na2SO4干燥后在50℃下进行旋转蒸发。粗产物通过柱色谱法进一步纯化，硅胶作为吸附相，石油醚/CH2Cl2(10：1，v/v)作为洗脱剂。得到产物4-羟基四苯基乙烯(TPE-OH)为白色固体。
步骤2、TPE-C6-Br的合成(取代反应，羟基和溴发生取代将TPE-OH进行烷基化修饰)
在150mL的三颈烧瓶中加入步骤1制备的4-羟基四苯基乙烯(1g，2.9mmol)，1,6-二溴己烷(1.8g，7.3mmol)、碳酸钾(0.8g，5.8mmol)，抽真空通氮气，反复三次。在氮气氛围下加入无水丙酮(溶剂)50mL，80℃回流24小时，通过薄层色谱法监测，原料4-羟基四苯基乙烯用尽，视为反应结束。反应完成后，过滤除去不溶物，收集滤液，将滤液用无水Na2SO4进行干燥后在20℃下进行旋转蒸发。粗产物通过柱色谱法进一步纯化，硅胶作为吸附相，石油醚/CH2Cl2(20:1，v/v)作为洗脱剂，得到四苯乙烯衍生物(TPE-C6-Br)。
步骤3、mPEG-COOH的合成(开环反应，对mPEG-OH羧基化修饰)
在50ml圆底烧瓶中加入聚乙二醇单甲醚(mPEG-OH)(5.0g，1mmol)、丁二酸酐(2.0g，20mmol)，抽真空通氮气，重复三次。在氮气氛围下加入30mL甲苯(溶剂)中，85℃下搅拌反应16h。待反应体系冷却至室温时，过滤浓缩，在无水乙醚中重沉淀，干燥后得到甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)。
步骤4、mPEG-TK-OH的合成(酯化反应)
将步骤3制备的甲氧基聚乙二醇羧基(mPEG-COOH)(4.0g，0.8mmol)和硫缩酮(TK)(0.6g，4mmol)加入到120mL无水二氯甲烷(溶剂)中，25℃下搅拌；待固体物质完全溶解后，继续加入二环己基碳二亚胺(DCC)(1.1g，5.4mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.060g，0.5mmol)，室温反应56h；过滤后浓缩，在乙醚中重沉淀，干燥后得到mPEG-TK-OH(Mn＝5000)。
步骤5、mPEG-TK-PCL-OH的合成(开环聚合)
将步骤4制备的硫缩铜功能化的聚乙二醇(mPEG-TK-OH)(1g，0.2mmol)、ε-己内酯(ε-CL)(1.0g，8.8mmol)和诺维信435脂肪酶(Novozyme-435)(0.20g，催化剂)置于10mL烧瓶中，加入5mL甲苯(溶剂)溶液，于80℃下搅拌反应7h。所得到的聚合产物溶液溶于二氯甲烷中，过滤除去酶，将滤液浓缩后溶于四氢呋喃溶液中，用无水乙醚进行重沉淀，得到具有ROS响应的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH。
步骤6、mPEG-TK-PCL-TPE的合成(取代反应)
在一个50ml圆底烧瓶中，依次加入步骤2制备的四苯乙烯衍生物(TPE-C6-Br)(1.7g，1.4mmol)、步骤5制备的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物(mPEG-TK-PCL-OH)(3.0g，0.6mmol)和氢化钠(NaH)(0.8g，3.4mmol)溶于10mL的无水DMF(溶剂，N,N-二甲基甲酰胺)中。在85℃下搅拌16h，过滤后收集滤液，在冰甲醇中进行重沉淀。沉淀后抽滤，真空干燥箱中静置48h后备用，得到具有AIE性质的ROS响应型聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE。
步骤7、载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX的合成(物理包埋)
采用透析法制备聚合物载药胶束，具体操作如下：将5mg的盐酸阿霉素(DOX·HCl)和50mg的mPEG-TK-PCL-TPE溶于3mL二甲基亚砜(DMSO)中，完全溶解后加入300μL的三乙胺(TEA)，40℃搅拌6h。然后置于透析袋(MWCO 3500)中，在蒸馏水中透析16h，每2h换次水；冷冻干燥得到共聚物的载药胶束mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
S1，4-羟基四苯基乙烯TPE-OH的合成：用四氯化钛在四氢呋喃介质中还原，将二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮进行羰基缩合去氧得到4-羟基四苯基乙烯TPE-OH；
S2，四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br的合成：以步骤S1制备的4-羟基四苯基乙烯TPE-OH和1,6-二溴己烷为反应原料，在碱性环境下进行取代反应，得到四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br；
S3，甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH的合成：以聚乙二醇单甲醚mPEG-OH和丁二酸酐为反应原料，对mPEG-OH进行羧基化修饰，得到甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH；
S4，硫缩酮功能化的聚乙二醇mPEG-TK-OH的合成：以步骤S3制备的甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH和硫缩酮TK为反应原料，进行酯化反应，得到硫缩酮功能化的聚乙二醇mPEG-TK-OH；
S5，具有ROS响应的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH的制备：以步骤S4制备的mPEG-TK-OH和ε-己内酯ε-CL为反应原料，以Novozyme-435为催化剂，通过酶促法进行开环聚合，得到具有ROS响应的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH；
S6，具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE的制备：以步骤S2制备的四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br和步骤S5制备的聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH为反应原料，NaH为催化剂，进行取代反应，得到具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE；
S7，具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系的制备：以盐酸阿霉素DOX·HCl和步骤6制备的聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE为原料，以三乙胺TEA为缚酸剂进行物理包埋，得到具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮的摩尔比是1：1.1~2；和/或
在合成时，以锌粉作为催化剂；和/或
在合成时，保持惰性气体或氮气气体氛围。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述二苯甲酮和4-羟基二苯甲酮的摩尔比是1：1.5。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH和硫缩酮TK的摩尔比为1：3.75-7.5；和/或
进行酯化反应时，加入酯化反应缩合剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述甲氧基聚乙二醇羧基mPEG-COOH和硫缩酮TK的摩尔比为1：3.75；和/或
所述酯化反应缩合剂为二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S6中，所述四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br和聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH的摩尔比为7-21:6。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述四苯乙烯衍生物TPE-C6-Br和聚乙二醇和聚己内酯的两亲性聚合物mPEG-TK-PCL-OH的摩尔比为7:6。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S7中，所述物理包埋的具体方法为：将盐酸阿霉素DOX·HCl和步骤6制备的聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE溶解于溶剂中，加入三乙胺于室温下搅拌以便使得盐酸阿霉素DOX·HCl完全包进聚乙二醇和聚己内酯的共聚物mPEG-TK-PCL-TPE中，然后用蒸馏水透析，得到具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系mPEG-TK-PCL-TPE@DOX。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤S7中，所述DOX·HCl和mPEG-TK-PCL-TPE质量比是1：10；和/或
所述溶剂为DMSO/H2O混合溶液，所述DMSO/H2O混合溶液中，水组分含量为0-90%。
10.具有聚集诱导发光性质的活性氧响应型药物控释体系，是应用权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的。
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