发明内容:
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇嵌段生物降解聚酯梳型接枝共聚物及其制备方法和应用。本发明具有良好生物相容性、可生物降解性的多功能两亲性共聚物,是以聚乙二醇嵌段的可降解聚酯梳型接枝共聚物,可以包载疏水性药物形成药物纳米制剂,也可以作为基因的载体用于基因的负载和传递,还可以同时负载疏水性药物和基因,依据接枝侧链的性质,还具有温度敏感性、pH敏感性,可用于智能型给药体系。
本发明提供的一种聚乙二醇嵌段生物降解聚酯梳型接枝共聚物是如式(I)和(II)所示的共聚物,PEG指带有聚乙二醇链单元的聚合物,A为可生物降解聚酯的结构单元,(B)n为侧链,B是可以进行原子转移自由基聚合(ATRP)的单体单元:
可生物降解聚酯指内酯、交酯或它们的混合物的共聚物,阳离子聚合物指具有温敏性的阳离子单体的均聚物或共聚物。
所述的主链聚酯的聚合度为2~1045,(B)n侧链上n为1~450,聚乙二醇的相对分子质量为400~10000。
所述的共聚物是以PEG嵌段的含溴官能团的聚酯大分子为引发剂,通过原子转移自由基聚合接枝上聚合物侧链而制备的,其中溴为原子转移自由基聚合的活性中心,引发侧链单体聚合;所述的PEG嵌段的含溴官能团聚酯大分子是通过PEG引发γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)-己内酯与内酯、交酯或它们的混合物开环聚合制备的;内酯主要选自β-羟丁酯或β-羟戊酯、己内酯,交酯主要选自丙交酯、乙交酯。
γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)-己内酯(γ-(2-bromo-2methylpropionate)-ε-caprolactone,简写BMPC),结构如下:
BMPC结构式
所述的PEG嵌段的含溴官能团聚酯大分子的制备方法还可以是:聚乙二醇引发5-乙二醇缩酮-ε-己内酯与内酯、交酯或它们的混合物的开环聚合得嵌段共聚物,将所制备的嵌段共聚物中的5-乙二醇缩酮-ε-己内酯单元上的乙二醇保护基团脱掉,再偶联上2-溴-2-甲基丙酸-2-氨氧基乙酯;内酯主要选自β-羟丁酯或β-羟戊酯、己内酯,交酯主要选自丙交酯、乙交酯。
2-溴-2-甲基丙酸2-氨氧基乙酯(AEBMP)的结构式如下:
所述的侧链是下述单体的均聚物或共聚物:甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基甲酯、丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯、丙烯酸-N,N-二甲氨基甲酯、甲基丙烯酸-N,N-二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸-N,N-二乙氨基甲酯、丙烯酸-N,N-二乙氨基乙酯或丙烯酸-N,N-二乙氨基甲酯、N-异丙基丙烯酰胺或N-异丙基甲基丙烯酰胺、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺、N,N-二甲基甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基甲基丙烯酰胺。
所述的聚乙二醇嵌段可生物降解聚酯梳型接枝共聚物,可选的侧链是甲基丙烯酸酯、丙烯酸羟乙酯、乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、醋酸乙烯酯的均聚物或共聚物。
本发明提供的一种聚乙二醇嵌段可生物降解聚酯梳型接枝共聚物的制备方法包括的步骤是:反应器中加入PEG,BMPC、共聚的内酯或交酯以及辛酸亚锡,再至少反复三次抽真空、充氮气,密封,在搅拌下80~90℃下反应12~18h,待反应结束后,打开反应器,加入四氢呋喃溶解聚合物,将聚合物倒入0℃的正庚烷中沉淀,放入冰箱中,过夜,抽滤,真空干燥,得到PEG嵌段的含溴官能团的聚酯大分子引发剂;然后在反应器中加入聚酯大分子引发剂和2,2’-联吡啶,至少反复三次抽真空、充氮气(或氩气);迅速加入催化剂(CuBr)和侧链单体,再至少反复三次抽真空、充氮气,封管;然后在搅拌下于30~90℃恒温水浴中反应8~24h,待反应结束后,打开反应器,加入四氢呋喃溶解聚合物,用透析袋在水中透析去除催化剂,冷冻干燥,得到两亲性梳型接枝共聚物。
本发明提供的一种聚乙二醇嵌段可生物降解聚酯梳型接枝共聚物的制备方法包括的步骤是:将聚乙二醇单甲醚加入到聚合管中,加热融化,抽真空除水,室温N2保护下加入催化剂辛酸亚锡的甲苯溶液,减压抽真空除掉甲苯,N2保护下加入5-乙二醇缩酮-ε-己内酯、内酯或交酯,反复充氮气抽真空后真空封管,120~130℃反应20~30h,产物脱乙二醇保护基团后,在对甲苯磺酸催化下,与2-溴-2-甲基丙酸-2-氨氧基乙酯偶联,制备出PEG嵌段的含溴官能团的聚酯大分子引发剂;然后在反应器中加入聚酯大分子引发剂和2,2’-联吡啶,至少反复三次抽真空、充氮气(或氩气);迅速加入催化剂(CuBr)和侧链单体,再至少反复三次抽真空、充氮气,封管;然后在搅拌下于30~90℃恒温水浴中反应8~24h,待反应结束后,打开反应器,加入四氢呋喃溶解聚合物,用透析袋在水中透析去除催化剂,冷冻干燥,得到两亲性梳型接枝共聚物。
本发明所述的聚乙二醇嵌段可生物降解聚酯梳型接枝共聚物可以在水中自组装形成纳米粒,纳米粒内核疏水,外壳亲水且具有阳离子特征,可用于制备疏水性药物纳米粒,或与DNA、RNA以及多肽、蛋白类生物大分子复合形成纳米粒,也可以同时负载疏水性药物和DNA或多肽、蛋白,用于药物制剂、基因传递和转染试剂、检测和免疫制剂。
本发明所述的聚乙二醇嵌段可生物降解聚酯梳型接枝共聚物还具有温度敏感、pH敏感性,纳米粒的粒径和药物释放性质对温度和pH有较大的依赖性,可用于生物体内环境敏感性药物释放体系。所述嵌段共聚物的载药、载药/DNA或未载药/DNA纳米粒的冻干粉具有可再分散性,粒径小于1000nm。
本发明具有良好生物相容性、可生物降解性的多功能两亲性共聚物,是以聚乙二醇嵌段的可降解聚酯梳型接枝共聚物,可以包载疏水性药物形成药物纳米制剂,也可以作为基因的载体用于基因的负载和传递,还可以同时负载疏水性药物和基因,依据接枝侧链的性质,还具有温度敏感性、pH敏感性,可用于智能型给药体系。
具体实施方式:
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:
聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂(PI)制备:向Schlenk管中加入相对分子量2000的聚乙二醇单甲醚mPEG2000(2g),酒精灯加热使其融化,抽真空除水,自然冷却。然后,按单体中溴的摩尔百分含量为4.0mol%,依次加入BMPC(1.116g),共聚单体己内酯(10.944g),辛酸亚锡(2.4g),80℃下反应12h。反应结束后,用四氢呋喃溶解聚合物,将聚合物倒入0℃的正庚烷中沉淀,放入冰箱中,过夜,抽滤,干燥,得到含溴官能团的聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂PI-1。
通过改变共聚单体以及引发剂PEG的种类,调节BMPC在单体中的摩尔含量(1~100%),可以制备不同溴含量、不同相对分子质量的聚酯大分子引发剂,如表1所示。
实施例2:
在Schlenk管反应器中按化学计量比加入实施例1制备的含溴官能团聚乙二醇嵌段聚己内酯大分子引发剂PI-1(1g)、2,2’-联吡啶(bpy,27mg),加入催化剂(CuBr,13mg)和甲基丙烯酸-N,N-二甲胺基乙酯(DMAEMA,2.15g),封管。然后搅拌下于60℃恒温水浴中反应12h,待反应结束后,打开反应器,加入四氢呋喃溶解聚合物,用透析袋(Mw:8000-14000)水中透析去除催化剂,冷冻干燥,得到两亲性梳型接枝共聚物PEG-PCL-g-PDMAEMA-1,
通过核磁共振表征聚合物结构并计算相对分子质量,核磁谱图示例如图1,所制备的梳形接枝共聚物如表2所示。图1是聚酯大分子引发剂PI-1和两亲性聚酯梳型接枝共聚物PEG-PCL-g-PDMAEMA-1的分子结构示意图及它们的核磁共振谱图,图中出现了两者分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰,证明了所制备的产物的结构组成PI-1为mPEG45-P(CL86-BMPC4)、PEG-PCL-g-PDMAEMA-1的结构组成为mPEG45-PCL86-g-PDMAEMA40。图1的核磁共振谱图可以证明梳型接枝共聚物的结构并可以计算出聚合物的相对分子质量。
表1聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂
aBMPC占单体总量的摩尔百分数,即接枝度。b指聚酯段总的聚合度。
mPEG:聚乙二醇单甲醚;ePEG:聚乙二醇单乙醚;mePEG:聚乙二醇单甲酯;
CL:己内酯;LA:L-丙交酯;DLLA:D,L-丙交酯;GA:乙交酯。
实施例3:
装置与操作同实施例2,只是将聚己内酯大分子引发剂改为表1中制备的其它大分子引发剂,按表2所示的原料组成投料,制备出表2中的聚乙二醇嵌段可生物降解聚酯梳型接枝共聚物。
实施例4:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA改为N-异丙基丙烯酰胺(IPAA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得聚乙二醇嵌段可生物降解聚酯梳型接枝共聚物PEG-PCL-g-PIPAA。
表2PCL-g-PDMAEMA两亲性梳型接枝共聚物
PI∶CuBr∶BPY=1∶1∶2(摩尔比),PI为表1中的聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂,BPY为2,2’-联吡啶
实施例5:
装置与操作同实施例4,只是采用IPAA与N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)(质量比1/1)为侧链单体,采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-P(IPAA/DMAAA)(1/1)。
表3实施例4~16制备的两亲性梳型接枝共聚物
PI是表1中的聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂
实施例6:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA改为丙烯酸-N,N-二乙氨基甲酯(DEAMA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDEAMA。
实施例7:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成DMAEMA与甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基甲酯(DMAMMA)共混单体(质量比1/9),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-P(DMAEMA/DMAMMA)(1/9)。
实施例8:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯(DMAEA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDMAEA。
实施例9:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成丙烯酸-N,N-二甲氨基甲酯(DMAMA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDMAMA。
实施例10:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成甲基丙烯酸-N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDEAEMA。
实施例11:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成甲基丙烯酸-N,N-二乙氨基甲酯(DEAMMA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDEAMMA。
实施例12:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成丙烯酸-N,N-二乙氨基乙酯(DEAEA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDEAEA。
实施例13:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成丙烯酸-N,N-二乙氨基甲酯(DEAMA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDEAMA。
实施例14:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成DMAEMA与N-异丙基甲基丙烯酰胺(IPMAA)混合单体(质量比8/2),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-P(DMAEMA/IPMAA)(8/2)。
实施例15:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成N,N-二甲基甲基丙烯酰胺(DMMAA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDMMAA。
实施例16:
装置与操作同实施例3,只是将DMAEMA换成N,N-二乙基甲基丙烯酰胺(DEMAA),采用的聚己内酯大分子引发剂及用量如表3,制得PEG-PCL-g-PDEMAA。
实施例17:
装置与操作同实施例3,只是将侧链共聚单体换成DMAEMA和不同分子量的单甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯(PEGA),按表4所示的原料组成投料,制备表4梳型接枝共聚物。
实施例18
装置与操作同实施例17,只是将侧链共聚单体换成不同分子量的单甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)与DMAEMA,制备出不同侧链的两亲性梳型接枝共聚物。
把实施例1~18中的侧链共聚单体换成其它可以进行ATRP的聚合单体,改变组成,可以制备出不同侧链性质的多种聚乙二醇嵌段聚酯梳型接枝共聚物。
实施例19
将1mmol聚乙二醇单甲醚(相对分子质量5000)加入到Schlenk管中,酒精灯加热融化,抽真空除水,冷却至室温后,N2保护下加入催化剂0.5ml辛酸亚锡甲苯溶液,减压抽真空半小时,将甲苯除掉。N2保护下加入4mmol 5-乙二醇缩酮-ε-己内酯(TOSUO)、92mmol己内酯,减压抽真空半小时,中间反复充氮气抽真空。最后真空封管,130℃反应30h。将聚合物溶解在四氢呋喃中,用正己烷沉淀。重复沉淀2次。将聚合物过滤,40℃真空干燥,得到PEG-P(CL-co-TOSUO)(PECO1)。将mPEG-P(CL-co-TOSUO)的乙二醇保护基团脱保护,得到mPEG-P(CL-co-OPD)(PECO2);将0.072mmol PECO2,0.36mmol 2-溴-2-甲基丙酸-2-氨氧基乙酯(AEBMP),1.4mg对甲苯磺酸,17mL THF加入Schlenk管中,于27℃反应8h。反应结束后,旋干,用冷冻正己烷沉淀,过滤,真空干燥的产物。反复沉淀2次。获得大分子引发剂mPEG-b-P(CL-co-OPD-co-AEBMP)(PI-11)。核磁共振谱图如图2(图2实施例19制备的大分子引发剂核磁共振谱图,δ=4.3ppm左右两组峰面积相等,分别为图中-O-CH 2-CH 2-O-两处亚甲基的质子化学位移;δ=1.95ppm处的峰对应图中CH 3 -CBr-CH 3处甲基上质子的化学位移。由此可以判定,该化合物即为大分子引发剂mPEG113-b-P(CL94-co-OPD8-co-AEBMPC),验证其结构组成,mPEG113-P(CL94-co-OPD8-co-AEBMP)。
表4聚酯大分子引发剂
aAEBMP占单体总量的摩尔百分数;b指聚酯段总的聚合度。
按照实施例19方法,改变PEG、共聚单体(己内酯、丙交酯、乙交酯),按照表4所示的比例,可制备出表4中其它大分子引发剂。
表5聚乙二醇嵌段聚酯甲基丙烯酸酯类梳型接枝共聚物
PI∶CuBr∶BPY=1∶1∶2(摩尔比),PI为表1中的聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂,BPY为2,2’-联吡啶
PMMA聚甲基丙烯酸甲酯;PMA聚丙烯酸甲酯;PBMA:聚甲基丙烯酸丁酯;
PHEMA:聚丙烯酸羟乙酯;PVP:聚乙烯基吡咯烷酮;PVAC:聚醋酸乙烯酯.
实施例20
向Sclenck管中,加入PI-11(0.3g)及Bpy(6.63mg),抽真空,通氮气三次,N2保护下加入CuBr(3.1mg,0.022mmol)和甲基丙烯酸甲酯(0.34g),液氮冷却,再抽真空通氮气三次。放入80℃油浴反应12h。终止反应,加入8mL THF,完全溶解后,透析袋(截留分子量为8000)中透析两天后将透析液放入表面皿中,冷冻干燥,得到聚乙二醇嵌段聚酯梳型接枝共聚物mPEG-PCL-PMMA-1。核磁共振分析表征其结构,计算出各嵌段、侧链的相对分子质量,如图3。图3为实施例20制备的mPEG-PCL-PMMA-1的核磁谱图。δ=3.59ppm处的峰对应图中O=C-O-CH 3甲基上质子的化学位移;δ=1.03ppm和δ=0.80处的双峰对应图中-CH 2-C这个重复单元的亚甲基上质子的化学位移。在1H NMR图中,mPEG-b-(PCL-g-PMMA)各位置氢核在谱图中均有所属,由此可以判定该化合物即为设计的mPEG113-b-(PCL102-g-PMMA40)。
实施例21
将97mg PEG-PCL-g-PDMAEMA-3与3mg紫杉醇一起溶于2mL丙酮,在氮气保护下,加热至60℃蒸发2h,得到药物与共聚物的固态混合物,室温真空干燥后,将药物与共聚物的固态混合物在60℃预热至透明胶状,搅拌下加入60℃的双蒸水(或磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.6))10mL,形成药物纳米粒水分散液,离心分离,清液冷冻干燥得PEG-PCL-g-PDMAEMA-3载药纳米粒冻干粉PMT1,粒径如图4(A)。将97mg PEG-PCL-g-PDMAEMA-1与3mg紫杉醇一起溶于2mL丙酮,采用同样的方法制备载药纳米粒冻干粉PMT2。两种纳米粒冻干粉的水分散液(1%)的粒径分布如图4(B)所示,粒径小于1μm。
精确称取4mgPMT1或PMT2,置于透析袋内,用2mL配制好的PBS分散PMT1或PMT2。将密封好的透析袋置于28mL PBS中,于37℃,磁力搅拌下进行体外释放实验。每2小时取20mL释放液,并补充20mL新鲜的PBS,即置换量为20mL。用HPLC检测取出的释放液中的紫杉醇含量,再计算累积释放量,结果如图5。
累计是放量的计算公式如下:
(1)
式中Fr:药物累积释放量,%;Ve:PBS的置换体积,20mL;V0:释放液PBS的体积,30mL;Ci:第i次置换取样时释放液中药的浓度,μg/mL;mdrug:用于释放的载药胶束中紫杉醇的质量,μg;n:置换PBS的次数。
实施例22
将PEG-PCL-g-PDMAEMA-1、PEG-PCL-g-PDMAEMA-3、PEG-PCL-g-PDMAEMA-6、pEGFP-N1质粒DNA分别用PBS(pH7.4)溶解稀释(约1μg/100μL),按照N/P比(聚合物中的氮与DNA中的磷原子含量的摩尔比)为10/1、20/1、30/1的比例,将聚合物的稀释液逐滴加入到pEGFP-N1质粒DNA的稀释液中,边加边振荡,使之充分混匀,形成复合物,室温放置20min,光散射仪测定复合物的粒径,如图6。
培养板中种植HEK 293胚肾细胞,加入含10%小牛血清的DMEM细胞培养液培养。生长到70~80%融合时,移去培养基,再加入无血清培养基,然后将上述制备的DNA复合物溶液加到培养板中,混匀,将细胞置于培养箱培养4h后,将培养基换成含血清的培养基,继续培养24h,用流式细胞仪检测EGFP阳性细胞比例。结果如图7。图7是载有3%紫杉醇的PEG-PCL-g-PDMAEMA-3纳米粒(PMT1)以及PEG-PCL-g-PDMAEMA-1纳米粒(PMT2)的体外药物释放结果。可见,纳米粒能够较好地控制药物缓释。
实施例23
按实施例21方法,采用PEG-PCL-g-PMMA-1负载紫杉醇,制备载药纳米粒PMT3,纳米粒的水分散液(1%)的粒径分布如图8所示,药物释放曲线如图9。