CN105358172A - 源自产甲酸草酸杆菌的促分泌素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促分泌素化合物，所述促分泌素化合物源自草酸盐降解细菌，用于治疗对象中草酸盐相关的疾病和/或草酸盐相关的失衡，其中施用所述促分泌素导致所述对象中尿草酸盐和/或血浆草酸盐减少。本发明还涉及一种包含这种促分泌素化合物的药物组合物、一种对患有草酸盐相关疾病的对象进行治疗的方法、以及一种用于制备促分泌素的方法。

Description

源自产甲酸草酸杆菌的促分泌素
技术领域
本发明涉及一种鉴定到的源自草酸盐降解细菌的促分泌素化合物。本发明还涉及一种对需要的对象进行治疗的方法，其中所述方法包括施用药物组合物以减少对象中存在的草酸盐，所述药物组合物包含源自草酸盐降解细菌的一种或多种促分泌素并且还包含或不含一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合。本发明还包括制造足够量的用于鉴定和预期用途的促分泌素的方法。
背景技术
草酸盐是弱酸盐且是通过肾排泄的代谢终产物。由于草酸盐作为游离的草酸盐和作为草酸钙晶体两者都倾向于损害肾实质细胞，因此，人和动物中紊乱的草酸盐动态平衡可以造成严重病症；由此，在许多情况中造成不可逆的损害。草酸盐动态平衡因诸如原发性高草酸尿(PH)的先天性障碍而严重紊乱。
原发性高草酸尿(PH)是一种罕见的常染色体隐性遗传的乙醛酸代谢先天性障碍，发病率为百万分之0.1～0.2。I型PH是因肝脏特定的过氧化物酶体丙氨酸/乙醛酸转氨酶(AGT)的活性不足或缺失造成的。在某些患者中，酶存在但错误地靶向线粒体，在线粒体中它被代谢失活。
II型PH是因乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)的酶活性不足而发生的。两种类型的PH的特征都在于从出生就存在严重的高草酸尿。患者经历复发的草酸钙尿石病、肾钙沉着症和进行性肾衰竭。
对于治疗I型PH或II型PH中酶缺陷或酶功能障碍来说，没有批准的疗法。目前的PH疗法涉及降低草酸盐的产生或提高草酸钙的尿溶解度以保护肾脏功能。通过镁、柠檬酸盐和正磷酸盐的补充以提高草酸钙的尿溶解度来对患者进行治疗。吡哆醇是缺陷型AGT的辅助因子且吡哆醇的药理学剂量可以降低患有I型PH的少数患者内的尿草酸盐水平。最终仅有的治愈性疗法是组合的肾和肝移植。
继发性高草酸尿包括草酸盐相关的病症，例如但不限于，高草酸尿、吸收性高草酸尿、肠源性高草酸尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石病)、外阴痛、与终末期肾病相关的尿酸盐沉积症、心脏传导障碍、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎以及由胃肠道手术、减肥手术(用于肥胖症的手术)和/或抗生素治疗造成的/与它们相关的障碍/病症。肾/尿道结石疾病(尿石病)是全球范围内的主要健康问题。与尿石病相关的大部分结石由单独的草酸钙或草酸钙与磷酸钙构成。
肾或尿道结石疾病在西方国家中发生在多达12％的人口中且约70％的这些结石由草酸钙构成或由草酸钙和磷酸钙构成。某些个体(例如患有肠道疾病如克罗恩病、炎性肠病或脂肪泻的患者以及还有经历了空肠回肠(jejunoileal)或Roux-en-Y旁路手术的患者)在其膳食中比其他个体吸收更多的草酸盐。对于这些个体，草酸盐尿石病的发病率明显更高。
草酸盐动态平衡是一个复杂的过程，尚未完全搞清楚，包括许多不同的身体器官和机理。哺乳动物的肾以及肠道充当排泄途径，因此降低了体内草酸盐的浓度。然而，通过肾排泄草酸盐，造成了肾实质细胞存在毒物学影响的风险和以肾结石的形式形成晶体的风险。由于被动和主动两种草酸盐转运(Hatch和Freel,2004；Freel等,2006)以及与定植的草酸盐降解细菌的共生关系，哺乳动物的肠道由此在草酸盐控制方面发挥主要作用。
先前已经报道，包含产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)(这是一种利用草酸作为其唯一能量源的非致病专性厌氧细菌)的高度浓缩的冻干粉末能够用于减少血浆和尿中的草酸盐(美国专利号：6,200,562B1；美国专利号：6,355,242B1)。已经对草酸盐的降解机理进行了表征，所述机理涉及三种独特的蛋白质：草酸盐:甲酸盐膜转运蛋白、草酰基-CoA脱羧酶(OXC)和甲酰基-CoA转移酶(FRC)。草酸盐降解蛋白的非常高的表达及其独特的动力学性质使得产甲酸草酸杆菌成为已知的最有效的草酸盐降解系统之一。
产甲酸草酸杆菌是脊椎动物中健康的肠道微生物群的一部分，并因此显著参与草酸盐动态平衡过程。在机理上，产甲酸草酸杆菌增加草酸盐在胃肠道中的降解，创建合适的跨上皮梯度，并促进草酸盐的被动肠消除。对于本领域技术人员来说，平衡的肠道微生物群的重要性是众所周知的，另外还已知的是，微生物学领域的发展已经证实了人类肠道中细菌促分泌素的影响的许多病例。例如，霍乱弧菌(VibrioCholerae)和产肠毒素的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)产生促分泌素化合物，简单地说，所述促分泌素化合物引起离子的外流并随后引起体液进入肠腔而导致腹泻(Flores,J.,Sharp,G.W.,1976；Field,M.,Graf,L.H.等,1978)。其他肠道定植菌通过促分泌素的作用而诱发粘蛋白分泌过多(例如Navarro-Garcia,F.等,2010,Caballero-Franco,C.等,2006)。
近来对SLC26(溶质连接的载体)基因家族进行了鉴定(Mount,D.B.等,PflugersArch.2004；447(5):710-721；Soleimani,M.,Xu,J.,Seminarsinnephrology.2006；26(5):375-385)。该基因家族编码结构相关的阴离子转运蛋白：SLC26A1(SAT1)、SCL26A2(DTDST)、SLC26A3(DRA)、SLC26A6(PAT1或CFEX)、SLC26A7和SCL26A9，所述转运蛋白具有可测量的草酸盐亲和性并在GI道内被发现。另外，在汇合后和汇合的Caco-2单层中分别观察到了SLC26A1和SCL26A2(Hatch,M.等,NIHOxalosisandHyperoxaluriaWorkshop,2003；Morozumi,M.等,KidneyStones:Inside&Out.HongKong:2004,Pp.170-180)。尽管取得了这些目前的进展，但关于对离子在上皮膜上的复杂平衡、不同草酸盐转运蛋白的作用以及它们对高草酸盐病症产生何种影响仍存在许多问题(Hassan,H.A.,AmJPhysiolCellPhysiol,302:C46-C58,2012；Aronson,P.S.,JNephrol2010；23(S16):S158-S164)。
具有草酸盐亲和性的许多转运蛋白也对其他底物表现出亲和性并通常与细胞内的酸-碱平衡相联系；例如：在瓜蟾卵母细胞中所表达的DRA是一种Cl-碱交换剂(Chernova,M.N.等,JPhysiol,549:3,2003)且研究表明SO4 2-是另一种底物(Byeon,M.K.等,ProteinExprPurif,12:67,1998)；在瓜蟾中所表达的小鼠PAT-1对Cl-HCO3 -、Cl-Ox2-、SO4 2-Ox2-表现出不同的亲和性(XieQ.等,AmJPhysiolRenalPhysiol283:F826,2002)；且SLC26A4基因编码Cl-甲酸盐交换剂(Morozumi,M.等In:GohelMDI,AuDWT(eds)Kidneystones:insideandout.HongKong,p.170)。对草酸盐不具有亲和性的许多其他转运蛋白具有与草酸盐转运蛋白相同的底物，例如：Na+/K+腺苷三磷酸酶、Na+/H+交换剂(NHE)、Na+-K+-2Cl-共转运蛋白(NKCC)以及基底外侧的K+通道和顶部的Cl-通道如囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)(Venkatasubramanian,J.等,CurrOpinGastroenterol,26:123-128,2010)。Na+、Cl-、K+、HCO3 -的调节通过所列出的这众多转运蛋白的相互作用和调节而在肠道内是高度协调的，因为其也决定了水的运动。
在诸如WO2007070052A2、Hoppe等(NephrolDialTransplant,2011,26:3609-3615)和US20050232901A1的现有技术中已经对几种降低草酸盐的药物制剂进行了描述。其中包括肠溶包衣的组合物或其它组合物，所述组合物包含已被建议作为降低草酸盐浓度的手段的草酸盐降解细菌或酶。利用这种治疗的目的是使得患者获得更低或正常化的尿草酸盐水平。
此外，WO2005097176A2描述了包含能够存活的产甲酸草酸杆菌和/或其裂解物的组合物。所述组合物可用于治疗患有肾衰竭的动物对象。
发明内容
本文中描述的发明涉及源自草酸盐降解细菌的促分泌素组分或促分泌素化合物，其在哺乳动物的肠道内产生直接或间接效应。所述效应涉及草酸盐通过草酸盐的被动流出和/或主动转运的促进而穿过肠道上皮的交换。本发明还描述了产生足够量的用于高草酸尿疗法中的鉴定、分析和预期用途的这种促分泌素组分的制造方法。
由于离子和转运蛋白在肠道内复杂的多组分相互作用、每种转运蛋白识别多种底物、以及取决于不同离子平衡的被动和主动流出，所以重要的是指出，从下面这个意义上说，促分泌素效应可能是间接的：鉴定到的促分泌素化合物可能通过标称离子平衡和稳态的改变来发挥其效应并由此改变草酸盐离子的流出。
产甲酸草酸杆菌是天然存在的草酸盐降解细菌，存在于脊椎动物的GI道内，其在所述GI道内参与与哺乳动物宿主的复杂共生。利用产甲酸草酸杆菌进行的研究表明，当定植在大鼠和小鼠的肠道内时，通过诱发草酸盐从肠胃外位点到肠腔的经上皮流出，能够促进草酸盐的肠消除。此外，将产甲酸草酸杆菌施用于患有终末期肾病的人类对象表明，显著降低血浆的草酸盐(WO2005123116A2)。这些发现支持发明人在理论上的概念，即，分泌的化合物以有利于产甲酸草酸杆菌在人类和啮齿动物的肠道内存活的方式影响肠上皮细胞。
对制造和使用潜在促分泌素的大规模方法进行了探索，这导致鉴定到具有所提出的促分泌素效应的蛋白质化合物和如本文中所描述的发明。由于许多蛋白质以较低的量存在，所以大规模的制造方法和随后的纯化和分离使得鉴定变得可能。据我们(本发明人)的知识所最佳了解的，目前本领域中未鉴定到关于产甲酸草酸杆菌的所描述的促分泌素化合物且这是对其分离并鉴定以用于高草酸尿治疗的首次尝试。
根据本发明人的研究，已经在足以鉴定的规模下制造了由产甲酸草酸杆菌产生的化合物，所述化合物据预期造成诱发的分泌通量。已经对所述化合物(促分泌素)进行了纯化和表征。
由此，本发明还提供一种分离足够量的用于鉴定和在高草酸尿治疗中的预期用途的促分泌素的方法。促分泌素的分离和富集能够与草酸盐降解细菌的分离组合；由此产生的方法涉及草酸盐降解细菌的收获以及由草酸盐降解细菌在发酵期间分泌的化合物的富集两方面。
源自产甲酸草酸杆菌的促分泌素化合物被鉴定为单独或一起对哺乳动物肠道内的草酸盐流出产生直接或间接影响的一种或多种促分泌素蛋白质和肽，所述促分泌素化合物应以足以用于鉴定和用于高草酸尿治疗的量产生。鉴定的化合物从细菌细胞中分泌出来，或被维持在细胞内并在细胞死亡后释放入培养介质中。细胞死亡是细胞培养物生长期间的一个连续过程；因此，从不含细胞的培养介质中鉴定到的具有提出的促分泌素效应的蛋白质或其他化合物不可能固有地为分泌的化合物。
促分泌素化合物在需要辅助因子的反应中在肠道内发挥其组合的或单独的效应。因此，如果对于在哺乳动物肠道内发挥促分泌素积极效应来说是必要的，一种或多种辅助因子(例如：NAD+、NADP+、FAD、CoA、ATP、ADP等)与一种或多种促分泌素的组合也被包括在本发明内。
促分泌素化合物通过改变其他化合物如离子和小有机化合物的标称通量而间接发挥其组合的或单独的促分泌素效应并由此造成草酸盐通量变化。因此，本文中所提及的促分泌素化合物的间接效应也被包括在本发明内，所述促分泌素化合物通过例如离子或小有机化合物的通量的变化而间接改变草酸盐的通量。
以与草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合组合的方式可以提高促分泌素化合物的效应。因此，如果对于在哺乳动物肠道内发挥促分泌素积极效应来说是必要的，一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物与一种或多种促分泌素的组合也被包括在本发明内。
本文中还公开了通过肠消除来除去外源和/或內源草酸盐的方法，所述方法包括将促分泌素自身或与草酸盐降解酶、草酸盐降解细菌、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物一起施用于需要除去草酸盐的哺乳动物对象。
一种或多种促分泌素与草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物的组合施用，确保了刺激草酸盐通量以提高草酸盐在肠腔方向上的转运以及草酸盐在整个胃肠道内更多的降解两方面。
因此，本发明涉及包含一种或多种鉴定到的组分或促分泌素的药物组合物，所述组分或促分泌素源自重组表达的或从调节的介质提取的草酸盐降解细菌，与或不与一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合一起施用于患者。
所述药物组合物包含有效量的促分泌素。促分泌素的有效量包括通过分泌到肠道中来降低全身存在的草酸盐的比例的量。可以单独或以与草酸盐降解细菌和/或酶组合的方式用于单剂量组合物中的量可以在约10μg～1000,000μg、约100μg～100,000μg、约1mg～100mg的范围内以及在其中所涵盖的所有范围内。
这种药物组合物可以耐受胃酸的降解。所述组合物可以为例如片剂、胶囊或球的形式，任选地具有肠溶包衣或对在胃和上部小肠中的降解提供耐受性的其他机构。
本发明还涉及一种对需要的对象进行治疗的方法，其中所述方法包括施用有效量的源自于草酸盐降解细菌或由草酸盐降解细菌产生的促分泌素化合物或包含所述促分泌素化合物的药物组合物，以降低对象中存在的草酸盐，所述促分泌素化合物与或不与一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合一起施用。促分泌素的有效量包括通过分泌到肠道中来降低全身存在的草酸盐的比例的量。可以单独或以与草酸盐降解细菌和/或酶组合的方式用于单剂量组合物中的量可以在约10μg～1000,000μg、约100μg～100,000μg、约1mg～100mg的范围内以及在其中所涵盖的所有范围内。
由此，本发明提供一种源自草酸盐降解细菌例如源自产甲酸草酸杆菌的促分泌素(下文中将更详细地定义)，用于治疗对象中草酸盐相关的疾病和/或草酸盐相关的失衡(下文中将更详细地定义)，其中促分泌素的施用导致对象中尿草酸盐和/或血浆草酸盐减少。
根据本发明，草酸盐相关疾病可以选自：原发性高草酸尿、高草酸尿、吸收性高草酸尿、肠源性高草酸尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石病)、外阴痛、与终末期肾病相关的尿酸盐沉积症、心脏传导障碍、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎以及由胃肠道手术、减肥手术(用于肥胖症的手术)和/或抗生素治疗造成的/与它们相关的障碍/病症。
根据本发明，所述促分泌素可以包含氨基酸序列，其具有促分泌素活性并与SEQIDNO:1～19中任一项的氨基酸序列具有至少85％如90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
所述促分泌素可以被重组表达在合适的有机体中或提取自调节的介质。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种如上所述的促分泌素，任选地还包含一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶(下文中将更详细地定义)、草酸盐代谢中所涉及的酶(下文中将更详细地定义)、辅助因子(下文中将更详细地定义)、底物(下文中将更详细地定义)或其组合。
所述药物组合物可以被配制成具有经肠、肠胃外或局部施用途径。
本发明还提供一种对患有草酸盐相关疾病的对象进行治疗的方法，所述方法包括将源自草酸盐降解细菌的促分泌素施用于所述对象，其中所述促分泌素的施用导致对象中尿和/或血浆草酸盐减少。
在所述方法中，所述促分泌素可以包含氨基酸序列，其具有促分泌素活性并与SEQIDNO:1～19中任一项的氨基酸序列具有至少85％如90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
所述方法还包括将一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合施用于所述对象。
在所述方法中，草酸盐相关疾病选自：原发性高草酸尿、高草酸尿、吸收性高草酸尿、肠源性高草酸尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石病)、外阴痛、与终末期肾病相关的尿酸盐沉积症、心脏传导障碍、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎以及由胃肠道手术、减肥手术(用于肥胖症的手术)和/或抗生素治疗造成的/与它们相关的障碍/病症。
本发明还提供一种制备如上所述的促分泌素的方法，所述方法包括：
i)将草酸盐降解细菌如产甲酸草酸杆菌接种到温度平衡的选择性生长介质中，所述生长介质特定地用于利用草酸盐作为唯一碳源的微生物，所述生长介质包括作为碳源的草酸盐、必需的痕量金属以及在厌氧条件下的氨基酸；
ii)例如通过使用瓶口和无菌气体的压力，经由不透空气的管来置换液体，将细胞培养物在厌氧条件下的容器之间如厌氧瓶之间或厌氧瓶与发酵罐之间转移；
iii)收获细胞悬浮液，并通过使用例如切向流过滤对所述细胞悬浮液进行处理以从悬浮液分离全细胞和碎片，由此得到不含细胞的渗透物；
iv)例如通过使用中空纤维对所述不含细胞的渗透物进行过滤以得到渗余物，所述中空纤维选择性除去<10kDa的化合物和希望减少的肽；
v)通过使用例如液相色谱、电泳、沉淀、超离心和/或浓缩离心柱从所述渗余物分离一种或多种促分泌素。
特别地，本发明提供一种源自草酸盐降解细菌例如源自产甲酸草酸杆菌的促分泌素，其用于治疗对象中草酸盐相关的疾病和/或草酸盐相关的失衡，其中促分泌素的施用导致对象中尿草酸盐和/或血浆草酸盐减少，其中所述促分泌素化合物包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有促分泌素活性并与SEQIDNO:3、4、6、13和19中任一项的氨基酸序列具有至少85％如90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。本发明还提供包含这种促分泌素的药物组合物。此外，本发明提供：一种治疗患有草酸盐相关疾病的对象的方法，其包括将如上所述的促分泌素施用于所述对象；以及一种制备这种促分泌素的方法。
附图说明
图1A～E：用于重组表达的产甲酸草酸杆菌的潜在的促分泌素蛋白质的SDS-PAGE凝胶(左)和Western印迹(右)。将牛血清白蛋白(2μg)用作对照(泳道1)。在SDS-PAGE凝胶上的靶蛋白在泳道2中示出，且在Western印迹上的靶蛋白在泳道3中示出。梯度重量被显示在各自分析图像的右侧。M1＝蛋白质标记物Genscript目录号M00505。M2＝蛋白质标记物Genscript目录号MM0908。
图1A：SEQIDNo.3表达的蛋白质分析。
图1B：SEQIDNo.4表达的蛋白质分析。
图1C：SEQIDNo.6表达的蛋白质分析。
图1D：SEQIDNo.13表达的蛋白质分析。
图1E：SEQIDNo:19表达的蛋白质分析。
图2：显示在0～30分钟的首次通量时间段期间标记的草酸盐(C14草酸盐)的通量的柱形图。带条纹的柱描绘了粘膜到浆膜的通量(M-S通量)，且填充的柱描绘了浆膜到粘膜的通量(S-M通量)。在横轴上，G1～G3表示三组治疗，G＝组。误差柱＝±SEM(平均值的标准误差)。竖轴显示了14C草酸盐，单位为μmol·cm2·h。
图3：显示在30～60分钟的二次通量时间段期间标记的草酸盐(C14草酸盐)的通量的柱形图。带条纹的柱描绘了粘膜到浆膜的通量(M-S通量)，且填充的柱描绘了浆膜到粘膜的通量(S-M通量)。在横轴上，G1～G3表示三组治疗，G＝组。误差柱＝±SEM(平均值的标准误差)。竖轴显示了14C草酸盐，单位为μmol·cm2·h。
定义
用于本文中的所有术语都意欲具有本领域中通常所赋予它们的含义。为了清晰起见，下面还对一些术语进行了定义。
促分泌素
促分泌素是一种直接或间接促进另一种物质、组分或化合物的分泌的物质、组分或化合物。促分泌素可以是肽、激素、蛋白质或小分子。本文中的单词促分泌素被用于鉴定到的蛋白质化合物，其在哺乳动物体内具有提出的促分泌素效应。
本文中所述的促分泌素分离自产甲酸草酸杆菌细胞培养悬浮液的上清液，因此可以源自分泌过程或细胞死亡和裂解促进的释放。
分泌的化合物和提出的促分泌素被表征为分子量在8.8～98.8kDa范围内的蛋白质，其中>50％的化合物在30～50kDa的跨度内。在十九种蛋白质中，十三种是酶且剩余的六种是不具有已知催化功能的蛋白质。在这六种蛋白质中，一种蛋白质被定义为“保守的假定蛋白质”，即这种蛋白质存在于来自几种系统发育谱系的有机体内，但还未在功能上对其进行表征。将这六种蛋白质中的另一种蛋白质定义为“预测的蛋白质”。这是出于词条输入(entry)使用的，而没有在蛋白质、转录或同源性水平的证据。鉴定到的提出的促分泌素的氨基酸序列在实施例4中示出，序列ID为：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4等直至最后一个即SEQIDNO:19。
与氨基酸序列ID：SEQIDNO:3、4、6、13和19相对应的五种蛋白质被重组表达在大肠杆菌中并在尤斯(Ussing)室内在大鼠肠道组织上对标记的草酸盐的促分泌素活性进行了筛选。表达的所有重组蛋白质都显示出比对照物更低的总体草酸盐通量。特别地，一种蛋白质即SEQIDNO.3具有增加标记的草酸盐在大鼠末梢肠道组织上的净分泌的效应。
本文中还从稳定性(不稳定性指数II)、热稳定性(对于球状蛋白质：脂族指数)和溶解度(GRAVY，总平均疏水性(GrandAverageofHydropathy))角度对分泌的化合物进行了描述，参见实施例5。根据指数(得分>40)，三种蛋白质被预测为不稳定的：丝氨酸羟甲基转移酶、酰基载体蛋白质、核黄素合酶β亚基。另外，对促分泌素的氨基酸序列的潜在的信号肽切割位点进行了研究(参见实施例6)。
调节的介质
调节的介质是用于生长特殊有机体的生长介质。术语“调节的”是指有机体已经利用原始介质组合物的组分进行生长和代谢并释放其代谢和基因表达产物这一事实。调节的介质还包含且是指在培养物生长所固有的连续细胞死亡和裂解后所释放的代谢和基因表达产物。调节的介质还被称为不含细胞的培养悬浮液。本文中所述的调节的介质源自具有实施例1中所述组成的未调节的介质。这种未调节的介质是出于产甲酸草酸杆菌生长以及由此伴随的促分泌素的制备的独特目的而特别开发的专用介质，且包含草酸盐作为主要碳源。
草酸盐降解酶
术语“草酸盐降解酶”应解释为能够减少草酸盐的任意酶，并包括草酸盐脱羧酶、草酸盐氧化酶、甲酰基-CoA转移酶和草酰基-CoA脱羧酶。其本身可减少草酸盐和/或其可以在草酸盐减少通路中发挥作用。在本文中，术语“草酸盐”包括草酸和/或其任意盐。
草酸盐代谢中所涉及的酶
术语“草酸盐代谢中所涉及的酶”应解释为在与草酸盐代谢相关的通路中发挥作用的任意酶，并包括丙氨酸-乙醛酸转氨酶(AGT)、乙醛酸还原酶(GR)和4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(HOGA)。
辅助因子
术语“辅助因子”应解释为酶的活性所需要的非酶化合物，且包括维生素B6、NAD+、NADP+、FAD、CoA、ATP和ADP。
底物
术语“底物”应解释为酶催化反应的进入化合物，并包括草酸盐、乙醛酸和4-羟基-2-酮戊二酸等。
草酸盐相关的疾病和/或草酸盐相关的失衡
术语“草酸盐相关的疾病和/或草酸盐相关的失衡”应解释为因全身草酸盐水平失衡而造成或实现的疾病，且包括原发性高草酸尿、高草酸尿、吸收性高草酸尿、肠源性高草酸尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石病)、外阴痛、与终末期肾病相关的尿酸盐沉积症、心脏传导障碍、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎以及由胃肠道手术、减肥手术(用于肥胖症的手术)和/或抗生素治疗造成的/与它们相关的障碍/病症。
发明详述
本文中所述的发明涉及从不含细胞的培养悬浮液鉴定到的一种或多种蛋白质促分泌素，所述培养悬浮液源自产甲酸草酸杆菌培养物。鉴定到的蛋白质促分泌素对人或动物的肠道中草酸盐的转运产生影响。由鉴定到的蛋白质促分泌素产生的上述提出的影响是来自一种鉴定到的蛋白质促分泌素或来自两种鉴定到的促分泌素、三种鉴定到的促分泌素、四种鉴定到的促分泌素、五种鉴定到的促分泌素或六种以上鉴定到的促分泌素的组合的作用的结果。当按本文中所述施用时，鉴定到的化合物可以在动物或人的肠内产生积极效应，这将积极影响如本文中所述的关键病症。
在动物或人的肠道内由一种或多种产甲酸草酸杆菌来源的促分泌素的作用所产生的效应可能需要多种辅助因子。因此，潜在的辅助因子也应认为被包括在本发明内，所述辅助因子确保以与一种或多种促分泌素组合的方式对肠内的草酸盐通量产生积极效应。如上所述，对于促分泌素在动物或人的肠道内产生积极作用来说可能必需的辅助因子包括但不限于：NAD+、NADP+、FAD、CoA、ATP、ADP。
通过包括一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合，可以提高动物或人的肠道内由一种或多种产甲酸草酸杆菌来源的促分泌素的作用所产生的效应。因此，当与一种或多种促分泌素组合时能够确保对肠内的草酸盐通量产生积极效应的一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合应也应认为被包括在本发明内。
可以提高促分泌素效应的草酸盐降解细菌优选为产甲酸草酸杆菌。
可以以与一种或多种促分泌素组合的方式提高总体效应的草酸盐降解酶包括但不限于草酸盐脱羧酶、草酸盐氧化酶、甲酰基-CoA转移酶和草酰基-CoA脱羧酶。
可以以与一种或多种促分泌素组合的方式提高总体效应的草酸盐代谢中所涉及的酶包括但不限于丙氨酸-乙醛酸转氨酶(AGT)、乙醛酸还原酶(GR)和4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(HOGA)。
上述辅助因子包括但不限于维生素B6、NAD+、NADP+、FAD、CoA、ATP和ADP。在药物组合物中所提及的底物包括但不限于草酸盐、乙醛酸、4-羟基-2-酮戊二酸等。
促分泌素化合物可以通过改变其他化合物如离子和小有机化合物的标称通量而间接发挥其组合的或单独的促分泌素效应并由此造成草酸盐通量变化。例如，在本领域内已知的是，具有草酸盐亲和性的转运蛋白也对其他小化合物或离子表现出亲和性。为了描述且不限制本发明的范围，那些离子和小化合物包括但不限于：碳酸盐、硫酸盐、氯化物、钠和甲酸盐等。因此，通过改变这些离子和小化合物的平衡，可以改变草酸盐的通量。由此，本文中所提及的促分泌素化合物的间接效应也被包括在本发明内，所述促分泌素化合物通过例如离子或小有机化合物的通量的变化而间接改变草酸盐的通量。
单独或以与其他鉴定到的促分泌素、草酸盐降解细菌、酶、辅助因子和/或底物组合的方式对动物或人肠道内的草酸盐转运产生直接或间接效应的鉴定到的蛋白质促分泌素包括：丙醇半醛还原酶、半胱氨酸合酶A、酰基载体蛋白质、预测的蛋白质(登录号：gi|237749499)、甲硫氨酸腺苷转移酶1、YgiW蛋白质、核黄素合酶β亚基、烷基氢过氧化物还原酶/硫醇特异性抗氧化剂/mal过敏原、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶、延伸因子Tu、s-腺苷高半胱氨酸水解酶、保守的假定蛋白质(登录号：gi|237747886)、二氨基庚二酸脱氢酶、丝氨酸羟甲基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、苹果酸酶、顺乌头酸水合酶1、热休克蛋白70样蛋白质。根据本发明的促分泌素是包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有促分泌素活性并与SEQIDNO:1～19中任一项的氨基酸序列具有至少85％如90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在不限制本发明范围的条件下，应注意，在分析氨基酸序列之后，所述YgiW蛋白质(登录号：gi|237748090)被预测为在氨基酸编号28和29(ASA-QY)之间具有信号肽切割位点。蛋白质上的信号肽具有将蛋白质靶向细胞内部(特定的细胞器)或外部的特定位置的目的。分泌蛋白质和膜蛋白质也使用信号肽进行定位。
另外，在不影响本发明的范围的条件下，应注意，鉴定到的一种蛋白质(YgiW：登录号：gi|237748090)的计算的pI高达9.33。这个pI意味着蛋白质在生理pH下具有净正电荷。众所周知，大多数的生物表面携带净负电荷；因此，蛋白质的高净正电荷支持与生物表面或生物膜相互作用的功能。可能的是，支持潜在的促分泌素化合物与生物表面的相互作用的任意物质都有助于由其促进的分泌过程。
由鉴定到的蛋白质促分泌素单独或与其他鉴定到的促分泌素、细菌、酶、辅助因子和/或底物组合的方式对动物或人的肠道内的草酸盐转运所产生的提出的效应包括但不限于：与膜蛋白质或膜转运蛋白的直接或间接的相互作用；与上皮细胞内的表达因子或上皮细胞的基因组的间接的相互作用。上面所指的膜转运蛋白可以包括但不限于：SLC26A1(SAT1)、SCL26A2(DTDST)、SLC26A3(DRA)、SLC26A6(PAT1或CFEX)、SLC26A7和SCL26A9。此外，所述相互作用可以是任何调制，即包括但不限于如下的任意活动：增加、增强、激动、促进、减少、降低、抑制、阻断或拮抗。
分离方法
本发明提供一种产生促分泌素的方法。本发明还提供一种在低产品损失下分离促分泌素的方法。促分泌素的产生包括在一个、两个、三个、四个或更多的步骤中以任意组合的方式使用小瓶、厌氧瓶或发酵罐的种子培养(seedtrain)。使用的介质组合物、生长条件、发酵时间、收获和过滤步骤都是在实施例1和2中所描述的并被包括在本发明中用于产生促分泌素。本领域技术人员认为合理的任意其他添加、减少或普通替代也落在本发明下。
用于产生促分泌素的发酵方法可以包括为了通过使用不同诱发手段诱发产甲酸草酸杆菌生产促分泌素所进行的修改，所述不同诱发手段例如为改变的或更低的草酸盐浓度、改变的对甲酸盐的暴露或甲酸盐的浓度、和/或其他形式的应力诱发。本领域技术人员认为合理的对所述方法的这种诱发修改或用于促进活性促分泌素分泌的其他诱发手段被认为包括在本发明内。
促分泌素的分离优选使用切向流过滤(TFF)和中空纤维过滤步骤，但可以包括本领域技术人员认为合理的分离蛋白质物质的其他通常使用的方法。
促分泌素的分离和富集可以与草酸降解细菌的分离组合；由此产生的方法涉及草酸盐降解细菌的收获以及由草酸盐降解细菌在发酵期间所分泌的化合物的富集两者。该方法包括但不限于诸如以下的方法：离心法、TFF法、中空纤维法和本领域技术人员认为合理的细胞收集、过滤和浓缩的其他方法。
鉴定到的促分泌素也可以被重组表达。重组表达的蛋白质可以来源于与SEQIDNO:1～19的序列具有至少85％的序列同一性的天然提取的或合成的基因序列。蛋白质同系物和变体包括但不限于：多态性变体和天然或人工突变体、其中一个或多个残基被修饰的修饰多肽、和包含一个或多个修饰残基的突变体。突变包括但不限于核酸的截短、缺失、取代或添加突变。
重组酶可以被表达在蛋白质表达领域的技术人员已知的多种宿主内，包括但并不表示限于：大肠杆菌、乳杆菌(Lactobacillusspp)、芽孢杆菌(Bacillusspp)等。
对于酶或蛋白质的重组生产来说，宿主应包含含有酶或蛋白质或其功能片段的质粒、载体、噬菌体或者转录或表达盒形式的构建物。可以获得多种构建物，包括维持单拷贝或多拷贝的构建物。许多重组表达系统、组分和重组表达用试剂可商购获得，例如来自InvitrogenCorporation(Carlsbad,Calif.)；U.S.Biological(Swampscott,Mass.)；BDBiosciencesPharmingen(SanDiego,Calif.)；Novagen(Madison,Wis.)；Stratagene(LaJolla,Calif.)；以及DeutscheSammlungvonMikroorganismenandZellkulturenGmbH(DSMZ)(Braunschweigh,Germany)。
异源启动子，包括组成性和/或诱导性启动子，任选地控制蛋白质的重组表达。启动子如T7或其他启动子适用于宿主，并且对本领域技术人员来说是熟知的。启动子可还源自草酸杆菌属。
酶或蛋白质的重组核酸序列可以包括用于表达蛋白质之外的目的的核酸，包括但不限于用于纯化目的、折叠目的等。其实例为：分泌序列、信号序列、连接子、表达控制元件、亲和性标签等。从这些核酸序列产生的氨基酸可以或可以不在蛋白质表达后除去。上述所有构建物都可用于酶和蛋白质的表达，用于本文中所述的方法中。
利用如上所述的选择的表达系统转化/转染宿主细胞。用本领域技术人员已知的方法培养细胞，这包括在摇瓶和发酵罐中的液体培养以及在板中的固体培养等。
可以在用于本文中所列方法之前，从来源如天然或重组来源对蛋白质进行纯化。纯化可以包括利用如下手段从宿主细胞进行提取：超声处理、法国压机、玻璃珠、或其他物理裂解手段或者化学细胞裂解；以及通过层析步骤或本领域技术人员已知的其他手段进行的分离。任选地，例如通过透析、层析色谱法和/或与缓冲液交换相关的方法来使用浓缩步骤。
化合物和组合物
本发明的化合物和组合物适用于降低人或动物中的草酸盐水平。
将本发明组合物中的具有促分泌素效应的鉴定到的蛋白质物质和降解草酸盐的粒子或细胞和/或必需的辅助因子以有效量施用于个体。有效量包括源自草酸盐降解细菌或由草酸盐降解细菌产生的一种或多种组分或促分泌素以及一种或多种草酸盐降解酶或细菌的量。所述有效量，任选地以与来自细菌或酶的草酸盐降解活性组合的方式，足以减少疾病状态下全身的草酸盐以获得临床效果。可以单独或以与草酸盐降解细菌和/或酶组合的方式用于单剂量组合物中的量可以在约10μg～1000,000μg、约100μg～100,000μg、约1mg～100mg的范围内以及在其中所涵盖的所有范围内。所述组分或促分泌素将主动促进草酸盐流出到肠中，在肠中一种或多种草酸盐降解酶或细菌将降解所述草酸盐。
本发明还涉及包含一种或多种鉴定到的组分或促分泌素的药物组合物，所述组分或促分泌素源自重组表达的或从调节的介质提取的草酸盐降解细菌，所述药物组合物可以与或不与草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、草酸盐降解细菌和/或底物一起施用。在优选实施方案中，这种药物组合物对胃和上部小肠中胃酸和降解酶的降解具有耐受性。所述组合物可以为例如片剂或胶囊的形式。
可以与一种或多种鉴定到的化合物或促分泌素组合施用的草酸盐降解细菌(即，可以另外存在于包含一种或多种鉴定到的化合物或促分泌素的组合物中的草酸盐降解细菌)是产甲酸草酸杆菌。
与一种或多种鉴定到的促分泌素组合施用的草酸盐降解酶(即，可以另外存在于包含一种或多种鉴定到的促分泌素的组合物中的草酸盐降解酶)包括但不限于草酸盐脱羧酶、草酸盐氧化酶、甲酰基-CoA转移酶和草酰基-CoA脱羧酶。
与一种或多种鉴定到的促分泌素组合施用的酶(即，可以另外存在于包含一种或多种鉴定到的促分泌素的组合物中的酶)包括但不限于丙氨酸-乙醛酸转氨酶(AGT)、乙醛酸还原酶(GR)和4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(HOGA)。
与一种或多种鉴定到的促分泌素组合施用的辅助因子(即，可以另外存在于包含一种或多种鉴定到的促分泌素的组合物中的辅助因子)包括但不限于维生素B6、NAD+、NADP+、FAD、CoA、ATP和ADP。在药物组合物中所提及的底物包括但不限于草酸盐、乙醛酸、4-羟基-2-酮戊二酸等。
与一种或多种鉴定到的促分泌素组合施用的草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、细菌和/或底物可以根据对于最佳生物利用度和活性来说最合适的方法以相同或不同的方式施用，如本领域所已知的。相关的施用方法包括但不限于经肠、肠胃外和/或局部施用。
一种或多种促分泌素与产甲酸草酸杆菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子和/或底物的组合施用，确保了刺激草酸盐通量以提高草酸盐在肠腔方向上的转运以及草酸盐在整个胃肠道内更多的降解两方面。
粒子和组合物的使用—治疗方法
本发明的方法包括提供一种根据本发明的组合物，所述组合物包含由草酸盐降解细菌产生的一种或几种鉴定到的促分泌素，所述促分泌素与或不与草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、草酸盐降解细菌和/或底物一起施用。该组合物的鉴定到的组分或促分泌素包括但不限于：丙醇半醛还原酶、半胱氨酸合酶A、酰基载体蛋白质、预测的蛋白质(登录号：gi|237749499)、甲硫氨酸腺苷转移酶1、YgiW蛋白质、核黄素合酶β亚基、烷基氢过氧化物还原酶/硫醇特异抗氧化剂/mal过敏原、磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶、延伸因子Tu、s-腺苷高半胱氨酸水解酶、保守的假定蛋白质(登录号：gi|237747886)、二氨基庚二酸脱氢酶、丝氨酸羟甲基转移酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、苹果酸酶、顺乌头酸水合酶1、热休克蛋白70样蛋白质，并包含与实施例4中列出的序列ID为SEQIDNo:1、SEQIDNo:2、SEQIDNo:3、SEQIDNo:4等直至最后一个即SEQIDNo:19的序列具有至少85％序列同一性如90％或95％序列同一性的序列。
本发明的组合物适合于降低动物体或人体内草酸盐水平的方法并用于治疗或预防草酸盐相关的病症，所述病症包括但不限于高草酸尿、吸收性高草酸尿、肠源性高草酸尿、原发性高草酸尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石病)、外阴痛、与终末期肾病相关的尿酸盐沉积症、心脏传导障碍、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎以及由胃肠道手术、减肥手术(用于肥胖症的手术)和/或抗生素治疗造成的/与它们相关的障碍/病症。
本发明的方法包括施用组合物，所述组合物能够提高草酸盐从血浆到肠的净通量以用于由一种或多种草酸盐降解酶或细菌进行的降解。通过提供根据本发明的制剂，所述方法将一种或几种鉴定到的组分或促分泌素提供给胃和/或小肠，所述组分或促分泌素由一种或多种草酸盐降解细菌产生、或源自草酸盐降解细菌且是重组表达的。
通过将一种或几种鉴定到的组分或促分泌素与草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、细菌和/或底物提供至胃肠道可以实现草酸盐的减少。本发明的组合物可用于降解从循环系统分泌到肠中的草酸盐，由此本发明的方法设想了总体降低个体中的草酸盐负荷。
可以在对象的任意组织或体液环境中测量所述减少。体液包括身体的分泌物如鼻或胃分泌物、唾液、血液、血清、血浆、尿、食糜或消化物、组织液以及人或动物产生的其它流体或半固体材料。例如，可以将草酸盐减少酶粒子组合物和/或细菌施用于人或动物以诱导草酸盐进入肠的净通量，其中所述草酸盐减少酶的活性降解存在于对象中的草酸盐。
降低人或动物中的草酸盐水平和治疗并预防草酸盐相关病症的方法包括施用一种或几种鉴定到的组分或促分泌素，所述组分或促分泌素源自重组表达的或从调节的介质提取的一种或多种草酸盐降解细菌，与或不与一种或多种草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、细菌和/或底物一起施用。有效量包括一种或几种组分或促分泌素与或不与一种或多种草酸盐降解酶和/或细菌和/或辅助因子一起减少对象的肠、组织或体液中存在的草酸盐或维持对象中草酸盐的量比施用所述组合物之前存在的草酸盐的量更低的量，所述组分或促分泌素源自一种或多种草酸盐降解细菌或由一种或多种草酸盐降解细菌产生。以单独或与草酸盐降解细菌和酶组合的方式，这种有效量可以在约10μg～1000,000μg如约100μg～100,000μg或约1mg～100mg促分泌素的范围内。
在治疗方法中，以如下频率口服施用有效量的组合物/化合物/促分泌素以被对象摄取：至少一天一次、至少一天两次、至少一天三次、至少一天四次或根据需要更多，并且这种施用可以持续一天、两天、三天、四天、五天或一个星期、两个星期、三个星期或一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、超过六个月、一年、两年、或多年或在患者整个寿命期间连续施用。这种治疗可以持续进行以维持对象中所期望的草酸盐水平。
本文中包括的所有专利、专利申请和参考文献都通过参考以其完整形式明确并入本文中。
当然，应理解，上述内容仅涉及本发明的示例性实施例且在不背离本申请所提出的发明主旨和范围的条件下可以在其中完成大量变体或变化。
尽管本文中提供了本发明的示例性实施例，但本发明不限制于此。存在对于本领域技术人员来说显而易见的大量变体或变化。
利用本文中包含的实施例进一步对本发明进行了说明，提供所述实施例是为了清楚理解。所述实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。相反，应明确理解，在不背离本发明的主旨和/或权利要求书的范围的条件下能够对多种其他实施方案、变体及其等价物进行改变，在阅读本文中的说明之后，所述改变对于本领域技术人员来说是显而易见的。
具体实施方式
实施例
实施例1
制备提出的产甲酸草酸杆菌的促分泌素
为了制备足够量的物质以用于鉴定，从400L发酵物中分离所提出的促分泌素。以从甘油主细胞库接种的四步种子培养(500毫升至400升)的方式产生这种培养悬浮液。种子培养的所有步骤使用由痕量金属和如下化合物(单位为gm/L)构成的无菌厌氧专用草酸盐介质(100mM的草酸盐)：0.25的磷酸钾一水合物、0.25的磷酸钾二水合物、0.5的硫酸铵、0.025的硫酸镁、0.02的EDTA(二钠盐)、1.36的乙酸钠三水合物、0.001的刃天青钠盐、1的酵母提取物、13.4的草酸钠、4的碳酸钠(无水)、0.5的L-半胱氨酸HCl。在无刃天青的条件下制备了发酵介质(40L和320L)。当种子已经达到晚期对数生长期时实施发酵过程期间的所有转移。发酵进展如下：利用1％的产甲酸草酸杆菌MCB对含500ml草酸盐介质(37℃)的厌氧瓶进行接种并在37℃、75rpm下生长，直至达到晚期指数期。随后，使用无菌注射器、针头和CO2气体将培养物厌氧转移至含有3.5L草酸盐介质的厌氧瓶中并在37℃、75rpm下温育直到达到晚期指数期。将所生长的种子培养物(总体积4L)接种到含有40L无菌厌氧专用草酸盐介质的100L种子发酵罐中。在达到晚期指数期之后，将种子发酵罐培养物转移到含有320L草酸盐介质的500L的发酵罐。当培养物已经达到晚期指数期时，收获总共400L的培养悬浮液。
实施例2
从400L培养悬浮液分离所提出的促分泌素
使用切向流过滤(TFF)，利用500kDa的标称分子量截止过滤器从最终的培养悬浮液收获细胞。将制得的无细胞滤液通过10kDa的中空纤维进一步处理。将渗余物无菌收集并间歇地储存在4℃下，然后使用0.2μm的瓶顶过滤器无菌过滤成250ml等分试样。将瓶子随后冷冻以长期储存在-80℃下。在随后的步骤中，使用具有3kDa标称分子量截止的浓缩离心管对渗余物进一步处理以进一步浓缩约90倍。使用Bradford测定法和Coomassie试剂确定最终浓缩物的蛋白质浓度。将牛血清白蛋白(BSA)用于标准曲线制作。最终浓缩物是1mg总蛋白质/mL的澄清的黄色液体。
实施例3
使用LC-MS/MS鉴定所提出的促分泌素
样品制备(胰蛋白酶消化)
在搅拌下将蛋白质浓缩物重新溶解在100μL50mM的NH4HCO3中并添加5μL200mM的DTT。将样品加热到95℃并持续5分钟。通过添加在100mM的NH4HCO3中的4μL1M碘乙酰胺来将蛋白质烷基化并使其反应(45分钟，25℃，黑暗)。通过添加20μL200mM的DTT并温育(25℃，45分钟)来终止烷基化。以胰蛋白酶对蛋白质为1:50的比例将在NH4HCO3中的胰蛋白酶添加到样品并温育(37℃，16～18小时)。
LC-MS/MS分析
将酶促消化的样品注射到毛细管阱并脱盐(3μl/分钟0.1％体积/体积的甲酸并持续5分钟)。然后将样品装载到纳米流动HPLC柱上，经95分钟的洗脱梯度(溶剂A97～60溶剂B3～40％)，并进行25分钟的再平衡以用于蛋白质鉴定。溶剂A由0.1％体积/体积的甲酸、3％体积/体积的乙腈和96.9％体积/体积的H2O构成。溶剂B由0.1％体积/体积的甲酸、96.9％体积/体积的乙腈和3％体积/体积的H2O构成。使用225V聚焦电位和2400V离子喷雾电压在混合四极杆-TOF质谱仪上实施LC-MS/MS分析。在调查扫描(m/z400-1800)下使用操作的信息依赖采集(IDA)模式，随后是四个最强离子的碰撞诱导解离(CID)。每个IDA循环的调查和MS/MS谱图分别累积1秒和3秒。
蛋白质检索算法
通过ABIAnalyst版本2.0提取串联质谱。使用为检索NCBI(假定消化酶胰蛋白酶的分类学细菌数据库)而设置的Mascot(MatrixScience,London,UK；版本2.2.2)对所有样品进行分析。在0.50Da碎片离子质量偏差和0.50Da母体离子偏差的条件下检索Mascot。Cys的碘乙酰胺衍生物、Asn和Gln的脱酰胺、Met的氧化在Mascot中被指定为可变的修饰。使用Scaffold(版本Scaffold-3.3.2,ProteomeSoftwareInc.,Portland,OR)来验证基于MS/MS的肽和蛋白质的鉴定。如果肽的鉴定是在大于95.0％的概率下确立的，则肽的鉴定是能接受的，如肽预测算法(PeptideProphetalgorithm)(Keller,A.等,AnalChem74,5383-92(2002))所指定的。如果肽的鉴定是在大于99.0％的概率下确立的并包含至少2个鉴定到的独特肽，则肽的鉴定是能接受的。蛋白质的概率由蛋白质预测算法指派(Nesvizhskii,A.I.等,AnalChem75,4646-58(2003))。
结果
分泌的化合物被表征为分子量在8.8～98.8kDa范围内的蛋白质，其中>50％的化合物在30～50kDa的跨度内。下表1列出了鉴定到的蛋白质和序列起源(人类菌株产甲酸草酸杆菌OXCC13)。产甲酸草酸杆菌OXCC13与产甲酸草酸杆菌HC-1属于相同的亚组(组1)；其完整的基因组已被测序，因此是可检索的。
在十九种蛋白质中，十三种是具有已知催化功能的酶且剩余六种是蛋白质。在所述六种蛋白质中，一种蛋白质被定义为“保守的假定蛋白质”，即这种蛋白质存在于来自几种系统发育谱系的有机体内，但还未在功能上对其进行表征。将这六种蛋白质中的另一种蛋白质定义为“预测的蛋白质”。这是出于词条输入使用的，而没有在蛋白质、转录或同源性水平的证据。
实施例4
从产甲酸草酸杆菌OXCC13鉴定到的蛋白质的氨基酸序列
本文中提供的19种氨基酸序列(SEQIDNO:1～19)是来自实施例3中所述的蛋白质鉴定以及各自的鉴定编号(gi编号和RefSeq登录号(zp)的结果。使用这些鉴定编号中的任一种，都可以检索到所述序列。
SEQIDNO:1
丙醇半醛还原酶[产甲酸草酸杆菌OXCC13]gi|237749254|ref|ZP_04579734.1|
MANLGFIGLGIMGVPMAVNLQNGGNKLFVNDKKAPPAALTDGGAKACATGAEVAKNADIIFIMVPDTPDVEAVLFGENGVAQGLSAGKIVVDMSSISPIATKEFAKKINDLGCEYLDAPVSGGEVGAKAGSLTIMVGGKEETFNKVKPLFELMGKNITLVGGNGDGQTTKVANQIIVALNIQAVAEALLFASKAGADPAKVRQALMGGFASSRILEVHGERMINRTFNPGFRINLHQKDLNLALQGAKALGISLPNTATAQELMNACAANGLSGMDHSALCRAVEIMSAHEIAKA
SEQIDNO:2
半胱氨酸合酶A[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237748046|ref|ZP_04578526.1|
MSNIAKSATDLIGNTPLLEISRFGKHVDADATILAKLEYFNPAGSAKDRIAKAMIDAAEADGKLIPGSTI
IEPTSGNTGIALAAVGAARGYRVIITMPETMSVERQKLIRGYGADLVLTEGAKGMKGAIEKAQELAATIPGGFVPLQFANPANPAIHKATTGPEIWRDTDGKVDIFVAGVGTGGTLTGVGKYLKEQNPAVQVVAIEPAASPVLAGGKPGPHKIQGIGAGFIPEALDVNVFDEVIGVPNDAAFATAKTLAHAEGVLVGISSGAALWAASELAKRPENRGKTIVVLLADNGERYLSTDLFSN
SEQIDNO:3
酰基载体蛋白质[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237747699|ref|ZP_04578179.1|
MSDIEQRVKKIVAEQLGVAEDEIKLESSFVDDLGADSLDTVELVMALEDEFEIEIPDEQAEKITTVQQAVDYATANMQS
SEQIDNO:4
预测的蛋白质[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237749499|ref|ZP_04579979.1|
MKLRPLQDRIIVKRVDQEKTTASGIVIPDNAAEKPDQGEVIAVGNGKVLEDGKVLPLDVKVGDIVLFGKYSGQTVKVEGEELLVMHESDVMAIVQN
SEQIDNO:5
甲硫氨酸腺苷基转移酶1[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237747590|ref|ZP_04578070.1|
MSQDYLFTSESVSEGHPDKVADQISDAILDAILEQDPHARVAAETLCNTGLVVLAGEITTTANIDYISVA
RDTIKRIGYDNNDYGIDHRGCAVLVGYDKQSPDIAQGVDEGRGIDLDQGAGDQGLMFGYACDETPELMPAAIYYAHRLVERQSQLRKDGRIAWLRPDAKSQVTLRYVDGKPVAAETIVLSTQHAPEVEHKQIEEAVIEEIIKPVMPAEWLKESKYLVNPTGRFVIGGPQGDCGLTGRKIIVDTYGGSCPHGGGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLAKKCQIQVSYAIGVARPINITINTEGTGVIADSKIAALVNDHFDLRPKGIVQMLDLLHPRYVKTAAYGHFGRDEPEFTWEKTDKAADLRQAAGL
SEQIDNO:6
YgiW蛋白质[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237748090|ref|ZP_04578570.1|
MMSKKLLTGLFAAGLSIGMLAVSSTASAQYIGPTRIAPTTVNKVLKSPVDDQYVLLSGKITSQVSKDKYTFTDKTGSIVVEIDNEVFAGRQVGPDTQVEIWGKVDKDMFKEPKIDVKRLGIPNQTK
SEQIDNO:7
核黄素合酶β亚基[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237749243|ref|ZP_04579723.1|
MMTVNTFEIDLQGQDLRIGIVQSRFNEEICRGLLGACLEELKRLGVADEDILVATVPGALEIPTALQKMAESQQFDALIAVGGIIKGETYHFELVSNESAAGISRVALDFDMPIANAILTTYTDEQAEARMVEKGTEAARVAVEMANLVMAIDELEPPEEDE
SEQIDNO:8
烷基氢过氧化物还原酶/硫醇特异性抗氧化剂/Mal过敏原[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237747586|ref|ZP_04578066.1|
MSSLINTEIIPFKAQAYHNGQFVKVTDADLKGKWSVVFFYPADFSFVCPTELGDLADHYEEFKKLGVEIYSVSTDTHFVHKGWHDASDTIKKIQFPMVGDPSGQISRNFNVLIDDDGVALRGTFVINPEGVIKLCEIHDLGIGRSATELLRKVQAAQYVATHKGQVCPASWQPGAETLAPSLDLVGKI
SEQIDNO:9
A链，具有源自草酰基-Coa的天冬氨酰基-Coa硫酯中间体的甲酰基-Coa转移酶
gi|163931105|pdb|2VJK|A
MTKPLDGINVLDFTHVQAGPACTQMMGFLGANVIKIERRGSGDMTRGWLQDKPNVDSLYFTMFNCNKRSIELDMKTPEGKELLEQMIKKADVMVENFGPGALDRMGFTWEYIQELNPRVILASVKGYAEGHANEHLKVYENVAQCSGGAAATTGFWDGPPTVSGAALGDSNSGMHLMIGILAALEIRHKTGRGQKVAVAMQDAVLNLVRIKLRDQQRLERTGILAEYPQAQPNFAFDRDGNPLSFDNITSVPRGGNAGGGGQPGWMLKCKGWETDADSYVYFTIAANMWPQICDMIDKPEWKDDPAYNTFEGRVDKLMDIFSFIETKFADKDKFEVTEWAAQYGIPCGPVMSMKELAHDPSLQKVGTVVEVVDEIRGNHLTVGAPFKFSGFQPEITRAPLLGEHTDEVLKELGLDDAKIKELHAKQVV
SEQIDNO:10
磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237749194|ref|ZP_04579674.1|
MDTTDDLRILAMKELTPPAHLIREFPCEEKAAETVSGCRKAIQRVLHNQDDRLVVIIGPCSIHDPKAAMEYAHRLAEEKERYGDELVVVMRVYFEKPRTTIGWKGLINDPFMDHSYRINEGLHIARELLRDVNELGLPAATEYLDMISPQYVADMISWGAIGARTTESQVHRELSSGLSCPVGFKNGTDGNIKIAIDAIKAASHPHHFLSVTKGGHTAIFETEGNQDCHIILRGGYKPNYDAASVNEAARAVEAAGLAPKIMIDASHGNSSKKAENQVPVSLEVGENIAKGDDRIIGLMIESNLVGGRQDHEVGKKLVYGQSVTDACIGWEDSSKLLGQLAETVKRRRDVLKK
SEQIDNO:11
延伸因子Tu[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237747517|ref|ZP_04577997.1|
MSKKFGGEAKDYDQIDAAPEEKARGITINTSHVEYETAARHYAHVDCPGHADYIKNMITGAAQMDGAILVVSAADGPMPQTREHILLARQVGVPYIIVFLNKCDMVDDAELLELVEMEVRELLSRYEFPGDDIPIIKGSAKLALEGDAGELGETAILALADALDSYIPTPERAVDGAFLMPVEDVFSISGRGTVVTGRVERGIIKVGEEIEIVGIKETAKTTCTGVEMFRKLLDQGQAGDNIGVLLRGTKREEVERGQVLAKPGSIKPHLNFEGEVYVLSKEEGGRHTPFFNNYRPQFYFRTTDVTGAIELPKDKEMVMPGDNVSISVKLISPIAMEEGLRFAIREGGRTVGAGVVAKITE
SEQIDNO:12
S-腺苷高半胱氨酸水解酶[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237749247|ref|ZP_04579727.1|
MNAVSKTEQDFYIADPDLTAWGNKEIRIAETEMPGLMAIREEYAASKPLSGARISGSLHMTIQTAVLIQTLEALGAKVRWASCNIYSTQDHAAAAIASNGTPVFAFKGESLDDYWEFTHRIFEWPDGGYSNMILDDGGDATLLLHLGSRAEKDATVLDNPGSEEEVCLFNAIKRHLKTDPNWYSKRIKEIKGVTEETTTGVHRLYQMHEEGKLKFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRESLVDGIKRATDVMIAGKVAVVCGYGDVGKGCAQALKALSAQVWVTEVDPICALQAAMEGYRVVTMDYAAEMADIFVTCTGNYHVITHDHMVKMKDQAIVCNIGHFDNEIDVASMKKYTWDNIKPQVDHIILPNGNRIILLAEGRLVNLGCGTGHPSYVMSSSFANQTIAQIELFTNTEAYPVGVYTLPKHLDEKVARLQLKKLNAVLTELSDEQAAYIGVKKEGPYKPNHYRY
SEQIDNO:13
保守的假定蛋白质[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237747886|ref|ZP_04578366.1|
MANQEEPIKVTDDFKQCWQSAGRHLQSQVEGGLTWMRASLDEPFMEHLSFRLGNQLFFVRVIDVDNELKVPGTDENLIKIAEGCKGHACIMPMRFSFGNWMPVEKGWGLLSAVDKKPVNPPDLVTDEKIEMTDWELHDFAVQVVRQNLMHEGEHVAGWVSNPELQPSIWISTEEFPQWVVVQAVRWPAEAKIPDNIKEIEDAYASKEAKGTFAYVTFANENQNVKEPLKEGEKPLPIYRGDKAYISYSGLLSTEN
SEQIDNO:14
二氨基庚二酸脱氢酶[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237749390|ref|ZP_04579870.1|
MTTIKAAVHGLGNIGRHVIDCLTCAPDFECLGVIRRESSLGTQTLERRNIPDYASIDKLIAEKGKPDVVILCGPSRSVPEDAKFYLSRGIRTVDSFDIHTDIAELVEKLDVVAKENNSACITAAGWDPGTDSVFRTLFEAMAPTGTTFTNFGRGRSMGHSVAARAIKGVADATSITIPIGGGRHARLVYVLAEKGASFEQIKKDLASDPYFSHDPLDVREVKTPEEMEAVADNSHGVLMERIGASGRTSNQNLTFTMKIDNPALTSQVLVSCARAVTRMGAGCHTLIDVPPVMLLAGERMQHIARLV
SEQIDNO:15
丝氨酸羟甲基转移酶[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237749274|ref|ZP_04579754.1|
MFAKDYSLAQVDSELWDAILRENTRQEEHIELIASENYCSPAVMQAQGSQLTNKYAEGYPGKRYYGGCEYVDIAEQLALDRVKKLFGAEAANVQPNSGSQANQAIFLAMLNPGDTIMGMSLAEGGHLTHGMALNMSGKWFNVVSYGLNEKEEIDYDRMEQLAHEHKPKLIIAGASAYSLRIDFERFAKVARDVGAFFMVDMAHYAGLIAAGVYPSPVPYADFVTSTTHKSLRGPRGGFILMKPEFERKINSAVFPGLQGGPLMHVIAGKAVAFKEALQPEFKTYQEQVLKNASVLAKTLVDRGFRIISGRTESHVMLVDLQSKNITGRQAETILNSGHITCNKNAIPNDPQTPFVTSGVRLGSPAMTTRGFKETESAIVGNLLADVIENPNDQATIERVRAEVKKLTTAFPVYQH
SEQIDNO:16
天冬氨酸半醛脱氢酶[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237748872|ref|ZP_04579352.1|
MKLVGLIGWRGMVGSVLMQRMQEENDFDLFEPVFFTTSNVGGKAPAMAKNETVLKDAFNIDELKKCDILISCQGGDYTVDVFPKLRAAGWDGYWIDAASKLRMNDDALIILDPVNRKVIEDGLSKGIKNYIGGNCTVSCMLMGLGGLFENDLVEWMTSMTYQAASGGGAQHMRELLTQFGSIHTEVRMNLENPASAILEIDRQVLARQRGMTADETKQFGVPLAGNLIPWIDTDLGNGMSREEWKGGAETNKILGKNDGNKVIVDGLCVRVGAMRCHSQALTIKLKKDVPLDEITDILKSHNQWAKVVPNTKEDSVRDLTPAAVSGSLTIPVGRLRKLEMGNDYLSAFTVGDQLLWGAAEPLRRMLRIILE
SEQIDNO:17
苹果酸酶[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237749327|ref|ZP_04579807.1|
MNSQDQKKELLKKNALAFHRFPIPGKISVNPTKEVRDQNELALAYTPGVACACEEIHANPENAYIYTTKGNLVAVISNGTAVLGLGNIGAQASKPVMEGKGVLFKKFADINVFDLEINELDPDKLCDIIASLEPTFGGINLEDIRAPECFYIERKLREKMNIPVFHDDQHGTAVIVGAAVLNALKVVGKNIKNCKMVVSGAGAGAMGCLELLVDLGFPVENIWVTDIKGVVYKGRKELMDPEKEKYAQETDARTLMDVISDADIFLGLSAGNVLKPEMVLKMAKDPVIFAMANPIPEILPEVAHATRDDVIMGTGRSDYPNQINNSMCFPYLFRGALDCRAKTINREMELAAVRAIASLAEMECPEEIVAMYGKKYTFGRDYLLPFQFDPRLLWVVAPAVAQAAMDSGVARVQIADMDAYRAKLKEFVG
SEQIDNO:18
顺乌头酸水合酶1[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237747686|ref|ZP_04578166.1|
MSCFTQNTYKEFPVTHEKKGHFYSIPALGKELGLDLSRLPVSIRIVLESVLRNCDGKKITEEHVRQLANWKPNEERSNEIPFVVARVILQDFTGIPLLVDLAAMRNVAVKTGKNPKKIEPLVPVDLVVDHSVQIDYFRQDNALDLNMKLEFDRNRERYQFMKWGMQAFDTFGVVPPGFGIVHQVNMEYLARGVHKRNDAEAGDVYYPDTLVGTDSHTTMINGVGVVGWGVGGIEAEAGMLGQPVYFLTPDVIGMNLTGKLREGCTATDLVLTITELLRKEKVVGKFVEFFGEGAASLSATDRATIANMAPEYGATIGFFTVDEATISYFKNTGRTDEEVSALESYFRAQGMFGIPKAGQIDYTRVVNLDLGSVTASVSGPRRPQDRIELGNLKKRFTELFSAPVKDGGFNKKPADMEATYVNSDNVELKNGDILIAAITSCTNTSNPAVLLAAGLLAKKAVEAGLQVSPRIKTSLAPGSRIVTNYLEKAGLLPYLEKLGFNVAAYGCTTCIGNAGDLTPAMNEAIVKNDVVAAAVLSGNRNFEARIHPNIRANFLASPPLVVAYAIAGNVTRDLTTEPLGKGKDGKDIYLSDIWPTSHEVAALVPLALDAPSFRKNYSDIKTAPGELWQKIAGFATGDVYDWPQSTYIAEPPFFSDFGMEPNAASANISGARALALFGDSITTDHISPAGSIQEKSPAGQWLMEHGISKANFNSFGSRRGNHEVMMRGTFGNVRIKNQMLPVGPDGSRREGGYTLYQPGGEETSIFDAAMRYQKENVPTIVIGGEEYGTGSSRDWAAKGTQLLGVKAVIARSFERIHRSNLVGMAVLPLQFTGNDSAESLGLKGDETFDLTGLDDITPLQDVTLVVHRADGTTQNVPLLLRIDTPIEVDYYRHGGILPFVLRQLLSN
SEQIDNO:19
热休克蛋白70样蛋白质[产甲酸草酸杆菌OXCC13]
gi|237749571|ref|ZP_04580051.1|
MSKIIGIDLGTTNSCVAIIEGSQPRVVENSEGNRTTPSVIAYLDDGEILVGAPAKRQAVTNPKNTLYAIK
RLIGRKFDDKEVQRDIPIMPFSIIKAENNDAWVSVLNDKKLAPPQVSAEVLRKMKKTAEDYLGEEVTEAV
ITVPAYFNDAQRQATKDAGRIAGLDVKRIINEPTAAALAFGLDKAGKGDKKIAVYDLGGGTFDISIIEIA
DLDGDKQFEVLSTNGDTFLGGEDFDQRIIDFIIDEFNKINGIDLKKDPIALQRIKASAERAKIELSSSQQ
TEINEPYIAMANGAPVHLNMKLTRAKLESLAEGLIDQTIEPCRIALKDAGLSVSDIDDVILVGGMTRMPA
VQDKVKAFFGKEPRKDINPDEAVAVGAALQGAVLSGDRKDLLLLDVTPLSLGIETLGGVMTKMIQKNTTIPTKFSQIFSTAEDNQPAVTIKVYQGEREMAAGNKALGEFNLEGIPASPRGMPQIEVTFDIDANGILHVSAKDKATGKENKITIKANSGLSEDEIQRMIKDAEVNAAEDHKVRELTEARNQGDALVHTTKKSMEEYGDKLDAPAKESIESAIKDLEESLKGDDKADIDSKMSALSAAAQKLGEKMYADQAPEGAAAGAAGAGASAGAAPEPELEDDVVDADFKEVKDKD
实施例5
鉴定到的促分泌素的物理-化学特征的描述
方法
计算天然蛋白质在水中的蛋白质消光系数：
所使用的蛋白质消光系数的计算为如由Edelhoch(Edelhoch,H.,(1967)[PubMed:6049437]所述的，使用由Pace(Pace,C.N.等,(1995)[PubMed:8563639]确定的关于Tyr和Trp的消光系数。
不稳定性指数的计算和解释：
不稳定性指数按Guruprasad,K.等,(1990)[PubMed:2075190]所述的来确定并提供且估算蛋白质在试管中的稳定性。稳定性指数低于40被预测为稳定的，而超过40的值预测蛋白质可能是不稳定的。
脂族指数的计算：
将脂族指数定义为由脂族侧链(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)占据的相对体积并根据由Ikai(Ikai,A.J.(1980)[PubMed:7462208]所述的式来计算。其可被认为是提高球状蛋白质热稳定性的积极因素。
总平均疏水性(GRAVY)的计算
按氨基酸疏水性值的总和除以序列中的残基数，计算GRAVY(Kyte,J.,Doolittle,R.F.(1982)[PubMed:7108955]。参见下表2。
实施例6
在鉴定到的促分泌素的氨基酸序列中鉴定推定的信号肽切割位点
方法
使用由丹麦技术大学的生物序列分析中心提供的在线预测服务(http://www.cbs.dtu.dk/services/)，进行信号肽切割位点的推定存在和位置的鉴定。
细菌中双精氨酸信号肽切割位点的存在与位置的预测
按JannickBendtsen等人、(BMCbioinformatics,6:167,2005)所述，进行双精氨酸信号肽的预测。
结果：
十九种提出的促分泌素中的一种蛋白质具有对双精氨酸信号肽切割位点来说阳性的序列：YgiW蛋白质(登录号：gi|237748090)。C最大值、Y最大值、S最大值、S平均值和D最大值分别具有值0.872、0.500、0.797、0.314和0.407，对信号肽切割位点都给出了阳性(YES)响应。类似的切割位点在位置28与29之间：ASA-QY。
两种另外的蛋白质的序列在C最大值方面对信号肽切割位点来说是阳性的，但其在Y最大值方面未得到确认：磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶和半胱氨酸合酶A。
实施例7.1
鉴定到的潜在促分泌素化合物的重组表达
方法
本文中鉴定并列出的酶和蛋白质可以被重组表达在适合重组表达的天然宿主或选择的宿主中，如本领域技术人员所已知的。重组表达的酶和蛋白质将包含与列出的序列(SEQNo1～19)具有至少85％序列同一性的序列。蛋白同系物和变体包括但不限于：多态性变体和天然或人工突变体；其中一个或多个残基被修饰的修饰多肽；和包含一个或多个修饰残基的突变体。突变包括但不限于核酸的截短、缺失、取代或添加突变
重组酶可以被表达在蛋白质表达领域的技术人员已知的多种宿主内，包括但并不表示限于：大肠杆菌、乳杆菌、芽孢杆菌等。
对于酶或蛋白质的重组生产来说，宿主应包含含有酶或蛋白质或其功能片段的质粒、载体、噬菌体或者转录或表达盒形式的构建物。可以获得多种构建物，包括维持单拷贝或多拷贝的构建物。许多重组表达系统、组分和重组表达用试剂可商购获得，例如来自InvitrogenCorporation(Carlsbad,Calif.)；U.S.Biological(Swampscott,Mass.)；BDBiosciencesPharmingen(SanDiego,Calif.)；Novagen(Madison,Wis.)；Stratagene(LaJolla,Calif.)；以及DeutscheSammlungvonMikroorganismenandZellkulturenGmbH(DSMZ)(Braunschweigh,Germany)。
异源启动子，包括组成性和/或诱导性启动子，任选地控制蛋白质的重组表达。启动子如T7或其他启动子适用于宿主，并且对本领域技术人员来说是熟知的。启动子可还源自草酸杆菌属。
酶或蛋白质的重组核酸序列可以包括用于表达蛋白质之外的目的的核酸，包括但不限于用于纯化目的、折叠目的等。其实例为：分泌序列、信号序列、连接子、表达控制元件、亲和性标签等。从这些核酸序列产生的氨基酸可以或可以不在蛋白质表达后除去。上述所有构建物都可用于酶和蛋白质的表达，用于本文中所述的方法中。
利用如上所述的选择的表达系统转化/转染宿主细胞。用本领域技术人员已知的方法培养细胞，这包括在摇瓶和发酵罐中的液体培养以及在板中的固体培养等。
可以在用于本文中所列方法之前，从来源如天然或重组来源对蛋白质进行纯化。纯化可以包括利用如下手段从宿主细胞进行提取：超声处理、法国压机、玻璃珠、或其他物理裂解手段或者化学细胞裂解；以及通过层析步骤或本领域技术人员已知的其他手段进行的分离。任选地，例如通过透析、层析色谱法和/或与缓冲液交换相关的方法来使用浓缩步骤。
实施例7.2
如上述实施例7.1中所列出的，本文中所鉴定并列出的酶和蛋白质中，根据通常使用的方法和技术(分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology),书705,ThomasC.EvansJr.,Ming-QunXu,Humana出版社；2011；分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology),书235,NicolaCasali,AndrewPreston)，将SEQIDNO:3、4、6、13和19在大肠杆菌中重组过表达。重组表达的蛋白质源自与实施例4的SEQIDNO:3、4、6、13和19的序列具有至少90％序列同一性的合成的基因序列。未对实施例4中提供的序列实施突变但添加了短的序列标签以有助于纯化(组氨酸标签)。利用SDS-PAGE和Western印迹确认了纯化的蛋白质分子量和同一性。SDS-PAGE在4％～20％的梯度凝胶上运行，随后进行考马斯蓝染色。Western印迹分析利用来自Genscript目录号A00612或目录号A00186的抗His抗体。
结果
蛋白质被成功过表达，并使用组氨酸标签亲和纯化将其从大肠杆菌培养上清液纯化至接近同质(约85％的纯度)。用于所有蛋白质的最终储存缓冲液为50mMTris-HCl，150mMNaCl，10％甘油，pH8。除了SEQIDNo.3和SEQIDNo.4之外，对于所有蛋白质都利用SDS-PAGE凝胶确认了理论分子量，SEQIDNo.3和SEQIDNo.4在凝胶的迁移暗示了比预期更大的分子量。然而，对于这两种蛋白质，都通过Maldi-TOF确认了理论分子量。此外，在SDS-PAGE凝胶上的反常行为与特别是从其他细菌的酰基载体蛋白质所观察到的结果一致(J.Bacteriol.178:4794-4800,J.Biol.Chem.267:5751-5754,J.Bacteriol.174:3818-3821)，并且是由高的荷质比以及低的疏水性氨基酸含量引起的，这两种因素对SDS结合具有重要影响(J.Biol.Chem.254:9778-9785)并由此成为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4两者的这种反常性的原因。
通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的光密度分析，确定了所有蛋白质的纯度为约85％(图1A～E)。将牛血清白蛋白(2μg)用作对照(泳道1)。在SDS-PAGE凝胶上的靶蛋白在泳道2中示出，并且在Western印迹上的靶蛋白在泳道3中示出。
图1A：SEQIDNo.3表达的蛋白质分析。
使用的抗His抗体：Genscript目录号A00612。
图1B：SEQIDNo.4表达的蛋白质分析。
使用的抗His抗体：Genscript目录号A00612。
图1C：SEQIDNo.6表达的蛋白质分析。
使用的抗His抗体：Genscript目录号A00612。
图1D：SEQIDNo.13表达的蛋白质分析。
使用的抗His抗体：Genscript目录号A00186。
图1E：SEQIDNo.19表达的蛋白质分析。
使用的抗His抗体：Genscript目录号A00186。
实施例8
使用肠细胞模型筛选潜在的促分泌素
方法
使用人肠Caco2-BBE细胞、T84或适用于模拟在肠上皮上的转运的另一种细胞系，针对细胞层上改变的净草酸盐转运，对产甲酸草酸杆菌调节的介质和/或重组表达的促分泌素的效应进行了筛选。在评价调节的介质的情况中，利用产甲酸草酸杆菌调节的介质和未调节的介质的合适稀释液(例如1:50)以及嗜酸乳杆菌(LactobacillusAcidophilus)的调节的介质将细胞预先温育24小时。在向外的Cl梯度的存在下对顶部的[14C]草酸盐流入通量进行测量。在评价重组表达的蛋白质的情况中，利用合适浓度的纯化的蛋白质或来自表达宿主的细胞裂解物对细胞进行预先温育。包括几种稀释液以评价剂量响应。作为对照，分别使用蛋白质缓冲液或未转化的宿主细胞裂解物。
实施例9.1
使用动物肠组织筛选潜在的促分泌素
方法
作为筛选潜在促分泌素化合物的方法，可以从小鼠或大鼠分离肠组织。使用100％的CO2将动物安乐死并立即取出肠。使用冰冷的0.9％的NaCl将组织彻底清洗，除去结缔组织，并沿肠系膜的边界将区段打开。将组织的平片安装在修改的尤斯室内，并通过含1.25μM草酸盐的缓冲盐水(pH7.4)在37℃下在两侧上对组织进行浸泡，同时利用95％的O2、5％的CO2进行鼓泡。使用自动电压钳在短路条件下在合适时间间隔下测量[14C]草酸盐的两个单向通量。在整个实验期间都对组织的电参数进行测量(开路电位、短路电流等)。本领域中描述了计划的实验的细节(Hatch和FreelAmJNephrol23:18-26,2003,Freel等AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol290:G719-G728,2006)。
适合使用的动物包括但不限于使用乙二醇进行高草酸尿诱导或未进行高草酸尿诱导的Sprague-Dawley大鼠、AGT敲除小鼠(如由Salido等(PNASUSA103:18249-18254,2006)描述的C57BL/6背景的品系)、或转运蛋白敲除小鼠如Slc26a6-/-(Wang等,AmJPhysiolCellPhysiol288:C957-C965,2005)。
用于转运研究的肠组织源自上述品系的小鼠或大鼠，所述小鼠或大鼠使用含或不含草酸盐的食物进行饲养。还可利用产甲酸草酸杆菌的活培养物对所述动物进行反复灌喂以诱发定植，同时喂食含或不含草酸盐的食物。
为了确认定植和高草酸尿的状态，在动物圈养期间收集尿和粪便样品，并按本领域所充分描述的对草酸盐和产甲酸草酸杆菌进行分析。在使用产甲酸草酸杆菌进行定植的任何尝试之前，确认动物是未定植的。
为了确认潜在的促分泌素对阴离子交换转运蛋白的作用，可以将合适的抑制剂添加到尤斯室的隔室内，这些抑制剂包括但不限于DIDS(4,4'-二异硫氰基-2,2'-芪二磺酸酯)和SITS(4-乙酰氨基-4'-异硫氰基芪2'-二磺酸酯)。
实施例9.2
使用大鼠肠组织对来自产甲酸草酸杆菌的重组表达的潜在蛋白质促分泌素进行筛选
方法
尤斯室实验
如同上述实施例9.1中列出的，将肠区段与肌肉层剥夺并安装在尤斯室内，将每侧浸泡在含1.5μM(未标记的)草酸钠的5ml葡萄糖-林格(Ringer)溶液(林格组合物(单位为mmol/L)：Na+140、Cl-119.8、K+5.2、HCO3 -25、Ca2+1.2、Mg++1.2、HPO4 2-2.4、H2PO4 -0.4、葡萄糖10，当在37℃下利用95％O2/5％CO2充气时pH为7.4)。使用将室溶液连接到电压钳的两组电极直接记录透壁(transmural)电位差(PD)(单位为mV)并确定短路电流(ISC)(单位为μA/cm2)。使用欧姆定律计算总电阻(RT)(单位为ohms·cm2)，其中PD＝ISC×RT。
除了在周期性转换到开路状态以记录PD时之外，所有实验都在短路条件下进行。在T＝0分钟时，将治疗添加到粘膜溶液对。将组织短路并平衡20分钟，同时记录ISC和RT。在T＝20分钟时，将10μCi标记的C14草酸盐添加到成对组织中一者的粘膜或浆膜浴中。在T＝30分钟时，从未标记侧开始每15分钟进行100μl通量取样，并持续60分钟的时间段。用100μl未标记的缓冲液置换来自“未标记”侧的100μl溶液。在实验阶段开始和结束时取等份(100μl)的“热”侧溶液，并对其值求平均以得到关于所述阶段的比活性。利用液体闪烁计数器测量同位素活性。对单向通量进行计算(JOX＝cpm/时间·比活性·面积)并表示为μmol/分钟·cm2。作为成对样本之间的单向通量差，计算净通量。在每次取样间隔的开始和结束时记录ISC(单位为μA)(换算成μEq/cm2·小时)和PD(单位为mV)，并针对所述间隔求平均值。
使用Sprague-Dawley大鼠远端结肠组织，与试验制品同样地对对照(仅缓冲液)进行评价。试验制品需要实施例7.2的重组表达的蛋白质，所述蛋白质分为三组：组1：SEQIDNo.3的蛋白质；组2：SEQIDNo.4和19的蛋白质；组3：SEQIDNo.6和13的蛋白质。每种治疗使用来自六只大鼠的组织(n＝6)。使用成对组织C14草酸盐的基底粘膜到浆膜(m-s)与浆膜到粘膜(s-m)的通量之差来建立关于特定治疗的草酸盐的净吸收(m-s>s-m)或分泌(s-m>m-s)。如果相对于各自对照，治疗产生了效果，则确定关于所有治疗的净通量的平均值+/-SEM的计算。
结果
缓冲液对照示出了大鼠组织的这种远端肠区段的净吸收通量，确认了利用类似大鼠肠区段的先前文献研究。在两个时间段0～30分钟和30～60分钟内测量了通量。在两个时间段内都观察到了对照的类似行为。在两个时间段内，三个组的治疗都降低了标记的草酸盐的总通量。然而，在后一个时间段内，组1在浆膜到粘膜(s-m)通量方面显示出更大的变化，导致在该时间段内标记的草酸盐在肠组织上的净分泌更大。由于一个异常值的复制本，所以在该数据组中仅包括实验的五个复制本。
图2描绘了在0～30分钟的首次通量时间段(T＝30到T＝60，按照“尤斯室实验”的注释)期间标记的草酸盐通量。M-S通量＝粘膜到浆膜的通量，S-M通量＝浆膜到粘膜的通量。G1～G3表示三组治疗，G＝组。
图3显示了在30～60分钟的二次通量时间段(T＝60到T＝90，按照“尤斯室实验”的注释)期间标记的草酸盐的通量。M-S通量＝粘膜到浆膜的通量，S-M通量＝浆膜到粘膜的通量。G1～G3表示三组治疗，G＝组。
实施例10
体内转运蛋白的表达图案的评价
为了确认体内转运蛋白、特别是属于SLC26A(溶质连接的载体)类的蛋白质的存在，可以使用合适的免疫印迹和探测方法对粘膜刮取物进行分析，所述方法在本领域内是熟知的且本文中进行简要说明。
方法
使用SDS-PAGE对粘膜刮取物进行分析并随后转移到硝酸纤维素膜上。将所述膜利用例如1％的酪蛋白溶液进行封闭，用含洗涤剂的磷酸盐缓冲的盐水洗涤，然后使用特异性第一抗体并随后使用与检测用酶如HRP(辣根过氧化物酶)酶连接的合适的第二抗体进行探测。
可以产生针对重组表达的转运蛋白的第一抗体并用于检测特定的转运蛋白如SLC26a6。用于制备抗体的方法是本领域内公知的，本文中不再说明。
实施例11
重组表达的转运蛋白与潜在的促分泌素化合物之间的结合相互作用的评价
作为筛选鉴定到的潜在促分泌素化合物的补充性或替代性方式，对于具有期望特性的化合物，可以对转运蛋白与所提出的促分泌素化合物之间的相互作用进行分析。
方法
存在几种合适的方法来表征蛋白质-蛋白质的相互作用，这对本领域技术人员来说是已知的。例如可以使用各种间接方法即ELISA、RIA和表面等离子体共振来表征草酸盐转运膜蛋白与表达并纯化的潜在的促分泌素之间的相互作用。另外，通过确定蛋白质-蛋白质缔合时所涉及的热量，可以使用等温滴定量热法(ITC)来量化所述相互作用。
实施例12
高草酸尿动物模型中潜在促分泌素的评价
在对体内重组表达的潜在促分泌素进行筛选之后，将有希望的化合物包括在使用合适动物模型的研究中(关于可以按本文中所述使用的动物模型的实例，参见实施例9)，以确认体内效应。关于与产甲酸草酸杆菌同时发生的定植或缺乏定植，使用各自的臂来实施该研究。
方法
几种动物模型已被用于模拟高草酸尿病症，其中之一是AGT敲除的小鼠模型(参见实施例9)。该小鼠模型可以用于评价潜在的促分泌素化合物。关于这些动物模型的执行已在文献中被很好地描述，本文中仅进行一般说明。此外，血浆和尿的草酸盐和钙的分析方法是本领域内通常使用的且不再列出。
使用雌性和雄性两种小鼠。在研究的开始(约5天)，小鼠可以随意获取水和标准小鼠食物(例如食物2018S，Harlanteklad)以建立待监测的参数(包括但不限于血浆和尿的草酸盐和钙)的基线值。
为了提高草酸盐水平的对比和/或促进产甲酸草酸杆菌的定植，可以并入其中用高草酸盐食物(例如补充有1.5％草酸盐的食物(0.5％的钙)；食物89000，HarlanTeklad)引发小鼠的时间段(约5天)。如果期望，通过0.5毫升含湿产甲酸草酸杆菌细胞小球的接种物的食管饲法利用产甲酸草酸杆菌在相隔48小时的两种场合对选择臂进行定植。利用失活的产甲酸草酸杆菌培养物或类似物对对照组进行灌胃。在五天之后，使用PCR检测粪便样品以确认在各个动物中的定植，并随后对两个组都施用促分泌素化合物。
可以将各个组分为其中施用或不施用促分泌素的单独的臂，促分泌素可以连续施用3～5天。在整个研究期间，对血浆和尿的草酸盐和钙进行监测。在结束产物的施用之后，可以实施一个连续的高草酸盐食物时间段以观察参数值返回到施用促分泌素前的水平。如果期望，定植的动物的给予产物的单独臂可以保持在产物上，但返回至常规草酸盐水平的食物(0.5％)，从而评价敲除小鼠在无外源添加草酸盐的条件下是否能够持续定植。

Claims (13)

1.一种促分泌素，所述促分泌素源自草酸盐降解细菌例如源自产甲酸草酸杆菌(Oxalobacterformigenes)，用于治疗对象中草酸盐相关的疾病和/或草酸盐相关的失衡，其中施用所述促分泌素导致所述对象中尿草酸盐和/或血浆草酸盐减少。
2.根据权利要求1的所使用的促分泌素，其中所述草酸盐相关的疾病选自：原发性高草酸尿、高草酸尿、吸收性高草酸尿、肠源性高草酸尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石病)、外阴痛、与终末期肾病相关的尿酸盐沉积症、心脏传导障碍、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、以及由胃肠道手术、减肥手术(用于肥胖症的手术)和/或抗生素治疗造成的/与它们相关的障碍/病症。
3.根据权利要求1或2的所使用的促分泌素，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有促分泌素活性并与SEQIDNO:1～19中任一项的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
4.根据权利要求3的所使用的促分泌素，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有促分泌素活性并与SEQIDNO:3、4、6、13和19中任一项的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
5.根据权利要求1～4中任一项的所使用的促分泌素，其被重组表达在合适的有机体中或提取自调节的介质。
6.一种药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种权利要求1～5中任一项所述的促分泌素，任选地还包含一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合。
7.权利要求6的组合物，其中所述组合物被配制成具有经肠、肠胃外或局部施用途径。
8.一种对患有草酸盐相关疾病的对象进行治疗的方法，其包括将源自草酸盐降解细菌的促分泌素施用于所述对象，其中所述促分泌素的施用导致所述对象中尿草酸盐和/或血浆草酸盐减少。
9.根据权利要求8的方法，其中所述促分泌素包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有促分泌素活性并与SEQIDNO:1～19中任一项的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
10.根据权利要求9的方法，其中所述促分泌素包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有促分泌素活性并与SEQIDNO:3、4、6、13和19中任一项的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
11.根据权利要求8～10中任一项的方法，其还包括将一种或多种草酸盐降解细菌、草酸盐降解酶、草酸盐代谢中所涉及的酶、辅助因子、底物或其组合施用于所述对象。
12.根据权利要求8～11中任一项的方法，其中所述草酸盐相关疾病选自：原发性高草酸尿、高草酸尿、吸收性高草酸尿、肠源性高草酸尿、特发性草酸钙肾结石疾病(尿石病)、外阴痛、与终末期肾病相关的尿酸盐沉积症、心脏传导障碍、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎以及由胃肠道手术、减肥手术(用于肥胖症的手术)和/或抗生素治疗造成的/与它们相关的障碍/病症。
13.一种制备如权利要求1～5中任一项所述的促分泌素的方法，所述方法包括：
i)将草酸盐降解细菌如产甲酸草酸杆菌接种到温度平衡的选择性生长介质中，所述生长介质特定地用于利用草酸盐作为唯一碳源的微生物，所述生长介质包括作为碳源的草酸盐、必需的痕量金属以及在厌氧条件下的氨基酸；
ii)例如通过使用瓶口和无菌气体的压力，经由不透空气的管来置换液体，将细胞培养物在厌氧条件下的容器之间如厌氧瓶之间或厌氧瓶与发酵罐之间转移；
iii)收获细胞悬浮液，并通过使用例如切向流过滤对所述细胞悬浮液进行处理以从所述悬浮液分离全细胞和碎片，由此得到不含细胞的渗透物；
iv)例如通过使用中空纤维对所述不含细胞的渗透物进行过滤以得到渗余物，所述中空纤维选择性除去<10kDa的化合物和希望减少的肽；
v)通过使用例如液相色谱、电泳、沉淀、超离心和/或浓缩离心柱从所述渗余物分离一种或多种促分泌素。
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