JP2020515647A - Clpb由来タンパク質およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ClpBタンパク質のフラグメントを含むポリペプチドおよびタンパク質ならびにそれらによる組成物に関する。本発明は、炎症、特に体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害の治療ならびに/あるいは予防にも関する。本発明は、飽満を誘導する、満腹を延長する、食事量を減少させる、摂食量を減少させる、体重増加を制御する、および体重減少を刺激する方法にも関する。【選択図】なし
Description
本発明は、炎症、例えば肥満、体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害などの治療あるいは予防に関する。本発明は、飽満を誘導する、満腹を延長する、摂食量を減少させる、体重増加を制御する、および体重減少を刺激する方法に関する。
肥満は、多数の共存症を伴い、極めて治療可能性に乏しい慢性病態の1つである。肥満および体重過多は通常、摂食量の増加およびエネルギー消費量の減少を特徴とし、エネルギーバランスを調節するペプチド作動性システムの役割が変化したことを示唆するものである。実際、食欲および摂食行動の調節には、腸の飢餓ペプチドホルモンと満腹ペプチドホルモンの間の相互作用に加え、食欲促進神経ペプチドと食欲抑制神経ペプチドを含む脳神経回路が関与している(Schwartzら,2000.Nature.404(6778):661−71)。
現在の摂食制御に関するモデルでは、腸由来の飢餓ホルモンと満腹ホルモンが複数の脳回路にシグナルを伝達し、摂食の恒常性に関する側面と快不快に関する側面を調節することが示されている(Berthoud H.−R.,2011.Curr.Opin.Neurobiol.21(6):888−896;Murphyら,2006.Nature.444(7121):854−859)。そのなかでも重要なのが、視床下部弓状核(ARC)に由来し、室傍核(PVN)で中継されるプロオピオメラノコルチン(POMC)ニューロンおよび神経ペプチドY(NPY)/アグーチ関連タンパク質(AgRP)ニューロンをそれぞれ含む食欲抑制経路および食欲促進経路である(Atasoyら,2012.Nature.488(7410):172−177;Garfieldら,2015.Nat.Neurosci.18(6):863−71;Shiら,2013.Cell Metab.17(2):236−248)。
前駆体のプロオピオメラノコルチン(POMC)に由来し4型MC受容体(MC4R)に作用するαメラニン細胞刺激ホルモン(α−MSH)を含めたメラノコルチンペプチドからなる中枢メラノコルチン(MC)系はエネルギーバランスの調節に決定的に関与している(Cone,2006.Endocr.Rev.27(7):736−49)。実際、ヒトおよび遺伝子改変げっ歯類ともに、POMC発現およびMC4Rシグナル伝達がともに欠損すると過食症および肥満を引き起こす(Huszarら,1997.Cell.88(1):131−41;Krudeら,1998.Nat.Genet.19(2):155−7;Farooqiら,2003.N.Engl.J.Med.348(12):1085−95)。したがって、中枢MC4Rの選択的刺激が過食症および肥満の治療に極めて魅力的な標的であるように思われ、これまでにα−MSHペプチド類似体、例えばPOMC欠損時の補充療法としての、またプラダー・ウィリー症候群の過食症の治療のためのセトメラノチドなどが開発され、臨床試験が実施されてきた(Chenら,2015.J.Clin.Endocrinol.Metab.100(4):1639−45;Kuehnenら,2016.N.Engl.J.Med.375(3):240−6)。しかし、高親和性α−MSH様薬物が脳内に侵入することにより、血圧上昇などの望ましくない副作用のリスクが発生する。
最近、腸内共生大腸菌(Escherichia coli)(E.coli)カゼイン分解性プロテアーゼB(ClpB)タンパク質がα−MSHの立体配座模倣体であることが明らかにされており、特定の細菌タンパク質を新たなタイプのペプチド様薬物として使用できる可能性が示唆されている(Tennouneら,2014.Transl.Psychiatry.4:e458)。ClpBタンパク質は分子量が95kDaを上回り、このことがいくつかの難題(例えば、生産、安定性など)を生み出している。
腸の腸内分泌細胞にあるMC4Rが活性化されると、満腹ホルモンのグルカゴン様ペプチド1(GLP−1)およびペプチドYY(PYY)の放出が刺激されることが明らかにされている(Panaroら,2014.Cell Metab.20(6):1018−1029)。
最近の研究で、大腸菌(E.coli)のClpB配列のアミノ酸残基534〜548に相当するClpBフラグメントが、MC3RおよびMC5Rに対して部分活性を示すがMC4Rには活性を示さないマイクロモルレベルの完全MC1Rアゴニストであることが明らかにされている(Ericsonら,Bioorganic & Medical Chemistry Letters,2015,25:5306−5308)。しかし、α−MSH様エピトープを含む完全ClpBフラグメントまたはそれより大きいフラグメントのMCRに対する活性は、Ericsonらが試験した短い改変フラグメントとは異なるものであり得る。
ホルモンであるα−MSHは、MC1RおよびMC3Rなどのメラノコルチン受容体を発現する免疫系の細胞および末梢非免疫細胞型に対して強力な抗炎症作用および保護作用を示すこともわかっている(Brzoskaら,2008.Endrocr.Rev.29(5):581−602)。さらに、最近の研究で、α−MSHが乾癬、アレルギー性鼻炎、変形性関節症および神経炎症性疾患の治療に関して興味深い標的となることが明らかにされている(Auriemmaら,2012.J.Invest.Dermatol.132(7):1814−24;Kleinerら,Clin.Exp.Allergy.46(8):1066−74;Bohmら,2016.Biochem.Pharmacol.116:89−99;Mykickiら,2016.Sci.Transl.Med.8(362):362ra146)。
したがって、α−MSHの生物活性、特にメラノコルチン受容体との結合を保持する新たなポリペプチドまたはタンパク質を特定することが依然として必要とされている。
本発明者らは驚くべきことに、α−MSHエピトープと配列相同性を有するClpBフラグメントが腸粘膜細胞に対して直接作用してPYYの分泌を刺激することを明らかにした。
したがって、本発明は、ClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むポリペプチドおよびタンパク質ならびにその使用に関する。
本発明は、負荷電残基と2つの連続するArg残基およびTrp残基とを含むClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含む、少なくとも15アミノ酸のポリペプチドまたはタンパク質であって、完全長のClpBタンパク質ではない、ポリペプチドまたはタンパク質に関する。
一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号4のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、配列GKPVと少なくとも75%の配列相同性を有する配列をさらに含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号6のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチドまたはタンパク質を含む、組成物にも関する。
本発明はさらに、本明細書に記載されるポリペプチドまたはタンパク質と、少なくとも1種の薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物に関する。
本発明の別の目的は、本発明によるポリペプチドまたはタンパク質を含む、医薬である。
本発明はまた、本明細書に記載されるポリペプチドまたはタンパク質を含む、栄養補助食品にも関する。本発明はさらに、本明細書に記載されるポリペプチドまたはタンパク質を含む、食用組成物に関する。
本発明はさらに、必要とする対象の肥満、体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害の治療あるいは予防に使用するための、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、医薬組成物または医薬に関する。
本発明の別の目的は、対象の体重を減少させるための、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、栄養補助食品または食用組成物の使用である。一実施形態では、対象は肥満ではない。
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、組成物、医薬組成物、医薬、栄養補助食品または食用組成物を含む、キットに関する。
(定義)
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する:
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する:
数字の前にある「約」は、前記数字の値のプラスマイナス10%を意味する。
本明細書で使用される「アミノ酸」は、当該技術分野で周知のその完全名、3文字コードまたは1文字コードによって表される。ペプチド中のアミノ酸残基は以下の通りに略記される:フェニルアラニンはPheまたはFであり;ロイシンはLeuまたはLであり;イソロイシンはIleまたはIであり;メチオニンはMetまたはMであり;バリンはValまたはVであり;セリンはSerまたはSであり;プロリンはProまたはPであり;トレオニンはThrまたはTであり;アラニンはAlaまたはAであり;チロシンはTyrまたはYであり;ヒスチジンはHisまたはHであり;グルタミンはGlnまたはQであり;アスパラギンはAsnまたはNであり;リジンはLysまたはKであり;アスパラギン酸はAspまたはDであり;グルタミン酸はGluまたはEであり;システインはCysまたはCであり;トリプトファンはTrpまたはWであり;アルギニンはArgまたはRであり;グリシンはGlyまたはGである。
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸と合成アミノ酸の両方およびDアミノ酸とLアミノ酸の両方を包含する。「標準アミノ酸」または「天然のアミノ酸」は、天然のペプチドに通常みられる20種類の標準L−アミノ酸のうちのいずれかを意味する。「非標準アミノ酸残基」は、合成により調製されたものであるか、天然源に由来するものであるかに関係なく、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。例えば、合成しやすくするためトリプトファンをナフトリルアラニン(naphtlylalanine)で置換することができる。置換することが可能なその他の合成アミノ酸としては、特に限定されないが、L−ヒドロキシプロピル、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニル、α−アミノ酸、例えばL−α−ヒドロキシリシルおよびD−α−メチルアラニル、L−α−メチルアラニルなど、β−アミノ酸およびイソキノリルが挙げられる。
「アミノ酸」という用語は、特に限定されないが、塩、アミノ酸誘導体(アミドなど)および置換体を含めた化学修飾アミノ酸も包含する。本発明のポリペプチドの範囲内に含まれるアミノ酸は、特にそのカルボキシ末端またはアミノ末端を、その活性に悪影響を及ぼさずにポリペプチドの循環血中半減期を変化させることができる他の化学基によるメチル化、アミド化、アセチル化または置換によって修飾することができる。さらに、本発明のポリペプチド内にジスルフィド結合が存在していても、存在していなくてもよい。
「抗体」および「免疫グロブリン」(「Ig」)は互換的なものであり、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)および抗体フラグメントを包含する。
「むちゃ食い」、「過食」、「むちゃ食い障害」および「過食障害」は、制御不能な摂食エピソードからなるが、それに続くパージングエピソード(例えば、嘔吐)を伴わない摂食障害を指す。「むちゃ食い者」は、むちゃ食い尺度チェックリスト(Gormallyら,1982.Addict Behav.7(1):47−55)またはそれと同等の診断尺度(例えば、専門家による評価)に基づきむちゃ食いまたは過食が認められる者として特定される。むちゃ食いまたは過食の重症度は、個々の事象の重症度によって、かつ/またはそのような事象の頻度によって測定される。
「立体配座模倣体」は、別のタンパク質と少なくとも部分的に同じ立体配座を共有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。一実施形態では、「α−MSHペプチドの立体配座模倣体」は、α−MSHペプチド(配列番号20)と少なくとも部分的に同じ立体配座を共有するポリペプチドまたはタンパク質を意味する。特定の実施形態では、α−MSHペプチドの立体配座模倣体は、連続するArg残基とTrp残基、配列GKPVと少なくとも75%の配列相同性を有する配列および/または連続するArgとTrpの上流にある負荷電残基を有する。
「保存的置換」とは、あるアミノ酸を、それと類似した特性を有するため、ペプチド化学の当業者にポリペプチドの二次構造および疎水・親水性が実質的に変化しないことが予想される別のアミノ酸で置換する置換のことである。したがって、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づくものである。上記の様々な特性を考慮に入れた例示的置換は当業者に周知であり、アルギニンとリジン;グルタミン酸とアスパラギン酸;セリンとトレオニン;グルタミンとアスパラギン;およびバリンとロイシンとイソロイシンがこれに含まれる。さらに、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および/または両親媒性の類似性に基づいてアミノ酸置換を実施し得る。例えば、負荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられ;正荷電アミノ酸としては、ヒスチジンとリジンとアルギニンが挙げられ;親水性値が同程度の非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、ロイシンとイソロイシンとバリン;グリシンとアラニン;アスパラギンとグルタミン;およびセリンとトレオニンとフェニルアラニンとチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るその他のアミノ酸のグループとしては、
(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr;
(2)Cys、Ser、Tyr、Thr;
(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;
(4)Lys、Arg、His;および
(5)Phe、Tyr、Trp、His
が挙げられる。
(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr;
(2)Cys、Ser、Tyr、Thr;
(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;
(4)Lys、Arg、His;および
(5)Phe、Tyr、Trp、His
が挙げられる。
「保存的アミノ酸置換」という用語はさらに、以下の5つのグループ:
(i)非極性の、またはわずかに極性のある小さい脂肪族残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
(ii)極性負荷電残基およびそのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
(iii)極性正荷電残基:His、Arg、Lys;
(iv)大きい脂肪族非極性残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys;
(v)大きい芳香族残基:Phe、Tyr、Trp
のうちの1つのグループ内でのアミノ酸交換として定義され得る。
(i)非極性の、またはわずかに極性のある小さい脂肪族残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
(ii)極性負荷電残基およびそのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
(iii)極性正荷電残基:His、Arg、Lys;
(iv)大きい脂肪族非極性残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys;
(v)大きい芳香族残基:Phe、Tyr、Trp
のうちの1つのグループ内でのアミノ酸交換として定義され得る。
「エピトープ」は、抗体が結合する1つまたは複数のタンパク質上にある特定のアミノ酸配置を指す。エピトープは多くの場合、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子集団からなり、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。エピトープは、直線状であり、かつ/または立体配座的なもの、すなわち、抗原の様々な領域に必ずしも連続するとは限らない2つ以上のアミノ酸配列を含むものであり得る。
「フラグメント」は、タンパク質、例えばClpBタンパク質の一部分または領域であって、インタクトのタンパク質または完全なタンパク質、例えばClpBタンパク質より少ないアミノ酸残基を含むものを指す。「フラグメント」という用語はさらに、例えば、アミノ酸配列、例えば配列番号1のアミノ酸配列の少なくとも約5個のアミノ酸、10個のアミノ酸、20個のアミノ酸、30個のアミノ酸、40個のアミノ酸、50個のアミノ酸、75個のアミノ酸、100個のアミノ酸、150個のアミノ酸、200個のアミノ酸、250個のアミノ酸、300個のアミノ酸、400個のアミノ酸、500個のアミノ酸、600個のアミノ酸、700個のアミノ酸、800個のアミノ酸またはそれ以上の部分であって、少なくとも1つのプロテアーゼによるタンパク質分解切断によって天然のアミノ酸配列から切断したもの、または当業者に公知の化学的方法によって、もしくは組換えDNA技術を用いて(例えば、天然のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一部分から発現させて)合成した天然のアミノ酸配列の一部分であるものを指す。「フラグメント」は、特定のアミノ酸配列、例えば配列番号1のアミノ酸配列の一部分、例えば、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%を指すこともある。
「同一性」または「同一の」は、2つ以上のアミノ酸配列の配列間の関係で使用される場合、一続きの2つ以上のアミノ酸残基の間のマッチ数によって求められるアミノ酸配列間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)により処理したギャップアライメント(存在する場合)を有する2つ以上の配列の小さい方の間の同一マッチのパーセントを測定するものである。2つ以上の配列の同一性を比較する方法は当該技術分野で周知である。このような方法としては、特に限定されないが、Arthur M.Lesk,Computational Molecular Biology:Sources and Methods for Sequence Analysis(New−York:Oxford University Press,1988);Douglas W.Smith,Biocomputing:Informatics and Genome Projects(New−York:Academic Press,1993);Hugh G.GriffinおよびAnnette M.Griffin,Computer Analysis of Sequence Data,Part 1(New Jersey:Humana Press,1994);Gunnar von Heinje,Sequence Analysis in Molecular Biology:Treasure Trove or Trivial Pursuit(Academic Press,1987);Michael GribskovおよびJohn Devereux,Sequence Analysis Primer(New York:M.Stockton Press,1991);ならびにCarilloら,1988.SIAM J.Appl.Math.48(5):1073−1082に記載されている方法が挙げられる。同一性を求めるのに好ましい方法は、被験列間の最大マッチが得られるよう設計されたものである。同一性を求める方法については、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。コンピュータプログラムにより2配列間の同一性を求める方法としては、GAPを含むGCGプログラムパッケージ(Devereuxら,1984.Nucl.Acid.Res.12(1 Pt 1):387−395;Genetics Computer Group、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、マディソン、ウィスコンシン州)、BLASTP、BLASTN、TBLASTNおよびFASTA(Altschulら,1990.J.Mol.Biol.215(3):403−410)が挙げられる。BLASTXプログラムは米国立生物工学情報センター(NCBI)およびその他の入手源(BLAST Manual,Altschulら,NCB/NLM/NIHベセスダ、メリーランド州20894;Altschulら,1990.J.Mol.Biol.215(3):403−410)が公開している。ニードルマン・ブンシュグローバルアライメントアルゴリズム(Needleman S.B.およびWunsch C.D.,1970.J.Mol.Biol.48:443−453)を用いて、2つの配列の全長を考慮に入れたときのその最適アライメント(ギャップを含む)を明らかにする「needle」プログラムを用いるのが好ましい場合もある。needleプログラムは、例えば、ワールドワイドウェブサイトebi.ac.ukで入手可能である。本発明による同一性の割合は、「Gap Open」パラメータが10.0であり、「Gap Extend」パラメータが0.5であり、Blosum62マトリックスを用いるEMBOSS:needle(グローバル)プログラムを用いて算出するのが好ましい。よく知られたスミス・ウォーターマンアルゴリズムを用いて同一性を求めてもよい。
「肥満」は、対象のBMIが好ましくは30を上回る医学的状態を指す。「BMI」または「体格指数」は、対象の体重を対象の身長の2乗で除したものと定義される。医学で広く用いられている公式により測定単位kg/m2が得られる。「中程度肥満」の対象は、BMIが30〜35の対象を指す。「非肥満」の対象とは、BMIが30未満の対象のことである。したがって、「非肥満」の対象は、正常体重または体重過多であり得る。「正常体重」は、本明細書ではBMIが18.5〜25となる体重を指す。
「体重過多」は、BMIが25〜30となる体重を指す。いくつかの実施形態では、対象は、健康な体重過多または合併症のない体重過多の対象である。「健康な体重過多」または「合併症のない体重過多」の対象は、本明細書では、対象の体重と直接関係のある疾患も病態も一切みられない体重過多の対象を意味する。
「薬学的に」または「薬学的に許容される」は、必要に応じて対象、特にヒトに投与したとき、有害反応もアレルギー反応もその他の望ましく反応も引き起こすことのない分子的実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または添加剤は、任意のタイプの無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤助剤を指す。本発明の組成物に使用し得る薬学的に許容される添加剤としては、特に限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えばプロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウムなど、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム)、ポリエチレングリコール、ポリアクリラート、ロウ、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。本発明の医薬組成物では、以下の有効成分を単独で、または別の有効成分と組み合わせて、従来の医薬担体との混合物として単位投与形態で動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、経口経路形態、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤または液剤など、舌下および頬側投与形態、エアゾール剤、埋植物、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、髄腔内および鼻腔内投与形態ならびに直腸内投与形態を含む。好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に薬学的に許容される媒体を含有する。これらは具体的には、等張で無菌の生理食塩水溶液(リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物)、または場合に応じて滅菌した水もしくは生理食塩水を添加して注射用液剤を構成することができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物であり得る。注射可能な用途に適した医薬形態としては、無菌水溶液剤または分散液剤;ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤;および無菌注射用液剤または分散液剤を即時調製する無菌粉末が挙げられる。いずれの場合も、形態は無菌でなければならず、注射針を容易に通過する性質がみられる程度に流動性があるものでなければならない。それは、製造および保管の条件下で安定なものでなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されたものでなければならない。本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容される塩として液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。分散液剤もグリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびに油で調製することができる。通常の保管および使用の条件下では、これらの調製物は微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。有効成分は中性形態または塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、(タンパク質の遊離アミノ基と形成される)酸付加塩および無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。担体は、例えば,水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液剤の場合は必要とされる粒子径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。無菌注射用液剤は、必要量の活性なポリペプチドを、必要に応じて上に列挙した様々な他の成分と適切な溶媒中で組み合わせた後、ろ過滅菌することにより調製する。分散液剤は一般に、様々な滅菌有効成分を、基礎となる分散媒と、上に列挙した他の成分のうち必要なものとを含有する無菌媒体に組み込むことにより調製する。無菌注射用液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法として、予め滅菌ろ過した有効成分の溶液から有効成分と任意の追加の所望成分の粉末が得られる真空乾燥技術および凍結乾燥技術がある。製剤化した後、液剤を投与製剤と適合性のある方法で、治療効果のある量で投与する。製剤は、上記の注射用液剤のタイプなどの様々な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセル剤などを用いてもよい。水溶液での非経口投与には、例えば、溶液を必要に応じて適切に緩衝し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にしておくべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適したものである。これと関連して、用いることができる無菌水性媒体については、本開示を踏まえれば当業者にはわかるであろう。例えば、1用量を等張NaCl溶液1mLに溶かし、皮下注入液1000mLに加えるか、または考えられる注入部位に注射し得る。治療する対象の状態によっては、用量にある程度の変化が必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与を担当する者が個々の対象に適した用量を決定することになる。
「ポリペプチド」は、その従来の意味で、すなわち、100個未満の一続きのアミノ酸として使用される。ポリペプチドは通常、単量体の実体を指す。「タンパク質」という用語は、100個を超える一続きのアミノ酸および/または多量体の実体を指す。本発明のタンパク質は特定の長さの生成物に限定されない。この用語は、天然のものも非天然のものも含め、タンパク質の発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などおよび当該技術分野で公知の他の修飾を指すものでも除外するものでもない。タンパク質はタンパク質全体またはその配列であり得る。「単離タンパク質」とは、その天然環境の構成成分から同定および分離され、かつ/または回収されたタンパク質のことである。好ましい実施形態では、単離タンパク質を、
(1)ローリー方法による測定で80重量%、85重量%、90重量%、95重量%を超えるまで、最も好ましくは96重量%、97重量%、98重量%または99重量%を超えるまで、
(2)スピニングカップ配列決定装置の使用により少なくとも15残基のN末端または内部のアミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、あるいは
(3)還元性条件下または非還元性条件下でクーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いるSDS−PAGEにより均一になるまで、
精製する。単離タンパク質は、タンパク質の天然環境の少なくとも1つの構成成分が存在しないことから、組換え細胞内のin situのタンパク質を包含する。しかし、少なくとも1つの精製段階により単離タンパク質を調製するのが通常である。
(1)ローリー方法による測定で80重量%、85重量%、90重量%、95重量%を超えるまで、最も好ましくは96重量%、97重量%、98重量%または99重量%を超えるまで、
(2)スピニングカップ配列決定装置の使用により少なくとも15残基のN末端または内部のアミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、あるいは
(3)還元性条件下または非還元性条件下でクーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いるSDS−PAGEにより均一になるまで、
精製する。単離タンパク質は、タンパク質の天然環境の少なくとも1つの構成成分が存在しないことから、組換え細胞内のin situのタンパク質を包含する。しかし、少なくとも1つの精製段階により単離タンパク質を調製するのが通常である。
「ポリペプチド誘導体」または「タンパク質誘導体」は、アミノ基(−−NH−−)、より具体的にはペプチド結合を有する化合物を指す。ポリペプチドおよびタンパク質を置換アミドと考えることができる。アミド基と同じように、ペプチド結合は高度の共鳴安定化を示す。ペプチド結合内のC−−N単結合は通常、二重結合性が約40パーセントであり、C=O二重結合は単結合性が約40パーセントである。「保護基」とは、保護されていない官能基に関わる望ましくない反応(タンパク質分解など)を防止する基のことである。アミノ保護基の具体例としては、ホルミル;トリフルオロアセチル;ベンジルオキシカルボニル;(オルト−またはパラ−)クロロベンジルオキシカルボニルおよび(オルト−またはパラ−)ブロモベンジルオキシカルボニルなどの置換ベンジルオキシカルボニル;ならびにt−ブトキシカルボニルおよびt−アミロキシカルボニルなどの脂肪族オキシカルボニルが挙げられる。アミノ酸のカルボキシル基は、エステル基への変換により保護することができる。エステル基としては、ベンジルエステル、置換ベンジルエステル、例えばメトキシベンジルエステルなど;アルキルエステル、例えばシクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステルまたはt−ブチルエステルなどが挙げられる。グアニジノ部分は保護基を必要としないものの、ニトロ;またはアリールスルホニル、例えばトシル、メトキシベンゼンスルホニルまたはメシチレンスルホニルなどによって保護してもよい。イミダゾールの保護基としては、トシル、ベンジルおよびジニトロフェニルが挙げられる。トリプトファンのインドール基は、ホルミルによって保護しても、保護しなくてもよい。
少なくともClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドまたはタンパク質の修飾は、特にそのin vivoの寿命を改善することを目的とする。修飾の1つのタイプに、ポリペプチドまたはタンパク質のN末端またはC末端へのポリエチレングリコール(PEG)の付加がある。PEGは、ポリペプチドの理想的な担体になるための多数の特性、例えば高い水溶性、溶液中での高い移動性および低い免疫原性などを有することが当業者に知られている。この修飾により、ポリペプチドおよびタンパク質がエキソペプチダーゼから保護され、したがって、その全体的なin vivo安定性も増大する。
エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼによるポリペプチドおよびタンパク質の分解を防ぐのに用いられるその他の修飾としては、アセチル化またはグリコシル化などのN末端修飾、アミド化などのC末端修飾およびポリペプチドまたはタンパク質内の特定部位での非天然アミノ酸(β−アミノおよびα−トリフルオロメチルアミノ酸)の使用が挙げられる。
ポリペプチドおよびタンパク質の分子の大きさを増大させるまた別の方法として、ポリペプチドとヒト免疫グロブリン(例えば、IgA、IgMおよびIgGを含む)のFcドメインとの遺伝子融合またはポリペプチドとアルブミンとの融合がある。
「満腹」は、個体がその欲求が満たされている、または最小限に抑えられていると感じる実質的にホメオスタシスの状態を指す。多数の生理学的因子が個体の満腹に影響を及ぼすと考えられている。例えば、味覚、すなわち味、嗅覚、すなわち匂いおよび胃部膨満感はいずれも、個体が「満腹である」と感じるかどうかに寄与すると思われる。より具体的には、「満腹」はそれ以上食べることが抑えられた状態であり、食間の時間および次の食事で摂取する食事の量を決定する。「満腹感の増大」などは、対照状況に比して満腹感が強く、かつ/または持続するという意味を有する。
「飽満」は、食事中に食べることを停止する状態を指し、この状態は通常、食事の摂取を開始してから一定時間(例えば、20〜30分)以内に起こる/観察される。したがって、本明細書で「飽満の誘導」などと言う場合、それは常に、対象が食事中に食事の摂取を止める傾向が生じることという意味を有する。飽満に対する効果は、食事停止の時点、すなわち、食事開始から食事停止までに経過した時間をスコア化することにより判定することができる。食事停止時点での摂取カロリー量が対照より有意に少ない場合、例えば少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%またはそれ以上少ない場合などに、飽満効果が認められたことになる。それより長い期間(1週間、2週間、3週間、4週間、5週間またはそれ以上など)にわたって、体重減少または体重変化を対照食と比較してスコア化することもできる。一定量の被験組成物(例えば、1日1回、1日2回またはそれ以上)投与する対象の体重は、対照対象より有意に制御される(減少する、または増加が少ない)のが好ましい。本明細書で使用される「対照対象」は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤およびワクチンのいずれも投与していない対象を指す。
「対象」は、温血動物、好ましくはヒト、ペットまたは家畜を指す。本明細書で使用される「ペット」および「家畜」という用語は、特に限定されないが、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマおよび家禽を包含する。いくつかの実施形態では、対象は雄または雌の対象である。いくつかの実施形態では、対象は成体(例えば、[ヒトの年齢で]18歳超の対象または生殖能力獲得後の対象)である。別の実施形態では、対象は子供(例えば、[ヒトの年齢で]18歳未満の対象または生殖能力獲得前の対象)である。いくつかの実施形態では、対象は「患者」、すなわち、医療を受けるのを待っている、もしくは医療を受けている対象、または本発明の方法による医学的処置などの医学的処置の対象であった/対象である/対象となる予定である対象、または疾患の発症をモニターしている対象であってよい。
「徐放」は、治療活性物質が、(薬剤の毒性レベル未満にとどまっている)血中レベルが長時間(例えば、24時間以上、それにより、1日投与量の単回投与製剤となる)にわたって治療上有益なレベルに維持され得るように、制御された速度で組成物から放出され得ることを表す。
「治療有効量」は、
・少なくともClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質;または
・少なくとも本明細書に記載されるClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
・少なくとも本明細書に記載されるClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質をコードするベクター;
の量であって、対象に重大な負の副作用も有害な副作用も引き起こさずに有益な効果(例えば、満腹の刺激、飽満の延長、摂食量の減少、体重増加の制御、特に減少、体重減少の刺激および/または除脂肪量に対する脂肪量の比の減少)を得るのに十分な量を指す。本発明においては、対象に投与するポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはベクターの量は、個体の特徴、例えば全般的健康状態、年齢、性別、体重などによって決まる。当業者であれば、これらの因子およびその他の因子に応じて適切な用量を決定することが可能であろう。
・少なくともClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質;または
・少なくとも本明細書に記載されるClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
・少なくとも本明細書に記載されるClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質をコードするベクター;
の量であって、対象に重大な負の副作用も有害な副作用も引き起こさずに有益な効果(例えば、満腹の刺激、飽満の延長、摂食量の減少、体重増加の制御、特に減少、体重減少の刺激および/または除脂肪量に対する脂肪量の比の減少)を得るのに十分な量を指す。本発明においては、対象に投与するポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはベクターの量は、個体の特徴、例えば全般的健康状態、年齢、性別、体重などによって決まる。当業者であれば、これらの因子およびその他の因子に応じて適切な用量を決定することが可能であろう。
「治療すること」、「治療」または「緩和」は、治療的治療および予防手段の両方を指し、ここでは、その目的は標的とする病態または障害を予防する、または遅らせる(軽減する)ことである。治療を必要とする者としては、既に障害を有する者および障害を有する傾向がある者または障害を予防するべき者が挙げられる。治療量の本発明による薬剤を投与した後、対象に観察可能かつ/または測定可能な飽満、満腹の延長、摂食量の減少、体重増加の制御、体重減少の刺激および/または除脂肪量に対する脂肪量の比の減少がみられる場合、その対象または哺乳動物は標的とする病態または障害が良好に「治療された」ことになる。病態または障害の良好な治療および改善を評価するためのこれらのパラメータは、医師がよく知る日常的な方法によって容易に測定できるものである。
「バリアント」および「変異体」は互換可能な用語であり、1つまたは複数の置換、欠失、付加および/または挿入がある点で、本明細書に具体的に開示されるポリペプチドまたはタンパク質とは通常異なるポリペプチドまたはタンパク質を指す。このようなバリアントは、天然に存在するものであっても、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質の配列を修飾し、本明細書に記載されるポリペプチドもしくはタンパク質の1つもしくは複数の生物活性を評価し、かつ/または多数ある当該技術分野で周知の技術のうちのいずれかを用いることによって合成により作製したものであってもよい。ポリペプチドまたはタンパク質の構造に修飾を施し、それでもなお所望の特徴を有するバリアントまたは誘導体のポリペプチドまたはタンパク質をコードする機能的分子を得ることができる。
ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を変化させて、同等の、または場合によっては改善された本発明のポリペプチドまたはタンパク質のバリアントまたは一部分を作製することが望まれる場合、当業者は通常、コードDNA配列のコドンのうち1つまたは複数のものを変化させる。例えば、野生型タンパク質、例えばClpBタンパク質と比較してそれほど機能を失わせずに、タンパク質構造内の特定のアミノ酸を他のアミノ酸で置換し得る。
ポリペプチド配列またはタンパク質配列および当然のことながらその基礎となるDNAコード配列に特定のアミノ酸配列置換、欠失、付加および/または挿入を施し、それにより様々な特性を有するポリペプチドまたはタンパク質を得ることができる。したがって、ポリペプチドもしくはタンパク質の配列または前記ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする対応するDNA配列に、その生物学的な有用性または活性を大幅に調節(すなわち、活性化/増強または阻害/喪失)して様々な改変を施し得ることが考えられる。このような変異としては、特に限定されないが、ナンセンス変異、フレームシフト変異および非保存的ミスセンス変異が挙げられる。
ポリペプチド配列またはタンパク質配列および当然のことながらその基礎となるDNAコード配列に特定のアミノ酸配列置換、欠失、付加および/または挿入を施し、それでもなお同じ特性を有するポリペプチドまたはタンパク質を得ることができる。したがって、ポリペプチドもしくはタンパク質の配列または前記ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする対応するDNA配列に、その生物学的な有用性も活性もそれほど失わせずに様々な改変を施し得ることが考えられる。このような変異としては、特に限定されないが、サイレント変異、サイレントミスセンス変異および保存的変異が挙げられる。
「バリアント」および「変異体」という用語は、以下の修飾のうち1つまたは複数のものを有するポリペプチド:
i)ペプチジル−C(O)NR−結合のうち1つまたは複数のものが、非ペプチジル結合、例えば、RがC1〜C4アルキルである−CH2−カルバマート結合(−CH2OC(O)NR−)、ホスホナート結合、−CH2−スルホンアミド(−CH2−S(O)2NR−)結合、尿素(−NHC(O)NH−)結合、−CH2−第二級アミン結合またはアルキル化ペプチジル結合(−C(O)NR−)などに置き換わったポリペプチド;
ii)N末端が、RおよびR1が水素またはC1〜C4アルキルであり、ただし、RおよびR1はともに水素ではない−NRR1基、−NRC(O)R基、−NRC(O)OR基、−NRS(O)2R基、−NHC(O)NHR基に誘導体化されたポリペプチド;
iii)C末端が、R2がC1〜C4アルコキシからなる群より選択される−C(O)R2ならびにR3およびR4が独立に水素およびC1〜C4アルキルからなる群より選択される−NR3R4に誘導体化されたポリペプチド
も包含する。
i)ペプチジル−C(O)NR−結合のうち1つまたは複数のものが、非ペプチジル結合、例えば、RがC1〜C4アルキルである−CH2−カルバマート結合(−CH2OC(O)NR−)、ホスホナート結合、−CH2−スルホンアミド(−CH2−S(O)2NR−)結合、尿素(−NHC(O)NH−)結合、−CH2−第二級アミン結合またはアルキル化ペプチジル結合(−C(O)NR−)などに置き換わったポリペプチド;
ii)N末端が、RおよびR1が水素またはC1〜C4アルキルであり、ただし、RおよびR1はともに水素ではない−NRR1基、−NRC(O)R基、−NRC(O)OR基、−NRS(O)2R基、−NHC(O)NHR基に誘導体化されたポリペプチド;
iii)C末端が、R2がC1〜C4アルコキシからなる群より選択される−C(O)R2ならびにR3およびR4が独立に水素およびC1〜C4アルキルからなる群より選択される−NR3R4に誘導体化されたポリペプチド
も包含する。
「野生型」は、天然の入手源から単離された遺伝子またはタンパク質の特徴を有するその遺伝子またはタンパク質を指す。野生型の遺伝子またはタンパク質は、集団内で最も頻繁に観察され、したがって、「バリアント」または「変異体」に対して任意に「野生型」の遺伝子またはタンパク質と呼ばれるものである。
(詳細な説明)
したがって、本発明は、少なくともClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドまたはタンパク質に関する。
したがって、本発明は、少なくともClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドまたはタンパク質に関する。
一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、長さで少なくとも15個のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、75個、100個またはそれ以上のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、長さで100個、75個、60個、50個、40個、35個、30個、25個、20個、19個、18個、17個または16個未満のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、4〜100個もしくはそれ以上のアミノ酸、10〜80個のアミノ酸、15〜70個のアミノ酸、20〜60個のアミノ酸、25〜50個のアミノ酸、30〜45個のアミノ酸または35〜40個のアミノ酸を含む。
別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、10〜100個のアミノ酸または10〜80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個もしくは15個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、15〜100個のアミノ酸または15〜80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個もしくは20個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、20〜100個のアミノ酸または20〜80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個もしくは25個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、25〜100個のアミノ酸または25〜80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個もしくは30個のアミノ酸を含む。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個または24個のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個または100個のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、本発明のポリペプチドは15個未満のアミノ酸は含まない。一実施形態では、本発明のポリペプチドは少なくとも15個のアミノ酸を含む。一実施形態では、本発明のポリペプチドは20個未満のアミノ酸は含まない。一実施形態では、本発明のポリペプチドは少なくとも20個のアミノ酸を含む。
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、長さで少なくとも100個、125個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個、550個、600個またはそれ以上のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、本発明のタンパク質は、100〜1500個もしくはそれ以上のアミノ酸、100〜1000個のアミノ酸、100〜900個のアミノ酸、100〜850個のアミノ酸、100〜800個のアミノ酸、100〜750個のアミノ酸または100〜700個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のタンパク質は、150〜1500個、1000個、900個、850個、800個、750個または700個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のタンパク質は、200〜1500個、1000個、900個、850個、800個、750個または700個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のタンパク質は、300〜1500個、1000個、900個、850個、800個、750個または700個のアミノ酸を含む。
一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、15〜1500個もしくはそれ以上のアミノ酸、15〜1000個のアミノ酸、15〜900個のアミノ酸、15〜800個のアミノ酸、15〜700個のアミノ酸、15〜600個のアミノ酸または15〜500個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、20〜1500個、1000個、900個、800個、700個、600個または500個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、25〜1500個、1000個、900個、800個、700個、600個または500個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、30〜1500個、1000個、900個、800個、700個、600個または500個のアミノ酸を含む。
本発明によるClpBタンパク質は、六量体AAA+−ATPアーゼのHsp100/ClpBファミリーのメンバーであるカゼイン分解性プロテアーゼBタンパク質を指す。
一実施形態では、本発明によるClpBタンパク質は細菌のClpBタンパク質である。一実施形態では、本発明によるClpBタンパク質は腸内細菌科のタンパク質である。腸内細菌科としては、特に限定されないが、アルセノフォナス(Arsenophonus)、ブレネリア(Brenneria)、ブフネラ(Buchnera)、ブドビシア(Budvicia)、ブティアウクセラ(Buttiauxella)、セデセア(Cedecea)、シトロバクター(Citrobacter)、コセンゼア(Cosenzaea)、クロノバクター(Cronobacter)、ディケヤー(Dickeya)、エドワードシエラ(Edwardsiella)、エンテロバチルス(Enterobacillus)、エンテロバクター(Enterobacter)、エルウィニア(Erwinia)、エシェリキア(Escherichia)、エウィンゲラ(Ewingella)、フランコニバクター(Franconibacter)、ギッブシエラ(Gibbsiella)、ハフニア(Hafnia)、イズハキエラ(Izhakiella)、コサコニア(Kosakonia)、クレブシエラ(Klebsiella)、クライベラ(Kluyvera)、レクレルシア(Leclercia)、レリオッチア(Lelliottia)、レミノレラ(Leminorella)、レビネア(Levinea)、ロンスダレア(Lonsdalea)、マングロビバクター(Mangrovibacter)、モエレレラ(Moellerella)、モーガネラ(Morganella)、オベサムバクテリウム(Obesumbacterium)、パントエア(Pantoea)、ペクトバクテリウム(Pectobacterium)、ファセオリバクター(Phaseolibacter)、フォトラブダス(Photorhabdus)、プレシオモナス(Plesiomonas)、プルラリバクター(Pluralibacter)、プラジア(Pragia)、プロテウス(Proteus)、プロビデンシア(Providencia)、シュードシトロバクター(Pseudocitrobacter)、ラーネラ(Rahnella)、ラオウルテラ(Raoultella)、ローゼンベルギエラ(Rosenbergiella)、ロウシエラ(Rouxiella)、サッカロバクター(Saccharobacter)、サルモネラ(Salmonella)、サムソニア(Samsonia)、セラチア(Serratia)、シゲラ(Shigella)、シムウェリア(Shimwellia)、シッキバクター(Siccibacter)、ソーダリス(Sodalis)、テイタメラ(Tatumella)、ソルセリア(Thorsellia)、トラブルシエラ(Trabulsiella)、ウィグレスウォルシア(Wigglesworthia)、ゼノラブダス(Xenorhabdus)、エルシニア(Yersinia)およびヨケネラ(Yokenella)が挙げられる。
一実施形態では、本発明によるClpBタンパク質は、ハフニア(Hafnia)由来ClpB、好ましくはハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)由来ClpB(配列番号1)である。一実施形態では、本発明によるClpBタンパク質は、大腸菌(E.coli)由来ClpB、好ましくは大腸菌(E.coli)K12由来ClpB(配列番号21)である。
ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)では、シャペロンタンパク質ClpBは857アミノ酸のタンパク質である。一実施形態では、ClpBタンパク質は、配列番号1で示されるハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)由来シャペロンタンパク質ClpBのアミノ酸配列(GenBank参照番号:KIC99545.2)を有する。一実施形態では、ClpBのアミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも約95〜約100%同一であるアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。本願においては、同一性の割合は、グローバルアライメント(すなわち、2つの配列をその全長にわたって比較する)を用いて算出されるものである。
配列番号1
MRLDRLTSKFQLALADAQSLALGRDNQFIEPVHLMSALLNQDGGTVRPLLTSAGVNTASLRQELEQAISRLPQVEGAGGDVQPSNELIRVLNLCDKLAQKRNDTFISSELFVLAVLEDRGNLGDILKAAGANVQKVSTAIEQMRGGEKVDDANAEDQRQALKKYTVDLTERAEQGKLDPVIGRDEEIRRTIQVLQRRTKNNPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRIINGEVPEGLKNKRVLSLDMGSLIAGAKFRGEFEERLKAVLSDLSKQEGNVILFIDELHTMVGAGKGDGAMDAGNMLKPALARGELHCVGATTLDEYRQYIEKDAALERRFQKVFVAEPTVEDTIAILRGLKERYELHHHVQITDPAIVAAANLSHRYIADRQLPDKAIDLIDEAASSIRMQMDSKPESLDRLERRIIQLKLEQQALNKESDEASKKRLEMLNEELEHKEREYSELEEEWKAEKASLSGTQNIKAEIEQAKIALEQARRVGDLAKMSEIQYGKLPGLEKQLEAATQSEGKTMKLLRNKVTDVEIAEVLARWTGIPVSRMLESERAKLLRMEDDLHERVIGQNEAVEAVSNAIRRSRAGLSDPNRPIGSFLFLGPTGVGKTELCKALANFLFDSDDAMVRIDMSEFMEKHSVSRLVGAPPGYVGYEEGGYLTEAVRRRPYSVILLDEVEKAHPDVFNILLQVLDDGRLTDGQGRTVDFRNTVVIMTSNLGSDLIQDRFGQLDYGEMKELVMSVVSHHFRPEFINRIDETVVFHPLDQKNIKAIARIQLERLYQRLEEKGYSVTITDAALEQLSKAGFDPVYGARPLKRAIQQEIENPLAQQILSGKLIPGKDITLDVADEQIVAKQ
MRLDRLTSKFQLALADAQSLALGRDNQFIEPVHLMSALLNQDGGTVRPLLTSAGVNTASLRQELEQAISRLPQVEGAGGDVQPSNELIRVLNLCDKLAQKRNDTFISSELFVLAVLEDRGNLGDILKAAGANVQKVSTAIEQMRGGEKVDDANAEDQRQALKKYTVDLTERAEQGKLDPVIGRDEEIRRTIQVLQRRTKNNPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRIINGEVPEGLKNKRVLSLDMGSLIAGAKFRGEFEERLKAVLSDLSKQEGNVILFIDELHTMVGAGKGDGAMDAGNMLKPALARGELHCVGATTLDEYRQYIEKDAALERRFQKVFVAEPTVEDTIAILRGLKERYELHHHVQITDPAIVAAANLSHRYIADRQLPDKAIDLIDEAASSIRMQMDSKPESLDRLERRIIQLKLEQQALNKESDEASKKRLEMLNEELEHKEREYSELEEEWKAEKASLSGTQNIKAEIEQAKIALEQARRVGDLAKMSEIQYGKLPGLEKQLEAATQSEGKTMKLLRNKVTDVEIAEVLARWTGIPVSRMLESERAKLLRMEDDLHERVIGQNEAVEAVSNAIRRSRAGLSDPNRPIGSFLFLGPTGVGKTELCKALANFLFDSDDAMVRIDMSEFMEKHSVSRLVGAPPGYVGYEEGGYLTEAVRRRPYSVILLDEVEKAHPDVFNILLQVLDDGRLTDGQGRTVDFRNTVVIMTSNLGSDLIQDRFGQLDYGEMKELVMSVVSHHFRPEFINRIDETVVFHPLDQKNIKAIARIQLERLYQRLEEKGYSVTITDAALEQLSKAGFDPVYGARPLKRAIQQEIENPLAQQILSGKLIPGKDITLDVADEQIVAKQ
大腸菌(E.coli)K12では、シャペロンタンパク質ClpBは857アミノ酸のタンパク質である。一実施形態では、ClpBタンパク質は、配列番号21で示される大腸菌(E.coli)K12由来シャペロンタンパク質ClpBのアミノ酸配列(GenBank参照番号:BAA16476.1)を有する。一実施形態では、ClpBのアミノ酸配列は、配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも約95〜約100%同一であるアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。本願においては、同一性の割合は、グローバルアライメント(すなわち、2つの配列をその全長にわたって比較する)を用いて算出されるものである。
一実施形態では、本発明によるClpBタンパク質はClpBバリアントである。
一実施形態では、本明細書で使用されるClpBバリアントは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示す配列を含むかこれよりなるものである。
ClpBバリアントは、上記のものに加えて、またはこれに代えて、非保存的変化を含み得る。一実施形態では、バリアントポリペプチドは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加により天然の配列とは異なるものである。バリアントは、上記のものに加えて(またはこれに代えて)、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水・親水性に対する影響が最小限になるアミノ酸の欠失または付加によって改変されていてよい。
一実施形態では、配列番号1のバリアントは、配列番号1のものと少なくとも同等の効率で、必要とする対象の飽満を誘導すること、満腹を延長すること、摂食量を減少させること、体重増加を制御すること、体重減少を刺激することおよび/または除脂肪量に対する脂肪量の比を減少させることが可能である。
一実施形態では、配列番号1のバリアントは、配列番号1の配列と比較して保存的アミノ酸置換、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の保存的アミノ酸置換などを含む。
別の実施形態では、配列番号1のバリアントは、配列番号1の配列の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個もしくはそれ以上のアミノ酸が存在しないか、任意のアミノ酸によって置換されている、または1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個もしくはそれ以上のアミノ酸(連続するものであるかどうかを問わない)が付加されている、ポリペプチドである。
一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、少なくともClpBのフラグメント、好ましくは、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列を有するClpBのフラグメントを含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、ClpBタンパク質、好ましくは配列番号1のアミノ酸配列を有するClpBの少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、75個、100個またはそれ以上のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、長さで100個、75個、60個、50個、40個、35個、30個、25個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個未満またはそれ以下のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、4〜100個もしくはそれ以上のアミノ酸、10〜80個のアミノ酸、15〜70個のアミノ酸、20〜60個のアミノ酸、25〜50個のアミノ酸、30〜45個のアミノ酸または35〜40個のアミノ酸を含む。
別の実施形態では、ClpBフラグメントは、4〜80個のアミノ酸または4〜70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、15個もしくは10個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ClpBフラグメントは、6〜100個のアミノ酸または6〜80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、15個もしくは10個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ClpBフラグメントは、8〜100個のアミノ酸もしくは8〜80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、15個もしくは10個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ClpBフラグメントは、10〜100個のアミノ酸または10〜80個、70個、60個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個もしくは15個のアミノ酸を含む。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個または20個のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。別の実施形態では、ClpBフラグメントは、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、80個、90個または100個のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。
別の実施形態では、ClpBフラグメントは、100〜500個もしくはそれ以上のアミノ酸、100〜400個のアミノ酸、100〜300個のアミノ酸、100〜200個のアミノ酸または100〜150個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ClpBフラグメントは、150〜500個もしくはそれ以上のアミノ酸、150〜400個のアミノ酸、150〜300個のアミノ酸または150〜200個のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ClpBフラグメントは、100〜350個のアミノ酸、150〜300個のアミノ酸または200〜250個のアミノ酸を含む。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、100個、125個、150個、175個、200個、250個または300個のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。別の実施形態では、ClpBフラグメントは、220個のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、210個、211個、212個、213個、214個、215個、216個、217個、218個、219個、220個、221個、222個、223個、224個、225個、226個、227個、228個、229個または230個のアミノ酸を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1またはそのバリアントの少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、75個、100個またはそれ以上のアミノ酸残基を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1の少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、75個、100個またはそれ以上の連続するアミノ酸残基を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1またはそのバリアントの少なくとも4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、50個、60個、75個、100個またはそれ以上の不連続のアミノ酸残基を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1またはそのバリアントの少なくとも5個の不連続のアミノ酸残基を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1またはそのバリアントの少なくとも6個の不連続のアミノ酸残基を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、本発明のClpBフラグメントは、負荷電残基と、2つの連続するArg残基とTrp残基とを含む。一実施形態では、本発明のClpBフラグメントは、連続するArg残基とTrp残基と、連続するArg残基とTrp残基の上流にある負荷電残基とを含む。
一実施形態では、本発明のClpBフラグメントは、少なくとも連続するArg残基とTrp残基の上流にある負荷電残基を含む。本明細書で使用される「連続するArg残基とTrp残基の上流」という用語は、Arg残基から−1、−2、−3、−4または−5の位置を意味する。換言すれば、一実施形態では、連続するArgとTrpの配列のArg残基は、負荷電残基から+1、+2、+3、+4または+5の位置にある。
一実施形態では、負荷電残基はGlu残基またはAsp残基である。特定の実施形態では、負荷電残基はGlu残基である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、少なくとも配列番号1またはそのバリアントのアミノ酸残基E538を含む。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、少なくとも配列番号1またはそのバリアントのアミノ酸残基R542および/またはW543を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1またはそのバリアントの少なくともアミノ酸残基R542およびW543を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、少なくとも配列番号1のアミノ酸残基E538、R542およびW543を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号2のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号2
E/D−X2〜4−R−W
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸であり、好ましくはE/DはEである。
E/D−X2〜4−R−W
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸であり、好ましくはE/DはEである。
別の特定の実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号3のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号3
E/D−V−X−X−R−W
式中、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはE/DはEである。
E/D−V−X−X−R−W
式中、Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはE/DはEである。
別の特定の実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号4のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号4
E/D−V−L−A−R−W
E/D−V−L−A−R−W
好ましい実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号5のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号5
E−V−L−A−R−W
E−V−L−A−R−W
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号2、3、4または5のアミノ酸配列を含み、長さが少なくとも15アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸である。
一実施形態では、本発明のClpBフラグメントは、配列GKPVと少なくとも75%の配列相同性を有する配列をさらに含む。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、少なくとも配列番号1またはそのバリアントのアミノ酸残基G545、P547および/またはV548をさらに含む。特定の実施形態では、ClpBフラグメントは、少なくとも配列番号1またはそのバリアントのアミノ酸残基G545、I546、P547および/またはV548を含む。好ましい実施形態では、ClpBフラグメントは、少なくとも配列番号1またはそのバリアントのアミノ酸残基G545、I546、P547およびV548を含む。
一実施形態では、本発明によるClpBフラグメントは、少なくとも配列番号1またはそのバリアントのアミノ酸残基E538、R542、W543、G545、P547およびV548を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、本発明によるClpBフラグメントは、少なくとも配列番号1またはそのバリアントのアミノ酸残基E538、R542、W543、G545、I546、P547およびV548を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号6のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号6
E/D−X2〜4−R−W−X−G−X−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸であり、好ましくはE/DはEである。
E/D−X2〜4−R−W−X−G−X−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸であり、好ましくはE/DはEである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号7のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号7
E/D−X2〜4−R−W−X−G−I/K−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
E/D−X2〜4−R−W−X−G−I/K−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号8のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号8
E−X2〜4−R−W−X−G−I/K−P−V
E−X2〜4−R−W−X−G−I/K−P−V
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号9のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号9
E−X2〜4−R−W−X−G−I−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
E−X2〜4−R−W−X−G−I−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号10のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号10
E−X2〜4−R−W−T−G−I−P−V
式中、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
E−X2〜4−R−W−T−G−I−P−V
式中、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号11のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号11
E−V−X−X−R−W−T−G−I−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸である。
E−V−X−X−R−W−T−G−I−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号12のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号12
E−V−L−A−R−W−T−G−I−P−V
E−V−L−A−R−W−T−G−I−P−V
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号13のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号13
E−X2〜4−R−W−X−G−K−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
E−X2〜4−R−W−X−G−K−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸であり、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号14のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号14
E−X2〜4−R−W−T−G−K−P−V
式中、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
E−X2〜4−R−W−T−G−K−P−V
式中、X2〜4は2個、3個または4個の任意のアミノ酸である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号15のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号15
E−V−X−X−R−W−T−G−K−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸である。
E−V−X−X−R−W−T−G−K−P−V
式中、Xは任意のアミノ酸である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号16のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
配列番号16
E−V−L−A−R−W−T−G−K−P−V
E−V−L−A−R−W−T−G−K−P−V
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16のアミノ酸配列を含み、長さが少なくとも15アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸である。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列538〜548(EVLARWTGIPV、配列番号12)と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号12のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列536〜548(IAEVLARWTGIPV、配列番号18)と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号18のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号21のアミノ酸配列534〜548(AEIAEVLARWTGIPV、配列番号19)と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号19のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列534〜548(VEIAEVLARWTGIPV、配列番号17)と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号17のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号21のアミノ酸配列537〜756(配列番号22)と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。一実施形態では、ClpBフラグメントは、配列番号22のアミノ酸配列を含むかこれよりなるものである。
一実施形態では、少なくともClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドまたはタンパク質は、ClpBタンパク質のアミノ酸配列からなるものではない。換言すれば、一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質は完全長ClpBタンパク質ではない。したがって、一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列は、ClpB配列と100%同一というわけではない。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号1と100%同一というわけではなく、かつ/または配列番号21と100%同一というわけではない。
一実施形態では、少なくともClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドまたはタンパク質は、α−MSHのアミノ酸配列からなるものではない。特定の実施形態では、少なくともClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号20で示されるアミノ酸配列からなるものではない。
一実施形態では、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントは、α−MSH(配列番号20)と相同性を有する。一実施形態では、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントは、α−MSHと立体配座相同性を有する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントはα−MSHと配列相同性を有する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントは、α−MSHと立体配座および配列相同性を有する。
一実施形態では、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントは、抗α−MSH抗体によって認識される。換言すれば、一実施形態では、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントは、抗α−MSH抗体のエピトープとしての役割を果たす。一実施形態では、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントは、抗α−MSH抗体の立体構造エピトープとしての役割を果たす。
一実施形態では、少なくともClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチド誘導体である。
一実施形態では、当該技術分野で周知の手段により、例えば、リン酸基、酢酸基、脂質基または炭水化物基などの1つもしくは複数の官能基の付加により、かつ/または1つもしくは複数の保護基の付加により、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントを修飾する。例えば、1つまたは複数のリン酸、酢酸などの官能基または様々な脂質および炭水化物の付加により、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントを修飾することができる。
本明細書に記載される本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントは、当該技術分野で周知のように、化学合成または酵素合成によって合成により作製することができる。あるいは、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質または本発明のそのバリアントをコードするヌクレオチド配列をタンパク質発現ベクターに導入し、適切な宿主生物体(例えば、細菌、昆虫細胞など)に産生させた後、精製することができる。一実施形態では、例えば、当該技術分野で公知の任意の産生系、例えば大腸菌(E.coli)、酵母、バキュロウイルス−昆虫細胞またはHEKもしくはCHO発現系などの哺乳動物細胞などを用いて、クローニング法により本発明のポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアントを得る。
ポリペプチドを精製または同定または精製する目的で追加のポリペプチド(「タグ」)を付加することができる。タンパク質タグにより、例えば、ポリペプチドを高い親和性でマトリックスに吸着させ、次いで、複合体をほとんど溶離させずにマトリックスを適切な緩衝液でしっかりと洗浄し、次いで、吸着した複合体を選択的に溶離させることが可能になる。当業者に公知のタンパク質タグの例には、(His)6タグ、Mycタグ、FLAGタグ、赤血球凝集素タグ、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)タグ、アフィニティキチン結合タグを有するインテインまたはマルトース結合タンパク質(MBP)タグがある。これらのタンパク質タグは、N末端、C末端および/または内部に位置し得る。
本発明はさらに、少なくとも本明細書に記載されるClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは核酸に関する。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は、例えばメッセンジャーRNA(mRNA)の形態のRNAである。
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は一本鎖である。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸は二本鎖である。
本発明のまた別の目的は、少なくとも本明細書に記載されるClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質をコードする、または少なくとも本明細書に記載されるClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくは核酸を含む、ベクターである。
ベクターの例としては、特に限定されないが、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、カチオン小胞または他の任意のタイプのベクターが挙げられる。
一実施形態では、本発明のベクターは発現ベクターである。
本発明のまた別の目的は、本明細書に記載されるポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアント、あるいは本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは核酸、あるいは本明細書に記載されるベクターを含む、組成物である。
本発明のまた別の目的は、本明細書に記載されるポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアント、あるいは本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは核酸、あるいは本明細書に記載されるベクターと、少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物である。
本発明のまた別の目的は、本明細書に記載されるポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアント、あるいは本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは核酸、あるいは本明細書に記載されるベクターを含む、薬剤である。
一実施形態では、本発明の医薬組成物または薬剤は、治療有効量の本発明のポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸またはベクターを含む。
本発明のまた別の目的は、本明細書に記載されるポリペプチドもしくはタンパク質またはそのバリアント、あるいは本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは核酸、あるいは本明細書に記載されるベクターを含む、ワクチンである。
一実施形態では、本発明によるワクチンは、体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害の予防に使用するためのものである。
本発明のまた別の目的は、本明細書に記載されるClpBタンパク質のフラグメントを含むポリペプチド、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列を含むClpBフラグメントを含むポリペプチドを含む、栄養補助食品またはタンパク質栄養補助食品である。
本発明のまた別の目的は、本明細書に記載されるClpBタンパク質のフラグメントを含むポリペプチド、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列を含むClpBフラグメントを含むポリペプチドを含む、食用組成物である。
一実施形態では、栄養補助食品または食用組成物は、約1重量%〜約80重量%の本発明によるClpBタンパク質のフラグメントを含むポリペプチドまたはタンパク質を含むか、これよりなるものである。一実施形態では、栄養補助食品または食用組成物は、約1重量%〜約50重量%、好ましくは約2重量%〜約25重量%の本発明によるClpBタンパク質のフラグメントを含むポリペプチドまたはタンパク質を含むか、これよりなるものである。
一実施形態では、栄養補助食品または食用組成物は、少なくとも1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%またはそれ以上の本発明によるClpBタンパク質のフラグメントを含むポリペプチドを含むか、これよりなるものである。
一実施形態では、本発明の栄養補助食品または食用組成物は、単純炭水化物および/または複合炭水化物、脂質、繊維あるいはミネラルのなかから選択される少なくとも1つの追加の成分を含む。
一実施形態では、本発明の栄養補助食品または食用組成物は、少なくとも1つの必須アミノ酸を含む。好ましくは、前記少なくとも1つの必須アミノ酸は、単離されているか、遊離している、すなわち、タンパク質鎖の中で結合していない。
一実施形態では、本発明による栄養補助食品または食用組成物は、無水粉末または水もしくは水分を含有する粉末の形態である。
一実施形態では、栄養補助食品または食用組成物は、担体または媒体をさらに含む。「担体」または「媒体」は、投与に適した材料を意味し、任意の当該技術分野で公知のこのような材料、例えば、無毒性であり、組成物のあらゆる構成成分、特に細菌株と有害な方法で相互作用することのない任意の液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤などがこれに含まれる。栄養学的に許容される担体の例としては、例えば、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ロウ、石油ゼリー、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエスラル(petroethral)脂肪酸エステル、ヒドロキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
一実施形態では、本発明の栄養補助食品または食用組成物は、一定量の食物繊維を含む。食物繊維は酵素による消化を受けずに小腸を通過し、天然の膨張性薬剤および緩下剤として機能する。食物繊維は可溶性であっても不溶性であってもよく、一般に、この2つのタイプを配合したものが好ましい。適切な食物繊維源としては、ダイズ、エンドウマメ、エンバク、ペクチン、グアーガム、アラビアゴム、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、シアリル−ラクトースおよび動物の乳由来のオリゴ糖が挙げられる。いくつかの実施形態では、食物繊維はマンナン類のなかから選択される。マンナン類(グルコマンナンおよびガラクトマンナンなど)、例えばグアーガム、イナゴマメガム、コンニャクおよびキサンタンガムなどは、一部の植物細胞壁中に存在する。グルコマンナンは一般に、(1−4)−β結合したグルコースとマンノースの単位からなり、ガラクトマンナンは一般に、(1−6)−α−ガラクトースの単一単位で置換された(1−4)−βマンナン主鎖からなる。グアーおよびイナゴマメなどの胚乳を形成するマメ科植物の多くは、種子発生期の胚乳中にガラクトマンナンが含まれている。グルコマンナンは、穀物の微量構成成分であることも明らかにされている。
一実施形態では、本発明の栄養補助食品または食用組成物は、USRDAなどの政府機関の推奨に従って、微量元素およびビタミンなどのミネラルおよび微量栄養素を含有する。例えば、組成物は1日量当たり、以下の所与の範囲の微量栄養素、すなわち、300〜500mgのカルシウム、50〜100mgのマグネシウム、150〜250mgのリン、5〜20mgの鉄、1〜7mgの亜鉛、0.1〜0.3mgの銅、50〜200μgのヨウ素、5〜15μgのセレン、1000〜3000μgのベータカロテン、10〜80mgのビタミンC、1〜2mgのビタミンB1、0.5〜1.5mgのビタミンB6、0.5〜2mgのビタミンB2、5〜18mgのナイアシン、0.5〜2.0μgのビタミンB12、100〜800μgの葉酸、30〜70μgのビオチン、1〜5μgのビタミンD、3〜10μgのビタミンEのうち1つまたは複数のものを含有し得る。
一実施形態では、本発明の栄養補助食品または食用組成物は乳化剤をさらに含む。食品用乳化剤の例としては通常、ジアセチル酒石酸モノグリセリドエステル、ジアセチル酒石酸ジグリセリドエステル、レシチン、モノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられる。同様に、適切な塩および安定剤も含まれ得る。
一実施形態では、本発明による栄養補助食品または食用組成物をダイエット食品の調製に使用することができる。
一実施形態では、本発明による栄養補助食品または食用組成物を毎日の食事への導入に使用することができる。
本発明は、必要とする対象の炎症の治療に使用する上記の少なくともClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤にも関する。
本発明のまた別の目的は、必要とする対象の炎症を治療する方法であって、対象に有効量の上記の少なくともClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤を投与することを含む、方法に関する。
本発明の意義の範囲内では、「炎症」は、Dorland’s Medical Dictionaryで定義されるように、「組織の損傷または破壊によって引き起こされ、有害な物質および損傷組織の両方を破壊する、希釈する、または囲う役割を果たす局所的防御応答」を意味する。炎症は、毛細血管系の開窓、血液要素の間質腔内への漏出および炎症組織内への白血球に移動を特徴とする。肉眼レベルでは、これに紅斑、浮腫、痛覚過敏(圧痛)および疼痛といったよく知られた臨床徴候が伴う。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤は、炎症の治療に使用するためのものであり、前記炎症は、肥満、肥満に関連する疾患または障害、神経炎症、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、アレルギー、強直性脊椎炎、関節炎(変形性関節症、関節リウマチまたは乾癬性関節炎)、喘息、移植片対宿主病、パーキンソン病、アルツハイマー病、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス、腎炎および潰瘍性大腸炎を含む群より選択される。
一実施形態では、本発明の炎症は急性炎症である。別の実施形態では、本発明の炎症は慢性炎症である。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤は、炎症の治療に使用するためのものであり、前記炎症は、肥満、肥満に関連する疾患または障害、神経炎症、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性鼻炎、変形性関節症および神経炎症性疾患を含むかこれよりなる群から選択される。特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤は、炎症の治療に使用するためのものであり、前記炎症は、肥満、神経炎症、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性鼻炎、変形性関節症および神経炎症性疾患を含むかこれよりなる群から選択される。
本発明のまた別の目的は、必要とする対象の肥満の治療または予防に使用する本発明による少なくともClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤に関する。
本発明のまた別の目的は、必要とする対象の肥満を治療または予防する方法であって、対象に有効量の上記の少なくともClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤を投与することを含む、方法に関する。
本発明の一態様は、体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害の治療あるいは予防に使用する上記の少なくともClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤に関する。
本発明のまた別の態様は、必要とする対象の体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害を治療あるいは予防する方法であって、対象に有効量の上記の少なくともClpBタンパク質もしくはそのバリアントのフラグメントを含むかこれよりなるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ワクチン、医薬組成物または薬剤を投与することを含む、方法に関する。
体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害としては、特に限定されないが、高血圧、糖尿病(特に2型糖尿病)、グルコース不耐性、インスリン抵抗性、心血管疾患(アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、狭窄動脈、狭心症、心臓発作、血餅など)、高コレステロール、脂肪性肝疾患、肝脂肪症、胆石症、関節障害、変形性関節症、整形外科的障害、平衡障害、皮膚病態、睡眠時無呼吸、呼吸障害、喘息、重度のいびき、癌(乳癌、結腸癌、胆嚢癌、子宮がん、結腸癌および前立腺癌を含む)、メタボリック症候群、月経異常および心理社会的影響が挙げられる。
本発明の一態様は、必要とする対象に飽満を誘導する方法であって、対象に有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを投与することを含む、方法に関する。
本発明の一態様は、必要とする対象に飽満を誘導するのに使用する本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンに関する。
本発明の一態様は、対象に飽満を誘導することへの本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の非治療的使用に関する。
本発明の一態様は、必要とする対象の満腹を延長する方法であって、対象に有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与することを含む、方法に関する。
本発明の一態様は、必要とする対象の満腹を延長するのに使用する本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物に関する。
本発明の一態様は、対象の満腹を延長することへの本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の非治療的使用に関する。
一実施形態では、満腹の延長は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の延長である。特定の実施形態では、満腹の延長は、食間に経過した時間、好ましくは本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の食間に経過した時間の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の延長である。一実施形態では、満腹の延長は、少なくとも15%、20%または25%の延長である。特定の実施形態では、満腹の延長は、食間に経過した時間、好ましくは本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の食間に経過した時間の少なくとも15%、20%または25%の延長である。
本発明の一態様は、必要とする対象の食事量を減少させる方法であって、対象に有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与することを含む、方法に関する。
本発明の一態様は、必要とする対象の食事量を減少させるのに使用する本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物に関する。
本発明の一態様は、対象の食事量を減少させることへの本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の非治療的使用に関する。
一実施形態では、食事量の減少は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の減少である。特定の実施形態では、食事量の減少は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の食事量の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の減少である。一実施形態では、食事量の減少は、少なくとも15%、20%または25%の減少である。特定の実施形態では、食事量の減少は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の食事量の少なくとも15%、20%または25%の減少である。
本発明の一態様は、必要とする対象の摂食量を減少させる方法であって、対象に有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与することを含む、方法に関する。
本発明の一態様は、必要とする対象の摂食量を減少させるのに使用する本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物に関する。
本発明の一態様は、対象の摂食量を減少させることへの本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の非治療的使用に関する。
一実施形態では、摂食量の減少は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の減少である。特定の実施形態では、摂食量の減少は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の摂食量の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の減少である。一実施形態では、摂食量の減少は、少なくとも15%、20%または25%の減少である。特定の実施形態では、摂食量の減少は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の摂食量の少なくとも15%、20%または25%の減少である。
本発明の一態様は、必要とする対象の体重増加を制御する、特に減少させる方法であって、対象に有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与することを含む、方法にも関する。
本発明の一態様は、必要とする対象の体重増加を制御する、特に減少させるのに使用する本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物に関する。
本発明の一態様は、対象の体重増加を制御する、特に減少させることへの本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の非治療的使用に関する。
本発明のさらなる一態様は、必要とする対象の体重減少を刺激する方法であって、対象に有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与することを含む、方法にも関する。
本発明の一態様は、必要とする対象の体重減少を刺激するのに使用する本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物に関する。
本発明の一態様は、対象の体重減少を刺激することへの本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の非治療的使用に関する。
一実施形態では、体重減少の刺激は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の刺激である。特定の実施形態では、体重減少の刺激は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の対象の体重減少の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の刺激である。一実施形態では、体重減少の刺激は、少なくとも15%、20%または25%の刺激である。特定の実施形態では、体重減少の刺激は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の対象の体重減少の少なくとも15%、20%または25%の刺激である。
本発明のさらなる一態様は、必要とする対象の体重を減少させる方法であって、対象に有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与することを含む、方法にも関する。
本発明の一態様は、必要とする対象の体重を減少させるのに使用する本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物に関する。
本発明の一態様は、対象の体重を減少させることへの本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の非治療的使用に関する。
一実施形態では、体重の減少は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の減少である。特定の実施形態では、体重の減少は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の対象の体重の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の減少である。一実施形態では、体重の減少は、少なくとも15%、20%または25%の減少である。特定の実施形態では、体重の減少は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の対象の体重の少なくとも15%、20%または25%の減少である。
本発明の一態様は、必要とする対象の除脂肪量に対する脂肪量の比を減少させる方法であって、対象に有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与することを含む、方法に関する。
本発明の一態様は、必要とする対象、特に肥満の対象の除脂肪量に対する脂肪量の比を減少させるのに使用する本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物に関する。
本発明の一態様は、対象、特に正常体重または合併症のない体重過多の対象の除脂肪量に対する脂肪量の比を減少させることへの本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の非治療的使用に関する。
一実施形態では、除脂肪量に対する脂肪量の比の減少は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の減少である。特定の実施形態では、除脂肪量に対する脂肪量の比の減少は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の対象の除脂肪量に対する脂肪量の比の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%または10%の減少である。一実施形態では、除脂肪量に対する脂肪量の比の減少は、少なくとも15%、20%または25%の減少である。特定の実施形態では、除脂肪量に対する脂肪量の比の減少は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する前の対象の除脂肪量に対する脂肪量の比の少なくとも15%、20%または25%の減少である。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、栄養補助食品または食用組成物の使用は、美容的使用である。
一実施形態では、対象は雌である。いくつかの実施形態では、対象は雄である。
一実施形態では、対象は子供、例えば(ヒトの年齢で)18歳未満の個体などである。別の実施形態では、対象は成体、例えば(ヒトの年齢で)18歳以上の個体などである。
一実施形態では、対象は肥満である。一実施形態では、対象は体格指数(BMI)が30超である。
一実施形態では、対象は中程度の肥満である。一実施形態では、対象は、BMIが約30〜約35の範囲内にある。一実施形態では、対象は重度の肥満である。一実施形態では、対象は、BMIが約35〜約40の範囲内にある。一実施形態では、対象は病的に肥満である。一実施形態では、対象は、BMIが約40〜約50以上の範囲内にある。
一実施形態では、対象は肥満ではない。一実施形態では、対象はBMIが30未満である。一実施形態では、対象は体重過多である。したがって、一実施形態では、対象は、BMIが約25〜約30の範囲内にある。
一実施形態では、対象は健康な体重過多対象である。一実施形態では、対象は健康ではない体重過多対象である。
一実施形態では、対象は正常体重である。一実施形態では、対象は、BMIが約18.5〜25の範囲内にある。
一実施形態では、対象は、減量のための食事療法を実施中であり、かつ/または体重減少を望んでいる。別の実施形態では、対象は、減量のための食事療法を実施中ではなく、かつ/または体重減少を望んでいない。
一実施形態では、対象に体重が増加するリスクがある。いくつかの実施形態では、対象に過剰な脂肪が蓄積するリスクがある。
一実施形態では、対象に体重過多および/または肥満が発現するリスクがある。一実施形態では、対象に体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害が発現するリスクがある。
一実施形態では、対象はむちゃ食い者である。一実施形態では、対象にむちゃ食い障害または過食障害が認められる。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸またはベクターを組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンの形態で対象に投与する。一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸またはベクターを薬学的に許容される添加剤および任意選択で生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合せて医薬組成物を形成する。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを経口的に、注射により、局所的に、経鼻的に、頬側的に、直腸内に、経膣的に、気管内に、内視鏡により、経粘膜的に、または経皮投与により投与することができる。
本発明による開示のポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンは、様々な方法で標的細胞に送達することができる。選択する送達機序は、部分的には、標的とする細胞のタイプおよび送達を例えばin vivoまたはin vitroのいずれで実施するかによって決まる。当業者であれば、本発明のポリペプチドまたは核酸配列の送達を適合させることが可能であろう。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを経口的に投与することができる。経口投与に適した製剤の例としては、特に限定されないが、固体形態、液体形態およびゲルが挙げられる。経口投与に適した固体形態の例としては、特に限定されないが、丸剤、錠剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、カプレット、圧縮錠剤、カシェ剤、オブラート剤、糖衣丸剤、糖衣錠または分散/もしくは崩壊錠剤、粉末、経口投与前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに適した固体形態および発泡錠が挙げられる。経口投与に適した液体形態の例としては、特に限定されないが、液剤、懸濁剤、飲用液剤、エリキシル剤、密閉バイアル、頓服水薬、水薬、シロップおよび濃縮溶液が挙げられる。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンは、注射により投与する、好ましくは全身注射することができる。全身注射に適した製剤の例としては、特に限定されないが、液体の液剤または懸濁剤、使用前に液体に溶解または懸濁させるのに適した固体形態が挙げられる。全身注射の例としては、特に限定されないが、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、硝子体内注射および腹腔内注射または灌流が挙げられる。別の実施形態では、注射する場合、本発明の組成物、医薬組成物または薬剤は無菌である。無菌医薬組成物を得る方法としては、特に限定されないが、GMP合成(GMPは「Good manufacturing practice」の略語である)が挙げられる。
別の実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを局所的に投与することができる。局所投与に適した製剤の例としては、特に限定されないが、スティック剤、ワックス剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、バーム剤、ゲル剤、マスク剤、リーブオンウォッシュ(leave−on wash)などが挙げられる。
本発明の一実施形態では、軟膏は、油性軟膏;乳化軟膏、例えば水中油型もしくは油中水型軟膏など;または水溶性軟膏であり、好ましくは油性軟膏である。
本発明の一実施形態では、油性軟膏は基剤、例えば植物油および動物油など;植物性脂肪および動物性脂肪;ロウ;ワセリン、例えば白ワセリンまたはワセリン油など;ならびにパラフィン、例えば流動パラフィンまたはパラフィン油などを用いるものである。
別の実施形態では、経皮システム、例えば組成物を染み込ませ不浸透性の裏地に積層した樹脂性架橋剤を有するアクリル系ポリマー粘着剤の1つなどを用いて、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを局所的に塗布することもできる。経皮投与に適した製剤の例としては、特に限定されないが、軟膏、ペースト、クリーム、フィルム、バーム、パッチ、例えば経皮パッチなど、ゲル、リポソームの形態などが挙げられる。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを経皮パッチ、より具体的には徐放経皮パッチとして局所的に投与することができる。経皮パッチとしては、任意の従来の形態、例えば粘着性マトリックス、ポリマーマトリックス、リザーバーパッチ、マトリックスまたは一体型の層状構造物などが挙げられ、一般に、1つまたは複数の裏地層、粘着剤、浸透促進剤、任意選択の速度制御膜および適用前に取り外して粘着剤を露出させる剥離ライナーからなるものである。ポリマーマトリックスパッチはポリマーマトリックス形成材料も含む。適切な経皮パッチについては当該技術分野で十分に記載されている[例えば、米国特許第5262165号、同第5948433号、同第6010715号および同第6071531号を参照されたい]。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを制御放出、遅延放出、持続放出、長時間作用型放出、調節放出、徐放または時間放出の形態で投与する。したがって、一実施形態では、本発明による組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンは、生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスをさらに含む。
一実施形態では、本発明による栄養補助食品または食用組成物を経口的に投与することができる。経口投与に適した製剤の例としては、特に限定されないが、固体形態、液体形態およびゲルが挙げられる。経口投与に適した固体形態の例としては、特に限定されないが、丸剤、錠剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、カプレット、圧縮錠剤、カシェ剤、オブラート剤、糖衣丸剤、糖衣錠または分散/もしくは崩壊錠剤、粉末、経口投与前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに適した固体形態および発泡錠が挙げられる。経口投与に適した液体形態の例としては、特に限定されないが、液剤、懸濁剤、飲用液剤、エリキシル剤、密閉バイアル、頓服水薬、水薬、シロップおよび濃縮溶液が挙げられる。
一実施形態では、本発明による栄養補助食品または食用組成物を、例えばミルク、ジュース、水などの消費可能な液体と混合する粉末、または他の食事用の液体もしくは食品に混ぜる消費可能なゲルもしくはシロップとして製剤化する。一実施形態では、本発明による栄養補助食品または食用組成物を他の食品または液体とともに製剤化して、例えば一食用のバーなどの予め計量した補助食品にする。必要に応じて香味剤、結合剤、タンパク質、複合炭水化物などを添加し得る。
一実施形態では、任意の薬学的に許容される形態のビタミン、ミネラルおよび上記のその他の栄養素ならびその塩を用いて、本発明による栄養補助食品または食用組成物を製剤化する。好ましい形態には、炭酸カルシウム、水酸化マグネシウムまたは硫酸マグネシウム、四ホウ酸ナトリウム、酸化第二銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、コレカルシフェロール、フマル酸第一鉄、ピリドキシン塩酸塩、ピコリン酸クロム、d−アルファトコフェロールおよびアスコルビン酸がある。
一実施形態では、治療有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを少なくとも1日1回、1日2回または少なくとも1日3回投与する。別の実施形態では、治療有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを毎日、隔日、2日置きに、3日置きに、4日置きに、5日置きに、または6日置きに投与する。
別の実施形態では、治療有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを毎週、週2回、2週間ごとに、または月1回投与する。別の実施形態では、治療有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを毎月、少なくとも2か月、3か月、4か月、5か月または6か月の期間にわたって投与する。
別の実施形態では、治療有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドまたはベクターは、約1μg〜5gの範囲内にある。別の実施形態では、投与する治療有効量の本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくはベクターは、約0.1μg/kg〜1g/kg、すなわち、体重1キロ当たり0.1μg〜体重1キロ当たり1gの範囲内にある。
一実施形態では、本発明の方法は慢性治療のためのものである、すなわち、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを長期間にわたって、例えば少なくとも約1週間、1か月間、1年間またはそれ以上などにわたって投与する。
別の実施形態では、本発明の方法は急性治療、例えば本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤またはワクチンを1回、2回または3回のみ投与する治療などのためのものである。
一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物の投与を例えば、1日2〜3回、1日間またはそれ以上にわたって、一般には、必要に応じて1つまたは複数の中断期間を設けて、少なくとも4日、または場合によっては4〜15週間の長期間にわたって反復する。一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を対象の食事と同時に、または逐次的に投与する。一実施形態では、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を対象の食事の前に投与する。
本発明は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、組成物、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を含む、キットにも関する。
一実施形態では、本発明のキットは、必要とする対象にポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する手段をさらに含む。
ポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する手段としては、特に限定されないが、シリンジ、針およびその他の器具が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与する手段は、本発明のポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、医薬組成物、薬剤またはワクチンを予め充填したシリンジを含む。
一実施形態では、本発明のキットは、前記対象にポリペプチドもしくはタンパク質、ポリヌクレオチドもしくは核酸、医薬組成物、薬剤、ワクチン、栄養補助食品または食用組成物を投与するための指示書をさらに含む。
一実施形態では、本発明のキットは、必要とする対象の肥満の治療または予防に使用するためのものである。一実施形態では、本発明のキットは、必要とする対象の体重過多および/または肥満に関連する疾患もしくは障害の治療または予防に使用するためのものである。
一実施形態では、本発明のキットは、必要とする対象の飽満の誘導する、満腹の延長、食事量の減少、摂食量の減少、体重増加の制御、体重増加の減少、体重減少の刺激、体重の減少および/または除脂肪量に対する脂肪量の比の減少に使用するためのものである。
本発明を実施例によってさらに説明する。ただし、これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。
実施例1:α−MSHと相同性を有する細菌タンパク質の同定
これまでのコンピュータ解析から、大腸菌(E.coli)および一部のその他の微生物の数種類のタンパク質にはα−MSHとアミノ酸配列の相同性があることが明らかにされており、これらのタンパク質がα−MSH反応性自己抗体の産生を担っている可能性が示唆されている(Fetissov,in:Neuropsychiatric Disorders and Infection,Fatemi,S.H.(編),Taylor & Francis Books Ldt,2004,pp 253−262;Fetissovら,2008.Nutrition.24:348−359)。
これまでのコンピュータ解析から、大腸菌(E.coli)および一部のその他の微生物の数種類のタンパク質にはα−MSHとアミノ酸配列の相同性があることが明らかにされており、これらのタンパク質がα−MSH反応性自己抗体の産生を担っている可能性が示唆されている(Fetissov,in:Neuropsychiatric Disorders and Infection,Fatemi,S.H.(編),Taylor & Francis Books Ldt,2004,pp 253−262;Fetissovら,2008.Nutrition.24:348−359)。
いずれの細菌タンパク質が理論的のみならず機能的にもα−MSH抗原模倣体である可能性があるのかを明らかにするため、これまで大腸菌(E.coli)株K12を用いた新規なプロテオミクスアプローチに取り組んできた。この方法の新規性は、ウエスタンブロットなどの免疫検出プロトコルにみられるいわゆる一次抗体による非特異的染色という周知の現象を利用する点にあった。この方法では、α−MSHペプチドと細菌タンパク質の間の構造的立体配座相同性の基盤として、抗体の産生に用いられる抗原ペプチド以外のタンパク質の「非特異的染色」を調べた。
材料および方法
ここで概説するプロテオミクスアプローチは、最初の研究(Tennouneら,2014,Transl Psychiatry,4:e458)で用いられたものであり、大腸菌(E.coli)K12の全タンパク質を分離する二次元ゲル電気泳動にある。
ここで概説するプロテオミクスアプローチは、最初の研究(Tennouneら,2014,Transl Psychiatry,4:e458)で用いられたものであり、大腸菌(E.coli)K12の全タンパク質を分離する二次元ゲル電気泳動にある。
二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動
二次元(2D)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)では、大腸菌(E.coli)K12タンパク質抽出物400μgを等電点フォーカシング緩衝液(7M尿素、2Mチオウレアおよび0.5%両性電解質、pH4〜7、20mMジチオスレイトール、2mMトリブチルホスフィン、2%CHAPSおよび0.005%ブロモフェノールブルー)に加え、軽く振盪しながら室温で60分間可溶化した。ReadyStrip IPG Strip(18cm、pH4〜7 NL、Bio−Rad社、マルヌ=ラ=コケット、フランス)を用いて一次元のゲル分離を実施した。等電点フォーカシング緩衝液でストリップの受動的再水和を24時間実施した後、タンパク質試料を陰極から1.5cmの位置に設置されたローディングカップからストリップに加えた。Ettan IPGphor 3 System(GE Healthcare社)を用いて等電点フォーカシングを4段階(31500Vh)、すなわち、500Vを1時間、1000Vの勾配、10000Vの勾配および10000Vを2時間で実施した。2%ジチオスレイトールおよび2.5%ヨードアセトアミドをそれぞれ用いた2つの平衡化段階の後、Ettan Daltsix垂直電気泳動システム(GE Healthcare社)を用い、1ゲル当たり12mAで二次元、すなわち、SDS−PAGE(10%ポリアクリルアミドゲル、20cm×18cm×1mm)を実施した。SDS−PAGE後、2Dゲルを2%(体積:体積)オルトリン酸中および50%(体積:体積)メタノール中、室温で2時間固定した。
二次元(2D)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)では、大腸菌(E.coli)K12タンパク質抽出物400μgを等電点フォーカシング緩衝液(7M尿素、2Mチオウレアおよび0.5%両性電解質、pH4〜7、20mMジチオスレイトール、2mMトリブチルホスフィン、2%CHAPSおよび0.005%ブロモフェノールブルー)に加え、軽く振盪しながら室温で60分間可溶化した。ReadyStrip IPG Strip(18cm、pH4〜7 NL、Bio−Rad社、マルヌ=ラ=コケット、フランス)を用いて一次元のゲル分離を実施した。等電点フォーカシング緩衝液でストリップの受動的再水和を24時間実施した後、タンパク質試料を陰極から1.5cmの位置に設置されたローディングカップからストリップに加えた。Ettan IPGphor 3 System(GE Healthcare社)を用いて等電点フォーカシングを4段階(31500Vh)、すなわち、500Vを1時間、1000Vの勾配、10000Vの勾配および10000Vを2時間で実施した。2%ジチオスレイトールおよび2.5%ヨードアセトアミドをそれぞれ用いた2つの平衡化段階の後、Ettan Daltsix垂直電気泳動システム(GE Healthcare社)を用い、1ゲル当たり12mAで二次元、すなわち、SDS−PAGE(10%ポリアクリルアミドゲル、20cm×18cm×1mm)を実施した。SDS−PAGE後、2Dゲルを2%(体積:体積)オルトリン酸中および50%(体積:体積)メタノール中、室温で2時間固定した。
次いで、ゲルを水ですすぎ、タンパク質のスポットをCBB G−250(Bio−Rad Laboratories社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国)染色(34%(体積:体積)メタノール、17%(重量:体積)硫酸アンモニウム、2%(体積:体積)オルトリン酸および1リットル当たり0.66gのCBB G−250)により可視化した。
イムノブロッティング
2D−PAGEののち、大腸菌(E.coli)細胞質タンパク質を乾燥転写法(Trans Blot Cell、Bio−Rad社)および0.8mA/cm2膜サイズの一定電流により2時間、Hybond−ECLポリビニリデンジフルオリド膜(GE Healthcare社)に転写した。転写後、0.05%(体積:体積)Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS;10mmol/Lトリス、pH8および150mmol/L NaCl)中5%(重量:体積)のミルク(Regilait社、マコン、フランス)で膜をブロックした。洗浄後、膜をポリクローナルウサギ抗α−MSH IgG(1:1000、Peninsula Laboratories社、サンカルロス、カリフォルニア州、米国)と4℃で一晩インキュベートした後、洗浄し、ポリクローナルブタ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートIg(1:3000;Dako社、トラップ、フランス)とインキュベートした。ECL検出システム(GE Healthcare社)により免疫ブロットを明らかにし、ImageScanner II(GE Healthcare社)でスキャンし、Labscan 6.00ソフトウェア(GE Healthcare社)でデジタル化した。
2D−PAGEののち、大腸菌(E.coli)細胞質タンパク質を乾燥転写法(Trans Blot Cell、Bio−Rad社)および0.8mA/cm2膜サイズの一定電流により2時間、Hybond−ECLポリビニリデンジフルオリド膜(GE Healthcare社)に転写した。転写後、0.05%(体積:体積)Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS;10mmol/Lトリス、pH8および150mmol/L NaCl)中5%(重量:体積)のミルク(Regilait社、マコン、フランス)で膜をブロックした。洗浄後、膜をポリクローナルウサギ抗α−MSH IgG(1:1000、Peninsula Laboratories社、サンカルロス、カリフォルニア州、米国)と4℃で一晩インキュベートした後、洗浄し、ポリクローナルブタ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートIg(1:3000;Dako社、トラップ、フランス)とインキュベートした。ECL検出システム(GE Healthcare社)により免疫ブロットを明らかにし、ImageScanner II(GE Healthcare社)でスキャンし、Labscan 6.00ソフトウェア(GE Healthcare社)でデジタル化した。
106Mのα−MSHペプチド(Bachem AG社、ブーベンドルフ、スイス)を用い、ウサギ抗α−MSH IgGを4℃で一晩吸着させた後、同じ手順を実施した。
タンパク質同定
Ettan Spot Picker(GE Healthcare社)を用いて、目的とするタンパク質のスポットをCBB G−250染色2Dゲルから切り出し、自動化されたタンパク質のゲル中消化をEttan Digester(GE Healthcare社)で実施した。次いで、タンパク質抽出物を5%(体積:体積)アセトニトリル/0.1%(体積:体積)ギ酸10μlに再懸濁させ、次いで、ナノスプレー源およびHPLCチップキューブインターフェースを備えた6340イオントラップ質量分析計と連結したナノLC1200システム(Agilent Technologies社、クールタブフ、フランス)で分析した。簡潔に述べれば、ペプチドを40nlのRPC18トラップカラムで濃縮および脱塩し、Zorbax(細孔径30nm、粒子径5μm)C18カラム(長さ43mm×内径75μm;Agilent Technologies社)で分離した。流速400nl/分で9分の直線勾配(0.1%ギ酸中アセトニトリル3〜80%)を用い、溶離液をイオントラップ質量分析計で分析した。タンパク質同定には、MS/MSピークリストを抽出し、MASCOT Daemon version 2.2.2(Matrix Science社、ボストン、マサチューセッツ州、米国)検索エンジンを用いることによりタンパク質データベースと比較した。検索は以下の具体的パラメータ:酵素特異性、トリプシン;切断ミスを1つ許容;固定修飾無し;可変修飾、メチオニンの酸化、システインのカルバミドメチル化、セリン、チロシンおよびトレオニンのリン酸化;モノアイソトピック;ペプチド電荷、2+および3+;前駆体イオンの質量許容差、1.5Da;断片化の質量許容差、0.6Da;機器としてエレクトロスプレーイオン化トラップ;分類、大腸菌(E.coli);米国立生物工学情報センター(NCBI)データベース(NCBI Nr20120531(18280215配列、6265275233残基);ベセスダ、メリーランド州、米国)を用いて実施した。タンパク質のヒットが以下の基準、すなわち、それぞれMASCOTスコア454(Po0.01)の少なくとも2つの上位ペプチド(太字および赤色)と同一またはそれぞれMASCOTスコア447(Po0.05)の少なくとも2つの上位ペプチドと同一のうち1つのものを満たすかどうかを自動的に検証した。偽陽性率を評価するため、最初のデータベース検索はいずれもMASCOTの「デコイ」オプションを用いて実施した。偽陽性率が1%を超えることがない場合、結果を適切であるとした。
Ettan Spot Picker(GE Healthcare社)を用いて、目的とするタンパク質のスポットをCBB G−250染色2Dゲルから切り出し、自動化されたタンパク質のゲル中消化をEttan Digester(GE Healthcare社)で実施した。次いで、タンパク質抽出物を5%(体積:体積)アセトニトリル/0.1%(体積:体積)ギ酸10μlに再懸濁させ、次いで、ナノスプレー源およびHPLCチップキューブインターフェースを備えた6340イオントラップ質量分析計と連結したナノLC1200システム(Agilent Technologies社、クールタブフ、フランス)で分析した。簡潔に述べれば、ペプチドを40nlのRPC18トラップカラムで濃縮および脱塩し、Zorbax(細孔径30nm、粒子径5μm)C18カラム(長さ43mm×内径75μm;Agilent Technologies社)で分離した。流速400nl/分で9分の直線勾配(0.1%ギ酸中アセトニトリル3〜80%)を用い、溶離液をイオントラップ質量分析計で分析した。タンパク質同定には、MS/MSピークリストを抽出し、MASCOT Daemon version 2.2.2(Matrix Science社、ボストン、マサチューセッツ州、米国)検索エンジンを用いることによりタンパク質データベースと比較した。検索は以下の具体的パラメータ:酵素特異性、トリプシン;切断ミスを1つ許容;固定修飾無し;可変修飾、メチオニンの酸化、システインのカルバミドメチル化、セリン、チロシンおよびトレオニンのリン酸化;モノアイソトピック;ペプチド電荷、2+および3+;前駆体イオンの質量許容差、1.5Da;断片化の質量許容差、0.6Da;機器としてエレクトロスプレーイオン化トラップ;分類、大腸菌(E.coli);米国立生物工学情報センター(NCBI)データベース(NCBI Nr20120531(18280215配列、6265275233残基);ベセスダ、メリーランド州、米国)を用いて実施した。タンパク質のヒットが以下の基準、すなわち、それぞれMASCOTスコア454(Po0.01)の少なくとも2つの上位ペプチド(太字および赤色)と同一またはそれぞれMASCOTスコア447(Po0.05)の少なくとも2つの上位ペプチドと同一のうち1つのものを満たすかどうかを自動的に検証した。偽陽性率を評価するため、最初のデータベース検索はいずれもMASCOTの「デコイ」オプションを用いて実施した。偽陽性率が1%を超えることがない場合、結果を適切であるとした。
結果
大腸菌(E.coli)K12の全タンパク質を分離する二次元ゲル電気泳動の結果を図1aに示す。膜に転写した後、ポリクローナル抗α−MSH IgGを加えてα−MSH様エピトープを含むタンパク質の存在を確認したところ、陽性スポットがいくつか明らかになった(図1b)。一方、α−MSHペプチドを前吸着させた後に抗α−MSH IgGを加えたところ、いくつかの陽性スポットのみが消失し(図1c)、消失したスポット(矢印)にのみα−MSH様エピトープが含まれることが示唆された。α−MSH特異的に染色されたスポットのうち最も強く染色されたスポットを質量分析により同定したところ、それらが熱ショックファミリーの96kDaタンパク質であるカゼイン分解性プロテアーゼB(ClpB)ホモログに対応することが明らかになった(図1aのスポット1、2、3、4)。
大腸菌(E.coli)K12の全タンパク質を分離する二次元ゲル電気泳動の結果を図1aに示す。膜に転写した後、ポリクローナル抗α−MSH IgGを加えてα−MSH様エピトープを含むタンパク質の存在を確認したところ、陽性スポットがいくつか明らかになった(図1b)。一方、α−MSHペプチドを前吸着させた後に抗α−MSH IgGを加えたところ、いくつかの陽性スポットのみが消失し(図1c)、消失したスポット(矢印)にのみα−MSH様エピトープが含まれることが示唆された。α−MSH特異的に染色されたスポットのうち最も強く染色されたスポットを質量分析により同定したところ、それらが熱ショックファミリーの96kDaタンパク質であるカゼイン分解性プロテアーゼB(ClpB)ホモログに対応することが明らかになった(図1aのスポット1、2、3、4)。
実施例2:ClpBとα−MSHとの間の配列アライメント
腸内細菌のClpBタンパク質は、α−MSH交差反応性抗体の産生を刺激することが明らかにされている。そこで本発明者らは、腸内細菌のClpBタンパク質内にα−MSH様エピトープが存在するとする仮説を立てた。
腸内細菌のClpBタンパク質は、α−MSH交差反応性抗体の産生を刺激することが明らかにされている。そこで本発明者らは、腸内細菌のClpBタンパク質内にα−MSH様エピトープが存在するとする仮説を立てた。
ClpBとα−MSHとの間の配列アライメントから、大腸菌(E.coli)とH.アルベイ(H.alvei)のClpBの中央部分(配列番号1のアミノ酸残基534〜548)に不連続な6アミノ酸配列の相同性があることが明らかになった(図2A)。このような配列は、大腸菌(E.coli)のタンパク質データベース、H.アルベイ(H.alvei)のタンパク質データベースともに、α−MSHの連続する配列の相同性に対する検索アルゴリズムを用いてα−MSHとの相同性をコンピュータで解析しても予測されなかった。さらに、このような連続する配列を含む大腸菌(E.coli)およびH.アルベイ(H.alvei)のタンパク質はプロテオミクスアプローチ(Fetissovら,2008.Transl Psychiatry,2014,4:e458)では同定することはできず、コンピュータによる方法を用いて機能的重要性を有する大きいタンパク質にペプチド様エピトープの存在を予測することの困難さが浮き彫りになった。さらに、このような配列相同性はカゼイ菌(L.casei)、B.アニマリス(B.animalis)、フェカリス菌(E.fecalis)およびS.セレビシエ(S.cerevisiae)などの他の細菌にも酵母にもみられなかった(図2B)。
α−MSHは、N末端ペプチドがアシル化された13アミノ酸である。中央部分HFRW(配列番号2のアミノ酸残基6〜9)は中枢メラノコルチン(MC)系の全ペプチドに共通のファルマコフォアであり、MC受容体活性化に必要とされ、Arg(8)とTrp(9)が最も重要なアミノ酸であり、N末端とC末端はともに異なる方法でMCR結合に関与する(Hrubyら,1987,J.Med.Chem.30:2126−2130;Schioethら,European Journal of Pharmacology,1998,349:359−366;Haskell−Luevanoら,2001,Journal of Medical Chemistry,44:2247−2252)。酸性アミノ酸Glu(5)(配列番号2のアミノ酸残基5)の存在が塩基性のArg(8)(配列番号2のアミノ酸残基8)との塩橋形成を介してα−MSHの空間的立体配座に関与しているものと思われる。このようなα−MSHのフォールディングがβターンを形成し、MCR活性化に必要なペプチドコア配列を露出させている(Liら,1999,European Journal of Biochemistry,265:430−440)。
腸内細菌のClpB配列は、α−MSHペプチドに関して以下のような特性を共通にもつ:
1.MC受容体の活性化に必要なα−MSHファルマコフォアの2つの極めて重要なアミノ酸(配列番号2のR8W9)である連続するArg(配列番号1のR542)とTrp(配列番号1のW543)の存在;
2.タンパク質/ペプチドのフォールディングおよびβターンでの中央RW配列の露出に重要であると考えられるGlu(配列番号2のE5)と相同な負荷電Glu(配列番号1のE538)の存在;
3.(配列番号1の)GIPV545〜548の(配列番号2の)GKPV10〜13、すなわち、α−MSHのC末端(側)との配列相同性(75%)存在。
1.MC受容体の活性化に必要なα−MSHファルマコフォアの2つの極めて重要なアミノ酸(配列番号2のR8W9)である連続するArg(配列番号1のR542)とTrp(配列番号1のW543)の存在;
2.タンパク質/ペプチドのフォールディングおよびβターンでの中央RW配列の露出に重要であると考えられるGlu(配列番号2のE5)と相同な負荷電Glu(配列番号1のE538)の存在;
3.(配列番号1の)GIPV545〜548の(配列番号2の)GKPV10〜13、すなわち、α−MSHのC末端(側)との配列相同性(75%)存在。
抗原性相互作用およびα−MSH様リガンド相互作用をともに含めたClpBのα−MSH様エピトープ(配列番号1のアミノ酸残基534〜548)に特有の機能には、最初の2つの特性の組合せが必要である可能性が考えられる。
あらゆる共生性および病原性の腸内細菌科に同一のClpBのα−MSH様エピトープが含まれており、この科に属する細菌がα−MSHシグナル伝達に干渉することができることが示唆された。このような細菌としては、特に限定されないが、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、シゲラ(Shigella)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、シトロバクター(Citrobacter)属、クロノバクター(Cronobacter)属およびハフニア(Hafnia)属が挙げられる。
実施例3:ClpBフラグメントの同定
材料および方法
ClpB断片化
最初に、異なる条件、すなわち、(5mg/mLのストックから)10分の1に希釈したClpBおよび0.0025%トリプシンを含む10分の1ClpBで断片化を実施した。これらの条件を37℃で20分間置いた。インキュベーション後、直ちにチューブを氷上に置いて断片化を停止させ、ウエスタンブロットを実施した。
材料および方法
ClpB断片化
最初に、異なる条件、すなわち、(5mg/mLのストックから)10分の1に希釈したClpBおよび0.0025%トリプシンを含む10分の1ClpBで断片化を実施した。これらの条件を37℃で20分間置いた。インキュベーション後、直ちにチューブを氷上に置いて断片化を停止させ、ウエスタンブロットを実施した。
ウエスタンブロット法
断片化の後、βメルカプトエタノールを含まないLeamli溶液をチューブに加え、トリス−グリシン緩衝液(BioRad社、ハーキュリーズ、米国)中20%のアクリルアミドSDSゲルでウエスタンブロットを実施し、ニトロセルロース膜(GE Healthcare社、オルセー、フランス)に転写した。次いで、0.05%(w/v)Tween 20を加えたTBS(10mmol/Lトリス、pH8;150mmol/L NaCl)中5%(w/v)の無脂肪粉乳で膜を室温で少なくとも1時間ブロックした。ブロッキング後、膜を抗a−MSH抗体と4℃で一晩インキュベートした。膜をウサギポリクローナル抗α−MSH抗体(1:1000、Phoenix Pharmaceuticals社)と4℃で一晩インキュベートした。TBS/0.05%Tween 20中5%(w/v)の無脂肪粉乳のブロッキング溶液で3回洗浄した後、膜をペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギIgG(1:1000、SantaCruz Biotechnology社)と1時間インキュベートした。3回洗浄した後、ECL検出キット(GE Healthcare社)を用いてペルオキシダーゼ反応を明らかにした。タンパク質バンドを分子量標準物質(Precision Plus、BioRad社)と比較し、ImageScanner III(GE Healthcare社)を用いてフィルムをスキャンした。
断片化の後、βメルカプトエタノールを含まないLeamli溶液をチューブに加え、トリス−グリシン緩衝液(BioRad社、ハーキュリーズ、米国)中20%のアクリルアミドSDSゲルでウエスタンブロットを実施し、ニトロセルロース膜(GE Healthcare社、オルセー、フランス)に転写した。次いで、0.05%(w/v)Tween 20を加えたTBS(10mmol/Lトリス、pH8;150mmol/L NaCl)中5%(w/v)の無脂肪粉乳で膜を室温で少なくとも1時間ブロックした。ブロッキング後、膜を抗a−MSH抗体と4℃で一晩インキュベートした。膜をウサギポリクローナル抗α−MSH抗体(1:1000、Phoenix Pharmaceuticals社)と4℃で一晩インキュベートした。TBS/0.05%Tween 20中5%(w/v)の無脂肪粉乳のブロッキング溶液で3回洗浄した後、膜をペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギIgG(1:1000、SantaCruz Biotechnology社)と1時間インキュベートした。3回洗浄した後、ECL検出キット(GE Healthcare社)を用いてペルオキシダーゼ反応を明らかにした。タンパク質バンドを分子量標準物質(Precision Plus、BioRad社)と比較し、ImageScanner III(GE Healthcare社)を用いてフィルムをスキャンした。
血漿、視床下部および結腸粘膜を用いたウエスタンブロット
動物の管理および実験はいずれも、米国国立衛生研究所によって確立されたガイドラインに従い、フランスの規則および欧州共同体の規則(Official Journal of the European Community L358,18,18/12/1986)を順守するものとした。雄のSprague−DawleyラットまたはマウスC57Bl6(Janvier Labs社、ジュネスト=サン=ティスル、フランス)を飼育ケージ中、制御された環境条件下(22℃±1℃、午前7:30点灯の12時間の明暗周期)で飼育した。馴化期間中、水およびRM1標準固形飼料(RM1飼料;Special Diet Service社、ウィザム、エセックス、英国)を自由摂取させた。
動物の管理および実験はいずれも、米国国立衛生研究所によって確立されたガイドラインに従い、フランスの規則および欧州共同体の規則(Official Journal of the European Community L358,18,18/12/1986)を順守するものとした。雄のSprague−DawleyラットまたはマウスC57Bl6(Janvier Labs社、ジュネスト=サン=ティスル、フランス)を飼育ケージ中、制御された環境条件下(22℃±1℃、午前7:30点灯の12時間の明暗周期)で飼育した。馴化期間中、水およびRM1標準固形飼料(RM1飼料;Special Diet Service社、ウィザム、エセックス、英国)を自由摂取させた。
上記のラットおよびマウスから結腸の粘膜を採取し、PBSで洗浄した。これらの同じ動物から血漿および視床下部も採取し、−80℃で保管した。
組織を抽出緩衝液(PBS+プロテアーゼ阻害剤)(1%))とインキュベートした。加えた体積は試料の量によって異なる。ポッターを用いて試料をホモジナイズした。次いで、試料を遠心分離した(12000g、20分、4℃)。上清は、直ちに分析しない場合、−80℃で保管した。
用いたプロトコルは、Laemli溶液にβメルカプトエタノール10%(w/v)を加えた以外は先に記載したものと同じである。次いで、試料を85℃で2分間加熱した後、ゲル上で泳動させた。2種類の一次抗体、すなわち、ウサギポリクローナル抗大腸菌(E.coli)ClpB抗体(1:5000、Delphi Genetics社)および抗アルファMSH抗体(1:3000、Phoenix Pharmaceuticals社)を試験した。使用する二次抗体はともにペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギIgG(1:5000、Dako社)とした。
結果
トリプシンとプレインキュベートしたClpBタンパク質で実施したウエスタンブロットでは、抗α−MSH抗体で明らかにしたときバンドが数本みられた(図3)。したがって、トリプシン処理の段階ではClpBのフラグメントがいくつか得られる。特に、約25kDaのものが他のフラグメントより多く得られるように思われる。さらに、これらの結果は、フラグメントが抗α−MSH抗体によって認識されることから、フラグメントにはα−MSHペプチドと類似性を有する配列が含まれていることを示している。
トリプシンとプレインキュベートしたClpBタンパク質で実施したウエスタンブロットでは、抗α−MSH抗体で明らかにしたときバンドが数本みられた(図3)。したがって、トリプシン処理の段階ではClpBのフラグメントがいくつか得られる。特に、約25kDaのものが他のフラグメントより多く得られるように思われる。さらに、これらの結果は、フラグメントが抗α−MSH抗体によって認識されることから、フラグメントにはα−MSHペプチドと類似性を有する配列が含まれていることを示している。
さらに、ウエスタンブロットでは、トリプシン処理後の溶液中には完全長ClpB(約96kDa)が全く存在しないことが明らかになった。
さらに、図4の結果から、約25kDaのフラグメントがマウス(A)およびラット(B)の結腸粘膜、視床下部および血漿に検出されることがわかる。さらに、このフラグメントはポリクローナル抗α−MSH(a)および抗ClpB抗体(b)で明らかになるものである。
この約25kDaのフラグメントのシークエンシングを実施したところ、このフラグメントはClpB配列のアミノ酸537〜アミノ酸756(配列番号22)に対応するように思われる。
実施例4:PYYおよびGLP−1放出に対する本発明のポリペプチドの効果
ラット結腸を用いたPYY分泌実験
細胞培養
ラットを安楽死させた後、結腸の試料を採取し、新鮮なリン酸緩衝生理食塩水液(PBS)で洗浄した。次いで、生理的pHを維持しながら腸組織をL−15培地(リーボビッツ15培地;Sigma−Aldrich社、ミズーリ州、米国)で洗浄した。結腸粘膜をかき取り、高グルコースDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地(Dominique Dutscher社、フランス)に5.5mmol/LのL−グルタミン、100U/mLのペニシリン、0.1mg/mLのストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を添加したもの)中、37℃で5〜10分間、0.4mg/mLのコラゲナーゼIX(Psichasら,2015.Int J Obes(Lond).39(3):424−9)で消化した。細胞懸濁液を750rpmで8分間遠心分離し、腸細胞を10%のウシ胎児血清を添加した同じ添加DMEM培地に懸濁させた。細胞懸濁液を100μm(Merck Millipore社、マサチューセッツ州、米国)でろ過し、1%マトリゲル(Corning社、ニューヨーク州、米国)でコートした24ウェルプレートで培養した。最後に、プレートを95%O2/5%CO2雰囲気下、37℃で一晩インキュベートした。
ラット結腸を用いたPYY分泌実験
細胞培養
ラットを安楽死させた後、結腸の試料を採取し、新鮮なリン酸緩衝生理食塩水液(PBS)で洗浄した。次いで、生理的pHを維持しながら腸組織をL−15培地(リーボビッツ15培地;Sigma−Aldrich社、ミズーリ州、米国)で洗浄した。結腸粘膜をかき取り、高グルコースDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地(Dominique Dutscher社、フランス)に5.5mmol/LのL−グルタミン、100U/mLのペニシリン、0.1mg/mLのストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸を添加したもの)中、37℃で5〜10分間、0.4mg/mLのコラゲナーゼIX(Psichasら,2015.Int J Obes(Lond).39(3):424−9)で消化した。細胞懸濁液を750rpmで8分間遠心分離し、腸細胞を10%のウシ胎児血清を添加した同じ添加DMEM培地に懸濁させた。細胞懸濁液を100μm(Merck Millipore社、マサチューセッツ州、米国)でろ過し、1%マトリゲル(Corning社、ニューヨーク州、米国)でコートした24ウェルプレートで培養した。最後に、プレートを95%O2/5%CO2雰囲気下、37℃で一晩インキュベートした。
細胞溶解物の調製
事前に野生型(WT)およびClpB欠失型(ΔClpB)の大腸菌(E.coli)K12の細菌培養を実施し、全タンパク質抽出に進んだ。タンパク質抽出は、1%プロテアーゼ阻害剤(Sigma−Aldrich社、ミズーリ州、米国)を含有するPBS中、30秒間の超音波処理により実施した。次いで、10000rpm、4℃での遠心分離を30分間実施した。次いで、タンパク質を含有する上清を0.0025%トリプシンと37℃で20分間インキュベートした。インキュベーション後、直ちにチューブを氷上に置いて断片化を停止させた。タンパク質を含有する溶液の試料を採取し投与して、各条件の総タンパク質濃度を求めた。
事前に野生型(WT)およびClpB欠失型(ΔClpB)の大腸菌(E.coli)K12の細菌培養を実施し、全タンパク質抽出に進んだ。タンパク質抽出は、1%プロテアーゼ阻害剤(Sigma−Aldrich社、ミズーリ州、米国)を含有するPBS中、30秒間の超音波処理により実施した。次いで、10000rpm、4℃での遠心分離を30分間実施した。次いで、タンパク質を含有する上清を0.0025%トリプシンと37℃で20分間インキュベートした。インキュベーション後、直ちにチューブを氷上に置いて断片化を停止させた。タンパク質を含有する溶液の試料を採取し投与して、各条件の総タンパク質濃度を求めた。
これと同時に、腸細胞をpH7.4の分泌緩衝液(4.5mMのKCl、138mMのNaCl、4.2mMのNaHCO3、1.2mMのNaH2PO4,2.6mMのCaCl2、1.2MmのMgCl2および10mMのHEPES)中でインキュベートした。次いで、大腸菌(E.coli)K12 WTおよび大腸菌(E.coli)K12ΔClpB由来のタンパク質のトリプシン処理フラグメントを0.015μg/μLで含む分泌緩衝液中、細胞を37℃で20分間インキュベートした(Bretonら,2015.International Journal of Eating Disorders.49:805−808;各条件につきn=4)。対照として、細胞をPBSでもインキュベートした。
インキュベーション後、上清の試料を採取し、遠心分離し(10000rpmで3分間)、直ちに−80℃で保管した。次いで、細胞を溶解緩衝液(50mmol/Lトリス−HCl、150mmol/L NaCl、1%IGEPAL−CA630、0.5%デスオキシコール酸および無EDTAプロテアーゼインヒビターカクテル)で処理して細胞内のペプチドを抽出した。PYY測定を目的として直ちに細胞溶解物を−80℃で保管した。
PYY投与
細胞培地および細胞溶解物にPYY投与を実施して、PYYの(培地中への)遊離、(溶解物中での)産生および相対総PYY産生量(培地および溶解物)を測定した。この投与は、Fluorescent Immunoassay Kit(登録商標)(Phoenix Pharmaceuticals社)を製造業者の指示通りに用いて実施した。
細胞培地および細胞溶解物にPYY投与を実施して、PYYの(培地中への)遊離、(溶解物中での)産生および相対総PYY産生量(培地および溶解物)を測定した。この投与は、Fluorescent Immunoassay Kit(登録商標)(Phoenix Pharmaceuticals社)を製造業者の指示通りに用いて実施した。
簡潔に述べると、全試薬を再構成した後、1×アッセイ緩衝液50μl(総結合として2つのウェルに)、調製ペプチド標準物質50μl(2点測定で)、再水和した陽性対照50μl(2点測定で)および調製試料50μl(2点測定で)をイムノプレートに入れた。次いで、再水和した一次抗体25μlおよび再水和したビオチン化ペプチド25μlをブランクウェル以外の各ウェルに加えた。マイクロプレートを300〜400rpmの軌道振盪下、室温(20〜23℃)で2時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルを1×アッセイ緩衝液350μlで4回洗浄し、事前にSA−HRP 12μlを1×アッセイ緩衝液12mlで希釈して調製したSA−HRP抗体溶液100μlを加えた。イムノプレートを300〜400rpmの軌道振盪下、室温(20〜23℃)で1時間、再びインキュベートした。インキュベーション後、各ウェルを前の場合と同様に洗浄し、TMB基質溶液100μlを加えた。プレートを300〜400rpmの軌道振盪下、室温(20〜23℃)で1時間インキュベートし光から保護した。
最後に、2N HCl 100μlを各ウェルに加えて反応を停止させ(ウェル内の色が青色から黄色に変化した)、イムノプレートをマイクロタイタープレートリーダーで読み取った。吸光度を450nmで読み取った。
ラットの結腸および回腸を用いたPYY分泌実験
雄ラット(Janvier Labs社、ジュネスト=サン=ティスル、フランス)から結腸および回腸を取り出した。それを氷冷PBS、次いで氷冷L−15(リーボビッツ)培地(PAA社、ヨービル、英国)で洗浄した。次いで、高グルコースDMEM(+1%L−グルタミン+1%ペニシリン+1%ストレプトマイシン+1%非必須アミノ酸)中0.4mg/mLのコラゲナーゼXI(Sigma社、プール、英国)で10分間、37℃で消化した。細胞懸濁液を遠心分離し(400gで10分間)、ペレットを高グルコースDMEM(10%ウシ胎児血清(FBS)を含むこと以外は前のものと同じ)に再懸濁させた。細胞懸濁液をナイロンメッシュ(細孔径100μm)(Merck Millipore社、マサチューセッツ州、米国)でろ過し、24ウェルの1%マトリゲルコートプレート(Corning社、ニューヨーク州、米国)上に播いた。プレートを95%O2および5%CO2の雰囲気下、37℃で一晩インキュベートした。
雄ラット(Janvier Labs社、ジュネスト=サン=ティスル、フランス)から結腸および回腸を取り出した。それを氷冷PBS、次いで氷冷L−15(リーボビッツ)培地(PAA社、ヨービル、英国)で洗浄した。次いで、高グルコースDMEM(+1%L−グルタミン+1%ペニシリン+1%ストレプトマイシン+1%非必須アミノ酸)中0.4mg/mLのコラゲナーゼXI(Sigma社、プール、英国)で10分間、37℃で消化した。細胞懸濁液を遠心分離し(400gで10分間)、ペレットを高グルコースDMEM(10%ウシ胎児血清(FBS)を含むこと以外は前のものと同じ)に再懸濁させた。細胞懸濁液をナイロンメッシュ(細孔径100μm)(Merck Millipore社、マサチューセッツ州、米国)でろ過し、24ウェルの1%マトリゲルコートプレート(Corning社、ニューヨーク州、米国)上に播いた。プレートを95%O2および5%CO2の雰囲気下、37℃で一晩インキュベートした。
24時間の培養後、細胞を水浴中、pH7.4に調整した分泌緩衝液(4mM KCl、138mM NaCl、1.2mM NaHCO3、1.2mM NaH2PO4、2.6mM CaCl2、1.2mM MgCl2および10mM HEPES)および濃度10nMの完全長ClpBまたは約25kDaのフラグメントと20分間インキュベートした。対照として、細胞を分泌緩衝液およびPBSとインキュベートした。
インキュベーション後、細胞を溶解緩衝液(50mmol/Lトリス−HCl、150mmol/L NaCl、1%IGEPAL CA−630、0.5%デオキシコール酸+EDTAを全く含まないプロテアーゼ阻害剤タブレットのカクテル)で処理して細胞内のペプチドを抽出した。セルスクレーパーで細胞を収集し、溶解物を遠心分離した(12000gで20分間)。溶解物は、直ちに分析しない場合、−80℃で保管した。
PYY Fluorescent Immunoassay Kit(登録商標)(Phoenix Pharmaceuticals社)を上記の通りに用いて腸ホルモンの分泌をアッセイした。
結果
ラット結腸でのPYY放出
トリプシンとプレインキュベートしてClpBフラグメントを得た上記と同じ大腸菌(E.coli)タンパク質をラット結腸由来の初代培養腸細胞での実験に用いた。結果から、PYY放出が対照と比較して増大しているのがわかる(図5)。これとは対照的に、ClpB枯渇菌株では全く効果が観察されなかった(図5)。
ラット結腸でのPYY放出
トリプシンとプレインキュベートしてClpBフラグメントを得た上記と同じ大腸菌(E.coli)タンパク質をラット結腸由来の初代培養腸細胞での実験に用いた。結果から、PYY放出が対照と比較して増大しているのがわかる(図5)。これとは対照的に、ClpB枯渇菌株では全く効果が観察されなかった(図5)。
以上の結果は、ClpBのフラグメントの方が効率的にPYYの放出を引き起こすことを示しており、それによりMC4Rの活性化を示している(Panaroら,2014.Cell Metab.20(6):1018−1029を参照されたい)。
ラットの結腸および回腸でのPYY放出
結果から、ラット由来の腸組織を完全長ClpBとインキュベートしても約25kDaのフラグメントとインキュベートしても、PYY分泌が対照と比較して増大することがわかる(図6)。
結果から、ラット由来の腸組織を完全長ClpBとインキュベートしても約25kDaのフラグメントとインキュベートしても、PYY分泌が対照と比較して増大することがわかる(図6)。
実施例5:摂食量に対する本発明のポリペプチドの効果
材料および方法
雄C57/Bl6マウスをBioDAQマウスケージ(Research Diets社、ニューブランズウィック、ニュージャージー州)に単独で入れて摂食量を測定した。各マウスに生理的血清(n=6)、完全長ClpBまたは約25kDaのフラグメントを投与した。
材料および方法
雄C57/Bl6マウスをBioDAQマウスケージ(Research Diets社、ニューブランズウィック、ニュージャージー州)に単独で入れて摂食量を測定した。各マウスに生理的血清(n=6)、完全長ClpBまたは約25kDaのフラグメントを投与した。
2種類の投与様式、すなわち、体積200μL中2pmolの濃度での腹腔内(i.p.)注射(n=8)および体積200μL中60pmolの濃度での経口投与(n=10)を試験した。
結果
図7および8に示す結果から、約25kDaのフラグメントの投与により、少なくとも90分の間にマウスの摂食量が少なくとも完全長ClpBタンパク質と同程度に減少することがわかる。
図7および8に示す結果から、約25kDaのフラグメントの投与により、少なくとも90分の間にマウスの摂食量が少なくとも完全長ClpBタンパク質と同程度に減少することがわかる。
特に、約25kDaのフラグメントの経口投与では摂食量が減少するが、完全長ClpBタンパク質の経口投与ではそのような効果は全くみられない(図8)。
Claims (15)
- 負荷電残基と2つの連続するArg残基およびTrp残基とを含むClpBタンパク質またはそのバリアントのフラグメントを含む、少なくとも15アミノ酸のポリペプチドまたはタンパク質であって、完全長のClpBタンパク質ではない、ポリペプチドまたはタンパク質。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- 配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- 配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- 配列GKPVと少なくとも75%の配列相同性を有する配列をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- 配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質を含む、組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質と、少なくとも1種の薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質を含む、医薬。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質を含む、栄養補助食品。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質を含む、食用組成物。
- 必要とする対象の肥満、体重過多ならびに/あるいは肥満に関連する疾患および障害の治療あるいは予防における使用のための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質、請求項8に記載の医薬組成物、請求項9に記載の医薬。
- 対象の体重を減少させるための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質、請求項10に記載の栄養補助食品あるいは請求項11に記載の食用組成物の使用。
- 前記対象が肥満ではない、請求項12または13に記載の使用のためのポリペプチドまたはタンパク質、医薬組成物、医薬、栄養補助食品あるいは食用組成物。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはタンパク質、請求項7に記載の組成物、請求項8に記載の医薬組成物、請求項9に記載の医薬、請求項10に記載の栄養補助食品あるいは請求項11に記載の食用組成物を含む、キット。
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