ES2869911T3 - Secretagogos derivados de oxalobacter formigenes - Google Patents

Secretagogos derivados de oxalobacter formigenes Download PDF

Info

Publication number
ES2869911T3
ES2869911T3 ES14747997T ES14747997T ES2869911T3 ES 2869911 T3 ES2869911 T3 ES 2869911T3 ES 14747997 T ES14747997 T ES 14747997T ES 14747997 T ES14747997 T ES 14747997T ES 2869911 T3 ES2869911 T3 ES 2869911T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
oxalate
secretagogue
protein
secretagogues
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14747997T
Other languages
English (en)
Inventor
Elisabeth Lindner
Helena Cowley
Aaron Cowley
Maria Åkerman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oxthera Intellectual Property AB
Original Assignee
Oxthera Intellectual Property AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oxthera Intellectual Property AB filed Critical Oxthera Intellectual Property AB
Application granted granted Critical
Publication of ES2869911T3 publication Critical patent/ES2869911T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/04—Drugs for disorders of the urinary system for urolithiasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1014—Hydroxymethyl-, formyl-transferases (2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/0106—2-Hydroxy-3-oxopropionate reductase (1.1.1.60)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01016—Diaminopimelate dehydrogenase (1.4.1.16)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y108/00—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8)
    • C12Y108/01—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.8.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/02—Hydroxymethyl-, formyl- and related transferases (2.1.2)
    • C12Y201/02001—Glycine hydroxymethyltransferase (2.1.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01006—Methionine adenosyltransferase (2.5.1.6), i.e. adenosylmethionine synthetase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01009—Riboflavin synthase (2.5.1.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01047—Cysteine synthase (2.5.1.47)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y303/00—Hydrolases acting on ether bonds (3.3)
    • C12Y303/01—Thioether and trialkylsulfonium hydrolases (3.3.1)
    • C12Y303/01001—Adenosylhomocysteinase (3.3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01003—Aconitate hydratase (4.2.1.3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)

Abstract

Un secretagogo derivado de bacterias degradantes del oxalato, comprendiendo dicho secretagogo una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad de secretagogo y al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19, para su uso en combinación con bacterias degradantes del oxalato en la prevención o tratamiento de una enfermedad relacionada con oxalato y/o desequilibrio relacionado con oxalato en un sujeto, en el que la enfermedad relacionada con oxalato y/o desequilibrio relacionado con oxalato es causada o realizada por un desequilibrio en niveles sistémicos de oxalato, y en el que la administración del secretagogo y las bacterias degradantes del oxalato da como resultado una reducción del oxalato en orina y/o del oxalato en plasma en el sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Secretagogos derivados de oxalobacter formigenes
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto secretagogo identificado derivado de bacterias degradantes del oxalato para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad relacionada con oxalato y/o desequilibrio relacionado con oxalato en un sujeto que lo necesita. La invención comprende el uso de uno o más secretagogos derivados de bacterias degradantes del oxalato en combinación con una o más bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con una o más enzimas degradantes de oxalatos, enzimas implicadas en el metabolismo del oxalato, o cofactores, sustratos, o combinaciones de los mismos, para reducir el oxalato en orina y/o el oxalato en plasma en el sujeto.
Antecedentes de la invención
El oxalato es la sal de un ácido débil y es un producto final metabólico que se excreta a través de los riñones. Una homeostasis alterada del oxalato en humanos y animales puede causar condiciones severas debido a la tendencia del oxalato a dañar las células del parénquima renal tanto como oxalato libre como cristales de oxalato de calcio; de este modo, en muchos casos provocando daños irreversibles. La homeostasis del oxalato se ve gravemente alterada debido a errores innatos tales como la hiperoxaluria primaria (PH).
La hiperoxaluria primaria (PH) es un error innato autosómico recesivo raro del metabolismo del glioxilato, con una tasa de incidencia de 0.1-0.2 por millón. La PH tipo I es causada por una actividad deficiente o ausente de la alanina/glioxilato aminotransferasa peroxisomal específica del hígado (AGT). En algunos pacientes, la enzima está presente, pero está mal dirigida a las mitocondrias, donde es metabólicamente inactiva.
El PH tipo II se produce como resultado de una actividad enzimática deficiente glioxilato reductasa/hidroxipiruvato reductasa (GRHPR). Ambos tipos de PH se caracterizan por una hiperoxaluria grave que está presente desde el nacimiento. Los pacientes experimentan urolitiasis recurrente de oxalato de calcio, nefrocalcinosis e insuficiencia renal progresiva.
No existen terapias aprobadas para tratar la deficiencia enzimática o la disfunción enzimática en ya sea la PH tipo I o la PH tipo II. Las terapias actuales para la PH están dirigidas a disminuir la producción de oxalato o aumentar la solubilidad urinaria del oxalato de calcio para preservar la función renal. Los pacientes reciben tratamiento con suplementos de magnesio, citrato y ortofosfato para aumentar la solubilidad urinaria del oxalato de calcio. La piridoxina es un cofactor de la AGT deficiente y las dosis farmacológicas de piridoxina pueden reducir los niveles urinarios de oxalato en una minoría de pacientes con PH I. Finalmente, la única terapia curativa es un trasplante combinado de riñón e hígado.
La hiperoxaluria secundaria incluye afecciones relacionadas con el oxalato tales como, pero sin limitarse a, hiperoxaluria, hiperoxaluria absortiva, hiperoxaluria entérica, enfermedad idiopática de cálculos renales de oxalato de calcio (urolitiasis), vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en etapa terminal, trastornos de la conductancia cardíaca, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y trastornos/afecciones causados por/asociados con cirugía gastrointestinal, cirugía bariátrica (cirugía para la obesidad) y/o tratamiento con antibióticos. La enfermedad por cálculos renales/del tracto urinario (urolitiasis) es un problema de salud importante en todo el mundo. La mayoría de los cálculos asociados con la urolitiasis se componen de oxalato de calcio solo o de oxalato de calcio más fosfato de calcio.
La enfermedad por cálculos renales o del tracto urinario se presenta en hasta el 12 % de la población en los países occidentales y aproximadamente el 70 % de estos cálculos están compuestos de oxalato de calcio o de oxalato de calcio más fosfato de calcio. Algunas personas (por ejemplo, pacientes con enfermedades intestinales tales como la enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino o esteatorrea y también pacientes que se han sometido a una cirugía de bypass yeyunoileal o en Y de Roux) absorben más oxalato en sus dietas que otros. Para estos individuos, la incidencia de urolitiasis por oxalato aumenta notablemente.
La homeostasis del oxalato es un procedimiento complejo, aún no completamente resuelto, que incluye muchos órganos y mecanismos corporales diferentes. Los riñones de los mamíferos, así como el tracto intestinal, actúan como vías de excreción y, en consecuencia, reducen las concentraciones de oxalato en el organismo. Sin embargo, la excreción de oxalato a través de los riñones presenta un riesgo de efectos toxicológicos sobre las células del parénquima renal y de formación de cristales en forma de cálculos renales. De este modo, el tracto intestinal de los mamíferos juega un papel importante en el control del oxalato debido al transporte de oxalato pasivo y activo (Hatch and Freel, 2004; Freel et al., 2006), así como a las relaciones simbióticas con las bacterias colonizadoras degradantes del oxalato.
Se ha informado previamente que un polvo liofilizado altamente concentrado que contiene Oxalobacter formigenes (O. formigenes), una bacteria anaeróbica obligada no patógena que usa ácido oxálico como su única fuente de energía, se puede usar para disminuir el oxalato en plasma. y orina (Patente de los Estados Unidos No.: 6,200,562 B1; Patente de los Estados Unidos No.: 6,355,242 B1). El mecanismo de degradación del oxalato se ha caracterizado e implica tres proteínas únicas, un transportador de membrana de oxalato:formiato, oxalil-CoA descarboxilasa (OXC) y formil-CoA transferasa (FRC). Una expresión muy alta de proteínas degradante (s) del oxalato y sus propiedades cinéticas únicas hacen de O. formigenes uno de los sistemas de degradación de oxalato más eficientes que se conocen.
O. formigenes es parte de una microbiota intestinal sana en vertebrados y, como tal, participa significativamente en el procedimiento de homeostasis del oxalato. Mecánicamente, O. formigenes aumenta la degradación del oxalato en el tracto gastrointestinal, crea un gradiente transepitelial apropiado y promueve la eliminación entérica pasiva de oxalato. Para el experto en la técnica, la importancia de una microbiota intestinal equilibrada es bien conocida; además, también se sabe que los desarrollos en el campo de la microbiología han demostrado numerosos casos de influencias secretagogos bacterianos en el intestino humano. Por nombrar algunos ejemplos; Vibrio Cholerae y Escherichia coli enterotoxigénica producen compuestos secretagogos que, descritos brevemente, provocan una salida de iones y posteriormente fluidos hacia la luz intestinal con el resultado de diarreas (Flores, J., Sharp, G.W., 1976; Field, M., Graf, L.H., et al., 1978). Otros habitantes intestinales inducen una hipersecreción de mucina por acción secretagoga (por ejemplo, Navarro-Garcia, F., et al., 2010, Caballero-Franco, C., et al., 2006).
Recientemente se identificó la familia de genes SLC26 (portador ligado a soluto) (Mount, D. B., et al., Pflugers Arch.
2004; 447 (5):710-721; Soleimani, M., Xu, J., Seminars in nephrology. 2006; 26 (5):375-385). Esta familia de genes codifica transportadores de aniones estructuralmente relacionados que tienen una afinidad de oxalato medible y se encuentran en el tracto GI: SLC26A1 (SAT1), SCL26A2 (DTDST), SLC26A3 (DRA), SLC26A6 (PAT1 o CFEX), SLC26A7, y SCL26A9. Además, se han observado SLC26A1 y SCL26A2 en monocapas de Caco-2 postconfluentes y confluentes, respectivamente (Hatch, M., et al., NIH Oxalosis and Hyperoxaluria Workshop, 2003; Morozumi, M., et al., Kidney Stones: Inside & Out. Hong Kong: 2004, Pp. 170-180). A pesar de estos avances recientes, quedan muchas preguntas sobre el complejo equilibrio de los contraiones sobre la membrana epitelial, el papel de los diferentes transportadores de oxalato y el impacto que tienen en las condiciones hiperoxalúricas (Hassan, H.A., Am J Physiol Cell Physiol, 302: C46-C58, 2012; Aronson, P.S., JNephrol 2010; 23 (S16): S158-S164).
Muchos de los transportadores con afinidad por el oxalato también demuestran afinidad por otros sustratos y, a menudo, están ligados a los equilibrios ácido-base dentro de las células; por nombrar algunos ejemplos: DRA expresado en Xenopus oocytes es un intercambiador de bases de Cl (Chernova, M.N. et al., J Physiol, 549:3, 2003) y los estudios sugieren que SO42' es otro sustrato (Byeon, M.K. et al., Protein Expr Purif, 12: 67, 1998); PAT-1 de ratón expresado en Xenopus exhibe una variedad de afinidades por Cl-HCO3 -, Cl-Ox2-, SO42-Ox2-(Xie Q. et al., Am J Physiol Renal Physiol 283: F826, 2002); y el gen SLC26A4 codifica un intercambiador de formiato de Cl (Morozumi, M. et al. In: Gohel MDI, Au DWT (eds) Kidney stones: inside and out. Hong Kong, p. 170). Muchos otros transportadores, sin afinidad por el oxalato, tienen sustratos en común con las proteínas transportadoras de oxalato, por ejemplo: Na+/K+ATPasa, intercambiadores de Na+/H+(NHE), cotransportadores de Na+-K+-2Cl-(NKCC) y canales de K+ basolaterales y canales de Cl' apicales, tales como el regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) (Venkatasubramanian, J. et al., Curr Opin Gastroenterol, 26: 123-128, 2010). La regulación de Na+, Cl-, K+, HCO3- está altamente coordinada en el tracto intestinal, ya que también dicta el movimiento del agua, a través de interacciones y regulaciones de esta multitud de transportadores reseñados.
Se han descrito en la técnica varias formulaciones farmacéuticas reductoras de oxalato, tales como en el documento WO2007070052 A2, Hoppe et al. (Nephrol Dial Transplant, 2011, 26: 3609-3615), y US 20050232901 A1. Entre estas se encuentran las composiciones con recubrimiento entérico u otras que comprenden bacterias o enzimas degradantes del oxalato que se han sugerido como un medio para reducir las concentraciones de oxalato. Un objetivo de dicho tratamiento es que los pacientes reduzcan o normalicen los niveles de oxalato en orina.
Además, el documento WO2005097176 A2 describe composiciones que comprenden Oxalobacter formigenes, que pueden ser viables y/o un lisado del mismo. Las composiciones son útiles para tratar a un sujeto animal que padece insuficiencia renal.
Sumario de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones. La invención descrita en este documento se refiere a un componente secretagogo, o un compuesto secretagogo, derivado de una bacteria que degrada el oxalato, que ejerce un efecto directo o indirecto en el tracto intestinal de un mamífero.
Un secretagogo según la invención, para su uso en combinación con bacterias degradantes del oxalato en la prevención o tratamiento de una enfermedad relacionada con oxalato y/o desequilibrio relacionado con oxalato en un sujeto, comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad de secretagogo y al menos 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19. La enfermedad relacionada con el oxalato y/o el desequilibrio relacionado con el oxalato es causado o realizado por un desequilibrio en los niveles de oxalato sistémicos, y la administración del secretagogo y las bacterias degradantes del oxalato da como resultado una reducción del oxalato en orina y/o del oxalato en plasma en el sujeto.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más secretagogos derivados de bacterias degradantes del oxalato, comprendiendo dicho uno o más secretagogos una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad de secretagogo y al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos según a cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19, comprendiendo además dicha composición una o más bacterias degradantes del oxalato.
El efecto se refiere a un intercambio de oxalato a través del epitelio intestinal en un mamífero a través del flujo pasivo de oxalato y/o una promoción del transporte activo. En este documento se describe adicionalmente el procedimiento de fabricación para producir cantidades suficientes de este componente secretagogo para la identificación, análisis y uso propuesto en la terapia de hiperoxaluria.
Debido a las complejas interacciones multicomponente de iones y transportadores en el tracto intestinal, el reconocimiento de múltiples sustratos por transportador y la dependencia del flujo pasivo y activo de diferentes equilibrios iónicos, es importante señalar que un efecto secretagogo puede ser indirecto en el sentido de que un compuesto secretagogo identificado puede ejercer su efecto mediante el desplazamiento de los balances y equilibrios iónicos nominales y, de este modo, alterar el flujo del ión oxalato.
O. formigenes es una bacteria que degrada el oxalato de origen natural, presente en los tractos GI de los vertebrados, donde participa en una simbiosis compleja con el huésped mamífero. Los estudios con O. formigenes apoyan la promoción de la eliminación entérica de oxalato al inducir el flujo transepitelial de oxalato desde un sitio parenteral a la luz intestinal, cuando habita en el tracto intestinal de ratas y ratones. Además, la administración de O. formigenes a sujetos humanos con enfermedad renal en etapa terminal demuestra una disminución significativa del oxalato en plasma (documento WO2005123116A2). Estos hallazgos apoyaron a los inventores en su concepto teorizado de compuestos secretados que afectan a las células del epitelio intestinal de una manera favorable para la supervivencia de O. formigenes en el tracto intestinal de humanos y roedores.
Se exploró un procedimiento de fabricación a gran escala y uso de un secretagogo potencial, que condujo a la identificación de compuestos proteicos con un efecto secretagogo propuesto y la invención como se describe aquí. Como muchas de las proteínas están presentes en cantidades bajas, el procedimiento de fabricación a gran escala y la posterior purificación y aislamiento hicieron posible la identificación. Hasta donde se sabe (los inventores presentes), actualmente no hay compuestos secretagogos identificados descritos para O. formigenes en la técnica y este es el primer intento de aislarlos e identificarlos para su uso en la terapia de hiperoxaluria.
En base a las investigaciones de los presentes inventores, los compuestos producidos por O. formigenes, propuestos para causar un flujo secretor inducido, se han fabricado a una escala suficiente para ser identificados. Los compuestos (secretagogos) se han purificado y caracterizado.
De este modo, se describe adicionalmente en este documento un método de aislamiento de un secretagogo en cantidades suficientes para su identificación y uso propuesto en la terapia de hiperoxaluria. El aislamiento y enriquecimiento del secretagogo se puede combinar con el aislamiento de bacterias degradantes del oxalato; por consiguiente, resulta en un procedimiento que pertenece tanto a la recolección de bacterias degradantes del oxalato como al enriquecimiento de compuestos secretados por las bacterias degradantes del oxalato durante la fermentación.
Los compuestos secretagogos de O. formigenes, que se deben producir en cantidades suficientes para su identificación y uso en la terapia de hiperoxaluria, se identifican como una o más proteínas secretagogos y péptidos que individualmente o en conjunto ejercen un efecto directo o indirecto sobre el flujo de oxalato en el tracto intestinal de un mamífero. Los compuestos identificados se secretan fuera de la célula bacteriana o se mantienen intracelularmente y se liberan en el medio de cultivo tras la muerte celular. La muerte celular es un procedimiento continuo durante el crecimiento del cultivo celular; por consiguiente, las proteínas u otros compuestos, identificados a partir de medios de cultivo libres de células, con un efecto secretagogo propuesto, pueden no ser compuestos secretados de forma inherente.
Los compuestos secretagogos pueden ejercer sus efectos combinados o individuales en el tracto intestinal en una reacción que requiera un cofactor. Por lo tanto, una combinación de uno o más cofactores (por ejemplo: NAD+, NADP+, FAD, CoA, ATP, ADP entre otros) y uno o más secretagogos, si es necesario para iniciar el efecto secretagogo positivo en el tracto intestinal de un mamífero, también está abarcado en esta invención.
Los compuestos secretagogos pueden ejercer sus efectos secretagogos combinados o individuales indirectamente alterando los flujos nominales de otros compuestos, por ejemplo, iones y pequeños compuestos orgánicos y de ese modo provocar un cambio en el flujo de oxalato. Por lo tanto, un efecto indirecto de los compuestos secretagogos mencionados en este documento, que indirectamente altera el flujo de oxalato a través de un cambio en el flujo de iones o pequeños compuestos orgánicos, por ejemplo, también está abarcado en esta invención.
El efecto de los compuestos secretagogos se mejora en este documento principalmente en combinación con bacterias degradantes del oxalato, pero también opcionalmente con enzima (s) degradante (s) de oxalato, enzima (s) implicadas en el metabolismo del oxalato, cofactores, sustratos o combinaciones de los mismos. Por lo tanto, una combinación de una o más bacterias degradantes del oxalato, enzima (s) degradante (s) de oxalato, enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato, cofactores, sustratos y uno o más secretagogos, si es necesario para comenzar el efecto positivo del secretagogo en el tracto intestinal de un mamífero, también se abarca en esta invención.
También se describe en este documento un método para eliminar oxalato exógeno y/o endógeno mediante eliminación entérica mediante la administración del secretagogo junto con bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente junto con enzimas degradantes del oxalato, enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato, cofactor (es), sustrato (s), a un sujeto mamífero que necesite eliminación de oxalato.
La administración combinada de uno o más secretagogos y bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con una o más enzima (s) degradante (s) del oxalato, enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato, cofactor (es), sustrato (s), asegura tanto un estímulo del flujo de oxalato, para aumentar el transporte de oxalato en la dirección de la luz intestinal, así como una mayor degradación de oxalato en todo el tracto gastrointestinal.
En consecuencia, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más componentes o secretagogos identificados, derivados de bacterias degradantes del oxalato, expresados de forma recombinante o extraídos de medios acondicionados, administrados a pacientes con una o más bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con una o más enzimas degradantes del oxalato, enzimas implicadas en el metabolismo del oxalato, cofactores, sustratos o combinaciones de los mismos.
La composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de un secretagogo. Una cantidad eficaz de un secretagogo comprende una cantidad que reducirá una parte del oxalato presente sistémicamente por secreción en el tracto intestinal. La cantidad que se puede usar en una composición de dosis única, sola o en combinación con bacterias y/o enzimas degradantes del oxalato, puede variar desde aproximadamente 10 |ig a 1000,000 |ig, desde aproximadamente 100 |ig a 100,000 |ig, desde aproximadamente 1 mg a 100 mg, y todos los intervalos abarcados en la misma.
Esta composición farmacéutica puede ser resistente a la degradación por el ácido gástrico. La composición puede estar, por ejemplo, en forma de comprimido, cápsula o perla, opcionalmente provista de un recubrimiento entérico u otros medios para proporcionar resistencia a la degradación en el estómago y la parte superior del intestino delgado.
También se describe en este documento un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto secretagogo, derivado o producido por bacterias degradantes del oxalato, o una composición farmacéutica que comprende tal compuesto secretagogo administrado con una o más bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con una o más enzimas degradantes del oxalato, enzimas implicadas en el metabolismo del oxalato, cofactores, sustratos o combinaciones de los mismos, para reducir así la presencia de oxalato en el sujeto. Una cantidad eficaz de un secretagogo comprende una cantidad que reducirá una parte del oxalato presente sistémicamente por secreción en el tracto intestinal. La cantidad que se puede usar en una composición de dosis única, sola o en combinación con bacterias y/o enzimas degradantes del oxalato, puede variar desde aproximadamente 10 |ig a 1000,000 |ig, desde aproximadamente 100 |ig a 100,000 |ig, desde aproximadamente 1 mg a 100 mg, y todos los intervalos abarcados en la misma.
De este modo, la presente divulgación proporciona un secretagogo derivado de bacterias degradantes del oxalato, comprendiendo dicho secretagogo una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad de secretagogo y al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19 para su uso en combinación con bacterias degradantes del oxalato en la prevención o el tratamiento de una enfermedad relacionada con el oxalato y/o un desequilibrio relacionado con el oxalato en un sujeto, en el que la enfermedad relacionada con el oxalato y/o el desequilibrio relacionado con el oxalato se produce o se realiza por un desequilibrio en los niveles sistémicos de oxalato, y en el que la administración del secretagogo y de las bacterias degradantes del oxalato da como resultado una reducción del oxalato en orina y/o del oxalato en plasma en el sujeto.
Según la presente divulgación, la enfermedad relacionada con oxalato se puede seleccionar del grupo que consiste en hiperoxaluria primaria, hiperoxaluria, hiperoxaluria absortiva, hiperoxaluria entérica, enfermedad idiopática de cálculos renales de oxalato de calcio (urolitiasis), vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en etapa terminal, trastornos de la conductancia cardíaca, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y trastornos/afecciones causadas por/asociadas con cirugía gastrointestinal, cirugía bariátrica (cirugía para la obesidad) y/o tratamiento con antibióticos.
De acuerdo con la presente divulgación, el secretagogo puede comprender una secuencia de aminoácidos, que tiene una actividad de secretagogo y al menos 85 %, tal como 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19.
El secretagogo se puede expresar de forma recombinante en un organismo apropiado o extraerse de medios acondicionados.
La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende uno o más secretagogos como se definió anteriormente, que comprende además una o más bacterias degradantes del oxalato, que opcionalmente comprende además una o más enzimas degradantes del oxalato (definidas con más detalle a continuación), enzimas implicadas en el metabolismo del oxalato (definidas con más detalle a continuación), cofactores (definido con más detalle a continuación), sustratos (definidos con más detalle a continuación) o combinaciones de los mismos.
La composición farmacéutica se puede formular para que tenga una vía de administración enteral, parenteral o tópica. La presente divulgación proporciona además el uso de dicho secretagogo en un método de tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad relacionada con el oxalato y/o un desequilibrio relacionado con el oxalato, que comprende administrar a dicho sujeto un secretagogo derivado de bacterias degradantes del oxalato como se define en este documento, en el que la administración del secretagogo da como resultado una reducción del oxalato en orina y/o plasmático en el sujeto.
En dicho método, el secretagogo puede comprender una secuencia de aminoácidos, que tiene actividad de secretagogo y al menos 85 %, tal como 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19.
El método comprende además administrar a dicho sujeto una o más bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente además una o más enzimas degradantes del oxalato, enzimas implicadas en el metabolismo del oxalato, cofactores, sustratos o combinaciones de los mismos.
En dicho método, la enfermedad relacionada con oxalato se selecciona del grupo que consiste en hiperoxaluria primaria, hiperoxaluria, hiperoxaluria absortiva, hiperoxaluria entérica, enfermedad idiopática de cálculos renales de oxalato de calcio (urolitiasis), vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en etapa terminal, trastornos de la conductancia cardíaca, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y trastornos/afecciones causadas o asociadas con cirugía gastrointestinal, cirugía bariátrica (cirugía para la obesidad) y/o tratamiento con antibióticos.
La presente divulgación también describe un método de preparación de un secretagogo como se define anteriormente, que comprende:
i) inocular bacterias degradantes del oxalato, por ejemplo, Oxalobacter formigenes, en un medio de crecimiento selectivo con temperatura equilibrada, específico para microbios que usan oxalato como única fuente de carbono, incluyendo dicho medio de crecimiento oxalato como fuente de carbono, metales traza necesarios y aminoácidos en condiciones anaeróbicas;
ii) transferir cultivo celular entre recipientes en condiciones anaeróbicas, tal como como entre botellas anaeróbicas o entre una botella anaeróbica y un fermentador, por ejemplo mediante el uso de puertos de botella y una presión de gas estéril para desplazar el líquido a través de un tubo no permeable al aire;
iii) recolectar una suspensión celular y procesar dicha suspensión celular usando, por ejemplo, filtración de flujo tangencial para separar las células enteras y los desechos de la suspensión, obteniendo así un permeado libre de células;
iv) filtrar el permeado exento de células para obtener un retenido, por ejemplo usando fibra hueca que elimina selectivamente compuestos de <10k Da y péptidos de interés reducido;
v) aislar uno o más secretagogos del retenido usando, por ejemplo, cromatografía líquida, electroforesis, precipitación, ultracentrifugación y/o columnas de centrifugación de concentración.
En particular, la presente divulgación proporciona un secretagogo, derivado de bacterias degradantes del oxalato, por ejemplo, de Oxalobacter formigenes, para su uso en combinación con bacterias degradantes del oxalato en el tratamiento de una enfermedad relacionada con el oxalato y/o un desequilibrio relacionado con el oxalato en un sujeto, en el que la administración del secretagogo y las bacterias degradantes del oxalato da como resultado una reducción del oxalato en orina y/u oxalato en plasma en el sujeto, en el que el compuesto secretagogo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene actividad de secretagogo y al menos 85 %, tal como 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identidad de secuencia, con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden dicho secretagogo y bacterias degradantes del oxalato. Además, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad relacionada con el oxalato, que comprende administrar a dicho sujeto un secretagogo y bacterias degradantes del oxalato como se definió anteriormente, así como un método de preparación de dicho secretagogo.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1A-E. Geles SDS-PAGE (izquierda) y Western Blots (derecha) para proteínas secretagogas potenciales de Oxalobacter formigenes expresadas de forma recombinante. Se procesó albúmina de suero bovino (2 ug) como control (carril 1). La proteína diana en gel SDSPAGE se presenta en el carril 2, y la proteína diana en Western blot se presenta en el carril 3. Los pesos de escala se muestran a la derecha de la imagen de análisis respectiva. M1 = marcador de proteínas Genscript Cat. No. M00505. M2 = marcador de proteínas Genscript Cat. No. MM0908.
Figura 1A: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 3.
Figura 1B: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 4.
Figura 1C: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 6.
Figura 1D: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 13.
Figura 1E: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 19.
Figura 2. Gráfico de barras que muestra el flujo de oxalato marcado (C14-oxalato) durante el primer período de flujo, 0-30 minutos. Las barras con rayas representan el flujo de mucosa a serosa (flujo M-S) y las barras rellenas representan el flujo de serosa a mucosa (flujo S-M). En el eje horizontal, G1-G3 indican los tres grupos de tratamiento, G = grupo. Barras de error = ± SEM (error estándar de la media). El eje vertical muestra 14C-oxalato en umol.cm2.h. Figura 3. Gráfico de barras que muestra el flujo de oxalato marcado (oxalato C14) durante el segundo período de flujo, 30-60 minutos. Las barras con rayas representan el flujo de mucosa a serosa (flujo M-S) y las barras rellenas representan el flujo de serosa a mucosa (flujo S-M). En el eje horizontal, G1-G3 indican los tres grupos de tratamiento, G = grupo. Barras de error = ± SEM (error estándar de la media). El eje vertical muestra 14C-oxalato en umol.cm2.h. Definiciones
Se pretende que todos los términos usados en el presente texto tengan el significado que se les da habitualmente en la técnica. En aras de la claridad, algunos términos también se definen a continuación.
Secretagogo
Un secretagogo es una sustancia, componente o compuesto que promueve directa o indirectamente la secreción de otra sustancia, componente o compuesto. Los secretagogos pueden ser péptidos, hormonas, proteínas o moléculas pequeñas. En este documento, la palabra secretagogo se usará para compuestos proteicos identificados, que tienen un efecto secretagogo propuesto en el cuerpo de un mamífero.
Los secretagogos descritos en este documento se aislaron del sobrenadante de una suspensión de cultivo de células de O. formigenes y, como tales, se pueden originar a partir de un procedimiento de secreción o una liberación promovida por muerte celular y lisis.
Los compuestos secretados y los secretagogos propuestos se caracterizaron como proteínas con un peso molecular en el intervalo de 8.8 a 98.8 kDa, con > 50 % de los compuestos en el rango de 30 a 50 kDa. De las diecinueve proteínas, trece eran enzimas y las seis restantes eran proteínas sin función catalizadora conocida. De estas seis proteínas, una se definió como "proteína hipotética conservada", es decir, esta proteína se encuentra en organismos de varios linajes filogenéticos pero no se ha caracterizado funcionalmente. Otra de las seis proteínas se definió como "proteína predicha". Esto se usa para entradas sin evidencia a niveles de proteína, transcripción u homología. Las secuencias de aminoácidos de los secretagogos propuestos identificados se presentan en el ejemplo 4, con ID de secuencia: SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, etc., hasta la última, es decir, SEQ ID No: 19. Se expresaron de forma recombinante cinco proteínas, correspondientes a las ID de secuencia de aminoácidos: SEQ ID No: 3, 4, 6, 13 y 19, en E. coli y se cribó la actividad de secretagogo de oxalato marcado sobre tejido intestinal de rata en cámaras Ussing. Todas las proteínas recombinantes expresadas demostraron un flujo de oxalato global reducido en comparación con el control. Una proteína en particular, de SEQ ID No. 3, tuvo un efecto que aumentó la secreción neta de oxalato marcado sobre el tejido intestinal distal de rata.
Los compuestos secretados también se describen en este documento en términos de estabilidad (índice de inestabilidad II), termoestabilidad (para proteínas globulares: índice alifático) y solubilidad (GRAVY, Gran Promedio de Hidropatía), véase el ejemplo 5. Se predijo que tres proteínas eran inestables según el índice (puntuación > 40): serina hidroximetiltransferasa, proteína portadora de acilo, subunidad beta de riboflavina sintasa. Además, se investigaron las secuencias de aminoácidos de los secretagogos en busca de posibles sitios de escisión del péptido señal (véase el ejemplo 6).
Medio acondicionado
Un medio acondicionado es un medio de crecimiento que se ha usado para hacer crecer un organismo en particular. El término condicionado se refiere al hecho de que el organismo ha usado componentes de la composición del medio original para el crecimiento y el metabolismo, así como productos liberados de su metabolismo y expresión génica. Un medio acondicionado también contiene y se refiere a productos del metabolismo y expresión génica liberados tras la muerte celular continua y la lisis inherente al crecimiento de un cultivo. Los medios acondicionados también se pueden denominar suspensiones de cultivo sin células. El medio acondicionado descrito en este documento se origina a partir de un medio no acondicionado con la composición descrita en el ejemplo 1. Este medio no acondicionado es un medio especial desarrollado específicamente para el propósito único del crecimiento de O. formigenes y, de este modo, la preparación de secretagogo concomitante también, y contiene oxalato como fuente de carbono principal.
Enzima degradante del oxalato
El término "enzima degradante del oxalato" se interpretará como cualquier enzima que sea capaz de reducir el oxalato, e incluye oxalato descarboxilasa, oxalato oxidasa, formil-CoA transferasa y oxalil-CoA descarboxilasa. Puede reducir el oxalato per se y/o puede funcionar en una vía de reducción de oxalato. En este contexto, el término "oxalato" abarca ácido oxálico y/o cualquiera de sus sales.
Enzima implicada en el metabolismo del oxalato.
El término "enzima implicada en el metabolismo del oxalato" se interpretará como cualquier enzima que funcione en una vía relacionada con el metabolismo del oxalato, e incluye alanina-glioxilato aminotransferasa (AGT), glioxilato reductasa (GR) y 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (HOGA).
Cofactor
El término "cofactor" se interpretará como un compuesto no enzimático necesario para la actividad de una enzima, e incluye vitamina Be, NAD+, NADP+, FAD, CoA, ATP y ADP.
Sustrato
El término "sustrato" se interpretará como el compuesto de entrada de una reacción catalizada por enzima, e incluye oxalato, glioxilato y 4-hidroxi-2-oxoglutarato, entre otros.
Enfermedad relacionada con el oxalato y/o desequilibrio relacionado con el oxalato
El término "enfermedad relacionada con el oxalato y/o desequilibrio relacionado con el oxalato" se interpretará como enfermedades causadas o realizadas por un desequilibrio en los niveles sistémicos de oxalato, e incluye hiperoxaluria primaria, hiperoxaluria, hiperoxaluria absortiva, hiperoxaluria entérica, enfermedad idiopática de cálculos renales de oxalato de calcio (urolitiasis), vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en etapa terminal, trastornos de la conductancia cardíaca, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y trastornos/afecciones causadas por/asociadas con cirugía gastrointestinal, cirugía bariátrica (cirugía para la obesidad) y/o tratamiento con antibióticos.
Divulgación detallada de la invención
La invención descrita en este documento se refiere a uno o más secretagogos de proteínas identificados a partir de una suspensión de cultivo libre de células que se origina en un cultivo de O. formigenes. Los secretagogos de proteínas identificados ejercen un efecto sobre el transporte de oxalato en el tracto intestinal de un animal o ser humano. El efecto propuesto, descrito anteriormente, ejercido por los secretagogos de proteína identificados es un resultado de un impacto de un secretagogo de proteína identificado o de una combinación de dos secretagogos identificados, tres secretagogos identificados, cuatro secretagogos identificados, cinco secretagogos identificados o seis o más secretagogos identificados. Los compuestos identificados pueden ejercer un efecto positivo en el intestino de animales o seres humanos, que influirá positivamente en las condiciones críticas como se describe en este documento, cuando se administren como se describe en este documento.
El efecto ejercido en el tracto intestinal de un animal o ser humano por la acción de uno o más secretagogos derivados de O. formigenes puede requerir una especie de cofactor. Por lo tanto, un cofactor potencial, que asegura un efecto positivo sobre el flujo de oxalato en el intestino en combinación con uno o más secretagogos, también se debe considerar abarcado en esta invención. El cofactor que puede ser necesario para que el secretagogo ejerza una acción positiva dentro del tracto intestinal de un animal o ser humano, como se describe anteriormente, incluye pero no se limita a: NAD+, NADP+, FAD, CoA, ATP, ADP.
El efecto ejercido en el tracto intestinal de un animal o ser humano por la acción de uno o más secretagogos derivados de O. formigenes se mejora con la inclusión de una o más bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con una o más enzimas degradantes del oxalato, enzima (s) implicadas en el metabolismo del oxalato, cofactores, sustratos o combinaciones de los mismos. Por lo tanto, una o más bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente además una o más enzima (s) degradante (s) del oxalato, enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato, cofactor (es), sustrato (s) o combinaciones de los mismos, lo que asegura un efecto positivo sobre el flujo de oxalato en el intestino en combinación con uno o más secretagogos también está abarcado en esta invención.
La bacteria que degrada el oxalato que puede mejorar el efecto del (los) secretagogo (s) es preferiblemente O. formigenes.
La (s) enzima (s) degradante (s) del oxalato que pueden mejorar el efecto global en combinación con uno o más secretagogos incluyen, pero no se limitan a, oxalato descarboxilasa, oxalato oxidasa, formil-CoA transferasa y oxalil-CoA descarboxilasa.
La (s) enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato que pueden mejorar el efecto global en combinación con uno o más secretagogos incluyen, pero no se limitan a, alanina-glioxilato aminotransferasa (AGT), glioxilato reductasa (GR) y 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (HOGA).
Los cofactores a los que se hace referencia anteriormente incluyen, pero no se limitan a, vitamina Be, NAD+, NADP+, FAD, CoA, ATP y ADP. Los sustratos a los que se hace referencia en la composición farmacéutica incluyen, pero no se limitan a, oxalato, glioxilato, 4-hidroxi-2-oxoglutarato, entre otros.
Los compuestos secretagogos pueden ejercer sus efectos secretagogos combinados o individuales indirectamente alterando los flujos nominales de otros compuestos, por ejemplo, iones y pequeños compuestos orgánicos y provocar así un cambio en el flujo de oxalato. Por ejemplo, se sabe en el campo que los transportadores con afinidad por oxalato también demuestran afinidad por otros pequeños compuestos o iones. En aras de la descripción y sin limitar el alcance de esta invención, esos iones y pequeños compuestos incluyen, pero no se limitan a; carbonato, sulfato, cloruro, sodio y formiato, por mencionar algunos. Por lo tanto, al alterar los equilibrios de estos iones y pequeños compuestos, se podría alterar el flujo de oxalato. De este modo, un efecto indirecto de los compuestos secretagogos mencionados en este documento, que altera indirectamente el flujo de oxalato a través de un cambio en el flujo de iones o pequeños compuestos orgánicos, por ejemplo, también está abarcado en esta invención.
El secretagogo de proteína identificado que ejerce un efecto directo o indirecto, individualmente o en combinación con otro (s) secretagogo (s) identificado (s), bacterias degradantes del oxalato, enzima (s), cofactor (es) y/o sustratos, sobre el transporte de oxalato en el tracto intestinal de animales o humanos incluye: semialdehído reductasa tartrónica, cisteína sintasa A, proteína transportadora de acilo, proteína predicha (número de acceso: gi|237749499), metionina adenosiltransferasa 1, proteína YgiW, subunidad beta de riboflavina sintasa, alquil hidroperóxido reductasa/antioxidante específico de tiol/alérgeno mal, fosfo-2-deshidro-3-desoxiheptonato aldolasa, factor de elongación Tu, s-adenosilhomocisteína hidrolasa, proteína hipotética conservada (número de acceso: gi|237747886), diaminopimelato deshidrogenasa, serina hidroximetilhidrogenasa, aspartato-semialdehído deshidrogenasa, enzima málica, aconitato hidratasa 1, proteína similar a hsp70. El secretagogo según la presente invención es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, que tiene actividad de secretagogo y al menos 85 % identidad de secuencia, tal como 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identidad de secuencia, con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19.
Sin limitar el alcance de esta invención, se observa que después del análisis de la secuencia de aminoácidos, se predijo que la proteína YgiW (número de acceso: gi|237748090) tenía un sitio de escisión del péptido señal entre los aminoácidos número 28 y 29. (ASA-QY). Un péptido señal en una proteína tiene el propósito de dirigir la proteína a una ubicación particular dentro (un determinado órgano) o fuera de la célula. Las proteínas secretadas y las proteínas de membrana también se localizan usando péptidos señal.
Además, sin afectar el alcance de esta invención, se ha observado que el pl calculado de una de las proteínas identificadas (YgiW: número de acceso: gi|237748090) era tan alto como 9.33. Este pl significa que la proteína tiene una carga neta positiva a pH fisiológico. Es bien sabido que la mayoría de las superficies biológicas tienen una carga negativa neta; por consiguiente, una carga positiva neta alta de una proteína apoya una función, que es interactiva con ya sea una bio superficie o una bio membrana. Es probable que cualquier cosa que apoye la interacción de un compuesto secretagogo potencial con una biosuperficie facilite el procedimiento de promoción de la secreción por parte del mismo.
El efecto propuesto ejercido por los secretagogos de proteínas identificados, individualmente o en combinación con otros secretagogo (s), bacterias, cofactor (es) de enzimas y/o sustratos identificados, sobre el transporte de oxalato en el tracto intestinal de animales o humanos, incluye pero no se limitan a: una interacción directa o indirecta con una proteína de membrana o un transportador de membrana, una interacción indirecta con un factor de expresión dentro de las células epiteliales o el genoma de las células epiteliales. Los transportadores de membrana mencionados anteriormente pueden incluir, pero no se limitan a, SLC26A1 (SAT1), SCL26A2 (DTDST), SLC26A3 (DRA), SLC26A6 (PAT1 o CFEX), SLC26A7, y SCL26A9. Además, la interacción puede ser cualquier modulación, es decir, cualquier actividad que incluye, pero no se limita a: aumentar, mejorar, agonizar, promover, disminuir, reducir, suprimir, bloquear o antagonizar.
Método de aislamiento
La presente divulgación describe un método de producción de secretagogos. La divulgación describe además un método para aislar los secretagogos con una baja pérdida de producto. La producción de los secretagogos implica un tren de semillas que usa viales, botellas anaeróbicas o fermentadores en cualquier combinación, en uno, dos, tres, cuatro o más etapas. La composición del medio, las condiciones de crecimiento, el tiempo de fermentación, las etapas de recolección y filtración usadas se describen en los ejemplos 1 y 2 y se describen para la producción de secretagogos.
El procedimiento de fermentación para producir un secretagogo puede implicar modificaciones para inducir la producción de secretagogo por las células de O. formigenes mediante el uso de diferentes medios de inducción, por ejemplo, concentraciones variadas o más bajas de oxalato, exposición variada o concentración de formiato y/u otras formas de inducción de estrés.
El aislamiento de secretagogos usa preferiblemente la filtración de flujo tangencial (TFF) y las etapas de filtración de fibra hueca, pero pueden incluir otros métodos de aislamiento de especies proteínicas comúnmente usados como razonables para los expertos en la técnica.
El aislamiento y enriquecimiento del secretagogo se puede combinar con el aislamiento de bacterias degradantes del oxalato; por consiguiente, resulta en un procedimiento que pertenece tanto a la recolección de bacterias degradantes del oxalato como al enriquecimiento de compuestos secretados por las bacterias degradantes del oxalato durante la fermentación. Este procedimiento incluye, pero no se limita a, métodos tales como centrifugación, TFF, fibra hueca y otros métodos de recogida, filtración y concentración de células que sean razonables para los expertos en la técnica. El secretagogo identificado también se puede expresar de forma recombinante. Las proteínas expresadas de forma recombinante pueden originarse a partir de una secuencia génica extraída o sintetizada de forma natural que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID No:s 3, 4, 6, 13 y 19. Las variantes y homólogos de proteínas incluyen pero no se limitan a: variantes polimórficas y mutantes naturales o artificiales, polipéptidos modificados en los que se modifica uno o más residuos, y mutantes que comprenden uno o más residuos modificados. Las mutaciones incluyen, pero no se limitan a, mutaciones de truncamiento, deleción, sustitución o adición de ácidos nucleicos.
Las enzimas recombinantes se pueden expresar en una amplia variedad de hospedadores, conocidos para los expertos en la técnica de la expresión de proteínas, que incluyen pero no se limitan a: E. coli, Lactobacillus spp, Bacillus spp etc.
Para una producción recombinante de la enzima o proteína, el huésped debe comprender una construcción en forma de plásmido, vector, fagémido o casete de transcripción o expresión que comprenda la enzima o proteína o un fragmento funcional de la misma. Hay una variedad de construcciones disponibles, incluidas las construcciones, que se mantienen en una sola copia o en copias múltiples. Muchos sistemas de expresión recombinante, componentes y reactivos para la expresión recombinante están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Invitrogen Corporation (Carlsbad, Calif.); U.S. Biological (Swampscott, Mass.); BD Biosciences Pharmingen (San Diego, Calif.): Novagen (Madison, Wis.); Stratagene (La Jolla, Calif.); y Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH (DSMZ), (Braunschweigh, Alemania).
Un promotor heterólogo, que incluye un promotor constitutivo y/o inducible, controla opcionalmente la expresión recombinante de las proteínas. Los promotores tales como, por ejemplo, T7 u otros promotores, según sean apropiados para el huésped, y que sean bien conocidos para los expertos en la técnica. El promotor también puede provenir del género Oxalobacter.
La secuencia de ácido nucleico recombinante de la enzima o proteína puede incluir ácidos nucleicos con fines adicionales a la expresión de la proteína, incluyendo, pero no se limitan a, fines de purificación, plegamiento, etc. Ejemplos de estos son: secuencias de secreción, secuencias señal, enlazantes, elementos de control de expresión, etiquetas de afinidad, por nombrar algunos. Los aminoácidos resultantes de estas secuencias de ácidos nucleicos pueden o no eliminarse después de la expresión de la proteína. Todas las construcciones mencionadas anteriormente se pueden usar para la expresión de las enzimas y proteínas, que se usarán en los métodos descritos en este documento.
Las células huésped se transformarán/transfectarán con el sistema de expresión elegido, descrito anteriormente. Las células se cultivarán usando métodos conocidos para los expertos en la técnica, esto incluye cultivos líquidos en matraces de agitación y fermentadores, así como cultivos sólidos en placas, etc.
Las proteínas se pueden purificar a partir de la fuente, tal como una fuente natural o recombinante, antes de usarse en los métodos descritos en este documento. La purificación puede comprender la extracción de las células huésped por medio de sonicación, prensa francesa, perlas de vidrio u otro medio de lisis física, o lisis celular química, y separación por etapas cromatográficas u otros medios conocidos para los expertos en la técnica. Opcionalmente, se puede usar una etapa de concentración, por ejemplo, mediante diálisis, cromatografía de cromatoenfoque y/o asociada con el intercambio de solución reguladora.
Compuestos y composiciones
Los compuestos y composiciones de la presente invención son apropiados para su uso en la reducción de los niveles de oxalato en seres humanos o animales.
Una especie de proteína identificada, con un efecto secretagogo, y una partícula o célula degradante del oxalato y/o cofactores necesarios, en una composición de la presente invención se administra en una cantidad eficaz a un individuo. Una cantidad eficaz comprende una cantidad de uno o varios componentes o secretagogos, derivados o producidos por bacterias degradantes del oxalato, junto con una o más enzimas o bacterias degradantes del oxalato. La cantidad eficaz es suficiente, opcionalmente en combinación con la actividad degradante del oxalato de bacterias o enzima (s), para reducir el oxalato sistémico para un efecto clínico en un estado patológico. La cantidad que se puede usar en una composición de dosis única, sola o en combinación con bacterias y/o enzimas degradantes del oxalato, puede variar desde aproximadamente 10 |ig a 1000,000 |ig, desde aproximadamente 100 |ig a 100,000 |ig, desde aproximadamente 1 mg a 100 mg, y todos los intervalos abarcados en la misma. El componente o secretagogo promoverá activamente el flujo de oxalato al intestino, donde una o más enzimas o bacterias degradantes del oxalato degradarán el oxalato.
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más componentes o secretagogos identificados, derivados de bacterias degradantes del oxalato, expresados de forma recombinante o extraídos de medios acondicionados, cuyas composiciones farmacéuticas se pueden administrar con o además comprenden bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente además, enzima (s) degradante (s) del oxalato, enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato, cofactor (es) y/o sustrato (s). En una realización preferida, esta composición farmacéutica es resistente a la degradación por ácidos gastrointestinales y enzimas degradantes en el estómago y la parte superior del intestino delgado. La composición puede estar, por ejemplo, en forma de comprimido o cápsula.
Las bacterias degradantes del oxalato que se pueden administrar en combinación con (es decir, que pueden estar presentes adicionalmente en una composición que comprende) uno o más compuestos o secretagogos identificados son O. formigenes.
La enzima degradante del oxalato administrada en combinación con (es decir, que adicionalmente puede estar presente en una composición que comprende) uno o varios secretagogos identificados incluyen, pero no se limitan a, oxalato descarboxilasa, oxalato oxidasa, formil-CoA transferasa y oxalil-CoA descarboxilasa.
La (s) enzima (s) administrada (s) en combinación con (es decir, que pueden estar presentes adicionalmente en una composición que comprende) uno o varios secretagogos identificados incluyen, pero no se limitan a, alanina-glioxilato aminotransferasa (AGT), glioxilato reductasa (GR) y 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (HOGA).
Los cofactores administrados en combinación con (es decir, que pueden estar presentes adicionalmente en una composición que comprende) uno o varios secretagogos identificados incluyen, pero no se limitan a, vitamina Ba, NAD+, NADP+, FAD, CoA, a Tp y ADP. Los sustratos a los que se hace referencia en la composición farmacéutica incluyen, pero no se limitan a, oxalato, glioxilato, 4- hidroxi-2-oxoglutarato, entre otros.
La (s) enzima (s) degradante (s) del oxalato, enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato, cofactor (es), bacteria y/o sustrato (s) administrado (s) en combinación con uno o varios secretagogos identificados se pueden administrar de la misma o diferente manera de acuerdo con el método más apropiado para una biodisponibilidad y actividad óptimas, como se conoce en la técnica. Los métodos de administración relacionados incluyen, pero no se limitan a, enteral, parenteral y/o tópico.
La administración combinada de uno o más secretagogos y O. formigenes, enzima (s) degradante (s) del oxalato, enzima (s) implicadas en el metabolismo del oxalato, cofactor (es) y/o sustrato (s), asegura tanto un estímulo del flujo de oxalato, para aumentar el transporte de oxalato en la dirección de la luz intestinal, así como una mayor degradación de oxalato en todo el tracto gastrointestinal.
Uso de partículas y composiciones: método de tratamiento.
Los métodos de la presente invención comprenden proporcionar una composición según la invención que comprende uno o varios secretagogos identificados producidos por bacterias degradantes del oxalato administradas con o presentes en una composición con bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con enzima (s) degradantes del oxalato, enzima (s) implicadas en el metabolismo del oxalato, cofactor (es) y/o sustrato (s).
Los componentes o secretagogos de esta composición identificados en este documento incluyen, pero no se limitan a; semialdehído reductasa tartrónica, cisteína sintasa A, proteína portadora de acilo, proteína predicha (número de acceso: gi|237749499), metionina adenosiltransferasa 1, proteína YgiW, subunidad beta de riboflavina sintasa, alquil hidroperóxido reductasa/antioxidante específico de tiol/alérgeno mal, fosfo-2-deshidro-3-desoxiheptonato aldolasa, factor de elongación Tu, s-adenosilhomocisteína hidrolasa, proteína hipotética conservada (número de acceso: gi|237747886), diaminopimelato deshidrogenasa, serina hidroximetiltransferasa, aspartato-semialdehído deshidrogenasa, enzima málica, aconitato hidratasa 1, y proteína similar a hsp70. Un secretagogo de la presente invención comprende una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia, tal como un 90 % o 95 % de identidad de secuencia, con los ID de secuencia: 3, 4, 6, 13 y 19.
Las composiciones de la presente invención son apropiadas en métodos de reducción de los niveles de oxalato en el cuerpo animal o ser humano y se usan en el tratamiento o prevención de afecciones relacionadas con el oxalato que incluyen, pero no se limitan a, hiperoxaluria, hiperoxaluria absortiva, hiperoxaluria entérica, hiperoxaluria primaria, enfermedad idiopática de cálculos renales de oxalato de calcio (urolitiasis), vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en etapa terminal, trastornos de la conductancia cardíaca, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y trastornos/afecciones causadas por/asociadas con cirugía gastrointestinal, cirugía bariátrica (cirugía para la obesidad) y/o tratamiento con antibióticos.
Los métodos de la presente invención comprenden administrar una composición que permite un aumento del flujo neto de oxalato desde el plasma al intestino para su degradación por una o más enzimas o bacterias degradantes del oxalato. Un método para proporcionar uno o varios componentes identificados o secretagogos producidos a partir de una o más bacterias degradantes del oxalato, o derivadas de bacterias degradantes del oxalato y expresadas de forma recombinante, al estómago y/o intestino delgado proporcionando una formulación según la invención.
Se puede lograr una reducción de oxalato proporcionando uno o varios componentes o secretagogos identificados con bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con enzima (s) degradante (s) del oxalato, enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato, cofactor (s) y/o sustrato (s) al tracto gastrointestinal. Las composiciones de la presente invención son útiles para degradar el oxalato secretado al intestino desde el sistema circulatorio y, de este modo, los métodos de la presente invención contemplan una reducción global de la carga de oxalato en un individuo.
La reducción puede medirse en cualquier tejido o entorno de fluido corporal del sujeto. Los fluidos corporales incluyen secreciones corporales tales como secreciones nasales o gástricas, saliva, sangre, suero, plasma, orina, quimo o materia digestiva, fluido tisular y otros materiales fluidos o semisólidos fabricados por seres humanos o animales. Por ejemplo, las composiciones de partículas de enzima reductora de oxalato y/o bacterias se pueden administrar a un ser humano o animal para inducir un flujo neto de oxalato a los intestinos donde la actividad de la enzima reductora del oxalato degrada el oxalato presente en el sujeto.
Los métodos de reducción de los niveles de oxalato en un ser humano o animal y tratar y prevenir afecciones relacionadas con el oxalato comprenden la administración de uno o varios componentes identificados o secretagogos derivados de una o más bacterias degradantes del oxalato, expresadas de manera recombinante o extraídas de medios acondicionados, junto con una o más bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con una o más enzima (s), enzima (s) implicada (s) en el metabolismo del oxalato, cofactor (es) y/o sustrato (s). Una cantidad eficaz comprende una cantidad de uno o varios componentes o secretagogos, derivados o producidos a partir de una o más bacterias degradantes del oxalato, junto con una o más bacterias degradantes del oxalato, opcionalmente con una o más enzimas degradantes del oxalato y/o cofactor (es) que reducirá el oxalato presente en los intestinos, tejidos o fluidos corporales del sujeto o mantendrá una cantidad menor de oxalato en el sujeto en comparación con la cantidad de oxalato presente antes de la administración de la composición. Dicha cantidad eficaz puede variar desde aproximadamente 10 |ig a 1000,000 |ig, tal como desde aproximadamente 100 |ig a 100,000 |ig, o desde aproximadamente 1mg a 100mg, del secretagogo, solo o en combinación con bacterias y enzimas degradantes del oxalato.
En un método de tratamiento, se administra por vía oral una cantidad eficaz de una composición/compuesto/secretagogo para ser ingerida por un sujeto al menos una vez al día, al menos dos veces al día, al menos tres veces al día, al menos cuatro veces un día o más si es necesario, y dicha administración puede durar un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días o una semana, dos semanas, tres semanas o un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, más de seis meses, un año, dos años, o durante años o de forma continua a lo largo de la vida del paciente. Tal tratamiento se puede continuar para mantener los niveles de oxalato deseados en un sujeto.
Se debe entender, por supuesto, que lo anterior se refiere solo a ejemplos de ejemplo de la presente invención y que se pueden realizar numerosas modificaciones o alteraciones en los mismos sin apartarse del alcance de la invención como se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Aunque los ejemplos de ejemplo de la presente invención se proporcionan en este documento, la presente invención no se limita a ellos. Existen numerosas modificaciones o alteraciones que pueden sugerirse a los expertos en la técnica.
La presente invención se ilustra adicionalmente por medio de los ejemplos contenidos en este documento, que se proporcionan para mayor claridad de comprensión. Los ejemplos no deben interpretarse en modo alguno como una imposición de limitaciones al alcance de los mismos. Por el contrario, se debe entender claramente que se pueden realizar cambios en diversas otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de las mismas que, después de leer la descripción en este documento, pueden sugerirse a los expertos en la técnica sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1
Preparación de secretagogos de O. formigenes propuestos.
Para preparar cantidades suficientes para la identificación, los secretagogos propuestos se aislaron de una fermentación de 400 L. Esta suspensión de cultivo se produjo en un tren de semillas de cuatro etapas (500 mL a 400 L) inoculado de un banco de células maestras de glicerol. Todas las etapas del tren de semillas usaron medios de oxalato especializados anaeróbicos estériles (oxalato 100 mM) compuestos de metales traza y los siguientes compuestos en gm/L: fosfato de potasio monohidrato 0.25, fosfato de potasio dihidrato 0.25, sulfato de amonio 0.5, sulfato de magnesio 0.025, EDTA 0.02 (sal disódica), acetato sódico trihidrato 1.36, sal sódica de resazurina 0.001, extracto de levadura 1, oxalato sódico 13.4, carbonato sódico 4 (anhidro), L-Cisteína HCl 0.5. El medio fermentador (40 L y 320 L) se preparó sin resazurina. Todas las transferencias durante el procedimiento de fermentación se realizaron cuando la semilla había alcanzado el crecimiento en fase logarítmica tardía. La fermentación progresó de la siguiente manera: se inoculó una botella anaeróbica que contenía 500 ml de medio oxalato (37 °C) con O. formigenes MCB al 1 % y se cultivó a 37 °C, 75 rpm hasta alcanzar la fase exponencial tardía. Posteriormente el cultivo se transfirió anaeróbicamente, usando jeringas estériles, agujas y gas CO2 , a una botella anaeróbica que contenía 3.5 L de medio oxalato y se incubó a 37 °C, 75 rpm hasta alcanzar la fase exponencial tardía. El cultivo de semillas desarrollado (volumen total 4 L) se inoculó en un fermentador de semillas de 100 L que contenía 40 L de medio oxalato especializado anaeróbico estéril. El cultivo del fermentador de semillas se transfirió a un fermentador de 500 L que contenía medio oxalato 320 L después de alcanzar la fase exponencial tardía. La recolección de los 400 L totales de suspensión de cultivo se realizó cuando el cultivo había alcanzado la fase exponencial tardía.
Ejemplo 2
Aislamiento de los secretagogos propuestos a partir de una suspensión de cultivo de 400 L.
La recolección de las células de la suspensión de cultivo final se realizó usando filtración de flujo tangencial (TFF) con un filtro de corte de peso molecular nominal de 500 kDa. El filtrado libre de células resultante se procesó adicionalmente a través de una fibra hueca de 10 kDa. El retenido se recogió asépticamente y se almacenó intermitentemente a 4 °C antes de esterilizarse por filtración usando filtros de botella de 0.2 |im en alícuotas de 250 mL. Posteriormente, las botellas se congelaron para un almacenamiento a largo plazo a -80 °C. En una etapa posterior, el retenido se procesó adicionalmente usando tubos de centrífuga concentradores con un límite de peso molecular nominal de 3 kDa para una concentración adicional de aproximadamente 90 veces. La concentración de proteína se determinó en el concentrado final usando el ensayo de Bradford y el reactivo de Coomassie. Se usó albúmina de suero bovino (BSA) para la preparación de la curva estándar. El concentrado final fue un líquido amarillo claro con 1 mg de proteína total por mL.
Ejemplo 3
Identificación de secretagogos propuestos mediante LC-MS/MS.
Preparación de la muestra (digestión de tripsina)
El concentrado de proteína se volvió a disolver en 100 |iL de NH4HCO3 50 mM con agitación y se agregaron 5 |iL de DTT 200 mM. La muestra se calentó a 95 °C, durante 5 minutos. La proteína se alquiló agregando 4 |iL de yodoacetamida 1 M en NH4HCO3 100 mM y se dejó reaccionar (45 min, 25 °C, oscuridad). La alquilación se detuvo agregando 20 |iL de DTT 200 mM e incubando (25 °C, 45 min). Se agregó tripsina en NH4HCO3 a la muestra en una proporción de tripsina a proteína 1:50 y se incubó (37 °C, 16-18 h).
Análisis LC-MS/MS
Las muestras digeridas enzimáticamente se inyectaron en una trampa capilar y se desalaron (3 |il/min de ácido fórmico al 0.1 % v/v durante 5 min). Después, las muestras se cargaron en una columna de HPLC de nanoflujo con gradiente de elución (Disolvente A 97-60 Disolvente B 3-40 %) durante 95 minutos con un reequilibrio de 25 minutos para la identificación de proteínas. El disolvente A constaba de ácido fórmico al 0.1 % v/v, ACN al 3 % v/v y H2O al 96.9 % v/v. El disolvente B constaba de ácido fórmico al 0.1 % v/v, ACN al 96.9 % v/v y H2O al 3 % v/v. El análisis LC-MS/MS se llevó a cabo en un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-TOF usando un potencial de enfoque de 225 V y un voltaje de pulverización de iones de 2400 V. Se empleó el modo de operación de adquisición dependiente de información (IDA) con una exploración de reconocimiento (m/z 400-1800) seguida de disociación inducida por colisión (CID) de los cuatro iones más intensos. Los espectros de reconocimiento y MS/MS para cada ciclo IDA se acumularon durante 1 y 3 s, respectivamente.
Algoritmo de búsqueda de proteínas
Los espectros de masas en tándem se extrajeron mediante ABI Analyst versión 2.0. Todas las muestras se analizaron usando Mascot (Matrix Science, Londres, Reino Unido; versión 2.2.2) configurado para buscar NCBI (base de datos de taxonomía de bacterias asumiendo la enzima de digestión tripsina). Mascot se buscó con tolerancia de masa de iones de fragmentos de 0.50 Da y tolerancia de iones de origen de 0.50 Da. El derivado de yodoacetamida de Cys, desamidación de Asn y Gln, oxidación de Met, se especificó en Mascot como modificaciones variables. Se usó Scaffold (versión Scaffold-3.3.2, Proteome Software Inc., Portland, OR) para validar las identificaciones de péptidos y proteínas basadas en MS/MS. Las identificaciones de péptidos se aceptan si pueden establecer con una probabilidad superior al 95.0 % según lo especificado por el algoritmo Peptide Prophet (Keller, A., et al., Anal Chem 74, 5383-92 (2002)). Se aceptan identificaciones de proteínas si se pueden establecer con una probabilidad superior al 99.0 % y contienen al menos 2 péptidos únicos identificados. Las probabilidades de proteínas se asignaron mediante el algoritmo Protein Prophet algorithm (Nesvizhskii, A.I., et al., Anal Chem 75, 4646-58 (2003)).
Resultados
Los compuestos secretados se caracterizaron como proteínas con un peso molecular en el intervalo desde 8.8 a 98.8 kDa, con> 50 % de compuestos en el lapso de 30 a 50 kDa. La tabla 1 a continuación enumera las proteínas identificadas y el origen de la secuencia (cepa humana O. formigenes OXCC13). O. formigenes OXCC13 pertenece al mismo subgrupo (grupo 1) que O. formigenes HC-1; su genoma completo ha sido secuenciado y, de este modo, se puede buscar.
De las diecinueve proteínas, trece eran enzimas con una función catalizadora conocida y las seis restantes eran proteínas. De las seis proteínas, una se definió como "proteína hipotética conservada", es decir, esta proteína se encuentra en organismos de varios linajes filogenéticos pero no se ha caracterizado funcionalmente. Otra de las seis proteínas se definió como "proteína predicha". Esto se usa para entradas sin evidencia a niveles de proteína, transcripción u homología.
Ejemplo 4
Secuencias de aminoácidos de proteínas identificadas a partir de O. formigenes OXCC13.
Las 19 secuencias de aminoácidos presentadas en este documento (SEQ ID NO:s 1-19) son los resultados de la identificación de la proteína descrita en el ejemplo 3 y los números de identificación respectivos (número gi y número de acceso RefSeq (zp). Las secuencias son se pueden buscar usando cualquiera de estos números de identificación.
SEQ ID NO: 1
Semialdehído reductasa tartrónica [Oxalobacter formigenes OXCC13]
g ¡|237749254| ref |ZP_04579734.11
M AN LGFIGLGIMGVPMAVN LQ NGG NKLFVND KKAPPAAITDGGAKACAT GAE VAKNADIIFIIM V PDTPDVEAVLFGEhJGVAQGLSAGKIW DMSSISPIATKEFAKKINDLGCEYLDAPVSGGEVGAK AGSLTIM VGG KE ETFN K VKPLF E L MG K NITL VGGN GDGQTTK VA N Q 11VALNIQ A VA E AL LF AS K AGADPAKVRQALMGGFASSRILEVHGERMINRTFNPGFRINLHQKDLNLALQGAKALGISLPNT ATAQELMNACAANGLSGMDPISALCRAVEIMSAHEIAKA
SEQ ID NO: 2
Cisteína sintasa A [Oxalobacter formigenes OXCC13] gi|237748046|ref¡ZP_04578526 11
MSNIAKSATDLIGNTPLLEISRFGKHVDADATILAKLEYFNPAGSAKDRIAKAMIDAAEADGKLIP GSTI IEPTSGNTGIALAAVGAARGYRVIITMPETMSVERQKLIRGYGADLVLTEGAKGMKGAIEKAQEL AATIPGGFVPLQFANPANPAIHKATTGPEIW RDTDGKVDIFVAGVGTGGTLTGVGKYLKEQNPA VQVVAlEPAASPVLAGGKPGPHKIQGIGAGFIPEALDVNVFDEViGVPNDAAFATAKTLAHAEGV LVGISSGAALWAASE LAKRPENRGKT! VVLLADIMGERYLSTDLFSN
SEQ ID NO: 3
Proteína portadora de acilo [Oxalobacter formigenes OXCC13] gi¡237747699|ref|ZP_04578179.11
M S DIEQ R VKKIVAE QLG VAED EIKL ESSF VD D LG ADSL DTVELVM AL ED E F El EIP D EQ A EKITTV GQAV DYATANMQS
SEQ ID NO: 4
Proteína precíicha [Oxalobacter form¡genes OXCC13] gi|237749499|ref|ZP_04579979.11
MKLRPLQDRIIVKRVDQEKTTASGIVIPDNAAEKPDQGEVIAVGNGKVLEDGKVLPLDVKVGDIV LFGKYSGQTVKVEGEELLVMHESDVMAIVQN!
SEQ ID NO: 5
Metionina adenosiltransferasa 1 [Oxalobacter formigenes OXCC13] gi|237747590|ref|ZP_04578070.11
MSQDYLFTSESVSEGHPDKVADQISDAILDAILEGDPHARVAAETLCNTGLW tAGEITTTANID YISVA RDTIKRIGYDNNDYGIDHRGCAVLVGYDKQSPDIAQGVDEGRGIDLDQGAGDQGLMFGYACD ETPELMPAAIYYAHRLVERQSQLRKDGRIAW LRPDAKSQVTLRYVDGKPVAAETIVLSTQHAPE VEHKQIEEAVIEEIIKPVMPAEW LKESKYLVNPTGRFVIGGPQGDCGLTGRKIIVDTYGGSCPHG GGAFSGKDPSKVDRSAAYAARYVAKNIVAAGLAKKCQIQVSYAiGVARPINlTINTEGTGVIADSK IAALVNDHFDLRPKGIVGMLDLLHPRYVKTAAYGHFGRDEPEFTW EKTDKAADLRGAAGL
SEQ ID NO: 6
Proteína YgiW [Oxalobacter formigenes OXCC13] -gi[237748090|ref¡ZP_04578570.11
MMSKKLLTGLFAAGLSIGMLAVSSTASAQYIGPTRIAPTTVNKVLKSPVDDQYVLLSGKITSQVS KDKYTFTDKTGSIW EIDNEVFAGRGVGPDTGVEIW GKVDKDMFKEPKÍDVKRLGIPNQTK
SEQ ID NO: 7
Subunidad beta de la riboflavina sintasa [Oxalobacter formigenes OXCC13] gi|237749243|ref|ZP_04579723.11
IV1MTVNTFEIDLQGGDLRIGIVGSRFNEEICRGLLGACLEELKR LGVADEDILVATVPGALEIPTAL QKMAESQQFDALIAVGGIIKGETYHFELVSNESAAGISRVALDFDMPIANAILTTYTDEQAEARM VEKGTEAARVAVEMANLVMAIDELEPPEEDE
SEQ ID NO: 8
Alquil hidroperóxido reductasa/Antioxidante específico de tiol/Alérgeno Mal [Oxalobacter form ¡genes OXCC13]
gi|237747586|ref|ZP_04578066.11
M SSLINTEIIPFKAQAYHNGQFVKVTDADLKGKW SW FFYPADFSFVCPTELGDLADHYEEFKK LGVEIYSVSTDTHFVHKGW HDASDTIKKIQFPMVGDPSGQISRNFNVLIDDDGVALRGTFVINPE GVIKLCEIHDLGIGRSATELLRKVQAAQYVATHKGQVCPASW QPGAETLAPSLDLVGKI
SEQ ID NO: 9
Cadena A, formil-Coa transferasa con aspartil-Coa tioéster intermedio derivado de oxalii-coa
gi] 163931105¡pdb]2VJK|A MTKPLDGINVLDFTHVQAGPACTQMMGFLGANVIKIERRGSGDMTRGWLQDKPNVDSLYFTM FNCNKRSIELDMKTPEGKELLEQMIKKADVMVENFGPGALDRMGFTW EYIQELNPRVILASVKG YAEGHAN EH LKVYEN VAQCSGGAAATTGFW DGPPTVSGAALGDSNSGMHLMIGILAALEIRHK TGRGQKVAVAMQDAVLNLVRIKLRDQQRLERTGIIAEYPGAQPNFAFDRDGNPLSFDNITSVP RGG N AG GGGQ PG WM LKC KG \AET D ADSY VYFTIAAN M WP GICDMIDKPE WKD DP A YNT F EG RVDKLM DIFSFIETKFADKDKFEVTEW AAGYGIPCGPVMSMKELAHDPSLQKVGTW EVVDEIR GNHLTVGAPFKFSGFQPEITRAPLLGEHTDEVLKELGILDDAKIKELHAKQW SEQ ID NO: 10
Fosfo-2-deshidro-3-desoxiheptonato aldolasa [Oxalobacter formigenes OXCC13]
gi| 237749194| ref | ZP_0457 9674.11
M DTTDDLRILAMKELTPPAHLIREFPCEEKAAETVSGCRKAIQRVLHNQDDRLW IIGPCSIHDPK AAMEYAHRLAEEKERYGDELVW MRVYFEKPRTTIGW KGLINDPFMDHSYRINEGLHIARELLR D VNELGLPAATE YLDM ! SPQYVADMISWGAIG ARTTESQ VHRELSSGLSCPVGFKNGTDGNIKI AIDAIKAASHPHHFLSVTKGGHTAIFETEGNQDCHIILRGGYKPNYDAASVNEAARAVEAAGLA.P KIMIDASHGNSSKKAENQVPVSLEVGENIAKGDDRIIGLMIESNLVGGRQDHEVGKKLVYGQSV TDACIGW EDSSKLLGQLAETVKRRRDVLKK SEQ ID NO: 11
Factor de elongación Tu [Oxalobacter formigenes OXCC13] gÍ|237747517|ref|ZP_04577997.1¡ ' MSKKFGGEAKDYDQIDAAPEEKARGITINTSHVEYETAARHYAHVDCPGHADYIKNMITGAAQM DGAILW SAADGPMPQTREHILLARQVGVPYIIVFLNKCDMVDDAELLELVEMEVRELLSRYEFP GDDIPIIKGSAKLALEGDAGELGETAILALADALDSYIPTPERAVDGAFLMPVEDVFSISGRGTW TGRVERGIIKVGEEIEIVGIKETAKTTCTGVEMFRKLLDQGQAGDNIGVLLRGTKREEVERGQVL AKPGSIKPFILNFEGE VY VL S KE EGG RFITP FF N N YRP QF YF RTTD VTG A IE LP KDKEM VM PG DN VSISVKLISPIAM EEGLRFAIREGGRTVGAGW AKITE
SEQ ID NO: 12
S-adenosilhomocisteína hidrolasa [Oxalobacter formigenes OXCC13] gi|237749247|ref|ZP__04579727.1|
M N A VSKTEQ D F Yl AD P D LTAWGN KE IRIAETEMP G LM AIR EE YAAS KP LSG AR ISGS LH MTIQTA VLIQTLEALGAKVRW ASCNIYSTQDHAAAAIASNGTPVFAFKGESLDDYW EFTHRIFEW PDGGY SNMILDDGGDATLLLHLGSRAEKDATVLDNPGSEEEVGLFNAIKRHLKTDPNWYSKRIKEIKGVT EETTTGVHRLYQMHEEGKLKFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRESLVDGIKRATDVMIAGKVAW C G YG D V G KGCAQ AL KAL S A Q V WVT E VD P [ C ALQ AA M E G YR W T M D YAAE M A DIF VTCT G N Y Fi VITHDHMVKMKDQAIVCNIGHFDMEIDVASMKKYTW DNIKPGVDHIILPNGNRIILLAEGRLVNLG C G TG H P S YVM SSSFAIMQTIAQIEL FTNTE A YP VG VYTLP K H LD E K VAR LG LK K l N A VLTE LSD E QAAYIGVKKEGPYKPNHYRY
SEQ ID NO: 13
Proteína hipotética conservada [Oxalobacterformigenes OXCC13] gj|237747886|ref|ZP_04578366,1l
MANQEEPIKVTDDPKQCWQSAGRHLQSQVEGGLTWMRASLDEPFMEHLSFRLGMQLFFVRVI D VDN E L K VPGTD E N LIKIAEGC KG FtAC IMPMRFSFGN WM P VE KG WG LL SA VD KK P VNP P D L VT
DEKIEMTDW ELHDFAVQVVRGNLMHEGEHVAGWVSNPELQPSIW ISTEEFPQW W VQAVRW PAEAKIPDNIKEIÉDAYASKÉAKGTPAYVTFAMENQNVKEPLKEGEKPLPIYRGDKAYISYSGLLS TEN
SEQ ID NO: 14
Diaminopimelato deshidrogenasa [Oxalobacter formigenes OXCC13] gi|237749390|refIZP JM579870.11
MTTIKAAVHGLGNIGRHVIDCLTCAPDFECLGVIRRESSLGTQTLERRNIPDYASIDKLIAEKGKP D W I LCGPSRSVPEDAKFYLSRGIRTVDSFDIHTDIAELVEKLDWAKENNSACITAAGWDPGTDSVF RTLFEAMAPTGTTFTNFGRGRSMGHSVAARAIKGVADATSmPIGGGRHARLW VLAEKGASF EQIKKDLASDPYFSHDPLDVREVKTPEEMEAVADNSHGVLMERIGASGRTSNQNLTFTMKIDN PALTSQVLVSCARAVTRMGAGCHTLIDVPPVMLLAGERMQHIARLV
SEQ ID NO: 15
Serina hidroximetiltransferasa [Oxalobacter form¡genes 0XCC13] gi|237749274|ref¡ZP_04579754,1|
MFAKDYSLAQVDSELWDAILRENTRQEEHIELIASENYCSPAVMQAQGSQLTNKYAEGYPGKR YYGGCEYVDIAEQLALDRVKKLFGAEAANVQPNSGSQANQAIFLAIVILNPGDTIMGMSLAEGGH LTHGMALNMSGKWFNWSYGLNEKEEIDYDRMEGLAHEHKPKLIIAGASAYSLRIDFERFAKVA RDVGAFFMVDMAHYAGLIAAGVYPSPVPYADFVTSTTHKSLRGPRGGFILMKPEFERKINSAVF P G LGG G P LM H VIAGKA VAF KE ALO P E FKT YQEQ VLKM AS VLAKTL VD RGF R11SG RTE S H VM LV DLQSKNITGRQAETILNSGHITCNKNAIPNDPQTPFVTSGVRLGSPAMTTRGFKETESAIVGNLL ADVIENPNDQATIERVRAEVKKLTTAFPVYQH
SEQ ID NO: 16
Aspartato-semialdehído deshidrogenasa [Oxalobacter formigenes OXCC13] gi|237748872|ref|ZP_04579352.11
MKLVGLIGWRGMVGSVLMQRMQEENDFDLFEPVFFTTSNVGGKAPAMAKNETVLK.DAFNIDE LKKC DI Ll SC QG G D YT VD VF P KL R AAG WDG Y Wl D AAS KLRM N DD A L11LDP VN R K VIE DG LS KG I KNYIGGNCTVSCMLMGLGGLFENDLVEWIVITSMTYQAASGGGAQHMRELLTQFGSIHTEVRM NLENPASAILEIDRQVLARQRGMTADETKQFGVPLAGNLIPWIDTDLGNGIVISREEWKGGAETN
KiLG KN DGNKVIVDGLC VRVG AMRCHSQALTIKLKKD VPLDEITDILKSHNQW AKW PNTKEDS VR DLTPAAVSGSLTIPVGRLR KLEMGN DYLSAFTVGDQLLWGAAEPLR RMLRIILE
SEQ ID NO: 17
Enzima mélica [Oxalobacíer form¡genes OXCC13] gi|237749327|ref|ZP_04579807.1 (
MNSQDQKKELLKKNALAFHRFPIPGKISVNPTKEVRDQNELALAYTPGVACACEEIPIANPENAYll YTTKGNLVAVISNGTAVLGLGNIGAQASKPVMEGKGVLFKKFADINVFDLEINELDPDKLCDIIAS LEPTFGGINLEDIRAPECFYIERKLREKMNIPVFHDDQHGTAVIVGAAVLNALKW GKNIKNCKM VVSGAGAGAM GCLELLVDLGFPVENIVW TDIKGW YKGRKELMDPEKEKYAQETDARTLMDV! SDADIFLGLSAGNVLKPEMVLKMAKDPVIFAMANPIPEILPEVAFIATRDDVIMGTGRSDYPNQIN NSMCFPYLFRGALDCRAKTINREMELAAVRAIASLAEMECPEEIVAMYGKKYTFGRDYLLPFQF DPRLLW W APAVAQAAMDSGVARVQIADMDAYRAKLKEFVG
SEQ ID NO: 18
Aconitato hidraíasa 1 [Oxalobacíer formigenes OXCC13] gÍ|237747686|ref|ZP_04578166.1|
MSCFTGWTYKEFPVTHEKKGFiFYSIPALGKELGLDLSRLPVSIRIVLESVIRNCDGKKITEEHVR QLANW KPNEERSNEIPFW ARVILQDFTGIPLLVDLAAMRNVAVKTGKNPKKIEPLVPVDLVVDH SVQIDYFRQDNALDLNMKLEFDRNRERYGFMKW GMQAFDTFGW PPGFGIVHQVNMEYLAR GVHKRNDAEAGDW YPDTLVGTDSHTTM INGVGW GW GVGGIEAEAGM LGQPVYFLTPDVIG M NLTGKLREGCTATDLVLTITELLRKEKW GKFVEFFGEGAASLSATDRATIANMAPEYGATIGF FTVD EATIS YFKN TG RTD E EVS A LES YF RA QG M FGIPKAGQIDYTRW NLDLGSVT AS VSG P R R PGDRIELGNLKKRFTELFSAPVKDGGFNKKPADMEATYVNSDNVELKNGDILlAAtTSCTNTSWP A VLLAAG LLAKKAVEAGLQ VS PRIKTS LAP G SRIVTN YLE KAG LLP YLEKLGFN VAAYG CTTCIG NAGDLTPAMNEAIVKNDW AAAVLSGNRNFEARIHPNIRANFLASPPLVVAYAIAGNVTRDLTTE PLGKGKDGKDIYLSDIWPTSHEVAALVPLALDAPSFRKNYSDIKTAPGELW QKIAGFATGDVYD WPQSTYIAEPPFFSDFGMEPNAASANISGARALALFGDSITTDHISPAGSIQEKSPAGQW LMEH GISKANFNSFGSRRGNHEVMMRGTFGNVRIKNQMLPVGPDGSRREGGYTLYQPGGEETSIFD AAMRYQKENVPTIVIGGEEYGTGSSRDW AAKGTQLLGVKAVIARSFERIHRSNLVGMAVLPLGF TG N DS A ESLG LKG D ETF D LTGL D DITPL QD V T LW H R ADGTT QN VP LLLRI DTP IEVD YYR H G GI LPFVLRQLLSN
SEQ ID NO: 19
Proteína similar a Hsp70 [Oxalobacter formigenes OXCC13]
g i|237749571 |ref|ZP_04580051.11
MSKI IGi DLGTTNSC VAIIEGSQPR VVEN SEGN RTTPSVi AYLDDGEIL VGAPAKRGAVTNPKNTL YAIK RLIGRKFDDKEVQRDIPIMPFSIIKAENNDAWVSVLNDKKLAPPQVSAEVLRKMKKTAEDYLGEE VTEAV IT VP A Y F N D AQRQ ATK D AGRIAG LD VKR11N E PT AAA LA FGLDKAG KG DKKIA VYDLGGGTFDIS11 EIA DLDGDKQFEVLSTNGDTFLGGEDFDQRIIDFIIDEFNKINGIDLKKDPIALQRIKASAERAKIELSS SQQ TEINEPYIAMANGAPVPILNMKLTRAKLESLAEGUDQTIEFCRIALKDAGLSVSDIDDVILVGGMT RMPA VGDKVKAFFGKEPRKDINPDEAVAVGAALGGAVLSGDRKDLLLLDVTPLSLGIETLGGVMTKMI QK NTT! PTK FSQIFSTAE D N Q PA VTIK VYQG ER EM AAG N KALG EENLEGIPASPRGMPGIEVTF D IDANGILHVSAKDKATGKENKITIKANSGLSEDEIQRMIKDAEVNAAEDHKVRELTEARNQGDAL VHTTKKSMEEYGDKLDAPAKESIESAIKDLEESLKGDDKADIDSKMSALSAAAQKLGEKMYADQ AP EG AAAGAAGAGASAGAAPE PELE DD V V DADFKEVKDKD
Ejemplo 5
Descripción de las características fisicoquímicas de los secretagogos identificados.
Métodos
Cálculo del coeficiente de extinción de proteínas de proteínas nativas en agua:
Los cálculos del coeficiente de extinción de proteínas usados fueron los descritos por Edelhoch (Edelhoch, H., (1967) [PubMed: 6049437] usando coeficientes de extinción para Tyr y Trp determinados por Pace (Pace, C.N., et al., (1995) [PubMed: 8563639].
Cálculo e interpretación del índice de inestabilidad:
El índice de inestabilidad se determinó como describen Guruprasad, K., et al., (1990) [PubMed: 2075190] y proporciona y estimación de la estabilidad de la proteína en un tubo de prueba. Un índice de estabilidad inferior a 40 se predice como estable, mientras que un valor superior a 40 predice que la proteína puede ser inestable.
Cálculo del índice alifático:
El índice alifático se define como el volumen relativo ocupado por las cadenas laterales alifáticas (alanina, valina, isoleucina y leucina) y se calcula según la fórmula descrita por Ikai (Ikai, A.J. (1980) [PubMed: 7462208]. Se puede considerar como un factor positivo para el aumento de la termoestabilidad de las proteínas globulares.
Cálculo del gran promedio de hidropatía (GRAVY)
GRAVY se calcula como la suma de los valores de hidropatía de aminoácidos, dividida por el número de residuos en la secuencia (Kyte, J., Doolittle, R.F. (1982) [PubMed: 7108955]. Véase la Tabla 2 a continuación.
Ejemplo 6
Identificación de sitios de escisión de péptidos señal putativos en la secuencia de aminoácidos de los secretagogos identificados.
Métodos
La identificación de la presencia putativa y la ubicación de los sitios de escisión del péptido señal se realizó usando los servicios de predicción en línea proporcionados por The Center for Biological Sequence Analysis at the Technical University of Denmark (http://www.cbs.dtu.dk/services/).
Predicción de la presencia y ubicación de sitios de escisión del péptido señal de arginina gemela en bacterias:
La predicción de péptidos señal de arginina gemela se realizó como describieron por Jannick Dyrl0v Bendtsen et al (b Mc bioinformatics, 6: 167, 2005).
Resultados:
Una proteína de los diecinueve secretagogos propuestos tenía una secuencia que era positiva para un sitio de escisión del péptido señal de arginina gemela: proteína YgiW (número de acceso: gi|237748090). El máx. C, máx. Y, máx. S, media S y máx. D todos dieron una respuesta positiva (SÍ) para un sitio de escisión del péptido señal con un valor de 0.872, 0.500, 0.797, 0.314 y 0.407, respectivamente. El sitio de escisión probable está entre la posición 28 y 29: ASA-QY.
Dos proteínas adicionales tenían una secuencia que era positiva para un sitio de escisión del péptido señal en máx. C pero que no se confirmó en máx. Y: fosfo-2-deshidro-3-desoxiheptonato aldolasa y cisteína sintasa A.
Ejemplo 7.1
Expresión recombinante de los compuestos secretagogos potenciales identificados
Métodos
Las enzimas y proteínas identificadas y descritas en este documento se pueden expresar de forma recombinante en el huésped nativo o en un huésped de elección, apropiado para la sobreexpresión recombinante como conocen los expertos en la técnica. Las enzimas y proteínas expresadas de forma recombinante comprenderán una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con las secuencias descritas (SEQ No 1-19). Las variantes y homólogos de proteínas incluyen, pero no se limitan a: variantes polimórficas y mutantes naturales o artificiales, polipéptidos modificados en los que se modifica uno o más residuos, y mutantes que comprenden uno o más residuos modificados. Las mutaciones incluyen, pero no se limitan a, mutaciones de truncamiento, deleción, sustitución o adición de ácidos nucleicos.
Las enzimas recombinantes se pueden expresar en una amplia variedad de hospedadores, conocidos para los expertos en la técnica de la expresión de proteínas, que incluyen pero no se limitan a: E. coli, Lactobacillus spp, Bacillus spp etc.
Para una producción recombinante de la enzima o proteína, el huésped debe comprender una construcción en forma de plásmido, vector, fagémido o casete de transcripción o expresión que comprenda la enzima o proteína o un fragmento funcional de la misma. Hay una variedad de construcciones disponibles, incluidas las construcciones, que se mantienen en una sola copia o en copias múltiples. Muchos sistemas de expresión recombinante, componentes y reactivos para la expresión recombinante están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Invitrogen Corporation (Carlsbad, Calif.); U.S. Biological (Swampscott, Mass.); BD Biosciences Pharmingen (San Diego, Calif.): Novagen (Madison, Wis.); Stratagene (La Jolla, Calif.); y Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH (DSMZ), (Braunschweigh, Alemania).
Un promotor heterólogo, que incluye un promotor constitutivo y/o inducible, controla opcionalmente la expresión recombinante de las proteínas. Promotores tales como, por ejemplo, T7 u otros promotores, según sean apropiados para el huésped, y que sean bien conocidos para los expertos en la técnica. El promotor también puede provenir del género Oxalobacter.
La secuencia de ácido nucleico recombinante de enzima o proteínas puede incluir ácidos nucleicos con fines adicionales a la expresión de la proteína, incluyendo, pero no se limitan a, fines de purificación, fines de plegamiento, etc. Ejemplos de estos son: secuencias de secreción, secuencias señal, enlazantes, elementos de control de expresión, etiquetas de afinidad, por nombrar algunos. Los aminoácidos resultantes de estas secuencias de ácidos nucleicos pueden o no eliminarse después de la expresión de la proteína. Todas las construcciones mencionadas anteriormente se pueden usar para la expresión de las enzimas y proteínas, que se usarán en los métodos descritos en este documento.
Las células huésped se transformarán/transfectarán con el sistema de expresión elegido, descrito anteriormente. Las células se cultivarán usando métodos conocidos para los expertos en la técnica, esto incluye cultivos líquidos en matraces de agitación y fermentadores, así como cultivos sólidos en placas, etc.
Las proteínas se pueden purificar a partir de la fuente, tal como una fuente natural o recombinante, antes de usarse en los métodos descritos en este documento. La purificación puede comprender la extracción de las células huésped por medio de sonicación, prensa francesa, perlas de vidrio u otro medio de lisis física, o lisis celular química, y separación por etapas cromatográficas u otros medios conocidos para los expertos en la técnica. Opcionalmente, se puede usar una etapa de concentración, por ejemplo, mediante diálisis, cromatografía de cromatoenfoque y/o asociada con el intercambio de solución reguladora.
Ejemplo 7.2
Como se describe anteriormente en el ejemplo 7.1, de las enzimas y proteínas identificadas y descritas en este documento, las SEQ ID No:s 3, 4, 6, 13 y 19 se sobreexpresaron de forma recombinante en E. coli, según los métodos y técnicas comúnmente usados (Methods in Molecular Biology, Book 705, Thomas C. Evans Jr., Ming-Qun Xu, Humana Press; 2011; Methods in Molecular Biology, Book 235, Nicola Casali, Andrew Preston). Las proteínas expresadas de forma recombinante se originaron a partir de una secuencia génica sintetizada que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con las secuencias de SEQ ID No:s 3, 4, 6, 13 y 19 del ejemplo 4. No se realizaron mutaciones en las secuencias presentadas en el ejemplo 4 pero se agregaron etiquetas de secuencia corta para facilitar la purificación (etiqueta de histidina). El peso molecular y la identidad de la proteína purificada se confirmaron mediante SDS-PAGE y Western blot. Se corrió SDS-PAGE en gel en gradiente al 4 % -20 %, seguido de tinción con azul Coomassie. El análisis de transferencia de Western usó el anticuerpo Anti-His de Genscript, Cat. No. A00612 o A00186.
Resultados
Las proteínas se sobreexpresaron y purificaron con éxito a partir del sobrenadante del cultivo de E. coli mediante el uso de purificación por afinidad de etiquetas de histidina, hasta casi homogeneidad (aproximadamente 85 % de pureza). La solución reguladora de almacenamiento final para todas las proteínas fue Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, pH 8. Se confirmó el peso molecular teórico con gel SDS-PAGE para todas las proteínas excepto SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4, para cuya migración sobre el gel insinuó un peso molecular mayor de lo esperado. Sin embargo, para ambas proteínas, el peso molecular teórico fue confirmado por Maldi-TOF. Además, tal comportamiento anómalo en el gel SDS-PAGE es consistente con las observaciones de, en particular, proteínas portadoras de acilo de otras bacterias (J. Bacteriol. 178:4794-4800, J. Biol. Chem. 267:5751-5754, J. Bacteriol. 174:3818-3821) y se ha atribuido a la alta proporción carga-masa, así como a su bajo contenido de aminoácidos hidrófobos, dos factores que tienen una influencia considerable en la unión de SDS (J. Biol. Chem. 254:9778-9785), y de este modo puede ser la causa de esta anomalía tanto para SEQ ID No. 3 como para SEQ ID No. 4. La pureza de todas las proteínas se determinó mediante análisis densitométrico de gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie hasta aproximadamente 85 % (Fig..1A-E). Se procesó albúmina de suero bovino (2 ug) como control (carril 1). La proteína diana en gel SDS-PAGE se presenta en el carril 2, y la proteína diana en Western blot se presenta en el carril 3.
Figura 1A: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 3.
Anticuerpo anti-His usado: Genscript Cat. No. A00612.
Figura 1B: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 4.
Anticuerpo anti-His usado: Genscript Cat. No. A00612.
Figura 1C: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 6.
Anticuerpo anti-His usado: Genscript Cat. No. A00612.
Figura 1D: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 13.
Anticuerpo anti-His usado: Genscript Cat. No. A00186.
Figura 1E: análisis de proteínas expresadas en SEQ ID No. 19.
Anticuerpo anti-His usado: Genscript Cat. No. A00186.
Ejemplo 8
Cribado de secretagogos potenciales mediante modelo de células intestinales
Métodos
Usando células intestinales humanas Caco2-BBE, T84 u otra línea celular apropiada para simular el transporte sobre el epitelio intestinal, el efecto del medio acondicionado de Oxalobacterformigenes y/o los secretagogos expresados de forma recombinante se puede cribar para el transporte neto de oxalato alterado sobre la capa celular. En el caso de la evaluación de medios acondicionados, las células se incubarán con una dilución apropiada (por ejemplo, 1:50) de medios acondicionados de O. formigenes y medios no acondicionados, así como medios acondicionados de Lactobacillus Acidophilus, durante 24 h. El influjo apical de [14C] oxalato se medirá en presencia de un gradiente de Cl hacia el exterior. En el caso de la evaluación de proteínas expresadas de forma recombinante, las células se incubarán con ya sea una concentración apropiada de proteína purificada o con un lisado celular del huésped de expresión. Se incluirán varias diluciones para evaluar la respuesta a la dosis. Como controles, se usará la solución reguladora de proteína o el lisado de la célula huésped no transformada, respectivamente.
Ejemplo 9.1
Cribado de secretagogos potenciales usando tejido intestinal de animal.
Métodos
Como método para cribar compuestos secretagogos potenciales, se puede aislar tejido intestinal de ratones o ratas. Los animales se sacrifican usando CO2 al 100 % y se extrae inmediatamente el intestino. El tejido se limpia a fondo con NaCl al 0.9 % helado, se extrae el tejido conectivo y se abren los segmentos a lo largo del borde mesentérico. Se montan láminas planas de tejido en una cámara de Ussing modificada y el tejido se baña en ambos lados con solución salina regulada (pH 7.4) que contiene 1.25 uM de oxalato a 37 °C, mientras se burbujea con 95 % de O2, 5 % de CO2. Los dos flujos unidireccionales de [14C] oxalato se medirán a intervalos de tiempo apropiados en condiciones de cortocircuito usando una pinza de tensión automática. Se medirán los parámetros eléctricos del tejido (potencial de circuito abierto, corriente de cortocircuito, etc.) a lo largo del experimento. Los detalles de los experimentos planificados se describen en la técnica (Hatch and Freel Am J Nephrol 23: 18-26, 2003, Freel et al Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290: G719-G728, 2006).
Los animales que pueden ser apropiados para usar incluyen, pero no se limitan a, ratas Sprague-Dawley con o sin inducción de hiperoxaluria usando etilenglicol, ratones con deficiencia genética AGT (cepa de fondo C57BL/6 como se describe por Salido et al (PNAS USA 103: 18249-18254, 2006), o ratones con deficiencia genética de proteínas de transporte, por ejemplo, Slc26a6-/-(Wang et al., Am J Physiol Cell Physiol 288: C957-C965, 2005),
Los tejidos intestinales usados para los estudios de transporte se derivarán de las cepas de ratones o ratas descritas anteriormente, criadas usando una dieta que contenga oxalato o no. Los animales también pueden ser alimentados repetidamente con cultivos vivos de O. formigenes para inducir la colonización, mientras se alimentan o no con una dieta que contenga oxalato.
Para confirmar la colonización y el estado de hiperoxaluria, se recolectarán muestras de orina y heces durante el alojamiento de los animales y se analizarán en busca de oxalato y O. formigenes como se describe detalladamente en la técnica. Se confirmará que los animales no están colonizados antes de cualquier intento de colonizar con O. formigenes.
Para confirmar la acción potencial del secretagogo sobre una proteína de transporte de intercambio aniónico, se pueden agregar inhibidores apropiados a los compartimentos de la cámara de Ussing, estos incluyen pero no se limitan a DIDS (4,4'-diisotiociano-2,2'-estilbeno disulfonato), y SITS (4-acetamido-4'-isotiocianoestilbeno 2'-disulfonato).
Ejemplo 9.2
Cribado de secretagogos de proteínas potenciales expresados de forma recombinante a partir de Oxalobacter formigenes usando tejido intestinal de ratas
Métodos
Experimento de la cámara de Ussing
Como se describe anteriormente en el ejemplo 9.1, los segmentos intestinales se despojaron de las capas musculares y se montaron en cámaras Ussing, cada lado se bañó en 5 ml de solución de glucosa-Ringer que contenía oxalato de sodio 1.5 |i M (sin marcar) (composición Ringer en mmol/L: Na 140, Cl- 119.8, K+ 5.2, HCO3- 25, Ca2+ 1.2, Mg++ 1.2, HPO42" 2.4, H2 PO4- 0.4, glucosa 10, pH 7.4 cuando se gasifica con O2 al 95 %/CO2 al 5 % a 37 °C). El registro directo de la diferencia de potencial eléctrico (PD) transmural en mV y la determinación de la corriente de cortocircuito (Isc) en |i A/cm2 se realizó usando dos juegos de electrodos que conectan las soluciones de la cámara a las pinzas de voltaje. La resistencia eléctrica total (Rt ) en ohms.cm2 se calculó usando la ley de Ohm, donde PD = Isc x RT.
Todos los experimentos se llevaron a cabo en condiciones de cortocircuito, excepto cuando se cambiaron periódicamente al estado de circuito abierto para el registro de DP. A T = 0 min, los tratamientos se agregaron a la solución mucosa del par. Los tejidos se cortocircuitaron y equilibraron durante 20 min mientras se leían Is c y Rt . A T = 20 min, se agregaron 10 |i C¡ de C14-oxalato marcado ya sea al baño de mucosa o seroso de uno de los tejidos emparejados. A T = 30 min, se inició el muestreo de flujo de 100 |i l cada 15 min, desde el lado sin marcar, y se continuó durante un período de 60 min. Los 100 |i l de solución del lado "sin etiquetar' se reemplazaron por 100 |i l de solución reguladora sin etiquetar. Se tomaron alícuotas (100 |i l) de la solución del lado "caliente" al comienzo y al final de los períodos experimentales y se promediaron sus valores para obtener la actividad específica para el período. La actividad isotópica se midió con un contador de centelleo líquido. Se calcularon los flujos unidireccionales (Jox = cpm/tiempo.actividad.específica.area) y se expresaron como umol/min.cm2 Los flujos netos se calcularon como la diferencia en los flujos unidireccionales entre muestras emparejadas. Se registraron Isc en |i A (convertido a |i Eq/cm2 hr) y PD en mV al comienzo y al final de cada intervalo de muestreo y se promediaron para ese intervalo.
El control (solo solución reguladora) se evaluó de forma idéntica al artículo de prueba, usando tejido de colon distal de rata Sprague-Dawley. Los artículos de prueba implicaron las proteínas expresadas de forma recombinante del ejemplo 7.2 divididas en tres grupos: Grupo 1: Proteína de SEQ ID No. 3, Grupo 2: Proteínas de SEQ ID No. 4 y 19, Grupo 3: Proteínas de SEQ ID No. 6 y 13. Se usaron tejidos de seis ratas por tratamiento (n = 6). Las diferencias entre los flujos de mucosa basal a serosa (m-s) y serosa a mucosa (s-m) de C14-oxalato para tejidos emparejados se usan para establecer la absorción neta (m-s > s-m) o la secreción (s-m > m-s) de oxalato para un tratamiento específico. El cálculo de la media /- SEM del flujo neto para todos los tratamientos determina si hay un efecto de un tratamiento sobre el control respectivo.
Resultados
El control de solución reguladora demostró un flujo de absorción neto para este segmento intestinal distal de tejido de rata, lo que confirma estudios de la literatura previos con segmentos intestinales de rata similares. El flujo se midió en dos períodos, 0-30 minutos y 30-60 minutos. Se observó un comportamiento similar del control en ambos períodos. En ambos períodos, los tratamientos de los tres grupos reducen todos el flujo total de oxalato marcado. Sin embargo, en el período posterior, el Grupo 1 demostró un cambio mayor en el flujo de la serosa a la mucosa (s-m), lo que resultó en una secreción neta mayor sobre el tejido intestinal, de oxalato marcado, en este período. Debido a una réplica de valores atípicos, solo se incluyeron cinco réplicas del experimento en este conjunto de datos.
La figura 2 representa el flujo de oxalato marcado durante el primer período de flujo, 0-30 minutos (T = 30 a T = 60, según las denotaciones de "Experimento de cámara Ussing"). Flujo M-S = flujo mucoso-a-seroso, flujo S-M = flujo seroso-a-mucoso. G1-G3 indican los tres grupos de tratamiento, G = grupo.
La figura 3 muestra el flujo de oxalato marcado durante el segundo período de flujo, 30-60 minutos (T = 60 a T = 90, según las denotaciones de "Experimento de cámara Ussing"). Flujo M-S = flujo mucoso-a-seroso, flujo S-M = flujo seroso-a-mucoso. G1-G3 indican los tres grupos de tratamiento, G = grupo.
Ejemplo 10
Evaluación del patrón de expresión de proteínas de transporte in vivo
Para confirmar la presencia de proteínas de transporte in vivo, en particular proteínas que pertenecen a la clase de SLC26A (portador ligado a soluto), los raspados de mucosas se pueden analizar usando inmunotransferencia y sondeos apropiados, métodos que están bien descritos en la técnica y se describen en este documento brevemente. Métodos
El raspado de la mucosa se analizaría usando SDS-PAGE y posteriormente se transferiría a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueará con, por ejemplo, una solución de caseína al 1 %, se lavará con un detergente que contiene solución salina regulada con fosfato y luego se probará usando un anticuerpo primario específico y posteriormente un anticuerpo secundario apropiado unido a una enzima para la detección, por ejemplo, enzima HRP (peroxidasa de rábano picante).
Los anticuerpos primarios se pueden producir contra proteínas de transporte expresadas de forma recombinante y usarse para detectar proteínas de transporte específicas, por ejemplo, SLC26a6. Los métodos para la preparación de anticuerpos son un lugar común en la técnica y no se describe en este documento.
Ejemplo 11
Evaluación de interacciones de unión entre proteínas de transporte expresadas de forma recombinante y compuestos secretagogos potenciales
Como una forma complementaria o alternativa de cribar los compuestos secretagogos potenciales identificados para el (los) compuesto(s) con las características deseadas, se puede analizar la interacción entre el (los) transportador (es) y los compuestos secretagogos propuestos.
Métodos
Existen varios métodos apropiados para caracterizar las interacciones proteína-proteína, conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar diversos métodos indirectos, es decir, ELISA, RIA y resonancia de plasmón de superficie para caracterizar la interacción entre la proteína de la membrana del transportador de oxalato y el secretagogo potencial expresado y purificado. Además, la calorimetría de valoración isotérmica (ITC) se puede usar para cuantificar las interacciones determinando el calor desarrollado en la asociación proteína-proteína.
Ejemplo 12
Evaluación de secretagogos potenciales en modelos animales con hiperoxaluria
Después de un cribado de los secretagogos potenciales expresados de forma recombinante in vitro, los compuestos prometedores se incluirán en un estudio usando modelos animales apropiados (véase el ejemplo 9 para ver ejemplos de modelos animales que se pueden usar como se describe en este documento), para confirmar el efecto in vivo. Este estudio se puede realizar usando un brazo respectivo para la colonización concurrente con O. formigenes, o la falta de colonización.
Métodos
Se han usado diversos modelos animales para simular condiciones hiperoxalúricas, entre los que se encuentra el modelo de ratón con deficiencia genética de AGT (véase el ejemplo 9). Este modelo de ratón se puede usar para evaluar el compuesto secretagogo potencial. La ejecución de estos modelos animales está bien descrita en la bibliografía y solo se describirá aquí de forma general. Además, los métodos para el análisis de calcio y oxalato en plasma y orina se usan comúnmente en el campo y no se describirán.
Se utilizarán ratones tanto machos como hembras. Al comienzo del estudio (aproximadamente 5 días), los ratones tendrán acceso libre a agua y comida estándar para ratones (por ejemplo, dieta 2018S, Harlan teklad) para establecer un valor de línea base para los parámetros que se van a monitorear, incluyendo, pero no se limitan a, al oxalato y calcio en plasma y orina.
Para aumentar el contraste en los niveles de oxalato y/o facilitar la colonización de O. formigenes, se puede incorporar un período (aproximadamente 5 días) en el que los ratones se cebaron con una dieta alta en oxalato (por ejemplo, dieta suplementada con oxalato al 1.5 % (calcio al 0.5 %; dieta 89000, Harían Teklad). Si se desea, un brazo seleccionado se colonizará con O. formigenes mediante sonda esofágica de un inóculo de 0.5 mL que contiene pellas celulares de O. formigenes húmedas en dos ocasiones, con una separación de 48 horas. El grupo de control se alimentará por sonda nasogástrica con un cultivo inactivado de O. formigenes o similar. Después de cinco días se confirma la colonización en los animales respectivos mediante detección en muestras fecales por PCR y puede sobrevenir la administración del compuesto secretagogo para ambos grupos.
Cada grupo se puede dividir en brazos separados en los que se administra o no el secretagogo, la administración del secretagogo puede continuar durante 3-5 días. Durante todo el estudio se controlarán el oxalato y el calcio en plasma y orina. Posteriormente, después de finalizar la administración del producto, se puede realizar un período de dieta alta en oxalato continua para ver que los valores de los parámetros regresen a los niveles previos al secretagogo. Si se desea, un brazo separado de los animales colonizados a los que se les administró el producto se puede mantener en el producto pero volver a dietas regulares de nivel de oxalato (0.5 %) para evaluar si los ratones con deficiencia genética pueden mantener la colonización sin la adición exógena de oxalato.
Tabla 1 Secretagogos propuestos identificados
Figure imgf000025_0001
Tabla 2 Descripción de las características físico-químicas de los secretagogos identificados
Figure imgf000026_0001

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un secretagogo derivado de bacterias degradantes del oxalato, comprendiendo dicho secretagogo una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad de secretagogo y al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19, para su uso en combinación con bacterias degradantes del oxalato en la prevención o tratamiento de una enfermedad relacionada con oxalato y/o desequilibrio relacionado con oxalato en un sujeto, en el que la enfermedad relacionada con oxalato y/o desequilibrio relacionado con oxalato es causada o realizada por un desequilibrio en niveles sistémicos de oxalato, y en el que la administración del secretagogo y las bacterias degradantes del oxalato da como resultado una reducción del oxalato en orina y/o del oxalato en plasma en el sujeto.
2. El secretagogo para su uso según la reivindicación 1, en el que la bacteria que degrada el oxalato es Oxalobacter formigenes.
3. El secretagogo para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho secretagogo comprende una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19.
4. El secretagogo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho secretagogo comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 3, o una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la misma.
5. El secretagogo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la enfermedad relacionada con oxalato se selecciona del grupo que consiste en hiperoxaluria primaria, hiperoxaluria, hiperoxaluria absortiva, hiperoxaluria entérica, enfermedad idiopática de cálculos renales de oxalato de calcio (urolitiasis), vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en etapa terminal, trastornos de conductancia cardíaca, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y trastornos/afecciones causados por/asociados con cirugía gastrointestinal, cirugía bariátrica (cirugía para la obesidad) y/o tratamiento con antibióticos.
6. El secretagogo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que se ha expresado de forma recombinante en un organismo apropiado o se ha extraído de un medio acondicionado.
7. Una composición farmacéutica que comprende uno o más secretagogos derivados de bacterias degradantes del oxalato, comprendiendo dicho uno o más secretagogos una secuencia de aminoácidos que tiene una actividad de secretagogo y al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos según una cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 4, 6, 13 y 19, comprendiendo además dicha composición una o más bacterias degradantes del oxalato.
8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, que comprende además una o más enzimas degradantes del oxalato, enzimas implicadas en el metabolismo de oxalato, cofactores o sustratos, o cualquier combinación de los mismos.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 u 8, en la que la composición se formula para tener una vía de administración enteral, parenteral o tópica.
ES14747997T 2013-07-05 2014-07-03 Secretagogos derivados de oxalobacter formigenes Active ES2869911T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/SE2013/050875 WO2015002588A1 (en) 2013-07-05 2013-07-05 Secretagogues derived from oxalobacter formigenes
PCT/SE2014/050848 WO2015002604A1 (en) 2013-07-05 2014-07-03 Secretagogues derived from oxalobacter formigenes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2869911T3 true ES2869911T3 (es) 2021-10-26

Family

ID=48856920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14747997T Active ES2869911T3 (es) 2013-07-05 2014-07-03 Secretagogos derivados de oxalobacter formigenes

Country Status (7)

Country Link
US (3) US10125176B2 (es)
EP (2) EP3865148A1 (es)
CN (1) CN105358172B (es)
DK (1) DK3016669T3 (es)
ES (1) ES2869911T3 (es)
JO (2) JOP20200118A1 (es)
WO (2) WO2015002588A1 (es)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015002588A1 (en) 2013-07-05 2015-01-08 Oxthera Intellectual Property Ab Secretagogues derived from oxalobacter formigenes
US20170035800A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 Kenneth Davin Fine Reduction of Oxalate Absorption in Individuals
AU2017376780A1 (en) 2016-12-15 2019-07-04 Novome Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for modulating growth of a genetically modified gut bacterial cell
CN112055697A (zh) * 2018-03-06 2020-12-08 环境工程师国际私人有限公司 用于修复工业废水的方法
US12016899B2 (en) 2018-07-18 2024-06-25 The University Of Chicago Compositions comprising Sel1-derived peptides and methods of treatment/prevention of excess oxalate levels and associated conditions/diseases therewith
WO2020071994A1 (en) * 2018-10-04 2020-04-09 Oxthera Intellectual Property Ab New medical use of oxalate-reducing bacteria
CN109402022A (zh) * 2018-12-05 2019-03-01 上海上药信谊药厂有限公司 一种产甲酸草酸杆菌及其应用
RU2704022C1 (ru) * 2019-01-09 2019-10-23 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ протеомной коррекции оксалатного нефролитиаза

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2288709C (en) 1997-05-23 2010-05-18 Ixion Biotechnology, Inc. Oxalate-degrading microorganisms or oxalate-degrading enzymes for preventing oxalate related disease
US8486389B2 (en) 1997-05-23 2013-07-16 Oxthera, Inc. Compositions and methods for treating or preventing oxalate-related disease
US6355242B1 (en) 1997-05-23 2002-03-12 Ixion Biotechnology, Inc. Materials and methods for treating or preventing oxalate-related disease
WO2005097176A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 University Of Florida Research Foundation, Inc. Modulating oxalate transport
US20050232901A1 (en) * 2004-04-14 2005-10-20 Zaghmout Ousama M Materials and methods for treating or preventing oxalate-related disease
PL1962873T3 (pl) 2005-12-14 2014-03-31 Oxthera Intellectual Property Ab Kompozycje farmaceutyczne zawierające bakterie zmniejszające ilość szczawianu
US8142775B2 (en) * 2006-08-02 2012-03-27 Althea Technologies, Inc. Crystallized oxalate decarboxylase and methods of use
US20130333068A1 (en) * 2008-04-29 2013-12-12 Marie Coffin Genes and uses for plant enhancement
WO2015002588A1 (en) 2013-07-05 2015-01-08 Oxthera Intellectual Property Ab Secretagogues derived from oxalobacter formigenes

Also Published As

Publication number Publication date
JOP20200118A1 (ar) 2017-06-16
WO2015002604A1 (en) 2015-01-08
US20160137701A1 (en) 2016-05-19
US10125176B2 (en) 2018-11-13
JO3591B1 (ar) 2020-07-05
US20220098247A1 (en) 2022-03-31
CN105358172A (zh) 2016-02-24
DK3016669T3 (da) 2021-05-10
EP3865148A1 (en) 2021-08-18
CN105358172B (zh) 2019-12-10
EP3016669B1 (en) 2021-03-31
EP3016669A1 (en) 2016-05-11
US20190085035A1 (en) 2019-03-21
EP3016669B8 (en) 2021-04-21
US10988510B2 (en) 2021-04-27
WO2015002588A1 (en) 2015-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2869911T3 (es) Secretagogos derivados de oxalobacter formigenes
JP6953135B2 (ja) タンパク質のインビボ産生
US20230013773A1 (en) Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
US20240110192A1 (en) Bacteria engineered to treat diseases that benefit from reduced gut inflammation and/or tightened gut mucosal barrier
JP2021192606A (ja) ヒト疾患に関連する生物製剤およびタンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
BR112017018656B1 (pt) Bactéria geneticamente modificada, composição farmaceuticamente aceitável compreendendo a dita bactéria e uso da dita composição para tratar ou prevenir uma doença ou condição associada à inflamação intestinal e/ou função da barreira intestinal comprometida
ES2925049T3 (es) Bacterias manipuladas para reducir la hiperfenilalaninemia
ES2665002T3 (es) Extracto bacteriano para trastornos respiratorios y procedimiento para su preparación
JP2018532412A5 (es)
BR112014015803A2 (pt) arginase humana e arginase humana pegilada direcionada para sítio e o seu uso
WO2015161820A1 (zh) 两亲性合成抗菌肽、其药物组合物及其用途
US20230210824A1 (en) Methods and Compositions for Delivery of Biotin to Mitochondria
US10646555B2 (en) Compositions and methods relating to argininosuccinate synthetase
JP2014504601A (ja) 抗糖尿病ペプチドとしてのアポリポタンパク質ａｉｖ
WO2017192761A1 (en) Propionyl-coa carboxylase compositions and uses thereof
WO2009035497A2 (en) Disease related cysteine modifications and uses thereof
ES2850650T3 (es) Insulina rectal para el tratamiento de enfermedades inflamatorias del intestino
Nosworthy et al. Enterally delivered dipeptides improve small intestinal inflammatory status in a piglet model of intestinal resection
WO2020259109A1 (zh) 植物生产的epo与转铁蛋白的融合蛋白及其应用
EP3606943A1 (en) Proteins derived from clpb and uses thereof
RU2797466C2 (ru) Faecalibacterium prausnitzii и desulfovibrio piger для применения при лечении или предупреждении диабета и заболеваний кишечника
WO2018204603A1 (en) PROPIONYL-CoA CARBOXYLASE COMPOSITIONS AND USES THEREOF
RU2412992C1 (ru) Штамм бактерий escherichia coli eb387 для защиты животных семейства псовых от токсикозов, вызванных цитотоническими токсинами типа a1b5, и пробиотический препарат на его основе
Senan Structure-function studies of SLC15 peptide transporters