BR112014015803A2 - arginase humana e arginase humana pegilada direcionada para sítio e o seu uso - Google Patents

Abstract

arginase humana e arginase humana peguilada direcionada de sítio e seu uso. a presente invenção refere-se a uma arginase de mutação direcionada de sítio e o seu processo de preparação, e o uso da dita arginase de mutação direcionada de sítio na preparação de um medicamento para tratamento de uma doença relacionada com arginase. a presente invenção também refere-se a uma arginase peguilada direcionada de sítio e o seu processo de preparação, e o uso de dita arginase peguilada na preparação de um medicamento para tratamento de uma doença relacionada com arginase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ARGI- NASE HUMANA E ARGINASE HUMANA PEGUILADA DIRECIONA- DA DE SÍTIO E SEU USO".

[001] Este pedido de patente reivindica prioridades a partir de pedido de patente Chinês Nº 201110445965.8, depositado em 27 de dezembro de 2011, intitulado "Arginase humana e arginase humana peguilada e o seu uso", e do pedido de patente Chinês Nº

201210069605.7, depositado em 16 de março de 2012, intitulado "Ar- ginase humana e arginase humana peguilada direcionada de sítio e o seu uso", que são aqui incorporados por referência em suas totalida- des. Referência a Listagem de Sequências

[002] A cópia dura da listagem de sequências submetida com o mesmo e com a correspondente forma legível em computador são ambas aqui incorporadas por referência em suas totalidades. Campo da Invenção

[003] A presente invenção provê uma arginase, o seu processo de preparação e o seu uso no tratamento de doenças relacionadas com arginase. Especificamente, a presente invenção provê uma argi- nase que sofreu mutação direcionada de sítio, o seu processo de pre- paração e o seu uso. Antecedentes da Invenção

[004] Arginina é um importante aminoácido em mamíferos inclu- indo seres humanos, que está envolvido em vários processos fisiológi- cos, incluindo proliferação e crescimento de célula. Por exemplo, argi- nina é um precursor imediato para a síntese da potencial molécula si- nal de óxido nítrico (NO). NO funciona como um neurotransmissor, um relaxante de músculo ou um vasodilatador. A biossíntese de NO en- volve reações dependentes de NADPH e Ca** catalisadas por óxido nítrico sintase. Uma outra função de arginina é como um precursor pa-

ra poliamina, espermidina ou espermina e participa em diferentes pro- cessos fisiológicos.

[005] Estudos mostraram que quando arginina é menos que 8 UM, células de câncer sofrem morte irreversível (Srorr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency on Iymphoma cells.Br.J.Cancer 30, 50). Através de estudo de efeito sobre crescimento de célula, foi verifi- cado que com remoção de arginina, as células normais na fase GO de ciclo de célula podem entrar num estado de descanso e permanece- rem viáveis por várias semanas sem dano significante; quando a con- centração de arginina retornou para nível normal, as células podem retornar para ciclo de célula normal. Entretanto, certas células de tu- mor podem proceder do ponto 'R' da fase G1 de ciclo de célula para fase S em privação de arginina, e logo sofrerem apoptose. A apoptose de células de tumor como um resultado de deficiência de arginina é irreversível. Por isso, cientistas começam a considerar tratamento de cânceres através de controle de nível de arginina no corpo, especial- mente para tumores auxotróficos como câncer de fígado e melanoma. Esta abordagem agora tem sido usada para estudar a inibição de vá- rios tumores. Arginase é a enzima catalisando a hidrólise de L-arginina para ornitina e ureia. Em geral, arginase é expressa no fígado, rins e testículos dos animais produzindo ureia (mamíferos, elasmobrânquios, anfíbios, e tartarugas) como uma das enzimas no ciclo ureia. Arginase catalisa a etapa final do caminho de reciclagem de ureia em mamiífe- ros, convertendo arginina para ornitina e ureia. Na maioria dos ani- mais, a família de arginase inclui arginase | e arginase Il. Arginase | é expressa principalmente nas células de fígado, e arginase |l é expres- sa principalmente no rim e eritrócitos. Existem dois processos para produzir arginase; dos quais um é para separar a mesma do organis- mo produzindo arginase, e a outra é através de técnicas de engenha- ria genética recombinante. As últimas têm suas vantagens. Por exem-

plo, experimentos mostraram que uma grande quantidade de arginase pode ser produzida por E. coli. Entretanto, podem haver problemas técnicos para produção de arginase através de técnicas de engenharia genética recombinante, como baixa atividade de enzima ou pobre es- tabilidade e curta meia-vida in vivo, limitando sua aplicação em prática clínica.

[006] US 7951366B2 mostrou uma composição farmacêutica e processo para o tratamento de tumor maligno humano através de es- gotamento de arginina usando arginase | humana recombinante com etiqueta-his, onde a arginase é modificada através de conjugação co- valente com polietileno glicol de peso molecular de 5000 (MW5000) no terminal-N ou o grupo amina sobre a superfície da arginase. A argina- se humana modificada teve uma estabilidade aumentada com uma meia-vida de 3 dias em soro humano.

[007] US20100247508A1 mostrou uma arginase humana modifi- cada com his-tag, onde as cisteínas 168 e 303 são substituídas com serinas e a arginase é peguilada com polietileno glicol de uma peso molecular de 20 KDa. Como a arginase | humana recombinante mos- trada em US7951366B2, um adicional fragmento de peptídeo, His-tag é incluído na sequência de aminoácidos da arginase. As agências re- guladoras de fármacos na maioria dos países não recomenda o uso destes fragmentos de peptídeos. Por exemplo, China State Food and Drug Administration indica no "Technical Quidelines on the Quality Control of Recombinant DNA Product for Human Use " que adicionais fragmentos de peptídeos como etiqueta-His introduzidos para o propó- sito de simplificação de processo de produção devem ser removidos tanto quanto possível do produto final.

[008] WO 2011/008495A2 mostrou uma arginase modificada di- recionada de sítio, na qual as três cisteínas foram retidas e um outro resíduo cisteína é introduzido substituindo o terceiro resíduo de ami-

noácido do terminus-N, e então peguilado com metóxi polietileno glicol maleimida de peso molecular de 20 KDa. Uma vez que a dita arginase humana ainda transporta os três resíduos cisteína originais, seu produ- to de peguilação é propenso a heterogêneo e baixo em rendimento, o que também adiciona dificuldades para purificação.

[009] O presente campo técnico tem a necessidade de uma me- lhor arginase ou seus derivados, para o tratamento de doenças ou dis- túrbios relacionados com arginina. Sumário da Invenção

[0010] A presente invenção provê uma arginase isolada e subs- tancialmente pura. Arginase é a enzima na etapa final do caminho de reciclagem de ureia na síntese de ureia em mamíferos, convertendo arginina em ornitina e ureia. Na maioria dos mamíferos, a família de argina se inclui arginase | e arginase Il. Estudos sobre arginase | de várias origens mostraram que arginase | de diferentes origens têm um lote de regiões conservadas e sítios ativos, embora sua sequência possa ser diferente. Como reportado por Haraguchi, Y., etc., 1987, Proc. Natl. Acad. Sc1. 84, 412-415, arginase | humana tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1, que compreen- de três cisteínas nas posições de aminoácidos 45, 168 e 303. A argi- nase | humana tipo selvagem tem uma sequência de ácidos nucléicos de SEQ ID NO. 2.

[0011] Na presente invenção, o termo "isolada" refere-se a uma forma não natural. O termo "substancialmente puro" significa que o produto pode compreender outros componentes derivados de produ- ção ou modificação de proteína, ainda que tais outros componentes não estejam substancialmente presentes ou somente presentes em uma pequena razão.

[0012] Na presente invenção, a descrição sobre a localização de sítio de aminoácido é comumente usada por aqueles versados na téc-

nica. Por exemplo, a frase "em posição 45 da sequência de SEQ ID NO.x" ou "Cys (cisteína) em posição 45 da sequência de SEQ ID NO.x" ou "Cys45" todas referem-se ao 45º resíduo de aminoácido na sequência amino ou a cisteína na posição 45.

[0013] Em um aspecto, a presente invenção provê uma arginase mutante, que é uma arginase | humana compreendendo

[0014] (1) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, onde qualquer uma, duas ou três das cisteínas em posições 45, 168 e 303 sofreu/sofreram mutação, ou

[0015] (2) uma sequência de aminoácidos onde substituição, su- pressão, inserção, adição ou inversão de um ou mais aminoácidos é introduzida na sequência de aminoácidos definida em (1),

[0016] e que tem atividade arginase.

[0017] Em um aspecto, as cisteínas na arginase da presente in- venção sofrem mutação para aminoácidos não polares. De acordo com as propriedades de sua cadeia lateral, os aminoácidos podem ser classificados como aminoácidos polares ou não polares. Aminoácidos tendo cadeias laterais sendo não carregadas ou fracamente polariza- das são chamados aminoácidos não polares, tais como, glicina, alani- na, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano e pro- lina.

[0018] Em um aspecto, as cisteínas na arginase da presente in- venção sofrem independentemente mutação para glicina, alanina, vali- na, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina. Preferivelmente, as cisteínas sofrem independentemente mutação pa- ra alanina. A presente invenção inesperadamente verificou que a ativi- dade enzimática de arginase | humana é significantemente aumentada quando a cisteína, que é um aminoácido polar não iônico sofre muta- ção para um aminoácido não polar (tal como alanina). Uma das possí- veis razões é que a ligação entre a arginase mutante e o substrato é aperfeiçoada.

[0019] Em um aspecto, uma das cisteínas nas posições 45, 168 e 303 da arginase da presente invenção sofre mutação. Ainda em um aspecto da presente invenção, cisteína na posição 303 sofre mutação. Preferivelmente, a dita cisteína sofre mutação para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano, ou proli- na; e mais preferivelmente, a dita cisteína sofre mutação para alanina.

[0020] Em um aspecto, quaisquer duas das cisteínas em posições 45, 168 e 303 da arginase da presente invenção sofrem mutação. Ain- da em um aspecto da presente invenção, cisteínas em posições 45 e 303 sofrem mutação. Preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem muta- ção para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano, ou prolina; e mais preferivelmente, as ditas cisteí- nas sofrem mutação para alanina. Em um aspecto, cisteínas em posi- ções 168 e 303 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na ar- ginase da presente invenção sofrem mutação. Preferivelmente, as di- tas cisteínas sofrem mutação para glicina, alanina, valina, leucina, iso- leucina, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina; e mais preferi- velmente, as ditas cisteínas sofremmutação para alanina. Em um as- pecto, cisteínas em posições 45 e 303 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na arginase da presente invenção sofrem mutação. Preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para glicina, alani- na, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação pa- ra alanina.

[0021] Em um aspecto, cisteínas em posições 45, 168 e 303 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na arginase da presente invenção sofrem mutação. Preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina, e mais preferivelmente, as ditas cis-

teínas sofrem mutação para alanina.

[0022] A arginase da presente invenção tem atividade enzimática maior que a arginase tipo selvagem. A arginase da presente invenção geralmente tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 500 U/mg; preferivelmente, a atividade é de pelo menos cerca de 700 U/mg; e mais preferivelmente, a atividade é pelo menos cerca de 800 U/mg. Arginase da presente invenção geralmente tem atividade enzi- mática maior que a arginase tipo selvagem.

[0023] Em um aspecto da presente invenção, a arginase tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, onde pelo menos um códon para o resíduo de aminoácido cisteína em posições 45, 168 e 303 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 está substituído. Pre- ferivelmente, um, dois ou três dos códons para cisteína é/são substitu- ídos. Aminoácidos são codificados por polinucleotídeos. Um códon de três nucleotídeos em um RNA mensageiro define um aminoácido sim- ples. Em um aspecto da presente invenção, a substituição de nucleotí- deo é o códon TGT substituído por um códon codificando glicina, ala- nina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina. Preferivelmente, o códon TGT é substituído por um códon co- dificando alanina.

[0024] Em um aspecto da presente invenção, os ditos códons co- dificando alanina são GCT, GCC, GCA, GCG, e preferivelmente é GCT.

[0025] Em um aspecto, a presente invenção provê um processo para preparação de arginase mencionada acima, incluindo expressão de gene da arginase ou arginase mutante em um hospedeiro que é capaz de expressar a proteína. O processo de preparação para a argi- nase da presente invenção geralmente inclui as seguintes etapas prin- cipais. Desejados genes ou fragmentos de nucleotídeos são obtidos por PCR ou processo sintético. O fragmento de DNA com o desejado gene é ligado a um vetor, tal como um plasmídeo, fago ou vírus, que pode replicar independentemente e tem um marcador de seleção para formar moléculas de DNA recombinante. A ligação de fragmentos de DNA em um vetor é principalmente através de caudas de homopolime- ros, extremidades coesivas, extremidade — embotada ou ligante artifi- cial. DNA recombinante tem de ser introduzido na célula hospedeira de modo a ser multiplicado e expresso. De acordo com diferentes propri- edades dos vetores, transfecção, transformação, transdução são reali- zadas de modo que as moléculas de DNA recombinante são introduzi- das em uma célula hospedeira e multiplicadas. Apropriados hospedei- ros de engenharia genética são conhecidos na técnica, os quais inclu- em Escheria coli, levedura, células de inseto e semelhantes.

[0026] A presente invenção também provê arginase peguilada iso- lada e substancialmente pura, caracterizada em que a peguilação de específica de sítio. Na dita arginase peguilada, molécula de polietileno glicol é covalentemente ligada com os resíduos de aminoácidos espe- cificados da arginase para obter a peguilação específica de sítio. Na presente invenção, cada arginase está ligada com pelo menos uma molécula de polietileno glicol para formar a arginase peguilada.

[0027] Em um aspecto da presente invenção, a arginase na dita arginase peguilada é a arginase mutante como definida anteriormente.

[0028] Em um aspecto, a presente invenção provê uma arginase peguilada, onde a arginase é uma arginase | humana que compreen- de:

[0029] (1) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, onde uma ou duas das cisteínas em posições 45, 168 e 303 sofre/ sofrem mutação, ou

[0030] (2) uma sequência de aminoácidos onde substituição, su- pressão, inserção, adição ou inversão de um ou mais aminoácidos é introduzida na sequência de aminoácidos definida em (1),

[0031] e que tem atividade arginase.

[0032] Em um aspecto, as cisteínas na arginase peguilada da pre- sente invenção sofrem independentemente mutação para aminoácido não-polar. As estruturas dos 20 aminoácidos são diferentes devido à diferença de sua cadeia lateral. Aminoácidos tendo grupos sendo car- regados ou fracamente polarizados pertencem a aminoácidos não po- lares, tais como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano e prolina.

[0033] Em um aspecto da invenção, a arginase | peguilada não compreende uma sequência etiqueta para uso na purificação, tal como uma sequência etiqueta-His adicionada no terminus C ou N. Proteína de fusão de etiqueta-His é o meio mais comum de expressão de prote- Ína, que tem a vantagem de facilidade para purificação e sem signifi- cante efeito para a atividade da proteína. Produtos de expressão de proteína tanto em forma sólida como em corpo de inclusão pode ser purificada através de cromatografia de afinidade de íon de metal imobi- lizado. Por outro lado, devido à potencial propriedade de imunogenici- dade, China State Food and Drug Administration indica no " Technical Quidelines on the Quality Control of Recombinant DNA Product for Human Use " que adicionais fragmentos de peptídeos tais como eti- queta-His introduzidos para o propósito de simplificação de processo de produção devem ser removidos tanto quanto possível do produto final.

[0034] Na presente invenção, a peguilação da arginase pode ser obtida através de modificação química, a dita modificação pode ser realizada através de uso de um derivado de polietileno glicol com um agente de acoplamento (também referido como um reagente de pegui- lação) para ligar covalentemente uma molécula de polietileno glicol com um grupo sobre a arginase. A dita modificação química pode ser específica, isto é, moléculas de PEG conjugadas com um específico grupo sobre a arginase através de uso de reagentes de acoplamento com específicas atividades ligantes. Peguilação direcionada de sítio conforma-se aos seguintes princípios: (1) modificação do sítio ativo de proteína deve ser evitada tanto quanto possível para evitar seu efeito negativo sobre atividade de proteína; e (2) o inteiro processo deve ser tão simples quanto possível para ser controlável. Molécula de polietile- no glicol comum tem um grupo hidroxila em cada sua extremidade. Um metóxi polietileno glicol (MPEG) é um polietileno glicol bloqueado em uma extremidade com um grupo metoxi. Os reagentes de peguilação mais comumente estudados usados na modificação de peptídeos ou proteínas são derivados de metóxi polietileno glicol (MPEG). Um pro- cesso de peguilação comum é ligar covalentemente polietileno glicóis ou reagentes de peguilação com e-NH, de lisina de superfície ou a- NH, terminal-N da proteína, tal como succinimidil butirato de metóxi polietileno glicol (mMPEG-SBA), mPEG-propionato de succinimidila (MPEG-SPA), mPEG-succinato de succinimidila (mMPEG-SS), mPEG- carbonato de succinimidila (mPEG-SC), mPEG-glutarato de succinimi- dila (MPEG-SG), mPEG-N-hidroxil succinimida (MPEG-NHS), mPEG- tresilato e MPEG-aldeído. Um outro processo de peguilação comum é usar seletivamente polietileno glicóis ou reagentes de peguilação que possam ser especificamente conjugados com o grupo tiol de proteínas, tais como mMPEG-maleimida, mPEG — dissulfeto de orto — piridila, mPEG — vinil sulfona e MPEG — iodo acetamida para modificar o grupo tiol de peptídeos ou proteínas. Uma vez que o número de grupos tiol em proteínas ou peptídeos é relativamente pequeno, é geralmente fá- cil obter um produto de peguilação homogêneo.

[0035] Arginase humana tem três resíduos cisteína localizados em posições 45, 168 e 303 da sequência de aminoácidos. Em um aspecto da presente invenção, a dita arginase peguilada tem peguilação espe- cífica de sítio em uma ou duas das ditas posições de cisteína.

[0036] Em um aspecto da presente invenção, a dita peguilação específica de sítio é obtida através de mutagênese direcionada de sítio da cisteína da arginase e seguida por peguilação específica de sítio de arginase mutante em resíduo cisteína. Ainda em um aspecto da pre- sente invenção, a dita peguilação específica de cisteína é obtida atra- vés de ligação covalente de PEG com o grupo tiol de cisteína sobre a arginase através de metóxi polietileno glicol — maleimida.

[0037] Em um aspecto da presente invenção, a dita peguilação específica de sítio é obtida através de mutagênese direcionada de sítio de cisteína para outro aminoácido em uma ou duas posições cisteína que não é/são para ser peguilada, e preferivelmente sofre mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alani- na, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, a dita cisteína(s) so- fre/sofrem mutação para alanina.

[0038] A seleção de peso molecular do PEG deve realizar uma consideração compreensiva da bioatividade e as propriedades fárma- co — cinéticas. Estudos mostraram que o tempo de atuação dos fárma- cos de proteína modificada no corpo estão correlacionados com os números e peso de molécula de PEG conjugado. O PEG usado para a presente invenção tem um peso de molécula variando de 5 K a 40 K, linear ou ramificado. Os PEGs usados para a presente invenção po- dem ser derivados de PEG usados no campo técnico. O PEG usado para a presente invenção não é limitado a certos tipos especificados. Em um aspecto da presente invenção, o peso molecular médio da mo- lécula de PEG ligada covalentemente com a arginase é cerca de 20 K, K, ou 40 40 K. Proteínas peguiladas podem ser administradas atra- vés de injeção intravenosa. O peso molecular médio do polietileno gli- col pode afetar a sua meia-vida em soro. Estudos verificaram que de- puração renal de PEG depende de sua taxa de filtração glomerular. Os glomérulos podem permitir que proteínas com pesos moleculares me-

nores que 70 KDa ou PEGs com pesos moleculares menores que 30KDa sejam filtrados. O efeito de peso molecular de PEG sobre a meia-vida e atividade da proteína ligada é usualmente imprevisível, o que é geralmentegeralmente relacionado de perto com o peso molecu- lar de proteína, modo de ação, sítio ativo, e sítio de ligação de PEG de proteína.

[0039] Em um aspecto da presente invenção, a arginase peguilada é peguilada direcionada para sítio em posições 45 e 168 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, e preferivelmente, a dita peguilação direcionada para sítio é obtida por mutagênese da cisteína em posição 303 da arginase; e o peso molecular médio do PEG é cerca de 20 K ou 30 K. Preferivelmente a dita cisteína sofre mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, a dita cisteína sofre mutação para alanina.

[0040] Em um aspecto da presente invenção, a arginase peguilada é peguilada de sítio direcionado na posição 168 de sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1; e preferivelmente, a dita peguilação de sítio direcionado é obtida através de mutagênese das cisteínas em po- sições 45 e 303 da arginase, e o peso molecular médio do PEG é cer- ca de 40 K . Preferivelmente, as ditas cisteínas soffem mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, trip- tofanol ou prolina; e mais preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina.

[0041] Em um aspecto da presente invenção, a arginase peguilada é peguilada de sítio direcionado em posição 45 da sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 1; e preferivelmente, a dita peguilação de sítio direcionado é obtida através de mutagênese da cisteíina em posi- ções 168 e 303 da arginase, e o peso molecular do PEG é de cerca de 40 K. Preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina,

glicina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, as ditas cisteínas softfem mutação para alanina.

[0042] A presente invenção provê uma arginase peguilada tendo uma pureza de mais que 70%; preferivelmente, a pureza é de mais que 80%; e mais preferivelmente, a pureza é de mais que 90%. Na presente invenção, o termo "pureza de arginase peguilada" significa a porcentagem da arginase peguilada (isto é, arginase ligada covalen- temente com PEG) na arginase total (arginase ligada covalentemente com PEG, arginase não ligada covalentemente com PEG e arginase peguilada polimérica). Geralmente, o produto ainda precisa purificação porque ele contém arginase não ligada covalentemente com PEG e arginase peguilada polimérica. Meios comumente usados de técnica de purificação são conhecidos na técnica, incluindo a cromatografia de troca de cátions, etc. A arginase peguilada da presente invenção tem uma meia-vida de pelo menos 0,5 dia; preferivelmente, a dita arginase tem uma meia-vida de pelo menos 2,5 dias; e mais preferivelmente a dita arginase tem uma meia-vida de pelo menos 3,5 dias no sangue ou soro. A meia-vida da arginase pode ser medida com o processo co- nhecido e comumente usado na técnica. Há certa relação entre os da- dos medidos para a meia — vida de arginase no sangue ou soro e o modelo animal usado. Os dados de meia-vida obtidos em um animal com maior taxa metabólica (por exemplo, rato) são geralmente meno- res que aqueles com menor taxa metabólica (por exemplo, seres hu- manos).

[0043] A presente invenção provê um processo para a preparação de uma arginase peguilada, onde a peguilação é específica de sítio. Na arginase peguilada da presente invenção, a molécula de PEG está conjugada com o específico grupo sobre a arginase para obter a pe- guilação específica de sítio. Na arginase peguilada da presente inven-

ção, cada molécula de arginase está ligada com pelo menos uma mo- lécula de PEG para formar a arginase peguilada.

[0044] Na presente invenção, peguilação direcionada de sítio é obtida através de modificação química, onde a dita modificação é rea- lizada através de conjugação covalente de moléculas de PEG com os grupos sobre a arginase na presença de reagente de acoplamento. À dita modificação química pode ser específica, ou seja, a molécula de PEG conjuga somente com específico resíduo de aminoácido da argi- nase usando reagentes que se ligam com grupo específico.

[0045] A presente invenção também provê a aplicação / uso da arginase ou a arginase peguilada mencionadas acima ou a composi- ção farmacêutica contendo as mesmas no tratamento de uma doença relacionada com arginase. As ditas doenças relacionadas com argina- se conhecidas no campo incluem condições / doença / distúrbios rela- cionados com nível de arginina no corpo de mamíferos. Tais condições 1 doença / distúrbios incluem hiperargininemia. Devido a deficiência de arginase, a arginina no corpo de um sujeito não pode ser degradada em ureia e participar no ciclo de metabolismo de ornitina, de modo que o nível de arginina no sangue pode ser 7 a 10 vezes maior que o valor no sangue normal, ao mesmo tempo em que o nível de arginina no fluido cérebro — espinhal e urina e excreção de ureia de creatinina também são aumentadas. Além disso, as ditas condições / doença / distúrbios incluem hiperplasia ou tumor dependente de arginina. Atra- vés de estudo de efeito sobre crescimento de célula, foi verificado que com remoção de arginina, as células normais na fase GO de ciclo de célula podem entrar em um estado de repouso e permanecerem viá- veis por várias semanas sem dano significante; quando a concentra- ção de arginina retornou para nível normal, as células podem retornar para ciclo de célula normal. Células em proliferação ou tumores, entre- tanto, podem proceder depois do ponto 'R' da fase G1 do ciclo de célu-

la para entrarem na fase S na privação de arginina, e logo sofrerem apoptose. A apoptose de células de hiperplasia ou células de tumor como um resultado de deficiência de arginina é irreversível. Por isso, cientistas começam a considerar tratamento de hiperplasia ou tumor através de controle de nível de arginina no corpo.

[0046] A presente invenção também provê uma composição arma- cêutica, onde o ingrediente ativo da dita composição farmacêutica da presente invenção é a arginase ou a arginase peguilada como descrita acima. A formulação de dita composição farmacêutica pode estar na forma de sólido, soluções, emulsões, dispersões, micelas, lipossomas, onde a formulação contém uma ou mais da arginase ou arginase pe- guilada humana da presente invenção como ingrediente ativo e mistu- rada com carreador ou excipiente orgânico ou inorgânico apropriado para aplicações parenterais. Além disso, adjuvantes, estabilizadores, espessantes, agentes corantes e perfumes podem ser incluídos. Uma ou mais arginases ou arginases peguiladas humanas isoladas e subs- tancialmente puras da presente invenção são compreendidas como ingrediente ativo em uma quantidade suficiente para produzir o dese- jado efeito sobre as condições ou doenças. As composições farmacêu- ticas podem ser formuladas em formas apropriadas para administra- ção oral, tais como comprimidos, pílulas, losangos, suspensões base- adas em óleo ou hidratação, pulverizados ou grânulos dispersos, e- mulsões, cápsulas duras e moles, ou xaropes. Formulações para ad- ministração oral podem ser encapsuladas de acordo com técnicas co- nhecidas para diminuir a decomposição e absorção no trato gastroin- testinal, pelo que provendo efeitos sustentados por um maior tempo. À formulação também pode ser uma forma de suspensão ou solução in- jetável estéril. A dita suspensão pode ser preparada de acordo com processos conhecidos na técnica através de uso de agentes de dis- persão ou umectantes e agentes de suspensão.

[0047] A composição farmacêutica da presente invenção ainda pode ser formulada em uma forma sólida, líquida, suspensão, micela ou lipossoma. Em um aspecto da presente invenção, a composição farmacêutica é formulada em uma forma oral ou injetável. Breve Descrição dos Desenhos

[0048] A Figura 1 mostra a sequência de nucleotídeos de arginase | tipo selvagem.

[0049] A Figura 2 mostra análise de eletroforese de gel de poliacri- lamida — SDS de arginase | humana sob condição redutora.

[0050] A Figura 3 mostra a expressão de arginase humana através de análise de cromatografia líquida de alta pressão.

[0051] A Figura 4 mostra os resultados de testes de arginase | mu- tante e tipo selvagem com eletroforese de gel de poliacrilamida — SDS redutora e não redutora.

[0052] A Figura 5 mostra análise de eletroforese de gel de poliacri- lamida — SDS de arginase | mutante purificada (rhArgl-A303, rhArgl- A168/303 e rhArgl-A45/303) sob condições redutoras e não-redutoras.

[0053] A Figura 6 mostra análises de eletroforese de gel de polia- crilamida - SDS de arginase | mutante purificada (rhArgl-A45/168 e rhArgl-A45/168/303) sob condições redutoras e não-redutoras.

[0054] A Figura 6a mostra análises de eletroforese de gel de polia- crilamida — SDS não redutoras de arginase | mutante purificada (rhAr- gl-A45/168 e rhArgl-A45/168/303).

[0055] A Figura 6b mostra análises de eletroforese de gel de polia- crilamida —- SDS redutora de arginase | mutante purificada (rhArgl- A45/168 and rhArgl-A45/168/303).

[0056] A Figura 7 mostra análise de eletroforese de gel de poliacri- lamida — SDS não redutora de arginase | humana peguilada. Descrição Detalhada de Realizações Preferidas da Invenção

[0057] Esta invenção ainda será ilustrada usando as realizações descritas abaixo. Deve ser entendido que embora estas realizações ilustrem as realizações preferidas da presente invenção, elas são so- mente dadas por meio de amostras ilustradas. Com referência à des- crição e realizações acima, aqueles versados na técnica podem de- terminar as características essenciais da invenção, mudar e modificar a invenção em várias maneiras em adaptação para outros usos e con- dições sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Por isso, ou- tras que não aquelas aqui mostradas e descritas, de acordo com ante- rior, quaisquer mudanças / modificações feitas para esta invenção se- rão aparentes para aqueles versados na técnica e estas modificações também são pretendidas formarem parte do escopo das reivindicações apostas.

Exemplo 1: Expressão e construção de plasmídeo pET30a (+)- rharginase de arginase | humana recombinante livre de etiqueta-His

[0058] Sequência gene arginase | humana foi publicada em 1987 (Haraguchi. Y. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, 84, 412415). Gene arginase humana foi amplificado por reação de cadeia polimerase (P- CR) usando biblioteca de cDNA plus estiramento 5' de fígado humano (Clontech) como molde e iniciadores ARG-V (+) e ARG-V (-) projeta- dos de acordo com a sequência de arginase | mencionada anterior- mente. Iniciador ARG-V (+) contém um sítio de endonuclease de res- trição Ndel, e um iniciador ARG-V (-) contém um sítio de endonuclease de restrição Xhol. Usando técnicas comuns de laboratório de biologia molecular, produto de PCR de arginase | humana foi obtido e confir- mado através de eletroforese de gel agarose. O produto de PCR de arginase | humana amplificado e vetor de expressão comercialmente disponível pET30a (+) foram digeridos com endonucleases de restri- ção, Ndel e Xhol (Promega) separadamente a 37ºC por 1,5 horas. Os fragmentos digeridos foram ligados por toda noite a 16ºC por T4 DNA ligase, e o resultante plasmídeo recombinante ligado foi transformado em células competentes de E.coli DH5a. As células transformadas fo- ram selecionadas através de revestimento e cultura sobre uma placa de agar LB contendo canamicina (30 ug / mL). Plasmídeos contendo a inserção correta foram identificados através de ensaio de digestão com endonuclease de restrição. O correto plasmídeo de expressão de arginase | humana recombinante, a seguir conhecido como pET30a (+)-rharginase-V, foi analisado por sequenciamento para assegurar a sequência correta e inserção de gene arginase | humana. O tamanho de inserção é de 969 pares de bases em comprimento. Como mostra- do na Figura 1, ela tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2.

[0059] ARG-V(+):

[0060] 5' GGEAATTCCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATAG 3'

[0061] Ndel

[0062] ARG-V(-):

[0063] 5' —CCGCTCGAGTTATTACTTAGGTGGGTTAAGGTAGT- CAATAGG 3'

[0064] Xhol Exemplo 2: Expressão de plasmídeo DNA pET30aa (+)-rharginase-V de arginase | humana recombinante livre de etiqueta-His e purificação de proteína alvo

[0065] Cem microlitros de células BL21(DE3) competentes foram descongelados sobre gelo. Um microlitro de plasmídeo recombinante pET30a (+)-V foi adicionado às células competentes e incubados so- bre gelo por 30 minutos. A mistura foi então tratada com choque térmi- co em um banho de água a 42ºC por 90 s seguido por ainda incubação sobre gelo por 2 minutos. Quinhentos microlitros de caldo LB foram adicionados às células transformadas e cultivadas — agitadas a 37ºC, 150 rpm por 1 hora. Após incubação, 200 microlitros da suspensão de células transformadas foram revestidos e espalhados sobre uma placa de ágar LB canamicina, que foi então incubada de cabeça para baixo em uma incubadora a 37ºC por 16 horas.

[0066] Colônias simples transformadas com plasmídeo recombi- nante foram selecionadas, transferidas em 25 mL de caldo LB e culti- vadas — agitadas a 37ºC, 150 rpm até a densidade ótica em 600 nm (OD600nm) atingir 0,6-0,8. Uma concentração final de IPTG 0,2 mM foi adicionada à cultura para induzir expressão de proteína alvo por 3 horas. Expressão de proteína alvo dos clones selecionados foi anali- sada usando eletroforese de gel de poliacrilamida — SDS (SDS — PA- GE). Os clones com maior expressão de proteína foram estocados em estoque de glicerol como bactérias engenheiradas.

[0067] As células de bactérias engenheiradas foram alimentadas — cultivadas em batelada em um fermentador de 15 L. Quando ODG600nm atinge 12-13, uma concentração final de IPTG de 0,2 mM foi adicionada na cultura para induzir expressão de proteína alvo por 3- 4 h. Células de bactérias induzidas foram coletadas e lisadas. O lisado de células foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado para subse- quente separação e purificação de proteína alvo.

[0068] Purificação de proteína alvo foi realizada usando cromato- grafia líquida de cátion CM. Tris-HCI foi usado para equilibrar a coluna antes de carga de amostra. O sobrenadante lisado de células bacteri- anas foi carregado na coluna, seguido por lavagem com três volumes de coluna de tampão de equilíbrio para remover impurezas associadas fracamente ou ligadas não-especificamente. Quando a leitura de UV280nm estabilizou, a proteína alvo foi eluída usando um tampão de eluição contendo Tris-HCl e NaCl. Os picos de proteínas eluídas da coluna foram coletados e analisados por SDS-PAGE e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

[0069] Resultados experimentais foram ilustrados em Figuras 2 e

3.

[0070] A Figura 2 mostra o resultado de análise SDS-PAGE de nível de expressão de arginase | humana. As amostras em cada faixa são como se seguem:

[0071] 1. padrão de peso molecular de proteína; 2. sobrenadante de lisado de bactérias; 3. arginase | humana livre de etiqueta-His; 4. fluxo através de coluna de troca de cátions CM.

[0072] A Figura 3 mostra o resultado de análise de HPLC de argi- nase | humana purificada.

[0073] Como mostrado em Figuras 2 e 3, a pureza de arginase obtida via o procedimento de cromatografia acima é de mais que 90%. Exemplo 3: Mutagênese de sítio direcionado de arginase | humana (rharal)

[0074] Mutações de sítio direcionado foram introduzidas em posi- ções 45, 168 e 303 de sequência de aminoácidos de arginase | huma- na usando QuickChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene). Plasmídeo recombinante pET30a-rharginase |-V contendo arginase humana tipo selvagem foi usado como molde. Códons que codificam cisteína (TGT) em posições 45, 168 e 303 sofreram independentemen- te mutação para códons que codificam alanina (GCT), resultando em mutações de sítio simples, duplas ou triplas. Os iniciadores pretendi- dos para introdução de códon GCT de substituição em posições 45, 168, e 303 de arginase | humana são mostrados abaixo:

[0075] ARG-m45(+):

[0076] 5' GAGAAACTTAAAGAACAAGAGGCTGATGTGAAGGAT- TATGGGG 3'

[0077] ARG-m45(-):

[0078] 5' CCCCATAATCCTTCACATCAGCCTCTTGTTCTTTA- AGTTTCTC 3'

[0079] ARG-m168(+):

[0080] 5' —"GATTCTCCTGGGTGACTCCCGCTATATCTGCCAAG-

GATATTG 3'

[0081] ARG-m168(-):

[0082] 5' ” CAATATCCTTGGCAGATATAGCGGGAGTCACCCAG- GAGAATC 3'

[0083] ARG-m303(+):

[0084] 5D' GTTGCAATAACCTTGGCTGCTTTCG- GACTTGCTCGGG 3'

[0085] ARG-m303(-):

[0086] 5' CCCGAGCAAGTCCGAAAGCAGCCAAGGTTATTGCA- AC3'

[0087] PCR foi conduzida de acordo com as instruções providas no kit de mutagênese. Molde DNA parente sem mutação foi digerido com endonuclease de restrição Dpnl. Os plasmídeos que sofreram mutação foram então transformados em células competentes e confir- mados por sequenciamento. Clones que foram transformados com o plasmídeo de arginase mutante contendo a mutação de códon codifi- cando cisteína (TGT) para códon codificando alanina (GCT) foram se- lecionados e expandidos em caldo de cultura LB. Plasmídeos mutan- tes alvos foram isolados usando Wizard Plus mini prep kit.

[0088] Arginase | humana mutante com mutação simples de ciste- Ína para alanina em posição de aminoácido 303, 168 ou 45 foi repre- sentada como rhArgl-A303, rhArgl-A168 ou rhArgl-A45, respectiva- mente. Arginase | humana mutante com mutações duplas de cisteína para alanina em posições de aminoácidos 168 e 303, em posições de aminoácidos 45 e 303 e em posições de aminoácidos 45 e 168 foram representadas como rhArgl-A168/303, rhArgl-A45/3803 e rhArgl- A45/168, respectivamente. Arginase | humana mutante com três muta- ções cisteína para alanina em posições de aminoácidos 45, 168 e 303 foi representada como rhArgl-A45/168/303. Plasmídeos contendo as inserções mutantes de arginase acima foram representados como pET30a(+)-rhArgl-A303, pET30a(+)-rhArgl-A168, pET30a(+)-rhArgl- A45, —pET30a(+)-rhArgl-A168/803, pET30a(+)-rhArgl- A45/303, pET30a(+)-rhArgl-A45/168 ou pET30a(+)-rhArgl- A45/168/303.

[0089] Cem microlitros de células BL21(DE3) competentes foram descongelados sobre gelo. Um microlitro da construção mutante foi adicionado às células competentes BL21(DE3) e incubadas sobre gelo por 30 minutos. A mistura foi então tratada com choque térmico a 42ºC por 90 s, seguido por ainda incubação sobre gelo por 2 minutos. Qui- nhentos microlitros de caldo LB foram adicionados às células trans- formadas e cultivadas — agitadas a 37ºC, 150 rpm por 1 hora. Após incubação, 200 microlitros da suspensão de células transformadas fo- ram revestidos e espalhados sobre uma placa de agar LB canamicina e incubada de cabeça para baixo a 37ºC por 16 horas.

[0090] Colônia simples transformada com plasmídeo recombinante foi selecionada, transferida em 25 mL de caldo LB, e cultivada — agita- da a 37ºC, 150 rpm, até a densidade ótica em 600 nm (OD600nm) a- tingir 0,6-0,8. Uma concentração final de 0,2 mM de IPTG foi adiciona- da à cultura para induzir expressão de proteína alvo por 3 horas. Ex- pressão de proteína alvo nos clones selecionados foi analisada usan- do SDS-PAGE. Os clones com maior expressão de proteína foram es- tocados em estoque de glicerol como bactérias engenheiradas. Exemplo 4: Expressão e purificação de proteína de arginase | que so- freu mutação específica de sítio

[0091] Células de E. coli engenheiradas transformadas com plas- mídeos arginase | mutante (rhArgl) (pET30a(+)-rhArgl-A3O3, pET30a(+)-rhArgl-A168, “pET30a(+)-rhArgl-A45, pET30a(+)-rhArgl- A168/303, pET30a(+)-rhArgl- A45/303, pET30a(+)-rhArgl-A45/168 ou- pET30a(+)-rhArgl-A45/168/303) foram cultivada batelada — alimenta- das em um fermentador de 15 L. Quando OD600nm atingiu 12-13, uma concentração final de 0,2 mM de IPTG foi adicionada à cultura para induzir expressão de proteína alvo por 3-4 horas. As células bac- terianas foram coletadas e lisadas O lisado de células foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado para subsequente isolamento e purifica- ção de proteína.

[0092] Purificação de proteína alvo foi realizada usando coluna de troca de cátions CM. Tris-HCI foi usado para equilibrar a coluna antes de carga de amostra. O sobrenadante de lisado de células bacterianas foi carregado na coluna, seguido por lavagem com três vezes o volu- me de coluna de tampão de equilíbrio para remover impurezas fraca- mente associadas ou ligadas não especificamente. Quando a leitura de UV280nm estabilizou, proteína alvo foi eluída usando um tampão de eluição contendo Tris-HCI e NaCl. Os picos de proteínas eluídas da coluna foram coletados para obter arginase | mutante rhArgl-A303, rhArgl-A168, rhArgl-A45, rhArgl-A168/303, rhArgl-A45/303, rhArgl- A45/168 e rhArgl-A45/168/303. Pureza das amostras de proteínas co- letadas foi analisada por SDS-PAGE e HPLC. Usando o procedimento de cromatografia acima, a pureza de arginase foi determinada ser mais de 90%. Exemplo 5: Atividade de arginase | mutante específica de sítio (rhArgl)

[0093] A atividade de arginase foi determinada através de um en- saio espectrofotométrico acoplado com urease e glutamato desidroge- nase, que é mostrado através de diagrama esquemático abaixo. NAD- PH tem absorbância ótima no comprimento de onda de 340 nm. Quando NADPH é oxidada a NADP+, a absorbância em 340 nm dimi- nui. A atividade de arginase pode ser correlacionada e determinada através de monitoração de diminuição em absorbância em 340 nm jun- to com o coeficiente de extinção molar de NADPH (AE340 = 6220 M' em”). Arginina + HO Arginase , Ornitina+Ureia Ureia + HO Urease HCO;3' + 2NH,Í

Glutamate NH,* + a-cetoglutarato + NADPH (YEscnaso nlutamato + NADP* + HO

[0094] Uma unidade (U) de atividade arginase foi definida como a liberação de 1 umol de ureia sob a condição de 30ºC, pH 8,3.

[0095] Atividade específica de arginase foi calculada usando a se- guinte equação: Atividade Específica (Umg) = [(AA/At) x (1/e) x 10º x (1/2)] / [E]

[0096] AA = Diferenças em absorbâncias em 340 nmminm

[0097] € = constante Michaelis - Menten (Km) NADPH (6220M cm” ó

[0098] [E] = concentração de enzima na mistura de reação (mg/mL)

[0099] Usando o ensaio acima, as atividades específicas de várias arginases | (rhArgl-A303, rhArgl-A168/303, rhArgl-A45/303, rhArgl- A45/168 and rhArgl-A45/168/303) foram determinadas serem 747 +/- 63 U/mg, 814 +/- 91 U/mg, 786 +/- 58 Ul/mg, 782 +/- 19 U/mg, e 759 +/- 68, respectivamente. A atividade específica de arginase | humana tipo selvagem foi determinada ser 491 +/- 42 U/mg, demonstrando um sig- nificante aumento de atividade arginase após as cisteínas aminoácidos não polares em posições 168/303, 45/303, 45/168 e 45/168/303 sofre- rem mutação para aminoácidos não polares alaninas. Exemplo 6: Análise SDS-PAGE de arginase | tipo selvagem e mutante (rhargl)

[00100] O gel de poliacrilamida foi preparado usando processo tra- dicional. Amostras foram tratadas sob condição redutora (isto é, beta- mercapto etanol foi incluído no tampão de carga de amostra para des- truir ligações dissulfeto inter- e intramoleculares) ou não redutora antes de análise para decifrar a formação de ponte dissulfeto intramolecular de arginase | tipo selvagem e vários mutantes usando eletroforese de gel poliacrilamida 12% (Figura 4, 5, 6A, 6B).

[00101] A Figura 4 mostra o resultado de análise SDS-PAGE de arginase | tipo selvagem após tratamento sob condições redutoras e não redutoras. As amostras nas faixas são como se segue: Faixas 1 e 3: sobrenadante de lisado de células bacterianas; Faixa 2: arginase livre de etiqueta-His purificada (não redutora); M: padrão de peso mo- lecular de proteína; Faixa 4: arginase | humana livre de etiqueta-His (redutora).

[00102] A Figura 5 mostra o resultado de análise SDS-PAGE de arginase | mutante purificada (rhArgl-A303, rhArgl-A168/303 e rhArgl- A45/303) sob condições redutoras e não redutoras. As amostras em cada faixa são como se segue: Faixa 1: arginase | mutante, rhArhl- ASO3 (não-redutora); Faixa 2: arginase | mutante, rhArgl-A168/303 (não-redutora); Faixa 3: arginase | mutante, rhArgl-A45/303 (não- redutora); M: padrão de peso molecular de proteína; Faixa 4: arginase | mutante, rhArgl|-A303 (redutora); Faixa 5: arginase | mutante, rhArgl- A168/303 (redutora); Faixa 6: arginase | mutante, rhArgl-A45/303 (re- dutora).

[00103] A Figura 6a mostra o resultado de análise SDS-PAGE de arginase | mutante purificada (rhArgl-A45/168 e rhArgl-A45/168/303) sob condição não-redutora. As amostras em, cada faixa são como se segue: M: padrão de peso molecular de proteína; Faixa 1: arginase | mutante, rhArgl-A45/168/303; Faixa 2: arginase | mutante, rhArgl- A45/168.

[00104] A Figura 6b mostra o resultado de análise SDS-PAGE de arginase | mutante purificada (rhArgl-A45/168 e rhArgl-A45/168/303) sob condição redutora. As amostras em cada faixa são como se se- gue: M: padrão de peso molecular de proteína; Faixa 1: arginase | mu- tante, rhArgl-A45/168/303; Faixa 2: arginase | mutante, rhArgl- A45/168.

[00105] “Como revelado a partir das análises SDS-PAGE de argina-

se | sob condições redutoras e não redutoras, arginase | humana tipo selvagem tem outras conformações sob as condições experimentais estabelecidas desta invenção. Sob tal condição, quando cisteína na posição 303 sofreu mutação para alanina, outras conformações tam- bém estiveram presentes. Entretanto, quando quaisquer dois (rhArgl- A168/303, rhArgl-A45/303, ou rhArgl-A45/168) ou todos os três resí- duos cisteína em posições de aminoácidos 45, 168 e 303 sofreram mutação para alanina, somente uma conformação foi detectada sob condição não redutora (Figura 5 e Figura 6A). Não sendo limitado por quaisquer teorias conhecidas, o inventor acredita que a presença de múltiplas conformações para a arginase | humana tipo selvagem em SDS-PAGE não redutor é provavelmente devida à formação de ligação dissulfeto intramolecular que é contribuída por cisteínas 45, 168 e 303 sob certas condições. Quando somente cisteína 303 sofreu mutação para alanina, tal conformação de arginase | mutante também pode ser detectada por SDS-PAGE sob condição não redutora possivelmente devido à formação de ligações dissulfeto intramoleculares entre cisteí- nas 45 e 168 que não sofreram mutação. Quando tanto duas como todos os três resíduos cisteína em posições 45, 168 e 303 sofreram mutação (rhArgl-A168/303, rhArgl|-A45/303, rhArgl-A45/168 ou rhArgl- A45/168/303) todas as possibilidades de formação de ligação dissulfe- to foram abolidas, resultando em somente uma conformação sendo detectada na análise SDS-PAGE.

[00106] Exemplo7: Peguilação direcionada de sítio de arginase | que sofreu mutação (rhArgl) e purificação de proteína peguilada

[00107] Mutantes arginase | específicos de sítio (rhArgl-A303, rhAr- gl- A168/303 ou rhArgl-A45/303) foram misturados separadamente com metóxi polietileno glicol maleimida em uma faixa de razão molar de 1:5— 1:10 em tampão PBS 20 mM (pH 7,0), onde a dita metóxi po- lietileno glicol maleimida tem um peso molecular de 20 K, 30 K ou 40

K, respectivamente. A metóxi polietileno glicol maleimida de 40 K foi ramíificada em forma de Y, consistindo em duas cadeias polietileno gli- col. A reação de peguilação foi realizada em temperatura ambiente por 2-4 horas. No final da reação, os produtos finais foram estocados em um refrigerador a 4ºC.

[00108] Arginase | humana peguilada específica de sítio foi isolada e purificada usando coluna de troca de cátions Macro SP matriz para remover proteínas e PEGs não reagidos residuais. Tampão fosfato e tampão fosfato contendo NaCl (1M) foram usados como tampão de equilíbrio e eluição, respectivamente. Antes de carga de amostra, a- mostras de proteína peguilada foram diluídas com água destilada até a condutividade elétrica de amostra ser idêntica àquela do tampão de equilíbrio; e a coluna foi equilibrada com cinco vezes o volume de co- luna de tampão de equilíbrio. Após carga de amostra, a coluna foi ain- da lavada com cinco vezes o volume de coluna de tampão de equilí- brio e eluída com tampão de eluição 35%. O eluente contendo picos de proteína foi coletado e sais retirados usando coluna G25. Proteínas alvos foram coletadas e analisadas por SDS-PAGE como mostrado na Figura 7.

[00109] A3SO03-M20K(2): arginase | mutante de sítio direcionado (rhArgl|l-A303) foi reagida com metóxi polietileno glicol maleimida- 20kDa (mMPEG-MAL-20K). A arginase | humana peguilada direcionada para sítio foi purificada por coluna de troca de cátions Macrocap SP matriz. A porcentagem da arginase | humana peguilada conjugada com duas moléculas de MPEG-MAL de 20 kDa (referidas como A303- M20K(2)) em cisteínas 45 e 168 totaliza mais que 70% do produto de reação total.

[00110] A3SO03-M30K(2): arginase | mutante direcionada para sítio (rhArgl|-A303) foi reagida com metóxi polietileno glicol maleimida- 30kDa (mMPEG-MAL-30K). A arginase | humana peguilada direcionada para sítio foi purificada através de coluna de troca de cátions Macro- cap SP matriz. A porcentagem da arginase | humana peguilada conju- gada com duas moléculas de MPEG-MAL de 30kDa (referidas como A3S03-M30K(2)) em cisteínas 45 e 168 totaliza mais que 70% do produ- to de reação total.

[00111] A168/303-Y40K: arginase | mutante específica de sítio (rhArgl|-A168/303) foi reagida com polietileno glicol maleimida de 40K ramíificada em forma de Y (Y-MAL-40K). Arginase | humana peguilada foi purificada por coluna de troca de cátions Macrocap SP matriz. À proteína arginase | peguilada conjugada com uma cadeia PEG Y-MAL- 40K em cisteína 45 (A168/303-Y40K) totaliza mais que 85% dos pro- dutos de reação totais.

[00112] A45/303-Y40K: Arginase | mutante específica de sitio (rhArg|-A45/303) foi reagida com polietileno glicol maleimida ramifica- da em forma de Y de 40 K (Y-MAL-40 K). Arginase | humana peguila- da foi purificada através de coluna de troca de cátions Macrocap SP matriz. A proteína arginase | peguilada conjugada com uma cadeia PEG Y-MAL-40K em cisteína 168 (A45/303-Y40K) totalizada mais que 85% dos produtos finais de reação.

[00113] Usando o ensaio espectrofotométrico acoplado previamente descrito, a atividade de diferentes arginases | humanas peguiladas foi medida e determinada através de mudanças em absorbância de NADPH. Os resultados de testes mostraram que os produtos peguila- dos preservaram a atividade arginase, onde as específicas atividades de A3S03-M20K(2), AS03-M30K(2), A168/303-Y40K e A45/303-Y40K foram todas maiores que 400 U/mg, variando 400-800 U/mg. Exemplo 7: Análise fármaco-cinética in-vivo de arginase | humana pe- guilada direcionada para sítio

[00114] Perfis fármaco — cinéticos de diferentes arginases | huma- nas peguiladas foram avaliados após administração intravenosa sim-

ples para ratos Sprague Dawley em uma dosagem de 3 mg/kg. Estes estudos foram conduzidos por Pharmalegacy Laboratories Limited (Shanghai). Amostras de sangue foram coletadas pré-dose, 2 minutos, 1 hora, 4 horas, 24 horas, 72 horas, 120 horas, 168 horas e 240 horas após dosagem para análises de arginase e arginina em soro. Aproxi- madamente 0,4 mL de amostras de soro foram coletados em cada ponto de tempo a partir de veia orbital após anestesia através de iso- flurano e transferidos para um tubo de centrífuga de 2 mL. Amostras foram colocadas em temperatura ambiente por 30 minutos até centri- fugação em 4000 g por 15 minutos a 4ºC.

[00115] Concentrações de arginase | em soro foram determinadas através de um ensaio imuno de intercalada de enzima quantitativo com kits providos por Shanghai ExCell Biology, Inc. Anticorpo monoclional arginase | anti-humana foi revestido sobre a superfície das cavidades da placa de ELISA. Amostras ou padrões de proteínas de arginase | humana foram adicionados separadamente nas cavidades da placa ELISA (100 microlitros / cavidade), que foi então coberta com uma fita selante e incubada a 37ºC por 90 minutos para permitir formação de complexo imuno entre anticorpo monoclonal e arginase | humana. A- pós incubação, a placa foi lavada cinco vezes e anticorpos policlonais arginase | anti-humana Coelho (100 microlitros / cavidade) foram adi- cionados às cavidades. Ela foi coberta novamente com fita selante e ainda incubada a 37ºC por 60 minutos. Após a segunda incubação, a placa foi novamente lavada por cinco vezes, IgG anti-coelho HRP- conjugado cabra (100 microlitros / cavidade) foi adicionada a cada ca- vidade e coincubada por 30 minutos. Após outras lavagens por cinco vezes, substrato cromogênico foi adicionado nas cavidades e incubado no escuro por 10-15 minutos. Solução de interrupção foi adicionada a cada cavidade e bem misturada. A densidade ótica em 450 nm foi me- dida dentro de 10 minutos após adição de solução de interrupção. À curva padrão foi gerada usando processo de adaptação quadrática para equação de regressão e a concentração de arginase | de cada amostra foi calculada usando o valor OD medido. Os parâmetros PK foram derivados usando WinnoLin com um processo de ensaio não compartimental. Os valores de meia — vida (T12) de várias formas de arginase | humana peguilada específica para sítio, AS303-M20K(2), ASO03-M30K(2), A168-303-Y40K e A45/303-Y40K foram determinados serem 28,0 +/- 4,5, 28,4 +/- 8,4, 27,2 +/- 3,8, e 15,1 +/- 0,6 hora, res- pectivamente.

Tabela 1: Os parâmetros fármaco-cinéticos (média +/- desvio padrão; n = 6) de administração de dose única de arginase | humana peqguilada em rato Ti12 (h) Cmax AUC jast AUC nr (ug/mL) (h*ug/mL) (h*ug/mL) -A3BO3 28045 41,595 1603,5+187,5 1614,5+1886. M20K(2) A3O03- 284+84 324+31 11136+116,8 1192,9+121,2 M30K(2) A168/380 27,2+3,8 45,2+5,1 2077,5+160,6 2083,9+163,3 3-Y40K A45/303 15,1+0,6 105,2+66.9 548,1+50,3 564,5 + 50,8 -Y40K

[00116] Esta invenção usa mutagênese direcionada para sítio para modificar tanto um, como dois ou todos os três resíduos cisteína em posições 45, 168 e 303 de arginase | humana, onde a dita modificação é conduzida através de substituição do códon codificando cisteína por outros aminoácidos, particularmente alanina, para obter arginase hu- mana com maior atividade específica. Em adição, a presente invenção provê uma nova arginase humana peguilada direcionada para sítio, que não contém qualquer sequência de proteína his-tag potencialmen- te imunogênica. A dita arginase humana peguilada foi peguilada atra- vés de conjugação de polietileno glicol maleimida de 20, 30 ou 40 kDa respectivamente para resíduo cisteína 45, 168 ou 303. A arginase hu- mana peguilada produzida desta maneira tem uma reduzida taxa de filtração glomerular. Além disso, o sítio de peguilação da arginase em conjugação com PEG foi definido e o produto de peguilação é mais homogêneo e mais fácil para purificação, favorável para controle de qualidade de produção em massa. A arginase peguilada provida na presente invenção tem uma meia-vida significantemente aumentada em mamíferos, que pode ser tão longa quanto 15-28 horas em soros de ratos.

[00117] A menos que de outro modo estabelecido, a prática desta invenção envolve o uso de técnicas comuns que são empregadas em biotecnologia, química orgânica, ou química inorgânica, etc. Aparen- temente, outras descrições e realizações que não as mencionadas a- cima, existem outros meios que podem ser usados para implementar a presente invenção. Quaisquer mudanças ou modificações sob o esco- po desta invenção serão aparentes para aqueles versados na técnica. De acordo com os ensinamentos da presente invenção, muitas mu- danças e modificações são possíveis e são, portanto, classificadas sob a cobertura desta invenção. As patentes mencionadas neste artigo, seus pedidos de patente e publicações científicas são todas incorpo- radas neste artigo.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Arginase, onde a dita arginase é arginase | humana ca- racterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 1; qualquer uma ou duas, de todas as cisteínas em posições 45, 168 e 303 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é / são mutadas para aminoácido não polar.

   2. Arginase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita cisteína na posição 45, 168 ou 303 “sofre inde- pendentemente mutação para alanina, glicina, valina, leucina, isoleuci- na, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina; e preferivelmente, a dita cisteína sofre mutçaão para alanina.

   3. Arginase de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizada pelo fato de que uma de ditas cisteínas em posições 45, 168 e 303 sofre mutação, preferivelmente, a dita cisteína na posição 303 so- fre mutação; e mais preferivelmente, o dita cisteína na posição 303 sofre mutação para alanina.

   4. Arginase de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-3, caracterizada pelo fato de que quaisquer duas das ditas cis- teínas em posições 45, 168 e 303 sofrem mutação, por exemplo, as ditas cisteínas em posições 45 e 303, ou ditas cisteínas em posições 168 e 303, ou ditas cisteínas em posições 45 e 168 sofrem mutação, e mais preferivelmente, as ditas cisteínas sofrem mutação para alanina.

   5. Arginase de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1-3, caracterizada pelo fato de que as ditas três cisteínas em po- sições 45, 168 e 303 sofrem mutação; e preferivelmente, as ditas cis- teínas sofrem mutação para alanina.

   6. Arginase peguilada, caracterizada pelo fato de que a dita arginase é arginase | humana; a peguilação de dita arginase é especí- fica de sítio e qualquer uma ou duas das cisteínas nas posições 45, 168 e 303 de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é/são pe-

   guiladas.

   7. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 6, ca- racterizada pelo fato de que a peguilação específica de sítio é obtida por mutação direcionada de sítio de cisteína para outro aminoácido em qualquer uma ou duas das ditas posições de cisteínas que é/são para serem peguiladas, e seguido por peguilação específica de sítio de ar- ginase mutante no resíduo de cisteína.

   8. Arginase peguilada de acordo com a reivindicação 7, ca- racterizada pelo fato de que com a dita mutação direcionada de sítio, a dita cisteína sofre mutação para um aminoácido não-polar, preferivel- mente a dita cisteína sofre mutação para alanina, glicina, valina, leuci- na, isoleucina, metionina, fenil alanina, triptofano ou prolina; e mais preferivelmente, a dita cisteína sofre mutçaão para alanina.

   9. Arginase peguilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-8, onde o dito PEG tem um peso molecular médio de K, 30 K ou 40 K.

   10. Arginase peguilada de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-9, caracterizada pelo fato de que a dita arginase tem uma meia-vida de pelo menos 0,5 dia; preferivelmente, a dita arginase tem uma meia-vida de pelo menos 2,5 dias; e mais preferivelmente, a dita arginase tem uma meia-vida de pelo menos 3,5 dias no sangue ou soro.

   11. Processo para preparação caracterizada pelo fato de que uma arginase como definida em qualquer uma das reivindicações 1-5 ou uma arginase peguilada como definida em qualquer uma das reivindicações 6-10.

   12. Uso caracterizado pelo fato de que uma arginase como definida em qualquer uma das reivindicações 1-5 ou uma arginase pe- guilada como definida em qualquer uma das reivindicações 6-10, na preparação de um medicamento para tratamento de uma doença rela-

   cionada com arginase; preferivelmente, a dita doença é selecionada de hiperargininemia e hiperplasia ou tumor dependente de arginina, tal como câncer de fígado, melanoma, câncer de mama, câncer de pul- mão de célula pequena, câncer de próstata, linfoma ou leucemia.

   13. Composição farmacêutica para tratamento de uma doen- ça relacionada com arginase compreendendo uma arginase de qualquer uma das reivindicações 1-5 ou uma arginase peguilada de qualquer uma das reivindicações 6-10; onde a dita doença é selecionada de hiper argi- ninemia e hiperplasia ou tumor dependente de arginina, tal como câncer de fígado, melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão de célula pe- quena, câncer de próstata, linfoma ou leucemia.

   14. Processo para tratamento de uma doença relacionada com arginase, caracterizado pelo fato de que compreende administra- ção de uma arginase como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1-5 ou uma arginase peguilada como definida em qualquer uma das reivindicações 6-10; onde a dita doença é selecionada de hiperar- gininemia e hiperplasia ou tumor dependente de arginina, tal como câncer de fígado, melanoma, câncer de mama, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de próstata, linfoma ou leucemia.

   atgagegeca agtecagaac catagggatt attggagete ctttetoaaa gegacageca so CRAggaAgHHR tegaeagaage coctacagta ttgagasagg ctggtotgot tgagaaactt 120 asagaacaag agtgtgatet gaaggattat ggggacctgc cctttgotga catecetaat 180 gacagtoecct ttcasattgt gaagaatoca agetctetes gaaaagcaag cgagcagcte 240 BCtggCaage tegCagaagt caagaagaac graagaatca gcctegtect gsscARAÇaC 300 cacagtttgg casttggaag catototggo catgccages tecacootga tettggagto 360 atctegetas atectcacac tgatatcaac actecactga caaccacaag tegaaacttg 420 catggacaac ctgtatettt cotecetgaag gaactaaaag gaaagattec cgatgtgcoa 480 ggattctecot grntgactoc cigratatet gocaaggata ttgtetatat tggottgaga 540 gacgtggacc ctegegaaca ctacattttg aaaactotag gcattasata cttttcaatg 600 actgaagtgg acagactagg aattggcaag gtratrgaag aaacactcag ctatctacta 660 ERaagaaaga aaaggccaat tcatetaagt tttgatettg acggactega cecatettto 720 acaccageta ctggcacace agtegtgsga getctgacat acagagaagg tetetacate 780 acagaagasa tctacaaaac agggctacte tcaggattag atataatgga agtgaaccca 840 tccctgggga agacaccaga agaagtaact cgaacagtea acacagcagt tgcaataaco 200 ttesctigkt teggacttgo tegsgagest aatcacaage ctattgacta cettaaceca 960 ccetaagtaa 969 Fig 1 1 2 3 4

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   415KD —

   3SKD — Arginase | humana sem His-tag

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   PA 2 | À ? j | o PA / À 3 A É e, LÊ A ts: a" A - Ô 2 5 15 E 25 5 Vs " Relatório de porcentagem de área Classificação t Sinal Multiplicador & 1.0000 Diluição z 1.0000 Quantidade de amostra í 20.00000 [ng/ul] (Não usada em calibração) Multiplexador de uso ISTD e diluição Sinal 1: VWD1A, comprimento de onda =280 nm Pico Tempo deretenção Tipo Larguradepico Área de pico Altura de pico — Área de pico + Iminutos] Iminutos] E. (mau) o 1 7.076 BB 1.0143 1267.44189 — 17,.13606 95.5066 2 10.041 MMR 0.,7370 59.63036 1.34852 4,4934 Total: 1327.072256 1848458 Fig 3

   Não-redutora Redutora

   Z Z d 2 M 3 4 116KD

   66.2KD..

   A5KDesse: 35] > Arginase | Isoforma .

   — 25KDeam S — 18.4KDese — É 14.1KDemm Ê Fig 4 Não-redutora Redutora E Ec——, Dimero Arginase | Isoforma Fig5

   Não-redutora Redutora A Fm M 1 2 M 1 2 250KD ISO) 15060 TsokD Dos 100KD T8KD 75KD OND 50KD 37KD s O rinaso! 37KD OG > ovas: 25KD = 20KD 25KD 20KD Fig 6a Fig 6b 1 2 3 4 5 o —+» 250KD Lo Ned — e. 150KD 100 KD VT 75kD SS S50KD = —* 37KD - — Fig7