CN103571814A - 一种巯基修饰的重组人精氨酸酶ⅰ、其制备方法及应用 - Google Patents

一种巯基修饰的重组人精氨酸酶ⅰ、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种巯基修饰的重组人精氨酸酶Ⅰ、其制备方法与应用。精氨酸酶系采用重组技术与蛋白纯化技术获得的重组人精氨酸酶Ⅰ，所用聚乙二醇为Y型聚乙二醇马来酰亚胺，是一种包含两个甲氧基的支链型PEG衍生物，分子量40KD，其活性端基马来酰亚胺在中性及弱碱性条件下选择性地与蛋白分子的自由巯基(-SH)键连，修饰后的聚乙二醇化重组人精氨酸酶具有更强的体内药效和延长的体内半衰期，可以抑制部分人肝癌细胞与黑色素瘤细胞的生长，尤其是对精氨酸脱亚胺酶(ADI)产生抵抗的肝癌细胞。

Description

一种巯基修饰的重组人精氨酸酶Ⅰ、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及重组蛋白的化学修饰技术。 
发明背景 
精氨酸酶（Arginase）是尿素循环中的一种酶，催化精氨酸水解产生鸟氨酸和尿素，在机体氮代谢方面起重要作用。人体内精氨酸酶有两种（Ⅰ型称肝精氨酸酶，Ⅱ型称肝外精氨酸酶），Ⅰ型精氨酸酶基因的表达受底物精氨酸和辅酶Mn2+的诱导（Brock,A.A et al, Dietary manganese deficiency decreases rat hepatic arginase activity. J. Nutr. 1994,124:340-344），存在于肝外的Ⅱ型精氨酸酶有着广泛的组织分布，在不同组织和器官中发挥不同的作用，包括参与多胺代谢、NO合成等（Russel,D.H, et al, Polyamine biogenesis in the rat mammary gland during pregnancy and lactation.Bilchem. 1972,130:71-76），与Ⅰ型精氨酸酶相比，其活力较低。 
精氨酸酶通过分解精氨酸对肿瘤细胞进行营养剥夺，对正常组织影响较小，成为抗肿瘤治疗的又一选择。目前传统的放化疗方法已很难满足患者对生命质量的要求，而氨基酸剥夺的方法给癌症治疗注入新的活力。它虽然会引起生理和代谢方面的某些不平衡，但不像传统的放化疗等方式向体内引入有毒物质，使原本就不堪一击的病体雪上加霜。 
最早发现精氨酸酶有抑制肿瘤作用的是Bach和Lansitksi ，他们用提纯的牛肝精氨酸酶处理大鼠Walker256肉瘤四天，发现肿瘤生长减慢了31%一71%（Bach SJ, Lasnitzki I. Some aspects of the role of arginine and arginase in mouse carcinoma.Enzymologia. 1947,12:198-205）。精氨酸酶体外抗肿瘤活性自1960年已有报道（Bach SJ, HawkinsRA, Swaine D. A short method forthe purification of arginase from ox liver. Biochem J1963;89:263–5），Currie等报道精氨酸酶自脂多糖与酵母多糖刺激后的巨噬细胞释放，可引起中国大鼠肺细胞V79、淋巴瘤细胞L5178Y、HSN大鼠肉瘤细胞的凋亡。Storr和Burto报道用鼠和牛肝脏来源的精氨酸酶处理，当精氨酸水平降至低于8umol/L并持续24小时的情况下淋巴肉瘤细胞的生长受到抑制。Scott和Wheatley等对精氨酸耗竭的体外抗肿瘤活性进行了较为系统的研究（Scott 等,Single amino aacid(arginine)deprivation:rapid and selective death of cultured transformed and malignant cells. Br.J.Cancer 83,800-810），在测试的24种肿瘤细胞中，所有细胞株在精氨酸酶作用后5天内死亡，受试细胞株包括乳腺癌、直 肠结肠癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌等细胞。 
人肝癌(Human hepatocellular carcinoma,HCC)细胞与人黑色素瘤细胞属于精氨酸营养缺陷型细胞，其精氨基琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthetase，ASS）表达缺陷,可能与ASS基因的启动子被甲基化因而被抑制、在转录水平上下调有关（Dillon BJ et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer 2004;100:826–33）。精氨酸转亚氨酶（arginine deiminase,ADI）在治疗ASS缺陷型肿瘤方面有明确疗效，但许多非ASS缺陷型HCC细胞对ADI有抵抗(Shen LJ et al. Resistance to the anti-proliferative activity of recombinant arginine deiminase in cell culture correlates with the endogenous enzyme, argininosuccinate synthetase. Cancer Lett 2003;191:165–70)。国外文献报道重组人精氨酸酶Ⅰ（recombinant human arginase Ⅰ,rhArgⅠ）对非ASS缺陷型HCC细胞具有明确的抑制作用，所有五株HCC细胞均对rhArgⅠ敏感，但ADI对这些细胞无抑制作用,这些细胞均表达ASS，但不表达鸟氨酸转氨甲酰酶（ornithine transcarbamylase,OTC），rhArgⅠ降解精氨酸产生鸟氨酸，OTC将鸟氨酸转化为瓜氨酸，瓜氨酸再经ASS与精氨基琥珀酸裂解酶（argininosuccinate lyase，ASL）转化成精氨酸，将OTC转染HCC细胞可使该细胞对rhArg产生抵抗(Paul Ning-Man Cheng et al, Pegylated Recombinant Human Arginase (rhArg-peg5,000mw)Inhibits the In vitro and In vivo Proliferation of Human Hepatocellular Carcinoma through Arginine Depletion. Cancer Res 2007; 67: (1)309-317)(尿素循环与相关酶作用节点示意图见说明书附图1)。 
在一些细胞中尿素循环是不完全的（机制不清），代谢产物鸟氨酸不能再进入循环而产生精氨酸（Paul Ning-Man Cheng et al, Pegylated Recombinant Human Arginase (rhArg-peg5,000mw)Inhibits the In vitro and In vivo Proliferation of Human Hepatocellular Carcinoma through Arginine Depletion. Cancer Res 2007; 67: (1)309-317），因而与精氨酸转亚胺酶相比，精氨酸酶是降解血循环中精氨酸的更为有力的酶；从临床治疗效果看，将Arg开发成抗肿瘤药物的价值较ADI更大。 
重组人精氨酸酶Ⅰ已成功在大肠杆菌中获得表达（Masaki IKEMOTO et al,Expression of human liver arginase in Escherichia coli. Biochem,J.1990,(270):697-703），但其短的体内循环半衰期（短于30分钟）使得在不能进行频繁大剂量给药的情况下将其用于肿瘤患者以降低血中精氨酸水平很困难。另一种牛肝来源的精氨酸酶作为治疗人类肿瘤的候选药物一直不被看好，原因是在生理条件下其与底物精氨酸的亲和力较低，最适pH9.6，半衰期只有几分钟。自二十世纪八十年代以来，这些都被认为是牛肝精氨酸酶的严重缺陷。Savoca的研 究表明牛精氨酸酶对移植Taper肝癌的小鼠无抗肿瘤活性（Savoca KV et al, Cancer therapy with chemically modified enzymes. II. The therapeutic effectiveness of arginase, and arginase modified by the covalent attachment of polyethylene glycol, on the taper liver tumor and the L5178Y murine leukemia. Cancer Biochem Biophys1984, 7:261-268），其他一些研究者也认为牛精氨酸酶无抗肿瘤活性。 
虽然精氨酸酶的体外抑瘤作用明确，但将其用于体内试图通过精氨酸耗竭治疗癌症的多项研究并没有取得预期的效果（Storr等 Br.J.Cancer,1974,V30:50-59），这是因为机体应对氨基酸缺乏时存在体内氨基酸稳态机制（amino acid homeostatic mechanism），氨基酸匮乏时通过激活蛋白质分解途径将精氨酸释放到血液中参与循环，补充了精氨酸酶代谢造成的精氨酸耗竭。为克服机体的这种稳态机制，实现有治疗意义的精氨酸耗竭就需精氨酸降解酶的持续作用，因而要对其进行修饰改性，以达到长效作用。 
Tepic在美国专利UP 6,261,557中描述将精氨酸降解酶与蛋白质分解抑制剂胰岛素组合使用，以阻断通过降解机体肌肉来补充精氨酸这一途径，但胰岛素的应用受到患者血糖水平的限制，如果患者血糖水平不能保持在有限的正常范围内将导致危险。 
1979年Savaca等使用2,4,6-三氯-S-三嗪（氰尿酰氯）作为偶联剂，将牛肝脏来源的精氨酸酶与5KD的单甲氧基聚乙二醇共价连接（Savoca,K.V.等,1979，Biochimica et Biophysica Acta 578,47-53），将精氨酸酶在小鼠的体内半衰期由不到一小时延长至12小时，虽然聚乙二醇修饰可以在一定程度上降低蛋白质的免疫原性，牛精氨酸酶对人而言毕竟是异源蛋白；而且修饰后的分子只保留了原始酶活的65%，酶活损失较大。 
香港康达医药有限公司的PCT专利（PCT/CN2002/0006352002.9.9），采用枯草芽孢杆菌表达带6个组氨酸标签的人精氨酸酶I，以分子量5KD的mPEG-SPA作为修饰剂，修饰位点是赖氨酸或N末端的氨基，修饰后产物分子的PEG与Arg摩尔比为10-12，是一种结构混合物，体内半衰期延长至3天。这种修饰方式使Arg分子上连接数量不等的PEG分子，产物构象不均一，产品质量控制困难，制备工艺过程对批间产物的质量影响较大，工艺控制困难。 
另一种降解精氨酸的酶是精氨酸转亚胺酶（ADI)，这是一种源自支原体的酶。其长效分子是美国Phoenix Pharmacologics,Inc研制的PEG修饰物，目前已进入II期临床研究阶段（Francesco Izzo等 Pegylated Arginine Deiminase Treatment of Patients With Unresectable Hepatocellular Carcinoma: Results From Phase I/II Studies. Journal of Clinical Oncology 2004(22):10,1815-1822）。研究结果表明其对某些HCC细胞和黑色素瘤细胞具有明确的抑制作用，这些肿瘤细胞依赖外源性精氨酸来维持其生长，其精氨酸营养缺陷型的机理较复杂，根本原因是ASS基因的启动子被甲基化因而受到抑制。该药用分子的缺点在 于它是一种支原体酶，虽然进行了PEG修饰但其免疫原性仍是一个问题。在其Ⅱ期临床研究中已有报道自身抗体在前5周即可检测到，并且在以后其滴度继续上升，这将导致后续治疗的无效；其次ADI将精氨酸转变为瓜氨酸和游离氨基，在血氨水平高时会形成肝硬化和肝功能失代偿，在一些患者会出现肝性脑病。 
发明内容
本发明的目的是研制出一种优于上述几种方案的药用分子，使其具有体内高比活、延长的半衰期、低免疫原性、结构均一稳定，并且易于进行工艺与质量的控制；本发明的另一目的是提供该修饰分子在制备人类肝癌和黑色素瘤治疗药物中的应用。 
本发明的目的通过下列技术实现： 
根据现有技术，可以通过基因重组技术制备人精氨酸酶I(Masaki IKEMOTO,Masayoshi TABATA,Toshio MIYAKE,et al.Expression of human liver arginase in Escherichia coli. Biochem,J.1990,(270):697-703)；活化的聚乙二醇可以通过多种商业途径获得。 
本发明采用包含两个直链甲氧基PEG的支链型PEG衍生物作为修饰剂，控制反应条件，实现聚乙二醇分子与重组人精氨酸酶I分子上半胱氨酸巯基的单一连接，经分离纯化后获得的目标产物结构均一，制备工艺的批间可控性强，修饰前后酶活无显著差别，达到了增加药用蛋白稳定性、延长体内半衰期、降低免疫原性、增强体内药效的目的。 
本发明采用基因重组技术从人肝脏中获得人精氨酸酶I的mRNA，再将人精氨酸酶Ⅰ基因克隆到大肠杆菌表达载体，转染大肠杆菌，筛选获得高表达菌株，经发酵、纯化后获得纯度大于95%的重组人精氨酸酶I；选择包含两个直链甲氧基PEG的支链型PEG衍生物作为修饰剂，控制反应条件，对重组人精氨酸酶Ⅰ分子上的半胱氨酸巯基进行定点修饰，修饰物经凝胶排阻层析和离子交换层析后获得结构均一的目标分子，体外精氨酸降解法检测酶活，修饰后酶活下降幅度为10-20%。 
聚乙二醇修饰是20世纪70年代后期发展起来的蛋白质修饰技术。将活化的聚乙二醇与蛋白质分子偶联，通过影响蛋白质分子空间结构，使蛋白质各种性质发生改变：化学稳定性增加、抵抗蛋白酶水解的能力提高、体内药效更强、免疫原性和毒性降低、血浆清除率降低、体内半衰期延长等。 
就修饰方式而言，氨基是最为常用的被修饰基团，因为蛋白质分子表面的氨基有较高的亲核反应活性，较易实现修饰，但是蛋白质分子中存在较多的游离氨基，其修饰存在随机性和偶然性，修饰后易造成蛋白质活性的损失和终产品的不均一，给工艺与质量控制带来困难。巯基通常处于蛋白质的活性中心部位，位于蛋白质表面的自由巯基远少于氨基，因此修饰效 率较低，修饰后蛋白活性损失较大，其优点是修饰专一性显著高于氨基修饰。最常用的修饰剂是马来酰亚胺聚乙二醇（PEG Maleimide, MAL-PEG），属亲核类聚乙二醇衍生物。 
对蛋白质半胱氨酸残基的巯基（-SH）进行聚乙二醇修饰可以提高修饰的选择性（M J Roberts,et al, Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54: 459-476.），与-SH 特异反应的试剂较多，并且蛋白质中游离巯基要比赖氨酸残基中自由氨基少得多，如果蛋白质中不存在自由巯基， 可以通过基因工程手段加入，但这可能会引起错误的蛋白质折叠。 
可与巯基反应的试剂有马来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酸盐等（秦海娜、修志龙等. 化学通报, 2003, 66）。马来酰亚胺与巯基在弱碱性条件下(pH7-8)即可反应，形成的化合键较为稳定；乙烯基砜与巯基反应缓慢，如果提高反应的pH反应速度会加快，但同时乙烯基砜会与赖氨酸残基发生反应；碘乙酸盐与巯基发生亲核取代反应，反应缓慢但形成的化学键较稳定，该反应需在黑容器中进行以免反应生成的碘与其它氨基酸反应。 
马来酰亚胺末端的双键与半胱氨酸的巯基发生加成反应，形成稳定的硫醚键（Horswill, A.R., et al. (2004). Proc. Natl. Acad. Sci. USA101, 15591-15596.），Thermo Scientific的巯基结合平板即是用此原理开发的用于结合那些难于包被至聚苯乙烯平板的分子的产品；黄志锋、郑青等将haFGF的第98、132 位半胱氨酸突变为丝氨酸，仅保留第31位的半胱氨酸残基，用PEG-MAL对其进行定点修饰，较好地保留了haFGF 的生物学活性（为修饰前的55.53%），并且修饰产物的均一性好；李志华等对hIL-11的N末端进行定点突变引入一个半胱氨酸，用20KD的mPEG-MAL进行修饰，经纯化后得到均一的修饰产物，体外细胞生物学活性为原有活性的30%左右；吴宏等对溶葡球菌酶第133-154位的氨基酸进行定点突变引入半胱氨酸残基，用mPEG-MAL进行定点修饰，所得产物均一，但修饰后分子的酶活有大幅度降低，不及修饰前分子酶活的20%。 
将聚乙二醇的结构由线状改为叉状或梳状可以起得到更好的修饰效果（秦海娜、修志龙等. 化学通报, 2003, 66）：进一步降低蛋白酶与蛋白质的接触机会、空间位阻效应降低了聚乙二醇与蛋白质结合位点减少造成的失活、屏蔽效应更为显著进一步降低蛋白的抗原性和免疫原性。 
本发明选择的修饰剂为Y型聚乙二醇马来酰亚胺，是一种包含两个直链甲氧基PEG的支链型PEG衍生物，分子量40KD，其活性端基马来酰亚胺在中性及弱碱性条件下选择性地与蛋白分子的自由巯基（-SH）键连，此种活化PEG目前已有市售产品，也可按参考文献进行制备，经质量检测各指标达标即可用于修饰。 
本发明选择的反应pH条件为7-8，该pH值为马来酰亚胺末端双键与半胱氨酸的巯基发生加成反应所必需，pH值也影响反应体系中蛋白与修饰剂的投料比，如果pH值过低，需要更多的 PEG以实现更高的反应率，本发明选择的反应pH为6-9，优选7-8；通常反应体系中PEG与蛋白分子的摩尔比越低，可以连接到蛋白分子上的PEG分子数越少，本发明选择反应时Arg与PEG的摩尔比为1:1-1:10，优选1:2；被修饰分子的蛋白浓度控制在3-6mg/ml。 
本发明所用的被修饰分子为重组人精氨酸酶Ⅰ，由322个氨基酸组成，理论分子量34734.94道尔顿，理论等电点7.09，肽链中有3个半胱氨酸（45位、168位、303位，其中第45与168位形成链内二硫键，第303位为目标修饰位点），制备得到纯度大于95%的重组人精氨酸酶Ⅰ即可用于修饰反应。 
 PEG修饰后的混合物其分子量差异较明显，适宜用凝胶层析介质进行分离，选用Sephacryl S300层析作为修饰混合物分离的第一步，用对Arg酶活有利的pH9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液作为平衡与洗脱缓冲液，经此步操作可除去反应混合物中未反应的Arg，使PEG-Arg得以初步纯化，纯度可达90%左右。此步骤的另一个作用是对反应混合物中未参与反应的PEG进行有效去除。 
PEG的多修饰物与单修饰物在表面电荷效应上存在一定差异，利用这一点可以将S300层析后的样品中不能被完全分离的PEG多修饰物成分有效去除，达到对样品的精制。根据Arg在弱碱性条件下较稳定的特点，选择适用于弱碱条件的DEAE作为结合目标分子的固相介质，用pH9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液平衡后，以0.05MNaCl洗脱多修饰组分，0.2M NaCl洗脱目的分子，经此步骤样品纯度可达95%以上。 
经以上各步获得符合药学质量标准的修饰蛋白原液后，即可用于半成品的配制。就治疗用途而言，本发明的目标产物可以配制于无菌的生物相容的药用载体中使用，我们研制了注射液与冻干粉针两种剂型。 
液体剂型组成为（1ml/支）：PEG-Arg5mg，20mM磷酸盐缓冲液,0.01%吐温80,0.1M氯化钠，pH8.0。 
冻干剂型组成为（1ml/支）：PEG-Arg5mg，20mM磷酸盐缓冲液, 0.1M氯化钠，5%甘露醇，pH8.0。配液之后经冷冻干燥法制成冻干粉针，使用前加注射用水溶解后使用。 
本发明的目标产物可用于人肝癌和黑色素瘤的治疗，给药频率为每7天一次。治疗中发挥效用的PEG-Arg的用量通过临床试验确定，首先应在适用的动物模型中测定疗效并确定安全有效剂量，给药方式为肌肉内注射。 
附图说明：
图1. 修饰与修饰后分离样品SDS-PAGE电泳图 
1道-DEAE柱 0.05MNaCl洗脱组分；2道- DEAE柱 0.2MNaCl洗脱组分； 
3-6道- Sephacryl-S300洗脱组分；7道-修饰混合物 
图2.大鼠腹腔注射重组人精氨酸酶（4000 IU/只）血中精氨酸浓度-时间变化曲线； 
图3. 大鼠腹腔注射聚乙二醇化重组人精氨酸酶（1000 IU/只）血中精氨酸浓度-时间变化曲线。 
实施例
根据本发明，PEG-Arg的制备与其活性验证显示在下文中，实施例更为详尽地描述了本发明，但并不限制本发明，实施例中的Arg均为大肠杆菌表达的重组人精氨酸酶Ⅰ。 
实施例1. 重组人精氨酸酶Ⅰ的制备 
PCR扩增人Ⅰ型精氨酸酶基因（hAI），插入大肠杆菌表达载体pET30a中，构建重组表达质粒pET30a-hAI，转化大肠杆菌宿主菌BL21（DE3），构建大肠杆菌基因工程菌BL21（DE3）（pET30a-hAI），IPTG诱导后表达．SDS-PAGE分析表明，诱导后的BL21（DE3）（pET30a-hAI）在约35kD处有明显的蛋白表达。经过发酵、纯化后最终纯度为95%以上。详细步骤参照文献(Masaki IKEMOTO,Masayoshi TABATA,Toshio MIYAKE,et al.Expression of human liver arginase in Escherichia coli. Biochem,J.1990,(270):697-703) 
实施例2. 修饰位点在Arg第303位半胱氨酸巯基的PEG（40KD）-Arg的制备 
调节Arg的蛋白浓度至4.0mg/ml，调节蛋白溶液的至pH值7.5，加入相当于Arg摩尔数2倍量Y型PEG-MAL(40KD)，4℃搅拌反应12小时。反应中修饰效率用SDS-PAGE法检测，反应12小时候，SDS-PAGE结果表明80%以上的Arg被修饰，被修饰的组分中单修饰组分占50-70%，时间进一步延长，修饰率不再提高。反应终止后离心弃沉淀，上清部分直接上Sephacryl-S300柱，以50mM 甘氨酸-氢氧化钠（pH9.8）缓冲液加0.15M氯化钠作为洗脱液，经此步可将未被修饰的Arg分子去除。根据电泳纯度情况合并经Sephacryl-S300柱后的分部收集样，以50mM 甘氨酸-氢氧化钠（pH9.8）缓冲液经Sephadex G25脱盐后，再上已用相同缓冲液平衡过的DEAE Sepharose FF柱，以0.05MNaCl洗脱多修饰组分，0.2M NaCl洗脱目的分子，经此步骤样品纯度可达95%以上。 
实施例3. PEG-Arg注射液的制备 
经由实施例2获得的PEG-Arg原液用Lowry法测定蛋白浓度后，将5000mgPEG-Arg加入含有以下物质的液体中：磷酸氢二钠6.78g，磷酸二氢钠0.17g，0.1ml吐温80，氯化钠5.844g。无菌过滤后分装入2ml的西林瓶中，每支灌装量1ml。 
实施例4. 注射用PEG-Arg冻干粉针的制备 
经由实施例2获得的PEG-Arg原液用Lowry法测定蛋白浓度后，将5000mgPEG-Arg加入 含有以下物质的液体中：磷酸氢二钠6.78g，磷酸二氢钠0.17g，氯化钠5.844g，甘露醇50g。无菌过滤后分装入2ml的西林瓶中，经冷冻干燥后即得。 
实施例5. PEG-Arg对体外培养的肿瘤细胞的抑制试验 
选用小鼠肝癌细胞MH134、小鼠纤维瘤细胞Meth A、人肝癌细胞7402、7721、HepG2，人黑色素瘤细胞SK-MEL-28进行体外细胞生长抑制试验。细胞浓度为1.0×104/孔，培养基为含10%胎牛血清的RPM1640培养基，分试验组和对照组，试验组培养板分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2IU/ml的受试样品（ADI、Arg、PEG-Arg），于37℃、5%二氧化碳条件下孵育3-7天，之后每孔加入0.02mlMTS试剂，再孵育4小时，于490nm检测光吸收值，杀死50%细胞所需的样品比活单位被定义为IC50。 
实施例6. PEG-Arg对大鼠体内精氨酸的降解作用 
雌雄大鼠，平均体重250g，稳定后随机分组，腹腔注射不同剂量(500, 1,000, 2000, 4000 IU/只)的受试样品（Arg、PEG-Arg），注射前尾静脉取血作为基础值，给药后1至6天每两天取一次血样，取血时加EDTA防凝，与50%三氯醋酸混匀冰育30分钟沉淀杂蛋白，13000g离心15分钟，上清部分精氨酸水平采用高速氨基酸分析仪进行分析。（血中精氨酸浓度随时间变化曲线见说明书附图1与附图2）。 
大鼠腹腔注射(500, 1,000, 2000, 4000 IU/只)重组人精氨酸酶（Arg）后，检测血中精氨酸水平的变化，结果表明Arg只有最高剂量组（4000 IU/只）可使血中精氨酸水平在注射后5小时降至30uM以下，随后血中精氨酸水平逐渐回升，至注射2天后恢复到正常水平。 
大鼠腹腔注射(500, 1,000, 2000, 4000 IU/只)聚乙二醇化重组人精氨酸酶（PEG-Arg）后，检测血中精氨酸水平的变化，结果表明PEG-Arg较低剂量组（1000 IU/只）即可使血中精氨酸水平降至检测不到的水平并可持续7天。说明重组人精氨酸酶经过聚乙二醇修饰达到了增强体内药效、延长体内半衰期的目的。 

Claims (6)

1.一种巯基修饰的聚乙二醇化重组人精氨酸酶Ⅰ，其主要特征在于每个重组人精氨酸酶Ⅰ分子与一个聚乙二醇分子偶联，修饰位点是精氨酸酶Ⅰ分子半胱氨酸的巯基。
2.如权利要求1所述的巯基修饰的聚乙二醇化重组人精氨酸酶Ⅰ，其又一个特征是：所述聚乙二醇是支链型PEG衍生物，即包含两个直链甲氧基PEG的支链型PEG衍生物，分子量为40KD。
3.如权利要求1所述的巯基修饰的聚乙二醇化重组人精氨酸酶Ⅰ，其又一个特征是：所述重组人精氨酸酶Ⅰ是通过基因重组技术制备的人精氨酸酶Ⅰ或者具有相同活性的突变体。
4.一种制备如权利要求1所述聚乙二醇修饰的重组人精氨酸酶Ⅰ的方法，其主要步骤是：
（1）修饰反应：
在4℃、pH7-8的条件下，将重组人精氨酸酶Ⅰ与活化聚乙二醇混合，重组人精氨酸酶Ⅰ与聚乙二醇的投料比（摩尔比）为1:1-1:10，聚乙二醇的分子量为40KD，反应10-15小时。
（2）反应混合物的分离与纯化：
经凝胶排阻层析去除未修饰的重组人精氨酸酶Ⅰ分子，再经离子交换层析去除多修饰组分与未反应的PEG后即可获得巯基修饰的聚乙二醇化重组人精氨酸酶Ⅰ目标产物。
5.一种药物组合物，其特征在于该组合物以权利要求1所述的分子为主要活性物质。
6.权利要求1所述的巯基修饰的聚乙二醇化重组人精氨酸酶Ⅰ和权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗人类肝癌或黑色素瘤的药物中的应用。 
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