CN107073085A - 用于癌症治疗的对adi‑peg20抗体具有降低的交叉反应性的精氨酸脱亚氨酶 - Google Patents

用于癌症治疗的对adi‑peg20抗体具有降低的交叉反应性的精氨酸脱亚氨酶 Download PDF

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Abstract

本发明大体上涉及分离的精氨酸脱亚氨酶(ADI)蛋白，其与ADI‑PEG 20相比与抗ADI‑PEG 20抗体具有降低的交叉反应性，但其可具有类似于或优于ADI‑PEG 20的功能特征；包含所述ADI蛋白的组合物，以及治疗精氨酸依赖性疾病或相关疾病诸如癌症的相关方法。

Description

用于癌症治疗的对ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的 精氨酸脱亚氨酶
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年9月16日提交的美国申请号62/051,182的优先权，该申请以引用的方式整体并入本文中。
关于序列表的陈述
与本申请相关的序列表是以文本格式代替纸质副本提供，且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为POLA_005_01WO_SeqList_ST25.txt。该本文件为约97KB，创建于2015年9月15日，且经由EFS-Web以电子方式呈交。
背景
技术领域
本发明大体上涉及精氨酸脱亚氨酶(ADI)蛋白，包括与ADI-PEG20抗体具有降低的交叉反应性的ADI蛋白。此类ADI蛋白可用于治疗精氨酸依赖性或相关疾病诸如癌症。
相关技术的描述
氨基酸剥夺疗法可为某些形式的癌症的有效治疗方法。迄今为止，存在一个已知的与此方法有关的临床实例，其利用天冬酰胺酶来降低天冬酰胺的循环水平且抑制蛋白质合成。此治疗方法对急性淋巴母细胞性白血病尤为有效(Avramis 2005,Viera Pinheiro2004)。急性淋巴母细胞性白血病细胞需要氨基酸天冬酰胺以供生长和增殖。相比之下，大多数正常人细胞能够合成天冬酰胺且不受天冬酰胺耗尽的影响。因此，用天冬酰胺酶减少血清天冬酰胺可选择性杀死癌细胞，而不会损害正常细胞、组织和宿主。大肠杆菌(E.coli)衍生形式的天冬酰胺酶已被批准供人使用。然而，天冬酰胺酶仅发现于微生物中；此使得其在人体内具高度免疫原性且在注射之后还具有短血清半衰期(Avramis 2005)。为了使天冬酰胺酶成为更有效的药物，通过将大肠杆菌衍生的天冬酰胺酶与聚乙二醇(PEG)一起配制以降低此种酶的免疫原性和相关变态反应来将这些缺点减至最低程度。此外，PEG极大地延长了天冬酰胺酶的循环半衰期，从而使治疗频率与该疗法的总成本均降低。PEG配制的天冬酰胺酶被批准使用且以商标名(2011、Avramis 2005、VieraPinheiro 2004、Fu 2007、Zeidan 2008)出售。
精氨酸为人和小鼠的另一非必需氨基酸(关于评述参见Rogers 1994)。在人体内，精氨酸可由瓜氨酸以两个步骤经由克雷布斯(尿素)循环酶精氨基琥珀酸盐合成酶(ASS，L-瓜氨酸:L-天冬氨酸连接酶[形成AMP]，EC 6.3.4.5)和精氨基琥珀酸盐裂解酶(ASL，L-精氨基琥珀酸盐精氨酸-裂解酶，EC 4.3.2.)来合成(Haines 2011、Wu 2009、Morris 2006、Husson 2003、Tapiero 2002、Rogers 1994)。ASS催化瓜氨酸和天冬氨酸转化成精氨基琥珀酸盐，其然后通过ASL转化成精氨酸和富马酸。精氨酸缺乏型膳食在人体中不引起高氨血症、乳清酸尿，还不改变成年人体内全身一氧化氮(NO)合成的速率(Tapiero 2002、Castillo 1995、Rogers 1994、Carey 1987、Barbul 1986、Snyderman 1959、Rose 1949)。虽然早产婴儿似乎需要精氨酸(Wu 2004)，但精氨酸水平不与婴儿、儿童和年轻成年人间的年龄相关(Lücke 2007)。在1992年，Takaku和Sugimura分别报导人黑素瘤和肝细胞癌(HCC)细胞株似乎需要精氨酸以供生长。其它研究表明聚乙二醇化ADI有效治疗黑素瘤和肝细胞瘤，而几乎没有有害作用。
ADI-PEG 20治疗在一段时间内需要多个剂量。在许多次治疗之后，可产生可限制其持久有效性的抗ADI-PEG 20抗体。因此，本领域中对用于治疗中的与抗ADI-PEG20抗体具有降低的交叉反应性以改进和延伸精氨酸耗尽疗法的功效的ADI存在需要。本发明提供此优点和关于治疗癌症的其它优点。
参考文献：Avramis VI,Panosyan EH.2005.Clin Pharmacokinet 44:367-393；Barbul A.1986.J Parenteral Enteral Nutr 10:227-238；Carey GP等人1987.J Nutr117:1734-1739；Castillo L等人1995.Am J Physiol 268(Endocrinol Metab 31):E360-367；Fu CH,Sakamoto KM.2007.Expert Opin Pharmacother 8:1977-1984；Haines RJ等人2011.Int J Biochem Mol Biol 2:8-23；Husson A等人2003.Eur J Biochem 270:1887-1899；Lücke T等人2007.Clin Chem Lab Med 45:1525-1530；Morris SM Jr.2006.Am JClin Nutr 83(增):598S-512S；Rogers QR.1994.In Proceedings from a SymposiumHonoring Willard J.Visek-from Ammonia to Cancer and Gene Expression.专业出版物86-1994年4月,Agriculture Experiment Station,University of Illinois,211Mumford Hall,Urbana,IL 61801,第9-21页；Tapiero H等人2002.BiomedPharmacother 56:439-445,2002；Viera Pinheiro JP,Boos J.2004.Br J Haematol 125:117-127；Wu G等人2009.Amino Acids 37:153-168；Wu G等人2004.J Nutr Biochem 15:442-451；Zeidan A等人2008.Expert Opin Biol Ther 9:111-119)。
发明概要
某些实施方案涉及一种分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性。还包括治疗性组合物或药学组合物，其包含分离的精氨酸脱亚氨酶或其具有ADI活性的片段以及药学上可接受的载体。在某些实施方案中，组合物为无菌的和/或大体上不含热原质，诸如内毒素。在一些实施方案中，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶不来自人型支原体。在一些实施方案中，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶来自列于表1中的生物体。
在某些实施方案中，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶具有一种或多种类似于或优于ADI-PEG 20的性质。就此而言，所述一种或多种性质包括但不限于Kcat、Km、最佳pH值、稳定性、体内蛋白水解稳定性或不需要尚未存在于血液中的离子或辅因子或其任何组合。在一些实施方案中，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有至少5、10、15或20个表面残基变化。在某些实施方案中，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有约20至135个表面残基变化、约40至100个表面残基变化、约30至60个表面残基变化、约80至100个表面残基变化或约100至120个表面残基变化。
在某些实施方案中，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶来自唾液支原体(Mycoplasma salivarium)、泡沫支原体(Mycoplasmaspumans)、加拿大支原体(Mycoplasma canadense)、耳支原体(Mycoplasma auris)、猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)、泄殖腔支原体(Mycoplasma cloacale)、鹅支原体(Mycoplasma anseris)、产碱支原体(Mycoplasma alkalescens)、口腔支原体(Mycoplasmaorale)、惰性支原体(Mycoplasma iners)、火鸡支原体(Mycoplasma meleagridis)、蜂房支原体(Mycoplasma alvi)、穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、鸡支原体(Mycoplasmagallinarum)、梨支原体(Mycoplasma pirum)、灵长类支原体(Mycoplasma primatum)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、产脂支原体(Mycoplasma lipofaciens)、气管支原体(Mycoplasma felifaucium)、模仿支原体(Mycoplasma imitans)、乳白色支原体(Mycoplasma opalescens)、毛氏支原体(Mycoplasma moatsii)、象支原体(Mycoplasmaelephantis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、龟支原体(Mycoplasmatestudinis)、支原体属某种(Mycoplasma sp.)CAG:877或支原体属某种CAG:472。与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的说明性精氨酸脱亚氨酶包含SEQ ID NO:2至SEQID NO:28中所列的氨基酸序列中的任何一个或多个。
在一些实施方案中，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶已经修饰以移除至少一个聚乙二醇化位点。在与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的精氨酸脱亚氨酶的某些实施方案中，至少一个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。就此而言，在某些实施方案中，至少约5个赖氨酸残基、至少约10个赖氨酸残基或至少约20个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
在一些实施方案中，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的精氨酸脱亚氨酶是经由接头共价键结至PEG分子。就此而言，与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的精氨酸脱亚氨酶可共价键结至一个或多个PEG分子，诸如共价键结至约1至约10或约2至约8个PEG分子。PEG分子可为直链或支链PEG分子且总重均分子量可为约1,000至约40,000或总重均分子量为约10,000至约30,000。在一些实施方案中，在PEG经由接头共价键结至本文所描述的ADIr的情况下，接头可包含琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基或其任何组合。在具体实施方案中，琥珀酰基的来源为琥珀酸琥珀酰亚胺酯。
还包括编码本文所描述的分离的精氨酸脱亚氨酶的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体和包含所述载体的分离的宿主细胞。
某些实施方案涉及组合物，其包含如本文所描述与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶和生理学上可接受的载体。在某些实施方案中，组合物还包含化学治疗剂。示例性化学治疗剂包括但不限于多西他赛(docetaxel)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂(cisplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)和依维莫司(everolimus)。
还包括治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含如本文所描述与患者抗ADI-PEG20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶和生理学上可接受的载体的组合物，由此治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展。在某些实施方案中，有需要的患者已确定具有抗ADI-PEG 20抗体。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：肝细胞癌、黑素瘤(包括转移性黑素瘤)、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝细胞瘤、肉瘤、白血病、急性髓样白血病、复发性急性髓样白血病、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑部癌症、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌和胃癌。
一些实施方案包括治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含ADI-PEG 20的组合物，且在一段时间之后，向患者施用包含如本文所描述与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶和生理学上可接受的载体的组合物，由此治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展。所述时间段可例如通过检测患者中预定水平的抗ADI-PEG20抗体和/或测量或以其它方式观测患者中的ADI活性来确定，其中包含与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚氨酶的组合物是在于患者中检测到预定水平的所述抗ADI-PEG 20抗体和/或测量或观测到预定水平的ADI活性之后施用。
还包括本文所描述的分离的精氨酸脱亚氨酶蛋白，其用于制备或制造用于治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展的药剂。
附图简述
图1A-1D说明可缀合至本文所描述的ADIr酶的多种半胱氨酸反应性PEG分子。
发明详述
本发明的实施方案涉及所选ADI酶，其在一些实施方案中经由例如稳定接头的接头与PEG缀合。在一些实施方案中，ADI酶经工程改造或选择以例如相对于野生型序列或参考序列(参见例如表1)具有少量或以其它方式降低数目的表面赖氨酸残基。所选ADI酶选自来自不同生物体的大量ADI酶，此是基于其有益性质而进行。这些性质包括酶在人血液中经由精氨酸ADI转化成瓜氨酸和氨水而形成低精氨酸浓度并维持的能力。在一些实施方案中，所选ADI分子与ADI-PEG 20相比对抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性，此类抗体可能因患者先前使用ADI-PEG 20进行的治疗而产生。
在某些实施方案中，ADI酶经聚乙二醇化以提供针对肾清除和蛋白水解的保护，以及降低的免疫原性或抗原性。为增加聚乙二醇化的有效性，对酶进行修饰可工程改造至降低数目的表面赖氨酸残基并且因此限制可用PEG连接位点的数目。在一些情况下，降低赖氨酸残基的数目提供在剩余的赖氨酸连接残基处的更完全且均匀的聚乙二醇化。
在一些实施方案中，经选择以将甲氧基-PEG连接至ADI的PEG接头提供化学稳定键联。预期稳定接头将增加分子的生物活性寿命。化学上稳定的接头还将消除水解且减少附着于酶表面的去聚乙二醇化接头可能发生的免疫反应。
这些累积规格产生一个或多个分子，其从患者的血液中有效移除精氨酸且不由来自先前精氨酸耗尽疗法的抗ADI-PEG 20抗体中和或清除。分子为聚乙二醇化的，以便延迟因其自身免疫原性产生的中和以及清除。这些因素将允许其替代ADI-PEG 20或除ADI-PEG20之外(例如作为后继药物)进行使用，以延长精氨酸耗尽疗法并且因此作为抗癌治疗剂增加精氨酸耗尽治疗的有效性。
正常细胞不需要精氨酸来用于生长，因为其可由瓜氨酸通过ASS和ASL以两步法合成精氨酸。相比之下，某些癌症不表达ASS。某些癌症不表达ASL，而其它癌症可能对ASS和/或ASL具有降低的表达，或可能不表达ASS和/或ASL。因此，这些癌症对于精氨酸而言为营养缺陷型的。此代谢差异可用于发展安全且有效的疗法，以治疗这些形式的癌症。ADI催化精氨酸经由精氨酸双水解酶途径转化成瓜氨酸，且因此可用于消除精氨酸。
除非具体指出为相反的，否则本发明的实践将使用病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和该领域技术内的重组DNA技术的常规方法，下文出于说明目的描述其中的许多方法。此类技术充分解释于文献中。参见例如Current Protocols in Protein Science,Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubel等人,Short Protocols in MolecularBiology,第3版,Wiley&Sons,1995；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版,2001)；Maniatis等人Molecular Cloning:A LaboratoryManual(1982)；DNA Cloning:A Practical Approach,第I卷和第II卷(D.Glover编)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames和S.Higgins编,1985)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins编,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney编,1986)；Perbal,A Practical Guide to MolecularCloning(1984)和其它类似文献。
在重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)中可使用标准技术。酶促反应和纯化技术可根据制造商的规范或如本领域中通常所实现或如本文所描述来进行。这些和相关技术和程序通常可根据本领域中熟知的常规方法且如在本说明书通篇中所引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所描述来进行。除非提供具体定义，否则本文所描述的结合分子生物学、分析化学、合成有机化学和医学和药物化学使用的命名法以及分子生物学、分析化学、合成有机化学和医学和药物化学的实验程序和技术为本领域中熟知且常用的。在重组技术、分子生物合成、微生物学合成、化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗中可使用标准技术。
除非内容另外明确规定，否则如本说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包括多个参考物。
“约”意谓量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
如本文所用，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和非天然氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。举例来说，天然存在的氨基酸包括在蛋白质生物合成期间所用的20种(L)-氨基酸以及其它氨基酸，诸如4-羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、锁链素、异锁链素、高半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然氨基酸包括例如正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸及其类似物，其为本领域技术人员已知的。氨基酸类似物包括天然和非天然氨基酸的修饰形式。此类修饰可包括例如氨基酸上的化学基团和部分的取代或置换或通过氨基酸的衍生化进行。氨基酸模拟物包括例如展现功能类似性质(诸如参考氨基酸的电荷与电荷间隔特征)的有机结构。举例来说，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构将具有以类似分子间隔定位的正电荷部分且与天然存在的Arg氨基酸的侧链的e-氨基具有相同程度的可移动性。模拟物还包括受约束结构，从而维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳间隔和电荷相互作用。本领域技术人员已知或可确定什么结构构成功能等效氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
在本说明书通篇中，除非上下文另外要求，否则字语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式应理解为意味包括所陈述的要素或整数或要素或整数组，但不排除任何其它要素或整数或要素或整数组。
“生物相容”是指材料或化合物通常对生物功能无害并且将不产生任何程度的不可接受的毒性，包括变应原性和疾病病况。
术语“不含内毒素”和“大体上不含内毒素”大体上涉及至多含有痕量(例如临床上对受试者没有有害生理作用的量)的内毒素并且优选不可检测量的内毒素的组合物、溶剂和/或容器。内毒素为与某些细菌、典型地革兰氏阴性细菌相关的毒素，不过内毒素可发现于诸如单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的革兰氏阳性细菌中。最常见内毒素为发现于各种革兰氏阴性细菌的外部膜中的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，且其代表这些细菌引起疾病的能力中的中心病原特征。在人体内少量内毒素可引起发热、血压降低和炎症和凝结活化以及其它有害生理作用。
因此，在药物制备中，往往需要从药物产品和/或药物容器中移除大多数或所有痕量的内毒素，因为甚至少量即可在人体内引起有害作用。去热原烘箱可用于此目的，因为典型地需要超过300℃的温度来分解大多数内毒素。举例来说，基于诸如注射器或小瓶的主要包装材料，250℃的玻璃化温度与30分钟的保留时间的组合往往足以达成内毒素水平的3log降低。涵盖其它移除内毒素的方法，包括例如如本文所描述且本领域中已知的色谱法和过滤方法。还包括在诸如哺乳动物细胞的真核细胞中产生多肽且将其从真核细胞中分离以降低(如果不消除)内毒素存在于本发明组合物中的风险的方法。包括在不含血清细胞中产生多肽且将其从不含血清细胞中分离的方法。
内毒素可使用本领域中已知的常规技术来检测。举例来说，使用来自马蹄蟹的血液的鲎变形细胞溶解产物测定为一种用于检测内毒素存在的高度敏感的测定。在此测试中，非常低的LPS水平可引起鲎溶解产物的可检测凝结，其归因于增强此反应的强大酶促级联。内毒素还可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量。要大体上不含内毒素，内毒素水平可小于约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/ml。典型地，1ng脂多糖(LPS)对应于约1-10EU。
多肽的“半衰期”可指多肽的药理学、生理或其它活性相对于在向生物体的血清或组织中施用时或相对于任何其它规定时间点的此类活性损失一半所耗费的时间。“半衰期”还可指多肽的量或浓度相对于在向生物体的血清或组织中施用时或相对于任何其它规定时间点的此类量或浓度降低向生物体的血清或组织中施用的起始量的一半所耗费的时间。半衰期可在血清和/或任何一种或多种所选组织中测量。
“同源性”是指相同或构成保守取代的氨基酸的数目百分比。同源性可使用诸如GAP序列比较程序来确定(Deveraux等人,Nucleic Acids Research.12,387-395,1984)，其以引用的方式并入本文中。以此方式，类似或大体上长度不同于本文所列举的那些的序列可通过将空位插入比对中来比较，此类空位是例如通过GAP所用的比较算法来确定。
术语“调节”和“改变”包括典型地呈相对于对照的统计显著或生理学显著量或程度的“增加”、“提高”或“刺激”以及“降低”或“减少”。“增加”、“刺激”或“提高”的量典型地为“统计显著”量，且可包括由没有组合物(例如不存在试剂)或对照组合物所产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)的增加(包括其间的所有整数和范围，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。“降低”或“减少”的量典型地为“统计显著”量，且可包括由没有组合物(例如不存在试剂)或对照组合物产生的量中的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％降低(包括其间的所有整数和范围)。本文描述了比较值和“统计显著”量的实例。
“患者”或“受试者”是指动物，在某些实施方案中指哺乳动物，且在具体实施方案中指人。
在某些实施方案中，可具体规定组合物中任何给定试剂(例如ADIr、ADIr-PEG)的“纯度”。举例来说，某些组合物所包含的试剂如例如且决不限于通过高效液相色谱法(HPLC)(生物化学和分析化学中经常用于分离、识别和定量化合物的管柱色谱法的熟知形式)所测量可为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯，包括其间的所有小数和范围。
术语“参考序列”通常涉及编码序列的核酸或正在与另一序列比较的氨基酸序列。本文所描述的所有多肽和多核苷酸序列被包括作为参考序列，包括通过名称描述的那些和表格和序列表中描述的那些。
术语“序列同一性”或例如包含“与……50％相同的序列”是指在比较窗口上在核苷酸与核苷酸基础上或氨基酸与氨基酸基础上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来计算，从而确定在两个序列中均存在的相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目(即窗口尺寸)，且将结果乘以100，从而产生序列同一性百分比。
用于描述两种或两种以上多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“大体同一性”。“参考序列”的长度可为至少12个但经常为15至18个且往往至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。由于两种多肽可各包含(1)两种多肽之间类似的序列(即仅完全多肽序列的一部分)和(2)两种多肽之间有分歧的序列，故两种(或更多种)多肽之间的序列比较是典型地通过在“比较窗口”上比较两种多肽的序列以识别且比较具有序列相似性的局部区域来进行。“比较窗口”是指具有至少6个、通常约50至约100个、更通常约100至约150个连续位置的概念片段，其中在一序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳比对之后将两个序列相比较。对于两个序列的最佳比对，比较窗口可与参考序列(其不包含添加或缺失)相比包含约20％或更少的添加或缺失(即空位)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可通过算法的电脑化实现方式(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检查并且通过所选的各种方法中的任一种产生的最佳比对(即在比较窗口上产生最高百分比同源性)来进行。还可参考如例如由Altschul等人所公开的BLAST家族的程序(Nucl.AcidsRes.25:3389,1997)。序列分析的细节讨论可见于Ausubel等人的单元19.3(“CurrentProtocols in Molecular Biology”,John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章)。
序列之间的序列相似性或序列同一性(这些术语在本文中可互换使用)的计算可如下进行。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，可出于最佳比较目的比对序列(例如为获得最佳比对可在第一与第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位且出于比较目的可将非同源序列忽略)。在某些实施方案中，参考序列中出于比较目的而比对的长度为参考序列的长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、60％且甚至更优选至少70％、80％、90％或100％。然后，比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则在该位置处分子为相同的。
两个序列之间的同一性百分比随序列所共有的相同位置的数目而变化，将为进行两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目以及各空位的长度考虑在内。
序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可使用数学算法来实现。在一些实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比是使用Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48:444-453,1970)来确定，其已并入GCG软件包中的GAP程序，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4且长度权重为1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比是使用GCG软件包中的GAP程序来确定，其NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。另一示例性参数组(和除非另作说明，否则应使用者)包括Blossum 62打分矩阵，其中空位罚分为12、空位扩展罚分为4且移码空位罚分为5。两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比还可使用E.Meyers和W.Miller(Cabios.4:11-17,1989)的算法来确定，其已并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，间位长度罚分为12且空位罚分为4。
术语“溶解度”是指本文所提供的ADIr酶溶解于液体溶剂中且形成均匀溶液的性质。溶解度典型地通过每单位体积溶剂的溶质质量(每公斤溶剂的溶质克数、g/dL(100mL)、mg/ml等)、摩尔浓度、重量摩尔浓度、摩尔分数或对浓度的其它类似描述以浓度表示。单位量的溶剂可溶解的溶质的最大平衡量为在指定条件(包括温度、压力、pH值和溶剂性质)下所述溶质在所述溶剂中的溶解度。在某些实施方案中，溶解度是在生理pH值或其它pH值下、例如在pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 7.2、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8或pH 8.0下测量。在某些实施方案中，溶解度是在水或生理缓冲液(诸如PBS或NaCl)(在存在或不存在NaP的情况下)或本文所描述的其它缓冲液/组合物中测量。在具体实施方案中，溶解度是在相对较低pH值(例如pH 6.0)和相对较高盐(例如500mM NaCl和10mM NaP)下测量。在某些实施方案中，溶解度是在诸如血液或血清的生物流体(溶剂)中测量。在某些实施方案中，温度可为约室温(例如约20、21、22、23、24、25℃)或约体温(37℃)。在某些实施方案中，ADIr酶的溶解度在室温下或在37℃下为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30mg/ml。
“大体上”或“基本上”意谓几乎全部或完全，例如某一给定量的95％、96％、97％、98％、99％或更大。
“统计显著”意谓结果不可能偶然出现。统计显著性可通过本领域中已知的任何方法来确定。显著性的常用度量包括p值，如果无效假设为真的，则其为所观测的事件会发生的频率或概率。如果所获得的p值小于显著性水平，则排除无效假设。在简单情况下，显著性水平经定义是在0.05或更小的p值下。
除非另外明确陈述，否则本说明书中的各实施方案加以必要的变更即适用于每个其它实施方案。
在本公开通篇中，可使用以下缩写：PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脱亚氨酶；SS，琥珀酸琥珀酰亚胺酯；SSA，琥珀酰亚胺基琥珀酰亚胺；SPA，丙酸琥珀酰亚胺酯；NHS，N-羟基-琥珀酰亚胺；ASS1或ASS，精氨基琥珀酸盐合成酶；ASL，精氨基琥珀酸盐裂解酶。
编码ADI酶的多核苷酸可衍生、克隆、分离、合成或产生自任何来源，包括例如微生物、重组生物技术或其任何组合。举例来说，精氨酸脱亚氨酶可克隆自支原体属微生物。在某些实施方案中，精氨酸脱亚氨酶是克隆自唾液支原体、泡沫支原体、加拿大支原体、耳支原体、猪滑液支原体、泄殖腔支原体、鹅支原体、产碱支原体、口腔支原体、惰性支原体、火鸡支原体、蜂房支原体、穿透支原体、鸡支原体、梨支原体、灵长类支原体、发酵支原体、产脂支原体、气管支原体、模仿支原体、乳白色支原体、毛氏支原体、象支原体、肺炎支原体、龟支原体、支原体属某种CAG:877或支原体属某种CAG:472或其任何组合。在一些实施方案中，精氨酸脱亚氨酶克隆自列于表1中的物种。在特定实施方案中，ADI包含SEQ ID NO:2至SEQ IDNO:28中任一者的氨基酸序列或其具有ADI活性(例如能够将精氨酸代谢成瓜氨酸和氨水)的变体或片段或延伸。此类ADI酶可使用已知技术制备或合成。
在某些实施方案中，如本文所描述的ADI酶是与衍生自人型支原体的基准ADI-PEG20分子相比较。如本文所用，“ADI-PEG 20”是指本领域中已知的ADI分子且描述于例如美国专利第6,183,738号和第6,635,462号中；另参见Ascierto等人,2005.Pegylated argininedeiminase treatment of patients with metastatic melanoma:results from phase Iand II studies.J Clin Oncol 23(30):7660-7668；Izzo F等人(2004)Pegylatedarginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellularcarcinoma:results from phase I/II studies.J Clin Oncol 22(10):1815-1822；Holtsberg FW等人(2002),Poly(ethylene glycol)(PEG)conjugated argininedeiminase:effects of PEG formulations on its pharmacological properties.JControl Release80(1-3):259-271；Kelly等人,(2012)British Journal of Cancer 106,324-332。如熟练技术人员将认可，此分子为衍生自人型支原体的聚乙二醇化(PEG 20,000)ADI酶，且相对于野生型人型支原体ADI酶具有两个取代(K112E；P210S)。
如本文所描述的精氨酸脱亚氨酶筛选自大量ADI酶且被认为与患者的抗ADI-PEG20抗体具有降低水平的反应性且/或具有其它有益性质。抗ADI-PEG 20抗体可出现在用ADI-PEG 20治疗的受试者中且可使用已知方法测量。与抗ADI-PEG 20抗体的反应性可例如使用ELISA或熟练技术人员已知的其它类似测定来确定。
就此而言，ADI-PEG 20可用作比较来评估与患者抗ADI-PEG 20抗体的交叉反应性水平。与ADI-PEG 20与患者抗ADI-PEG 20抗体的交叉反应性水平相比统计显著更低的交叉反应性水平可适用本文中。在某些实施方案中，如本文所描述的精氨酸脱亚氨酶与抗ADI-PEG 20抗体具有低交叉反应性或没有交叉反应性。在某些实施方案中，同与ADI-PEG 20的反应性相比与抗ADI-PEG 20抗体的反应性的任何降低均可为有益的，因此ADI酶将改进用于需要精氨酸耗尽疗法的患者的处理选择。因此，在一些实施方案中，如本文所描述的精氨酸脱亚氨酶与患者抗ADI-PEG 20抗体具有与ADI-PEG 20与此类抗体的反应性相比降低的交叉反应性。
“ADIr”在本文中用于指本发明的与抗ADI-PEG 20抗体具有与ADI-PEG 20与此类抗体的反应性相比降低的交叉反应性的ADI酶。“ADIr”名称用于将本文所识别的分子与如本领域中已知的ADI和ADI-PEG 20区分开。ADIr酶的实例包括SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:28及其氨基酸序列不同于SEQ ID NO:1或ADI-PEG 20的变体。
在一些实施方案中，本发明的ADIr酶具有类似于或优于ADI-PEG 20的特性或性质，以降低并维持低血液精氨酸水平以有效治疗癌症。此类性质的实例包括Kcat、Km、最佳pH值、稳定性、体内蛋白水解稳定性和缺乏对尚未存在于血液中的离子或辅因子的需要或其任何组合。在某些实施方案中，如本文所描述的ADIr的性质与ADI-PEG 20的类似性质相比为约或至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一些实施方案中，本文所描述的ADIr的性质与所比较的ADI-PEG 20的具体性质相比为约或至少约100％、105％、110％、120％、140％、150％、160％、180％、200％、220％、240％、250％、260％、280％、300％、320％、340、350％、360％、400％、420％、450％、460％、500％、520％、550％或更高。
因此，在某些实施方案中，ADIr的Kcat为ADI-PEG 20的Kcat的约或至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更佳。在某些实施方案中，ADIr的Kcat为ADI-PEG 20 Kcat的约或至少约100％、105％、110％、120％、125％、140％、150％、160％、180％、200％、220％、240％、250％、260％、280％、300％、320％、340％、350％、360％、400％、420％、450％、460％、500％、520％、550％或更高倍。在某些实施方案中，本文所描述的ADIr酶或包含其的组合物的Kcat为约0.5秒-1至约15秒-1、约1秒-1至约12秒-1、约1秒-1至约10秒-1、约1.5秒-1至约9秒-1、约2秒-1至约8秒-1或约2.5秒-1至约7秒-1。在某些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG的Kcat为约2.5秒-1至约7.5秒-1。在一些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG的Kcat为约2.5秒-1、约3秒-1、约3.5秒-1、约4秒-1、约4.5秒-1、约5秒-1、约5.5秒-1、约6秒-1、约6.5秒-1、约7秒-1、约7.2秒-1、约7.5秒-1、约8秒-1、约10秒-1、约15秒-1、约20秒-1、约25秒-1、约30秒-1、约35秒-1、约40秒-1、约45秒-1、约50秒-1、约55秒-1、约60秒-1、约65秒-1、约70秒-1、约75秒-1、约80秒-1、约85秒-1、约90秒-1、约95秒-1或约100秒-1。
在某些实施方案中，ADIr的Km为ADI-PEG 20的Km的约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更佳。在某些实施方案中，ADIr的Km为ADI-PEG 20的Km的约或至少约100％、105％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、180％、200％、220％、240％或250％。在特定实施方案中，ADIr或其聚乙二醇化配制物的Km为约0.5μM至约50μM或约1.6μM至约48μM或约0.5μM至约15μM、约1μM至约12μM、约1μM至约10μM、约1.5μM至约9μM、约1.5μM至约8μM或约1.5μM至约7μM。在某些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG的Km为约1.5μM至约6.5μM。在一些实施方案中，ADIr或其聚乙二醇化配制物的Km为约1.5μM、约1.6μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约12μM、约14μM、约15μM、约16μM、约18μM、约20μM、约22μM、约24μM、约25μM、约26μM、约28μM、约30μM、约32μM、约34μM、约35μM、约36μM、约38μM、约40μM、约42μM、约44μM、约45μM、约46μM、约48μM或约50μM。
在某些实施方案中，ADIr官能团处于接近于人血液的生理pH值的pH值下。因此，在一些实施方案中，ADIr官能团处于约4至约10.8或约6至约8或约6.5至约7.5的pH值下。在某些实施方案中，ADIr在约pH 7.4下具有良好酶活性。
在某些实施方案中，ADIr在长期储存期间具有稳定性，且在人体中处理期间具有温度和蛋白水解稳定性。在一些实施方案中，ADIr不需要尚未存在于血液中的离子或辅因子来获得活性。
在某些实施方案中，本文所描述的ADIr通常具有十分不同于人型支原体的氨基酸序列，使得存在表面残基变化，其将减少或消除抗ADI-PEG 20抗体的抗原位点。在一些实施方案中，在所选ADIr分子与受试者中的现有抗ADI-PEG 20抗体之间将不存在交叉反应性(例如没有统计显著性交叉反应性)，且在受试者中将产生全新的免疫反应而不是现有对人型支原体ADI的反应的成熟。因此，在一些实施方案中，如本文所描述的ADIr与如SEQ IDNO:1中所列的人型支原体ADI具有20％-85％序列同一性。在某些实施方案中，如本文所描述的ADIr与人型支原体ADI具有甚至更低的序列同一性百分比，诸如10％或15％同一性。在某些实施方案中，如本文所描述的ADIr与人型支原体ADI具有20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％或甚至83％同一性，且仍对抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性。
在某些实施方案中，如本文所描述的ADIr与人型支原体ADI相比具有约10-140、15-140或25-140个表面残基变化。表面残基可由人型支原体ADI的晶体结构识别，且其它生物体的ADI的表面残基可通过序列同源性来确定。如本文所描述的ADIr与人型支原体ADI(参见SEQ ID NO:1)相比可具有约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或约140个表面残基变化。
在一些实施方案中，如本文所描述的ADIr与人型支原体ADI相比具有约10-140、15-140或25-140个表面残基变化。此类残基变化不仅需要表面氨基酸残基。此类残基变化(或添加或缺失)可在分子的任一末端或可在ADI的任何残基处，使得经修饰ADI具有如本文所描述的所需ADI活性。要改变的残基可由人型支原体ADI的晶体结构识别，且其它生物体的ADI的残基可通过序列同源性来确定。如本文所描述的ADIr与人型支原体ADI(参见SEQID NO:1)相比可具有约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或约140个氨基酸残基变化。
从大量ADI酶中，表1列举了27种ADIr酶及其相对于人型支原体ADI的序列同一性百分比。
在某些实施方案中，本文从许多所选物种中识别的ADIr酶具有规定数目的表面赖氨酸残基(在某些实施方案中，例如多至30个或更多)。本文识别的与抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的ADIr酶中的某些具有约、至少约或不超过约0、1、2、3、4、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个表面赖氨酸残基，包括其间的所有范围。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用且意谓不限于任何特定长度的氨基酸聚合物。术语“酶”包括多肽或蛋白质催化剂，且关于ADIr可与蛋白质、多肽或肽互换使用。术语包括修饰，诸如豆蔻酰化、硫酸盐化、糖基化、磷酰化和信号序列的添加或缺失。术语“多肽”或“蛋白”意谓氨基酸的一个或多个链，其中各链包含通过肽键共价键联的氨基酸，且其中所述多肽或蛋白质可包含多个通过肽键非共价和/或共价键联在一起的链，其具有天然蛋白质(即由天然存在和具体来说非重组细胞或基因工程改造或重组细胞产生的蛋白质)的序列，且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体来说涵盖本文所描述的ADIr酶/蛋白质，或具有ADIr蛋白质的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。在某些实施方案中，多肽为由重组细胞产生的“重组”多肽，所述重组细胞包含一个或多个重组DNA分子，其典型地由以其它方式将不存在于细胞中的异源多核苷酸序列或多核苷酸序列的组合构成。
本文提及的术语“分离蛋白”意谓目标蛋白质(1)不含将典型地与其一起发现于自然界中的至少另外一些蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源(例如来自相同物种)的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与至少约50％的在自然界中与其缔合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其它材料分离，(5)不与在自然界中与“分离蛋白”缔合的蛋白质的部分缔合(通过共价或非共价相互作用)，(6)可操作地与在自然界中不与其缔合的多肽缔合(通过共价或非共价相互作用)，或(7)不存在于自然界中。此类分离蛋白可由基因组DNA、cDNA、mRNA或可能具有合成来源的其它RNA或其任何组合编码。在某些实施方案中，分离蛋白大体上摆脱了在其自然环境中发现的会妨碍其用途(治疗、诊断、预防、研究或其它)的蛋白质或多肽或其它污染物。
术语“变体”包括因一个或多个取代、缺失、添加和/或插入而不同于本文具体公开的参考多肽(例如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:28)的多肽。变体多肽为生物活性的，即其持续具有参考多肽的酶促或结合活性。此类变体可由例如遗传多态性产生和/或来自人操纵。
在许多情况下，生物活性变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”为氨基酸取代具有类似性质的另一氨基酸，使得肽化学领域技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质大体上不变的取代。如上文所描述，可在本文所描述的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰且仍获得编码具有所需特性的变体或衍生多肽的功能分子。
举例来说，某些氨基酸可取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而没有明显损失与诸如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点的结构的相互作用结合能力。由于是蛋白质的相互作用能力和性质限定了蛋白质的生物功能活性，故可在蛋白质序列和当然其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，且仍然获得具有相似性质的蛋白质。因此，预期可在所公开组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中进行各种变化，而不明显损失其功效。
在进行此类变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物功能中的重要性为本领域中普遍了解的(Kyte和Doolittle,1982，其以引用的方式并入本文中)。公认氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，二级结构又限定了蛋白质与其它分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原及其类似物)的相互作用。已基于各氨基酸的疏水性和电荷特征为其分配亲水性指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域中已知某些氨基酸可由具有类似亲水性指数或分数的其它氨基酸取代且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效蛋白质。在进行此类变化时，亲水性指数在±2以内的氨基酸取代为优选的，±1以内的那些为尤其优选的，且±0.5以内的那些为甚至尤其更优选的。
本领域中还了解可基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(具体地以引用的方式整体并入本文中)陈述蛋白质的最大局部平均亲水性如由其相邻氨基酸的亲水性所控制与蛋白质的生物学性质相互关联。如美国专利4,554,101中所详述，已为氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应了解氨基酸可取代具有类似亲水性值的另一者且仍获得生物学等效物，且特定来说，免疫等效蛋白质。在此类变化中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代为优选的，±1以内的那些为尤其优选的，且±0.5以内的那些为甚至尤其更优选的。
如以上所概述，因此，氨基酸取代通常是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小及其类似物。将各种前述特征考虑在内的示例性取代为本领域技术人员熟知的，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
氨基酸取代可进一步基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。举例来说，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；且具有不带电荷的极性头部基团且具有类似亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；和丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可呈现保守变化的其它氨基酸群组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。
或者，变体还可含有非保守变化。在一个优选实施方案中，变体多肽因取代、缺失或添加少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2个氨基酸或甚至1个氨基酸而不同于天然序列。变体还可(或者)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构、酶活性和/或亲水性具有最小影响的氨基酸的缺失或添加来修饰。
一般来说，变体将展示与参考多肽序列(例如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:28)的约或至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性或序列同一性或序列同源性。此外，涵盖因添加(例如C端添加、N端添加、两者)、缺失、截断、插入或取代约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸而不同于天然或母体序列但保留母体或参考多肽序列的性质或活性的序列。
在一些实施方案中，变体多肽有至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基不同于参考序列。在一些实施方案中，变体多肽有约或至少0.5％或1％但小于20％、15％、10％或5％的残基不同于参考序列。(如果此比较需要比对，则应比对序列以获得最大相似性。因缺失或插入或失配而被“圈”出的序列视为差异)。
在一些实施方案中，ADIr的长度将为约300至约500个氨基酸，包括其间的所有整数和范围。在具体实施方案中，ADIr的长度将为约300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495或500个氨基酸，包括其间的所有整数和范围。
术语“多肽片段”是指天然存在或重组产生的多肽中具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失或取代的多肽。在某些实施方案中，多肽片段可包含至少5至约400个氨基酸长的氨基酸链。应了解，在某些实施方案中，片段为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350或400个氨基酸长。尤其适用的多肽片段包括功能结构域，包括本文所描述的ADIr的催化性ADI结构域。在ADIr的情况下，适用片段包括但不限于催化结构域和α-螺旋结构域。
许多用于缀合至ADI的活化PEG共价键结至赖氨酸残基。通常存在与赖氨酸残基相比少很多的PEG分子附着于ADI。自分子至分子连接的数目与分布均可为不均匀的。任何特定赖氨酸残基将在仅一小部分ADI分子中经修饰。此位点修饰不均匀性和低PEG占有率可产生药物表征与在抗原位点处PEG遮挡的有效性的问题。因此，在某些实施方案中，如本文所描述的所选ADIr酶通过用其它残基类型进行赖氨酸置换来修饰以减少赖氨酸残基的数目。此产生更均匀聚乙二醇化蛋白质且增加剩余赖氨酸残基处的PEG占有率。选择变成其它残基的具体赖氨酸残基将经选择以保留酶活性。此更均匀聚乙二醇化预期提供增加的针对血液中的蛋白水解的保护和增加的对抗原位点与患者抗体的隔离。
在某些实施方案中，ADIr酶如美国专利第6,635,462号中所描述进行修饰。特定来说，ADIr的天然存在的氨基酸残基中的一个或多个的修饰可提供一种酶，其更容易复性和配制，由此改进ADIr和包含其的治疗性组合物的制造。在一些实施方案中，ADIr酶经修饰以移除一个或多个赖氨酸残基(例如赖氨酸可经另一氨基酸或其类似物或非天然氨基酸取代)。特定来说，在一些实施方案中，ADIr酶经修饰在等效于SEQ ID NO:1(人型支原体ADI)的112、374、405或408的位置或这些位置中的一个或多个的组合处不含赖氨酸。在一些实施方案中，ADIr酶经修饰不含一个或多个赖氨酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或更多个赖氨酸残基(如果其存在)可经另一氨基酸或其类似物或非天然氨基酸取代。在具体实施方案中，ADIr酶例如在等效于SEQ ID NO:1的位置7、88、137、209和380的位置处具有5个经取代赖氨酸残基。在一些实施方案中，ADIr酶例如在等效于SEQ ID NO:1的位置7、9、59、88、115、116、137、178、209和380的位置处具有10个经取代赖氨酸残基。在某些实施方案中，ADIr酶例如在等效于SEQ ID NO:1的位置7、9、59、66、88、91、93、115、116、137、141、178、209、279和位置380的位置处具有15个经取代赖氨酸残基。在一些实施方案中，ADIr酶例如在等效于SEQ ID NO:1的位置7、9、56、59、66、88、91、93、96、115、116、137、141、178、209、254、279、325、326、380和406的位置处具有21个经取代赖氨酸残基。
在一些情况下，天然ADIr可发现于微生物中且因此具免疫原性且在患者中从循环中快速清除。这些问题可通过修饰ADIr以产生“经修饰ADIr”酶来克服。因此，某些实施方案包括包含“修饰剂”的ADIr酶，所述修饰剂的实例包括但不限于大分子聚合物、蛋白质、肽、多糖和其它化合物。ADIr酶和修饰剂可通过共价键或非共价相互作用键联以形成稳定缀合物或稳定组合物从而达成所要效应。在某些实施方案中，经修饰ADIr保留相应未修饰ADIr(例如具有相同或类似序列)的生物活性且具有与相应未修饰ADIr相比较长体内半衰期和较低抗原性。在某些实施方案中，经修饰ADIr保留相应未修饰ADIr的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的生物活性。一般来说，经修饰ADIr保留足够用于治疗用途的生物活性。
在一些实施方案中，修饰剂可为生物相容的聚合物或蛋白质或其片段且可增加ADIr在血液中的半衰期。修饰剂可化学偶合至ADIr或可适用时经由融合蛋白表达键联至ADIr。
大分子聚合物可包括非肽大分子聚合物，其在某些实施方案中可具有其自己的生物活性。适合的聚合物包括但不限于聚烯醇化合物、聚醚化合物、聚乙烯吡咯啶酮、聚氨基酸、二乙烯基醚和顺丁烯二酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、多糖、聚氧乙基化多元醇、肝素或其片段、聚烷基-乙二醇及其衍生物、聚烷基-乙二醇及其衍生物的共聚物、聚(乙烯基乙醚)、a,P-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺]、聚羧酸酯、聚氧化乙烯-甲醛、聚丙烯酰基吗啉、氨基化合物和氧化烯烃的共聚物、聚透明质酸、聚环氧乙烷、乙二酸和丙二酸的共聚物、聚(1,3-二氧杂环戊烷)、乙烯和顺丁烯二酰肼共聚物、聚唾液酸、环糊精等。在某些实施方案中，聚合物为聚乙二醇。
如本文所用的聚烯醇化合物包括但不限于聚乙二醇(包括单甲氧基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚烯丙醇、聚丁烯醇及其类似物，以及其衍生物，诸如脂质。
聚醚化合物包括但不限于聚烷二醇(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)2O)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)。
聚氨基酸包括但不限于一种类型的氨基酸的聚合物或两种或两种以上类型的氨基酸的共聚物，例如聚丙氨酸或聚赖氨酸或其嵌段共聚物。
多糖包括但不限于葡聚糖及其衍生物，例如硫酸右旋糖酐；纤维素及其衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)；淀粉及其衍生物；聚蔗糖等。
在具体实施方案中，ADIr通过与蛋白质或肽偶合来进行修饰，其中一种或多种蛋白质或肽直接或间接键联至ADIr。蛋白质可为天然存在的蛋白质或其片段，包括但不限于天然存在的人血清蛋白或其片段，诸如甲状腺素结合蛋白、甲状腺素转运蛋白、a1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白、Ig Fc区、白蛋白及其片段。“片段”意谓蛋白质中小于全蛋白但保留所需蛋白质功能的任何部分。如本文所描述的ADIr可经由共价键直接或间接键联至蛋白。直接键联意谓ADIr的一个氨基酸经由肽键或二硫键直接键联至修饰蛋白的一个氨基酸。间接键联是指ADIr与修饰蛋白之间经由在其之间起初存在的化学基团或通过生物或化学手段添加的具体化学基团或以上所提及的键联的组合而键联。
在特定实施方案中，ADIr通过共价连接至一个或多个PEG分子来进行修饰。经PEG共价修饰(在存在或不存在接头的情况下)的ADIr在下文中可称为“ADIr-PEG”。当与未修饰ADIr相比时，ADIr-PEG保留大多数其酶活性，免疫原性或抗原性低得多，具有大大延长的循环半衰期，且在肿瘤治疗中更有效。
“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷与水的呈支链或直链形式的冷凝聚合物的混合物，其由通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少为4。“聚乙二醇”或“PEG”与数字后缀组合使用以指示其近似重均分子量。举例来说，PEG5,000指总重均分子量为约5,000的PEG；PEG12,000指总重均分子量为约12,000的PEG；且PEG20,000指总重均分子量为约20,000的PEG。
在一些实施方案中，PEG的总重均分子量为约1,000至约50,000；约3,000至约40,000；约5,000至约30,000；约8,000至约30,000；约11,000至约30,000；约12,000至约28,000；约16,000至约24,000；约18,000至约22,000；或约19,000至约21,000。在一些实施方案中，PEG的总重均分子量为约1,000至约50,000；约3,000至约30,000；约3,000至约20,000；约4,000至约12,000；约4,000至约10,000；约4,000至约8,000；约4,000至约6,000；或约5,000。在具体实施方案中，PEG的总重均分子量为约20,000。一般来说，分子量为30,000或更大的PEG难以溶解，且配制产物的产量可降低。PEG可为支链或直链。一般来说，PEG的分子量增加使ADIr的免疫原性降低。PEG可为支链或直链，且在某些实施方案中为直链。具有本文所描述的分子量的PEG可与ADIr和任选存在的生物相容接头结合使用，以治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)或癌症，包括例如肝细胞癌、急性髓样白血病(诸如复发性急性髓样白血病)、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑部癌症、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、胃癌或食道癌，以及本文所描述的其它癌症。
某些实施方案使用硫醇、硫氢基或半胱氨酸反应性PEG。在一些实施方案中，硫醇、硫氢基或半胱氨酸反应性PEG连接至一个或多个天然存在的半胱氨酸残基、一个或多个所引入的半胱氨酸残基(例如用半胱氨酸残基取代一个或多个野生型残基、插入一个或多个半胱氨酸残基))或其任何组合(参见例如Doherty等人,Bioconjug Chem.16:1291-98,2005)。在某些实施方案中，野生型ADI半胱氨酸残基中的某些可首先经另一氨基酸取代以防止PEG聚合物连接至野生型半胱氨酸，例如防止PEG破坏以其它方式需要的生物活性。一些实施方案使用一种或多种非天然半胱氨酸衍生物(例如高半胱氨酸)替代半胱氨酸。
硫醇、硫氢基或半胱氨酸反应性PEG的非限制性实例包括甲氧基PEG顺丁烯二酰亚胺(M-PEG-MAL)(例如MW 2000、MW 5000、MW 10000、MW 20000、MW 30000、MW 40000)。M-PEG-MAL与蛋白质和肽中的半胱氨酸侧链上的硫醇基反应以产生稳定3-硫代琥珀酰亚胺基醚键。此反应具高度选择性且可在温和条件下在约pH5.0-6.5下在其它官能团存在下进行。市售硫醇、硫氢基或半胱氨酸反应性PEG分子的特定实例展示于图1A-1D中。因此，在某些实施方案中，ADIr酶缀合至本文所描述的硫醇、硫氢基或半胱氨酸反应性PEG分子中的任何一个或多个。
ADIr可在存在或不存在接头的情况下共价键结至修饰剂，诸如PEG，不过优选实施方案使用接头。ADIr可如例如以下文献所描述使用本领域中已知的方法经由生物相容接头共价键结至PEG：Park等人,Anticancer Res.,1:373-376(1981)；以及Zaplipsky和Lee,Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris编,Plenum Press,NY,第21章(1992)，其公开内容以本文引用的方式并入本文中。在一些情况下，ADIr可例如通过氨基、硫氢基、羟基、羧基或其它基团直接偶合(即不使用接头)至诸如PEG的修饰剂。
用于使ADIr共价连接至修饰剂(例如PEG)的接头可为任何生物相容接头。如上文所论述，“生物相容”表明化合物或基团为无毒的且可在体外或体内使用而不会引起损伤、疾病、疾病或死亡。诸如PEG的修饰剂可例如经由醚键、硫醇键、酰胺键或其它键键结至接头。
在一些实施方案中，适合的接头的总链长可为约1-100个原子、1-80个原子、1-60个原子、1-40个原子、1-30个原子、1-20个原子或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子，例如其中链中的原子包含C、S、N、P和/或O。在某些实施方案中，接头为任选存在的，例如PEG缀合的ADIr酶不包含接头。在一些情况下，接头基团包括例如琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基及其组合。稳定接头的特定实例包括琥珀酰亚胺、丙酸、羧基甲醇化物键联、醚、氨基甲酸酯、酰胺、胺、尿素、酰亚胺、脂族C-C键和硫醚。在某些实施方案中，生物相容接头为琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS)基团。
其它适合的接头包括氧基羰基咪唑基团(包括例如羰基咪唑(CDI))、硝基苯基(包括例如碳酸硝基苯酯(NCP)或碳酸三氯苯酯(TCP))、甲苯磺酸酯(trysylate)基团、醛基、异氰酸酯基、乙烯基砜基或伯胺。在某些实施方案中，接头衍生自SS、SPA、SCM或NHS；在某些实施方案中，使用SS、SPA或NHS，且在一些实施方案中，使用SS或SPA。因此，在某些实施方案中，可能的接头可由以下各项形成：甲氧基-PEG琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS)、甲氧基-PEG戊二酸琥珀酰亚胺酯(SG)、甲氧基-PEG碳酸琥珀酰亚胺酯(SC)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基羧甲基醚(SCM)、甲氧基-PEG2N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、甲氧基-PEG丁酸琥珀酰亚胺酯(SBA)、甲氧基-PEG丙酸琥珀酰亚胺酯(SPA)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基戊二酸酰胺和/或甲氧基-PEG琥珀酰亚胺基琥珀酰亚胺。
接头的其它实例包括但不限于以下中的一者或多者：-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、二价环烷基、-N(R6)-，R6为H或选自由以下组成的组的有机基团：烷基、经取代烷基、烯基、经取代烯基、炔基、经取代炔基、芳基和经取代芳基。另外，本文所描述的接头部分中的任一者可进一步包括包含1至20个环氧乙烷单体单元[即-(CH2CH2O)1-20-]的环氧乙烷寡聚物链。即，环氧乙烷寡聚物链可存在于在接头之前或之后且任选在包含两个或两个以上原子的接头部分的任何两个原子之间。另外，如果寡聚物邻近聚合物片段，则寡聚物链将不被视为接头部分的一部分，而仅仅表示聚合物片段的延伸部分。
具体示例性PEG分子和接头描述于下表A中。
在某些实施方案中，ADIr酶包含一个或多个PEG分子和/或如本文所描述(例如表A中)的接头。
PEG连接至ADIr增加ADIr的循环半衰期。一般来说，PEG连接至ADIr的伯胺。如熟练技术人员将已知，在ADIr上PEG或其它修饰剂的连接位点的选择是通过蛋白质的活性结构域内的各个位点的作用来确定。PEG可连接至ADIr的伯胺，而不会产生酶活性的实质性损失。举例来说，存在于ADIr中的赖氨酸残基全部是如本文所描述的ADIr可经由生物相容接头(诸如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS)连接至PEG的可能点。如本领域技术人员鉴于本公开将显而易知，PEG还可连接至ADIr上的其它位点。
1至约30个PEG分子可共价键结至ADIr。在某些实施方案中，ADIr经一个PEG分子修饰(即包含一个PEG分子)。在一些实施方案中，ADIr经超过一个PEG分子修饰。在特定实施方案中，ADIr经约1至约10或约7至约15个PEG分子或约2至约8或约9至约12个PEG分子修饰。在一些实施方案中，ADIr经约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个PEG分子修饰。在具体实施方案中，ADIr经每个ADIr 4.5-5.5个PEG分子修饰。在一些实施方案中，ADIr经5±1.5个PEG分子修饰。
在某些实施方案中，ADIr中约15％至约70％的伯氨基经PEG修饰，在一些实施方案中，精氨酸脱亚氨酶中的约20％至约65％、约25％至约60％，或在某些实施方案中，约30％至约55％或45％至约50％，或在一些实施方案中，约50％的伯氨基经PEG修饰。当PEG共价键结至ADIr的末端时，可能需要仅使用1个PEG分子。ADIr上PEG单元的数目增加使酶的循环半衰期增加。然而，ADIr上PEG单元的数目增加使酶的比活性降低。因此，如本领域技术人员鉴于本公开将显而易知，需要在两者之间达成平衡。
在一些实施方案中，生物相容接头的共同特征在于其经由琥珀酰亚胺基连接至精氨酸脱亚氨酶的伯胺。一旦与ADIr偶合，SS-PEG具有紧挨着PEG的酯键，其可赋予此位点血清酯酶敏感性，该血清酯酶可在体内从ADIr释放PEG。SPA-PEG和PEG2-NHS不具有酯键，因此其不对血清酯酶敏感。
连接至蛋白质的PEG可为直链，如在SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG情况下，或可使用PEG的支链，如在PEG2-NHS情况下。
在某些实施方案中，位于或邻近酶的催化区域的与ADIr缔合的聚乙二醇化位点经修饰。在某些实施方案中，词组“聚乙二醇化位点”定义为ADI或ADIr中可经聚乙二醇共价修饰的任何位点或位置。“聚乙二醇化位点”可视为位于或邻近酶的催化区域，其中位点的聚乙二醇化使得酶的催化活性显著降低。此类位点的聚乙二醇化传统上引起酶的钝化。举例来说，来自人型支原体的ADI在可视为位于或邻近酶的催化区域的112位置处具有赖氨酸。PEG连接至112位置处的此赖氨酸可使酶失活。此外，来自人型支原体的ADI在可视为位于或邻近酶的催化区域的397位置处具有半胱氨酸。397位置处的半胱氨酸的氨基酸取代可使酶失活。特定来说，丙氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸或酪氨酸取代397位置处的半胱氨酸可引起所有可检测酶活性的损失。来自人型支原体的ADI具有三个接近此保守半胱氨酸定位的赖氨酸残基，具体来说为Lys374、Lys405和Lys408。PEG连接至Lys374、Lys405、Lys408或其组合可使酶失活。
应了解，衍生自其它生物体的ADIr还可具有对应于来自人型支原体的ADI的112位置的聚乙二醇化位点。此外，来自一些生物体的ADI可具有对应于与来自人型支原体的ADI的112位置相同的总体位置的赖氨酸残基。来自此类生物体的ADI中的赖氨酸的位置为熟练人员已知的且描述于美国专利第6,635,462号中。
因此，一些实施方案提供ADIr的多肽链中的某些氨基酸取代。这些氨基酸取代提供经修饰ADIr，其在由修饰剂例如在聚乙二醇化后修饰时损失较少活性。通过消除位于或邻近酶的催化区域的聚乙二醇化位点或其它已知修饰位点，可达成最佳修饰(例如聚乙二醇化)，而不损失活性。
在一些实施方案中，举例来说，如上文所说明，氨基酸取代使用非天然氨基酸来缀合至PEG或其它修饰剂(参见例如de Graaf等人,Bioconjug Chem.20:1281-95,2009)。因此，某些实施方案包括经由一个或多个非天然氨基酸缀合至一个或多个PEG的ADIr酶。在一些实施方案中，非天然氨基酸包含具有选自由以下组成的组的官能团的侧链：烷基、芳基、芳基卤化物、乙烯基卤化物、烷基卤化物、乙酰基、酮、氮丙啶、腈、硝基、卤化物、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤基、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醚、环氧化物、砜、硼酸、硼酸酯(boronate ester)、硼烷、苯基硼酸、硫醇、硒基、磺酰基、硼酸酯(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环-、吡啶基、萘基、二苯甲酮、约束环(诸如环辛炔)、硫酯、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基、羧酸、α-酮基甲酸、α或β不饱和酸和酰胺、乙醛酰基酰胺和有机硅烷基团。在一些实施方案中，非天然氨基酸选自由以下组成的组：对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、高半胱氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、β-O-GlcNAc-L-丝氨酸、三-O-乙酰基-GalNAc-α-苏氨酸、α-GalNAc-L-苏氨酸、左旋多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸和异丙基-L-苯丙氨酸。
虽然ADIr-PEG为本文所描述的说明性经修饰ADIr，但如熟练人员将认可，ADIr可经其它聚合物或适当分子修饰以获得所要效应，尤其是降低抗原性和增加血清半衰期。
应了解，一些实施方案是基于以下理解：当经由重组技术制备时，精氨酸脱亚氨酶的某些结构特征可阻止或妨碍适当和快速复性。特定来说，这些结构特征妨碍或阻止酶在重组制备期间呈现活性构象。在一些实施方案中，术语“活性构象”定义为允许由未修饰或经修饰精氨酸脱亚氨酶产生的酶活性的三维结构。活性构象可尤其为催化精氨酸转化成瓜氨酸所必需的。术语“结构特征”可定义为由特定氨基酸或氨基酸组合产生的多肽链的任何特性、质量或性质。举例来说，精氨酸脱亚氨酶可含有在正常肽链中产生弯曲或扭折且因此防碍酶在酶的复性期间呈现活性构象的氨基酸。特定来说，来自人型支原体的精氨酸脱亚氨酶在210位置处具有脯氨酸，其可在肽链中产生弯曲或扭折，从而使得酶在重组制备期间更难以复性。应了解，衍生自其它生物体的精氨酸脱亚氨酶还可具有对应于来自人型支原体的精氨酸脱亚氨酶的210位置的位点。
因此，提供关于野生型精氨酸脱亚氨酶的多肽链中的某些氨基酸取代的一些实施方案。实例包括消除精氨酸脱亚氨酶的肽链中的问题结构特征的取代。还包括提供经修饰精氨酸脱亚氨酶的改进的复性的取代。这些氨基酸取代使得可能使用降低量的缓冲液使经修饰精氨酸脱亚氨酶快速复性。这些氨基酸取代还可提供增加产量的复性经修饰精氨酸脱亚氨酶。在一些实施方案中，经修饰精氨酸脱亚氨酶在P210或等效残基处具有氨基酸取代。如上文所提及，衍生自人型支原体的精氨酸脱亚氨酶具有位于210位置处的氨基酸脯氨酸。虽然不限制本发明，但认为在位置210处氨基酸脯氨酸的存在在正常多肽链中产生弯曲或扭折，从而增加使某些精氨酸脱亚氨酶复性(即再折叠)的难度。取代位置210处的脯氨酸使得可能使用降低量的缓冲液使经修饰精氨酸脱亚氨酶快速复性。取代位置210(或等效残基)处的脯氨酸还可提供增加产量的复性经修饰精氨酸脱亚氨酶。在一些实施方案中，位置210(或等效残基)处的脯氨酸经丝氨酸取代。其它取代的非限制性实例包括Pro210至Thr210、Pro210至Arg210、Pro210至Asn210、Pro210至Gln210或Pro210至Met210。通过消除那些与野生型精氨酸脱亚氨酶的位置210的氨基酸相关的结构特征，可达成酶的最佳再折叠。
本文所提供的方法可涉及体外或体内应用。在体外应用(包括细胞培养应用)的情况下，可添加本文所描述的化合物至培养物中的细胞中且然后孵育。本文所描述的化合物还可用于促进使用本领域中熟知的抗体制备技术制备单株和/或多株抗体。如本领域技术人员将显而易知，单株和/或多株抗体可然后用于多种诊断应用。
施用本文所描述的化合物或组合物的体内手段将视预期应用而不同。以纯形式或以适当药学组合物形式施用本文所描述的ADIr组合物可经由接受的用于提供类似功效的药剂投药模式中的任一种来进行。药学组合物可将ADIr(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)与适当的生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备，且可配制成诸如以下的呈固体、半固体、液体或气态形式的制剂：片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。此外，其它药物活性成分(包括如本文其它地方所描述的其它抗癌剂)和/或适合的赋形剂(诸如盐、缓冲液和稳定剂)可(但不需要)存在于组合物内。
投药可通过包括以下的多种不同途径来达成：口服、肠胃外、鼻内、静脉内、真皮内、皮下或局部。投药模式取决于所要治疗或预防的病状的性质。因此，ADIr酶(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)可经口、鼻内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴内、瘤内、肌肉内、经间质、动脉内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮和经皮施用。在投药之后，减轻、抑制、预防癌症或延迟其进展和/或转移的量视为有效量。在某些实施方案中，本文的ADIr组合物使患者的中值存活时间增加统计显著量。在一些实施方案中，本文所描述的ADIr治疗使患者的中值存活时间增加4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、40周或更久。在某些实施方案中，ADIr治疗使患者的中值存活时间增加1年、2年、3年或更久。在一些实施方案中，本文所描述的ADIr治疗使无进展存活增加2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更久。在某些实施方案中，本文所描述的ADIr治疗使无进展存活增加1年、2年、3年或更久。
在某些实施方案中，施用的量足以使肿瘤消退，正如由有活力肿瘤的量的统计显著性降低，例如至少10％、20％、30％、40％、50％或肿瘤质量的更大降低；或由扫描尺寸改变(例如具有统计显著性的减小)所指示。在某些实施方案中，施用的量足以使得疾病稳定。在某些实施方案中，施用的量足以产生具有熟练临床医师已知的特定疾病征象的症状的临床相关减轻。
在某些实施方案中，施用的量足以抑制NO合成、抑制血管生成和或足以诱导肿瘤细胞凋亡或其任何组合。NO合成、血管生成和凋亡可使用本领域中已知的方法来测量，参见例如Current Protocols in Immunology or Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009及其更新)；Ausubel等人,ShortProtocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995；和其它相似参考文献。在一些实施方案中，施用的量抑制NO合成且抑制黑素瘤生长，且补充、增加或协同加强如本文所描述的其它化学治疗剂，诸如顺铂。因此，一些实施方案提供一种通过与顺铂组合施用ADIr-PEG 20来治疗黑素瘤的方法，其中该治疗耗尽内源性一氧化氮(NO)。
治疗的精确剂量和持续时间随正在治疗的疾病而变且可根据经验使用已知测验程序或通过在本领域中已知的模型系统中测试组合物并由其推断来确定。还可进行控制临床试验。剂量还可随所要缓解的病状的严重性而变化。通常配制并施用药学组合物以发挥治疗有效作用，同时将不需要的副作用减至最少。组合物可一次性施用，或可分成要按多个时间间隔施用的许多较小剂量。对于任何特定受试者，具体给药方案可根据个体需要随时间推移进行调节。
ADIr(例如ADIr-PEG)组合物可单独或与诸如以下的其它已知癌症治疗组合施用：放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。组合物还可与抗生素组合施用。
ADIr组合物还可单独或与ADI-PEG 20治疗组合施用。在某些实施方案中，如本文所描述的ADIr是用于已经ADI-PEG 20疗法和已产生抗ADI-PEG 20抗体的患者中。此类患者不再受益于ADI-PEG 20治疗，因为酶由抗体中和。因此，在某些实施方案中，本发明提供一种治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含ADI-PEG 20的组合物，且在一段时间之后，向患者施用包含如本文所描述的ADIr的组合物，由此治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展。
在所述方法的一些实施方案中，所述时间段是通过检测患者中的预定水平的抗ADI-PEG 20抗体来确定，其中包含ADIr的组合物是在检测到预定水平的所述抗ADI-PEG 20抗体之后施用。在某些实施方案中，可确定要用ADI-PEG 20和本文所描述的ADIr酶治疗的患者中的抗ADI-PEG 20抗体的阈值水平或预定水平。抗ADI-PEG 20抗体的“预定阈值水平”(还称为“预定水平”或“预定截止值”)或有时称为预定截止值可使用本领域中已知的方法来确定，例如使用接受者操作特性曲线(Receiver Operator Characteristic curves)或“ROC”曲线来确定。在一些实施方案中，甚至非常低水平的抗ADI-PEG 20抗体即被认为足以成为将治疗由ADI-PEG 20转换成本文所描述的ADIr-PEG的根据。在某些实施方案中，将确定何时结束ADI-PEG 20治疗并开始用本文所描述的ADIr组合物治疗的抗ADI-PEG 20的适当水平可由熟练临床医师确定。
在一些实施方案中，所述时间段是通过检测或以其它方式观测患者中的ADI活性来确定，其中组合物是在检测或观测到预定水平的ADI活性之后施用。在特定实施方案中，组合物是在检测或观测到患者中的降低水平的ADI活性之后施用。ADI活性可直接地例如通过测定生物样品的至少一个ADI活性指示物，或间接地例如通过观测ADI-PEG 20治疗的所需或预期效果来测量。在某些实施方案中，将确定何时结束ADI-PEG 20治疗并开始用本文所描述的ADIr-PEG治疗的ADI活性的适当水平可由熟练临床医师确定。
因此，施用这些和相关药学组合物的典型途径包括但不限于口服、局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、颊内、直肠、阴道和鼻内。如本文所用，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。
某些药学组合物经配制使得允许其中所含的活性成分在向患者施用组合物之后为生物可利用的。将向受试者或患者施用的组合物可采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可为单一剂量单位，且本文所描述的呈气雾剂形式的ADIr组合物的容器可容纳多个剂量单位。制备此类剂型的实际方法为已知的，或是为本领域技术人员将显而易知的；例如参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(PhiladelphiaCollege of Pharmacy and Science,2000)。所要施用的组合物在任何情况下均将含有治疗有效量的本文所描述的ADIr-PEG，诸如ADIr-PEG 20，用于治疗根据本文教示的相关疾病或病状。在某些实施方案中，药学或治疗性组合物为无菌和/或无热原的。
药学组合物可呈固体或液体形式。在一些实施方案中，载体为微粒，使得组合物例如呈片剂或粉末形式。载体可为液体，并且组合物为例如施用口服油、可注射液体或气雾剂，其适合用于例如吸入投药。当旨在用于口服投药时，药学组合物通常呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文中视为固体或液体的形式内。
作为用于口服投药的固体组合物，药学组合物可配制成粉末、颗粒、压制片剂、丸剂、胶囊、口嚼胶、干胶片或其类似物。此类固体组合物将典型地含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。此外，可存在以下中的一者或多者：粘合剂，诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，诸如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉及其类似物；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或桔子味调味剂；和着色剂。当药学组合物呈胶囊(例如明胶胶囊)形式时，其除以上类型的材料之外可含有诸如聚乙二醇或油的液体载体。
药学组合物可呈液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可用于口服投药或用于通过注射递送。当旨在用于口服投药时，优选组合物除本发明化合物之外含有以下中的一者或多者：甜味剂、防腐剂、染色剂/着色剂和增味剂。在旨在通过注射施用的组合物中，可包括以下中的一者或多者：表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂。
液体药学组合物(无论其为溶液、悬浮液抑或其它类似形式)可包括以下助剂中的一者或多者：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(在某些实施方案中为生理盐水)、林格氏溶液(Ringer’s solution)、等渗氯化钠、不挥发性油(诸如可充当溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可封闭于安瓿、抛弃式注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水为优选助剂。可注射药学组合物优选为无菌的。
旨在用于肠胃外或口服投药的液体药学组合物应含有一定量的如本文所公开的ADIr(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)，使得将获得适合的剂量。典型地，此量为含于组合物中的至少0.01％的ADIr。当旨在用于口服投药时，此量可在组合物重量的0.1％与约70％之间变化。某些口服药学组合物含有约4％与约75％之间的ADIr。在某些实施方案中，药学组合物和制剂经制备使得肠胃外剂量单位在稀释之前含有0.01重量％至10重量％之间的ADIr。
药学组合物可旨在用于局部投药，在此情况下载体可适当包含溶液、乳液、软膏或凝胶基质。举例来说，基质可包含以下中的一者或多者：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、诸如水和乙醇的稀释剂以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可存在于用于局部投药的药学组合物中。如果旨在用于经皮投药，则组合物可包括经皮贴片或离子透入装置。药学组合物可旨在用于以例如栓剂的形式直肠投药，栓剂将在直肠中融化并释放药物。用于直肠投药的组合物可含有油脂性基质作为适合的无刺激性赋形剂。此类基质包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
药学组合物可包括改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。举例来说，组合物可包括形成包围活性成分的包衣外壳的材料。形成包衣外壳的材料典型地为惰性的，且可选自例如糖、虫胶和其它肠溶衣剂。或者，活性成分可包裹于明胶胶囊中。呈固体或液体形式的药学组合物可包括结合于ADIr(例如ADIr-PEG)且由此帮助递送化合物的试剂。可在此能力中起作用的适合的试剂包括单株或多株抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。药学组合物可基本上由可以气雾剂形式施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示从具有胶体性质的系统变化至由加压包装组成的系统的多种系统。递送可通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的适合的帮浦系统来进行。气雾剂可以单相、双相或三相系统形式递送来递送活性成分。气雾剂的递送包括必需容器、活化剂、阀、亚容器及其类似物，其一起可形成套组。本领域普通技术人员不进行过度实验即可确定优选气雾剂。
药学组合物可通过药学技术中熟知的方法来制备。举例来说，旨在通过注射施用的药学组合物可如下制备：通过将包含如本文所描述的ADIr(例如ADIr-PEG)和任选存在的盐、缓冲液和/或稳定剂中的一个或多个的组合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液。可添加表面活性剂以促进形成均匀溶液或悬浮液。表面活性剂为与ADIr(例如ADIr-PEG)组合物非共价相互作用以促进ADIr(例如ADIr-PEG)溶解或均匀悬浮于水性递送系统中的化合物。
组合物可以治疗有效量施用，所述治疗有效量将视包括以下的多种因素而不同：所用具体化合物(例如ADIr-PEG)的活性；化合物的代谢稳定性和作用时长；患者的年龄、体重、总体健康、性别和膳食；投药模式和时间；排泄速率；药物组合；特定病症或病状的严重性；和经受治疗的受试者。
本文所描述的化合物的治疗有效量为有效抑制肿瘤生长的量。一般来说，以小剂量起始治疗，小剂量可以小增量增加直至达成在所述情形下的最佳效果。一般来说，化合物的治疗剂量可为约1至约200mg/kg每周两次至约每两周一次。举例来说，剂量可为以2ml静脉注射形式约1mg/kg每周一次至约20mg/kg每3天一次。在一些实施方案中，剂量可为约每3天一次、约每周一次、约每周两次或约每2周一次施用约50IU/m2至约700IU/m2。在某些实施方案中，剂量可为约每3天一次、约每周一次、约每周两次或约每2周一次施用约50IU/m2、60IU/m2、70IU/m2、80IU/m2、90IU/m2、100IU/m2、110IU/m2、120IU/m2、130IU/m2、140IU/m2、150IU/m2、160IU/m2、170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、约320IU/m2、约330IU/m2、340IU/m2、约350IU/m2、360IU/m2、370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、620IU/m2、630IU/m2、640IU/m2、650IU/m2、660IU/m2、670IU/m2、680IU/m2、690IU/m2或约700IU/m2。在某些实施方案中，剂量可由熟练临床医师按需要进行修改。
在一些情况下，ADIr-SS-PEG5,000情况下的最佳剂量可为约每周两次，而ADIr-SS-PEG20,000情况下的最佳剂量可为约每周一次至约每两周一次。在某些实施方案中，ADIr-SS-PEG20,000情况下的最佳剂量可为约每周两次。
ADIr(例如ADIr-PEG)在注射之前可与磷酸盐缓冲盐水溶液或本领域技术人员已知的任何其它适当的溶液混合。在一些实施方案中，包含ADIr-PEG的液体组合物包含约10至约12mg的ADIr；约20至约40mg的聚乙二醇；约1.27mg±5％磷酸二氢钠，USP；约3mg±5％磷酸氢二钠，USP；约7.6mg±5％氯化钠，USP；在约6.6至约7的pH值下；含于适当量的注射用水(例如约1ml或约2ml)中。
在一些实施方案中，包含ADIr-PEG的液体组合物包含组氨酸-HCl，且在某些实施方案中，组合物缓冲液为约0.0035M组氨酸-HCl至约0.35M组氨酸-HCl。在一个特定实施方案中，组合物是于包含pH 6.8下的0.035M组氨酸-HCl的缓冲液中在0.13M氯化钠存在下进行配制。在某些实施方案中，组合物是于包含pH 6.8下的0.02M磷酸钠缓冲液的缓冲液中在0.13M氯化钠存在下进行配制。在一些实施方案中，包含ADIr-PEG的液体组合物包含约10至约12mg的ADIr；约20至约40mg的聚乙二醇；约5.4mg±5％组氨酸，USP；约7.6mg±5％氯化钠，USP；在约6.6至约7的pH值下；含于适当量的注射用水(例如约1ml或约2ml)中。
在一些实施方案中，包含ADIr(例如ADIr-PEG)的组合物的pH值为约5至约9、约6至约8或约6.5至约7.5。在一些实施方案中，包含ADIr的组合物的pH值为约6.8±1.0。
在一些实施方案中，包含ADIr(例如ADIr-PEG)的组合物中的游离PEG在1-10％之间。在一些实施方案中，其为总PEG的小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在某些实施方案中，包含ADIr(例如ADIr-PEG)的组合物中的未修饰ADIr小于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或小于0.1％。一般来说，包含ADIr-PEG的组合物的总杂质小于或等于约4％、3％、2％、1.5％、1％或0.5％。在一些实施方案中，内毒素限值满足陈述于USP中的要求，即≤50EU/mL。
在一些实施方案中，包含ADIr(例如ADIr-PEG)的组合物中的游离硫氢基大于约90％。在一些实施方案中，包含ADIr或ADIr-PEG的组合物中的游离硫氢基为约91％、约92％、约93％、约94％或约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。
在一些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的Km为约0.1μM或0.5μM至约15μM，或为约1μM至约12μM、约1μM至约10μM、约1.5μM至约9μM、约1.5μM至约8μM或约1.5μM至约7μM。在某些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的Km为约1.0μM至约10μM或约1.5μM至约6.5μM。在一些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG的Km为约、至少约或小于约0.1μM、约0.5μM、约1.0μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM或约7μM或约8μM或约9μM或约10μM。
在一些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的Kcat为约0.5秒-1至约80秒-1或约0.5秒-1至约70秒-1或约0.5秒-1至约60秒-1或约0.5秒-1至约50秒-1或约0.5秒-1至约40秒-1或约0.5秒-1至约30秒-1或约0.5秒-1至约20秒-1或约0.5秒-1至约15秒-1，或为约0.5秒-1至约80秒-1或约1秒-1至约80秒-1或约5秒-1至约80秒-1或约10秒-1至约80秒-1或约20秒-1至约80秒-1或约30秒-1至约80秒-1或约40秒-1至约80秒-1或约50秒-1至约80秒-1或约60秒-1至约80秒-1或约70秒-1至约80秒-1或约1秒-1至约12秒-1、约1秒-1至约10秒-1、约1.5秒-1至约9秒-1、约2秒-1至约8秒-1或约2.5秒-1至约7秒-1。在某些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的Kcat为约2.5秒-1至约7.5秒-1。在一些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG的Kcat为约或至少约2.5秒-1、约3秒-1、约3.5秒-1、约4秒-1、约4.5秒-1、约5秒-1、约5.5秒-1、约6秒-1、约6.5秒-1、约7秒-1、约7.5秒-1或约8秒-1、约10秒-1、约15秒-1、约20秒-1、约25秒-1、约30秒-1、约35秒-1、约40秒-1、约45秒-1、约50秒-1、约55秒-1、约60秒-1、约65秒-1、约70秒-1、约75秒-1、约80秒-1、约85秒-1、约90秒-1、约95秒-1或约100秒-1。
在一些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的电导率(本领域中还称为比电导)为约5mS/cm至约20mS/cm或约5mS/cm至约15mS/cm、约7mS/cm至约15mS/cm、约9mS/cm至约15mS/cm或约10mS/cm至约15mS/cm。在一些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的电导率为约9mS/cm、约10mS/cm、约11mS/cm、约12mS/cm或约13mS/cm、约14mS/cm或约15mS/cm。在某些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的电导率为约13mS/cm±1.0mS/cm。
在一些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的渗透压为约50mOsm/kg至约500mOsm/kg、约100mOsm/kg至约400mOsm/kg、约150mOsm/kg至约350mOsm/kg、约200mOsm/kg至约350mOsm/kg或约250mOsm/kg至约350mOsm/kg。在某些实施方案中，组合物中的ADIr(例如ADIr-PEG)的渗透压为约300±30mOsm/kg。
在一些实施方案中，蛋白质浓度为约11.0±1.0mg/mL。在某些实施方案中，蛋白质浓度在约8与约15mg/mL之间。在某些实施方案中，蛋白质浓度为约8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14或15mg/mL。
在一些实施方案中，酶比活性在约5.0与90IU/mg之间或约5与55IU/mg之间，其中1IU定义为在一分钟内在37℃下将1μmol精氨酸转化成1μmol瓜氨酸和1μmol的氨水的酶量且效价为100±20IU/ml。在某些实施方案中，酶比活性为约5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、35、40、45、50、55、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100±2.0IU/mg。在一个特定实施方案中，酶比活性为9±2.0IU/mg。
包含本文所描述的ADIr(例如ADIr-PEG)的组合物可与包括ADI-PEG 20的一种或多种其它治疗剂同时、在其施用之前或在其施用之后施用。此类组合疗法可包括施用含有本发明的化合物和一种或多种其它活性剂的单一药学剂量配制物，以及施用包含含于自己单独的药学剂量配制物中的本文所描述的ADIr(例如ADIr-PEG)和各活性剂的组合物。举例来说，ADIr(例如ADIr-PEG)和其它活性剂可以诸如片剂或胶囊的单一口服剂量组合物形式一起向患者施用，或各试剂以单独的口服剂量配制物形式施用。类似地，ADIr(例如ADIr-PEG)和其它活性剂可以诸如呈盐水溶液或其它生理学可接受的溶液形式的单一肠胃外剂量组合物形式一起向患者施用，或各试剂以单独的肠胃外剂量配制物形式通过相同或不同途径(例如一者通过注射，一者通过口服)施用。在使用单独的剂量配制物情况下，包含ADIr(例如ADIr-PEG)和一种或多种其它活性剂的组合物可基本上同时(即并行地)或分开地错开时间(即连续地)和以任何顺序施用；组合疗法应理解为包括所有这些方案。
因此，在某些实施方案中，还涵盖与一种或多种其它治疗剂组合施用本公开的ADIr组合物。此类治疗剂可在本领域中接受作为如本文所描述的特定疾病病况(诸如特定癌症或GVHD)的标准治疗。所涵盖的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、自噬抑制剂或其它活性剂和辅助试剂。
在某些实施方案中，本文所公开的ADIr(例如ADIr-PEG)组合物可与许多化学治疗剂结合施用。化学治疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯并替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、双氯乙基甲胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、胆固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C、卡奇霉素(calicheamicin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红比星(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢产物，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如环胞苷、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄酮(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；乙酰葡醛酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；贝他布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；氨基甲酸酯；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇，例如帕西他赛(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(Rhne-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；双羟蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；依班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，诸如TargretinTM(贝沙罗汀(bexarotene))、PanretinTM(阿利维甲酸(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼白介素2(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；和以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中还包括发挥作用调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)。其它化学治疗剂包括索拉非尼和其它蛋白激酶抑制剂，诸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、克唑替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、埃罗替尼(erlotinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、木利替尼(mubritinib)、尼罗替尼(nilotinib)、帕尼单抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、哌加他尼(pegaptanib)、雷珠单抗(ranibizumab)、鲁索替尼(ruxolitinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、维罗非尼(vemurafenib)和舒尼替尼；西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、依维莫司和其它mTOR抑制剂。以上中的任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物还预期用于本文中。
在某些实施方案中，本文所公开的ADIr(例如ADIr-PEG)组合物可与许多自噬抑制剂结合施用。在一些优选实施方案中，自噬抑制剂选自由以下组成的组：氯喹、3-甲基腺嘌呤、羟氯喹(Plaquenil.TM.)、巴菲霉素(bafilomycin)A1、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核糖核苷(AICAR)、冈田酸(okadaic acid)、自噬抑制性海藻毒素(其抑制2A型或1型蛋白磷酸酶)、cAMP的类似物和增加cAMP水平的药物、腺苷、N6-巯基嘌呤核糖核苷、渥曼青霉素(wortmannin)和长春花碱。此外，还可使用抑制自噬所必需的蛋白质(诸如ATG5)的表达的反义或siRNA。
在一些实施方案中，ADIr(例如ADIr-PEG)与一种或多种治疗剂的组合互补、相加或协同地作用。就此而言，本文描述互补或协同加强剂，其包括能够与如本文所提供的ADIr-PEG互补或协同地起作用的治疗剂(例如化学治疗剂、自噬抑制剂、mTOR抑制剂或用于治疗如本文所描述的癌症、GVHD或炎症性肠道疾病的任何其它治疗剂)，其中此类互补或协同作用表现为与当化学治疗剂存在但ADIr(例如ADIr-PEG)组合物不存在时和/或当ADIr(例如ADIr-PEG)存在但化学治疗剂不存在时可检测的作用相比，量值较大的可检测作用(即相对于适当对照情况以统计显著性方式)。用于测量协同性和互补性的方法为本领域中已知的(参见例如Cancer Res 2010年1月15日70；440)。
如本文所描述的包含ADIr(例如ADIr-PEG)和任选存在的其它治疗剂的组合物可用于用于治疗癌症的治疗方法和用于预防癌症转移的方法中。因此，一些实施方案包括用于治疗多种不同癌症、缓解其症状或抑制其进展或对其进行预防的方法。一些实施方案包括用于治疗GVHD、缓解其症状或抑制其进展的方法。特定实施方案包括用于治疗患者的癌症或GVHD、缓解其症状或抑制其进展的方法，其包括任选在用ADI-PEG 20治疗之后，尤其在患者产生抗ADI-PEG 20抗体的情况下，向患者施用治疗有效量的如本文所描述的ADIr组合物，由此治疗癌症或GVHD、缓解其症状或抑制其进展。因此，可向患有炎症性肠道疾病(例如克罗恩氏病(Crohn's disease)；溃疡性结肠炎)、GVHD或包括但不限于以下的癌症的个体施用本文所描述的ADIr组合物：肝细胞癌、白血病(例如急性髓样白血病和复发急性髓样白血病)、黑素瘤(包括转移性黑素瘤)、肉瘤(包括但不限于转移性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤)、胰腺癌、前列腺癌(诸如但不限于激素难治性前列腺癌)、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌(包括但不限于胃腺癌)、神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌(包括但不限于肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑部癌症、头颈癌(包括但不限于头颈部鳞状细胞癌；舌癌)、宫颈癌、睾丸癌、胆囊癌、胆管癌和胃癌。
还包括治疗患者的癌症、缓解其症状或抑制其进展的方法，其包括向患者施用如本文所描述包含ADIr(例如ADIr-PEG)和任选存在的一种或多种其它治疗剂的组合物，其中所述癌症缺乏ASS、ASL或两者。就此而言，ASS或ASL缺乏可为如通过mRNA表达或蛋白质表达所测量的表达降低，或可为蛋白质活性降低，且通常包含如由熟练人员所测定的统计显著性表达或活性降低。降低的ASS或ASL表达或活性可为与已知不具有癌症的适当对照样品中的表达或活性相比，表达或活性降低约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或更多。在某些实施方案中，ASS或ASL表达或活性与非癌症对照样品中的表达或活性相比降低至少两倍。
在某些实施方案中，ASS或ASL的降低的表达或活性是因ASS或ASL促进剂的甲基化或ASS或ASL促进剂的抑制而产生。在一些实施方案中，ASS或ASL的表达或活性降低是因DNA突变(例如一个或多个点突变、小片段缺失、插入及其类似突变)或使得基因缺失的染色体异常而产生。在一些实施方案中，癌症为ASS或ASL负性的，意谓未观测到表达或活性。
ASS或ASL表达或活性降低可使用本领域中已知的诸如但不限于以下的任何方法来测量：定量PCR、免疫组织化学、酶活性测定(例如用于测量瓜氨酸至精氨基琥珀酸盐的转化或精氨基琥珀酸盐至精氨酸和富马酸盐的转化的测定)及其类似方法。
因此，某些实施方案包括用于治疗患者的癌症、缓解其症状或抑制其进展的方法，其包括向患者施用包含如本文所描述的ADIr(例如ADIr-PEG)的组合物，其中癌症展现ASS或ASL或两者的降低的表达或活性，其中癌症包括但不限于肝细胞癌、白血病(例如急性髓样白血病和复发急性髓样白血病)、黑素瘤(包括转移性黑素瘤)、肉瘤(包括但不限于转移性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤)、胰腺癌、前列腺癌(诸如但不限于激素难治性前列腺癌)、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌(包括但不限于胃腺癌)、神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌(包括但不限于肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑部癌症、头颈癌(包括但不限于头颈部鳞状细胞癌；舌癌)、宫颈癌、睾丸癌、胆囊癌、胆管癌和胃癌。
文献中的各种研究已表明以下肿瘤中缺乏ASS：急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳癌、结肠直肠癌、胃癌、胶质母细胞瘤、HCC、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤和小细胞肺癌。因此，本文中具体地涵盖这些ASS缺乏型癌症的治疗，其使用单独的或与其它治疗组合(包括首先用ADI-PEG 20治疗)的ADIr-PEG。
还包括用于治疗患者的癌症、缓解其症状或抑制其进展的方法，其包括与自噬抑制剂组合向患者施用包含如本文所描述的ADIr(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)的组合物。一些实施方案包括用于治疗患者的癌症的方法，其包括与自噬抑制剂组合向患者施用治疗有效量的包含如本文所描述的ADIr的组合物，其中癌症为胰腺癌或小细胞肺癌。
一些实施方案包括如下治疗方法，其中包含本文所描述的ADIr的组合物的施用耗尽血浆中的精氨酸持续至少一个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更久。某些实施方案包括如下治疗方法，其中在终止用ADI-PEG 20治疗之后，在检测到抗ADI-PEG 20抗体之后，包含本文所描述的ADIr的组合物的施用耗尽血浆中的精氨酸持续至少一个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更久。
实施例
实施例1
与患者抗ADI-PEG 20抗体具有低交叉反应性的ADI酶的筛选和选择
此实施例描述与患者抗ADI-PEG 20抗体具有低交叉反应性的ADI酶的筛选和选择。
从大量ADI酶中，表1列举了关于相对于人型支原体ADI的序列同一性百分比所选择的27种ADI酶。
来自多种生物体的许多ADI酶经表征以确定哪些酶甚至在抗ADI-PEG 20抗体存在下还预期将移除患者血液中的精氨酸并维持低浓度。如下文所详述，这些研究表明来自基于序列同一性与人型支原体紧密相关的许多物种的ADI具有在各种温度和pH值下所测量的足够良好的酶催化性质，且还显示与抗ADI-PEG 20抗体的降低的交叉反应性。
ADI制备.重组ADI酶是根据如例如以下文献中所描述的标准方案克隆、表达并纯化以供测试：Gallego等人,PLOS One,7(10):e47886,2012；Monstadt和Holldorf,Biochem.J.273:739-745,1990；Joo Noh等人,Molecules and Cells.13:137-143,2002；以及Sugimura等人,Infection and Immunity.58:2510-2515,1990。
人抗ADI-PEG20抗体纯化.抗ADI-PEG20抗体是从在临床研究期间已接收ADI-PEG20的患者的血浆样品纯化。举例来说，从如通过ELISA测定所测定已针对ADI-PEG20达到高效价(效价>/＝4)的8个不同患者汇集总共60ml血浆。使用两步法纯化，进行蛋白质“A”色谱法(GE Healthcare)继之以ADI亲和色谱法。获得约20mg纯化抗体并以等分试样储存于-80℃直至需要时为止。
ADI酶测定.精氨酸脱亚氨酶(ADI)催化L-精氨酸转化成L-瓜氨酸和氨水。L-瓜氨酸的量可通过比色端点测定(参见例如Knipp和Vasak,Analytical Biochem.286:257-264,2000)检测，且与已知量的L-瓜氨酸的标准曲线相比较，以计算以每毫克蛋白质的IU数表示的ADI比活性。1IU的酶活性定义为在正在测试中的pH值和温度下每分钟产生1μmol瓜氨酸的酶的量。标准测定条件是在37℃下在生理HEPES缓冲液(PHB)50mM HEPES、160mM NaCl pH7.4(Lang和Zander,Clin Chem Lab Med.37:563-571,1999)加上0.1％BSA中进行。在条件允许的情况下，所有样品和标准品均一式两份或三份进行。
Km和Kcat值是通过使用上文所描述的活性测定的变化形式来测定。如在活性测定情况下(或除非另外指出，否则所有反应均在37℃下在PHB加上0.1％BSA中进行)。酶浓度、反应时间和底物浓度范围针对ADI或ADIr构筑体各自进行调节以解释其活性差异。一般来说，使用2nM酶、5分钟反应时间和0-160μM精氨酸作为起动条件。当优化条件时，特别注意呈占添加至反应中的总底物的百分比形式的所消耗底物的量。典型地，检测下限为约1μM瓜氨酸，并且定量下限为约2μM。对每个板进行瓜氨酸标准曲线试验，且用于定量由酶促反应产生的瓜氨酸。
还进行活性测定以评估在抗ADI-PEG20存在下的酶活性(抗体中和特征)。如上文所描述且在640nM、320nM、160nM、80nM、40nM、20nM、10nM和0nM抗ADI-PEG20抗体存在下进行这些测定。
计算.使用瓜氨酸标准曲线计算各反应中产生的瓜氨酸浓度(μM)且取平均值。然后，按μM/min/50nM ADI计算各反应的速率。通过将此值乘以“IU”因子(IU因子是由ADI的分子量和反应体积计算)来计算比活性(IU/mg或每毫克ADI每分钟的产物微摩尔数)。
数据显示于以下表2-7中。
这些数据尤其表明，与人型支原体ADI高度同源(约50％-100％同一性)的天然和聚乙二醇化ADI酶维持优良催化活性(表2-4)，包括在不同pH值(表6)和温度限定(表7)条件下。如通过(增加的)酶活性在抗ADI-PEG 20抗体存在下(表4-5)所测量，例如相对于人型支原体，其还显示降低的对患者抗ADI-PEG 20抗体的亲和力。因此，这些ADI酶在单独或在ADI-PEG 20治疗之后用于治疗癌症的疗法中时可具有治疗功效，以延长和/或增加精氨酸耗尽疗法的有效性。
上文所描述的各个实施方案可组合以提供其它实施方案。本说明书中所提及和/或应用数据表中所列的所有美国专利、美国专利申请公开案、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物以引用的方式整体并入本文中。必要时可修改实施方案的方面以使用各个专利、申请和出版物的概念来提供其它实施方案。
可根据以上详细描述对实施方案作出这些和其它变化。一般来说，在以下权利要求中，所用术语不应理解为将权利要求限于本说明书和权利要求中所公开的特定实施方案，而应理解为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求所授予等效内容的全部范围。因此，权利要求不受本公开限制。
序列表
<110> Polaris Group
Showalter, Richard E.
Almassy, Robert
Thomson, James A.
Sisson, Wes
Shia, Wei-Jong
Chen, Li-Chang
Lee, Yang
<120> 用于癌症治疗的对ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性的精氨酸脱亚氨酶
<130> POLA-005/01WO
<150> US 62,051,182
<151> 2014-09-16
<160> 28
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 409
<212> PRT
<213> 人型支原体
<400> 1
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile
50 55 60
Met Lys Asp Arg Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Lys Ala Ala Lys Glu Glu Phe Ile Glu
85 90 95
Thr Phe Leu Glu Glu Thr Val Pro Val Leu Thr Glu Ala Asn Lys Lys
100 105 110
Ala Val Arg Ala Phe Leu Leu Ser Lys Pro Thr His Glu Met Val Glu
115 120 125
Phe Met Met Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ser Glu
130 135 140
Asn Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp
145 150 155 160
Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Phe Met Arg Tyr
165 170 175
Ile Val Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Arg Phe Val Phe Arg Asn
180 185 190
His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met Lys
195 200 205
Met Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu Thr Leu
210 215 220
Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu Leu
225 230 235 240
Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg Ile Val
245 250 255
Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp
260 265 270
Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala Asn
275 280 285
Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala Glu
290 295 300
Pro Gln Pro Gln Leu Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Ile Asn Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Gly Gly Ala Gly Ala
325 330 335
Thr Glu Met Glu Ile Ala Arg Glu Thr Asn Phe Asp Gly Thr Asn Tyr
340 345 350
Leu Ala Ile Lys Pro Gly Leu Val Ile Gly Tyr Asp Arg Asn Glu Lys
355 360 365
Thr Asn Ala Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe His
370 375 380
Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser Met
385 390 395 400
Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> 唾液支原体
<400> 2
Met Ser Val Phe Ser Ser Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Lys Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ser Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Gln Glu Phe Val Ala Thr
50 55 60
Leu Lys Lys Glu Lys Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Thr
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Val Asp Gln Lys Thr Lys Asp Lys Leu Ile Asp
85 90 95
Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Thr Ala Glu Leu Lys Ala
100 105 110
Thr Val Lys Lys Phe Leu Lys Ser Phe Lys Glu Thr Arg Lys Leu Ile
115 120 125
Glu Val Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Lys Ala
130 135 140
Asp Arg Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Ile Phe Asn
180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met
195 200 205
Lys Met Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Ile Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala
290 295 300
Asn Pro Gln Pro Lys Asp Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Lys
305 310 315 320
Ser Ile Ile Gly Lys Glu Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly His His
325 330 335
Ala Thr Glu Ile Glu Val Ala Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ala Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro Phe
370 375 380
Lys Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210> 3
<211> 411
<212> PRT
<213> 泡沫支原体
<400> 3
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Gly Phe Val Ala Glu
50 55 60
Leu Lys Lys Gln Asn Val Asn Val Ile Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Glu Leu Ala Ser Lys Glu Ala Gln Ala Lys Leu Ile Glu
85 90 95
Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Asn Ala Glu Glu Ala Gln
100 105 110
Ala Val Arg Lys Phe Leu Ser Glu Arg Lys Ser Thr Arg Glu Met Val
115 120 125
Glu Tyr Met Met Ser Gly Leu Thr Lys Tyr Glu Leu Gly Leu Glu Ser
130 135 140
Ala Asp Arg Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr
145 150 155 160
Arg Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met
165 170 175
Lys Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ala Lys Phe Val Phe
180 185 190
Ser Asn His Pro Lys Leu Val Asn Thr Pro Arg Tyr Tyr Asp Pro Ser
195 200 205
Met Lys Leu Pro Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Glu
210 215 220
Thr Leu Val Val Gly Cys Ser Glu Arg Thr Glu Leu Glu Thr Ile Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Val Glu Phe Lys Arg
245 250 255
Ile Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp
260 265 270
Thr Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile
275 280 285
Ala Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly
290 295 300
Glu Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Glu Leu Leu
305 310 315 320
Ala Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Thr Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu
325 330 335
Gly Ala Thr His Ile Asp Val Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr
340 345 350
Asn Tyr Leu Ala Ile Ala Pro Ala Leu Ile Ile Gly Tyr Ser Arg Asn
355 360 365
Glu Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Lys Ala Gly Ile Thr Val Leu Pro
370 375 380
Phe His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met
385 390 395 400
Ser Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210> 4
<211> 410
<212> PRT
<213> 耳支原体
<400> 4
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Lys Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Glu Ala Arg Lys Glu His Lys Gln Phe Val Ala Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Val Ser Gln Glu Leu Lys Asp Lys Leu Ile Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Asp Asp Ser Tyr Pro Val Leu Thr Glu Glu His Lys Lys
100 105 110
Ala Val Arg Ser Phe Leu Lys Ser Arg Ser Ser Thr Arg Glu Leu Ile
115 120 125
Glu Tyr Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala
130 135 140
Glu Gly Asp Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Ile Phe Asp
180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Val Asn Thr Pro Arg Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu
195 200 205
Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Met Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Glu Thr Val Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro His Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Tyr Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ala
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Val Asn Glu Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Glu
305 310 315 320
Ser Ile Ile His Lys Lys Pro Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly
325 330 335
Ala Ser Gln Ile Asp Leu Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Val Leu Arg Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Ala Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Val Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
Tyr Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ser Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210> 5
<211> 410
<212> PRT
<213> 猪滑液支原体
<400> 5
Met Ser Val Phe Asn Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Asp Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Lys Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ser Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser Asn Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Glu Phe Val Glu Ile
50 55 60
Leu Lys Lys Glu Gly Val Asn Val Val Glu Leu Val Asp Leu Ile Ala
65 70 75 80
Glu Thr Ile Asp Leu Val Asp Ala Lys Lys Lys Glu Ala Leu Ile Asp
85 90 95
Glu Tyr Ile Glu Asp Ser Glu Pro Val Val Asp Ala Lys Val Lys Pro
100 105 110
Leu Val Lys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Lys Asp Thr Lys Glu Leu Val
115 120 125
Lys Leu Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Glu Ile Glu Ser
130 135 140
Glu Lys Glu Leu Ile Ile Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Arg
180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Thr Ser Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met
195 200 205
Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Asp Thr Ile Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Ile Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ser
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Lys Asp Asn Gly Leu Pro Leu Glu Lys Leu Leu Glu
305 310 315 320
Ser Ile Ile Gly Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Cys Cys
325 330 335
Ala Ser Asp Ile Glu Ile Ala Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Lys Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ala Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Lys Ala Leu Glu Lys Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
Lys Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210> 6
<211> 409
<212> PRT
<213> 泄殖腔支原体
<400> 6
Met Ser Val Phe Asp Lys Arg Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Gln Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Glu Phe Val Lys Ile
50 55 60
Leu Glu Ser Gln Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Ile Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Glu Leu Ala Ser Glu Glu Ala Lys Asp Asn Leu Ile Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Asp Glu Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Arg Ile
100 105 110
Leu Val Arg Asn Phe Leu Lys Gly Ile Thr Lys Thr Lys Glu Leu Val
115 120 125
Lys Met Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala
130 135 140
Asp Arg Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Ile Phe Glu
180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Val Ser Thr Pro Ile Tyr Tyr His Pro Ser Gln
195 200 205
Gly Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Ile Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Glu Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Asp
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Asp Asn Gly Leu Pro Leu Asn Glu Leu Leu Ala
305 310 315 320
Ser Ile Ile Gly Glu Glu Pro Val Leu Val Pro Ile Ala Gly Glu Gly
325 330 335
Ala Ser Lys Met Asp Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Lys Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
Lys Gly His Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Tyr Arg Lys Asp Val Lys
405
<210> 7
<211> 412
<212> PRT
<213> 产碱支原体
<400> 7
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly His Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ser Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Met
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Gln Phe Val Ala Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Asn Asn Val Asn Val Ile Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Lys Leu Ile Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu Asn Lys Ile
100 105 110
Ala Val Arg Asp Phe Leu Lys Ser Arg Lys Thr Thr Arg Glu Leu Ile
115 120 125
Glu Val Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Lys Asn
130 135 140
Cys Lys Cys Gln Asp Leu Val Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe
145 150 155 160
Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Ile Thr Ile His Tyr
165 170 175
Met Arg Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Ile
180 185 190
Phe Ala Asn His Pro Lys Leu Val Asn Thr Pro Ile Tyr Tyr His Pro
195 200 205
Ser Leu Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn
210 215 220
Asp Thr Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Glu Thr Ile
225 230 235 240
Thr Leu Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys
245 250 255
Arg Ile Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu
260 265 270
Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro
275 280 285
Ile Ala Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly
290 295 300
Gly Ala Glu Pro Lys Pro Val Glu Asn Gly Ser Ser Leu Glu Ala Ile
305 310 315 320
Leu Glu Ser Ile Ile His Lys Lys Pro Ile Leu Ile Pro Ile Gly Gly
325 330 335
Asp Ser Ala Ser Gln Ile Glu Val Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly
340 345 350
Thr Asn Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg
355 360 365
Asn Val Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Ile
370 375 380
Pro Phe His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys
385 390 395 400
Met Ser Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210> 8
<211> 410
<212> PRT
<213> 口腔支原体
<400> 8
Met Ser Val Phe Ser Asp Lys Phe Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Asp Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Lys Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser Thr Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Glu Phe Val Glu Ile
50 55 60
Leu Lys Lys Gln Gly Ile Asn Val Val Glu Leu Val Asp Leu Val Val
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asn Leu Val Asp Lys Lys Thr Gln Glu Lys Leu Leu Lys
85 90 95
Asp Phe Leu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Pro Glu His Arg Lys
100 105 110
Ala Val Glu Lys Phe Leu Lys Ser Leu Lys Ser Thr Lys Glu Leu Ile
115 120 125
Gln Tyr Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Lys Ala
130 135 140
Asp Lys Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Lys Phe Ile Phe Thr
180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Val Lys Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ala Met
195 200 205
Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Glu Thr Ile Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ser
290 295 300
Asn Pro Glu Pro Val Val Asn Gly Leu Pro Leu Asp Lys Leu Leu Glu
305 310 315 320
Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Val Leu Ile Pro Ile Ala Gly Lys Gly
325 330 335
Ala Thr Glu Ile Glu Thr Ala Val Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Lys Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Val
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Asn Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
Lys Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210> 9
<211> 401
<212> PRT
<213> 惰性支原体
<400> 9
Met Ser Lys Ile Asn Val Tyr Ser Glu Ile Gly Val Leu Lys Glu Val
1 5 10 15
Leu Val His Thr Pro Gly Asp Glu Ile Arg Arg Ile Ala Pro Ser Arg
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Glu Pro Ser Ala Ala Ile
35 40 45
Gln Glu His Lys Ser Phe Leu Lys Ile Leu Gln Asp Arg Gly Ile Lys
50 55 60
Thr Ile Gln Leu Ser Asp Leu Val Ala Glu Thr Tyr Lys His Tyr Ala
65 70 75 80
Ser Glu Ala Glu Lys Glu Ala Phe Ile Glu Lys Tyr Leu Asp Glu Ala
85 90 95
Thr Pro Val Leu Ser Lys Asp Met Arg Ala Lys Val Lys Asn Tyr Ile
100 105 110
Leu Ser Met Gln Gly Glu Pro Val Lys Met Val Arg Thr Met Met Ala
115 120 125
Gly Val Ser Lys Gln Glu Leu Asn Val Glu Ser Glu Val Glu Leu Ile
130 135 140
Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser
145 150 155 160
Ala Gly Asn Gly Ile Ser Leu Asn Asn Met Lys Tyr Val Val Arg Lys
165 170 175
Arg Glu Thr Ile Phe Ala Glu Phe Ile Phe Ser Ile His Pro Glu Tyr
180 185 190
Lys Lys Thr Pro His Trp Phe Asp Arg Leu Asp Asn Gly Ser Ile Glu
195 200 205
Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Lys Asp Thr Leu Val Ile Gly Val
210 215 220
Ser Glu Arg Thr Asn Lys Glu Ala Ile Ile Thr Ile Ala Lys His Ile
225 230 235 240
Gln Asp Asn Lys Glu Ala Gln Phe Lys Lys Ile Val Ala Ile Asn Val
245 250 255
Pro Pro Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Val
260 265 270
Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val Leu Lys
275 280 285
Val Trp Glu Ile Asp Leu Ser Lys Pro Ile Glu Met Val Glu Thr Asn
290 295 300
Lys Pro Leu Ala Glu Val Leu Glu Ser Ile Ile Gly Glu Lys Pro Ile
305 310 315 320
Leu Ile Pro Ile Ala Gly Lys Asp Ala Thr Gln Leu Asp Ile Asp Ile
325 330 335
Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Ala Pro Gly Val
340 345 350
Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Val Lys Thr Glu Ala Ala Leu Arg Ala
355 360 365
Ala Gly Val Thr Val Leu Ser Phe Glu Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly
370 375 380
Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Val Arg Glu Asp Val
385 390 395 400
Lys
<210> 10
<211> 401
<212> PRT
<213> 鸡支原体
<400> 10
Met Ser Lys Ile Arg Val Tyr Ser Glu Ile Gly Asn Leu Lys Lys Val
1 5 10 15
Leu Val His Thr Pro Gly Asp Glu Ile Arg Arg Ile Ser Pro Ser Arg
20 25 30
Leu Glu Glu Leu Leu Phe Ser Ala Val Leu Glu Pro Asn Ala Ala Ile
35 40 45
Glu Glu His Lys Arg Phe Val Lys Leu Leu Glu Asp Arg Gly Ile Gln
50 55 60
Ala Ile Gln Leu Ser Asp Leu Val Ala Glu Thr Tyr Val Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Thr Ala Glu Gln Lys Ala Ala Phe Ile Glu Lys Tyr Leu Asp Glu Ala
85 90 95
Thr Pro Ala Leu Ser Ala Glu Asn Arg Glu Arg Ala Lys Lys Tyr Ile
100 105 110
Leu Ser Leu Glu Met Gln Pro Val Lys Met Ile Arg Thr Met Met Ala
115 120 125
Gly Leu Ser Lys Tyr Glu Leu Asn Val Glu Ser Asn Ile Glu Leu Ile
130 135 140
Ile Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser
145 150 155 160
Ala Gly Asn Gly Ile Ser Leu Asn Asn Met Lys Tyr Val Val Arg Lys
165 170 175
Arg Glu Thr Ile Phe Ala Glu Phe Ile Phe Ala Ile His Pro Glu Tyr
180 185 190
Lys Glu Thr Pro His Trp Phe Asp Arg Leu Asp His Gly Ser Ile Glu
195 200 205
Gly Gly Asp Val Phe Val Tyr Asn Lys Asp Thr Leu Val Ile Gly Val
210 215 220
Ser Glu Arg Thr Asn Lys Glu Ala Ile Ile Thr Ile Ala Lys His Ile
225 230 235 240
Gln Asp Asn Lys Glu Ala Glu Phe Lys Lys Ile Val Ala Ile Asn Val
245 250 255
Pro Pro Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Val
260 265 270
Asp Lys Asn Lys Phe Ile Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val Leu Lys
275 280 285
Ile Trp Glu Ile Asp Leu Ala Lys Pro Ile Glu Met Val Glu Ser Asn
290 295 300
Lys Ser Leu Thr Glu Val Leu Glu Ser Ile Ile Gly Glu Lys Pro Ile
305 310 315 320
Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly Ala Ser Gln Leu Asp Ile Asp Ile
325 330 335
Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Ala Pro Gly Val
340 345 350
Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Glu Lys Thr Glu Lys Ala Leu Lys Ala
355 360 365
Ala Gly Ile Thr Val Leu Ser Phe Glu Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly
370 375 380
Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Val Arg Glu Asp Val
385 390 395 400
Lys
<210> 11
<211> 405
<212> PRT
<213> 梨支原体
<400> 11
Met Asn Ser Asn Gln Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Lys
1 5 10 15
Leu Lys Glu Val Leu Val His Arg Pro Gly Arg Glu Leu Asp Phe Leu
20 25 30
Asp Pro Thr Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ala Ala Thr Leu Glu Ala
35 40 45
Glu Thr Ala Arg Leu Glu His Asp Asn Phe Thr Asn Ala Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gly Val Thr Val Ile Glu Leu Ala Asp Leu Val Ala Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ser Ser Ser Thr Pro Thr Ile Lys Ala Ala Phe Ile Asn Lys Tyr Leu
85 90 95
Asp Glu Ala Thr Pro Ala Leu Thr Thr Lys Leu Arg Thr Leu Val Lys
100 105 110
Asp Phe Leu Thr Lys Gln Lys Ser Val Arg Lys Met Val Asp Tyr Met
115 120 125
Ile Gly Gly Ile Leu Ser Thr Asp Leu Asn Ile Lys Gly Lys Pro Glu
130 135 140
Leu Ile Val Glu Pro Met Pro Asn Ala Tyr Phe Thr His Asp Pro Phe
145 150 155 160
Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Leu His Tyr Met Lys His Asn Val
165 170 175
Arg Arg Arg Glu Val Leu Phe Ser Glu Phe Ile Phe Asn Asn Asn Glu
180 185 190
Arg Phe Gln Asn Thr Pro Arg Tyr Ile Val Pro Thr Lys Gly Leu Asp
195 200 205
Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Val Tyr Asn Lys Asn Thr Leu Val Val
210 215 220
Gly Val Ser Glu Arg Thr Lys Met Val Thr Ile Lys Glu Leu Ala Lys
225 230 235 240
Asn Ile Leu Lys Asn Lys Glu Cys Leu Phe Lys Lys Ile Tyr Ala Ile
245 250 255
Asn Val Pro Lys Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr
260 265 270
Met Leu Asp His Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val
275 280 285
Leu Lys Ile Trp Glu Ile Asp Ile Ser Ser Gly Lys Ser Ile Ser Ser
290 295 300
Pro Lys Glu Leu Asn Met Asp Leu Ser Lys Ala Leu Ser Ile Ile Ile
305 310 315 320
Gly Lys Lys Pro Ile Leu Ile Pro Val Ala Gly Glu Asn Ala Ser Gln
325 330 335
Ile Asp Ile Asn Ile Glu Thr Asn Phe Asp Ala Thr Asn Tyr Leu Val
340 345 350
Thr Gln Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Lys Lys Thr Glu
355 360 365
Ala Ala Leu Ile Lys Ala Gly Ile Glu Val Ile Pro Phe Gln Gly Asn
370 375 380
Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu
385 390 395 400
Ile Arg Glu Asp Val
405
<210> 12
<211> 404
<212> PRT
<213> 灵长类支原体
<400> 12
Met Ser Lys Ser Lys Ile Asn Val Tyr Ser Glu Tyr Gly Asn Leu Lys
1 5 10 15
Glu Val Leu Val His Thr Pro Gly Asp Glu Ile Arg Arg Ile Thr Pro
20 25 30
Ser Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Glu Pro Lys Ser
35 40 45
Ala Ile Ala Glu His Lys Ser Phe Cys Gln Ile Leu Lys Asp Asn Lys
50 55 60
Val Lys Ala Ile Gln Leu Asp Glu Leu Val Ala Ala Thr Tyr Lys Gly
65 70 75 80
Val Ser Glu Ser Val Gln Asn Ser Phe Val Glu Arg Trp Leu Asp Glu
85 90 95
Cys Glu Pro Lys Leu Glu Asn Asn Val Arg Pro Ile Val Lys Glu Tyr
100 105 110
Leu Leu Lys Ala Ala Glu Gln Ser Val Lys Lys Met Ile Arg Ile Met
115 120 125
Met Ala Gly Ile Asp Lys Arg Glu Ile Gly Val Glu Ser Glu Val Asp
130 135 140
Phe Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe
145 150 155 160
Ala Ser Val Gly Asn Gly Ile Thr Leu His His Met Lys Tyr Val Val
165 170 175
Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Glu Phe Ile Phe Asp Asn His Pro
180 185 190
Asp Tyr Lys Phe Val Pro Arg Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Glu Gly Lys
195 200 205
Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Ser Lys Thr Leu Val Val
210 215 220
Gly Ile Ser Glu Arg Thr Asn Lys Asp Ala Ile Arg Ile Val Ala Lys
225 230 235 240
Lys Ile Gln Ala Asn Ala Asp Ala Lys Phe Glu Lys Ile Phe Ala Ile
245 250 255
Asn Val Pro Pro Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr
260 265 270
Met Leu Asp Ser Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val
275 280 285
Leu Lys Val Trp Glu Ile Asn Leu Asp Asp Pro Ala Leu Glu Trp Lys
290 295 300
Glu Ile Ser Gly Ser Leu Glu Glu Ile Leu Thr Tyr Ile Ile Gly Lys
305 310 315 320
Lys Pro Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly Lys Gly Ala Ser Gln Phe Glu
325 330 335
Ile Asp Ile Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Ala Ile Ala
340 345 350
Pro Ser Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu Leu Thr Glu Lys Ala
355 360 365
Leu Lys Lys Ala Gly Val Lys Val Leu Ser Leu Asp Gly Asn Gln Leu
370 375 380
Ser Leu Gly Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ile Arg
385 390 395 400
Glu Asp Val Lys
<210> 13
<211> 401
<212> PRT
<213> 产脂支原体
<400> 13
Met Ser Lys Ile Asn Val Tyr Ser Glu Val Gly Val Leu Lys Glu Val
1 5 10 15
Leu Val His Thr Pro Gly Asp Glu Ile Arg Arg Val Ala Pro Ser Arg
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Glu Pro Gln Asp Ala Ile
35 40 45
Ala Glu His Lys Arg Phe Ile Lys Ile Leu Glu Asp Asn Asn Ile Lys
50 55 60
Val Ile Gln Leu Asp Glu Leu Val Ser Glu Thr Trp Glu Lys Ala Thr
65 70 75 80
Ala Glu Gln Arg Asp Ala Phe Ile Glu Lys Trp Leu Asp Glu Ala Glu
85 90 95
Pro Val Leu Asp Ala Lys Leu Arg Glu Thr Val Lys Lys Tyr Leu Leu
100 105 110
Ser Leu Asn Pro Val Lys Lys Met Val Arg Thr Met Met Ala Gly Ile
115 120 125
Asp Lys Lys Glu Leu Lys Ile Glu Leu Asp Arg Asp Leu Val Val Asp
130 135 140
Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Ala Gly
145 150 155 160
Asn Gly Ile Ser Leu Asn Asn Met Lys Tyr Val Thr Arg Lys Arg Glu
165 170 175
Thr Ile Phe Ala Glu Phe Ile Phe Asn Ile His Pro Asp Tyr Lys Thr
180 185 190
Thr Pro His Trp Phe Asp Arg Leu Asp Lys Gly Asn Ile Glu Gly Gly
195 200 205
Asp Val Phe Ile Tyr Asn Lys Asp Thr Leu Val Leu Gly Val Ser Glu
210 215 220
Arg Thr Asn Lys Asp Ala Val Met Thr Ile Ala Lys His Ile Gln Ser
225 230 235 240
Asn Glu Gln Ala Lys Phe Lys Lys Leu Val Ala Ile Asn Val Pro Pro
245 250 255
Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Val Asp His
260 265 270
Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val Leu Lys Ile Trp
275 280 285
Glu Ile Asp Leu Thr Pro Gly Lys Glu Ile Glu Met Val Glu Ser Thr
290 295 300
Lys Ser Leu Ser Asp Met Leu Glu Ser Ile Ile Gly Lys Lys Pro Val
305 310 315 320
Leu Ile Pro Ile Ala Gly Lys Asp Ala Ser Gln Leu Asp Ile Asp Ile
325 330 335
Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Arg Pro Gly Val
340 345 350
Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Cys Leu Thr Glu Gln Ala Leu Lys Asp
355 360 365
Ala Gly Val Thr Val Leu Ser Phe Asp Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly
370 375 380
Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Val Arg Glu Asp Ile
385 390 395 400
Lys
<210> 14
<211> 405
<212> PRT
<213> 气管支原体
<400> 14
Met Asn Lys Ile Asn Val Tyr Ser Glu Ile Gly Lys Leu Lys Glu Val
1 5 10 15
Leu Val His Thr Pro Gly Asn Glu Ile Arg Arg Ile Ser Pro Ser Arg
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Leu Leu Glu Pro Asn Phe Ala Ala
35 40 45
Lys Glu His Thr Ala Phe Cys Glu Ile Leu Lys Glu Asn Gly Ile Lys
50 55 60
Ala Ile Gln Leu Val Asp Leu Val Ser Asp Thr Trp Arg Ile Ala Ser
65 70 75 80
Glu Lys Ala Lys Thr Glu Phe Ile Glu Arg Trp Leu Asp Glu Cys Glu
85 90 95
Pro Lys Leu Asp Ser Asn Leu Arg Glu Ile Val Arg Lys His Ile Tyr
100 105 110
Ala Ile Glu Lys Arg Ser Val Lys Arg Met Val Lys Thr Met Met Ala
115 120 125
Gly Ile Glu Arg Arg Glu Leu Pro Val Thr Ser Lys Glu Val Ala Arg
130 135 140
Glu Leu Val Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro
145 150 155 160
Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Ile Ser Leu His His Met Lys Tyr Val
165 170 175
Thr Arg Gln Arg Glu Thr Ile Phe Ala Glu Phe Val Phe Gly Asn His
180 185 190
Pro Asp Tyr Ile Asp Thr Pro Arg Trp Phe Asp Arg Ser Asp Asp Gly
195 200 205
Arg Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Gly Ser Lys Thr Leu Val
210 215 220
Ile Gly Val Ser Glu Arg Thr Asn Lys Glu Ala Ile Lys Val Met Ala
225 230 235 240
Lys Lys Ile Gln Ala Asn Lys Glu Ala Thr Phe Glu Lys Ile Tyr Ala
245 250 255
Ile Asn Val Pro Pro Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu
260 265 270
Thr Met Leu Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ala
275 280 285
Val Leu Gln Val Trp Glu Ile Asp Leu Lys Asp Pro Glu Leu Thr Trp
290 295 300
His Glu Leu Ser Gly Ser Leu Glu Glu Ile Leu His Lys Ile Ile Gly
305 310 315 320
Arg Lys Pro Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly His Gly Ala Gln Gln Ile
325 330 335
Asp Ile Asp Ile Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Ala Ile
340 345 350
Ala Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Asn Arg Asn Val Leu Thr Glu Arg
355 360 365
Ala Leu Lys Lys Ala Gly Ile Lys Val Leu Ser Phe Glu Gly Asn Gln
370 375 380
Leu Ser Leu Gly Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ile
385 390 395 400
Arg Glu Asn Leu Lys
405
<210> 15
<211> 404
<212> PRT
<213> 模仿支原体
<400> 15
Met Phe Asn Lys Ile Lys Val Tyr Ser Glu Ile Gly Arg Leu Arg Lys
1 5 10 15
Val Leu Val His Thr Pro Gly Lys Glu Leu Glu Tyr Val Thr Pro Gln
20 25 30
Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ser Leu Leu Asn Pro Val Lys Ala
35 40 45
Arg Gln Glu His Glu Ala Phe Ile Lys Ile Leu Gln Asp Gln Gly Val
50 55 60
Glu Cys Val Gln Leu Thr Thr Leu Thr Ala Gln Thr Phe Gln Ser Ala
65 70 75 80
Thr Ser Glu Val Lys Glu Lys Phe Ile Asn Arg Trp Leu Asp Glu Cys
85 90 95
Leu Pro Lys Leu Ser Asp Asp Asn Arg Ile Lys Val Tyr Ala Tyr Leu
100 105 110
Lys Asp Leu Ser Ser Asp Pro Glu Val Met Ile Arg Lys Met Met Ser
115 120 125
Gly Ile Leu Ala Lys Glu Val Asn Val Gln Ser Asp Val Glu Leu Ile
130 135 140
Ala Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser
145 150 155 160
Ile Gly Lys Gly Val Thr Leu His Ser Met Phe His Pro Thr Arg Lys
165 170 175
Arg Glu Thr Ile Phe Ala Asp Phe Val Phe Ser His His Pro Glu Tyr
180 185 190
Lys Gln Thr Pro Lys Tyr Tyr Ser Arg Leu Asn Glu Tyr Ser Ile Glu
195 200 205
Gly Gly Asp Leu Phe Val Tyr Asp Asp Lys Thr Leu Val Ile Gly Val
210 215 220
Ser Glu Arg Thr Glu Lys Lys Ala Ile Gln Phe Leu Ala Glu Lys Leu
225 230 235 240
Arg Glu Asn Tyr Glu Thr Thr Phe Glu Lys Ile Tyr Ala Ile Asn Val
245 250 255
Pro Lys Met Ser Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu
260 265 270
Asp Tyr Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Met Gly Val Leu Lys
275 280 285
Ile Trp Glu Ile Asp Leu Thr His Glu Gln Leu Ser Trp Arg Glu Leu
290 295 300
Asn Glu Ser Leu Glu Glu Phe Leu Ser Met Val Ile Gly Lys Lys Ala
305 310 315 320
Thr Thr Ile Pro Val Ala Gly Glu Asp Ser Thr Gln Ile Glu Ile Asp
325 330 335
Val Glu Thr Asn Phe Asp Ala Thr Asn Phe Leu Val Ile Gln Pro Gly
340 345 350
Val Val Val Gly Tyr Asp Arg Asn Tyr Lys Thr Asn Gln Ala Leu Val
355 360 365
Asn Ala Gly Ile Lys Val Leu Ser Trp Asn Gly Asp Gln Leu Ser Leu
370 375 380
Gly Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Tyr Arg Asp Pro
385 390 395 400
Ile Lys Lys Gly
<210> 16
<211> 401
<212> PRT
<213> 乳白色支原体
<400> 16
Met Ser Lys Ile Asn Val Tyr Ser Glu Ile Gly Thr Leu Lys Glu Val
1 5 10 15
Leu Val His Thr Pro Gly Asp Glu Ile Arg Arg Val Ala Pro Ala Arg
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Glu Pro Asn His Ala Ile
35 40 45
Ala Glu His Lys Ala Phe Ile Lys Ile Leu Glu Asp Asn Gly Ile Lys
50 55 60
Val Ile Gln Leu Asp Glu Leu Val Val Gln Thr Trp Asn Gln Val Asp
65 70 75 80
Glu Ala Thr Arg Lys Ala Phe Val Thr Lys Trp Leu Asp Glu Cys Glu
85 90 95
Pro Lys Leu Glu Ser Asn Val Arg Val Glu Val Glu Lys Tyr Ile Tyr
100 105 110
Ser Leu Ala Lys Glu Pro Lys Lys Met Val Arg Thr Met Met Ala Gly
115 120 125
Ile Ser Lys Glu Glu Leu Pro Leu Asn Val Asn Arg Pro Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Val
145 150 155 160
Gly Thr Gly Ile Ser Leu His His Met Lys Tyr Val Thr Arg Gln Arg
165 170 175
Glu Thr Ile Phe Ala Gln Phe Val Phe Asp Asn His Lys Asp Tyr Asn
180 185 190
Thr Val Pro Arg Trp Phe Asp Asn Lys Asp Gln Gly Arg Ile Glu Gly
195 200 205
Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Val Ile Gly Val Ser
210 215 220
Glu Arg Thr Asp Lys Asp Ala Ile Lys Ile Met Ala Lys Lys Ile Gln
225 230 235 240
Ala Asp Lys Asn Cys Lys Phe Glu Lys Ile Phe Ala Ile Asn Val Pro
245 250 255
Pro Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Val Asp
260 265 270
Arg Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val Leu Lys Val
275 280 285
Trp Glu Ile Asp Leu Lys Asp Ala Ser Leu Ala Trp Lys Glu Ile Glu
290 295 300
Gly Ser Leu Ser Gln Ile Leu Glu Lys Ile Ile Gly Glu Lys Pro Ile
305 310 315 320
Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Asn Ala Ser Gln Leu Asp Ile Asp Ile
325 330 335
Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Ala Pro Gly Val
340 345 350
Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Val Lys Thr Glu Gln Ala Leu Lys Ala
355 360 365
Ala Gly Val Lys Val Leu Ser Phe Glu Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly
370 375 380
Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ile Arg Glu Asp Leu
385 390 395 400
Lys
<210> 17
<211> 431
<212> PRT
<213> 毛氏支原体
<400> 17
Met Gly Ile Lys Lys Ile Met Lys Lys Asn Ala Ile Asn Val Tyr Ser
1 5 10 15
Glu Ile Gly Lys Leu Lys Lys Val Leu Val His Arg Pro Gly Asp Glu
20 25 30
Leu Lys Tyr Val Thr Pro Gln Arg Met Asp Glu Leu Leu Met Ser Ala
35 40 45
Ile Ile Glu Leu Glu Gln Ala Lys Glu Glu His Asp Ala Phe Thr Lys
50 55 60
Ile Leu Arg Asp Asn Gly Val Glu Val Ile Glu Leu Ala Asp Leu Thr
65 70 75 80
Ala Glu Met Tyr Asp Ser Leu Thr Pro Ser Glu Lys Asp Ala Phe Leu
85 90 95
Asn Gln Trp Val Lys Glu Ala Ser Trp Gly Lys Lys Ser Ser Ile Asp
100 105 110
Ala Leu Lys Ile Lys Lys Asn Leu Ser Lys Lys Val Phe Asp Tyr Val
115 120 125
Lys Ser Ile Lys Pro Thr Arg Lys Met Ile Asp Lys Leu Met Ala Gly
130 135 140
Val Leu Leu Ser Glu Ile Gly Glu Lys Ser Ile Ile Leu Asn Lys Asp
145 150 155 160
Lys Lys Asn Glu Met Val Ile Asp Leu Val Val Asp Pro Met Pro Asn
165 170 175
Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Ile Thr
180 185 190
Leu His Asn Met Lys Tyr Pro Thr Arg Lys Arg Glu Thr Ile Phe Ala
195 200 205
Gln Trp Ile Phe Asn Lys His Pro Glu Tyr Lys Asp Val Pro Gln Phe
210 215 220
Ile Ser Lys Arg Asp Gly Lys Glu Thr Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe
225 230 235 240
Ile Tyr Thr Lys Asp Val Leu Ala Ile Gly Val Ser Glu Arg Thr Asn
245 250 255
Met Glu Ala Ile Leu Arg Ile Ala Thr Asn Ile Lys Lys Asp Lys Asn
260 265 270
Cys Glu Phe Lys Lys Ile Val Ala Ile Asn Val Pro Pro Met Gly Asn
275 280 285
Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Leu Phe
290 295 300
Leu Tyr Ser Gly Asn Ile Lys Ser Ala Leu Lys Val Trp Glu Ile Asp
305 310 315 320
Leu Thr Lys Pro Ile Thr Pro Lys Ser Pro Lys Leu Ser Thr Ala Lys
325 330 335
Leu Ala Asp Ile Leu Ala Lys Ile Val Gly Lys Lys Val Arg Met Ile
340 345 350
Pro Ile Gly Gly Lys Asp Gly Asn Gln Met Asp Ile Asp Ile Glu Thr
355 360 365
His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Val
370 375 380
Gly Tyr His Arg Asn Arg Lys Thr Gln Lys Ala Leu Glu Glu Ala Gly
385 390 395 400
Val Lys Val Leu Ala Phe Gln Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly
405 410 415
Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Val Arg Glu Glu Val Lys
420 425 430
<210> 18
<211> 399
<212> PRT
<213> 象支原体
<400> 18
Met Ser Gln Ile Asn Val Phe Ser Glu Ile Gly Gln Leu Lys Glu Val
1 5 10 15
Leu Val His Thr Pro Gly Asp Glu Ile Arg Arg Ile Ser Pro Lys Arg
20 25 30
Tyr Asn Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Glu Ala Asp Val Ala Ile
35 40 45
Lys Glu His Lys Ser Phe Val Lys Ile Leu Glu Glu Asn Asn Val Lys
50 55 60
Val Ile Gln Leu Lys Asp Ile Leu Leu Glu Thr Trp Asn Ile Cys Ser
65 70 75 80
Lys Glu Ala Lys Asn Ile Phe Ile Asn Lys Trp Ile Glu Glu Ala Gln
85 90 95
Pro Val Ile His Ser Ser Ser Leu Lys Glu Lys Ile Lys Leu Phe Leu
100 105 110
Lys Ser Lys Thr Pro Leu Glu Ile Ile Asp Ile Met Met Lys Gly Ile
115 120 125
Leu Lys Gln Glu Leu Gly Ile Glu Tyr Lys His Glu Leu Ile Ile Asp
130 135 140
Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Thr Ser Met Gly
145 150 155 160
Ser Gly Ile Thr Ile Asn Asn Met Lys Tyr Gln Thr Arg Lys Arg Glu
165 170 175
Thr Ile Phe Ser Glu Phe Ile Phe Asn Asn His Pro Lys Tyr Lys Asn
180 185 190
Thr Pro Arg Trp Phe Asp Arg Phe Asp Ser Gly Asn Ile Glu Gly Gly
195 200 205
Asp Leu Phe Val Tyr Thr Lys Glu Thr Ile Val Val Gly Val Ser Glu
210 215 220
Arg Thr Lys Lys Lys Ala Ile Leu Lys Ile Ala Lys Asn Ile Gln Glu
225 230 235 240
Asn Asn Asn Ser Phe Lys Lys Ile Val Val Ile Lys Val Pro Ile Met
245 250 255
Gln Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Ile Val Met Val Asp Phe Asp
260 265 270
Lys Phe Ile Tyr Ser Pro Asn Val Thr Lys Ser Leu Lys Phe Trp Glu
275 280 285
Ile Asp Leu Thr Lys Lys Pro Lys Phe Ile Gln Leu Lys Asn Glu Thr
290 295 300
Leu Glu Asp Val Leu Tyr Arg Val Ile Gly Lys Lys Pro Ile Leu Ile
305 310 315 320
Pro Val Ala Gly Glu Asn Ala Asn Gln Ile Asp Ile Asp Val Glu Thr
325 330 335
His Phe Asp Ala Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Arg Pro Gly Val Val Val
340 345 350
Gly Tyr Ser Arg Asn Lys Lys Thr Glu Glu Ala Leu Ile Asn Ala Gly
355 360 365
Val Lys Val Tyr Ala Phe Glu Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly
370 375 380
Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ile Arg Glu Asp Ile Ile
385 390 395
<210> 19
<211> 399
<212> PRT
<213> 龟支原体
<400> 19
Met Lys Asn Ile Asn Val Tyr Ser Glu Val Gly Lys Leu Lys Glu Val
1 5 10 15
Val Val His Thr Pro Gly Glu Glu Leu His Asn Val Ala Pro Ser Arg
20 25 30
Leu Gln Glu Leu Leu Thr Ser Ala Val Leu Glu Pro Glu Val Ala Arg
35 40 45
Lys Glu His Leu Lys Phe Ile Lys Ile Leu Asn Asp Tyr Gly Val Lys
50 55 60
Val Ile Gln Ile Val Asp Leu Ile Thr Glu Thr Tyr Glu Ala Val Asp
65 70 75 80
Ser Asn Lys Lys Glu Ala Phe Ile Asn Asn Trp Leu Asp Asn Ser Val
85 90 95
Pro Lys Leu Thr Asp Lys Asn Arg Met Ile Leu Arg Asn Tyr Leu Thr
100 105 110
Gln Phe Ser Thr Lys Ala Met Ile Arg Lys Met Ile Ser Gly Ile Arg
115 120 125
Ala Lys Glu Leu Asn Leu Lys Thr Pro Ser Ala Leu Leu Val Asp Pro
130 135 140
Met Pro Asn Leu Cys Phe Ala Arg Asp Thr Phe Ala Cys Val Gly Ser
145 150 155 160
Ala Ile Ser Leu Ser Thr Met Lys His Pro Thr Arg Arg Arg Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Thr Glu Phe Ile Phe Gln Asn His Pro Lys Tyr Lys Asp Val
180 185 190
Ile Lys Tyr Phe Asp Ser Lys Asn Ser Lys Ala Thr Ile Glu Gly Gly
195 200 205
Asp Ile Phe Val Tyr Asn Pro Lys Thr Leu Val Val Gly Asn Ser Glu
210 215 220
Arg Thr Asn Met Gln Ala Cys Leu Leu Leu Ala Lys Lys Ile Gln Ser
225 230 235 240
Asn Pro Asn Asn Lys Phe Glu Lys Ile Val Ile Val Asn Val Pro Pro
245 250 255
Leu Pro His Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Val Asp Tyr
260 265 270
Asp Lys Phe Ile Tyr Ser Pro Asn Ile Leu His Thr Leu Lys Phe Trp
275 280 285
Val Ile Asp Leu Lys Lys Arg Lys Leu Glu Ala Val Glu Lys His Asn
290 295 300
Thr Leu Lys Ala Met Leu Arg Met Ile Ile Lys Lys Glu Pro Ile Leu
305 310 315 320
Ile Pro Val Gly Asp Val Gly Ala Asp Gln Leu Asp Ile Asp Leu Glu
325 330 335
Thr His Phe Asp Ala Thr Asn Tyr Leu Ala Leu Ala Pro Gly Val Val
340 345 350
Val Gly Tyr Asp Arg Asn Ile Lys Thr Gln Arg Ala Leu Glu Lys Ala
355 360 365
Gly Val Lys Val Leu Ser Phe Ser Gly Asn Gln Leu Ser Leu Ala Met
370 375 380
Gly Ser Ala Arg Cys Leu Ser Met Pro Leu Ile Arg Glu Glu Asn
385 390 395
<210> 20
<211> 410
<212> PRT
<213> 加拿大支原体
<400> 20
Met Ser Val Phe Asp Ser Lys Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Glu Ser Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Lys Glu His Lys Gln Phe Val Ser Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Asn Asp Ile Asn Val Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Lys Asp Lys Leu Ile Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Glu Asp Ser Glu Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Ala
100 105 110
Ile Val Arg Lys Tyr Leu Lys Gly Ile Gln Pro Thr Arg Lys Leu Ile
115 120 125
Glu Met Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala
130 135 140
Asp His Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Val Phe Ser
180 185 190
Asn His Pro Lys Leu Val Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asp Pro Ser Leu
195 200 205
Lys Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Val Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Val Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Val Ala Asn Lys Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Lys Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Ser
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Glu Asn Gly Leu Pro Leu Glu Gly Leu Leu Glu
305 310 315 320
Ser Ile Ile Asn Lys Lys Pro Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Gly
325 330 335
Ala Ser Gln Met Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Arg Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
His Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ser Arg Lys Asp Val Lys Trp
405 410
<210> 21
<211> 409
<212> PRT
<213> 鹅支原体
<400> 21
Met Ser Val Phe Asp Lys Arg Phe Lys Gly Ile His Val Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Ile Gly Glu Leu Gln Thr Val Leu Val His Glu Pro Gly Arg Glu Ile
20 25 30
Asp Tyr Ile Thr Pro Ala Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile
35 40 45
Leu Glu Ser His Asp Ala Arg Ala Glu His Lys Lys Phe Val Ala Thr
50 55 60
Leu Lys Glu Gln Gly Ile Asn Thr Val Glu Leu Thr Asp Leu Val Ala
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ala Arg Asp Asn Leu Leu Glu
85 90 95
Glu Phe Leu Asp Asp Ser Ala Pro Val Leu Ser Glu Glu His Lys Glu
100 105 110
Ile Val Arg Thr Tyr Leu Lys Gly Ile Lys Gly Thr Arg Lys Leu Ile
115 120 125
Glu Thr Met Met Ala Gly Ile Thr Lys Tyr Asp Leu Gly Ile Glu Ala
130 135 140
Glu Gln Glu Leu Ile Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg
145 150 155 160
Asp Pro Phe Ala Ser Val Gly Asn Gly Val Thr Ile His Tyr Met Arg
165 170 175
Tyr Lys Val Arg Gln Arg Glu Thr Leu Phe Ser Arg Phe Ile Phe Ser
180 185 190
Asn His Pro Gln Leu Val Asn Thr Pro Trp Tyr Tyr Asn Pro Ala Glu
195 200 205
Gly Leu Ser Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Asn Asp Thr
210 215 220
Leu Val Val Gly Val Ser Glu Arg Thr Asp Leu Gln Thr Ile Thr Leu
225 230 235 240
Leu Ala Lys Asn Ile Lys Ala Asn Glu Glu Cys Glu Phe Lys Arg Ile
245 250 255
Val Ala Ile Asn Val Pro Lys Trp Thr Asn Leu Met His Leu Asp Thr
260 265 270
Trp Leu Thr Met Leu Asp Thr Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Ile Ala
275 280 285
Asn Asp Val Phe Lys Phe Trp Asp Tyr Asp Leu Val Asn Gly Gly Asp
290 295 300
Glu Pro Gln Pro Val Asp Asn Gly Leu Pro Leu Asn Glu Leu Leu Lys
305 310 315 320
Ser Ile Ile Gly Glu Glu Pro Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly Asp Gly
325 330 335
Ala Thr Gln Ile Glu Ile Glu Arg Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Ala Ile Ala Pro Gly Val Val Ile Gly Tyr Ser Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe
370 375 380
Lys Gly His Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Asn Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Tyr Arg Lys Asp Val Lys
405
<210> 22
<211> 401
<212> PRT
<213> 火鸡支原体
<400> 22
Met Ser Lys Ile Asn Val Tyr Ser Glu Ile Gly Val Leu Lys Glu Val
1 5 10 15
Leu Val His Thr Pro Gly Asp Glu Ile Arg Arg Ile Ser Pro Ser Arg
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Gln Pro Glu Gln Ala Ile
35 40 45
Lys Glu His Gln Ser Phe Val Lys Ile Leu Gln Asp Arg Gly Ile Lys
50 55 60
Val Ile Gln Leu Ser Asp Leu Val Ala Glu Thr Tyr Val Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Thr Ser Lys Glu Lys Glu Ser Phe Ile Glu Lys Trp Leu Asp Glu Ala
85 90 95
Thr Pro Ala Leu Asn Ser Glu Asn Arg Ala Arg Val Lys Asn Tyr Ile
100 105 110
Thr Ala Met Gln Gly Gln Pro Val Lys Met Val Arg Ala Met Met Ala
115 120 125
Gly Val Ser Lys Gln Glu Leu Asn Ile Glu Ser Asp Val Glu Leu Ile
130 135 140
Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser
145 150 155 160
Ala Gly Asn Gly Ile Ser Leu Asn Asn Met Lys Tyr Val Val Arg Lys
165 170 175
Arg Glu Thr Ile Phe Ala Glu Phe Ile Phe Ser Ile His Pro Glu Tyr
180 185 190
Lys Gln Thr Pro His Trp Phe Asp Arg Leu Asp Lys Gly Asn Ile Glu
195 200 205
Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Asn Lys Asp Thr Leu Val Ile Gly Val
210 215 220
Ser Glu Arg Thr Asn Lys Glu Ala Ile Leu Thr Ile Ala Glu His Ile
225 230 235 240
Lys Asn Asn Lys Glu Ala Lys Phe Lys Lys Ile Val Ala Ile Asn Val
245 250 255
Pro Pro Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Val
260 265 270
Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val Leu Lys
275 280 285
Ile Trp Glu Ile Asp Leu Ser Lys Glu Ile Lys Met Val Glu Thr Ser
290 295 300
Lys Pro Leu Ala Asp Val Leu Glu Ser Ile Ile Gly Glu Lys Pro Ile
305 310 315 320
Leu Ile Pro Ile Ala Gly Glu Asn Ala Ser Gln Leu Asp Ile Asp Ile
325 330 335
Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Ala Pro Gly Val
340 345 350
Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Val Lys Thr Glu Ala Ala Leu Lys Ala
355 360 365
Ala Gly Val Thr Val Tyr Ser Phe Asp Gly Asn Gln Leu Ser Leu Gly
370 375 380
Met Gly Ser Gly Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Val Arg Glu Asp Val
385 390 395 400
Lys
<210> 23
<211> 404
<212> PRT
<213> 蜂房支原体
<400> 23
Met Ser Ile Lys Glu Asn Gly Ile His Val Tyr Ser Glu Ile Gly Lys
1 5 10 15
Leu Arg Asp Val Leu Val His Arg Pro Gly Arg Glu Leu Asn Phe Leu
20 25 30
Asp Pro Ser Arg Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ala Ala Thr Leu Glu Pro
35 40 45
Glu Thr Ala Arg Leu Glu His Asp Asn Phe Thr Thr Val Leu Lys Asn
50 55 60
Gln Gly Val Asn Val Ile Glu Leu Ala Asp Leu Val Ser Gln Thr Tyr
65 70 75 80
Ser Lys Val Asp Ser Lys Val Lys Lys Glu Phe Ile Asp Gln Tyr Leu
85 90 95
Asn Glu Ala Thr Pro Lys Leu Thr Ser Glu Leu Ser Lys Lys Val Tyr
100 105 110
Asp Phe Leu Thr Lys Gln Lys Ser Asn Arg Glu Met Val Asp Phe Met
115 120 125
Met Gly Gly Ile Leu Ser Ser Asp Leu Asn Ile Lys Gly Gln Pro Tyr
130 135 140
Leu Ile Val Glu Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe
145 150 155 160
Ala Ser Val Gly Asn Gly Ala Thr Ile His Trp Met Lys His Asn Val
165 170 175
Arg Arg Arg Glu Val Leu Phe Ala Asn Phe Ile Phe Lys Tyr Asn Glu
180 185 190
Arg Phe Gln Asn Thr Pro Lys Tyr Ile Thr Pro Thr Lys Gly Leu Asp
195 200 205
Ile Glu Gly Gly Asp Val Phe Val Tyr Asn Lys Lys Thr Leu Val Val
210 215 220
Gly Val Ser Glu Arg Thr Lys Met Glu Thr Ile Lys Glu Leu Ala Lys
225 230 235 240
Asn Ile Ser Lys Asn Lys Glu Cys Thr Phe Thr Lys Ile Tyr Ala Ile
245 250 255
Asn Val Pro Lys Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr
260 265 270
Met Leu Asp Tyr Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val
275 280 285
Leu Lys Val Trp Glu Ile Asn Ile Ser Asn Asn Lys Val Ser Ala Pro
290 295 300
Lys Glu Leu Asn Val Asn Leu Glu Lys Ala Leu Ser Met Ile Ile Gly
305 310 315 320
Lys Lys Pro Ile Leu Ile Pro Val Ala Gly Ala Asn Ala Ser Gln Ile
325 330 335
Asp Ile Asn Ile Glu Thr Asn Phe Asp Ala Thr Asn Tyr Leu Val Ile
340 345 350
Glu Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Lys Lys Thr Glu Glu
355 360 365
Ala Leu Val Lys Ala Gly Ile Lys Val Leu Pro Phe His Gly Asn Gln
370 375 380
Leu Ser Leu Gly Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Tyr
385 390 395 400
Arg Glu Asp Val
<210> 24
<211> 410
<212> PRT
<213> 穿透支原体
<400> 24
Met Ser Ser Ile Asp Lys Asn Ser Leu Gly Asn Gly Ile Asn Val Tyr
1 5 10 15
Ser Glu Ile Gly Glu Leu Lys Glu Val Leu Val His Thr Pro Gly Asp
20 25 30
Glu Ile Arg Tyr Thr Ala Pro Ser Arg Leu Glu Glu Leu Leu Phe Ser
35 40 45
Ala Val Leu Lys Ala Asp Thr Ala Ile Glu Glu His Lys Gly Phe Val
50 55 60
Lys Ile Leu Gln Asn Asn Gly Ile Lys Val Ile Gln Leu Cys Asp Leu
65 70 75 80
Val Ala Glu Thr Tyr Glu Leu Cys Ser Lys Glu Val Arg Asn Ser Phe
85 90 95
Ile Glu Gln Tyr Leu Asp Glu Ala Leu Pro Val Leu Lys Lys Glu Ile
100 105 110
Arg Pro Val Val Lys Asp Tyr Leu Leu Ser Phe Pro Thr Val Gln Met
115 120 125
Val Arg Lys Met Met Ser Gly Ile Leu Ala Asn Glu Leu Asn Ile Lys
130 135 140
Gln Asp Asn Pro Leu Ile Ile Asp Gly Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr
145 150 155 160
Arg Asp Pro Phe Ala Ser Met Gly Asn Gly Val Ser Ile Asn Cys Met
165 170 175
Lys Tyr Pro Thr Arg Lys Arg Glu Val Ile Phe Ser Arg Phe Val Phe
180 185 190
Thr Asn Asn Pro Lys Tyr Lys Asn Thr Pro Arg Tyr Phe Asp Ile Val
195 200 205
Gly Asn Asn Gly Thr Ile Glu Gly Gly Asp Ile Phe Ile Tyr Asn Ser
210 215 220
Lys Thr Leu Val Ile Gly Asn Ser Glu Arg Thr Asn Phe Ala Ala Ile
225 230 235 240
Glu Ser Val Ala Lys Asn Ile Gln Ala Asn Lys Asp Cys Thr Phe Glu
245 250 255
Arg Ile Val Val Ile Asn Val Pro Pro Met Pro Asn Leu Met His Leu
260 265 270
Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu Asp Tyr Asp Lys Phe Leu Tyr Ser Pro
275 280 285
Asn Met Met Asn Val Leu Lys Ile Trp Glu Ile Asp Leu Asn Val Lys
290 295 300
Pro Val Lys Phe Val Glu Lys Lys Gly Thr Leu Glu Glu Val Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Ile Ile Asp Lys Lys Pro Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly Lys Gly
325 330 335
Ala Asn Gln Leu Asp Ile Asp Ile Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn
340 345 350
Tyr Leu Thr Ile Ala Pro Gly Val Val Val Gly Tyr Glu Arg Asn Glu
355 360 365
Lys Thr Gln Lys Ala Leu Val Glu Ala Gly Ile Lys Val Leu Ser Phe
370 375 380
Asn Gly Ser Gln Leu Ser Leu Gly Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser
385 390 395 400
Met Pro Leu Ile Arg Glu Asn Leu Lys Lys
405 410
<210> 25
<211> 404
<212> PRT
<213> 发酵支原体
<400> 25
Met Lys Lys Ile Asn Val Tyr Ser Glu Tyr Gly Lys Leu Lys Glu Val
1 5 10 15
Leu Val His Thr Pro Gly Asp Glu Ile Arg Arg Ile Ala Pro Ser Arg
20 25 30
Leu Asp Glu Leu Leu Phe Ser Ala Ile Leu Glu Pro Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Ala Glu His Lys Arg Phe Val Gln Leu Leu Lys Asp Asn Gly Ile Lys
50 55 60
Val Ile Gln Leu Asp Glu Leu Phe Ala Lys Thr Phe Asp Leu Val Ser
65 70 75 80
Glu Ser Val Lys Gln Ser Phe Ile Glu Arg Trp Leu Asp Glu Cys Glu
85 90 95
Pro Lys Leu Asp Ala Thr Leu Arg Ala Lys Val Lys Glu Tyr Ile Leu
100 105 110
Glu Leu Lys Ala Lys Ser Ser Lys Lys Met Val Arg Val Met Met Ala
115 120 125
Gly Ile Asp Lys Lys Glu Leu Gly Ile Glu Leu Asp Arg Asp Leu Val
130 135 140
Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro Phe Ala Ser
145 150 155 160
Val Gly Asn Gly Ile Ser Leu His His Met Lys Tyr Val Thr Arg Gln
165 170 175
Arg Glu Thr Ile Phe Ser Glu Phe Ile Phe Asp Asn Asn Leu Asp Tyr
180 185 190
Asn Thr Val Pro Arg Trp Phe Asp Arg Lys Asp Glu Gly Arg Ile Glu
195 200 205
Gly Gly Asp Val Phe Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Val Val Gly Val
210 215 220
Ser Glu Arg Thr Asn Lys Glu Ala Ile Asn Val Met Ala Arg Lys Ile
225 230 235 240
Ala Ala Asp Lys Glu Val Lys Phe Lys Arg Ile Tyr Ala Ile Asn Val
245 250 255
Pro Pro Met Pro Asn Leu Met His Leu Asp Thr Trp Leu Thr Met Leu
260 265 270
Asp Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ser Val Leu Lys
275 280 285
Val Trp Arg Ile Asp Leu Asn Asp Pro Asp Phe Val Trp His Glu Ile
290 295 300
Glu Gly Ser Leu Glu Glu Ile Leu Glu Gln Ile Ile Gly Met Lys Pro
305 310 315 320
Ile Leu Ile Pro Ile Ala Gly Lys Gly Ala Ser Gln Leu Asp Ile Asp
325 330 335
Ile Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Ile Ala Pro Ser
340 345 350
Val Val Val Gly Tyr Ser Arg Asn Glu Lys Thr Glu Lys Ala Leu Lys
355 360 365
Ala Ala Lys Val Lys Val Leu Ser Phe Glu Gly Asn Gln Leu Ser Leu
370 375 380
Gly Met Gly Ser Ala Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Ile Arg Glu Asp
385 390 395 400
Ile Lys Lys Lys
<210> 26
<211> 404
<212> PRT
<213> 肺炎支原体
<400> 26
Met Lys Tyr Asn Ile Asn Val His Ser Glu Ile Gly Gln Leu Gln Thr
1 5 10 15
Val Leu Val His Thr Pro Gly Asn Glu Ile Arg Arg Ile Ser Pro Arg
20 25 30
Arg Leu Asp Asp Leu Leu Phe Ser Ala Val Ile Glu Pro Asp Thr Ala
35 40 45
Ile Gln Glu His Gln Thr Phe Cys Gln Leu Leu Gln Glu Gln Asn Ile
50 55 60
Glu Val Val Gln Leu Thr Asp Leu Thr Ala Thr Thr Phe Asp Lys Ala
65 70 75 80
Asn Ala Thr Ala Gln Asn Gln Phe Ile Glu Thr Trp Leu Asp Gln Ala
85 90 95
Glu Pro Lys Leu Thr Pro Glu His Arg Lys Val Ala Lys Gln Tyr Leu
100 105 110
Leu Glu Gln Lys Ala Lys Ser Thr Leu Ser Met Val Arg Ser Met Met
115 120 125
Gly Gly Ile Asp Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Asn Thr Ile Asn Gly
130 135 140
Asp Phe Leu Val Asp Pro Met Pro Asn Leu Tyr Phe Thr Arg Asp Pro
145 150 155 160
Phe Ala Ser Ile Gly His Gly Ile Ser Ile Asn Arg Met Lys Tyr Leu
165 170 175
Thr Arg Arg Arg Glu Thr Leu Phe Ala Ser Phe Ile Phe Ala Asn His
180 185 190
Pro Ile Ile Ala Ala Arg Lys Phe Tyr Phe Lys Pro Ile Asp Met Gly
195 200 205
Thr Ile Glu Gly Gly Asp Ile Phe Val Tyr Asp Gln Gln Thr Val Val
210 215 220
Met Gly Leu Ser Glu Arg Thr Thr Glu Ala Ala Ile Asn Val Leu Ala
225 230 235 240
Lys Lys Ile Gln Gln Asp Ser Ser Thr Ser Phe Lys Arg Ile Phe Val
245 250 255
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260 265 270
Thr Met Leu Asp Arg Asn Lys Phe Leu Tyr Ser Pro Asn Met Leu Ala
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Glu Ile Asp Ile Glu Thr His Phe Asp Gly Thr Asn Tyr Leu Thr Ile
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Arg Lys Pro Leu
<210> 27
<211> 414
<212> PRT
<213> 支原体属某种
<400> 27
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Leu Leu His Arg Pro Gly Asn Glu Leu Leu Asn Leu Thr Pro Asp Thr
20 25 30
Leu Ser Arg Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Pro Asp Ala Ile
35 40 45
Lys Glu His Asp Glu Phe Ala Asp Ala Leu Arg Ala Asn Gly Val Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Ile Arg Asp Lys Phe Ile Lys Gln Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Ile
85 90 95
Arg Thr Pro Lys Tyr Lys Tyr Leu Val Phe Asp Tyr Leu Asp Gln Ile
100 105 110
Thr Asn Ser Lys Lys Leu Val Leu Lys Thr Met Glu Gly Ile Gln Ile
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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225 230 235 240
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245 250 255
Lys Ile Asp Thr Ile Leu Ala Phe Asn Ile Pro Glu Ser Arg Ala Phe
260 265 270
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275 280 285
Tyr His Pro Gly Ile Met Gly Thr Leu Gln Val Phe Glu Ile Thr Glu
290 295 300
Gly Asp Asp Pro Asn Ser Asp Glu Asp Leu Thr Val Thr Glu Ile Asn
305 310 315 320
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325 330 335
Leu Ile Pro Cys Ala Gly Gly Asp Lys Val Ser Ala Glu Arg Glu Gln
340 345 350
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355 360 365
Val Tyr Asp Arg Asn Asn Leu Thr Asn Ala Val Leu Arg Ser Tyr Gly
370 375 380
Leu Lys Val Ile Glu Ile His Gly Ala Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly
385 390 395 400
Gly Pro Arg Cys Met Ser Met Pro Leu Val Arg Glu Asp Ile
405 410
<210> 28
<211> 408
<212> PRT
<213> 支原体属某种
<400> 28
Met His Val Thr Ser Glu Ile Lys Lys Leu Lys Lys Val Leu Val His
1 5 10 15
Arg Pro Gly Lys Glu Leu Leu Asn Leu Thr Pro Asp Thr Leu Gly Arg
20 25 30
Leu Leu Phe Asp Asp Ile Pro Tyr Leu Lys Asp Ala Ile Leu Glu His
35 40 45
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
His Ser Val Thr Arg Ser Arg Glu Thr Ile Tyr Ala Tyr Tyr Ile Phe
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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340 345 350
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355 360 365
Asn Ile Thr Asn Glu Val Leu Arg Glu Lys Gly Ile Lys Val Ile Glu
370 375 380
Met Asn Ser Ala Glu Leu Ser Arg Gly Arg Gly Gly Pro Arg Cys Met
385 390 395 400
Ser Met Pro Leu Glu Arg Glu Asp
405

Claims (68)

1.一种治疗性组合物，其包含分离的精氨酸脱亚氨酶或其具有ADI活性的片段以及药学上可接受的载体，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性。
2.如权利要求1所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶不来自人型支原体。
3.如权利要求1或2所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶来自列于表1中的生物体。
4.如权利要求1至3中任一项所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶具有一种或多种类似于或优于ADI-PEG 20的性质。
5.如权利要求4所述的治疗性组合物，其中所述一种或多种性质为Kcat、Km、最佳pH值、稳定性、体内蛋白水解稳定性或不需要尚未存在于血液中的离子或辅因子或其任何组合。
6.如权利要求1至5中任一项所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有至少20个表面残基变化。
7.如权利要求6所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有20个至135个表面残基变化。
8.如权利要求6所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有40个至100个表面残基变化。
9.如权利要求6所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有30个至60个表面残基变化。
10.如权利要求6所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有80个至100个表面残基变化。
11.如权利要求6所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有100个至120个表面残基变化。
12.如权利要求1至11中任一项所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶来自唾液支原体、泡沫支原体、加拿大支原体、耳支原体、猪滑液支原体、泄殖腔支原体、鹅支原体、产碱支原体、口腔支原体、惰性支原体、火鸡支原体、蜂房支原体、穿透支原体、鸡支原体、梨支原体、灵长类支原体、发酵支原体、产脂支原体、气管支原体、模仿支原体、乳白色支原体、毛氏支原体、象支原体、肺炎支原体、龟支原体、支原体属某种CAG:877或支原体属某种CAG:472。
13.如权利要求1至12中任一项所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶包含SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:28中任一者中所列的氨基酸序列。
14.如权利要求1至13中任一项所述的治疗性组合物，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶已经修饰以移除至少一个聚乙二醇化位点。
15.如权利要求1至14中任一项所述的治疗性组合物，其中至少一个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
16.如权利要求15所述的治疗性组合物，其中至少5个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
17.如权利要求15所述的治疗性组合物，其中至少10个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
18.如权利要求15所述的治疗性组合物，其中至少15个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
19.如权利要求15所述的治疗性组合物，其中至少20个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
20.如权利要求1至19中任一项所述的治疗性组合物，其中所述精氨酸脱亚氨酶是经由接头共价键结至PEG分子。
21.如权利要求20所述的治疗性组合物，其中所述精氨酸脱亚氨酶是共价键结至超过一个PEG分子。
22.如权利要求20所述的治疗性组合物，其中所述精氨酸脱亚氨酶是共价键结至约1至约10个PEG分子。
23.如权利要求20所述的治疗性组合物，其中所述精氨酸脱亚氨酶是共价键结至约2至约8个PEG分子。
24.如权利要求20所述的治疗性组合物，其中所述PEG分子为直链或支链PEG分子。
25.如权利要求20所述的治疗性组合物，其中所述PEG的总重均分子量为约1,000至约40,000。
26.如权利要求20所述的治疗性组合物，其中所述PEG的总重均分子量为约10,000至约30,000。
27.如权利要求20至26中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述接头为琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基或其任何组合。
28.如权利要求27所述的治疗性组合物，其中所述琥珀酰基的来源为琥珀酸琥珀酰亚胺酯。
29.一种分离的精氨酸脱亚氨酶或其具有ADI活性的片段，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与患者抗ADI-PEG 20抗体具有降低的交叉反应性。
30.如权利要求29所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶不来自人型支原体。
31.如权利要求29或30所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶来自列于表1中的生物体。
32.如权利要求29至31中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶具有一种或多种类似于或优于ADI-PEG 20的性质。
33.如权利要求32所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述一种或多种性质为Kcat、Km、最佳pH值、稳定性、体内蛋白水解稳定性或不需要尚未存在于血液中的离子或辅因子或其任何组合。
34.如权利要求29至33中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有至少20个表面残基变化。
35.如权利要求34所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有20个至135个表面残基变化。
36.如权利要求34所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有40个至100个表面残基变化。
37.如权利要求34所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有30个至60个表面残基变化。
38.如权利要求34所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有80个至100个表面残基变化。
39.如权利要求34所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶与人型支原体精氨酸脱亚氨酶相比具有100个至120个表面残基变化。
40.如权利要求29至39中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶来自唾液支原体、泡沫支原体、加拿大支原体、耳支原体、猪滑液支原体、泄殖腔支原体、鹅支原体、产碱支原体、口腔支原体、惰性支原体、火鸡支原体、蜂房支原体、穿透支原体、鸡支原体、梨支原体、灵长类支原体、发酵支原体、产脂支原体、气管支原体、模仿支原体、乳白色支原体、毛氏支原体、象支原体、肺炎支原体、龟支原体、支原体属某种CAG:877或支原体属某种CAG:472。
41.如权利要求29至40中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶包含SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:28中任一者中所列的氨基酸序列。
42.如权利要求29至41中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述分离的精氨酸脱亚氨酶已经修饰以移除至少一个聚乙二醇化位点。
43.如权利要求29至42中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中至少一个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
44.如权利要求43所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中至少5个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
45.如权利要求43所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中至少10个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
46.如权利要求43所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中至少15个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
47.如权利要求43所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中至少20个赖氨酸残基已通过氨基酸取代进行修饰。
48.如权利要求29至47中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述精氨酸脱亚氨酶是经由接头共价键结至PEG分子。
49.如权利要求48所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述精氨酸脱亚氨酶是共价键结至超过一个PEG分子。
50.如权利要求48或49所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述精氨酸脱亚氨酶是共价键结至约1至约10个PEG分子。
51.如权利要求50所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述精氨酸脱亚氨酶是共价键结至约2至约8个PEG分子。
52.如权利要求48至51中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述PEG分子为直链或支链PEG分子。
53.如权利要求48至52中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述PEG的总重均分子量为约1,000至约40,000。
54.如权利要求53所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述PEG的总重均分子量为约10,000至约30,000。
55.如权利要求48至54中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述接头为琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基或其任何组合。
56.如权利要求55所述的分离的精氨酸脱亚氨酶，其中所述琥珀酰基的来源为琥珀酸琥珀酰亚胺酯。
57.一种多核苷酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的分离的精氨酸脱亚氨酶。
58.一种载体，其包含如权利要求57所述的多核苷酸。
59.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求58所述的载体。
60.如前述权利要求中任一项所述的治疗性组合物，其还包含化学治疗剂。
61.如权利要求60所述的治疗性组合物，其中所述化学治疗剂选自由以下组成的组：多西他赛、卡铂、环磷酰胺、吉西他滨、顺铂、索拉非尼、舒尼替尼和依维莫司。
62.一种治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如前述权利要求中任一项所述的治疗性组合物或分离的精氨酸脱亚氨酶，由此治疗所述癌症、缓解其症状或抑制其进展。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述有需要的患者已确定具有抗ADI-PEG 20抗体。
64.如权利要求62或63所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：肝细胞癌、黑素瘤、转移性黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝细胞瘤、肉瘤、白血病、急性髓样白血病、复发性急性髓样白血病、乳癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃癌、神经胶质瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑部癌症、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌和胃癌。
65.一种治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含ADI-PEG 20的组合物，且在一段时间之后，向所述患者施用如前述权利要求中任一项所述的治疗性组合物或精氨酸脱亚氨酶，由此治疗所述癌症、缓解其症状或抑制其进展。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述时间段是通过检测所述患者中的预定水平的抗ADI-PEG 20抗体来确定，其中所述治疗性组合物是在检测到所述预定水平的所述抗ADI-PEG 20抗体之后施用。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述时间段是通过检测所述患者中的ADI活性来确定，其中所述治疗性组合物是在检测到预定或降低水平的ADI活性之后施用。
68.一种如前述权利要求中任一项所述的治疗性组合物或分离的精氨酸脱亚氨酶的用途，其用于制造用于治疗癌症、缓解其症状或抑制其进展的药剂。
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