JP2021004268A - 癌治療のためのadi−peg20抗体に対する交差反応性が低減したアルギニンデイミナーゼ - Google Patents
癌治療のためのadi−peg20抗体に対する交差反応性が低減したアルギニンデイミナーゼ Download PDFInfo
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Abstract
【課題】癌治療のためのADI−PEG20抗体に対する交差反応性が低減したアルギニンデイミナーゼの提供。【解決手段】本発明は、一般的に、ADI−PEG20に比べて抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有するが、ADI−PEG20に匹敵するかまたはより良い機能特性を有し得る単離アルギニンデイミナーゼ(ADI)タンパク質、該ADIタンパク質を含む組成物、及び癌などのアルギニン依存性疾患または関連疾患を治療する関連方法に関する。本発明の実施形態は、選択ADI酵素に関し、一部の実施形態において、リンカー、例えば、安定リンカーを介してPEGと結合している。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、参照することによりその内容全体がここに組み込まれる2014年9月16日に出願された米国出願第62/051,182号に対する米国特許法第119条(e)に基づく優先権を主張する。
本出願は、参照することによりその内容全体がここに組み込まれる2014年9月16日に出願された米国出願第62/051,182号に対する米国特許法第119条(e)に基づく優先権を主張する。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、POLA_005_01WO_SeqList_ST25.txtである。該テキストファイルは約97KBであり、2015年9月15日に作成され、EFS−Webにより電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、POLA_005_01WO_SeqList_ST25.txtである。該テキストファイルは約97KBであり、2015年9月15日に作成され、EFS−Webにより電子的に提出されている。
背景
技術分野
本発明は、一般的にアルギニンデイミナーゼ(ADI)タンパク質に関し、これにはADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有するADIタンパク質が含まれる。該ADIタンパク質は、癌などのアルギニン依存性疾患または関連疾患の治療に有用である。
技術分野
本発明は、一般的にアルギニンデイミナーゼ(ADI)タンパク質に関し、これにはADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有するADIタンパク質が含まれる。該ADIタンパク質は、癌などのアルギニン依存性疾患または関連疾患の治療に有用である。
関連技術の説明
アミノ酸枯渇療法は、いくつかの形態の癌の有効な治療であり得る。現在まで、アスパラギナーゼを利用してアスパラギンの循環レベルを低下させ、タンパク質合成を阻害するこの手法に関連する1つの既知の臨床例がある。この治療は、急性リンパ芽球性白血病に特に有効である(Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004)。急性リンパ芽球性白血病細胞は、成長及び増殖のためにアミノ酸アスパラギンを必要とする。対照的に、大部分の正常なヒト細胞は、アスパラギンを合成することができ、アスパラギン欠乏によって影響を受けない。したがって、アスパラギナーゼで血清アスパラギンを減少させることは、正常な細胞、組織、及び宿主を傷つけることなく癌細胞を選択的に死滅させることができる。アスパラギナーゼのE.coli由来形は、ヒトへの使用が承認されている。しかしながら、アスパラギナーゼは微生物内でのみ見られ、ヒトにおいては高度に免疫原性になり、注射後の短い血清半減期をも有する(Avramis 2005)。アスパラギナーゼをより有効な薬物にするため、E.coli由来アスパラギナーゼをポリエチレングリコール(PEG)と配合して、この酵素の免疫原性及び関連するアレルギー反応を低減させるとによってこれらの欠点を最小限にした。さらに、PEGはアスパラギナーゼの循環半減期を大いに延長し、治療の頻度と療法の総費用を両方とも減少させる。PEG配合アスパラギナーゼは使用が承認されており、商標名Oncaspar(登録商標)で市販されている(Oncaspar(登録商標)2011,Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004,Fu 2007,Zeidan 2008)。
アミノ酸枯渇療法は、いくつかの形態の癌の有効な治療であり得る。現在まで、アスパラギナーゼを利用してアスパラギンの循環レベルを低下させ、タンパク質合成を阻害するこの手法に関連する1つの既知の臨床例がある。この治療は、急性リンパ芽球性白血病に特に有効である(Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004)。急性リンパ芽球性白血病細胞は、成長及び増殖のためにアミノ酸アスパラギンを必要とする。対照的に、大部分の正常なヒト細胞は、アスパラギンを合成することができ、アスパラギン欠乏によって影響を受けない。したがって、アスパラギナーゼで血清アスパラギンを減少させることは、正常な細胞、組織、及び宿主を傷つけることなく癌細胞を選択的に死滅させることができる。アスパラギナーゼのE.coli由来形は、ヒトへの使用が承認されている。しかしながら、アスパラギナーゼは微生物内でのみ見られ、ヒトにおいては高度に免疫原性になり、注射後の短い血清半減期をも有する(Avramis 2005)。アスパラギナーゼをより有効な薬物にするため、E.coli由来アスパラギナーゼをポリエチレングリコール(PEG)と配合して、この酵素の免疫原性及び関連するアレルギー反応を低減させるとによってこれらの欠点を最小限にした。さらに、PEGはアスパラギナーゼの循環半減期を大いに延長し、治療の頻度と療法の総費用を両方とも減少させる。PEG配合アスパラギナーゼは使用が承認されており、商標名Oncaspar(登録商標)で市販されている(Oncaspar(登録商標)2011,Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004,Fu 2007,Zeidan 2008)。
アルギニンは、ヒト及びマウスにとって別の非必須アミノ酸である(精査のためにはRogers 1994を参照されたい)。ヒトにおいて、アルギニンはKrebs(尿素)回路酵素アルギニノコハク酸シンテターゼ(ASS、L−シトルリン:L−アスパラギン酸リガーゼ[AMP形成]、EC 6.3.4.5)及びアルギニノコハク酸リアーゼ(ASL、L−アルギニノコハク酸アルギニン−リアーゼ、EC 4.3.2.)を介する2段階でシトルリンから合成され得る(Haines 2011,Wu 2009,Morris 2006,Husson 2003,Tapiero 2002,Rogers 1994)。ASSは、シトルリン及びアスパラギン酸のアルギノコハク酸への変換を触媒し、これは次にASLによってアルギニン及びフマル酸に変換される。ヒトにおけるアルギニン欠乏食は、成人において高アンモニア血症、オロト尿症を誘発せず、全身の一酸化窒素(NO)合成率をも変えない(Tapiero 2002,Castillo 1995,Rogers 1994,Carey 1987,Barbul 1986,Snyderman 1959,Rose 1949)。未熟児はアルギニンを必要とするように見えるが(Wu 2004)、アルギニンレベルは乳児、小児及び若年成人の間で年齢と相関しない(Lucke 2007)。1992年に、Takaku及びSugimuraは、ヒト黒色腫及び肝細胞癌(HCC)細胞系が成長のためにアルギニンを必要とすると思われると別々に報告した。他の研究により、ペグ化ADIがほとんど有害作用なしで黒色腫及び肝細胞腫の治療に有効であることが示された。
ADI−PEG20治療は、一定期間にわたる複数回投与を必要とする。多くの治療後に、持続した有効性を制限し得る抗ADI−PEG20抗体が生じる可能性がある。したがって、当該技術分野には、アルギニン枯渇療法の効力を改善及び延長するための治療に用いる、抗ADI−PEG20抗体に対して低減した交差反応性を有するADIが必要である。本発明は、癌治療のためにこの利点及び他の利点を提供する。
参考文献:Avramis VI,Panosyan EH.2005.Clin Pharmacokinet 44:367−393;Barbul A.1986.J Parenteral Enteral Nutr 10:227−238;Carey
GP,et al.1987.J Nutr 117:1734−1739;Castillo L,et al.1995.Am J Physiol 268(Endocrinol Metab 31):E360−367;Fu CH,Sakamoto KM.2007.Expert Opin Pharmacother8:1977−1984;Haines RJ, et al.2011.Int J Biochem Mol Biol 2:8−23;Husson A,et al.2003.Eur J Biochem 270:1887−1899;Lucke T,et al.2007.Clin Chem Lab Med 45:1525−1530;Morris
SM Jr.2006.Am J Clin Nutr 83(Suppl):598S−512S;Rogers QR.1994.In Proceedings from a Symposium Honoring Willard J.Visek−from Ammonia to Cancer and Gene Expression.Special Publication 86−April,1994,Agriculture Experiment Station,University of
Illinois,211 Mumford Hall,Urbana,IL 61801,pp.9−21、Tapiero H,et al.2002.Biomed Pharmacother 56:439−445,2002;Viera Pinheiro JP,Boos J.2004.Br J Haematol 125:117−127;Wu G,et al.2009.Amino Acids 37:153−168;Wu G,et al.2004.J Nutr Biochem 15:442−451;Zeidan A,et al.2008.Expert Opin Biol Ther 9:111−119)。
参考文献:Avramis VI,Panosyan EH.2005.Clin Pharmacokinet 44:367−393;Barbul A.1986.J Parenteral Enteral Nutr 10:227−238;Carey
GP,et al.1987.J Nutr 117:1734−1739;Castillo L,et al.1995.Am J Physiol 268(Endocrinol Metab 31):E360−367;Fu CH,Sakamoto KM.2007.Expert Opin Pharmacother8:1977−1984;Haines RJ, et al.2011.Int J Biochem Mol Biol 2:8−23;Husson A,et al.2003.Eur J Biochem 270:1887−1899;Lucke T,et al.2007.Clin Chem Lab Med 45:1525−1530;Morris
SM Jr.2006.Am J Clin Nutr 83(Suppl):598S−512S;Rogers QR.1994.In Proceedings from a Symposium Honoring Willard J.Visek−from Ammonia to Cancer and Gene Expression.Special Publication 86−April,1994,Agriculture Experiment Station,University of
Illinois,211 Mumford Hall,Urbana,IL 61801,pp.9−21、Tapiero H,et al.2002.Biomed Pharmacother 56:439−445,2002;Viera Pinheiro JP,Boos J.2004.Br J Haematol 125:117−127;Wu G,et al.2009.Amino Acids 37:153−168;Wu G,et al.2004.J Nutr Biochem 15:442−451;Zeidan A,et al.2008.Expert Opin Biol Ther 9:111−119)。
Avramis VI,Panosyan EH.2005.Clin Pharmacokinet 44:367−393
Barbul A.1986.J Parenteral Enteral Nutr 10:227−238
Carey GP,et al.1987.J Nutr 117:1734−1739
Castillo L,et al.1995.Am J Physiol 268(Endocrinol Metab 31):E360−367
Fu CH,Sakamoto KM.2007.Expert Opin Pharmacother8:1977−1984
Haines RJ, et al.2011.Int J Biochem Mol Biol 2:8−23
Husson A,et al.2003.Eur J Biochem 270:1887−1899
Lucke T,et al.2007.Clin Chem Lab Med 45:1525−1530
Morris SM Jr.2006.Am J Clin Nutr 83(Suppl):598S−512S
簡単な概要
特定実施形態は、単離アルギニンデイミナーゼに関し、この単離アルギニンデイミナーゼは、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する。単離アルギニンデイミナーゼまたはADI活性を有するその断片と、医薬的に許容できる担体とを含む治療組成物または医薬組成物も含まれる。特定実施形態において、組成物は無菌であり、及び/または内毒素などの発熱物質を実質的に含まない。一部の実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、M.hominis由来でない。一部の実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、表1に列挙される生物由来である。
特定実施形態は、単離アルギニンデイミナーゼに関し、この単離アルギニンデイミナーゼは、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する。単離アルギニンデイミナーゼまたはADI活性を有するその断片と、医薬的に許容できる担体とを含む治療組成物または医薬組成物も含まれる。特定実施形態において、組成物は無菌であり、及び/または内毒素などの発熱物質を実質的に含まない。一部の実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、M.hominis由来でない。一部の実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、表1に列挙される生物由来である。
特定実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、ADI−PEG20の特性に匹敵するかまたはより良い1つ以上の特性を有する。この点で、1つ以上の特性としては、限定するものではないが、Kcat、Km、pH最適条件、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血液中に既存しないイオンもしくは補因子への要求がないこと、またはその任意の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて少なくとも5、10、15、または20個の表面残基変化を有する。特定実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて約20〜135個の表面残基変化、約40〜100個の表面残基変化、約30〜60個の表面残基変化、約80〜100個の表面残基変化、または約100〜120個の表面残基変化を有する。
特定実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼは、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma spumans、Mycoplasma canadense、Mycoplasma auris、Mycoplasma hyosynoviae、Mycoplasma cloacale、Mycoplasma anseris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma orale、Mycoplasma iners、Mycoplasma meleagridis、Mycoplasma alvi、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma gallinarum、Mycoplasma pirum、Mycoplasma primatum、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma lipofaciens、Mycoplasma felifaucium、Mycoplasma imitans、Mycoplasma opalescens、Mycoplasma moatsii、Mycoplasma elephantis、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma testudinis、Mycoplasma sp.CAG:877、またはMycoplasma sp.CAG:472由来である。患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する例示アルギニンデイミナーゼは、配列番号2〜28に記載のずれか1つ以上のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有するアルギニンデイミナーゼは、少なくとも1つのペグ化部位を除去するように修飾されている。患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有するアルギニンデイミナーゼの特定実施形態において、少なくとも1個のリジン残基がアミノ酸置換によって修飾されている。この点で、特定実施形態において、少なくとも約5個のリジン残基、少なくとも約10個のリジン残基、または少なくとも約20個のリジン残基がアミノ酸残基置換によって修飾されている。
一部の実施形態において、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有するアルギニンデイミナーゼは、リンカーを介してPEG分子に共有結合している。この点で、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有するアルギニンデイミナーゼは、1個以上のPEG分子、例えば約1〜約10個または約2〜約8個のPEG分子に共有結合していてよい。PEG分子は、直鎖または分岐鎖PEG分子であってよく、約1,000〜約40,000の総重量平均分子量、または約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有し得る。PEGが本明細書に記載のADIrにリンカーを介して共有結合している一部の実施形態において、リンカーは、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバマート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはその任意の組み合わせを含む。具体的実施形態において、スクシニル基の起源はスクシンイミジルスクシナートである。
本明細書に記載の単離アルギニンデイミナーゼをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び該ベクターを含む単離宿主細胞も含まれる。
特定実施形態は、本明細書に記載の患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼと、生理学的に許容できる担体とを含む組成物に関する。特定実施形態において、組成物は、さらに化学療法薬を含む。典型的な化学療法薬としては、限定するものではないが、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ、及びエベロリムスが挙げられる。
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、それが必要な患者に、本明細書に記載の患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼと、生理学的に許容できる担体とを含む治療的に有効な量の組成物を投与し、それによって癌を治療し、その症状を寛解させ、またはその進行を阻害することを含む方法も含まれる。特定実施形態において、癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害が必要な患者は、抗ADI−PEG20抗体を有すると判定されている。一部の実施形態において、癌は、肝細胞癌、転移性黒色腫を含めた黒色腫、膵癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞腫、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌(stomach cancer)から成る群より選択される。
一部の実施形態には、癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、それが必要な患者に、治療的に有効な量の、ADI−PEG20を含む組成物を投与し、一定期間後に、本明細書に記載の患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼと、生理学的に許容できる担体とを含む組成物を該患者に投与し、それによって癌を治療し、その症状を寛解させ、またはその進行を阻害することを含む方法が含まれる。この一定期間は、例えば、患者における所定レベルの抗ADI−PEG20抗体を検出すること及び/または患者におけるADI活性を測定するかあるいは観察することによって決定可能であり、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する単離アルギニンデイミナーゼを含む組成物は、患者における所定レベルの前記抗ADI−PEG20抗体の検出及び/または所定レベルのADI活性の測定もしくは観察後に投与される。
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害用薬物の調製または製造に用いる、本明細書に記載の単離アルギニンデイミナーゼタンパク質も包含される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
単離アルギニンデイミナーゼ、またはADI活性を有するその断片と、医薬的に許容できる担体とを含む治療組成物であって、前記単離アルギニンデイミナーゼが、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する、前記治療組成物。
(項目2)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominis由来でない、項目1に記載の治療組成物。
(項目3)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、表1に列挙される生物由来である、項目1または2に記載の治療組成物。
(項目4)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、ADI−PEG20の特性に匹敵するかまたはそれより良い1つ以上の特性を有する、項目1〜3のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目5)
前記1つ以上の特性が、Kcat、Km、pH最適条件、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血液中に既存しないイオンもしくは補因子への要求がないこと、またはその任意の組み合わせである、項目4に記載の治療組成物。
(項目6)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて少なくとも20個の表面残基変化を有する、項目1〜5のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目7)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて20〜135個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目8)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて40〜100個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目9)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて30〜60個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目10)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて80〜100個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目11)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて100〜120個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目12)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma spumans、Mycoplasma canadense、Mycoplasma auris、Mycoplasma hyosynoviae、Mycoplasma cloacale、Mycoplasma anseris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma orale、Mycoplasma iners、Mycoplasma meleagridis、Mycoplasma alvi、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma gallinarum、Mycoplasma pirum、Mycoplasma primatum、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma lipofaciens、Mycoplasma felifaucium、Mycoplasma imitans、Mycoplasma opalescens、Mycoplasma moatsii、Mycoplasma elephantis、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma testudinis、Mycoplasma sp.CAG:877、またはMycoplasma sp.CAG:472由来である、項目1〜11のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目13)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、配列番号2〜28のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、項目1〜12のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目14)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、少なくとも1つのペグ化部位を除去するように修飾されている、項目1〜13のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目15)
少なくとも1個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目1〜14のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目16)
少なくとも5個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目15に記載の治療組成物。
(項目17)
少なくとも10個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目15に記載の治療組成物。
(項目18)
少なくとも15個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目15に記載の治療組成物。
(項目19)
少なくとも20個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目15に記載の治療組成物。
(項目20)
前記アルギニンデイミナーゼが、リンカーを介してPEG分子に共有結合している、項目1〜19のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目21)
前記アルギニンデイミナーゼが、1個より多くのPEG分子に共有結合している、項目20に記載の治療組成物。
(項目22)
前記アルギニンデイミナーゼが、約1〜約10個のPEG分子に共有結合している、項目20に記載の治療組成物。
(項目23)
前記アルギニンデイミナーゼが、約2〜約8個のPEG分子に共有結合している、項目20に記載の治療組成物。
(項目24)
前記PEG分子が、直鎖または分岐鎖PEG分子である、項目20に記載の治療組成物。
(項目25)
前記PEGが、約1,000〜約40,000の総重量平均分子量を有する、項目20に記載の治療組成物。
(項目26)
前記PEGが、約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有する、項目20に記載の治療組成物。
(項目27)
前記リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバマート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはその任意の組み合わせである、項目20〜26のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目28)
前記スクシニル基の起源がスクシンイミジルスクシナートである、項目27に記載の治療組成物。
(項目29)
患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する、単離アルギニンデイミナーゼ、またはADI活性を有するその断片。
(項目30)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominis由来でない、項目29に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目31)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、表1に列挙される生物由来である、項目29または30に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目32)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、ADI−PEG20の特性に匹敵するかまたはそれより良い1つ以上の特性を有する、項目29〜31のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目33)
前記1つ以上の特性が、Kcat、Km、pH最適条件、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血液中に既存しないイオンもしくは補因子への要求がないこと、またはその任意の組み合わせである、項目32に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目34)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて少なくとも20個の表面残基変化を有する、項目29〜33のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目35)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて20〜135個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目36)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて40〜100個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目37)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて30〜60個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目38)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて80〜100個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目39)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて100〜120個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目40)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma spumans、Mycoplasma canadense、Mycoplasma auris、Mycoplasma hyosynoviae、Mycoplasma cloacale、Mycoplasma anseris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma orale、Mycoplasma iners、Mycoplasma meleagridis、Mycoplasma alvi、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma gallinarum、Mycoplasma pirum、Mycoplasma primatum、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma lipofaciens、Mycoplasma felifaucium、Mycoplasma imitans、Mycoplasma opalescens、Mycoplasma moatsii、Mycoplasma elephantis、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma testudinis、Mycoplasma sp.CAG:877、またはMycoplasma sp.CAG:472由来である、項目29〜39のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目41)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、配列番号2〜28のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、項目29〜40のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目42)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、少なくとも1つのペグ化部位を除去するように修飾されている、項目29〜41のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目43)
少なくとも1個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目29〜42のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目44)
少なくとも5個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目43に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目45)
少なくとも10個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目43に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目46)
少なくとも15個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目43に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目47)
少なくとも20個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目43に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目48)
前記アルギニンデイミナーゼが、リンカーを介してPEG分子に共有結合している、項目29〜47のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目49)
前記アルギニンデイミナーゼが、1個より多くのPEG分子に共有結合している、項目48に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目50)
前記アルギニンデイミナーゼが、約1〜約10個のPEG分子に共有結合している、項目48または49に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目51)
前記アルギニンデイミナーゼが、約2〜約8個のPEG分子に共有結合している、項目50に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目52)
前記PEG分子が、直鎖または分岐鎖PEG分子である、項目48〜51のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目53)
前記PEGが、約1,000〜約40,000の総重量平均分子量を有する、項目48〜52のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目54)
前記PEGが、約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有する、項目53に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目55)
前記リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバマート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはその任意の組み合わせである、項目48〜54のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目56)
前記スクシニル基の起源がスクシンイミジルスクシナートである、項目55に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目57)
先行項目のいずれか1項に記載の前記単離アルギニンデイミナーゼをコードするポリヌクレオチド。
(項目58)
項目57に記載の前記ポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目59)
項目58に記載の前記ベクターを含む単離宿主細胞。
(項目60)
化学療法薬をさらに含む、先行項目のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目61)
前記化学療法薬が、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ及びエベロリムスから成る群より選択される、項目60に記載の治療組成物。
(項目62)
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、それが必要な患者に、治療的に有効な量の、先行項目のいずれか1項に記載の治療組成物または単離アルギニンデイミナーゼを投与し、それによって前記癌を治療し、その症状を寛解させ、またはその進行を阻害することを含む、前記方法。
(項目63)
前記癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害が必要な患者が、抗ADI−PEG20抗体を有すると判定されている、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記癌が、肝細胞癌、黒色腫、転移性黒色腫、膵癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞腫、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌(stomach cancer)から成る群より選択される、項目62または63に記載の方法。
(項目65)
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、それが必要な患者に、治療的に有効な量の、ADI−PEG20を含む組成物を投与し、一定期間後に、先行項目のいずれか1項に記載の治療組成物またはアルギニンデイミナーゼを前記患者に投与し、それによって前記癌を治療し、その症状を寛解させ、または進行を阻害する、前記方法。
(項目66)
前記一定期間が、前記患者における所定レベルの抗ADI−PEG20抗体を検出することによって決定され、前記治療組成物が、前記所定レベルの前記抗ADI−PEG20抗体の検出後に投与される、項目65に記載の方法。(項目67)
前記一定期間が、前記患者におけるADI活性によって決定され、前記治療組成物が、所定レベルまたは低減レベルのADI活性の検出後に投与される、項目65に記載の方法。
(項目68)
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害用薬物の製造における、先行項目のいずれか1項に記載の治療組成物または単離アルギニンデイミナーゼの使用。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
単離アルギニンデイミナーゼ、またはADI活性を有するその断片と、医薬的に許容できる担体とを含む治療組成物であって、前記単離アルギニンデイミナーゼが、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する、前記治療組成物。
(項目2)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominis由来でない、項目1に記載の治療組成物。
(項目3)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、表1に列挙される生物由来である、項目1または2に記載の治療組成物。
(項目4)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、ADI−PEG20の特性に匹敵するかまたはそれより良い1つ以上の特性を有する、項目1〜3のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目5)
前記1つ以上の特性が、Kcat、Km、pH最適条件、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血液中に既存しないイオンもしくは補因子への要求がないこと、またはその任意の組み合わせである、項目4に記載の治療組成物。
(項目6)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて少なくとも20個の表面残基変化を有する、項目1〜5のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目7)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて20〜135個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目8)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて40〜100個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目9)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて30〜60個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目10)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて80〜100個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目11)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて100〜120個の表面残基変化を有する、項目6に記載の治療組成物。
(項目12)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma spumans、Mycoplasma canadense、Mycoplasma auris、Mycoplasma hyosynoviae、Mycoplasma cloacale、Mycoplasma anseris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma orale、Mycoplasma iners、Mycoplasma meleagridis、Mycoplasma alvi、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma gallinarum、Mycoplasma pirum、Mycoplasma primatum、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma lipofaciens、Mycoplasma felifaucium、Mycoplasma imitans、Mycoplasma opalescens、Mycoplasma moatsii、Mycoplasma elephantis、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma testudinis、Mycoplasma sp.CAG:877、またはMycoplasma sp.CAG:472由来である、項目1〜11のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目13)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、配列番号2〜28のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、項目1〜12のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目14)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、少なくとも1つのペグ化部位を除去するように修飾されている、項目1〜13のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目15)
少なくとも1個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目1〜14のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目16)
少なくとも5個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目15に記載の治療組成物。
(項目17)
少なくとも10個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目15に記載の治療組成物。
(項目18)
少なくとも15個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目15に記載の治療組成物。
(項目19)
少なくとも20個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目15に記載の治療組成物。
(項目20)
前記アルギニンデイミナーゼが、リンカーを介してPEG分子に共有結合している、項目1〜19のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目21)
前記アルギニンデイミナーゼが、1個より多くのPEG分子に共有結合している、項目20に記載の治療組成物。
(項目22)
前記アルギニンデイミナーゼが、約1〜約10個のPEG分子に共有結合している、項目20に記載の治療組成物。
(項目23)
前記アルギニンデイミナーゼが、約2〜約8個のPEG分子に共有結合している、項目20に記載の治療組成物。
(項目24)
前記PEG分子が、直鎖または分岐鎖PEG分子である、項目20に記載の治療組成物。
(項目25)
前記PEGが、約1,000〜約40,000の総重量平均分子量を有する、項目20に記載の治療組成物。
(項目26)
前記PEGが、約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有する、項目20に記載の治療組成物。
(項目27)
前記リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバマート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはその任意の組み合わせである、項目20〜26のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目28)
前記スクシニル基の起源がスクシンイミジルスクシナートである、項目27に記載の治療組成物。
(項目29)
患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する、単離アルギニンデイミナーゼ、またはADI活性を有するその断片。
(項目30)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominis由来でない、項目29に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目31)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、表1に列挙される生物由来である、項目29または30に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目32)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、ADI−PEG20の特性に匹敵するかまたはそれより良い1つ以上の特性を有する、項目29〜31のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目33)
前記1つ以上の特性が、Kcat、Km、pH最適条件、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血液中に既存しないイオンもしくは補因子への要求がないこと、またはその任意の組み合わせである、項目32に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目34)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて少なくとも20個の表面残基変化を有する、項目29〜33のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目35)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて20〜135個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目36)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて40〜100個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目37)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて30〜60個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目38)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて80〜100個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目39)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、M.hominisのアルギニンデイミナーゼと比べて100〜120個の表面残基変化を有する、項目34に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目40)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma spumans、Mycoplasma canadense、Mycoplasma auris、Mycoplasma hyosynoviae、Mycoplasma cloacale、Mycoplasma anseris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma orale、Mycoplasma iners、Mycoplasma meleagridis、Mycoplasma alvi、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma gallinarum、Mycoplasma pirum、Mycoplasma primatum、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma lipofaciens、Mycoplasma felifaucium、Mycoplasma imitans、Mycoplasma opalescens、Mycoplasma moatsii、Mycoplasma elephantis、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma testudinis、Mycoplasma sp.CAG:877、またはMycoplasma sp.CAG:472由来である、項目29〜39のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目41)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、配列番号2〜28のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む、項目29〜40のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目42)
前記単離アルギニンデイミナーゼが、少なくとも1つのペグ化部位を除去するように修飾されている、項目29〜41のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目43)
少なくとも1個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目29〜42のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目44)
少なくとも5個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目43に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目45)
少なくとも10個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目43に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目46)
少なくとも15個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目43に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目47)
少なくとも20個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、項目43に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目48)
前記アルギニンデイミナーゼが、リンカーを介してPEG分子に共有結合している、項目29〜47のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目49)
前記アルギニンデイミナーゼが、1個より多くのPEG分子に共有結合している、項目48に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目50)
前記アルギニンデイミナーゼが、約1〜約10個のPEG分子に共有結合している、項目48または49に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目51)
前記アルギニンデイミナーゼが、約2〜約8個のPEG分子に共有結合している、項目50に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目52)
前記PEG分子が、直鎖または分岐鎖PEG分子である、項目48〜51のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目53)
前記PEGが、約1,000〜約40,000の総重量平均分子量を有する、項目48〜52のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目54)
前記PEGが、約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有する、項目53に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目55)
前記リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバマート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはその任意の組み合わせである、項目48〜54のいずれか1項に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目56)
前記スクシニル基の起源がスクシンイミジルスクシナートである、項目55に記載の単離アルギニンデイミナーゼ。
(項目57)
先行項目のいずれか1項に記載の前記単離アルギニンデイミナーゼをコードするポリヌクレオチド。
(項目58)
項目57に記載の前記ポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目59)
項目58に記載の前記ベクターを含む単離宿主細胞。
(項目60)
化学療法薬をさらに含む、先行項目のいずれか1項に記載の治療組成物。
(項目61)
前記化学療法薬が、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ及びエベロリムスから成る群より選択される、項目60に記載の治療組成物。
(項目62)
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、それが必要な患者に、治療的に有効な量の、先行項目のいずれか1項に記載の治療組成物または単離アルギニンデイミナーゼを投与し、それによって前記癌を治療し、その症状を寛解させ、またはその進行を阻害することを含む、前記方法。
(項目63)
前記癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害が必要な患者が、抗ADI−PEG20抗体を有すると判定されている、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記癌が、肝細胞癌、黒色腫、転移性黒色腫、膵癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞腫、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌(stomach cancer)から成る群より選択される、項目62または63に記載の方法。
(項目65)
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、それが必要な患者に、治療的に有効な量の、ADI−PEG20を含む組成物を投与し、一定期間後に、先行項目のいずれか1項に記載の治療組成物またはアルギニンデイミナーゼを前記患者に投与し、それによって前記癌を治療し、その症状を寛解させ、または進行を阻害する、前記方法。
(項目66)
前記一定期間が、前記患者における所定レベルの抗ADI−PEG20抗体を検出することによって決定され、前記治療組成物が、前記所定レベルの前記抗ADI−PEG20抗体の検出後に投与される、項目65に記載の方法。(項目67)
前記一定期間が、前記患者におけるADI活性によって決定され、前記治療組成物が、所定レベルまたは低減レベルのADI活性の検出後に投与される、項目65に記載の方法。
(項目68)
癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害用薬物の製造における、先行項目のいずれか1項に記載の治療組成物または単離アルギニンデイミナーゼの使用。
詳細な説明
本発明の実施形態は、選択ADI酵素に関し、一部の実施形態において、リンカー、例えば、安定リンカーを介してPEGと結合している。一部の実施形態において、ADI酵素は、少数あるいは、例えば野生型配列または基準配列(例えば、表1参照)に比べて低減した数の表面リジン残基を有するように操作または選択される。選択ADI酵素は、多数のADI酵素から、異なる生物から、それらの有利な特性に基づいて選択される。これらの特性としては、アルギニンのシトルリン及びアンモニアへのADI変換経由でヒト血液における低アルギニン濃度を確立及び維持する酵素の能力が挙げられる。一部の実施形態において、選択ADI分子は、ADI−PEG20に比べて、抗ADI−PEG20抗体に対する低減した交差反応性を有し、該抗体は、患者の以前のADI−PEG20による治療に起因する可能性がある。
本発明の実施形態は、選択ADI酵素に関し、一部の実施形態において、リンカー、例えば、安定リンカーを介してPEGと結合している。一部の実施形態において、ADI酵素は、少数あるいは、例えば野生型配列または基準配列(例えば、表1参照)に比べて低減した数の表面リジン残基を有するように操作または選択される。選択ADI酵素は、多数のADI酵素から、異なる生物から、それらの有利な特性に基づいて選択される。これらの特性としては、アルギニンのシトルリン及びアンモニアへのADI変換経由でヒト血液における低アルギニン濃度を確立及び維持する酵素の能力が挙げられる。一部の実施形態において、選択ADI分子は、ADI−PEG20に比べて、抗ADI−PEG20抗体に対する低減した交差反応性を有し、該抗体は、患者の以前のADI−PEG20による治療に起因する可能性がある。
特定実施形態において、ADI酵素は、腎クリアランス及びタンパク質分解に対する保護、ならびに低減した免疫原性または抗原性を提供するためにペグ化される。ペグ化の有効性を高めるため、酵素への修飾を操作して、表面リジン残基の数を減らし、ひいては利用可能なPEG付着部位の数を制限することができる。場合によっては、リジン残基の数を減らすことにより、残りのリジン付着残基におけるさらに完全かつ均一なペグ化を可能にする。
一部の実施形態において、メトキシ-PEGをADIに付着させるように選択されたP
EGリンカーは化学的に安定した結合を与える。安定リンカーは分子の生物活性寿命を増加させると予想される。化学的に安定したリンカーは、加水分解を排除し、酵素表面に付着した脱ペグ化リンカーに生じ得る免疫反応を低減させることにもなる。
EGリンカーは化学的に安定した結合を与える。安定リンカーは分子の生物活性寿命を増加させると予想される。化学的に安定したリンカーは、加水分解を排除し、酵素表面に付着した脱ペグ化リンカーに生じ得る免疫反応を低減させることにもなる。
これらの累積的な特異化は、患者の血液からアルギニンを効率的に除去し、以前のアルギニン枯渇療法からの抗ADI−PEG20抗体によって中和または除去されない1つ以上の分子をもたらす。該分子は、それら自体の免疫原性のために中和及びクリアランスを遅らせるようにペグ化される。これらの因子は、アルギニン枯渇療法を延長し、ひいては抗癌療法としてのアルギニン枯渇療法の有効性を高めるためにADI−PEG20に代わるかまたはADI−PEG20に加えた(例えば、後続薬物として)それらの使用を可能にする。
正常な細胞は、ASS及びASLによって触媒される2段階プロセスでシトルリンからアルギニンを合成できるので、成長のためにアルギニンを必要としない。対照的に、特定の癌はASSを発現しない。特定の癌はASLを発現せず、他の癌はASS及び/またはASLの発現を減少させたことがあるか、またはASS及び/またはASLを発現し得ない。したがって、これらの癌はアルギニンに対して栄養要求性である。この代謝の相違は、これらの形態の癌を治療するための安全かつ有効な療法を開発するために十分に生かすことができる。ADIは、アルギニンジヒドロラーゼ経路によるアルギニンからシトルリンへの変換を触媒し、結果としてアルギニンを排除するために使用し得る。
本発明の実施は、特に反対の指定がない限り、当該技術分野のスキルの範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組み換えDNA技術の従来の方法を利用することになり、その多くのものについて例示目的で以下に記載する。該技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Protein Science,Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009);Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.、Wiley&Sons,1995;Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);Mania
tis et al.Molecular Cloning:A Laboratory
Manual(1982);DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984);Nucleic
Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)及び他の類似の参考文献を参照されたい。
tis et al.Molecular Cloning:A Laboratory
Manual(1982);DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984);Nucleic
Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)及び他の類似の参考文献を参照されたい。
組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換のために標準技術(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従うかまたは当該技術分野で一般的に達成されるようにまたは本明細書の記載通りに行なってよい。これら並びに関連する技術及び手順は一般的に技術上周知の従来法に従って、また本明細書全体を通じて引用及び考察する種々の一般的及びより具体的な参考文献の記載通りに行なってよい。具体的な定義を与えていない限り、本明細書に記載の分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬及び薬化学に関連して利用する命名法、ならびにそれらの研究室の手順及び技術は、当該技術分野で周知かつ一般的に使用されているものである。組み換え技術、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、医薬品の調製、処方、及び送達、並びに患者の治療のために標準技術を使用することができる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形の「a」、「an」及び「the」は、内容から特に明白に示されない限り、複数の言及を包含する。
「約」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1%程度変動する数量、レベル、値、数、頻度、率、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」には、天然に存在するアミノ酸及び非天然アミノ酸のみならず、アミノ酸類似体及び模倣物も含まれる。天然に存在するアミノ酸としては、タンパク質生合成中に利用される20個の(L)−アミノ酸のみならず、例えば、4−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリン及びオルニチンなどの他のアミノ酸が挙げられる。非天然アミノ酸としては、例えば、ノルロイシン、ノルバリン、p−フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどがあり、これらは当業者に周知である。アミノ酸類似体には、天然及び非天然アミノ酸の修飾形が含まれる。該修飾としては、例えば、アミノ酸に関するかまたはアミノ酸の誘導体化による化学基及び部分の置換(substitutionまたはreplacement)が挙げられる。アミノ酸模倣物としては、例えば、基準アミノ酸の電荷及び電荷スペーシングなどの機能的に類似の特性を示す生物構造体が挙げられる。例えば、アルギニン(ArgまたはR)を模倣する生物構造体は、天然に存在するArgアミノ酸の側鎖のe−アミノ基と類似の分子空間に位置する正電荷部分を有し、同程度の移動度を有する。模倣物には、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適スペーシング及び電荷相互作用を維持するように制約された構造体も含まれる。当業者は、どんな構造体が機能的に等価なアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を構成するかを知っているかまたは決めることができる。
本明細書全体を通じて、内容から特に必要とされない限り、単語「含む(comprise)」、または「含む(comprises)」若しくは「含むこと(comprising)」などの変形は、当然のことながら、記述要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を包含することを意味するが、いずれの他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を意味しない。
「生体適合性」は、一般的に生物学的機能に対して傷害性でなく、かつアレルギー及び疾患状態を含め、いかなる程度の許容できない毒性をももたらさない物質または化合物を指す。
用語「内毒素を含まない」及び「内毒素を実質的に含まない」は、一般的に多くても痕跡量(例えば、対象に対して臨床的に有害な生理作用を持たない量)の内毒素、好ましくは検出不可能な量の内毒素を含有する組成物、溶媒、及び/または容器に関するものである。内毒素は、特定細菌、典型的にはグラム陽性菌と関連する毒素であるが、内毒素はリステリア・モノサイトゲネスなどのグラム陰性菌に見られることもある。最も蔓延している内毒素は、種々のグラム陰性菌の外膜に見られるリポ多糖(LPS)またはリポオリゴ糖(LOS)であり、これらの細菌が疾患を引き起こす能力の中心的病原性特徴となる。ヒトにおける少量の内毒素は、いくつかある有害な生理作用の中で特に、発熱、血圧低下、並びに炎症及び血液凝固の活性化を引き起こし得る。
したがって、医薬品製造において、少量でさえヒトに有害作用をもたらし得るので、多くの場合、薬物製品及び/または薬物容器から内毒素のほとんどまたは全ての痕跡を除去することが望ましい。ほとんどの内毒素を分解するためには典型的に300℃を超える温度が必要なので、この目的で脱発熱物質オーブンを使用してよい。例えば、注射器またはバイアルなどの主包装材料に基づいて、内毒素レベルの3log低減を達成するためには250℃のガラス温度と30分の保持時間の組み合わせで十分なことが多い。例えば、本明細書に記載され、当該技術分野で知られるクロマトグラフィー及び濾過法を含め、内毒素を除去する他の方法が企図される。本発明の組成物に内毒素が存在するリスクを排除までしなくても減少させるために哺乳類細胞などの真核細胞内でポリペプチドを生成し、そこからそれらを単離する方法も含まれる。無血清細胞内でポリペプチドを生成し、そこからそれらを単離する方法が含まれる。
当該技術分野で知られる常用手技を用いて内毒素を検出することができる。例えば、カブトガニからの血液を利用するLimulus Amoebocyte Lysateアッセイは、内毒素の存在を検出するための高感度アッセイである。この試験において、非常に低いレベルのLPSが、この反応を増幅する強力な酵素カスケードのためカブトガニライセートの検出可能な血液凝固を引き起こし得る。酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって内毒素を定量化することもできる。実質的に内毒素を含まないために、内毒素レベルは、約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、または10EU/mlであってよい。典型的に、1ngのリポ多糖(LPS)は、約1〜10EUに相当する。
ポリペプチドの「半減期」は、ポリペプチドが、生物の血清もしくは組織への投与時の該活性に比べて、または他の規定時点に比べて、その薬理学的、生理学的、または他の活性の半分を失うのにかかる時間を指し得る。「半減期」は、ポリペプチドの量もしくは濃度が、生物の血清もしくは組織への投与時の該量もしくは濃度に比べて、またはいずれかの他の規定時点に比べて、生物の血清もしくは組織に投与された出発量の半分だけ減少するのにかかる時間を指すこともある。半減期は、血清及び/またはいずれかの1つ以上の選択組織において測定可能である。
「相同性」は、同一であるかまたは保存的置換を構成するアミノ酸の百分率数を指す。相同性は、参照することによりその内容をここに援用するGAP(Deveraux et al.,Nucleic Acids Research.12,387−395,1984)などの配列比較プログラムを用いて決定可能である。このようにして、本明細書で引用するものと同様または実質的に異なる長さの配列は、ギャップのアラインメントへの挿入によって比較可能であり、該キャップは、例えばGAPが用いる比較アルゴリズムによって決定される。
用語「調節すること」及び「変化させること」は、コントロールに対して統計的に有意もしくは生理学的に有意な量または度合で「増加させること」、「強化すること」または「刺激すること」、ならびに「減少させること」または「低減させること」を包含する。「増加した」、「刺激された」または「強化された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、組成物がないか(例えば、薬剤の非存在)またはコントロール組成物によってもたらされる量の1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍またはそれより多い(例えば、500、1000倍)(全ての整数及び間の範囲、例えば、1.5、1.6、1.7、1.8などを含めて)増加を包含し得る。「減少した」または「低減した」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、組成物がないか(例えば、薬剤の非存在)またはコントロール組成物によってもたらされる量の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%の減少(全ての整数及び間の範囲を含めて)を包含し得る。比較及び「統計的に有意な」量の例は、本明細書に記載してある。
「患者」または「対象」は動物を指し、特定実施形態では哺乳動物、具体的実施形態ではヒトを指す。
特定実施形態において、組成物中のいずれかの所与の薬剤(例えば、ADIr、ADIr−PEG)の「純度」を具体的に定義することができる。例えば、特定組成物は、例えば、また手段を限定しないで、生化学及び分析化学で化合物を分離、同定、及び定量化するために頻繁に用いられる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、周知形態のカラムクロマトグラフィーによって測定した場合に、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%、全ての小数及び間の範囲を含めた純度である薬剤を含み得る。
用語「基準配列」は、別の配列と比較している一般的に核酸コード配列、またはアミノ酸配列を指す。本明細書に記載の全てのポリペプチド及びポリヌクレオチド配列は、表及び配列表に記載の名称によって示される当該配列ならびに表及び配列表に記載の当該配列を含めた基準配列として包含される。
本明細書で使用する用語「配列同一性」、または例えば、「〜と50%同一の配列」を含むとは、配列が、比較ウィンドウにわたってヌクレオチドごとに基づくかまたはアミノ酸ごとに基づいて同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにわたって2つの最適に整列された配列を比較し、両配列に同一核酸塩基(例えば、A、T、C、G、I)または同一アミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及びMet)が存在してマッチした位置の数をもたらす位置の数を決定し、マッチした位置の数を比較ウィンドウの位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割って、その結果に100を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出し得る。
2つ以上のポリペプチド間の配列の関係を示すために用いる用語には、「基準配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」及び「実質的同一性」が含まれる。「基準配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含めて、少なくとも12個、頻繁には15〜18個、多くの場合少なくとも25個のモノマー単位の長さであり得る。2個のポリペプチドはそれぞれ、(1)2個のポリペプチド間で類似の配列(すなわち、完全ポリペプチド配列の一部のみ)、及び(2)2個のポリペプチド間で異なる配列を含み得るので、2個(またはそれより多く)のポリペプチド間の配列比較は、典型的に2個のポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所領域を同定及び比較することによって行なわれる。「比較ウィンドウ」は、少なくとも6個、通常は約50〜約100個、さらに通常は約100〜約150個の近接位置の概念的セグメントを指し、その中で2つの配列を最適に整列させた後に同数の近接位置の基準配列と配列を比較する。比較ウィンドウは、2つの配列の最適アラインメントのために基準配列(付加または欠失を含まない)と比べて約20%以下の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでよい。比較ウィンドウの整列のための配列の最適アラインメントは、アルゴリズムのコンピュータ処理実行(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,WI,USAのGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)によるか、または選択された種々の方法のいずれかによって生成された挿入及び最良アルゴリズム(すなわち、比較ウィンドウにわたって最高百分率の相同性をもたらす)によって行ない得る。例えばAltschul et al.(Nucl.Acids Res.25:3389,1997)によって開示されているBLASTファミリーのプログラムをも参照し得る。配列
解析の詳細な考察はAusubel et al.のUnit 19.3(「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley&Sons Inc,1994−1998,Chapter 15)で見つけ
ることができる。
解析の詳細な考察はAusubel et al.のUnit 19.3(「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley&Sons Inc,1994−1998,Chapter 15)で見つけ
ることができる。
配列間の配列類似性または配列同一性(本明細書ではこれらの用語を互換的に使用する)の計算は以下のように行なうことができる。2個のアミノ酸配列、または2個の核酸配列の同一性パーセントを決定するため、最適の比較目的に合わせて整列させることができる(例えば、最適アラインメントのためには第1及び第2のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを挿入することができ、比較目的では非相同性配列を無視することができる)。特定実施形態において、比較目的で整列された基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、60%、なおさらに好ましくは少なくとも70%、80%、90%、または100パーセントである。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1配列の位置が、第2配列の対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されているときは、当該位置で分子は同一である。
2つの配列間の同一パーセントは、これらの配列が共有している同一位置の数の関数であり、2つの配列の最適アラインメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮する。
配列の比較及び2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成可能である。一部の実施形態において、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunschのアルゴリズム(J.Mol.Biol.48:444−453,1970)を利用して、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、及び16、14、12、10、8、6、または4のギャップウェイト及び1、2、3、4、5、または6の長さウェイトを用いて2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定する。一部の実施形態において、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを利用して、NWSgapdna.CMPマトリックス並びに40、50、60、70、または80のギャップウェイト及び1、2、3、4、5、または6の長さウェイトを用いて2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定する。パラメーターの別の例示セット(及び特に指定のない限り使用すべきセット)としては、12のギャップペナルティー、4のギャップ伸長ペナルティー、及び5のフレームシフトギャップペナルティーを用いるBlossum 62スコアリングマトリックスがある。2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれたE.Meyers及びW.Millerのアルゴリズム(Cabios.4:11−17,1989)を利用して、PAM120ウェイト残分テーブル、12のギャップ長ペナルティー及び4のギャップペナルティーを用いても決定可能である。
用語「溶解性」は、本明細書で提供するADIr酵素が液体溶媒に溶解し、均質溶液を形成する特性を指す。溶解度は、典型的に溶媒単位体積当たりの溶質の質量(溶媒1kg当たりの溶質のg、dL(100mL)当たりのg、mg/mlなど)、モル濃度、モル濃度、モル分率による濃度または他の類似の記述の濃度として表される。溶質が溶媒量毎に溶解できる最大平衡量は、温度、圧力、pH、及び溶媒の性質を含めた規定条件下で当該溶媒における当該溶質の溶解度である。特定実施形態において、溶解度は、生理学的pH、または他のpH、例えば、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH7.2、pH7.4、pH7.6、pH7.8、またはpH8.0で測定される。特定実施形態において、溶解度は、水またはPBSもしくはNaCl(NaPの有無にかかわらず)などの生理緩衝液または本明細書に記載の他の緩衝液/組成物中で測定される。具体的実施形態において、溶解度は、相対的に低いpH(例えば、pH6.0)及び相対的に高い塩(例えば、500mMのNaCl及び10mMのNaP)で測定される。特定実施形態において
、溶解度は、血液または血清などの生物流体(溶媒)中で測定される。特定実施形態において、温度はほぼ室温(例えば、約20、21、22、23、24、25℃)またはほぼ
体温(37℃)で測定される。特定実施形態において、ADIr酵素は、室温または37℃で少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、または30mg/mlの溶解度を有する。
、溶解度は、血液または血清などの生物流体(溶媒)中で測定される。特定実施形態において、温度はほぼ室温(例えば、約20、21、22、23、24、25℃)またはほぼ
体温(37℃)で測定される。特定実施形態において、ADIr酵素は、室温または37℃で少なくとも約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、または30mg/mlの溶解度を有する。
「実質的に」または「本質的に」は、ある所与の量のほとんど全体的または完全に、例えば、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上を意味する。
「統計的に有意」とは、結果が偶然によって生じた可能性が低かったことを意味する。統計的有意性は、当該技術分野で知られるいずれの方法によっても決定可能である。有意性の一般的に用いられる尺度にはp値があり、これは、帰無仮説が真実であった場合に、観察された事象が起こる頻度または確率である。得られたp値が有意レベルより小さい場合に、帰無仮説が否定される。単純な事例において、有意レベルは、0.05以下のp値で規定される。
本明細書の各実施形態は、特に明確に記述されない限り、あらゆる他の実施形態に準用されるべきである。
本開示全体を通じて、下記略語を使用することができる:PEG、ポリエチレングリコール;ADI、アルギニンデイミナーゼ;SS、スクシンイミジルスクシナート;SSA、スクシンイミジルスクシンイミド;SPA、シクシンイミジルプロピオナート;NHS、N−ヒドロキシ−スクシンイミド;ASS1またはASS、アルギニノコハク酸シンテターゼ;ASL、アルギニノコハク酸リアーゼ。
ADI酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、微生物、組み換えバイオテクノロジーまたはその任意の組み合わせを含めたいずれの起源からも誘導、クローン化、単離、合成または生成され得る。例えば、アルギニンデイミナーゼは、Mycoplasma属の微生物からクローン化され得る。特定実施形態において、アルギニンデイミナーゼは、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma spumans、Mycoplasma canadense、Mycoplasma auris、Mycoplasma hyosynoviae、Mycoplasma cloacale、Mycoplasma anseris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma orale、Mycoplasma iners、Mycoplasma meleagridis、Mycoplasma alvi、Mycoplasma penetrans、Mycoplasma gallinarum、Mycoplasma pirum、Mycoplasma primatum、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma lipofaciens、Mycoplasma felifaucium、Mycoplasma imitans、Mycoplasma opalescens、Mycoplasma moatsii、Mycoplasma elephantis、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma testudinis、Mycoplasma sp.CAG:877、もしくはMycoplasma sp.CAG:472、またはその任意の組み合わせからクローン化される。一部の実施形態において、アルギニンデイミナーゼは、表1に列挙される種からクローン化される。特定の実施形態において、ADIは、配列番号2〜28のいずれか1つのアミノ酸配列、またはADI活性を有する(例えば、アルギニンをシトルリン及びアンモニアに代謝することができる)そのバリアントまたは断片または延長部分を含む。該ADI酵素は、既知技術を用いて調製または合成可能である。
特定実施形態において、本明細書に記載のADI酵素をM.hominis由来のベンチマークADI−PEG20分子と比較する。本明細書で使用する場合、「ADI−PEG20」は、当該技術分野で知られ、例えば米国特許第6,183,738号及び第6,635,462号に記載されているADI分子を指す。Ascierto ,et al.,(2005).Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic melanoma:results from phase I and II studies.J Clin Oncol 23(30):7660−7668;Izzo F,et
al.(2004)Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma:results from phase I/II studies.J Clin Oncol 22(10):1815−1822;Holtsberg FW,et al.(2002),Poly(ethylene glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase:effects of PEG formulations on its pharmacological properties.J Control Release 80(1−3):259−271;Kelly et al.,(2012)British Journal of Cancer 106,324−332をも参照されたい。当業者には認識されるように、この分子は、M.hominis由来のペグ化(PEG20,000)ADI酵素であり、野生型M.hominisのADI酵素に比べて2つの置換(K112E、P210S)を有する。
al.(2004)Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma:results from phase I/II studies.J Clin Oncol 22(10):1815−1822;Holtsberg FW,et al.(2002),Poly(ethylene glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase:effects of PEG formulations on its pharmacological properties.J Control Release 80(1−3):259−271;Kelly et al.,(2012)British Journal of Cancer 106,324−332をも参照されたい。当業者には認識されるように、この分子は、M.hominis由来のペグ化(PEG20,000)ADI酵素であり、野生型M.hominisのADI酵素に比べて2つの置換(K112E、P210S)を有する。
本明細書に記載のアルギニンデイミナーゼ酵素は、多数のADI酵素からスクリーニングされ、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減したレベルの反応性及び/または他の有利な特性を有すると考えられる。抗ADI−PEG20抗体は、ADI−PEG20で治療された対象に出現する可能性があり、既知の方法論を用いて測定可能である。抗ADI−PEG20抗体に対する反応性は、例えば、当業者に知られるELISAまたは他の類似のアッセイを用いて決定可能である。
この点で、ADI−PEG20は、患者の抗ADI−PEG20抗体に対する交差反応性レベルを評価する対照として使用可能である。患者の抗ADI−PEG20抗体に対するADI−PEG20の交差反応性レベルより統計的に有意に低い交差反応性レベルが本明細書において役立ち得る。特定実施形態において、本明細書に記載のアルギニンデイミナーゼ酵素は、抗ADI−PEG20抗体に対して低い交差反応性を有するかまたは交差反応性を全く持たない。特定実施形態において、ADI−PEG20との反応性に比べて抗ADI−PEG20抗体に対する反応性のいずれの低減も、該ADI酵素はアルギニン枯渇療法が必要な患者の治療選択肢を改善するので有益であり得る。したがって、一部の実施形態において、本明細書に記載のアルギニンデイミナーゼ酵素は、患者の抗ADI−PEG20抗体に対するADI−PEG20の反応性に比べて患者の抗ADI−PEG20抗体に対する低減した交差反応性を有する。
本明細書では、「ADIr」を用いて、抗ADI−PEG20抗体に対するADI−PEG20の反応性に比べて該抗体に対して低減した反応性を有する本発明のADI酵素を指す。「ADIr」という名称を用いて、本明細書で同定される分子を当該技術分野で既知のADI及びADI−PEG20と区別する。ADIr酵素の例としては、配列番号2〜28、及び配列番号1またはADI−PEG20とはアミノ酸配列が異なるそのバリアントが挙げられる。
一部の実施形態において、本発明のADIr酵素は、アルギニンレベルを低減させて有効な癌治療に適した低い血中アルギニンレベルを維持するために、ADI−PEG20の特徴または特性に匹敵するかまたはそれより良い特徴または特性を有する。該特性の例としては、Kcat、Km、pH最適条件、安定性、インビボタンパク質分解安定性及び血液中に既存しないイオンもしくは補因子への要求がないこと、またはその任意の組み合わせが挙げられる。特定実施形態において、本明細書に記載のADIrは、ADI−PEG20の匹敵する特性より、約または少なくとも20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超えて高い特性を有する。一部の実施形態において、本明細書に記載のADIrは、比較されるADI−PEG20の特定の特性より、約または少なくとも約100%、105%、110%、120%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、250%、260%、280%、300%、320%、340、350%、360%、400%、420%、450%、460%、500%、520%、550%またはそれを超えて高い特性を有する。
したがって、特定実施形態において、ADIrは、ADI−PEG20のKcatの約または少なくとも約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはより良いKcatを有する。特定実施形態において、ADIrは、ADI−PEG20のKcatの約または少なくとも約100%、105%、110%、120%、125%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、250%、260%、280%、300%、320%、340、350%、360%、400%、420%、450%、460%、500%、520%、550%、またはより長い時間のKcatを有する。特定実施形態において、本明細書に記載のADIr酵素、またはそれを含む組成物のKcatは、約0.5秒−1〜約15秒−1、約1秒−1〜約12秒−1、約1秒−1〜約10秒−1、約1.5秒−1〜約9秒−1、約2秒−1〜約8秒−1、または約2.5秒−1〜約7秒−1である。特定実施形態において、組成物中のADIrまたはADIr−PEGは、約2.5秒−1〜約7.5秒−1のKcatを有する。一部の実施形態において、組成物中のADIrまたはADIr−PEGは、約2.5秒−1、約3秒−1、約3.5秒−1、約4秒−1、約4.5秒−1、約5秒−1、約5.5秒−1、約6秒−1、約6.5秒−1、約7秒−1、約7.2秒−1、約7.5秒−1、約8秒−1、約10秒−1、約15秒−1、約20秒−1、約25秒−1、約30秒−1、約35秒−1、約40秒−1、約45秒−1、約50秒−1、約55秒−1、約60秒−1、約65秒−1、約70秒−1、約75秒−1、約80秒−1、約85秒−1、約90秒−1、約95秒−1、または約100秒−1のKcatを有する。
特定実施形態において、ADIrは、ADI−PEG20のKmの約または少なくとも約5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはより良いKmを有する。特定実施形態において、ADIrは、ADI−PEG20のKmの約または少なくとも約100%、105%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、または250%のKmを有する。特定の実施形態において、ADIr、またはそのペグ化製剤は、約0.5μM〜約50μM、または約1.6μM〜約48μM、または約0.5μM〜約15μM、約1μM〜約12μM、約1μM〜約10μM、約1.5μM〜約9μM、約1.5μM〜約8μM、または約1.5μM〜約7μMのKmを有する。特定実施形態において、組成物中のADIrまたはADIr−PEGは、約1.5μM〜約6.5μMのKmを有する。一部の実施形態において、ADIrまたはそのペグ化製剤は、約1.5μM、約1.6μM、約2μM、約2.5μM、約3μM、約3.5μM、約4μM、約4.5μM、約5μM、約5.5μM、約6μM、約6.5μM、約7μM、約8μM、約9μM、約10μM、約12μM、約14μM、約15μM、約16μM、約18μM、約20μM、約22μM、約24μM、約25μM、約26μM、約28μM、約30μM、約32μM、約34μM、約35μM、約36μM、約38μM、約40μM、約42μM、約44μM、約45μM、約46μM、約48μM、または約50μMのKmを有する。
特定実施形態において、ADIrは、ヒト血液の生理学的pHに近いpHで機能する。したがって、一部の実施形態において、ADIrは、約4〜約10.8、または約6〜約8、または約6.5〜約7.5のpHで機能する。特定実施形態において、ADIrは約pH7.4で良好な酵素活性を有する。
特定実施形態において、ADIrは、長期保存中の安定性並びに人体の治療中の温度及びタンパク質分解安定性を有する。一部の実施形態において、ADIrは、活性のために、血液中に既存しないイオンまたは補因子を要求しない。
特定実施形態において、本明細書に記載のADIrは、一般にM.hominisと十分異なるアミノ酸配列を有し、その結果、抗ADI−PEG20抗体のための抗原部位を減らすかまたは排除することになる表面残基変化がある。一部の実施形態において、対象における選択ADIr分子と既存抗ADI−PEG20抗体との間の交差反応性(例えば、統計的に有意な交差反応性)はなく、M.hominisのADIに対する既存反応の成熟ではなく、完全に新しい免疫反応が対象に生じることになる。したがって、一部の実施形態において、本明細書に記載のADIrは、配列番号1に記載のM.hominisのADIに対して20%〜85%の配列同一性を有する。特定実施形態において、本明細書に記載のADIrは、M.hominisのADIに対して10%または15%の同一性などのさらに低いパーセントの配列同一性を有する。特定実施形態において、本明細書に記載のADIrは、M.hominisのADIに対して20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%または83%さえの同一性を有し、それでも抗ADI−PEG20抗体に対して低減した交差反応性を有する。
特定実施形態において、本明細書に記載のADIrは、M.hominisのADIと比べて約10〜140、15〜140、または25〜140個の表面残基変化を有する。表面残基は、M.hominisのADIの結晶構造から識別可能であり、他の生物由来のADIの表面残基は、配列相同性によって決定可能である。本明細書に記載のADIrは、M.hominisのADIと比べて約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、または約140個の表面残基変化を有し得る(配列番号1参照)。
一部の実施形態において、本明細書に記載のADIrは、M.hominisのADIと比べて約10〜140、15〜140、または25〜140個の残基変化を有する。該残基変化は、表面アミノ酸残基の変化のみである必要はない。該残基変化(または付加もしくは欠失)は、修飾されたADIが本明細書に記載の所望のADI活性を有するように、分子末端であっても、またはADIのいずれの残基であってもよい。変化すべき残基は、M.hominisのADIの結晶構造から識別可能であり、他の生物由来のADIの残基は、配列相同性によって決定可能である。本明細書に記載のADIrは、M.hominisのADIと比べて約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、または約140個のアミノ酸残基変化を有し得る(配列番号1参照)。
多数のADI酵素から、表1は、27個のADIr酵素及びそれらのM.hominisのADIに対する配列同一性パーセントを列挙する。
特定実施形態において、多数の選択種から本明細書で同定されたADIr酵素は、規定数(特定実施形態では、30個以上まで)の表面リジン残基を有する。抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有する、本明細書で同定された特定のADIr酵素は、約または少なくとも約0、1、2、3、4、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、もしくは60個、またはそれ以下の表面リジン残基を有し、間の全ての範囲を含める。
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」は、互換的に使用され、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。用語「酵素」には、ポリペプチドまたはタンパク質触媒も含まれ、ADIrに関してはタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと互換的に使用される。この用語には、シグナル配列のミリストイル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化及び付加または欠失などの修飾が含まれる。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸の1つ以上の鎖を意味し、各鎖は、ペプチド結合により共有結合しているアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合により非共有結合及び/または共有結合し、未変性タンパク質、すなわち天然に存在し、特に非組み換え細胞によって産生されたか、または遺伝子操作された細胞もしくは組み換え細胞によって産生されたタンパク質の配列を有する複数の鎖を含むことができ、かつ未変性タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または未変性配列の1つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加及び/もしくはその置換を有する分子を含むことがある。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、特に、本明細書に記載のADIr酵素/タンパク質、またはADIrタンパク質の1つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加、及び/またはその置換を有する配列を包含する。特定実施形態において、ポリペプチドは、そうしないと細胞内では見られないであろう異種ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の組み合わせから典型的に作製される1つ以上の組み換えDNA分子を含む組み換え細胞によって産生される「組み換え」ポリペプチドである。
本明細書で言及する用語「単離タンパク質」は、対象タンパク質が、(1)自然界に典型的に一緒に見られるであろう少なくともいくつかの他のタンパク質を含まず、(2)同起源、例えば同種由来の他のタンパク質を本質に含まず、(3)異なる種の細胞によって発現され、(4)自然界においてそれが関連するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約50パーセントから分離されており、(5)「単離タンパク質」が自然界において関連するタンパク質の一部と(共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって)関連せず、(6)自然界においてそれが関連しないポリペプチドと(共有結合性もしくは非共有結合性相互作用によって)使用可能に関連し、または(7)自然界に生じないことを意味する。該単離タンパク質は、合成起源であり得るゲノムDNA、cDNA、mRNAもしくは他のRNA、またはその任意の組み合わせによってコードされ得る。特定実施形態において、単離タンパク質は、その使用(治療用、診断用、予防用、研究用その他)を妨害するであろう、その自然環境で見られるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
用語「バリアント」は、本明細書で具体的に開示する基準ポリペプチド(例えば、配列番号1〜28)と1つ以上の置換、欠失、付加及び/または挿入によって異なるポリペプチドを包含する。バリアントポリペプチドは生物学的に活性であり、すなわち、それらは、基準ポリペプチドの酵素活性または結合活性を有し続けている。該バリアントは、例えば、遺伝子多型から及び/またはヒトの操作から生じ得る。
多くの場合、生物学的に活性なバリアントは、1つ以上の保存的置換を含有することになる。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの二次構造及び疎水性親水性の性質が実質的に不変であると予想するように、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されるものである。上述したように、本明細書に記載のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造に修飾を施してよく、それでも所望の特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。
例えば、特定アミノ酸は、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子の結合部位などの構造との相互作用的結合能を認識できるほど失うことなく、タンパク質構造において他のアミノ酸と置き換わり得る。当該タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の相互作用能及び性質であることから、タンパク質配列及び当然のことながらその基礎となるDNAコード配列に特定アミノ酸配列の置換を行うことができ、それにもかかわらず類似の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、開示組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応DNA配列に、それらの有用性を認識できるほど失うことなく種々の変更を加え得ることが企図される。
該変更を加える際に、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。当該技術分野では一般的に、相互作用的生物学的機能をタンパク質に与える際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性が理解されている(参照することにより本明細書に援用するKyte&Doolittle,1982)。アミノ酸の相対的な疎水性親水性の特徴が、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、そのことが、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定すると認められている。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている(Kyte&Doolittle,1982)。これらの値は、イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(−0.4)、トレオニン(−0.7)、セリン(−0.8)、トリプトファン(−0.9)、チロシン(−1.3)、プロリン(−1.6)、ヒスチジン(−3.2)、グルタミン酸(−3.5)、グルタミン(−3.5)、アスパラギン酸(−3.5)、アスパラギン(−3.5)、リジン(−3.9)、及びアルギニン(−4.5)である。当該技術分野において、特定アミノ酸を類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換してよく、それでも類似の生物学的活性を有するタンパク質をもたらす、すなわち、それでも生物学的機能的に等価なタンパク質を得ることができることが知られている。該変更を加える際に、疎水性親水性指標が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のものが特に好ましく、±0.5以内のものがなおさらに特に好ましい。
当該技術分野において、類似のアミノ酸の置換を親水性に基づいて有効に施し得ることも理解される。米国特許第4,554,101号(参照することによりその内容全体を明確に本明細書に援用する)は、その隣接アミノ酸の親水性によって左右されるタンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。米国特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン(+3.0)、リジン(+3.0)、アスパラギン酸(+3.0±1)、グルタミン酸(+3.0±1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、トレオニン(−0.4)、プロリン(−0.5±1)、アラニン(−0.5)、ヒスチジン(−0.5)、システイン(−1.0)、メチオニン(−1.3)、バリン(−1.5)、ロイシン(−1.8)、イソロイシン(−1.8)、チロシン(−2.3)、フェニルアラニン(−2.5)、トリプトファン(−3.4)。当然のことながら、アミノ酸を類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置き換え、それでも生物学的に等価、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができる。該変更において、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のものが特に好ましく、±0.5以内のものがなおさらに特に好ましい。
したがって、上記に概説したように、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。種々の上記特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとトレオニン、グルタミンとアスパラギン、及びバリン、ロイシンとイソロイシンが挙げられる。
さらに残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び/または両親媒性における類似性に基づいてアミノ酸置換を行なってよい。例えば、負の電荷を持つアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸があり;正の電荷を持つアミノ酸には、リジン及びアルギニンがあり;類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、及びバリン、グリシン及びアラニン;アスパラギン及びグルタミン;ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンがある。保存的変化を表し得るアミノ酸の他の群には、(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his、及び(5)phe、tyr、trp、hisがある。
その上、またはこれとは別に、バリアントは非保存的変化を含有することがある。好ましい実施形態において、バリアントポリペプチドは、約10、9、8、7、6、5、4、3、2個より少数のアミノ酸、または1個さえのアミノ酸の置換、欠失または付加によって天然配列と異なる。その上(またはこれとは別に)、バリアントは、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、酵素活性、及び/または疎水性親水性に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失または付加によって修飾され得る。
一般に、バリアントは、基準ポリペプチド配列(例えば、配列番号1〜28)に約または少なくとも約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の類似性または配列同一性または配列相同性を示すことになる。さらに、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100個またはそれより多くのアミノ酸の付加(例えば、C末端付加、N末端付加、その両方)、欠失、切断、挿入、または置換により天然または親配列と異なるが、親または基準ポリペプチド配列の特性または活性を保持する配列が企図される。
一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも1個であるが、50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3、または2個未満のアミノ酸残基だけ基準配列と異なる。一部の実施形態において、バリアントポリペプチドは、約または少なくとも0.5%または1%であるが、20%、15%、10%または5%未満の残基だけ基準配列と異なる。(この比較がアラインメントを必要とする場合、配列は、最大類似性のために整列されるべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチによる配列からの「ループド(looped)」アウトが考慮される差である。)。
一部の実施形態において、ADIrは、全ての整数及び間の範囲を含め、約300〜約500個のアミノ酸長さになる。具体的実施形態において、ADIrは、全ての整数及び間の範囲を含め、約300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495または500個のアミノ酸長さになる。
用語「ポリペプチド断片」は、天然に存在するかまたは組み換えにより産生されたポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び/または内部欠失もしくは置換を有するポリペプチドを指す。特定実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも5〜約400個のアミノ酸長さのアミノ酸鎖を含むことができる。特定実施形態において、断片は、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、または400個のアミノ酸長さであると認識される。特に有用なポリペプチド断片は、本明細書に記載のADIrの触媒ADIドメインを含めた機能性ドメインを含む。ADIrの場合、有用な断片としては、限定するものではないが、触媒ドメイン及びα−ヘリカルドメインが挙げられる。
ADIへの抱合のために用いられる多くの活性化PEGはリジン残基に共有結合する。通常、リジン残基よりはるかに少ないPEG分子がADIに付着している。付着の数も分布も分子ごとに不均一であり得る。いずれの特定リジン残基も、ADI分子のごく一部分しか修飾されない。この部位修飾の不均一性及び低いPEG占有率は、薬物の特徴づけと抗原部位におけるPEG遮蔽の有効性の両方に関連する問題をもたらし得る。したがって、特定実施形態において、本明細書に記載の選択ADIr酵素は、他の残基型によるリジン置換により修飾されてリジン残基の数を減らす。これは、より均一にペグ化されたタンパク質をもたらし、残りのリジン残基におけるPEG占有率を高める。酵素活性を保存するため、他の残基に変えるべく選ばれた特有のリジン残基が選択されることになる。このより均一なペグ化は、血液中のタンパク質分解に対する保護の増加及び患者の抗体からの抗原部位の遮蔽の増加をもたらすと予想される。
特定実施形態において、米国特許第6,635,462号に記載されているようにADIr酵素を修飾する。特に、ADIrの天然に存在する1個以上のアミノ酸残基の修飾は、より容易に復元及び配合される酵素を提供し、それによってADIr及びそれを含む治療組成物の製造を改善することができる。一部の実施形態において、ADIr酵素を修飾して1個以上のリジン残基を除去する(例えば、リジンは、別のアミノ酸もしくはその類似体、または非天然アミノ酸で置換可能である)。特に、一部の実施形態において、配列番号1(M.hominisのADI)の112、374、405または408に等価の位置、またはこれらの位置の1つ以上の組み合わせにリジンを含まないようにADIr酵素を修飾する。一部の実施形態において、1個以上のリジン残基、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21個、またはそれより多くのリジン残基を含まないようにADIr酵素を修飾する。それらが存在する場合、別のアミノ酸もしくはその類似体、または非天然アミノ酸で置換することができる。具体的実施形態において、ADIr酵素は、例えば、配列番号1の位置7、88、137、209、及び380と等価な位置で置換された5個のリジン残基を有する。一部の実施形態において、ADIr酵素は、例えば、配列番号1の位置7、9、59、88、115、116、137、178、209、及び380と等価な位置で置換された10個のリジン残基を有する。特定実施形態において、ADIr酵素は、例えば、配列番号1の位置7、9、59、66、88、91、93、115、116、137、141、178、209、279、及び380と等価な位置で置換された15個のリジン残基を有する。一部の実施形態において、ADIr酵素は、例えば、配列番号1の位置7、9、56、59、66、88、91、93、96、115、116、137、141、178、209、254、279、325、326、380、及び406と等価な位置で置換された21個のリジン残基を有する。
場合によっては、未変性ADIrが微生物に見られることがあり、これは免疫原性であり、患者の循環から迅速に除去される。これらの問題は、ADIrを修飾して「修飾ADIr」酵素を作ることによって克服することができる。したがって、特定実施形態は、「修飾剤」を含むADIr酵素を包含する。修飾剤の例としては、限定するものではないが、高分子ポリマー、タンパク質、ペプチド、多糖、及び他の化合物が挙げられる。ADIr酵素と修飾剤を共有結合または非共有結合性相互作用によって連結して安定抱合体または安定組成物を形成して所望の効果を達成することができる。特定実施形態において、修飾ADIrは、対応する非修飾ADIrの(例えば、同一または類似配列の)生物学的活性を保持し、対応する非修飾ADIrより長いインビボ半減期及び低い抗原性を有する。特定実施形態において、修飾ADIrは、対応する非修飾ADIrの生物学的活性の少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれを超える生物学的活性を保持する。一般的に、修飾ADIrは、治療的使用に十分な生物学的活性を保持する。
一部の実施形態において、修飾剤は生体適合性であり、血液中のADIrの半減期を増加し得るポリマーもしくはタンパク質またはその断片であり得る。修飾剤は、ADIrに化学的に結合するか、または適用可能な場合、融合タンパク質発現を介してADIrに連結することができる。
高分子ポリマーには、非ペプチド高分子ポリマーを含めてよく、特定実施形態において、それ自体の生物活性を有し得る。適切なポリマーとしては、限定するものではないが、ポリエノール化合物、ポリエーテル化合物、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルと無水マレイン酸のコポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピル)−メタクリルアミド、多糖、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリンまたはその断片、ポリ−アルキル−エチレングリコール及びその誘導体、ポリ−アルキル−エチレングリコールとその誘導体のコポリマー、ポリ(ビニルエチルエーテル)、a,P−ポリ[(2−ヒドロキシエチル)−DL−アスパルトアミド]、ポリカルボキシラート、ポリオキシエチレン−オキシメチレン、ポリアクリロイルモルホリン、アミノ化合物とオキシオレフィンのコポリマー、ポリヒアルロン酸、ポリオキシラン、エタン二酸とマロン酸のコポリマー、ポリ(1,3−ジオキソラン)、エチレンとマレイン酸ヒドラジドのコポリマー、ポリシアル酸、シクロデキストリンなどが挙げられる。特定実施形態において、ポリマーはポリエチレングリコールである。
本明細書で用いるポリエノール化合物としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール(モノメトキシポリエチレングリコール、モノヒドロキシルポリエチレングリコールを含めて)、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコール、ポリブテノールなど、及び脂質などのこれらの誘導体が挙げられる。
ポリエーテル化合物としては、限定するものではないが、ポリアルキレングリコール(HO((CH2)xO)nH)、ポリプロピレングリコール、ポリオキシレヒレン(HO((CH2)2O)nH)、ポリビニルアルコール((CH2CHOH)n)が挙げられる。
ポリアミノ酸としては、限定するものではないが、1種類のアミノ酸のポリマーまたは2種類以上のアミノ酸のコポリマー、例えば、ポリアラニンもしくはポリリジン、またはそのブロックコポリマーが挙げられる。
多糖としては限定するものではないが、グルコサン及びその誘導体、例えば、硫酸デキストラン、セルロース及びその誘導体(メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含めて)、デンプン及びその誘導体、ポリスクロースなどが挙げられる。
具体的実施形態において、タンパク質またはペプチドとカップリングさせることによってADIrを修飾し、1つ以上のタンパク質またはペプチドがADIrに直接的または間接的に連結される。タンパク質は、天然に存在するタンパク質またはそれらの断片であってよく、これには、限定するものではないが、天然に存在するヒト血清タンパク質またはそれらの断片、例えばチロシン結合タンパク質、トランスサイレチン、a1−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、IgFc領域、アルブミン、及びこれらの断片が挙げられる。「断片」とは、タンパク質全体より小さいが、タンパク質の所望の機能を保持するタンパク質のいずれの部分をも意味する。本明細書に記載のADIrは、共有結合を介してタンパク質に直接的または間接的に連結し得る。直接的連結は、ADIrの1個のアミノ酸が、ペプチド結合またはジスルフィド架橋を介して修飾タンパク質の1個のアミノ酸に直接連結されることを意味する。間接的連結は、間に元々存在している化学基または生物学的もしくは化学的手段により付加された特定の化学基を介したADIrと修飾タンパク質との間の連結、または上記連結の組み合わせを指す。
特定の実施形態において、1つ以上のPEG分子への共有結合によってADIrを修飾する。PEG(リンカーの有無にかかわらず)により共有結合により修飾されたADIrを本明細書では以降「ADIr−PEG」と呼ぶことがある。非修飾ADIrと比較すると、ADIr−PEGは、その酵素活性の大部分を保持し、免疫原性または抗原性がはるかに低く、大いに延長した循環半減期を有し、腫瘍の治療にさらに効果的である。
「ポリエチレングリコール」または「PEG」は、nが少なくとも4である一般式H(OCH2CH2)nOHで表される分岐鎖または直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を指す。「ポリエチレングリコール」または「PEG」を数字の接尾辞と併用して、その概算の重量平均分子量を示す。例えば、PEG5,000は、約5,000の総重量平均分子量を有するPEGを指し、PEG12,000は、約12,000の総重量平均分子量を有するPEGを指し、PEG20,000は、約20,000の総重量平均分子量を有するPEGを指す。
一部の実施形態において、PEGは、約1,000〜約50,000、約3,000〜約40,000、約5,000〜約30,000、約8,000〜約30,000、約11,000〜約30,000、約12,000〜約28,000、約16,000〜約24,000、約18,000〜約22,000、または19,000〜約21,000の総重量平均分子量を有し、一部の実施形態において、PEGは、約1,000〜約50,000、約3,000〜約30,000、約3,000〜約20,000、約4,000〜約12,000、約4,000〜約10,000、約4,000〜約8,000、約4,000〜約6,000、または約5,000の総重量平均分子量を有する。具体的実施形態において、PEGは、約20,000の総重量平均分子量を有する。一般的に、30,000以上の均分子量を有するPEGは、溶解し難く、配合生成物の収率が低減し得る。PEGは、分岐鎖または直鎖であってよい。一般的に、PEGの分子量が増加するにつれて、ADIrの免疫原性が低減する。PEGは分岐鎖または直鎖であってよく、特定実施形態においては直鎖である。ここに記載の分子量を有するPEGをADIr、及び場合により生体適合性リンカーと併用して移植片対宿主病(GVHD)または癌を治療することができる。該癌としては、本明細書に記載の他の癌の中でも特に、例えば、肝細胞癌、再発性急性骨髄性白血病などの急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、胃癌(stomach cancer)、または食道癌が挙げられる。
特定実施形態は、チオール、スルフヒドリル、またはシステイン反応性PEG(複数可)を利用する。一部の実施形態において、チオール、スルフヒドリル、またはシステイン反応性PEG(複数可)を1つ以上の天然に存在するシステイン残基、1つ以上の導入されたシステイン残基(例えば、1つ以上の野生型残基のシステイン残基(複数可)との置換)、1つ以上のシステイン残基の挿入)、またはその任意の組み合わせに付着させる(例えば、Doherty et al.,Bioconjug Chem.16:129
1−98,2005参照)。特定実施形態において、特定の野生型ADIシステイン残基をまず最初に別のアミノ酸と置き換えて、PEGポリマーの野生型システインへの付着を防止し、例えば、PEG(複数可)が他の望ましい生物活性を破壊するのを防止する。一部の実施形態は、システインの代わりに1つ以上の非天然システイン誘導体(例えば、ホモシステイン)を利用する。
1−98,2005参照)。特定実施形態において、特定の野生型ADIシステイン残基をまず最初に別のアミノ酸と置き換えて、PEGポリマーの野生型システインへの付着を防止し、例えば、PEG(複数可)が他の望ましい生物活性を破壊するのを防止する。一部の実施形態は、システインの代わりに1つ以上の非天然システイン誘導体(例えば、ホモシステイン)を利用する。
チオール、スルフヒドリル、またはシステイン反応性PEGの非限定として、メトキシPEGマレイミド(M−PEG−MAL)(例えば、MW2000、MW5000、MW10000、MW20000、MW30000、MW40000)が挙げられる。M−PEG−MALは、タンパク質及びペプチドのシステイン側鎖のチオール基と反応して安定3−チオスクシンイミジルエーテル結合を生成する。この反応は高度に選択的であり、他の官能基の存在下でpH約5.0〜6.5の穏和な条件下で起こり得る。商業的に入手可能なチオール、スルフヒドリル、またはシステイン反応性PEG分子の特定例を図1A〜1Dに例示してある。したがって、特定実施形態において、本明細書に記載のチオール、スルフヒドリル、システイン反応性PEG分子のいずれか1つ以上にADIr酵素を抱合させる。
ADIrは、リンカーの有無にかかわらず、PEGなどの修飾剤に共有結合し得るが、好ましい実施形態はリンカーを利用する。ADIrは、例えば、参照することによりその内容全体を本明細書に援用するPark et al,Anticancer Res.,1:373−376(1981);及びZaplipsky and Lee,Pol
yethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,ed.,Plenum Press,NY,Chapter 21(1992)に記載されている技術上周知の方法を用いて生体適合性リンカーを介してPEGに共有結合し得る。場合によっては、ADIrは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、または他の基を介してPEGなどの修飾剤に直接(すなわち、リンカーなしで)結合し得る。
yethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,ed.,Plenum Press,NY,Chapter 21(1992)に記載されている技術上周知の方法を用いて生体適合性リンカーを介してPEGに共有結合し得る。場合によっては、ADIrは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、または他の基を介してPEGなどの修飾剤に直接(すなわち、リンカーなしで)結合し得る。
ADIrを修飾剤(例えばPEG)に共有結合させるために用いるリンカーは、いずれの生体適合性リンカーであってもよい。上述したように、「生体適合性」は、化合物または基が無毒であり、傷害、病気、疾患、または死を引き起こすことなくインビトロまたはインビボで利用可能であることを意味する。PEGなどの修飾剤は、例えば、エーテル結合、チオール結合、アミド結合、または他の結合を介してリンカーに結合することができる。
一部の実施形態において、適切なリンカーは、約1〜100個の原子、1〜80個の原子、1〜60個の原子、1〜40個の原子、1〜30個の原子、1〜20個の原子、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の原子の全鎖長を有することができ、例えば、鎖内の原子は、C、S、N、P、及び/またはOを含む。特定実施形態において、リンカーは任意的であり、例えば、PEG抱合ADIr酵素はリンカーを含まない。場合によっては、リンカー基として、例えば、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバマート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、及びその組み合わせが挙げられる。安定リンカーの特定例としては、スクシンイミド、プロピオン酸、カルボキシメチラート結合、エーテル、カルバマート、アミド、アミン、カルバミド、イミド、脂肪族C−C結合、及びチオエーテルが挙げられる。特定実施形態において、生体適合性リンカーはスクシンイミジルスクシナート(SS)基である。
他の適切なリンカーとして、オキシカルボニルイミダゾール基(例えば、カルボニルイミダゾール(CDI)を含めて)、ニトロフェニル基(例えば、ニトロフェニルカルボナート(NCP)またはトリクロロフェニルカルボナート(TCP)を含めて)、トリシラート(trysylate)基、アルデヒド基、イソシアナート基、ビニルスルホン基、または一級アミンが挙げられる。特定実施形態において、リンカーは、SS、SPA、SCM、またはNHS由来であり、特定実施形態において、SS、SPA、またはNHSを使用し、一部の実施形態において、SSまたはSPAを使用する。したがって、特定実施形態において、有望なリンカーをメトキシ−PEGスクシンイミジルスクシナート(SS)、メトキシ−PEGスクシンイミジルグルタラート(SG)、メトキシ−PEGスクシンイミジルカルボナート(SC)、メトキシ−PEGスクシンイミジルカルボキシメチルエステル(SCM)、メトキシ−PEG2N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)メトキシ−PEGスクシンイミジルブタノアート(SBA)、メトキシ−PEGスクシンイミジルプロピオナート(SPA)、メトキシ−PEGスクシンイミジルグルタルアミド、及び/またはメトキシ−PEGスクシンイミジルスクシンイミドから形成可能である。
リンカーのさらなる例として、限定するものではないが、以下の1つ以上が挙げられる:―O―、―NH―、―S―、―C(O)―、C(O)―NH、NH―C(O)―NH、O―C(O)―NH、―C(S)―、―CH2―、―CH2―CH2―、―CH2―CH2―CH2―、―CH2―CH2―CH2―CH2―、―O―CH2―、―CH2―O―、―O―CH2―CH2―、―CH2―O―CH2―、―CH2―CH2―O―、―O―CH2―CH2―CH2―、―CH2―O―CH2―CH2―、―CH2―CH2―O―CH2―、―CH2―CH2―CH2―O―、―O―CH2―CH2―CH2―CH2―、―CH2―O―CH2―CH2―CH2―、―CH2―CH2―O―CH2―CH2―、―CH2―CH2―CH2―O―CH2―、―CH2―CH2―CH2―CH2―O―、―C(O)―NH―CH2―、―C(O)―NH―CH2―CH2―、―CH2―C(O)―NH―CH2―、―CH2―CH2―C(O)―NH―、―C(O)―NH―CH2―CH2―CH2―、―CH2―C(O)―NH―CH2―CH2―、―CH2―CH2―C(O)―NH―CH2―、―CH2―CH2―CH2―C(O)―NH―、―C(O)―NH―CH2―CH2―CH2―CH2―、―CH2―C(O)―NH―CH2―CH2―CH2―、―CH2―CH2―C(O)―NH―CH2―CH2―、―CH2―CH2―CH2―C(O)―NH―CH2―、―CH2―CH2―CH2―C(O)―NH―CH2―CH2―、―CH2―CH2―CH2―CH2―C(O)―NH―、―NH―C(O)―CH2―、―CH2―NH―C(O)―CH2―、―CH2―CH2―NH―C(O)―CH2―、―NH―C(O)―CH2―CH2―、―CH2―NH―C(O)―CH2―CH2、―CH2―CH2―NH―C(O)―CH2―CH2、―C(O)―NH―CH2―、―C(O)―NH―CH2―CH2―、―O―C(O)―NH―CH2―、―O―C(O)―NH―CH2―CH2―、―NH―CH2―、―NH―CH2―CH2―、―CH2―NH―CH2―、―CH2―CH2―NH―CH2―、―C(O)―CH2―、―C(O)―CH2―CH2―、―CH2―C(O)―CH2―、―CH2―CH2―C(O)―CH2―、―CH2―CH2―C(O)―CH2―CH2―、―CH2―CH2―C(O)―、―CH2―CH2―CH2―C(O)―NH―CH2―CH2―NH―、―CH2―CH2―CH2―C(O)―NH―CH2―CH2―NH―C(O)―、―CH2―CH2―CH2―C(O)―NH―CH2―CH2―NH―C(O)―CH2―、二価シクロアルキル基、―N(R6)―、R6はH、またはアルキル、置換アルキル、アケニル、置換アケニル、アキニル、置換アキニル、アリール及び置換アリールから成る群より選択される有機基である。さらに、ここに記載のリンカー部分のいずれもさらに、1〜20個のエチレンオキシドモノマー単位[すなわち、−(CH2CH2O)1−20−]を含むエチレンオキシドオリゴマー鎖を含んでよい。すなわち、エチレンオ
キシドオリゴマー鎖は、リンカーの前または後、かつ場合により2個以上の原子を含むリンカー部分のいずれの2個の原子間にも存在することができる。また、オリゴマー鎖は、該オリゴマーがポリマー区域に隣接し、単に該ポリマー区域の延長に相当する場合はリンカー部分の一部とみなされないことになる。
キシドオリゴマー鎖は、リンカーの前または後、かつ場合により2個以上の原子を含むリンカー部分のいずれの2個の原子間にも存在することができる。また、オリゴマー鎖は、該オリゴマーがポリマー区域に隣接し、単に該ポリマー区域の延長に相当する場合はリンカー部分の一部とみなされないことになる。
具体的な典型的PEG分子及びリンカーを下表Aに示す。
特定実施形態において、ADIr酵素は、本明細書(例えば、表A中)に記載の1つ以上のPEG分子及び/またはリンカーを含む。
PEGのADIrへの付着はADIrの循環半減期を増加させる。一般に、PEGをADIrの一級アミンに付着させる。ADIrへのPEG、または他の修飾剤の付着部位の選択は、当業者には分かるように、タンパク質の活性ドメイン内の各部位の役割によって決まる。酵素活性の実質的な損失なしでADIrの一級アミンにPEGを付着させ得る。例えば、ADIrに存在するリジン残基は、本明細書に記載のADIrがSS、SPA、SCM、SSA及び/またはNHSなどの生体適合性リンカーを介してPEGに付着し得る全ての可能な点である。本開示を考慮して当業者には明白なように、PEGはADIrの他の部位にも付着し得る。
1〜約30個のPEG分子がADIrに共有結合し得る。特定実施形態において、ADIrは1個のPEG分子で修飾される(すなわち、1個のPEG分子を含む)。一部の実施形態において、ADIrは1個より多くのPEG分子で修飾される。特定の実施形態において、ADIrは約1〜約10、または約7〜約15個のPEG分子、または約2〜約8または約9〜約12個のPEG分子で修飾される。一部の実施形態において、ADIrは、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個のPEG分子で修飾される。特定実施形態において、ADIrは、ADIr毎に4.5〜5.5個のPEG分子で修飾される。一部の実施形態において、ADIrは5±1.5個のPEG分子で修飾される。
特定実施形態において、ADIrの一級アミノ基の約15%〜約70%がPEGで修飾され、一部の実施形態では、アルギニンデイミナーゼの一級アミノ基の約20%〜約65%、約25%〜約60%、または特定実施形態では、約30%〜約55%、または45%〜約50%、または一部の実施形態では、約50%がPEGで修飾される。PEGがADIrの末端に共有結合するときは、1個だけのPEGを利用するのが望ましいことがある。ADIr上のPEG単位数が増えると、酵素の循環半減期が増加する。しかしながら、ADIr上のPEG単位数が増えると、酵素の比活性が低減する。したがって、本開示を考慮して当業者には明白なように、両者間のバランスを取る必要がある。
一部の実施形態において、生体適合性リンカーの共通の特徴は、それらがアルギニンデイミナーゼの一級アミンにスクシンイミド基を介して付着することである。一旦ADIrと結合すると、SS−PEGは、PEGの次にエステル結合を有し、これがこの部位を血清エステラーゼに対して感受性にし、この血清エステラーゼは体内でADIrからPEGを遊離させ得る。SPA−PEG及びPEG2−NHSはエステル結合を持たないので、それらは血清エステラーゼに感受性でない。
タンパク質に付着するPEGは、SS-PEG、SPA−PEG及びSC−PEGのよ
うに直鎖であってよく、またはPEG2−NHSのように分岐鎖のPEGを使用してよい。
うに直鎖であってよく、またはPEG2−NHSのように分岐鎖のPEGを使用してよい。
特定実施形態において、酵素の触媒領域に位置するかまたは隣接するADIrと関連するペグ化部位が修飾される。特定実施形態において、「ペグ化部位」という表現は、ポリエチレングリコールで共有結合的に修飾可能なADIまたはADIrの任意の部位または位置と定義される。「ペグ化部位」は、該部位のペグ化が酵素の触媒活性の有意な低減をもたらす、酵素の触媒領域に位置するかまたは隣接するとみなすことができる。該部位のペグ化は、伝統的に酵素の不活化をもたらしてきた。例えば、Mycoplasma hominisのADIは、酵素の触媒領域にあるかまたは隣接するとみなし得る112位にリジンを有する。112位のこのリジンへのPEGの付着は酵素を不活化することができる。さらに、Mycoplasma hominisのADIは、酵素の触媒領域にあるかまたは隣接するとみなし得る397位にシステインを有する。397位のシステインのアミノ酸置換は酵素を不活化することができる。特に、397位でシステインをアラニン、ヒスチジン、アルギニン、セリン、リジンまたはチロシンに置換すると、全ての検出可能な酵素活性の損失をもたらすことができる。Mycoplasma hominisのADIは、この保存システインの近傍に位置する3個のリジン残基、特にLys374、Lys405及びLys408をも有する。Lys374、Lys405、Lys408またはその組み合わせのPEGの付着は酵素を不活化することができる。
他の生物由来のADIrもMycoplasma hominisのADIの112位に対応するペグ化部位を有し得ることを理解すべきである。さらに、いくつかの生物由来のADIは、Mycoplasma hominisのADIの112位と同じ一般的位置に対応するリジン残基を有し得る。該生物由来のADIにおけるリジンの位置は、当業者に知られており、米国特許第6,635,462号に記載されている。
したがって、一部の実施形態は、ADIrのポリペプチド鎖における特定のアミノ酸置換を提供する。これらのアミノ酸置換は、修飾剤による修飾時、例えば、ペグ化時にあまり活性を失わない修飾ADIrを提供する。ペグ化部位、または酵素の触媒領域にあるかまたは隣接する他の既知の修飾部位を排除することによって、活性を失うことなく最適修飾、例えばペグ化を達成することができる。
一部の実施形態において、例えば、上述したように、PEGまたは他の修飾剤への抱合のために非天然アミノ酸を利用する(例えば、de Graaf et al.,Bioconjug Chem.20:1281−95,2009参照)。したがって特定実施
形態には、1つ以上の非天然アミノ酸を介して1つ以上のPEGに抱合されるADIr酵素が含まれる。一部の実施形態においては非天然アミノ酸は、アルキル、アリール、ハロゲン化アリール、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アルキル、アセチル、ケトン、アジリジン、ニトリル、ニトロ、ハロゲン化物、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、スルホン、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、フェニルボロン酸、チオール、セレノ、スルホニル、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環式−、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、シクロオクチンなどの束縛環、チオエステル、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ、カルボン酸、α−ケトカルボン酸、αまたはβ不飽和酸及びアミド、グリオキシルアミド、及びオルガノシラン基から成る群より選択される官能基を有する側鎖を含む。一部の実施形態において、非天然アミノ酸は、p−アセチル−L−フェニルアラニン、O−メチル−L−チロシン、L−3−(2−ナフチル)アラニン、3−メチル−フェニルアラニン、O−4−アリル−L−チロシン、ホモシステイン、4−プロピル−L−チロシン、トリ−O−アセチル−GlcNAcβ−セリン、β−O−GlcNAc−L−セリン、トリ−O−アセチル−GalAc−α−トレオニン、α−GalAc−L−トレオニン、L−ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−L−フェニルアラニン、p−アジド−L−フェニルアラニン、p−アシル−L−フェニルアラニン、p−ベンゾイル−L−フェニルアラニン、L−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p−ヨード−フェニルアラニン、p−ブロモフェニルアラニン、p−アミノ−L−フェニルアラニン、及びイソプロピル−L−フェニルアラニンから成る群より選択される。
形態には、1つ以上の非天然アミノ酸を介して1つ以上のPEGに抱合されるADIr酵素が含まれる。一部の実施形態においては非天然アミノ酸は、アルキル、アリール、ハロゲン化アリール、ハロゲン化ビニル、ハロゲン化アルキル、アセチル、ケトン、アジリジン、ニトリル、ニトロ、ハロゲン化物、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオエーテル、エポキシド、スルホン、ボロン酸、ボロン酸エステル、ボラン、フェニルボロン酸、チオール、セレノ、スルホニル、ボラート、ボロナート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロ環式−、ピリジル、ナフチル、ベンゾフェノン、シクロオクチンなどの束縛環、チオエステル、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ、カルボン酸、α−ケトカルボン酸、αまたはβ不飽和酸及びアミド、グリオキシルアミド、及びオルガノシラン基から成る群より選択される官能基を有する側鎖を含む。一部の実施形態において、非天然アミノ酸は、p−アセチル−L−フェニルアラニン、O−メチル−L−チロシン、L−3−(2−ナフチル)アラニン、3−メチル−フェニルアラニン、O−4−アリル−L−チロシン、ホモシステイン、4−プロピル−L−チロシン、トリ−O−アセチル−GlcNAcβ−セリン、β−O−GlcNAc−L−セリン、トリ−O−アセチル−GalAc−α−トレオニン、α−GalAc−L−トレオニン、L−ドーパ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル−L−フェニルアラニン、p−アジド−L−フェニルアラニン、p−アシル−L−フェニルアラニン、p−ベンゾイル−L−フェニルアラニン、L−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p−ヨード−フェニルアラニン、p−ブロモフェニルアラニン、p−アミノ−L−フェニルアラニン、及びイソプロピル−L−フェニルアラニンから成る群より選択される。
ADIr−PEGは本明細書に記載の例示修飾ADIrであるが、当業者に認められるように、ADIrは、所望の効果、特に抗原性を低減させ、血清半減期を増加させるために他のポリマーまたは適切な分子で修飾可能である。
一部の実施形態は、組み換え技術により産生されるときにアルギニンデイミナーゼの特定の構造特性が適正かつ迅速な復元を阻止または妨害し得るという理解に基づいていることを理解すべきである。特に、これらの構造特性は、組み換え産生中に酵素が活性コンホメーションをとることを妨げるかまたは阻止する。一部の実施形態において、用語「活性コンホメーション」は、非修飾または修飾アルギニンデイミナーゼによる酵素活性を許容する三次元構造と定義される。活性コンホメーションは、特に、アルギニンからシトルリンへの変換を触媒するために必要であり得る。用語「構造的特徴」は、特定のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせに起因するポリペプチド鎖の任意の形質、品質または特性と定義され得る。例えば、アルギニンデイミナーゼは、正常なペプチド鎖に折り曲げまたはねじれをもたらし、ひいては酵素の復元中に酵素が活性コンホメーションをとることを妨げるアミノ酸を含有し得る。特に、Mycoplasma hominisのアルギニンデイミナーゼは、ペプチド鎖に折り曲げまたはねじれをもたらし、組み換え産生中に酵素を復元することをより困難にし得るプロリンを210位に有する。他の生物由来のアルギニンデイミナーゼもMycoplasma hominisのアルギニンデイミナーゼの210位に対応する部位を有し得ることを理解すべきである。
したがって一部の実施形態は、野生型アルギニンデイミナーゼのポリペプチド鎖に特定のアミノ酸置換を提供する。例として、アルギニンデイミナーゼのペプチド鎖において問題のある構造的特徴を排除する置換が挙げられる。修飾アルギニンデイミナーゼの改善された復元を提供する置換も含まれる。これらのアミノ酸置換は、低減量の緩衝液を用いる修飾アルギニンデイミナーゼの迅速な復元を可能にする。これらのアミノ酸置換は、復元された修飾アルギニンデイミナーゼの収率増加をも提供し得る。一部の実施形態において、修飾アルギニンデイミナーゼは、P210または等価な残基にアミノ酸置換を有する。上述したように、Mycoplasma hominis由来のアルギニンデイミナーゼは、210位に位置するアミノ酸プロリンを有する。本発明を限定するものではないが、210位のアミノ酸プロリンの存在は、特定のアルギニンデイミナーゼ酵素の復元(すなわち、再折りたたみ)の困難さを増す折り曲げまたはねじれを正常なポリペプチド鎖にもたらすと考えられる。210位のプロリンの置換は、低減量の緩衝液を用いる修飾アルギニンデイミナーゼの迅速な復元を可能にする。210位のプロリン(または等価な残基)の置換は、復元された修飾アルギニンデイミナーゼの収率増加をも提供し得る。一部の実施態様において、210位のプロリン(または等価な残基)はセリンで置換される。他の置換の非限定としては、Pro210→Thr210、Pro210→Arg210、Pro210→Asn210、Pro210→Gln210またはPro210→Met210が挙げられる。野生型アルギニンデイミナーゼの210位のアミノ酸に関連する当該構造的特徴を排除することによって、酵素の至適再折りたたみを達成することができる。
本明細書で提供する方法は、インビトロまたはインビボのどちらかの用途を伴うことができる。細胞培養用途を含めたインビトロ用途の場合、本明細書に記載の化合物を培養物中の細胞に加えてからインキュベートすることができる。当該技術分野で周知の抗体産生技術を利用して、本明細書に記載の化合物を用いてモノクローナル及び/またはポリクローナル抗体の産生を促進することもできる。当業者には明白なように、次にモノクローナル及び/またはポリクローナル抗体を多種多様な診断用途に使用することができる。
本明細書に記載の化合物または組成物のインビボ投与手段は、意図した用途に応じて変わることになる。本明細書に記載のADIr組成物の純粋形または適切な医薬組成物での投与は、同様の実用性に役立つ薬剤のいずれの許容される投与様式によっても行なうことができる。医薬組成物は、ADIr、例えば、ADIr−PEG、ADIr−PEG20を適切な生理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせることよって調製可能であり、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、微粒子剤、及びエアロゾル剤などの固体、半固体、液体または気体の形態の調合剤に配合することができる。さらに、他の医薬的に活性な成分(本明細書のどこかに記載されている他の抗癌剤を含めて)ならびに/または塩、緩衝液及び安定剤などの適切な賦形剤が組成物内に存在してよいが、必ずしも必要ない。
投与は、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮内、皮下または局所を含めた種々の異なる経路によって達成可能である。投与様式は、治療または予防すべき状態の性質によって決まる。したがって、ADIr酵素(例えば、ADIr−PEG、ADIr−PEG20)を経口、鼻腔内、腹腔内、非経口、静脈内、リンパ内、腫瘍内、筋肉内、細胞間、動脈内、皮下、眼球内、滑液内、経上皮、及び経皮投与することができる。投与後に癌の進行及び/または転移を低減させ、阻害し、予防するかまたは遅延させる量が有効とみなされる。特定実施形態において、本明細書のADIr組成物は、統計的に有意な量、患者の生存期間の中央値を増加させる。一部の実施形態において、本明細書に記載のADIr治療は、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、15週間、20週間、25週間、30週間、40週間、またはそれ以上、患者の生存期間の中央値を増加させる。特定実施形態において、ADIr治療は、1年、2年、3年、またはそれ以上、患者の生存期間の中央値を増加させる。一部の実施形態において、本明細書に記載のADIr治療は、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間またはそれ以上、無進行生存期間を増加させる。特定実施形態において、本明細書に記載のADIr治療は、1年、2年、3年またはそれ以上、無進行生存期間を増加させる。
特定実施形態において、投与量は、生存腫瘍の量の統計的に有意な減少、例えば、腫瘍量の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%もしくはそれを超える減少、または走査寸法の変化(例えば、統計的に有意な縮小)により示される腫瘍退縮をもたらすのに十分である。特定実施形態において、投与量は、安定疾患をもたらすのに十分である。特定実施形態において、投与量は、熟練臨床医に既知の特定疾患適応症の症状に臨床関連低減をもたらすのに十分である。
特定実施形態において、投与量は、NO合成を阻害し、血管新生を阻害するのに十分であり、及びもしくは腫瘍細胞にアポトーシスを誘発するのに十分であるかまたはこれらの任意の組み合わせである。NO合成、血管新生及びアポトーシスは、当該技術分野で既知の方法を用いて測定可能であり、例えば、Current Protocols in Immunology or Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009 and updates thereto);Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,3rded.,Wiley&Sons,1995;及び他の同様の参考文献を参照されたい。一部の実施形態において、投与量は、NO合成を阻害し、黒色腫及び補体の成長を阻害し、シスプラチンなどの本明細書に記載の他の化学療法薬を強めるかまたはそれと相乗作用する。したがって、一部の実施形態は、ADIr−PEG20をシスプラチンと併用投与することによって黒色腫を治療する方法を提供し、この治療は、内在性一酸化窒素(NO)を枯渇させる。
正確な投薬量及び治療の持続期間は、治療される疾患の関数であり、既知の試験プロトコルを用いて経験的に、または当該技術分野で既知のモデル系で組成物を試験し、それから推定することによって決定可能である。対照臨床試験を行なってもよい。投薬量は、軽減すべき状態の重症度によっても変動し得る。医薬組成物は、一般的に治療上有用な効果を発揮し、同時に望ましくない副作用を最小限にするように配合及び投与される。組成物を一度に投与してよく、または時間間隔を置いて投与すべく複数のより少ない用量に分割してよい。いずれの特定対象についても、個人の必要性に従って経時的に具体的投与計画を調整することができる。
ADIr(例えば、ADIr−PEG)組成物は、単独でまたは放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学療法などの他の既知の癌治療と組み合わせて投与可能である。組成物を抗生物質と組み合わせて投与してもよい。
ADIr組成物は、単独でまたはADI−PEG20療法と組み合わせて投与してもよい。特定実施形態において、ADI−PEG20で治療され、かつ抗ADI−PEG20抗体が生じている患者に本明細書に記載のADIrを使用する。該患者は、ADI−PEG20治療からは、該酵素が抗体によって中和されるので、もはや恩恵を受けない。したがって、特定実施形態において、本発明は、癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、該方法が必要な患者に、治療的に有効な量の、ADI−PEG20を含む組成物を投与し、一定期間後に、本明細書に記載のADIrを含む組成物を患者に投与し、それによって癌を治療し、その症状を寛解させ、または進行を阻害する方法を提供する。
本方法の一部の実施形態において、一定期間は、患者における所定レベルの抗ADI−PEG20抗体を検出することによって決定され、ADIrを含む組成物は、所定レベルの前記抗ADI−PEG20抗体の検出後に投与される。特定実施形態において、ADI−PEG20及び本明細書に記載のADIrで治療すべき患者における抗ADI−PEG20抗体の閾値レベル(複数可)または所定レベルを確立することができる。抗ADI−PEG20抗体の「所定閾値レベル」(「所定レベル」若しくは「所定カットオフ値」とも呼ばれ、または時には所定カットオフと呼ばれる)は、当該技術分野で既知の方法を用いて、例えば、受信者動作特性曲線または「ROC」曲線を用いて確立し得る。一部の実施形態において、非常に低いレベルの抗ADI−PEG20抗体でさえ、ADI−PEG20から本明細書に記載のADIr−PEGへの治療切り替えを正当化するのに十分と判断される。特定実施形態において、熟練臨床医は、いつADI−PEG20治療を終了し、本明細書に記載のADIr組成物による治療を開始するかを決める適切なレベルの抗ADI−PEG20を決定することができる。
一部の実施形態において、一定期間は、患者におけるADI活性を検出するかあるいは観察することによって決定され、所定レベルのADI活性の検出または観察の後に組成物が投与される。特定の実施形態において、患者における低減したレベルのADI活性の検出または観察の後に組成物が投与される。ADI活性は、直接的に、例えば生物学的サンプルをADI活性の少なくとも1つの指標についてアッセイすることによって、または間接的に、例えばADI−PEG20治療の所望もしくは意図した効果を観察することによって測定可能である。特定実施形態において、熟練臨床医は、いつADI−PEG20治療を終了し、本明細書に記載のADIr−PEGによる治療を開始するかを決める適切なレベルのADI活性を決定することができる。
したがって、これらの及び関連する医薬組成物を投与する典型的経路としては、限定するものではないが、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸内、膣内、及び鼻腔内が挙げられる。本明細書で使用する非経口という用語には、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技術が含まれる。
特定の医薬組成物は、組成物が患者に投与されると、その中に含まれる活性成分が生体利用可能になるように配合される。対象または患者に投与される組成物は、1つ以上の投与単位の形態をとることができ、例えば、錠剤は、単回投与単位であり得、エアロゾル形態の本明細書に記載のADIr組成物の容器は、複数回投与単位を保持し得る。該剤形を調製する実際の方法は既知であり、当業者には明白である。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)を参照されたい。投与すべき組成物は、いずれの場合にも、本明細書の教示に従って目的の疾患または状態を治療するために治療的に有効な量の、ADIr−PEG20などの本明細書に記載のADIr−PEGを含有することになる。特定実施形態においては医薬組成物または治療組成物は無菌であり及び/または発熱物質を含まない。
医薬組成物は、固体または液体の形態であってよい。一部の実施形態において、担体(複数可)は粒状であり、その結果、組成物は、例えば、錠剤または粉末剤の形態である。担体(複数可)は液体であってよく、組成物は、例えば、アノラール油(anoral oil)、注射用液またはエアロゾルであり、例えば、吸入投与に有用である。経口投与を意図するとき、医薬組成物は、一般的に固体または液体の形態であり、本明細書で固体または液体とみなされる範囲内には半固体、半液体、懸濁液及びゲル形態が含まれる。
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物は、粉末剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム剤、ウエハ剤などに配合可能である。該固体組成物は、典型的に1種以上の不活性な希釈剤または食用担体を含有することになる。さらに、以下の1種以上が存在してよい:カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの結合剤;デンプン、ラクトースまたはデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Primogel、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムまたはSterotexなどの潤滑剤;コロイド二酸化ケイ素などの滑剤;スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤;ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料などの香味剤;及び着色剤。医薬組成物がカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態であるとき、上記タイプの物質に加えて、ポリエチレングリコールまたは油などの液体担体を含有してよい。
医薬組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、溶液、エマルションまたは懸濁液であってよい。液体は、2つの例として、経口投与用または注射による送達用であり得る。経口投与を意図するとき、好ましい組成物は、本発明の化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、染料/色素及び香味増強剤の1種以上を含有する。注射による投与を意図した組成物には、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝液、安定剤及び等張剤の1種以上を含めてよい。
液体医薬組成物は、溶液、懸濁液または他の同様の形態であるかにかかわらず、下記補助剤の1種以上を含んでよい:注射用水、食塩水、特定実施形態では生理食塩水、リンゲル液、等張塩化ナトリウムなどの滅菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁媒体として役立ち得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの固定油;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調節用薬剤。非経口調合剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多回用量バイアルに封入することができる。生理食塩水が好ましい補助剤である。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
非経口または経口投与のいずれかを意図した液体医薬組成物は、適切な投薬量が得られるような量の本明細書に開示のADIr(例えば、ADIr−PEG、ADIr−PEG20)を含有すべきである。典型的に、この量は組成物中に少なくとも0.01%のADIrである。経口投与を意図するとき、この量は、組成物の重量の0.1〜約70%で変動し得る。特定の経口医薬組成物は、約4%〜約75%のADIrを含有する。特定実施形態において、非経口投与単位が希釈前に0.01〜10重量%のADIrを含有するように医薬組成物及び調合剤を調製する。
医薬組成物は、局所投与が意図されることもあり、この場合、担体は適宜、溶液、エマルション、軟膏またはゲル基剤を含んでもよい。基剤は、例えば、以下の1種以上を含んでよい:ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱油、水及びアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤及び安定剤。局所投与用の医薬組成物には増粘剤が存在してよい。経皮投与が意図される場合、組成物に経皮パッチ剤またはイオン泳動装置が含まれることがある。医薬組成物は、直腸内で融解して薬物を放出する、例えば坐剤の形態で直腸内投与用に意図されることがある。直腸投与用組成物は、適切な非刺激性賦形剤として油性基剤を含有してよい。該基剤としては、限定でなく、ラノリン、カカオバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。
医薬組成物は、固体または液体の投与単位の物理的形態を改変する種々の物質を含んでよい。例えば、組成物は、活性成分の周りに被覆シェルを形成する物質を含むことができる。被覆シェルを形成する物質は典型的に不活性であり、例えば、糖、シェラック、及び他の腸溶性被覆剤から選択され得る。これとは別に、活性成分をゼラチンカプセルの中に入れてよい。固体または液体形態の医薬組成物は、ADIr(例えば、ADIr−PEG)に結合する薬剤を含んでよく、それによって化合物の送達を助ける。この能力で作用し得る適切な薬剤には、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、1種以上のタンパク質またはリポソームがある。医薬組成物は、エアロゾル剤として投与可能な投与単位から本質的に成ることがある。用語エアロゾル剤を用いて、コロイド性の系から、加圧包装から成る系までの範囲の種々の系を表す。送達は、液化もしくは圧縮ガスによるかまたは活性成分を分配する適切なポンプ系によるものであり得る。エアロゾル剤は、活性成分(複数可)を送達するため、単相、二相、または三相系で送達可能である。エアロゾル剤の送達には、必要な容器、活性化剤、バルブ、副容器などが含まれ、それらがまとまってキットを形成し得る。当業者は、過度の実験を行うことなく、好ましいエアロゾル剤を決定することができる。
医薬組成物は、医薬品技術で周知の方法論で調製可能である。例えば、注射による投与を意図すべき医薬組成物は、本明細書に記載のADIr(例えば、ADIr−PEG)ならびに場合により1種以上の塩、緩衝液及び/または安定剤を含む組成物を滅菌蒸留水と混ぜ合わせて溶液を形成することによって調製可能である。界面活性剤を加えて、均質な溶液または懸濁液の形成を促進することができる。界面活性剤は、ADIr(例えば、ADIr−PEG)組成物と非共有結合的に相互作用して、水性送達系におけるADIr(例えば、ADIr−PEG)の溶解または均質な懸濁を促進する化合物である。
治療的に有効な量で組成物を投与することができ、この量は、用いる具体的化合物(例えば、ADIr−PEG)の活性、化合物の代謝安定性及び作用の長さ;患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別、及び食事;投与の様式及び時間;排泄速度;薬物の組み合わせ;特定の障害または状態の重症度;ならびに療法を受ける対象を含めた種々の要因に応じて異なることになる。
本明細書に記載の化合物の治療的に有効な量は、腫瘍増殖を阻害するのに有効な量である。一般的に、治療は、少投薬量で開始され、その状況下で最適な効果が達成されるまで少量ずつの増加によって投薬量を増やすことができる。一般的に、化合物の治療投薬量は、1週間に2回から2週間毎に約1回の約1〜約200mg/kgであり得る。例えば、投薬量は、2mlの静脈内注射として1週間に1回の1mg/kgから3日毎に1回の約20mg/kgであり得る。一部の実施形態において、用量は、3日毎に約1回、1週間に約1回、1週間に約2回、または2週間毎に約1回投与される、約50IU/m2〜約700IU/m2であり得る。特定実施形態において、用量は、3日毎に約1回、1週間に約1回、1週間に約2回、または2週間毎に約1回投与される、約50IU/m2、60IU/m2、70IU/m2、80IU/m2、90IU/m2、100IU/m2、110IU/m2、120IU/m2、130IU/m2、140IU/m2、150IU/m2、160IU/m2、170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、約320IU/m2、約330IU/m2、340IU/m2、約350IU/m2、360IU/m2、370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、620IU/m2、630IU/m2、640IU/m2、650IU/m2、660IU/m2、670IU/m2、680IU/m2、690IU/m2、または約700IU/m2であり得る。特定実施形態において、熟練臨床医の要望通りに用量を修正してよい。
ADIr−SS−PEG5,000による至適投与は1週間に約2回であり得るが、ADIr−SS−PEG20,000による至適投与は1週間に約1回から2週間毎に約1回であり得る。特定実施形態において、ADIr−SS−PEG20,000による至適投与は1週間に約2回であり得る。
ADIr(例えば、ADIr−PEG)は、注射前に、リン酸緩衝食塩水、または当業者に既知のいずれの他の適切な溶液とも混合することができる。一部の実施形態において、ADIr−PEGを含む液体組成物は、約10〜約12mgのADIr、約20〜約40mgのポリエチレングリコール、約1.27mg±5%の一塩基リン酸ナトリウム、USP、約3mg±5%の二塩基リン酸ナトリウム、USP、約7.6mg±5%の塩化ナトリウム、USPを約6.6〜約7のpHで適量の注射用水(例えば、約1mlまたは約2ml)中に含む。
一部の実施形態において、ADIr−PEGを含む液体組成物は、ヒスチジン−HClを含み、特定実施形態において、組成物緩衝液は、約0.0035Mのヒスチジン−HCl〜約0.35Mのヒスチジン−HClである。特定の一実施形態において、pH6.8で0.035Mのヒスチジン−HClを0.13Mの塩化ナトリウムと共に含む緩衝液中で組成物を配合する。一部の実施形態において、pH6.8で0.02Mのリン酸ナトリウム緩衝液を0.13Mの塩化ナトリウムと共に含む緩衝液中で組成物を配合する。一部の実施形態において、ADIr−PEGを含む液体組成物は、約10〜約12mgのADIr、約20〜約40mgのポリエチレングリコール、約5.4mg±5%のヒスチジン、USP、約7.6mg±5%の塩化ナトリウム、USPを約6.6〜約7のpHで適量の注射用水(例えば、約1mlまたは約2ml)中に含む。
一部の実施形態において、ADIr(例えば、ADIr−PEG)を含む組成物は、約5〜約9、約6〜約8、または約6.5〜約7.5のpHを有する。一部の実施形態において、ADIrを含む組成物は約6.8±1.0のpHを有する。
一部の実施形態において、ADIr(例えば、ADIr−PEG)を含む組成物中の遊離PEGは、1〜10%である。一部の実施形態において、それは、総PEGの7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満または1%未満である。特定実施形態において、ADIr(例えば、ADIr−PEG)を含む組成物中の非修飾ADIrは、約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%未満または0.1%未満である。一般的に、ADIr−PEGを含む組成物は、約4%、3%、2%、1.5%、1%または0.5%以下の総不純物を有する。一部の実施形態において、内毒素の制限は、USPに記載の要件を満たし、すなわち、≦50EU/mLである。
一部の実施形態において、ADIr(例えば、ADIr−PEG)を含む組成物中の遊離スルフヒドリルは約90%を超える。一部の実施形態において、ADIrまたはADIr−PEGを含む組成物中の遊離スルフヒドリルは、約91%、約92%、約93%、約94%もしくは約95%、約96%、約97%、約98%、約99%またはそれ以上である。
一部の実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約0.1μMもしくは約0.5μM〜約15μMのKmを有し、または約1μM〜約12μM、約1μM〜約10μM、約1.5μM〜約9μM、約1.5μM〜約8μMもしくは約1.5μM〜約7μMである。特定実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約1.0μM〜約10μMまたは約1.5μM〜約6.5μMのKmを有する。一部の実施形態において、組成物中のADIrまたはADIr−PEGは、約、少なくとも約、または約0.1μM、約0.5μM、約1.0μM、約1.5μM、約2μM、約2.5μM、約3μM、約3.5μM、約4μM、約4.5μM、約5μM、約5.5μM、約6μM、約6.5μM、もしくは約7μM、もしくは約8μM、もしくは約9μM、もしくは約10μM未満のKmを有する。
一部の実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約0.5秒−1〜約80秒−1、または約0.5秒−1〜約70秒−1、または約0.5秒−1〜約60秒−1、または約0.5秒−1〜約50秒−1、または約0.5秒−1〜約40秒−1、または約0.5秒−1〜約30秒−1、または約0.5秒−1〜約20秒−1、または約0.5秒−1〜約15秒−1のKcatを有し、あるいは約0.5秒−1〜約80秒−1、または約1秒−1〜約80秒−1、または約5秒−1〜約80秒−1、または約10秒−1〜約80秒−1、または約20秒−1〜約80秒−1、または約30秒−1〜約80秒−1、または約40秒−1〜約80秒−1、または約50秒−1〜約80秒−1、または約60秒−1〜約80秒−1、または約70秒−1〜約80秒−1、または約1秒−1〜約12秒−1、約1秒−1〜約10秒−1、約1.5秒−1〜約9秒−1、約2秒−1〜約8秒−1または約2.5秒−1〜約7秒−1である。特定実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約2.5秒−1〜約7.5秒−1のKcatを有する。一部の実施形態において、組成物中のADIrまたはADIr−PEGは、約または少なくとも約2.5秒−1、約3秒−1、約3.5秒−1、約4秒−1、約4.5秒−1、約5秒−1、約5.5秒−1、約6秒−1、約6.5秒−1、約7秒−1、約7.5秒−1もしくは約8秒−1、約10秒−1、約15秒−1、約20秒−1、約25秒−1、約30秒−1、約35秒−1、約40秒−1、約45秒−1、約50秒−1、約55秒−1、約60秒−1、約65秒−1、約70秒−1、約75秒−1、約80秒−1、約85秒−1、約90秒−1、約95秒−1、または約100秒−1のKcatを有する。
一部の実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約5mS/cm〜約20mS/cm、または約5mS/cm〜約15mS/cm、約7mS/cm〜約15mS/cm、約9mS/cm〜約15mS/cmまたは約10mS/cm〜約15mS/cmの伝導率(当該技術分野では比導電率とも呼ばれる)を有する。一部の実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約9mS/cm、約10mS/cm、約11mS/cm、約12mS/cmまたは約13mS/cm、約14mS/cmまたは約15mS/cmの伝導率を有する。特定実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約13mS/cm±1.0mS/cmの伝導率を有する。
一部の実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約50mOsm/kg〜約500mOsm/kg、約100mOsm/kg〜約400mOsm/kg、約150mOsm/kg〜約350mOsm/kg、約200mOsm/kg〜約350mOsm/kgまたは約250mOsm/kg〜約350mOsm/kgのオスモル濃度を有する。特定実施形態において、組成物中のADIr(例えば、ADIr−PEG)は、約300±30mOsm/kgのオスモル濃度を有する。
一部の実施形態において、タンパク質濃度は約11.0±1.0mg/mLである。特定実施形態において、タンパク質濃度は約8〜約15mg/mLである。特定実施形態において、タンパク質濃度は、約8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、または15mg/mLである。
一部の実施形態において、比酵素活性は、約5.0〜90IU/mgまたは約5〜55IU/mgであり、ここで1IUは、1μmolのアルギニンを1μmolのシトルリンと1μmolのアンモニアに37℃にて1分間で変換する酵素の量と定義され、効力は100±20IU/mLである。特定実施形態において、比酵素活性は、約5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、35、40、45、50、55、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100±2.0IU/mgである。特定の一実施形態において、比酵素活性は、9±2.0IU/mgである。
本明細書に記載のADIr(例えば、ADIr−PEG)を含む組成物は、ADI−PEG20を含め、1種以上の他の治療薬の投与と同時、その前、またはその後に投与可能である。該併用療法には、本発明の化合物及び1種以上の追加活性薬を含有する単一の医薬投与製剤の投与のみならず、本明細書に記載のADIr(例えば、ADIr−PEG)及び各活性薬をそれ自体別個の医薬投与製剤で含む組成物の投与が含まれる。例えば、ADIr(例えば、ADIr−PEG)及び他の活性薬を錠剤もしくはカプセル剤などの単一の経口投与組成物で一緒に患者に投与することができ、または各薬剤を別個の経口投与製剤で投与することができる。同様に、ADIr(例えば、ADIr−PEG)及び他の活性剤薬を食塩水もしくは他の生理学的に許容できる溶液中などの単一の非経口投与組成物で一緒に患者に投与することができ、または各薬剤を同一もしくは異なる経路で(例えば、一方を注射で、一方を経口で)別個の非経口投与製剤で投与することができる。別個の投与製剤を用いる場合、ADIr(例えば、ADIr−PEG)及び1種以上の追加活性薬を含む組成物は、本質的に同時、すなわち同時発生的に、または別々に時差をつけて、すなわち連続的に任意の順番で投与することができ、併用療法はこれら全ての投与計画を含むと理解される。
したがって、特定実施形態において、1種以上の他の治療薬と組み合わせた本開示のADIr組成物の投与も企図される。該治療薬は、特定の癌またはGVHDなどの本明細書に記載の特定の疾患状態の標準的治療として当該技術分野において許容され得る。企図される典型的治療薬としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、NSAID、DMARD、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、自食作用阻害薬、または他の活性薬及び補助薬が挙げられる。
特定実施形態において、本明細書に開示のADIr(例えば、ADIr−PEG)組成物は、いずれの数の化学療法薬と併用投与してもよい。化学療法薬の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標))などアルキル化薬;ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホナート;ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチローロメラミンを含めたエチレンイミン及びメチラメラミン;クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;カムルスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素;アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質;メトトレキサート及び5−フルオロウラシル(5−FU)などの抗代謝薬;デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体;フルダラビン、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5−FUなどのピリミジン類似体;カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎薬;フロリン酸など葉酸補充薬;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキサート;デホファミン;デメコルシン;ジアジコン;エルホルミチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK;ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン;2,2’,2″−トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及びドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhne−Poulenc Rorer,Antony,France);クロラムブシル;ゲムシタビン;6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;シスプラチン及びカルボプラチンなど白金類似体;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP−16);イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;キセローダ;イバンドロネート;CPT−11;トポイソメラーゼ阻害薬RFS2000;ジフルオロメチルオミチン(difluoromethylomithine)(DMFO);Targretin(商標)(ベキサロテン)、Panretin(商標)(アリトレチノイン)などのレチノイン酸誘導体;ONTAK(商標)(デニロイキンジフチトクス);エスペラミシン;カペシタビン;ならびに上記のいずれかの医薬的に許容できる塩、酸または誘導体が挙げられる。例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)−イミダゾール、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、及びトレミフェン(Fareston)を含めた抗エストロゲン;並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲンのような、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン薬もこの定義に含まれる。さらなる化学療法薬としては、ソラフェニブならびに他のタンパク質キナーゼ阻害薬、例えばアファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ホスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、及びスニチニブなど;シロリムス(ラパマイシン)、エベロリムス及び他のmTOR阻害薬が挙げられる。上記のいずれかの医薬的に許容できる塩、酸または誘導体も本明細書での使用が企図される。
特定実施形態において、本明細書で開示するADIr(例えば、ADIr−PEG)組成物は、いずれの数の自食作用阻害薬とも併用投与可能である。一部の好ましい実施形態において、自食作用阻害薬は、クロロキン、3−メチルアデニン、ヒドロキシクロロキン(Plaquenil.TM.)、バフィロマイシンA1、5−アミノ−4−イミダゾールカルボキサミドリボシド(AICAR)、オカダ酸、2A型または1型のタンパク質ホスファターゼを阻害する自食作用抑制性藻類毒素、cAMPの類似体、及びcAMPレベルを上昇させる薬物、アデノシン、N6−メルカプトプリンリボシド、ウォルトマニン、及びビンブラスチンからなる群より選択される。さらに、例えばATG5などの自食作用に必須のタンパク質の発現を阻害するアンチセンスまたはsiRNAを使用してもよい。
一部の実施形態において、ADIr(例えば、ADIr−PEG)と1種以上の治療薬との組み合わせは、相補的、相加的、または相乗的に作用する。この点で、本明細書には相補薬または相乗作用薬を記載してあり、これには本明細書で提供するADIr−PEGと相補的または相乗的に作用することができる治療薬(例えば、本明細書に記載の化学療法薬、自食作用阻害薬、mTOR阻害薬、または癌、GVHD、もしくは炎症性腸疾患の治療に用いられるいずれもの他の治療薬)が含まれ、該相補性または相乗作用は、化学療法薬が存在するが、ADIr(例えば、ADIr−PEG)組成物が不在であるとき、及び/またはADIr(例えば、ADIr−PEG)が存在するが、化学療法薬が不在であるときに検出され得る効果より大きい(すなわち、適切な対照条件に対して統計的に有意な様式で)検出可能な効果として現れる。相乗作用及び相補性を測定する方法は、当該技術分野で知られている(例えば、Cancer Res January 15,2010 70;440参照)。
本明細書に記載のADIr(例えば、ADIr−PEG)及び場合により他の治療薬を含む組成物は、癌を治療する治療方法及び癌の転移を予防する方法に使用可能である。したがって、一部の実施形態には、種々の異なる癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害、または予防方法が含まれる。一部の実施形態には、GVHDの治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法が含まれる。特定の実施形態は、患者の癌またはGVHDの治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、場合により、特に患者に抗ADI−PEG20抗体が生じている場合は、ADI−PEG20による治療の後に、患者に治療的に有効な量の本明細書に記載のADIr組成物を投与し、それによって癌またはGVHDを治療し、その症状を寛解させ、またはその進行を阻害することを含む方法が含まれる。したがって、本明細書に記載のADIr組成物は、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、GVHD、または限定するものではないが、肝細胞癌、白血病(例えば、急性骨髄性白血病及び再発性急性骨髄性白血病)、転移性黒色腫を含めた黒色腫、肉腫(限定するものではないが、転移性肉腫、子宮平滑筋肉腫が含まれる)、膵癌、前立腺癌(例えば、限定するものではないが、ホルモン不応性前立腺癌など)、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)(限定するものではないが、胃腺癌が含まれる)、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎臓癌(限定するものではないが、腎細胞癌が含まれる)、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌(限定するものではないが、頭頸部の扁平上皮癌、舌癌が含まれる)、子宮頸癌、精巣癌、胆嚢癌、胆管細胞癌、ならびに胃癌(stomach cancer)が含まれる癌に罹患している個人に投与可能である。
患者の癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、ADIr(例えば、ADIr−PEG)、及び場合により本明細書に記載の1種以上の他の治療薬を含む組成物を患者に投与することを含み、癌はASS、ASL、またはその両方を欠損している、方法も含まれる。この点で、ASSまたはASLの欠損はmRNA発現もしくはタンパク質発現で測定した場合に発現の低減であり得、またはタンパク質活性の低減であり得、かつ一般的に当業者が判定した場合に発現または活性の統計的に有意な低減を含む。低減したASSまたはASLの発現または活性は、癌がないことが分かっている適切なコントロールサンプルにおける発現または活性に比べて、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、またはそれを超える発現または活性の低減であり得る。特定実施形態において、ASSまたはASLの発現または活性は、非癌コントロールサンプルにおける発現または活性に比べて少なくとも2倍低減している。
特定実施形態において、ASSまたはASLの低減した発現または活性は、ASSもしくはASLプロモーターのメチル化またはASSもしくはASLプロモーターの阻害に起因する。一部の実施形態において、ASSまたはASLの発現または活性の低減は、DNA突然変異(例えば、1つ以上の点突然変異、小さな欠失、挿入など)に起因するかまたは遺伝子の欠失をもたらす染色体異常に起因する。一部の実施形態において、癌はASSまたはASL陰性であり、これは発現または活性が観察されないことを意味する。
ASSまたはASLの発現または活性の低減は、限定するものではないが、定量的PCR、免疫組織化学、酵素活性アッセイ(例えば、シトルリンからアルギニノコハク酸への変換またはアルギニノコハク酸からアルギニンとフマル酸への変換を測定するためのアッセイ)などの当該技術分野で知られるいずれの方法を用いても測定可能である。
したがって、特定実施形態は、患者の癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、本明細書に記載のADIr(例えば、ADIr−PEG)を含む組成物を患者に投与することを含み、癌がASSもしくはASL、またはその両方の低減した発現または活性を示し、癌には、限定するものではないが、肝細胞癌、白血病(例えば、急性骨髄性白血病及び再発性急性骨髄性白血病)、転移性黒色腫を含めた黒色腫、肉腫(限定するものではないが、転移性肉腫、子宮平滑筋肉腫が含まれる)、膵癌、前立腺癌(例えば、限定するものではないが、ホルモン不応性前立腺癌など)、中皮腫、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)(限定するものではないが、胃腺癌が含まれる)、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎臓癌(限定するものではないが、腎細胞癌が含まれる)、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌(限定するものではないが、頭頸部の扁平上皮癌、舌癌が含まれる)、子宮頸癌、精巣癌、胆嚢癌、胆管細胞癌、ならびに胃癌(stomach cancer)が含まれる方法を包含する。
文献中の種々の研究により下記腫瘍においてASSが欠損していることが分かった:急性骨髄性白血病(AML)、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃(gastric)癌、神経膠芽腫、HCC、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、腎癌、肉腫、及び小細胞肺癌。したがって、本明細書では、ADIr−PEGのみを用いるかまたは最初にADI−PEG20を用いる治療を含め、他の治療と組み合わせた、これらのASS欠損癌の治療を企図する。
患者の癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害方法であって、患者に、本明細書に記載のADIr(例えば、ADIr−PEG、ADIr−PEG20)を自食作用阻害薬と組み合わせて含む組成物を投与することを含む方法も含まれる。一部の実施形態には、患者の癌の治療方法であって、治療的に有効な量の本明細書に記載のADIrを自食作用阻害薬と組み合わせて投与することを含み、癌が膵癌または小細胞肺癌である方法が含まれる。
一部の実施形態には、本明細書に記載のADIrを含む組成物の投与が、血漿中のアルギニンを少なくとも1カ月間、2カ月間、3カ月間、4カ月間、5カ月間、6カ月間またはそれ以上にわたって枯渇させる治療方法が含まれる。特定実施形態には、本明細書に記載のADIrを含む組成物の投与が、抗ADI−PEG20抗体の検出後にADI−PEG20による治療を終了した後、血漿中のアルギニンを少なくとも1カ月間、2カ月間、3カ月間、4カ月間、5カ月間、6カ月間またはそれ以上にわたって枯渇させる治療方法が含まれる。
実施例1
患者の抗ADI−PEG20抗体との低い交差反応性を有するADI酵素のスクリーニング及び選択
この実施例は、患者の抗ADI−PEG20抗体との低い交差反応性を有するADI酵素のスクリーニング及び選択について述べる。
患者の抗ADI−PEG20抗体との低い交差反応性を有するADI酵素のスクリーニング及び選択
この実施例は、患者の抗ADI−PEG20抗体との低い交差反応性を有するADI酵素のスクリーニング及び選択について述べる。
多数のADI酵素から、表1は、M.hominisのADIに対する配列同一性パーセントに関した選択された27個のADI酵素を列挙する。
種々の生物由来の多数のADI酵素を特徴づけて、どの酵素が抗ADI−PEG20抗体の存在下でさえ、患者の血液中の低濃度のアルギニンを除去及び維持すると予想されるかを判定した。以下に詳述するように、これらの研究により、M.hominisに密接に関係する多数の種由来のADIが、配列同一性に基づいて、種々の温度及びpHで測定される十分に良い酵素触媒特性を有し、ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性をも示すことが明らかになる。
ADIの調製。例えば、Gallego et al.,PLOS One,7(10):e47886,2012;Monstadt and Holldorf,Biochem.J.273:739−745,1990;Joo Noh et al.,Molecules and Cells.13:137−143,2002;及びSugimura et al.,Infection and Immunity.58:2510−2515,1990に記載されている標準的プロトコルに従う試験のために組み換えADI酵素をクローン化し、発現させ、精製した。
ヒト抗ADI−PEG20抗体の精製。臨床研究中にADI−PEG20を受けた患者の血漿サンプルから抗ADI−PEG20抗体を精製した。例えば、ELISAアッセイにより決定した場合にADI−PEG20に対して高い力価(力価>/=4)に達した8名の異なる患者から合計60mlの血漿をプールした。タンパク質「A」クロマトグラフィー(GE Healthcare)後にADIアフィニティークロマトグラフィーの2段階精製を利用した。約20mgの精製抗体を得、必要になるまで−80℃にて分割量で保存した。
ADI酵素アッセイ。アルギニンデイミナーゼ(ADI)は、L−アルギニンのL−シトルリン及びアンモニアへの変換を触媒する。比色終点アッセイ(例えば、Knipp and Vasak,AnalyticalBiochem.286:257−264,2000参照)によってL−シトルリンの量を検出し、既知量のL−シトルリンの標準曲線と比較して、タンパク質のIU/mgと表されるADIの比活性を計算することができる。1IUの酵素活性は、試験するpH及び温度で1分当たり1μmolのシトルリンを産生する酵素の量と定義された。50mMのHEPES、160mMのNaCl、pH7.4の生理学的HEPES緩衝液(PHB)(Lang and Zander,Clin Chem Lab Med.37:563−571,1999)プラス0.1%のBSA中で37℃にて標準アッセイ条件を実施した。条件が許す場合には全てのサンプル及び標準物質を二重または三重に試験した。
上記活性アッセイの変動を使用することによってKm及びKcat値を決定した。活性アッセイと同様に(または特に指定のない限り)、全ての反応はPHB+0.1%のBSA中で37℃にて行なった。各ADIまたは各ADIr構築物についてそれらの活性の差を考慮して酵素濃度、反応時間、及び基質濃度範囲を調整した。一般に、2nMの酵素、5分間の反応時間、及び0〜160μMのアルギニンを出発条件として用いた。条件を最適化するときは、反応に添加される総基質の百分率として消費される基質の量に対して特に注意を払った。典型的に、検出の下限は約1μMのシトルリンであり、定量化の下限は約2μMであった。プレート毎にシトルリン標準曲線を追跡し、これを用いて酵素反応により産生されたシトルリンを定量化した。
活性アッセイをも実施して、抗ADI−PEG20の存在下での酵素活性を評価した(抗体中和プロファイル)。これらのアッセイは、上述したように、640nM、320nM、160nM、80nM、40nM、20nM、10nM、及び0nMの抗ADI−PEG20抗体の存在下で行なった。
計算。シトルリン標準曲線を用いて、各反応ウエルで産生されたシトルリン濃度(μM)を計算して平均した。次に各反応の速度をμM/分/50nMのADIで計算した。この値に「IU」因数を掛けて比活性(IU/mgまたはμmolの生成物/分/mgのADI)を計算した(IU因数は、ADIの分子量及び反応体積から計算した)。
データを下表2〜7に示す。
これらのデータにより、とりわけ、M.hominisのADIに対して高い相同性(約50〜100パーセントの同一性)である天然及びPEG化ADI酵素は、種々のpHにおける場合(表6)及び温度で規定した場合(表7)を含め、優れた触媒活性を維持したことが明らかになる(表2〜4)。これらのデータにより、抗ADI−PEG20抗体の存在下で(上昇した)酵素活性によって測定したところ(表4〜5)、例えば、Mycoplasma hominisの酵素活性に比べて、患者の抗ADI−PEG20抗体に対して低減した親和性も示された。したがって、これらのADI酵素は、アルギニン枯渇療法の有効性を延長及び/または増加させるため、癌治療の療法における単独またはADI−PEG20治療後の使用に治療的有用性を有し得る。
上記種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照した及び/または出願データシートに列挙した全ての米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国の特許、外国の特許出願及び非特許出版物は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。種々の特許、出願及び公開公報の概念を利用するために必要であれば、実施形態の態様を修正してもなおさらなる実施形態を提供することができる。
上記詳細な説明を考慮してこれら及び他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、下記特許請求の範囲において、使用用語は、特許請求の範囲を本明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものと解釈すべきでなく、該特許請求の範囲に権利が与えられる全範囲の等価物と共に全ての可能な実施形態が含まれるものと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
Claims (24)
- ペグ化アルギニンデイミナーゼ、またはADI活性を有するその断片と、医薬的に許容できる担体とを含む、アルギニン栄養要求性の癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害のための治療組成物であって、前記治療組成物が、前記癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害が必要な患者に投与されることを特徴とし、前記ペグ化アルギニンデイミナーゼが、配列番号9もしくは配列番号22に記載のアミノ酸配列、または配列番号9もしくは配列番号22に対して少なくとも90%の配列同一性を示すそのバリアントを含み、前記ペグ化アルギニンデイミナーゼが、患者の抗ADI−PEG20抗体との低減した交差反応性を有し、前記アルギニンデイミナーゼが、リンカーを介してPEG分子に共有結合している、前記治療組成物。
- 前記ペグ化アルギニンデイミナーゼが、ADI−PEG20の特性に匹敵するかまたはそれより良い1つ以上の特性を有する、請求項1に記載の治療組成物。
- 前記1つ以上の特性が、Kcat、Km、pH最適条件、安定性、インビボタンパク質分解安定性、または血液中に既存しないイオンもしくは補因子への要求がないこと、またはその任意の組み合わせである、請求項2に記載の治療組成物。
- 前記ペグ化アルギニンデイミナーゼが、少なくとも1つのペグ化部位を除去するように修飾されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の治療組成物。
- 少なくとも1個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の治療組成物。
- 少なくとも5個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、請求項5に記載の治療組成物。
- 少なくとも10個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、請求項5に記載の治療組成物。
- 少なくとも15個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、請求項5に記載の治療組成物。
- 少なくとも20個のリジン残基が、アミノ酸置換によって修飾されている、請求項5に記載の治療組成物。
- 前記アルギニンデイミナーゼが、1個より多くのPEG分子に共有結合している、請求項1〜9のいずれか1項に記載の治療組成物。
- 前記アルギニンデイミナーゼが、約1〜約10個のPEG分子または約2〜約8個のPEG分子に共有結合している、請求項1〜9のいずれか1項に記載の治療組成物。
- 前記PEG分子が、直鎖または分岐鎖PEG分子である、請求項10または11に記載の治療組成物。
- 前記PEGが、約1,000〜約40,000または約10,000〜約30,000の総重量平均分子量を有する、請求項10または11に記載の治療組成物。
- 前記リンカーが、スクシニル基、アミド基、イミド基、カルバマート基、エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、炭水化物、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、メチレン基、またはその任意の組み合わせである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の治療組成物。
- 前記スクシニル基の起源がスクシンイミジルスクシナートである、請求項14に記載の治療組成物。
- 化学療法薬をさらに含む、請求項1に記載の治療組成物。
- 前記化学療法薬が、ドセタキセル、カルボプラチン、シクロホスファミド、ゲムシタビン、シスプラチン、ソラフェニブ、スニチニブ及びエベロリムスから成る群より選択される、請求項16に記載の治療組成物。
- 前記癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害が必要な患者が、抗ADI−PEG20抗体を有すると判定されている、請求項1に記載の治療組成物。
- 前記癌が、肝細胞癌、黒色腫、転移性黒色腫、膵癌、前立腺癌、小細胞肺癌、中皮腫、リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ腫、肝細胞腫、肉腫、白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌(gastric cancer)、神経膠腫、多形性神経膠芽腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、及び胃癌(stomach cancer)から成る群より選択される、請求項1に記載の治療組成物。
- アルギニン栄養要求性の癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害のための組み合わせ物であって、ADI−PEG20を含む組成物ならびに請求項1〜17のいずれか1項に記載の治療組成物を含み、ADI−PEG20を含む前記組成物が、前記癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害を必要とする患者に投与され、一定期間後に、前記治療組成物が前記患者に投与されることを特徴とする、前記組み合わせ物。
- 前記一定期間が、前記患者における所定レベルの抗ADI−PEG20抗体を検出することによって決定され、前記治療組成物が、前記所定レベルの前記抗ADI−PEG20抗体の検出後に投与される、請求項20に記載の組み合わせ物。
- 前記一定期間が、前記患者におけるADI活性によって決定され、前記治療組成物が、所定レベルまたは低減レベルのADI活性の検出後に投与される、請求項20に記載の組み合わせ物。
- アルギニン栄養要求性の癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害用薬物の製造における、請求項1〜17のいずれか1項に記載の治療組成物の使用。
- アルギニン栄養要求性の癌の治療、その症状の寛解、またはその進行の阻害のための、請求項16または17に記載の治療組成物。
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