TW201625295A - 用於治療癌症之與adi-peg 20抗體具有降低之交叉反應性的精胺酸脫亞胺酶 - Google Patents
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Abstract
本發明大體上係關於分離之精胺酸脫亞胺酶(ADI)蛋白,其與ADI-PEG 20相比與抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性,但其可具有類似於或優於ADI-PEG 20之功能特徵;包含該等ADI蛋白之組合物,以及治療精胺酸依賴性疾病或相關疾病諸如癌症之相關方法。
Description
本申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張於2014年9月16日申請之美國申請案第62/051,182號之優先權,該申請案以全文引用之方式併入本文中。
與本申請案相關之序列表係以文本格式代替文件拷貝形式提供,且在此以引用之方式併入本說明書中。含有序列表之文本文件之名稱為POLA_005_01TW_SeqList_ST25.txt。該文本文件為約97KB,且創建於2015年9月15日。
本發明大體上係關於精胺酸脫亞胺酶(ADI)蛋白,包括與ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的ADI蛋白。此類ADI蛋白適用於治療精胺酸依賴性或相關疾病諸如癌症。
胺基酸剝奪療法可為對一些形式之癌症的有效治療。迄今為止,存在一個已知臨床實例與此方法有關,其使用天冬醯胺酶來降低天冬醯胺之循環含量且抑制蛋白質合成。此治療對急性淋巴母細胞性白血病特別有效(Avramis 2005,Viera Pinheiro 2004)。急性淋巴母細胞性白血病細胞需要胺基酸天冬醯胺以供生長及增殖。相比之下,大多數正常人類細胞能够合成天冬醯胺且不受天冬醯胺耗盡之影響。因此,用天冬醯胺酶减少血清天冬醯胺可選擇性殺死癌細胞,而不會損害正常細胞、組織及宿主。大腸桿菌(E.coli)衍生形式之天冬醯胺酶已批准供人類使用。然而,天冬醯胺酶
僅發現於微生物中;此使得其在人體內具高度免疫原性且在注射之後亦具有短血清半衰期(Avramis 2005)。為使天冬醯胺酶成為更有效之藥物,藉由將大腸桿菌衍生天冬醯胺酶與聚乙二醇(PEG)一起調配以降低此酶之免疫原性及相關變態反應來將此等缺點减至最低程度。此外,PEG極大地延長了天冬醯胺酶之循環半衰期,此降低治療頻率與該療法之總成本兩者。PEG調配之天冬醯胺酶被批准使用且以商標名Oncaspar®(Oncaspar® 2011、Avramis 2005、Viera Pinheiro 2004、Fu 2007、Zeidan 2008)出售。
精胺酸為人類及小鼠之另一非必需胺基酸(關於評述,參見Rogers 1994)。在人體內,精胺酸可由瓜胺酸以兩個步驟經由克雷伯氏(Krebs)(尿素)循環酶精胺基丁二酸鹽合成酶(ASS,L-瓜胺酸:L-天冬胺酸連接酶[形成AMP],EC 6.3.4.5)及精胺基丁二酸鹽解離酶(ASL,L-精胺基丁二酸精胺酸-解離酶,EC 4.3.2.)來合成(Haines 2011、Wu 2009、Morris 2006、Husson 2003、Tapiero 2002、Rogers 1994)。ASS催化瓜胺酸及天冬胺酸轉化成精胺基丁二酸鹽,其然後藉由ASL轉化成精胺酸及反丁烯二酸。精胺酸缺乏型膳食在人體中不引起高氨血症、乳清酸尿,亦不改變成年人體內全身氧化氮(NO)合成之速率(Tapiero 2002、Castillo 1995、Rogers 1994、Carey 1987、Barbul 1986、Snyderman 1959、Rose 1949)。雖然早產嬰兒似乎需要精胺酸(Wu 2004),但精胺酸含量不與嬰兒、兒童及年輕成年人間的年齡相關(Lücke 2007)。在1992年,Takaku及Sugimura分別報導人類黑素瘤及肝細胞癌(HCC)細胞株似乎需要精胺酸以供生長。其他研究表明聚乙二醇化ADI有效治療黑素瘤及肝細胞瘤,而幾乎沒有有害作用。
ADI-PEG 20治療在一段時間內需要多個劑量。在許多次治療之後,可產生可限制其持久有效性之抗ADI-PEG 20抗體。因此,此項技術中對用於治療中之與抗ADI-PEG20抗體具有降低之交叉反應性以改良及延伸精胺酸耗盡療法之功效的ADI存在需要。本發明提供此優點及關於治療癌症之其他優點。
參考文獻:Avramis VI, Panosyan EH. 2005. Clin Pharmacokinet 44:367-393;Barbul A. 1986. J Parenteral Enteral Nutr 10:227-238;Carey GP等人1987. J Nutr 117:1734-1739;Castillo L等人1995.
Am J Physiol 268 (Endocrinol Metab 31):E360-367;Fu CH, Sakamoto KM. 2007. Expert Opin Pharmacother 8:1977-1984;Haines RJ等人2011. Int J Biochem Mol Biol 2:8-23;Husson A等人2003. Eur J Biochem 270:1887-1899;Lücke T等人2007. Clin Chem Lab Med 45:1525-1530;Morris SM Jr. 2006. Am J Clin Nutr 83(增):598S-512S;Rogers QR. 1994. In Proceedings from a Symposium Honoring Willard J. Visek - from Ammonia to Cancer and Gene Expression.專業出版物86-1994年4月,Agriculture Experiment Station, University of Illinois, 211 Mumford Hall, Urbana, IL 61801,第9-21頁;Tapiero H等人2002. Biomed Pharmacother 56:439-445, 2002;Viera Pinheiro JP, Boos J. 2004. Br J Haematol 125:117-127;Wu G等人2009. Amino Acids 37:153-168;Wu G等人2004. J Nutr Biochem 15:442-451;Zeidan A等人2008. Expert Opin Biol Ther 9:111-119)。
某些實施例係關於一種分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性。亦包括治療性組合物或醫藥組合物,其包含分離之精胺酸脫亞胺酶或其具有ADI活性之片段以及醫藥學上可接受之載劑。在某些實施例中,組合物為無菌的及/或實質上不含熱原質,諸如內毒素。在一些實施例中,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶不來自人黴漿菌。在一些實施例中,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶來自列於表1中之有機體。
在某些實施例中,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶具有一或多種類似於或優於ADI-PEG 20之性質。在此方面,該一或多種性質包括但不限於Kcat、Km、最佳pH值、穩定性、活體內蛋白水解穩定性或不需要尚未存在於血液中之離子或輔因子或其任何組合。在一些實施例中,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有至少5、10、15或20個表面殘基變化。在某些實施例中,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸
脫亞胺酶相比具有約20至135個表面殘基變化、約40至100個表面殘基變化、約30至60個表面殘基變化、約80至100個表面殘基變化或約100至120個表面殘基變化。
在某些實施例中,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶係來自唾液黴漿菌(Mycoplasma salivarium)、泡沫黴漿菌(Mycoplasma spumans)、加拿大黴漿菌(Mycoplasma canadense)、耳黴漿菌(Mycoplasma auris)、猪滑液黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae)、泄殖腔黴漿菌(Mycoplasma cloacale)、鵝黴漿菌(Mycoplasma anseris)、產鹼黴漿菌(Mycoplasma alkalescens)、口腔黴漿菌(Mycoplasma orale)、惰性黴漿菌(Mycoplasma iners)、火鶏黴漿菌(Mycoplasma meleagridis)、蜂房黴漿菌(Mycoplasma alvi)、滲透黴漿菌(Mycoplasma penetrans)、鶏黴漿菌(Mycoplasma gallinarum)、梨黴漿菌(Mycoplasma pirum)、靈長類黴漿菌(Mycoplasma primatum)、發酵黴漿菌(Mycoplasma fermentans)、產脂黴漿菌(Mycoplasma lipofaciens)、氣管黴漿菌(Mycoplasma felifaucium)、模仿黴漿菌(Mycoplasma imitans)、乳白色黴漿菌(Mycoplasma opalescens)、毛氏黴漿菌(Mycoplasma moatsii)、象黴漿菌(Mycoplasma elephantis)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)、龜黴漿菌(Mycoplasma testudinis)、黴漿菌屬某種(Mycoplasma sp.)CAG:877或黴漿菌屬某種CAG:472。與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的說明性精胺酸脫亞胺酶包含SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:28中所列之胺基酸序列中之任何一或多者。
在一些實施例中,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶已經修飾以移除至少一個聚乙二醇化位點。在與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的精胺酸脫亞胺酶之某些實施例中,至少一個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。在此方面,在某些實施例中,至少約5個離胺酸殘基、至少約10個離胺酸殘基或至少約20個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
在一些實施例中,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的精胺酸脫亞胺酶係經由連接子共價鍵結至PEG分子。在此方
面,與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的精胺酸脫亞胺酶可共價鍵結至一或多個PEG分子,諸如共價鍵結至約1至約10或約2至約8個PEG分子。PEG分子可為直鏈或分枝鏈PEG分子且總重量平均分子量可為約1,000至約40,000或總重量平均分子量為約10,000至約30,000。在一些實施例中,在PEG經由連接子共價鍵結至本文所描述之ADIr之情况下,連接子可包含丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基團、半胱胺酸基團、組胺酸基團、亞甲基或其任何組合。在具體實施例中,丁二醯基之來源為丁二酸丁二醯亞胺酯。
亦包括編碼本文所描述之分離之精胺酸脫亞胺酶的聚核苷酸、包含該聚核苷酸之載體及包含該等載體之分離之宿主細胞。
某些實施例係關於組合物,其包含如本文所描述與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶及生理學上可接受之載劑。在某些實施例中,組合物進一步包含化學治療劑。示例性化學治療劑包括但不限於多西他賽(docetaxel)、卡鉑(carboplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)及依維莫司(everolimus)。
亦包括治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展之方法,其包括向有需要之患者投與治療有效量之包含如本文所描述與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶及生理學上可接受之載劑的組合物,藉此治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展。在某些實施例中,有需要之患者已確定具有抗ADI-PEG 20抗體。在一些實施例中,癌症選自由以下組成之群:肝細胞癌、黑素瘤(包括轉移性黑素瘤)、胰臟癌、前列腺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝細胞瘤、肉瘤、白血病、急性髓樣白血病、復發性急性髓樣白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦部癌症、頭頸癌、子宮頸癌、睪丸癌及胃癌。
一些實施例包括治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展之方
法,其包括向有需要之患者投與治療有效量之包含ADI-PEG 20之組合物,且在一段時間之後,向患者投與包含如本文所描述與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶及生理學上可接受之載劑的組合物,藉此治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展。時間段可例如藉由偵測患者中預定含量之抗ADI-PEG 20抗體及/或量測或以其他方式觀測患者中之ADI活性來確定,其中包含與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的分離之精胺酸脫亞胺酶的組合物係在於患者中偵測到預定含量之該等抗ADI-PEG 20抗體及/或量測或觀測到預定水準之ADI活性之後投與。
亦包括本文所描述之分離之精胺酸脫亞胺酶蛋白,其用於製備或製造用於治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展之藥劑。
圖1A-1D說明可綴合至本文所描述之ADIr酶的多種半胱胺酸反應性PEG分子。
本發明之實施例係關於所選ADI酶,其在一些實施例中經由例如穩定連接子之連接子與PEG綴合。在一些實施例中,ADI酶經工程改造或選擇以例如相對於野生型序列或參考序列(參見例如表1)具有少量或以其他方式降低數目之表面離胺酸殘基。所選ADI酶選自來自不同有機體之大量ADI酶,此係基於其有益性質而進行。此等性質包括酶在人類血液中經由精胺酸ADI轉化成瓜胺酸及氨水而形成低精胺酸濃度並維持之能力。在一些實施例中,所選ADI分子與ADI-PEG 20相比與抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性,此類抗體可能因患者先前使用ADI-PEG 20進行之治療而產生。
在某些實施例中,ADI酶經聚乙二醇化以提供針對腎清除及蛋白水解之保護,以及降低之免疫原性或抗原性。為增加聚乙二醇化之有效性,對酶進行修飾可工程改造至降低數目之表面離胺酸殘基並且因此限制可用PEG連接位點之數目。在一些情况下,降低離胺酸殘基之數目提供在剩餘之離胺酸連接殘基處之更完全且均勻之聚乙二醇化。
在一些實施例中,經選擇以將甲氧基-PEG連接至ADI之PEG連接子提供化學穩定鍵聯。預期穩定連接子將增加分子之生物活性壽命。化學上穩定之連接子亦將消除水解且减少附著於酶表面之去聚乙二醇化連接子可能發生之免疫反應。
此等累積規格產生一或多個分子,其自患者之血液中有效移除精胺酸且不由來自先前精胺酸耗盡療法之抗ADI-PEG 20抗體中和或清除。分子為聚乙二醇化的,以便延遲因其自身免疫原性產生之中和及清除。此等因素將允許其替代ADI-PEG 20或除ADI-PEG 20之外(例如作為後繼藥物)進行使用,以延長精胺酸耗盡療法並且因此作為抗癌治療劑增加精胺酸耗盡治療之有效性。
正常細胞不需要精胺酸來用於生長,因為其可由瓜胺酸藉由ASS及ASL以兩步法合成精胺酸。相比之下,某些癌症不表現ASS。某些癌症不表現ASL,而其他癌症可能對ASS及/或ASL具有降低之表現,或可能不表現ASS及/或ASL。因此,此等癌症對於精胺酸而言為營養缺陷型的。此代謝差异可用於發展安全且有效之療法,以治療此等形式之癌症。ADI催化精胺酸經由精胺酸雙水解酶途徑轉化成瓜胺酸,且因此可用於消除精胺酸。
除非具體指出為相反的,否則本發明之實踐將使用病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學及該等領域技術內之重組DNA技術之習知方法,下文出於說明目的描述其中的許多方法。此類技術充分解釋於文獻中。參見例如Current Protocols in Protein Science,Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.(2009);Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley & Sons,1995;Sambrook及Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001);Maniatis等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);DNA Cloning:A Practical Approach,第I卷及第II卷(D.Glover編);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait編,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames及S.Higgins編,1985);Transcription and Translation(B.Hames及S.Higgins編,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney編,
1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)及其他類似文獻。
在重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型(例如電穿孔、脂質體轉染)中可使用標準技術。酶促反應及純化技術可根據製造商之規範或如此項技術中通常所實現或如本文所描述來進行。此等及相關技術及程序通常可根據此項技術中熟知之習知方法且如在本說明書通篇中所引用及討論之各種通用及更具體之參考文獻中所描述來進行。除非提供具體定義,否則本文所描述之結合分子生物學、分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學使用之命名法以及分子生物學、分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學之實驗程序及技術為此項技術中熟知且常用的。在重組技術;分子生物、微生物學、化學合成;化學分析;醫藥製備、調配及遞送;以及患者之治療中可使用標準技術。
除非內容另外明確規定,否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用,單數形式「一個/一種(a/an)」及「該」包括複數參考物。
「約」意謂量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度相對於參考量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化多達30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。
如本文所用,術語「胺基酸」包括天然存在之胺基酸及非天然胺基酸以及胺基酸類似物及模擬物。舉例而言,天然存在之胺基酸包括在蛋白質生物合成期間所用之20種(L)-胺基酸以及其他胺基酸,諸如4-羥基脯胺酸、羥基離胺酸、鎖鏈素、异鎖鏈素、高半胱胺酸、瓜胺酸及鳥胺酸。非天然胺基酸包括例如正白胺酸、正纈胺酸、對氟苯基丙胺酸、乙硫胺酸及其類似物,其為熟習此項技術者已知的。胺基酸類似物包括天然及非天然胺基酸之修飾形式。此類修飾可包括例如胺基酸上之化學基團及部分之取代或置換或通過胺基酸之衍生化進行。胺基酸模擬物包括例如展現功能類似性質(諸如參考胺基酸之電荷與電荷間隔特徵)之有機結構。舉例而言,模擬精胺酸(Arg或R)之有機結構將具有以類似分子間隔定位之正電荷部分且與天然存在之Arg胺基酸之側鏈之e胺基具有相同程度之可移動
性。模擬物亦包括受約束結構,從而維持胺基酸或胺基酸官能基之最佳間隔及電荷相互作用。熟習此項技術者已知或可確定什麽結構構成功能等效胺基酸類似物及胺基酸模擬物。
在本說明書通篇中,除非上下文另外要求,否則字語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變化形式應理解為意味包括所陳述之要素或整數或要素或整數組,但不排除任何其他要素或整數或要素或整數組。
「生物相容」係指材料或化合物通常對生物功能無害並且將不產生任何程度之不可接受之毒性,包括變應原性及疾病病况。
術語「不含內毒素」及「實質上不含內毒素」大體上係關於至多含有痕量(例如臨床上對個體沒有有害生理作用之量)之內毒素並且優選不可偵測量之內毒素的組合物、溶劑及/或容器。內毒素為與某些細菌、典型地革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacteria)相關之毒素,不過內毒素可發現於諸如單核細胞增多性李斯特單胞菌(Listeria monocytogene)之革蘭氏陽性細菌中。最常見內毒素為發現於各種革蘭氏陰性細菌之外部膜中的脂多醣(LPS)或脂寡醣(LOS),且其代表此等細菌引起疾病之能力中的中心病原特徵。在人類中,少量內毒素可引起發熱、血壓降低及炎症及凝結活化以及其他有害生理作用。
因此,在醫藥製備中,往往需要從藥物產品及/或藥物容器中移除大多數或所有痕量之內毒素,因為甚至少量即可在人類中引起有害作用。去熱原烘箱可用於此目的,因為典型地需要超過300℃之溫度來分解大多數內毒素。舉例而言,基於諸如注射器或小瓶之主要包裝材料,250℃之玻璃化溫度與30分鐘之保留時間的組合往往足以達成內毒素含量之3對數級數降低。涵蓋其他移除內毒素之方法,包括例如如本文所描述且此項技術中已知之層析法及過濾法。亦包括在諸如哺乳動物細胞之真核細胞中產生多肽且將其自真核細胞中分離以降低(若不消除)內毒素存在於本發明組合物中之風險的方法。包括在不含血清細胞中產生多肽且將其自不含血清細胞中分離之方法。
內毒素可使用此項技術中已知之常規技術來偵測。舉例而
言,使用來自馬蹄蟹之血液的鱟變形細胞溶解產物分析對於偵測內毒素之存在而言為一種高度敏感的分析。在此測試中,非常低之LPS含量可引起鱟溶解產物之可偵測凝結,其歸因於增强此反應之强大酶促級聯。內毒素亦可通過酶聯免疫吸附分析(ELISA)定量。要實質上不含內毒素,內毒素含量可小於約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/ml。典型地,1ng脂多醣(LPS)對應於約1-10EU。
多肽之「半衰期」可指多肽之藥理學、生理或其他活性相對於在向有機體之血清或組織中投與時或相對於任何其他規定時間點之此類活性損失一半所耗費之時間。「半衰期」亦可指多肽之量或濃度相對於在向有機體之血清或組織中投與時或相對於任何其他規定時間點之此類量或濃度降低向有機體之血清或組織中投與之起始量的一半所耗費之時間。半衰期可在血清及/或任何一或多種所選組織中量測。
「同源性」係指相同或構成保守取代之胺基酸的數目百分比。同源性可使用諸如GAP序列比較程式來確定(Deveraux等人,Nucleic Acids Research.12,387-395,1984),其以引用之方式併入本文中。以此方式,類似或實質上長度不同於本文所列舉之彼等之序列可藉由將空位插入比對中來比較,此類空位係例如藉由GAP所用之比較算法來確定。
術語「調節」及「改變」包括典型地呈相對於對照之統計顯著或生理學顯著量或程度的「增加」、「提高」或「刺激」以及「降低」或「减少」。「增加」、「刺激」或「提高」之量典型地為「統計顯著」量,且可包括由沒有組合物(例如不存在試劑)或對照組合物所產生之量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如500、1000倍)之增加(包括其間之所有整數及範圍,例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。「降低」或「减少」之量典型地為「統計顯著」量,且可包括由沒有組合物(例如不存在試劑)或對照組合物產生之量中之1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%降低(包括其間之所有整數及範圍)。
本文描述比較及「統計顯著」量之實例。
「患者」或「個體」係指動物,在某些實施例中指哺乳動物,且在具體實施例中指人類。
在某些實施例中,可具體規定組合物中任何給定試劑(例如ADIr、ADIr-PEG)之「純度」。舉例而言,某些組合物所包含之試劑如例如且决不限於藉由高效液相層析(HPLC)(生物化學及分析化學中經常用於分離、識別及定量化合物之管柱層析的熟知形式)所量測可為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純,包括其間的所有小數及範圍。
術語「參考序列」通常係關於編碼序列之核酸或正在與另一序列比較之胺基酸序列。本文所描述之所有多肽及多核苷酸序列被包括作為參考序列,包括藉由名稱描述之彼等及表格及序列表中描述之彼等。
術語「序列一致性」或例如包含「與......50%一致之序列」係指在比較窗口上在核苷酸與核苷酸基礎上或胺基酸與胺基酸基礎上序列一致之程度。因此,「序列一致性百分比」可藉由在比較窗口上比較兩個最佳比對序列來計算,從而確定在兩個序列中均存在之一致核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或一致胺基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)之位置的數目,以產生匹配位置之數目,將匹配位置之數目除以比較窗口中之位置的總數目(亦即窗口尺寸),且將結果乘以100,從而產生序列一致性百分比。
用於描述兩種或兩種以上多肽之間的序列關係之術語包括「參考序列」、「比較窗口」、「序列一致性」、「序列一致性百分比」及「實質一致性」。「參考序列」之長度可為至少12個但經常為15至18個且往往至少25個單體單元,包括核苷酸及胺基酸殘基。由於兩種多肽可各包含(1)兩種多肽之間類似的序列(亦即僅完全多肽序列之一部分)及(2)兩種多肽之間有分歧的序列,故兩種(或更多種)多肽之間的序列比較係典型地藉由在「比較窗口」上比較兩種多肽之序列以識別且比較具有序列相似性之局部區域來進行。「比較窗口」係指具有至少6個、通常約50至約100個、更
通常約100至約150個連續位置之概念片段,其中在一序列與具有相同數目之連續位置的參考序列最佳比對之後將兩個序列相比較。對於兩個序列之最佳比對,比較窗口可與參考序列(其不包含添加或缺失)相比包含約20%或更少之添加或缺失(亦即空位)。用於比對比較窗口之序列之最佳比對可藉由算法之計算機化實現方式(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Drive Madison,WI,USA)或藉由檢查並且藉由所選之各種方法中之任一者產生之最佳比對(亦即在比較窗口上產生最高百分比同源性)來進行。亦可參考如例如由Altschul等人所揭示之BLAST家族之程式(Nucl.Acids Res.25:3389,1997)。序列分析之細節討論可見於Ausubel等人之單元19.3(「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley & Sons Inc,1994-1998,第15章)。
序列之間的序列相似性或序列一致性(該等術語在本文中可互換使用)之計算可如下進行。為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比,可出於最佳比較目的比對序列(例如為獲得最佳比對可在第一與第二胺基酸或核酸序列中之一者或兩者中引入空位且出於比較目的可將非同源序列忽略)。在某些實施例中,參考序列中出於比較目的而比對之長度為參考序列之長度的至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、60%且甚至更佳至少70%、80%、90%或100%。然後,比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中相應位置相同之胺基酸殘基或核苷酸佔據時,則在彼位置處分子為一致的。
兩個序列之間的一致性百分比隨序列所共有之一致位置之數目而變化,將為進行兩個序列之最佳比對而需要引入之空位之數目以及各空位之長度考慮在內。
序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比之確定可使用數學算法來實現。在一些實施例中,兩個胺基酸序列之間的一致性百分比係使用Needleman及Wunsch算法(J.Mol.Biol.48:444-453,1970)來確定,其已併入GCG軟體包中之GAP程式,使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣,且空位權重為16、14、12、10、8、6或4且長度權重為1、2、3、4、
5或6。在一些實施例中,兩個核苷酸序列之間的一致性百分比係使用GCG軟體包中之GAP程式來確定,其NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之空位權重及1、2、3、4、5或6之長度權重。另一示例性參數組(及除非另作說明,否則應使用之一者)包括Blossum 62打分矩陣,其中空位罰分為12、空位擴展罰分為4且移碼空位罰分為5。兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller(Cabios.4:11-17,1989)之算法來確定,其已併入ALIGN程式(版本2.0),使用PAM120權重殘基表,間位長度罰分為12且空位罰分為4。
術語「溶解度」係指本文所提供之ADIr酶溶解於液體溶劑中且形成均勻溶液之性質。溶解度典型地通過每單位體積溶劑之溶質質量(每公斤溶劑之溶質公克數、g/dL(100mL)、mg/ml等)、莫耳濃度、重量莫耳濃度、莫耳分數或對濃度之其他類似描述以濃度表示。單位量之溶劑可溶解之溶質之最大平衡量為在指定條件(包括溫度、壓力、pH值及溶劑性質)下該溶質在該溶劑中之溶解度。在某些實施例中,溶解度係在生理pH值或其他pH值下、例如在pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 7.2、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8或pH 8.0下量測。在某些實施例中,溶解度係在水或生理緩衝液(諸如PBS或NaCl)(在存在或不存在NaP之情况下)或本文所描述之其他緩衝液/組合物中量測。在具體實施例中,溶解度係在相對較低pH值(例如pH 6.0)及相對較高鹽(例如500mM NaCl及10mM NaP)下量測。在某些實施例中,溶解度係在諸如血液或血清之生物流體(溶劑)中量測。在某些實施例中,溫度可為約室溫(例如約20、21、22、23、24、25℃)或約體溫(37℃)。在某些實施例中,ADIr酶之溶解度在室溫下或在37℃下為至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30mg/ml。
「實質上」或「基本上」意謂幾乎全部或完全,例如95%、96%、97%、98%、99%或一些給定量之更大值。
「統計顯著」意謂結果不可能偶然出現。統計顯著性可藉由此項技術中已知之任何方法來確定。顯著性之常用度量包括p值,若無效假設為真的,則其為所觀測之事件會發生之頻率或概率。若所獲得之p值
小於顯著性水平,則排除無效假設。在簡單情况下,顯著性水平經定義係在0.05或更小之p值下。
除非另外明確陳述,否則本說明書中之各實施例加以必要的變更即適用於每個其他實施例。
在本發明通篇中,可使用以下縮寫:PEG,聚乙二醇;ADI,精胺酸脫亞胺酶;SS,丁二酸丁二醯亞胺酯;SSA,丁二醯亞胺基丁二醯亞胺;SPA,丙酸丁二醯亞胺酯;NHS,N-羥基-丁二醯亞胺;ASS1或ASS,精胺基丁二酸鹽合成酶;ASL,精胺基丁二酸鹽解離酶。
編碼ADI酶之聚核苷酸可衍生、選殖、分離、合成或產生自任何來源,包括例如微生物、重組生物技術或其任何組合。舉例而言,精胺酸脫亞胺酶可選殖自黴漿菌屬微生物。在某些實施例中,精胺酸脫亞胺酶係選殖自唾液黴漿菌、泡沫黴漿菌、加拿大黴漿菌、耳黴漿菌、猪滑液黴漿菌、泄殖腔黴漿菌、鵝黴漿菌、產鹼黴漿菌、口腔黴漿菌、惰性黴漿菌、火鶏黴漿菌、蜂房黴漿菌、滲透黴漿菌、鶏黴漿菌、梨黴漿菌、靈長類黴漿菌、發酵黴漿菌、產脂黴漿菌、氣管黴漿菌、模仿黴漿菌、乳白色黴漿菌、毛氏黴漿菌、象黴漿菌、肺炎黴漿菌、龜黴漿菌、黴漿菌屬某種CAG:877或黴漿菌屬某種CAG:472或其任何組合。在一些實施例中,精胺酸脫亞胺酶選殖自列於表1中之物種。在特定實施例中,ADI包含SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:28中任一者之胺基酸序列或其具有ADI活性(例如能够將精胺酸代謝成瓜胺酸及氨水)之變异體或片段或延伸。此類ADI酶可使用已知技術製備或合成。
在某些實施例中,如本文所描述之ADI酶係與衍生自人黴漿菌之基準ADI-PEG 20分子相比較。如本文所用,「ADI-PEG 20」係指此項技術中已知之ADI分子且描述於例如美國專利第6,183,738號及第6,635,462號中;亦參見Ascierto等人,2005.Pegylated arginine deiminase treatment of patients with metastatic melanoma:results from phase I and II studies.J Clin Oncol 23(30):7660-7668;Izzo F等人(2004)Pegylated arginine deiminase treatment of patients with unresectable hepatocellular carcinoma:results from phase I/II studies.J Clin Oncol 22(10):1815-1822;Holtsberg FW
等人(2002),Poly(ethylene glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase:effects of PEG formulations on its pharmacological properties.J Control Release 80(1-3):259-271;Kelly等人,(2012)British Journal of Cancer 106,324-332。如熟練技術人員將認可,此分子為衍生自人黴漿菌之聚乙二醇化(PEG 20,000)ADI酶,且相對於野生型人黴漿菌ADI酶具有兩個取代(K112E;P210S)。
如本文所描述之精胺酸脫亞胺酶篩選自大量ADI酶且被認為與患者之抗ADI-PEG 20抗體具有降低水準之反應性且/或具有其他有益性質。抗ADI-PEG 20抗體可出現在用ADI-PEG 20治療之個體中且可使用已知方法量測。與抗ADI-PEG 20抗體之反應性可例如使用ELISA或熟練技術人員已知之其他類似分析來確定。
在此方面,ADI-PEG 20可用作比較來評估與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性水準。與ADI-PEG 20與患者抗ADI-PEG 20抗體之交叉反應性水準相比統計顯著更低之交叉反應性水準可適用本文中。在某些實施例中,如本文所描述之精胺酸脫亞胺酶與抗ADI-PEG 20抗體具有低交叉反應性或沒有交叉反應性。在某些實施例中,同與ADI-PEG 20之反應性相比與抗ADI-PEG 20抗體之反應性的任何降低均可為有益的,因此ADI酶將改良用於需要精胺酸耗盡療法之患者的處理選擇。因此,在一些實施例中,如本文所描述之精胺酸脫亞胺酶與患者抗ADI-PEG 20抗體具有與ADI-PEG 20與此類抗體之反應性相比降低之交叉反應性。
「ADIr」在本文中用於指本發明之與抗ADI-PEG 20抗體具有與ADI-PEG 20與此類抗體之反應性相比降低之交叉反應性的ADI酶。「ADIr」名稱用於將本文所識別之分子與如此項技術中已知之ADI及ADI-PEG 20區分開。ADIr酶之實例包括SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:28及其胺基酸序列不同於SEQ ID NO:1或ADI-PEG 20之變异體。
在一些實施例中,本發明之ADIr酶具有類似於或優於ADI-PEG 20之特性或性質,以降低並維持低血液精胺酸含量以有效治療癌症。此類性質之實例包括Kcat、Km、最佳pH值、穩定性、活體內蛋白水解穩定性及缺乏對尚未存在於血液中之離子或輔因子的需要或其任何組
合。在某些實施例中,如本文所描述之ADIr之性質與ADI-PEG 20之類似性質相比為約或至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在一些實施例中,本文所描述之ADIr的性質與所比較之ADI-PEG 20之具體性質相比為約或至少約100%、105%、110%、120%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、250%、260%、280%、300%、320%、340、350%、360%、400%、420%、450%、460%、500%、520%、550%或更高。
因此,在某些實施例中,ADIr之Kcat為ADI-PEG 20之Kcat的約或至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更佳。在某些實施例中,ADIr之Kcat為ADI-PEG 20 Kcat之約或至少約100%、105%、110%、120%、125%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%、250%、260%、280%、300%、320%、340%、350%、360%、400%、420%、450%、460%、500%、520%、550%或更高倍。在某些實施例中,本文所描述之ADIr酶或包含其之組合物的Kcat為約0.5秒-1至約15秒-1、約1秒-1至約12秒-1、約1秒-1至約10秒-1、約1.5秒-1至約9秒-1、約2秒-1至約8秒-1或約2.5秒-1至約7秒-1。在某些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Kcat為約2.5秒-1至約7.5秒-1。在一些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG的Kcat為約2.5秒-1、約3秒-1、約3.5秒-1、約4秒-1、約4.5秒-1、約5秒-1、約5.5秒-1、約6秒-1、約6.5秒-1、約7秒-1、約7.2秒-1、約7.5秒-1、約8秒-1、約10秒-1、約15秒-1、約20秒-1、約25秒-1、約30秒-1、約35秒-1、約40秒-1、約45秒-1、約50秒-1、約55秒-1、約60秒-1、約65秒-1、約70秒-1、約75秒-1、約80秒-1、約85秒-1、約90秒-1、約95秒-1或約100秒-1。
在某些實施例中,ADIr之Km為ADI-PEG 20之Km的約或至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、
40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更佳。在某些實施例中,ADIr之Km為ADI-PEG 20之Km的約或至少約100%、105%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、180%、200%、220%、240%或250%。在特定實施例中,ADIr或其聚乙二醇化調配物之Km為約0.5μM至約50μM或約1.6μM至約48μM或約0.5μM至約15μM、約1μM至約12μM、約1μM至約10μM、約1.5μM至約9μM、約1.5μM至約8μM或約1.5μM至約7μM。在某些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG之Km為約1.5μM至約6.5μM。在一些實施例中,ADIr或其聚乙二醇化調配物之Km為約1.5μM、約1.6μM、約2μM、約2.5μM、約3μM、約3.5μM、約4μM、約4.5μM、約5μM、約5.5μM、約6μM、約6.5μM、約7μM、約8μM、約9μM、約10μM、約12μM、約14μM、約15μM、約16μM、約18μM、約20μM、約22μM、約24μM、約25μM、約26μM、約28μM、約30μM、約32μM、約34μM、約35μM、約36μM、約38μM、約40μM、約42μM、約44μM、約45μM、約46μM、約48μM或約50μM。
在某些實施例中,ADIr官能基處於接近於人類血液之生理pH值之pH值下。因此,在一些實施例中,ADIr官能基處於約4至約10.8或約6至約8或約6.5至約7.5之pH值下。在某些實施例中,ADIr在約pH 7.4下具有良好酶活性。
在某些實施例中,ADIr在長期儲存期間具有穩定性,且在人體中處理期間具有溫度及蛋白水解穩定性。在一些實施例中,ADIr不需要尚未存在於血液中之離子或輔因子來獲得活性。
在某些實施例中,本文所描述之ADIr通常具有十分不同於人黴漿菌之胺基酸序列,使得存在表面殘基變化,其將减少或消除抗ADI-PEG 20抗體之抗原位點。在一些實施例中,在所選ADIr分子與個體中之現有抗ADI-PEG 20抗體之間將不存在交叉反應性(例如沒有統計顯著性交叉反應性),且在個體中將產生全新的免疫反應而不是現有對人黴漿菌ADI之反應的成熟。因此,在一些實施例中,如本文所描述之ADIr與如
SEQ ID NO:1中所列之人黴漿菌ADI具有20%-85%序列一致性。在某些實施例中,如本文所描述之ADIr與人黴漿菌ADI具有甚至更低之序列一致性百分比,諸如10%或15%一致性。在某些實施例中,如本文所描述之ADIr與人黴漿菌ADI具有20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%或甚至83%一致性,且仍與抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性。
在某些實施例中,如本文所描述之ADIr與人黴漿菌ADI相比具有約10-140、15-140或25-140個表面殘基變化。表面殘基可由人黴漿菌ADI之晶體結構識別,且其他有機體之ADI之表面殘基可藉由序列同源性來確定。如本文所描述之ADIr與人黴漿菌ADI(參見SEQ ID NO:1)相比可具有約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或約140個表面殘基變化。
在一些實施例中,如本文所描述之ADIr與人黴漿菌ADI相比具有約10-140、15-140或25-140個表面殘基變化。此類殘基變化不僅需要表面胺基酸殘基。此類殘基變化(或添加或缺失)可在分子之任一末端或可在ADI之任何殘基處,使得經修飾ADI具有如本文所描述之所需ADI活性。要改變之殘基可由人黴漿菌ADI之晶體結構識別,且其他有機體之ADI之殘基可藉由序列同源性來確定。如本文所描述之ADIr與人黴漿菌ADI(參見SEQ ID NO:1)相比可具有約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、
112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139或約140個胺基酸殘基變化。
自大量ADI酶中,表1列舉了27種ADIr酶及其相對於人黴漿菌ADI之序列一致性百分比。
在某些實施例中,本文自許多所選物種中識別之ADIr酶具有規定數目之表面離胺酸殘基(在某些實施例中,例如多至30個或更多)。本文識別之與抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的ADIr酶中之某些具有約、至少約或不超過約0、1、2、3、4、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個表面離胺酸殘基,包括其間之所有範圍。
術語「多肽」、「蛋白質」及「肽」可互換使用且意謂不限於任何特定長度之胺基酸聚合物。術語「酶」包括多肽或蛋白質催化劑,且關於ADIr可與蛋白質、多肽或肽互換使用。術語包括修飾,諸如豆蔻醯化、硫酸鹽化、糖基化、磷醯化及信號序列之添加或缺失。術語「多肽」或「蛋白」意謂胺基酸之一或多個鏈,其中各鏈包含藉由肽鍵共價鍵聯之胺基酸,且其中該多肽或蛋白質可包含多個藉由肽鍵非共價及/或共價鍵聯在一起之鏈,其具有天然蛋白質(亦即由天然存在及具體而言非重組細胞或基因工程改造或重組細胞產生之蛋白質)之序列,且包含具有天然蛋白質之胺基酸序列的分子或具有天然序列之一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代之分子。術語「多肽」及「蛋白質」具體而言涵蓋本文所描述之ADIr酶/蛋白質,或具有ADIr蛋白質之一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代之序列。在某些實施例中,多肽為由重組細胞產生之「重組」多肽,該重組細胞包含一或多個重組DNA分子,其典型地由以其他方式將不存在於細胞中之异源多核苷酸序列或多核苷酸序列之組合構成。
本文提及之術語「分離蛋白」意謂目標蛋白質(1)不含將典型地與其一起發現於自然界中之至少另外一些蛋白質,(2)基本上不含來自
相同來源(例如來自相同物種)之其他蛋白質,(3)由來自不同物種之細胞表現,(4)已與至少約50%之在自然界中與其締合之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他材料分離,(5)不與在自然界中與「分離蛋白」締合之蛋白質之部分締合(藉由共價或非共價相互作用),(6)可操作地與在自然界中不與其締合之多肽締合(藉由共價或非共價相互作用),或(7)不存在於自然界中。此類分離蛋白可由基因組DNA、cDNA、mRNA或可能具有合成來源之其他RNA或其任何組合編碼。在某些實施例中,分離蛋白實質上擺脫了在其自然環境中發現之會妨礙其用途(治療、診斷、預防、研究或其他)之蛋白質或多肽或其他污染物。
術語「變异體」包括因一或多個取代、缺失、添加及/或插入而不同於本文具體揭示之參考多肽(例如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:28)的多肽。變异體多肽為生物活性的,亦即其持續具有參考多肽之酶促或結合活性。此類變异體可由例如遺傳多態性產生及/或來自人類操縱。
在許多情况下,生物活性變异體將含有一或多個保守取代。「保守取代」為胺基酸取代具有類似性質之另一胺基酸,使得熟習肽化學技術者將預期多肽之二級結構及親水性質實質上不變的取代。如上文所描述,可在本文所描述之聚核苷酸及多肽之結構中進行修飾且仍獲得編碼具有所需特性之變异體或衍生多肽之功能分子。
舉例而言,某些胺基酸可取代蛋白質結構中之其他胺基酸,而沒有明顯損失與諸如抗體之抗原結合區或受質分子上之結合位點之結構的相互作用結合能力。由於是蛋白質之相互作用能力及性質限定了蛋白質之生物功能活性,故可在蛋白質序列及當然其基礎DNA編碼序列中進行某些胺基酸序列取代,且仍然獲得具有相似性質之蛋白質。因此,預期可在所揭示組合物之肽序列或編碼該等肽之相應DNA序列中進行各種變化,而不明顯損失其功效。
在進行此類變化時,可考慮胺基酸之親水指數。親水胺基酸指數在賦予蛋白質相互作用生物功能中之重要性為此項技術中普遍瞭解的(Kyte及Doolittle,1982,其以引用之方式併入本文中)。公認胺基酸之相對親水特性有助於所得蛋白質之二級結構,該二級結構又限定了蛋白質與其
他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物)之相互作用。已基於各胺基酸之疏水性及電荷特徵為其分配親水性指數(Kyte及Doolittle,1982)。此等值為:异白胺酸(+4.5);纈胺酸(+4.2);白胺酸(+3.8);苯基丙胺酸(+2.8);半胱胺酸(+2.5);甲硫胺酸(+1.9);丙胺酸(+1.8);甘胺酸(-0.4);蘇胺酸(-0.7);絲胺酸(-0.8);色胺酸(-0.9);酪胺酸(-1.3);脯胺酸(-1.6);組胺酸(-3.2);麩胺酸(-3.5);麩醯胺酸(-3.5);天冬胺酸鹽(-3.5);天冬醯胺(-3.5);離胺酸(-3.9);及精胺酸(-4.5)。此項技術中已知某些胺基酸可由具有類似親水性指數或分數之其他胺基酸取代且仍產生具有類似生物活性之蛋白質,亦即仍獲得生物功能等效蛋白質。在進行此類變化時,親水性指數在±2以內之胺基酸取代為較佳的,±1以內之彼等為尤其較佳的,且±0.5以內之彼等為甚至尤其更佳的。
此項技術中亦瞭解可基於親水性有效地進行相似胺基酸之取代。美國專利4,554,101(具體地以全文引用之方式併入本文中)陳述蛋白質之最大局部平均親水性如由其相鄰胺基酸之親水性所控制與蛋白質之生物學性質相互關聯。如美國專利4,554,101中所詳述,已為胺基酸殘基分配以下親水性值:精胺酸(+3.0);離胺酸(+3.0);天冬胺酸鹽(+3.0±1);麩胺酸鹽(+3.0±1);絲胺酸(+0.3);天冬醯胺(+0.2);麩醯胺(+0.2);甘胺酸(0);蘇胺酸(-0.4);脯胺酸(-0.5±1);丙胺酸(-0.5);組胺酸(-0.5);半胱胺酸(-1.0);甲硫胺酸(-1.3);纈胺酸(-1.5);白胺酸(-1.8);异白胺酸(-1.8);酪胺酸(-2.3);苯基丙胺酸(-2.5);色胺酸(-3.4)。應瞭解胺基酸可取代具有類似親水性值之另一者且仍獲得生物學等效物,且特定而言,免疫等效蛋白質。在此類變化中,親水性值在±2以內之胺基酸之取代為較佳的,±1以內之彼等為尤其較佳的,且±0.5以內之彼等為甚至尤其更佳的。
如以上所概述,因此,胺基酸取代通常係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性,例如其疏水性、親水性、電荷、大小及其類似物。將各種前述特徵考慮在內之示例性取代為熟習此項技術者熟知的,且包括:精胺酸及離胺酸;麩胺酸鹽及天冬胺酸鹽;絲胺酸及蘇胺酸;麩醯胺及天冬醯胺;及纈胺酸、白胺酸及异白胺酸。
胺基酸取代可進一步基於殘基之極性、電荷、溶解度、疏水
性、親水性及/或兩親性質來進行。舉例而言,帶負電荷之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸;帶正電荷之胺基酸包括離胺酸及精胺酸;且具有不帶電荷之極性頭部基團且具有類似親水性值之胺基酸包括白胺酸、异白胺酸及纈胺酸;甘胺酸及丙胺酸;天冬醯胺及麩醯胺;及絲胺酸、蘇胺酸、苯基丙胺酸及酪胺酸。可呈現保守變化之其他胺基酸群組包括:(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his;及(5)phe、tyr、trp、his。
或者,變异體亦可含有非保守變化。在一較佳實施例中,變异體多肽因取代、缺失或添加少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2個胺基酸或甚至1個胺基酸而不同於天然序列。變异體亦可(或者)藉由例如對多肽之免疫原性、二級結構、酶活性及/或親水性具有最小影響之胺基酸之缺失或添加來修飾。
一般而言,變异體將展示與參考多肽序列(例如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:28)之約或至少約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相似性或序列一致性或序列同源性。此外,涵蓋因添加(例如C端添加、N端添加、兩者)、缺失、截斷、插入或取代約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個胺基酸而不同於天然或母體序列但保留母體或參考多肽序列之性質或活性的序列。
在一些實施例中,變异體多肽有至少一個但少於50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2個胺基酸殘基不同於參考序列。在一些實施例中,變异體多肽有約或至少0.5%或1%但小於20%、15%、10%或5%之殘基不同於參考序列。(若此比較需要比對,則應比對序列以獲得最大相似性。因缺失或插入或失配而被「圈」出之序列視為差异)。
在一些實施例中,ADIr之長度將為約300至約500個胺基酸,包括其間之所有整數及範圍。在具體實施例中,ADIr之長度將為約300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、
435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495或500個胺基酸,包括其間之所有整數及範圍。
術語「多肽片段」係指天然存在或重組產生之多肽中具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失或取代的多肽。在某些實施例中,多肽片段可包含至少5至約400個胺基酸長之胺基酸鏈。應瞭解,在某些實施例中,片段為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350或400個胺基酸長。尤其適用之多肽片段包括功能結構域,包括本文所描述之ADIr的催化性ADI結構域。在ADIr之情况下,適用片段包括但不限於催化結構域及α-螺旋結構域。
許多用於綴合至ADI之活化PEG共價鍵結至離胺酸殘基。通常存在與離胺酸殘基相比少很多之PEG分子附著於ADI。自分子至分子連接之數目與分佈均可為非均質的。任何特定離胺酸殘基將在僅一小部分ADI分子中經修飾。此位點修飾非均質性及低PEG佔有率可產生藥物表徵與在抗原位點處PEG遮擋之有效性的問題。因此,在某些實施例中,如本文所描述之所選ADIr酶藉由用其他殘基類型進行離胺酸置換來修飾以减少離胺酸殘基之數目。此產生更均勻聚乙二醇化蛋白質且增加剩餘離胺酸殘基處之PEG佔有率。選擇變成其他殘基之具體離胺酸殘基將經選擇以保留酶活性。此更均勻聚乙二醇化預期提供增加之針對血液中之蛋白水解的保護及增加之對抗原位點與患者抗體之隔離。
在某些實施例中,ADIr酶如美國專利第6,635,462號中所描述進行修飾。特定而言,ADIr之天然存在之胺基酸殘基中之一或多者之修飾可提供一種酶,其更容易複性及調配,藉此改良ADIr及包含其之治療性組合物之製造。在一些實施例中,ADIr酶經修飾以移除一或多個離胺酸殘基(例如離胺酸可經另一胺基酸或其類似物或非天然胺基酸取代)。特定而言,在一些實施例中,ADIr酶經修飾在等效於SEQ ID NO:1(人黴漿菌ADI)之112、374、405或408之位置或此等位置中之一或多者之組合處不含離
胺酸。在一些實施例中,ADIr酶經修飾不含一或多個離胺酸殘基,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或更多個離胺酸殘基(若其存在)可經另一胺基酸或其類似物或非天然胺基酸取代。在具體實施例中,ADIr酶例如在等效於SEQ ID NO:1之位置7、88、137、209及380之位置處具有5個經取代離胺酸殘基。在一些實施例中,ADIr酶例如在等效於SEQ ID NO:1之位置7、9、59、88、115、116、137、178、209及380之位置處具有10個經取代離胺酸殘基。在某些實施例中,ADIr酶例如在等效於SEQ ID NO:1之位置7、9、59、66、88、91、93、115、116、137、141、178、209、279及位置380之位置處具有15個經取代離胺酸殘基。在一些實施例中,ADIr酶例如在等效於SEQ ID NO:1之位置7、9、56、59、66、88、91、93、96、115、116、137、141、178、209、254、279、325、326、380及406之位置處具有21個經取代離胺酸殘基。
在一些情况下,天然ADIr可發現於微生物中且因此具免疫原性且在患者中自循環中快速清除。此等問題可藉由修飾ADIr以產生「經修飾ADIr」酶來克服。因此,某些實施例包括包含「修飾劑」之ADIr酶,該修飾劑之實例包括但不限於大分子聚合物、蛋白質、肽、多醣及其他化合物。ADIr酶及修飾劑可藉由共價鍵或非共價相互作用鍵聯以形成穩定綴合物或穩定組合物從而達成所要效應。在某些實施例中,經修飾ADIr保留相應未修飾ADIr(例如具有相同或類似序列)之生物活性且具有與相應未修飾ADIr相比較長體內半衰期及較低抗原性。在某些實施例中,經修飾ADIr保留相應未修飾ADIr之至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多之生物活性。一般而言,經修飾ADIr保留足够用於治療用途之生物活性。
在一些實施例中,修飾劑可為生物相容之聚合物或蛋白質或其片段且可增加ADIr在血液中之半衰期。修飾劑可化學偶合至ADIr或可適用時經由融合蛋白表現鍵聯至ADIr。
大分子聚合物可包括非肽大分子聚合物,其在某些實施例中可具有其自己的生物活性。適合之聚合物包括但不限於聚烯醇化合物、聚
醚化合物、聚乙烯吡咯啶酮、聚胺基酸、二乙烯基醚及順丁烯二酸酐之共聚物、N-(2-羥丙基)-甲基丙烯醯胺、多醣、聚氧乙基化多元醇、肝素或其片段、聚烷基-乙二醇及其衍生物、聚烷基-乙二醇及其衍生物之共聚物、聚(乙烯基乙醚)、a,P-聚[(2-羥乙基)-DL-天冬醯胺]、聚羧酸酯、聚氧化乙烯-甲醛(oxymethylene)、聚丙烯醯基嗎啉、胺基化合物及氧化烯烴(oxyolefin)之共聚物、聚透明質酸、聚環氧乙烷、乙二酸及丙二酸之共聚物、聚(1,3-二氧雜環戊烷)、亞乙基及順丁烯二醯肼共聚物、聚唾液酸、環糊精等。在某些實施例中,聚合物為聚乙二醇。
如本文所用之聚烯醇化合物包括但不限於聚乙二醇(包括單甲氧基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚烯丙醇、聚丁烯醇及其類似物,以及其衍生物,諸如脂質。
聚醚化合物包括但不限於聚亞烷基二醇(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)2O)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)。
聚胺基酸包括但不限於一種類型之胺基酸的聚合物或兩種或兩種以上類型之胺基酸的共聚物,例如聚丙胺酸或聚離胺酸或其嵌段共聚物。
多醣包括但不限於葡聚糖及其衍生物,例如硫酸右旋糖酐;纖維素及其衍生物(包括甲基纖維素及羧甲基纖維素);澱粉及其衍生物;聚蔗糖等。
在具體實施例中,ADIr藉由與蛋白質或肽偶合來進行修飾,其中一或多種蛋白質或肽直接或間接鍵聯至ADIr。蛋白質可為天然存在之蛋白質或其片段,包括但不限於天然存在之人血清蛋白或其片段,諸如甲狀腺素結合蛋白、甲狀腺素轉運蛋白、a1-酸性糖蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白、Ig Fc區、白蛋白及其片段。「片段」意謂蛋白質中小於全蛋白但保留所需蛋白質功能之任何部分。如本文所描述之ADIr可經由共價鍵直接或間接鍵聯至蛋白。直接鍵聯意謂ADIr之一個胺基酸經由肽鍵或二硫鍵直接鍵聯至修飾蛋白之一個胺基酸。間接鍵聯係指ADIr與修飾蛋白之間經由在其之間起初存在之化學基團或通過生物或化學手段添加之具體化學基團或以上所提及之鍵聯之組合而鍵聯。
在特定實施例中,ADIr藉由共價連接至一或多個PEG分子來進行修飾。經PEG共價修飾(在存在或不存在連接子之情况下)之ADIr在下文中可稱為「ADIr-PEG」。當與未修飾ADIr相比時,ADIr-PEG保留大多數其酶活性,免疫原性或抗原性低得多,具有大大延長之循環半衰期,且在腫瘤治療中更有效。
「聚乙二醇」或「PEG」係指環氧乙烷與水之呈分枝鏈或直鏈形式之冷凝聚合物之混合物,其由通式H(OCH2CH2)nOH表示,其中n至少為4。「聚乙二醇」或「PEG」與數字後綴組合使用以指示其近似重量平均分子量。舉例而言,PEG5,000指總重量平均分子量為約5,000之PEG;PEG12,000指總重量平均分子量為約12,000之PEG;且PEG20,000指總重量平均分子量為約20,000之PEG。
在一些實施例中,PEG之總重量平均分子量為約1,000至約50,000;約3,000至約40,000;約5,000至約30,000;約8,000至約30,000;約11,000至約30,000;約12,000至約28,000;約16,000至約24,000;約18,000至約22,000;或約19,000至約21,000。在一些實施例中,PEG之總重量平均分子量為約1,000至約50,000;約3,000至約30,000;約3,000至約20,000;約4,000至約12,000;約4,000至約10,000;約4,000至約8,000;約4,000至約6,000;或約5,000。在具體實施例中,PEG之總重量平均分子量為約20,000。一般而言,分子量為30,000或更大之PEG難以溶解,且調配產物之產量可降低。PEG可為分枝鏈或直鏈。一般而言,PEG之分子量增加使ADIr之免疫原性降低。PEG可為分枝鏈或直鏈,且在某些實施例中為直鏈。具有本文所描述之分子量的PEG可與ADIr及視情况存在之生物相容連接子結合使用,以治療移植物抗宿主疾病(GVHD)或癌症,包括例如肝細胞癌、急性髓樣白血病(諸如復發性急性髓樣白血病)、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦部癌症、頭頸癌、子宮頸癌、睪丸癌、胃癌或食道癌,以及本文所描述之其他癌症。
某些實施例使用硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG。在一些實施例中,硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG連接至一或多個天然
存在之半胱胺酸殘基、一或多個所引入之半胱胺酸殘基(例如用半胱胺酸殘基取代一或多個野生型殘基、插入一或多個半胱胺酸殘基))或其任何組合(參見例如Doherty等人,Bioconjug Chem.16:1291-98,2005)。在某些實施例中,野生型ADI半胱胺酸殘基中之某些可首先經另一胺基酸取代以防止PEG聚合物連接至野生型半胱胺酸,例如防止PEG破壞以其他方式需要之生物活性。一些實施例使用一或多種非天然半胱胺酸衍生物(例如高半胱胺酸)替代半胱胺酸。
硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG之非限制性實例包括甲氧基PEG順丁烯二醯亞胺(M-PEG-MAL)(例如MW 2000、MW 5000、MW 10000、MW 20000、MW 30000、MW 40000)。M-PEG-MAL與蛋白質及肽中之半胱胺酸側鏈上之硫醇基反應以產生穩定3-硫代丁二醯亞胺基醚鍵。此反應具高度選擇性且可在溫和條件下在約pH 5.0-6.5下在其他官能基存在下進行。市售硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG分子之特定實例展示於圖1A-1D中。因此,在某些實施例中,ADIr酶綴合至本文所描述之硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG分子中之任何一或多者。
ADIr可在存在或不存在連接子之情况下共價鍵結至修飾劑,諸如PEG,不過較佳實施例使用連接子。ADIr可如例如以下文獻所描述使用此項技術中已知之方法經由生物相容連接子共價鍵結至PEG:Park等人,Anticancer Res.,1:373-376(1981);以及Zaplipsky及Lee,Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris編,Plenum Press,NY,第21章(1992),其揭示內容以本文引用之方式併入本文中。在一些情况下,ADIr可例如通過胺基、硫氫基、羥基、羧基或其他基團直接偶合(亦即不使用連接子)至諸如PEG之修飾劑。
用於使ADIr共價連接至修飾劑(例如PEG)之連接子可為任何生物相容連接子。如上文所論述,「生物相容」表明化合物或基團為無毒的且可在活體外或活體內使用而不會引起損傷、病態、疾病或死亡。諸如PEG之修飾劑可例如經由醚鍵、硫醇鍵、醯胺鍵或其他鍵鍵結至連接子。
在一些實施例中,適合之連接子之總鏈長可為約1-100個原子、1-80個原子、1-60個原子、1-40個原子、1-30個原子、1-20個原子或
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個原子,例如其中鏈中之原子包含C、S、N、P及/或O。在某些實施例中,連接子為視情况存在的,例如PEG綴合之ADIr酶不包含連接子。在一些情况下,連接子基團包括例如丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基團、半胱胺酸基團、組胺酸基團、亞甲基及其組合。穩定連接子之特定實例包括丁二醯亞胺、丙酸、羧基甲醇化物鍵聯、醚、胺甲酸酯、醯胺、胺、尿素、醯亞胺、脂族C-C鍵及硫醚。在某些實施例中,生物相容連接子為丁二酸丁二醯亞胺酯(SS)基團。
其他適合之連接子包括氧基羰基咪唑基團(包括例如羰基咪唑(CDI))、硝基苯基(包括例如碳酸硝基苯酯(NCP)或碳酸三氯苯酯(TCP))、甲苯磺酸酯(trysylate)基團、醛基、异氰酸酯基、乙烯基碸基或一級胺。在某些實施例中,連接子衍生自SS、SPA、SCM或NHS;在某些實施例中,使用SS、SPA或NHS,且在一些實施例中,使用SS或SPA。因此,在某些實施例中,潜在連接子可由以下各項形成:甲氧基-PEG丁二酸丁二醯亞胺酯(SS)、甲氧基-PEG戊二酸丁二醯亞胺酯(SG)、甲氧基-PEG碳酸丁二醯亞胺酯(SC)、甲氧基-PEG丁二醯亞胺基羧甲基醚(SCM)、甲氧基-PEG2 N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、甲氧基-PEG丁酸丁二醯亞胺酯(SBA)、甲氧基-PEG丙酸丁二醯亞胺酯(SPA)、甲氧基-PEG丁二醯亞胺基戊二酸醯胺及/或甲氧基-PEG丁二醯亞胺基丁二醯亞胺。
連接子之其他實例包括但不限於以下中之一或多者:-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)
-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、二價環烷基、-N(R6)-,R6為H或選自由以下組成之群的有機基團:烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、芳基及經取代芳基。另外,本文所描述之連接子部分中之任一者可進一步包括包含1至20個環氧乙烷單體單元[亦即-(CH2CH2O)1-20-]之環氧乙烷寡聚物鏈。亦即,環氧乙烷寡聚物鏈可存在於在連接子之前或之後且視情况在包含兩個或兩個以上原子之連接子部分之任何兩個原子之間。另外,若寡聚物鄰近聚合物片段,則寡聚物鏈將不被視為連接子部分之一部分,而僅僅表示聚合物片段之延伸部分。
具體示例性PEG分子及連接子描述於下表A中。
在某些實施例中,ADIr酶包含一或多個PEG分子及/或如本文所描述(例如表A中)之連接子。
PEG連接至ADIr增加ADIr之循環半衰期。一般而言,PEG連接至ADIr之一級胺。如熟練技術人員將已知,在ADIr上PEG或其他修飾劑之連接位點的選擇係藉由蛋白質之活性結構域內之各個位點之作用來確定。PEG可連接至ADIr之一級胺,而不會產生酶活性之實質性損失。舉例而言,存在於ADIr中之離胺酸殘基全部是如本文所描述之ADIr可經由生物相容連接子(諸如SS、SPA、SCM、SSA及/或NHS)連接至PEG之可能點。如熟習此項技術者鑒於本發明將顯而易知,PEG亦可連接至ADIr上之其他位點。
1至約30個PEG分子可共價鍵結至ADIr。在某些實施例
中,ADIr經一個PEG分子修飾(亦即包含一個PEG分子)。在一些實施例中,ADIr經超過一個PEG分子修飾。在特定實施例中,ADIr經約1至約10或約7至約15個PEG分子或約2至約8或約9至約12個PEG分子修飾。在一些實施例中,ADIr經約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個PEG分子修飾。在具體實施例中,ADIr經每個ADIr 4.5-5.5個PEG分子修飾。在一些實施例中,ADIr經5±1.5個PEG分子修飾。
在某些實施例中,ADIr中約15%至約70%之一級胺基經PEG修飾,在一些實施例中,精胺酸脫亞胺酶中之約20%至約65%、約25%至約60%,或在某些實施例中,約30%至約55%或45%至約50%,或在一些實施例中,約50%之一級胺基經PEG修飾。當PEG共價鍵結至ADIr之末端時,可能需要僅使用1個PEG分子。ADIr上PEG單元之數目增加使酶之循環半衰期增加。然而,ADIr上PEG單元之數目增加使酶之比活性降低。因此,如熟習此項技術者鑒於本發明將顯而易知,需要在兩者之間達成平衡。
在一些實施例中,生物相容連接子之共同特徵在於其經由琥珀醯亞胺基連接至精胺酸脫亞胺酶之一級胺。一旦與ADIr偶合,SS-PEG具有緊挨著PEG之酯鍵,其可賦予此位點血清酯酶敏感性,該血清酯酶可在體內自ADIr釋放PEG。SPA-PEG及PEG2-NHS不具有酯鍵,因此其不對血清酯酶敏感。
連接至蛋白質之PEG可為直鏈,如在SS-PEG、SPA-PEG及SC-PEG情况下,或可使用PEG之分枝鏈,如在PEG2-NHS情况下。
在某些實施例中,位於或鄰近酶之催化區域之與ADIr締合之聚乙二醇化位點經修飾。在某些實施例中,片語「聚乙二醇化位點」定義為ADI或ADIr中可經聚乙二醇共價修飾之任何位點或位置。「聚乙二醇化位點」可視為位於或鄰近酶之催化區域,其中位點之聚乙二醇化使得酶之催化活性顯著降低。此類位點之聚乙二醇化傳統上引起酶之鈍化。舉例而言,來自人黴漿菌之ADI在可視為位於或鄰近酶之催化區域的112位置處具有離胺酸。PEG連接至112位置處之此離胺酸可使酶失活。此外,來自人黴漿菌之ADI在可視為位於或鄰近酶之催化區域的397位置處具有半
胱胺酸。397位置處之半胱胺酸的胺基酸取代可使酶失活。特定而言,丙胺酸、組胺酸、精胺酸、絲胺酸、離胺酸或酪胺酸取代397位置處之半胱胺酸可引起所有可偵測酶活性之損失。來自人黴漿菌之ADI具有三個接近此保守半胱胺酸定位之離胺酸殘基,具體而言為Lys374、Lys405及Lys408。PEG連接至Lys374、Lys405、Lys408或其組合可使酶失活。
應瞭解,衍生自其他有機體之ADIr亦可具有對應於來自人黴漿菌之ADI的112位置之聚乙二醇化位點。此外,來自一些有機體之ADI可具有對應於與來自人黴漿菌之ADI的112位置相同之總體位置的離胺酸殘基。來自此類有機體之ADI中的離胺酸之位置為熟練人員已知的且描述於美國專利第6,635,462號中。
因此,一些實施例提供ADIr之多肽鏈中的某些胺基酸取代。此等胺基酸取代提供經修飾ADIr,其在由修飾劑例如在聚乙二醇化後修飾時損失較少活性。藉由消除位於或鄰近酶之催化區域的聚乙二醇化位點或其他已知修飾位點,可達成最佳修飾(例如聚乙二醇化),而不損失活性。
在一些實施例中,舉例而言,如上文所提及,胺基酸取代使用非天然胺基酸來綴合至PEG或其他修飾劑(參見例如de Graaf等人,Bioconjug Chem.20:1281-95,2009)。因此,某些實施例包括經由一或多個非天然胺基酸綴合至一或多個PEG之ADIr酶。在一些實施例中,非天然胺基酸包含具有選自由以下組成之群的官能基的側鏈:烷基、芳基、芳基鹵化物、乙烯基鹵化物、烷基鹵化物、乙醯基、酮、氮丙啶、腈、硝基、鹵化物、醯基、酮基、疊氮基、羥基、肼、氰基、鹵基、醯肼、烯基、炔基、醚、硫醚、環氧化物、碸、硼酸、硼酸酯(boronate ester)、硼烷、苯基硼酸、硫醇、硒基、磺醯基、硼酸酯(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸基、膦醯基、膦、雜環-、吡啶基、萘基、二苯甲酮、約束環(諸如環辛炔)、硫酯、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、胺基、羧酸、α-酮基甲酸、α或β不飽和酸及醯胺、乙醛醯基醯胺及有機矽烷基團。在一些實施例中,非天然胺基酸選自由以下組成之群:對乙醯基-L-苯基丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯基丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、高半胱胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcβ-絲胺酸、β-O-GlcNAc-L-絲胺酸、三
-O-乙醯基-GalNAc-α-蘇胺酸、α-GalNAc-L-蘇胺酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯基丙胺酸、异丙基-L-苯基丙胺酸、對疊氮基-L-苯基丙胺酸、對醯基-L-苯基丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯基丙胺酸、L-磷酸絲胺酸、膦醯基絲胺酸(phosphonoserine)、膦醯基酪胺酸(phosphonotyrosine)、對碘-苯基丙胺酸、對溴苯基丙胺酸、對胺基-L-苯基丙胺酸及异丙基-L-苯基丙胺酸。
雖然ADIr-PEG為本文所描述之說明性經修飾ADIr,但如熟練人員將認可,ADIr可經其他聚合物或適當分子修飾以獲得所要效應,尤其是降低抗原性及增加血清半衰期。
應瞭解,一些實施例係基於以下理解:當經由重組技術製備時,精胺酸脫亞胺酶之某些結構特徵可阻止或妨礙適當及快速複性。特定而言,此等結構特徵妨礙或阻止酶在重組製備期間呈現活性構象。在一些實施例中,術語「活性構象」定義為允許由未修飾或經修飾精胺酸脫亞胺酶產生之酶活性的三維結構。活性構象可尤其為催化精胺酸轉化成瓜胺酸所必需的。術語「結構特徵」可定義為由特定胺基酸或胺基酸組合產生之多肽鏈的任何特性、質量或性質。舉例而言,精胺酸脫亞胺酶可含有在正常肽鏈中產生彎曲或扭折且因此防礙酶在酶之複性期間呈現活性構象之胺基酸。特定而言,來自人黴漿菌之精胺酸脫亞胺酶在210位置處具有脯胺酸,其可在肽鏈中產生彎曲或扭折,從而使得酶在重組製備期間更難以複性。應瞭解,衍生自其他有機體之精胺酸脫亞胺酶亦可具有對應於來自人黴漿菌之精胺酸脫亞胺酶的210位置之位點。
因此,提供關於野生型精胺酸脫亞胺酶之多肽鏈中之某些胺基酸取代之一些實施例。實例包括消除精胺酸脫亞胺酶之肽鏈中之問題結構特徵的取代。亦包括提供經修飾精胺酸脫亞胺酶之改良之複性的取代。此等胺基酸取代使得可能使用降低量之緩衝液使經修飾精胺酸脫亞胺酶快速複性。此等胺基酸取代亦可提供增加產量之複性經修飾精胺酸脫亞胺酶。在一些實施例中,經修飾精胺酸脫亞胺酶在P210或等效殘基處具有胺基酸取代。如上文所提及,衍生自人黴漿菌之精胺酸脫亞胺酶具有位於210位置處之胺基酸脯胺酸。雖然不限制本發明,但鹹信在位置210處胺基酸脯胺酸之存在在正常多肽鏈中產生彎曲或扭折,從而增加使某些精胺酸脫
亞胺酶複性(亦即再摺疊)之難度。取代位置210處之脯胺酸使得可能使用降低量之緩衝液使經修飾精胺酸脫亞胺酶快速複性。取代位置210(或等效殘基)處之脯胺酸亦可提供增加產量之複性經修飾精胺酸脫亞胺酶。在一些實施例中,位置210(或等效殘基)處之脯胺酸經絲胺酸取代。其他取代之非限制性實例包括Pro210至Thr210、Pro210至Arg210、Pro210至Asn210、Pro210至Gln210或Pro210至Met210。藉由消除彼等與野生型精胺酸脫亞胺酶之位置210之胺基酸相關之結構特徵,可達成酶之最佳再摺疊。
本文所提供之方法可涉及活體外或活體內應用。在活體外應用(包括細胞培養應用)之情况下,可添加本文所描述之化合物至培養物中之細胞中且然後孵育。本文所描述之化合物亦可用於促進使用此項技術中熟知之抗體製備技術製備單株及/或多株抗體。如熟習此項技術者將顯而易知,單株及/或多株抗體可然後用於多種診斷應用。
投與本文所描述之化合物或組合物之活體內手段將視預期應用而不同。以純形式或以適當醫藥組合物形式投與本文所描述之ADIr組合物可經由接受之用於提供類似功效之藥劑投藥模式中之任一者來進行。醫藥組合物可將ADIr(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)與適當之生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合來製備,且可調配成諸如以下之呈固體、半固體、液體或氣態形式之製劑:錠劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球及氣霧劑。此外,其他醫藥學活性成分(包括如本文其他地方所描述之其他抗癌劑)及/或適合之賦形劑(諸如鹽、緩衝液及穩定劑)可(但不需要)存在於組合物內。
投藥可藉由包括以下之多種不同途徑來達成:口服、非腸道、鼻內、靜脉內、真皮內、皮下或局部。投藥模式取决於所要治療或預防之病狀的性質。因此,ADIr酶(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)可經口、鼻內、腹膜內、非腸道、靜脉內、淋巴內、瘤內、肌肉內、經間質、動脉內、皮下、眼內、滑膜內、經上皮及經皮投與。在投藥之後,减輕、抑制、預防癌症或延遲其進展及/或轉移之量視為有效量。在某些實施例中,本文之ADIr組合物使患者之中值存活時間增加統計顯著量。在一些實施例中,本文所描述之ADIr治療使患者之中值存活時間增加4週、5週、6週、7
週、8週、9週、10週、15週、20週、25週、30週、40週或更久。在某些實施例中,ADIr治療使患者之中值存活時間增加1年、2年、3年或更久。在一些實施例中,本文所描述之ADIr治療使無進展存活增加2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週或更久。在某些實施例中,本文所描述之ADIr治療使無進展存活增加1年、2年、3年或更久。
在某些實施例中,投與之量足以使腫瘤消退,正如由有活力腫瘤之量的統計顯著性降低,例如至少10%、20%、30%、40%、50%或腫瘤質量之更大降低;或由掃描尺寸改變(例如具有統計顯著性之减小)所指示。在某些實施例中,投與之量足以使得疾病穩定。在某些實施例中,投與之量足以產生具有熟練臨床醫師已知之特定疾病徵象之症狀的臨床相關减輕。
在某些實施例中,投與之量足以抑制NO合成、抑制血管生成及或足以誘導腫瘤細胞凋亡或其任何組合。NO合成、血管生成及凋亡可使用此項技術中已知之方法來量測,參見例如Current Protocols in Immunology or Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.(2009及其更新);Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley & Sons,1995;及其他相似參考文獻。在一些實施例中,投與之量抑制NO合成且抑制黑素瘤生長,且補充、增加或協同加强如本文所描述之其他化學治療,諸如順鉑。因此,一些實施例提供一種藉由與順鉑組合投與ADIr-PEG 20來治療黑素瘤之方法,其中該處理耗盡內源性氧化氮(NO)。
治療之精確劑量及持續時間隨正在治療之疾病而變且可根據經驗使用已知測驗程序或藉由在此項技術中已知之模型系統中測試組合物並由其推斷來確定。亦可進行控制臨床試驗。劑量亦可隨所要緩解之病狀之嚴重性而變化。通常調配並投與醫藥組合物以發揮治療有效作用,同時將不需要的副作用减至最少。組合物可一次性投與,或可分成要按多個時間間隔投與之許多較小劑量。對於任何特定個體,具體給藥方案可根據個體需要隨時間推移進行調節。
ADIr(例如ADIr-PEG)組合物可單獨或與諸如以下之其他已
知癌症治療組合投與:放射療法、化學療法、移植、免疫療法、激素療法、光動力療法等。組合物亦可與抗生素組合投與。
ADIr組合物亦可單獨或與ADI-PEG 20治療組合投與。在某些實施例中,如本文所描述之ADIr係用於已經ADI-PEG 20療法及已產生抗ADI-PEG 20抗體之患者中。此類患者不再受益於ADI-PEG 20治療,因為酶由抗體中和。因此,在某些實施例中,本發明提供一種治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展之方法,其包括向有需要之患者投與治療有效量之包含ADI-PEG 20之組合物,且在一段時間之後,向患者投與包含如本文所描述之ADIr的組合物,藉此治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展。
在該方法之一些實施例中,時間段係藉由偵測患者中之預定含量之抗ADI-PEG 20抗體來確定,其中包含ADIr之組合物係在偵測到預定含量之該等抗ADI-PEG 20抗體之後投與。在某些實施例中,可確定要用ADI-PEG 20及本文所描述之ADIr酶治療之患者中之抗ADI-PEG 20抗體之閾值含量或預定含量。抗ADI-PEG 20抗體之「預定閾值含量」(亦稱為「預定含量」或「預定截止值」)或有時稱為預定截止值可使用此項技術中已知之方法來確定,例如使用接受者操作特徵曲線(Receiver Operator Characteristic curves)或「ROC」曲線來確定。在一些實施例中,甚至非常低含量之抗ADI-PEG 20抗體即被認為足以成為將治療由ADI-PEG 20轉換成本文所描述之ADIr-PEG的根據。在某些實施例中,將確定何時結束ADI-PEG 20治療並開始用本文所描述之ADIr組合物治療之抗ADI-PEG 20之適當含量可由熟練臨床醫師確定。
在一些實施例中,該時間段係藉由偵測或以其他方式觀測患者中之ADI活性來確定,其中組合物係在偵測或觀測到預定水準之ADI活性之後投與。在特定實施例中,組合物係在偵測或觀測到患者中之降低水準之ADI活性之後投與。ADI活性可直接地例如藉由分析生物樣品之至少一個ADI活性指示物,或間接地例如藉由觀測ADI-PEG 20治療之所需或預期效果來量測。在某些實施例中,將確定何時結束ADI-PEG 20治療並開始用本文所描述之ADIr-PEG治療之ADI活性之適當水準可由熟練臨床醫師確定。
因此,投與此等及相關醫藥組合物之典型途徑包括但不限於口服、局部、經皮、吸入、非腸道、舌下、頰內、直腸、陰道及鼻內。如本文所用,術語非腸道包括皮下注射、靜脉內、肌肉內、胸骨內注射或輸注技術。
某些醫藥組合物經調配使得允許其中所含之活性成分在向患者投與組合物之後為生物可利用的。將向個體或患者投與之組合物可採取一或多個劑量單位的形式,其中例如錠劑可為單一劑量單位,且本文所描述之呈氣霧劑形式之ADIr組合物之容器可容納多個劑量單位。製備此類劑型之實際方法為已知的,或係為熟習此項技術者顯而易知的;例如參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。所要投與之組合物在任何情况下均將含有治療有效量之本文所描述之ADIr-PEG,諸如ADIr-PEG 20,用於治療根據本文教示之相關疾病或病狀。在某些實施例中,醫藥或治療性組合物為無菌及/或無熱原的。
醫藥組合物可呈固體或液體形式。在一些實施例中,載劑為粒子,使得組合物例如呈錠劑或粉末形式。載劑可為液體,並且組合物為例如投與口服油、可注射液體或氣霧劑,其適合用於例如吸入投藥。當旨在用於口服投藥時,醫藥組合物通常呈固體或液體形式,其中半固體、半液體、懸浮液及凝膠形式包括在本文中視為固體或液體之形式內。
作為用於口服投藥之固體組合物,醫藥組合物可調配成粉末、顆粒、壓製錠劑、丸劑、膠囊、口嚼膠、乾膠片或其類似物。此類固體組合物將典型地含有一或多種惰性稀釋劑或可食用載劑。此外,可存在以下中之一或多者:黏合劑,諸如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠;賦形劑,諸如澱粉、乳糖或糊精;崩解劑,諸如海藻酸、海藻酸鈉、Primogel、玉米澱粉及其類似物;潤滑劑,諸如硬脂酸鎂或Sterotex;助流劑,諸如膠體二氧化矽;甜味劑,諸如蔗糖或糖精;調味劑,諸如薄荷、水楊酸甲酯或桔子味調味劑;及著色劑。當醫藥組合物呈膠囊(例如明膠膠囊)形式時,其除以上類型之材料之外可含有諸如聚乙二醇或油之液體載劑。
醫藥組合物可呈液體形式,例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。作為兩個實例,液體可用於口服投藥或用於藉由注射遞送。當旨在用於口服投藥時,較佳組合物除本發明化合物之外含有以下中之一或多者:甜味劑、防腐劑、染色劑/著色劑及增味劑。在旨在藉由注射投與之組合物中,可包括以下中之一或多者:表面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝液、穩定劑及等滲劑。
液體醫藥組合物(無論其為溶液、懸浮液抑或其他類似形式)可包括以下助劑中之一或多者:無菌稀釋劑,諸如注射用水、鹽水溶液(在某些實施例中為生理鹽水)、林格氏溶液(Ringer’s solution)、等滲氯化鈉、不揮發性油(諸如可充當溶劑或懸浮介質之合成甘油單酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑;抗細菌劑,諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯;抗氧化劑,諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑,諸如乙二胺四乙酸;緩衝液,諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽;及用於調節張力之試劑,諸如氯化鈉或右旋糖。非腸道製劑可封閉於安瓿、拋弃式注射器或由玻璃或塑膠製成之多劑量小瓶中。生理鹽水為較佳助劑。可注射醫藥組合物較佳為無菌的。
旨在用於非腸道或口服投藥之液體醫藥組合物應含有一定量之如本文所揭示之ADIr(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20),使得將獲得適合之劑量。典型地,此量為含於組合物中之至少0.01%之ADIr。當旨在用於口服投藥時,此量可在組合物重量之0.1%與約70%之間變化。某些口服醫藥組合物含有約4%與約75%之間的ADIr。在某些實施例中,醫藥組合物及製劑經製備使得非腸道劑量單位在稀釋之前含有0.01重量%至10重量%之間的ADIr。
醫藥組合物可旨在用於局部投藥,在此情况下載劑可適當包含溶液、乳液、軟膏或凝膠基質。舉例而言,基質可包含以下中之一或多者:礦脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、諸如水及乙醇之稀釋劑以及乳化劑及穩定劑。增稠劑可存在於用於局部投藥之醫藥組合物中。若旨在用於經皮投藥,則組合物可包括經皮貼片或離子透入裝置。醫藥組合物可旨在用於以例如栓劑之形式直腸投藥,該栓劑將在直腸中融化並釋放藥
物。用於直腸投藥之組合物可含有油脂性基質作為適合之無刺激性賦形劑。此類基質包括但不限於羊毛脂、可可脂及聚乙二醇。
醫藥組合物可包括改變固體或液體劑量單位之物理形式的各種材料。舉例而言,組合物可包括形成包圍活性成分之包衣外殼之材料。形成包衣外殼之材料典型地為惰性的,且可選自例如糖、蟲膠及其他腸溶衣劑。或者,活性成分可包裹於明膠膠囊中。呈固體或液體形式之醫藥組合物可包括結合於ADIr(例如ADIr-PEG)且藉此幫助遞送化合物之試劑。可在此能力中起作用之適合之試劑包括單株或多株抗體、一或多種蛋白質或脂質體。醫藥組合物可基本上由可以氣霧劑形式投與之劑量單位組成。術語氣霧劑用於表示自具有膠體性質之系統變化至由加壓包裝組成之系統的多種系統。遞送可藉由液化或壓縮氣體或藉由分配活性成分之適合之幫浦系統來進行。氣霧劑可以單相、雙相或三相系統形式遞送來遞送活性成分。氣霧劑之遞送包括必需容器、活化劑、閥、亞容器及其類似物,其一起可形成套組。一般熟習此項技術者不進行過度實驗即可確定較佳氣霧劑。
醫藥組合物可藉由醫藥技術中熟知之方法來製備。舉例而言,旨在藉由注射投與之醫藥組合物可如下製備:藉由將包含如本文所描述之ADIr(例如ADIr-PEG)及視情况存在之鹽、緩衝液及/或穩定劑中之一或多者的組合物與無菌蒸餾水組合以形成溶液。可添加表面活性劑以促進形成均勻溶液或懸浮液。表面活性劑為與ADIr(例如ADIr-PEG)組合物非共價相互作用以促進ADIr(例如ADIr-PEG)溶解或均勻懸浮於水性遞送系統中之化合物。
組合物可以治療有效量投與,該治療有效量將視包括以下之多種因素而不同:所用具體化合物(例如ADIr-PEG)之活性;化合物之代謝穩定性及作用時長;患者之年齡、體重、總體健康、性別及膳食;投藥模式及時間;排泄速率;藥物組合;特定病症或病狀之嚴重性;及經受治療之個體。
本文所描述之化合物之治療有效量為有效抑制腫瘤生長之量。一般而言,以小劑量起始治療,該等小劑量可以小增量增加直至達成在該等情形下之最佳效果。一般而言,化合物之治療劑量可為約1至約200
mg/kg每週兩次至約每兩週一次。舉例而言,劑量可為以2ml靜脉注射形式約1mg/kg每週一次至約20mg/kg每3天一次。在一些實施例中,劑量可為約每3天一次、約每週一次、約每週兩次或約每2週一次投與約50IU/m2至約700IU/m2。在某些實施例中,劑量可為約每3天一次、約每週一次、約每週兩次或約每2週一次投與約50IU/m2、60IU/m2、70IU/m2、80IU/m2、90IU/m2、100IU/m2、110IU/m2、120IU/m2、130IU/m2、140IU/m2、150IU/m2、160IU/m2、170IU/m2、180IU/m2、190IU/m2、200IU/m2、210IU/m2、220IU/m2、230IU/m2、240IU/m2、250IU/m2、260IU/m2、270IU/m2、280IU/m2、290IU/m2、300IU/m2、310IU/m2、約320IU/m2、約330IU/m2、340IU/m2、約350IU/m2、360IU/m2、370IU/m2、380IU/m2、390IU/m2、400IU/m2、410IU/m2、420IU/m2、430IU/m2、440IU/m2、450IU/m2、500IU/m2、550IU/m2、600IU/m2、620IU/m2、630IU/m2、640IU/m2、650IU/m2、660IU/m2、670IU/m2、680IU/m2、690IU/m2或約700IU/m2。在某些實施例中,劑量可由熟練臨床醫師按需要進行修改。
在一些情况下,ADIr-SS-PEG5,000情况下之最佳劑量可為約每週兩次,而ADIr-SS-PEG20,000情况下之最佳劑量可為約每週一次至約每兩週一次。在某些實施例中,ADIr-SS-PEG20,000情况下之最佳劑量可為約每週兩次。
ADIr(例如ADIr-PEG)在注射之前可與磷酸鹽緩衝鹽水溶液或熟習此項技術者已知之任何其他適當的溶液混合。在一些實施例中,包含ADIr-PEG之液體組合物包含約10至約12mg之ADIr;約20至約40mg之聚乙二醇;約1.27mg±5%磷酸二氫鈉,USP;約3mg±5%磷酸氫二鈉,USP;約7.6mg±5%氯化鈉,USP;在約6.6至約7之pH值下;含於適當量之注射用水(例如約1ml或約2ml)中。
在一些實施例中,包含ADIr-PEG之液體組合物包含組胺酸-HCl,且在某些實施例中,組合物緩衝液為約0.0035M組胺酸-HCl至約0.35M組胺酸-HCl。在一個特定實施例中,組合物係於包含pH 6.8下之0.035M組胺酸-HCl之緩衝液中在0.13M氯化鈉存在下進行調配。在某些實施例中,組合物係於包含pH 6.8下之0.02M磷酸鈉緩衝液之緩衝液中在0.13M
氯化鈉存在下進行調配。在一些實施例中,包含ADIr-PEG之液體組合物包含約10至約12mg之ADIr;約20至約40mg之聚乙二醇;約5.4mg±5%組胺酸,USP;約7.6mg±5%氯化鈉,USP;在約6.6至約7之pH值下;含於適當量之注射用水(例如約1ml或約2ml)中。
在一些實施例中,包含ADIr(例如ADIr-PEG)之組合物之pH值為約5至約9、約6至約8或約6.5至約7.5。在一些實施例中,包含ADIr之組合物之pH值為約6.8±1.0。
在一些實施例中,包含ADIr(例如ADIr-PEG)之組合物中之游離PEG在1-10%之間。在一些實施例中,其為總PEG之小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%或小於1%。在某些實施例中,包含ADIr(例如ADIr-PEG)之組合物中之未修飾ADIr小於約1%、0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%或小於0.1%。一般而言,包含ADIr-PEG之組合物之總雜質小於或等於約4%、3%、2%、1.5%、1%或0.5%。在一些實施例中,內毒素限值滿足陳述於USP中之要求,亦即50EU/ml。
在一些實施例中,包含ADIr(例如ADIr-PEG)之組合物中之游離硫氫基大於約90%。在一些實施例中,包含ADIr或ADIr-PEG之組合物中之游離硫氫基為約91%、約92%、約93%、約94%或約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多。
在一些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之Km為約0.1μM或0.5μM至約15μM,或為約1μM至約12μM、約1μM至約10μM、約1.5μM至約9μM、約1.5μM至約8μM或約1.5μM至約7μM。在某些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之Km為約1.0μM至約10μM或約1.5μM至約6.5μM。在一些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG之Km為約、至少約或小於約0.1μM、約0.5μM、約1.0μM、約1.5μM、約2μM、約2.5μM、約3μM、約3.5μM、約4μM、約4.5μM、約5μM、約5.5μM、約6μM、約6.5μM或約7μM或約8μM或約9μM或約10μM。
在一些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之Kcat
為約0.5秒-1至約80秒-1或約0.5秒-1至約70秒-1或約0.5秒-1至約60秒-1或約0.5秒-1至約50秒-1或約0.5秒-1至約40秒-1或約0.5秒-1至約30秒-1或約0.5秒-1至約20秒-1或約0.5秒-1至約15秒-1,或為約0.5秒-1至約80秒-1或約1秒-1至約80秒-1或約5秒-1至約80秒-1或約10秒-1至約80秒-1或約20秒-1至約80秒-1或約30秒-1至約80秒-1或約40秒-1至約80秒-1或約50秒-1至約80秒-1或約60秒-1至約80秒-1或約70秒-1至約80秒-1或約1秒-1至約12秒-1、約1秒-1至約10秒-1、約1.5秒-1至約9秒-1、約2秒-1至約8秒-1或約2.5秒-1至約7秒-1。在某些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之Kcat為約2.5秒-1至約7.5秒-1。在一些實施例中,組合物中之ADIr或ADIr-PEG之Kcat為約或至少約2.5秒-1、約3秒-1、約3.5秒-1、約4秒-1、約4.5秒-1、約5秒-1、約5.5秒-1、約6秒-1、約6.5秒-1、約7秒-1、約7.5秒-1或約8秒-1、約10秒-1、約15秒-1、約20秒-1、約25秒-1、約30秒-1、約35秒-1、約40秒-1、約45秒-1、約50秒-1、約55秒-1、約60秒-1、約65秒-1、約70秒-1、約75秒-1、約80秒-1、約85秒-1、約90秒-1、約95秒-1或約100秒-1。
在一些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之電導率(此項技術中亦稱為比電導)為約5mS/cm至約20mS/cm或約5mS/cm至約15mS/cm、約7mS/cm至約15mS/cm、約9mS/cm至約15mS/cm或約10mS/cm至約15mS/cm。在一些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之電導率為約9mS/cm、約10mS/cm、約11mS/cm、約12mS/cm或約13mS/cm、約14mS/cm或約15mS/cm。在某些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之電導率為約13mS/cm±1.0mS/cm。
在一些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之滲透壓為約50mOsm/kg至約500mOsm/kg、約100mOsm/kg至約400mOsm/kg、約150mOsm/kg至約350mOsm/kg、約200mOsm/kg至約350mOsm/kg或約250mOsm/kg至約350mOsm/kg。在某些實施例中,組合物中之ADIr(例如ADIr-PEG)之滲透壓為約300±30mOsm/kg。
在一些實施例中,蛋白質濃度為約11.0±1.0mg/mL。在某些實施例中,蛋白質濃度在約8與約15mg/mL之間。在某些實施例中,蛋白
質濃度為約8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14或15mg/mL。
在一些實施例中,比酶活性在約5.0與90IU/mg之間或約5與55IU/mg之間,其中1IU定義為在一分鐘內在37℃下將1μmol精胺酸轉化成1μmol瓜胺酸及1μmol之氨水的酶量且效價為100±20IU/ml。在某些實施例中,比酶活性為約5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、35、40、45、50、55、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100±2.0IU/mg。在一個特定實施例中,比酶活性為9±2.0IU/mg。
包含本文所描述之ADIr(例如ADIr-PEG)之組合物可與包括ADI-PEG 20之一或多種其他治療劑同時、在其投與之前或在其投與之後投與。此類組合療法可包括投與含有本發明之化合物及一或多種其他活性劑之單一醫藥劑量調配物,以及投與包含含於自己單獨的醫藥劑量調配物中之本文所描述之ADIr(例如ADIr-PEG)及各活性劑之組合物。舉例而言,ADIr(例如ADIr-PEG)及其他活性劑可以諸如錠劑或膠囊之單一口服劑量組合物形式一起向患者投與,或各試劑以單獨的口服劑量調配物形式投與。類似地,ADIr(例如ADIr-PEG)及其他活性劑可以諸如呈鹽水溶液或其他生理學可接受之溶液形式之單一非腸道劑量組合物形式一起向患者投與,或各試劑以單獨的非腸道劑量調配物形式藉由相同或不同途徑(例如一者藉由注射,一者藉由口服)投與。在使用單獨的劑量調配物情况下,包含ADIr(例如ADIr-PEG)及一或多種其他活性劑之組合物可基本上同時(亦即并行地)或分開地錯開時間(亦即連續地)及以任何順序投與;組合療法應理解為包括所有此等方案。
因此,在某些實施例中,亦涵蓋與一或多種其他治療劑組合投與本發明之ADIr組合物。此類治療劑可在此項技術中接受作為如本文所描述之特定疾病病况(諸如特定癌症或GVHD)之標準治療。所涵蓋之示例性治療劑包括細胞因子、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗炎劑、化學治療劑、放射治療劑、自噬抑制劑或其他活性劑及輔助試劑。
在某些實施例中,本文所揭示之ADIr(例如ADIr-PEG)組合物可與許多化學治療劑結合投與。化學治療劑之實例包括烷基化劑,諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXANTM);磺酸烷基酯,諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶,諸如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)及烏瑞多巴(uredopa);乙烯亞胺及甲基蜜胺,包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺;氮芥,諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、雙氯乙基甲胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、氯乙環磷醯胺、尿嘧啶氮芥;硝基脲,諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine);抗生素,諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、氮雜絲胺酸、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C、加利車黴素(calicheamicin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、更生黴素(dactinomycin)、柔紅比星(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、阿黴素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝產物,諸如胺甲蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物,諸如二甲葉酸、胺甲蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物,諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物,諸如環胞苷、
阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷、5-FU;雄激素,諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄酮(mepitiostane)、睪內酯(testolactone);抗腎上腺劑,諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑,諸如亞葉酸(frolinic acid);乙醯葡醛酯(aceglatone);醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside);胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid);胺苯吖啶(amsacrine);貝斯西(bestrabucil);比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);多弗醯胺(defofamine);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);艾弗鳥胺酸(elformithine);依利醋銨(elliptinium acetate);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵;羥基脲;香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);足葉草酸(podophyllinic acid);2-乙肼;丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);西佐喃(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone);2,2',2”-三氯三乙胺;胺基甲酸酯;長春地辛(vindesine);達卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);加西托星(gacytosine);阿拉伯糖苷(「Ara-C」);環磷醯胺;噻替派;類紫杉醇,例如帕西他賽(paclitaxel)(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)及多西他賽(TAXOTERE®.,Rhne-Poulenc Rorer,Antony,France);苯丁酸氮芥;吉西他濱;6-硫代鳥嘌呤;巰基嘌呤;胺甲蝶呤;鉑類似物,諸如順鉑及卡鉑;長春花鹼(vinblastine);鉑;依托泊苷(etoposide)(VP-16);异環磷醯胺;絲裂黴素C;米托蒽醌(mitoxantrone);長春新鹼(vincristine);長春瑞濱(vinorelbine);諾維本(navelbine);雙羥蒽醌(novantrone);替尼泊苷(teniposide);道諾黴素(daunomycin);胺基蝶呤(aminopterin);截瘤達(xeloda);依班膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓撲异構酶抑制劑RFS 2000;二氟甲基鳥胺酸(DMFO);視黃酸衍生物,諸如
TargretinTM(蓓薩羅丁(bexarotene))、PanretinTM(阿利維甲酸(alitretinoin));ONTAKTM(地尼白介素2(denileukin diftitox));埃斯泊拉米星(esperamicin);卡培他濱(capecitabine);及以上中之任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義中亦包括發揮作用調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑,諸如抗雌激素,包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶之4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(Fareston);及抗雄激素,諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)。其他化學治療劑包括索拉非尼及其他蛋白激酶抑制劑,諸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、克唑替尼(crizotinib)、達沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼(erlotinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、木利替尼(mubritinib)、尼羅替尼(nilotinib)、帕尼單抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、哌加他尼(pegaptanib)、雷珠單抗(ranibizumab)、魯索替尼(ruxolitinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)及舒尼替尼;西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、依維莫司及其他mTOR抑制劑。以上中之任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物亦預期用於本文中。
在某些實施例中,本文所揭示之ADIr(例如ADIr-PEG)組合物可與許多自噬抑制劑結合投與。在一些較佳實施例中,自噬抑制劑選自由以下組成之群:氯喹、3-甲基腺嘌呤、羥氯喹(Plaquenil.TM.)、巴菲黴素(bafilomycin)A1、5-胺基-4-咪唑甲醯胺核糖核苷(AICAR)、岡田酸(okadaic acid)、自噬抑制性海藻毒素(其抑制2A型或1型蛋白磷酸酶)、cAMP之類似物及增加cAMP含量之藥物、腺苷、N6-巰基嘌呤核糖核苷、渥曼青黴素(wortmannin)及長春花鹼。此外,亦可使用抑制自噬所必需之蛋白質(諸如ATG5)的表現之反義或siRNA。
在一些實施例中,ADIr(例如ADIr-PEG)與一或多種治療劑之組合互補、相加或協同地作用。在此方面,本文描述互補或協同加强劑,
其包括能够與如本文所提供之ADIr-PEG互補或協同地起作用之治療劑(例如化學治療劑、自噬抑制劑、mTOR抑制劑或用於治療如本文所描述之癌症、GVHD或炎症性腸道疾病之任何其他治療劑),在情况下此類互補或協同作用表現為與當化學治療劑存在但ADIr(例如ADIr-PEG)組合物不存在時及/或當ADIr(例如ADIr-PEG)存在但化學治療劑不存在時可偵測之作用相比,量值較大之可偵測作用(亦即相對於適當對照情况以統計顯著性方式)。用於量測協同性及互補性之方法為此項技術中已知的(參見例如Cancer Res 2010年1月15日70;440)。
如本文所描述之包含ADIr(例如ADIr-PEG)及視情况存在之其他治療劑之組合物可用於用於治療癌症之治療方法及用於預防癌症轉移之方法中。因此,一些實施例包括用於治療多種不同癌症、緩解其症狀或抑制其進展或對其進行預防之方法。一些實施例包括用於治療GVHD、緩解其症狀或抑制其進展之方法。特定實施例包括用於治療患者之癌症或GVHD、緩解其症狀或抑制其進展之方法,其包括視情况,在用ADI-PEG 20治療之後,尤其在患者產生抗ADI-PEG 20抗體之情况下,向投與治療有效量之如本文所描述之ADIr組合物,藉此治療癌症或GVHD、緩解其症狀或抑制其進展。因此,可向患有炎症性腸道疾病(例如克羅恩氏病(Crohn's disease);潰瘍性結腸炎)、GVHD或包括但不限於以下之癌症之個體投與本文所描述之ADIr組合物:肝細胞癌、白血病(例如急性髓樣白血病及復發急性髓樣白血病)、黑素瘤(包括轉移性黑素瘤)、肉瘤(包括但不限於轉移性肉瘤、子宮平滑肌肉瘤)、胰臟癌、前列腺癌(諸如但不限於激素難治性前列腺癌)、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(包括但不限於胃腺癌瘤)、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌(包括但不限於腎細胞癌瘤)、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦部癌症、頭頸癌(包括但不限於鱗狀細胞頭頸癌;舌癌)、子宮頸癌、睪丸癌、膽囊癌、膽管癌及胃癌。
亦包括治療患者之癌症、緩解其症狀或抑制其進展之方法,其包括向患者投與如本文所描述包含ADIr(例如ADIr-PEG)及視情况存在
之一或多種其他治療劑之組合物,其中該癌症缺乏ASS、ASL或兩者。在此方面,ASS或ASL缺乏可為如藉由mRNA表現或蛋白質表現所量測之表現降低,或可為蛋白質活性降低,且通常包含如由熟練人員所測定之統計顯著性表現或活性降低。降低之ASS或ASL表現或活性可為與已知不具有癌症之適當對照樣品中之表現或活性相比,表現或活性降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或更多。在某些實施例中,ASS或ASL表現或活性與非癌症對照樣品中之表現或活性相比降低至少兩倍。
在某些實施例中,ASS或ASL之降低之表現或活性係因ASS或ASL促進劑之甲基化或ASS或ASL促進劑之抑制而產生。在一些實施例中,ASS或ASL之表現或活性降低係因DNA突變(例如一或多個點突變、小片段缺失、插入及其類似突變)或使得基因缺失之染色體异常而產生。在一些實施例中,癌症為ASS或ASL負性的,意謂未觀測到表現或活性。
ASS或ASL表現或活性降低可使用此項技術中已知之諸如但不限於以下之任何方法來量測:定量PCR、免疫組織化學、酶活性分析(例如用於量測瓜胺酸至精胺基丁二酸鹽之轉化或精胺基丁二酸鹽至精胺酸及反丁烯二酸酯之轉化的分析)及其類似方法。
因此,某些實施例包括用於治療患者之癌症、緩解其症狀或抑制其進展之方法,其包括向患者投與包含如本文所描述之ADIr(例如ADIr-PEG)之組合物,其中癌症展現ASS或ASL或兩者之降低之表現或活性,其中癌症包括但不限於肝細胞癌、白血病(例如急性髓樣白血病及復發急性髓樣白血病)、黑素瘤(包括轉移性黑素瘤)、肉瘤(包括但不限於轉移性肉瘤、子宮平滑肌肉瘤)、胰臟癌、前列腺癌(諸如但不限於激素難治性前列腺癌)、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌(包括但不限於胃腺癌瘤)、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌(包括但不限於腎細胞癌瘤)、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦部癌症、頭頸癌(包括但不限於鱗狀細胞頭頸癌;舌癌)、子宮頸癌、
睪丸癌、膽囊癌、膽管癌及胃癌。
文獻中之各種研究已表明以下腫瘤中缺乏ASS:急性髓性白血病(AML)、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、膠質母細胞瘤、HCC、淋巴瘤、黑素瘤、間皮瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、肉瘤及小細胞肺癌。因此,本文中具體地涵蓋此等ASS缺乏型癌症之治療,其使用單獨的或與其他治療組合(包括首先用ADI-PEG 20治療)之ADIr-PEG。
亦包括用於治療患者之癌症、緩解其症狀或抑制其進展之方法,其包括與自噬抑制劑組合向患者投與包含如本文所描述之ADIr(例如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)之組合物。一些實施例包括用於治療患者之癌症的方法,其包括與自噬抑制劑組合向患者投與治療有效量之包含如本文所描述之ADIr的組合物,其中癌症為胰臟癌或小細胞肺癌。
一些實施例包括如下治療方法,其中包含本文所描述之ADIr之組合物之投與耗盡血漿中之精胺酸持續至少一個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更久。某些實施例包括如下治療方法,其中在終止用ADI-PEG 20治療之後,在偵測到抗ADI-PEG 20抗體之後,包含本文所描述之ADIr之組合物之投與耗盡血漿中之精胺酸持續至少一個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或更久。
此實例描述與患者抗ADI-PEG 20抗體具有低交叉反應性之ADI酶之篩選及選擇。
自大量ADI酶中,表1列舉了關於相對於人黴漿菌ADI之序列一致性百分比所選擇之27種ADI酶。
來自多種有機體之許多ADI酶經表徵以確定哪些酶甚至在抗ADI-PEG 20抗體存在下亦預期將移除患者血液中之精胺酸並維持低濃度。如下文所詳述,此等研究表明來自基於序列一致性與人黴漿菌緊密相關之許多物種的ADI具有在各種溫度及pH值下所量測之足够良好之酶催化性質,且亦顯示與抗ADI-PEG 20抗體之降低之交叉反應性。
ADI製備. 重組ADI酶係根據如例如以下文獻中所描述之標準方案選殖、表現並純化以供測試:Gallego等人,PLOS One,7(10):e47886,2012;Monstadt及Holldorf,Biochem.J.273:739-745,1990;Joo Noh等人,
Molecules and Cells.13:137-143,2002;以及Sugimura等人,Infection and Immunity.58:2510-2515,1990。
人抗ADI-PEG20抗體純化. 抗ADI-PEG20抗體係自在臨床研究期間已接收ADI-PEG20之患者之血漿樣品純化。舉例而言,自如藉由ELISA分析所測定已針對ADI-PEG20達到高效價(效價>/=4)之8個不同患者彙集總共60ml血漿。使用兩步法純化,進行蛋白質「A」層析(GE Healthcare)繼之以ADI親和層析。獲得約20mg純化抗體並以等分試樣儲存於-80℃直至需要時為止。
ADI酶分析. 精胺酸脫亞胺酶(ADI)催化L-精胺酸轉化成L-瓜胺酸及氨水。L-瓜胺酸之量可藉由比色端點分析(參見例如Knipp及Vasak,Analytical Biochem.286:257-264,2000)偵測,且與已知量之L-瓜胺酸之標準曲線相比較,以計算以每毫克蛋白質之IU數表示之ADI比活性。1IU之酶活性定義為在正在測試中之pH值及溫度下每分鐘產生1μmol瓜胺酸之酶的量。標準分析條件係在37℃下在生理HEPES緩衝液(PHB)50mM HEPES、160mM NaCl pH 7.4(Lang及Zander,Clin Chem Lab Med.37:563-571,1999)加上0.1% BSA中進行。在條件允許之情况下,所有樣品及標準品均一式兩份或三份進行。
Km及Kcat值係藉由使用上文所描述之活性分析之變化形式來測定。如在活性分析情况下(或除非另外指出,否則),所有反應均在37℃下在PHB加上0.1% BSA中進行。酶濃度、反應時間及受質濃度範圍針對ADI或ADIr構築體各自進行調節以解釋其活性差异。一般而言,使用2nM酶、5分鐘反應時間及0-160μM精胺酸作為起動條件。當最佳化條件時,特別注意呈佔添加至反應中之總受質之百分比形式之所消耗受質之量。典型地,偵測下限為約1μM瓜胺酸,並且定量下限為約2μM。對每個板進行瓜胺酸標準曲線試驗,且用於定量由酶促反應產生之瓜胺酸。
亦進行活性分析以評估在抗ADI-PEG20存在下之酶活性(抗體中和型態)。如上文所描述且在640nM、320nM、160nM、80nM、40nM、20nM、10nM及0nM抗ADI-PEG20抗體存在下進行此等分析。
計算. 使用瓜胺酸標準曲線計算各反應中產生之瓜胺酸濃
度(μM)且取平均值。然後,按μM/min/50nM ADI計算各反應之速率。藉由將此值乘以「IU」因子(IU因子係由ADI之分子量及反應體積計算)來計算比活性(IU/mg或每毫克ADI每分鐘之產物微莫耳數)。
資料顯示於以下表2-7中。
此等資料尤其表明,與人黴漿菌ADI高度同源(約50%-100%一致性)之天然及聚乙二醇化ADI酶維持優良催化活性(表2-4),包括在各種pH值(表6)及溫度限定(表7)條件下。如藉由(增加之)酶活性在抗ADI-PEG 20抗體存在下(表4-5)所量測,例如相對於人黴漿菌,其亦顯示降低之對患者抗ADI-PEG 20抗體之親和力。因此,此等ADI酶在單獨或在ADI-PEG 20治療之後用於治療癌症之療法中時可具有治療功效,以延長及/或增加精胺酸耗盡療法之有效性。
上文所描述之各個實施例可組合以提供其他實施例。本說明書中所提及及/或應用資料表中所列之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、國外專利、國外專利申請案及非專利出版物以全文引用之方式併入本文中。必要時可修改實施例之態樣以使用各個專利、申
請案及出版物之概念來提供其他實施例。
可根據以上詳細描述對實施例作出此等及其他變化。一般而言,在以下申請專利範圍中,所用術語不應理解為將申請專利範圍限制於本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例,而應理解為包括所有可能的實施例以及此申請專利範圍所授予等效物之全部範疇。因此,申請專利範圍不受本發明限制。
<110> Polaris Group Showalter,Richard E. Almassy,Robert Thomson,James A. Sisson,Wes Shia,Wei-Jong Chen,Li-Chang Lee,Yang
<120> 用於治療癌症之與ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性的精胺酸脫亞胺酶
<130> POLA-005/01TW
<150> US 62,051,182
<151> 2014-09-16
<160> 28
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 409
<212> PRT
<213> 人黴漿菌
<400> 1
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> 唾液黴漿菌
<400> 2
<210> 3
<211> 411
<212> PRT
<213> 泡沫黴漿菌
<400> 3
<210> 4
<211> 410
<212> PRT
<213> 耳黴漿菌
<400> 4
<210> 5
<211> 410
<212> PRT
<213> 豬滑液黴漿菌
<400> 5
<210> 6
<211> 409
<212> PRT
<213> 泄殖腔黴漿菌
<400> 6
<210> 7
<211> 412
<212> PRT
<213> 產鹼黴漿菌
<400> 7
<210> 8
<211> 410
<212> PRT
<213> 口腔黴漿菌
<400> 8
<210> 9
<211> 401
<212> PRT
<213> 惰性黴漿菌
<400> 9
<210> 10
<211> 401
<212> PRT
<213> 雞黴漿菌
<400> 10
<210> 11
<211> 405
<212> PRT
<213> 梨黴漿菌
<400> 11
<210> 12
<211> 404
<212> PRT
<213> 靈長類黴漿菌
<400> 12
<210> 13
<211> 401
<212> PRT
<213> 產脂黴漿菌
<400> 13
<210> 14
<211> 405
<212> PRT
<213> 氣管黴漿菌
<400> 14
<210> 15
<211> 404
<212> PRT
<213> 模仿黴漿菌
<400> 15
<210> 16
<211> 401
<212> PRT
<213> 乳白色黴漿菌
<400> 16
<210> 17
<211> 431
<212> PRT
<213> 毛氏黴漿菌
<400> 17
<210> 18
<211> 399
<212> PRT
<213> 象黴漿菌
<400> 18
<210> 19
<211> 399
<212> PRT
<213> 龜黴漿菌
<400> 19
<210> 20
<211> 410
<212> PRT
<213> 加拿大黴漿菌
<400> 20
<210> 21
<211> 409
<212> PRT
<213> 鵝黴漿菌
<400> 21
<210> 22
<211> 401
<212> PRT
<213> 火雞黴漿菌
<400> 22
<210> 23
<211> 404
<212> PRT
<213> 蜂房黴漿菌
<400> 23
<210> 24
<211> 410
<212> PRT
<213> 滲透黴漿菌
<400> 24
<210> 25
<211> 404
<212> PRT
<213> 發酵黴漿菌
<400> 25
<210> 26
<211> 404
<212> PRT
<213> 肺炎黴漿菌
<400> 26
<210> 27
<211> 414
<212> PRT
<213> 黴漿菌屬某種
<400> 27
<210> 28
<211> 408
<212> PRT
<213> 黴漿菌屬某種
<400> 28
Claims (68)
- 一種治療性組合物,其包含分離之精胺酸脫亞胺酶或其具有ADI活性之片段以及醫藥學上可接受之載劑,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性。
- 如申請專利範圍第1項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶不來自人黴漿菌。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶來自列於表1中之有機體。
- 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶具有一或多種類似於或優於ADI-PEG 20之性質。
- 如申請專利範圍第4項之治療性組合物,其中該一或多種性質為Kcat、Km、最佳pH值、穩定性、活體內蛋白水解穩定性或不需要尚未存在於血液中之離子或輔因子或其任何組合。
- 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有至少20個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第6項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有20個至135個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第6項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有40個至100個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第6項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有30個至60個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第6項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有80個至100個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第6項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有100個至120個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶係來自唾液黴漿菌(Mycoplasma salivarium)、泡沫黴漿菌(Mycoplasma spumans)、加拿大黴漿菌(Mycoplasma canadense)、耳黴漿菌(Mycoplasma auris)、猪滑液黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae)、 泄殖腔黴漿菌(Mycoplasma cloacale)、鵝黴漿菌(Mycoplasma anseris)、產鹼黴漿菌(Mycoplasma alkalescens)、口腔黴漿菌(Mycoplasma orale)、惰性黴漿菌(Mycoplasma iners)、火鶏黴漿菌(Mycoplasma meleagridis)、蜂房黴漿菌(Mycoplasma alvi)、滲透黴漿菌(Mycoplasma penetrans)、鶏黴漿菌(Mycoplasma gallinarum)、梨黴漿菌(Mycoplasma pirum)、靈長類黴漿菌(Mycoplasma primatum)、發酵黴漿菌(Mycoplasma fermentans)、產脂黴漿菌(Mycoplasma lipofaciens)、氣管黴漿菌(Mycoplasma felifaucium)、模仿黴漿菌(Mycoplasma imitans)、乳白色黴漿菌(Mycoplasma opalescens)、毛氏黴漿菌(Mycoplasma moatsii)、象黴漿菌(Mycoplasma elephantis)、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)、龜黴漿菌(Mycoplasma testudinis)、黴漿菌屬某種(Mycoplasma sp.)CAG:877或黴漿菌屬某種CAG:472。
- 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶包含SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:28中任一者中所列之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之治療性組合物,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶已經修飾以移除至少一個聚乙二醇化位點。
- 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項之治療性組合物,其中至少一個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第15項之治療性組合物,其中至少5個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第15項之治療性組合物,其中至少10個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第15項之治療性組合物,其中至少15個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第15項之治療性組合物,其中至少20個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之治療性組合物,其中該精胺酸脫亞胺酶係經由連接子共價鍵結至PEG分子。
- 如申請專利範圍第20項之治療性組合物,其中該精胺酸脫亞胺酶係共 價鍵結至超過一個PEG分子。
- 如申請專利範圍第20項之治療性組合物,其中該精胺酸脫亞胺酶係共價鍵結至約1至約10個PEG分子。
- 如申請專利範圍第20項之治療性組合物,其中該精胺酸脫亞胺酶係共價鍵結至約2至約8個PEG分子。
- 如申請專利範圍第20項之治療性組合物,其中該等PEG分子為直鏈或分枝鏈PEG分子。
- 如申請專利範圍第20項之治療性組合物,其中該PEG之總重量平均分子量為約1,000至約40,000。
- 如申請專利範圍第20項之治療性組合物,其中該PEG之總重量平均分子量為約10,000至約30,000。
- 如申請專利範圍第20項至第26項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該連接子為丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基團、半胱胺酸基團、組胺酸基團、亞甲基或其任何組合。
- 如申請專利範圍第27項之治療性組合物,其中該丁二醯基之來源為丁二酸丁二醯亞胺酯。
- 一種分離之精胺酸脫亞胺酶或其具有ADI活性之片段,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與患者抗ADI-PEG 20抗體具有降低之交叉反應性。
- 如申請專利範圍第29項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶不來自人黴漿菌。
- 如申請專利範圍第29項或第30項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶來自列於表1中之有機體。
- 如申請專利範圍第29項至第31項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶具有一或多種類似於或優於ADI-PEG 20之性質。
- 如申請專利範圍第32項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該一或多種性質為Kcat、Km、最佳pH值、穩定性、活體內蛋白水解穩定性或不需要尚未存在於血液中之離子或輔因子或其任何組合。
- 如申請專利範圍第29項至第33項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶, 其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有至少20個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第34項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有20個至135個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第34項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有40個至100個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第34項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有30個至60個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第34項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有80個至100個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第34項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶與人黴漿菌精胺酸脫亞胺酶相比具有100個至120個表面殘基變化。
- 如申請專利範圍第29項至第39項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶係來自唾液黴漿菌、泡沫黴漿菌、加拿大黴漿菌、耳黴漿菌、猪滑液黴漿菌、泄殖腔黴漿菌、鵝黴漿菌、產鹼黴漿菌、口腔黴漿菌、惰性黴漿菌、火鶏黴漿菌、蜂房黴漿菌、滲透黴漿菌、鶏黴漿菌、梨黴漿菌、靈長類黴漿菌、發酵黴漿菌、產脂黴漿菌、氣管黴漿菌、模仿黴漿菌、乳白色黴漿菌、毛氏黴漿菌、象黴漿菌、肺炎黴漿菌、龜黴漿菌、黴漿菌屬某種CAG:877或黴漿菌屬某種CAG:472。
- 如申請專利範圍第29項至第40項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶包含SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:28中任一者中所列之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第29項至第41項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該分離之精胺酸脫亞胺酶已經修飾以移除至少一個聚乙二醇化位點。
- 如申請專利範圍第29項至第42項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中至少一個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第43項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中至少5個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第43項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中至少10個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第43項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中至少15個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第43項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中至少20個離胺酸殘基已藉由胺基酸取代進行修飾。
- 如申請專利範圍第29項至第47項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該精胺酸脫亞胺酶係經由連接子共價鍵結至PEG分子。
- 如申請專利範圍第48項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該精胺酸脫亞胺酶係共價鍵結至超過一個PEG分子。
- 如申請專利範圍第48項或第49項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該精胺酸脫亞胺酶係共價鍵結至約1至約10個PEG分子。
- 如申請專利範圍第50項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該精胺酸脫亞胺酶係共價鍵結至約2至約8個PEG分子。
- 如申請專利範圍第48項至第51項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該等PEG分子為直鏈或分枝鏈PEG分子。
- 如申請專利範圍第48項至第52項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該PEG之總重量平均分子量為約1,000至約40,000。
- 如申請專利範圍第53項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該PEG之總重量平均分子量為約10,000至約30,000。
- 如申請專利範圍第48項至第54項中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該連接子為丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基團、半胱胺酸基團、組胺酸基團、亞甲基或其任何組合。
- 如申請專利範圍第55項之分離之精胺酸脫亞胺酶,其中該丁二醯基之來源為丁二酸丁二醯亞胺酯。
- 一種聚核苷酸,其編碼如前述申請專利範圍中任一項之分離之精胺酸脫亞胺酶。
- 一種載體,其包含如申請專利範圍第57項之聚核苷酸。
- 一種分離之宿主細胞,其包含如申請專利範圍第58項之載體。
- 如前述申請專利範圍中任一項之治療性組合物,其進一步包含化學治療劑。
- 如申請專利範圍第60項之治療性組合物,其中該化學治療劑選自由以下組成之群:多西他賽(docetaxel)、卡鉑(carboplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)及依維莫司(everolimus)。
- 一種治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展之方法,該方法包括向有需要之患者投與治療有效量之如前述申請專利範圍中任一項之治療性組合物或分離之精胺酸脫亞胺酶,藉此治療該癌症、緩解其症狀或抑制其進展。
- 如申請專利範圍第62項之方法,其中該有需要之患者已確定具有抗ADI-PEG 20抗體。
- 如申請專利範圍第62項或第63項之方法,其中該癌症選自由以下組成之群:肝細胞癌、黑素瘤、轉移性黑素瘤、胰臟癌、前列腺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝細胞瘤、肉瘤、白血病、急性髓樣白血病、復發性急性髓樣白血病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦部癌症、頭頸癌、子宮頸癌、睪丸癌及胃癌。
- 一種治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展之方法,該方法包括向有需要之患者投與治療有效量之包含ADI-PEG 20之組合物,且在一段時間之後,向該患者投與如前述申請專利範圍中任一項之治療性組合物或精胺酸脫亞胺酶,藉此治療該癌症、緩解其症狀或抑制其進展。
- 如申請專利範圍第65項之方法,其中該時間段係藉由偵測該患者中之預定含量之抗ADI-PEG 20抗體來確定,其中該治療性組合物係在偵測到該預定含量之該等抗ADI-PEG 20抗體之後投與。
- 如申請專利範圍第65項之方法,其中該時間段係藉由偵測該患者中之ADI活性來確定,其中該治療性組合物係在偵測到預定或降低水準之ADI活性之後投與。
- 一種如前述申請專利範圍中任一項之治療性組合物或分離之精胺酸脫亞胺酶之用途,其用於製造用於治療癌症、緩解其症狀或抑制其進展之藥劑。
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