KR20190026813A - 시스틴의 인간-효소 매개된 고갈 - Google Patents

Abstract

L-시스틴(시스테인) 분해 효소 활성을 갖는 단백질의 조작과 관련된 방법 및 조성물이 기재되어 있다. 예를 들어, 특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고 L-시스틴(시스테인)을 분해할 수 있는 변형된 시스타티오닌-γ-분해효소가 개시될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 양태는 개시된 단백질 또는 핵산을 사용하여 L-시스틴(시스테인)을 갖는 암을 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

시스틴뇨증 환자를 치료하기 위한 시스틴의 인간-효소 매개된 고갈

본 출원은 2016년 7월 6일자로 제출된 미국 가출원 제62/359,018호의 우선권 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참고로 편입된다.

공동 연구 계약을 위한 당사자

본 명세서에 개시되고 청구된 발명은 Aeglea BioTherapeutics, Inc. 및 The University of Texas System 이사회 간의 공동 연구 계약의 범위 내에서 개발되었다.

본 발명은 일반적으로 의학 및 생물학 분야에 관한 것이다. 특히, 인간 요법에 적합한 높은 시스테인/시스틴 분해 활성 및 안정성을 갖는 영장류 효소의 조작방법에 관한 것이다. 더욱 더 상세하게는, 본 발명은 L-시스틴 및 L-시스테인 모두를 고갈시키는 효소로 시스틴뇨증을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

2. 관련 기술의 설명

시스틴뇨증은 신장 근위 세관의 시스틴 및 이염기성 아미노산 수송체를 코딩하는 SLC3A1 및 Slc7α9 유전자의 돌연변이에 의해 야기된 선천적 장애로, 시스틴(아미노산 시스테인의 디설파이드 형태)의 비정상적 배출 및 요로내 시스틴 결정/결석의 형성을 유발시킨다. 선천성 장애 시스틴뇨증을 앓고 있는 환자가 이용할 수 있는 치료제는 거의 없으며, 불량성 신장 수송체가 신장 여과 중에 시스틴을 재-흡수할 수 없다. 아미노산 L-시스테인의 디설파이드 형태인 시스틴은 고도로 불용성이고, 시스틴뇨증 환자는 요로에서 고농도로 도달하여 시스틴 결정 및 결석을 형성한다. 순환 시스틴 수준을 감소시키는 현존하는 요법은 요로 결석 형성을 부분적으로 방지하지만, 이의 용도를 제한하는 상당한 역효과를 갖는다.

발명의 요약

본 발명은 시스틴을 시스테인-퍼설파이드로 효율적으로 전환시키는 조작된 인간 시스타티오닌-감마-분해효소 효소를 이용하는 방법에 관한 것으로, 시스테인과 H₂S가 유리하여 신장 및 요로내에서 시스틴 축적 및 결석 형성을 방지하여, 시스틴뇨증 환자를 치료하기 위한 적합한 치료법이 된다. 시스틴은 일반적으로 대부분의 세포에서 생산되는 필수 아미노산이 아니기 때문에 동물 모델에서 장기간의 시스틴 고갈에 의해 유도되는 독성은 발견되지 않았다. 마찬가지로, 이 효소가 인간 서열로 구성되어 있기 때문에 부정적인 면역 반응을 유발하지는 않는다. 순환 시스틴의 총 수준을 무독성으로 제거하기 위한 시스틴 분해 치료제의 능력은 현존하는 치료적 레지멘보다 시스틴 결석 형성을 방지하는 우수한 구현예일 것이라는 것을 나타낸다.

본 발명은 L-시스틴 및 L-시스테인(본원에서 L-시스틴(시스테인)으로 지칭됨)이 혈청으로부터 효율적으로 분해될 수 있도록 하는 영장류 시스타티오닌-감마-분해효소(CGL) 효소의 조작에 관한 것이며, 및 인간 암 요법에 적합한 제형으로 변형된 CGL 효소를 제공하는 것에 관한 것이다. 낮은 K _M 및 높은 촉매적 활성, k _cat을 나타내는 효소를 개발하기 위해, 원상태 효소와 비교하여, 본 발명자들은 선택된 아미노산을 변형시킴으로써 원상태 효소를 조작하여 효소적 특성이 극적으로 향상된 효소를 생성시킨다. 이와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된 CGL 효소는 원상태 효소와 비교하여 L-시스틴(시스테인)-분해 촉매적 활성을 갖는 인간 또는 영장류 폴리펩타이드 서열을 포함하는 신규한 효소를 제공함으로써 당 기술분야의 주요 결핍을 극복한다. 따라서, 이들 변형된 효소는 암 요법에 적합할 수 있고 낮은 면역원성 및 향상된 혈청 안정성을 가질 수 있다.

따라서, 일 구현예에서, 변형된 폴리펩타이드, 특히 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL) 효소와 관련된 영장류 효소로부터 유래된 L-시스틴(시스테인) 분해 활성을 갖는 효소 변이체가 제공된다. 예를 들어, 효소 변이체는 SEQ ID NO: 2-6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 변이체는 인간 CGL과 같은 인간 효소로부터 유래될 수 있다. 특정 양태에서, L-시스틴(시스테인)을 분해할 수 있는 변형된 영장류 CGL을 포함하는 폴리펩타이드가 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 생리적 조건 하에서 L-시스틴(시스테인)을 분해할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 L-시스틴(시스테인)(k _cat/K _M)에 대해 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10⁴, 10⁵, 10⁶ s^-1M^-1 또는 본 명세서에서 유도가능한 임의의 범위의 촉매적 효율(k _cat/K _M)을 가질 수 있다.

비변형된 폴리펩타이드는 원상태 CGL, 특히 인간 동형체 또는 다른 영장류 동형체일 수 있다. 예를 들어, 원상태 인간 CGL은 SEQ ID NO: 1의 서열을 가질 수 있다. 다른 원상태 영장류 CGL의 비-제한적인 예로는 퐁고 아벨리이(Pongo abelii) CGL(Genbank ID: NP_001124635.1; SEQ ID NO: 7), 마카카 파스시컬라리스(Macaca fascicularis) CGL(Genbank ID: AAW71993.1; SEQ ID NO: 8), 팬 트로글로다이테스(Pan troglodytes) CGL(Genbank ID: XP_513486.2, SEQ ID NO: 9) 및 팬 패니스쿠스(Pan paniscus) CGL(Genbank ID: XP_003830652.1, SEQ ID NO: 10)이 포함된다. 예시적인 원상태 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 7-10 또는 이의 단편에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (또는 본 명세서에서 유도가능한 임의의 범위)의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 원상태 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 7-10의 서열의 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 405 잔기(또는 본 명세서에서 유도가능한 임의의 범위) 이하를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 원상태 CGL은 화학적 변형, 치환, 삽입, 결실 및/또는 절단과 같은 하나 이상의 다른 변형에 의해 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 원상태 CGL은 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 치환의 수는 1, 2, 3, 4 또는 그 이상일 수 있다. 추가의 구현예에서, 원상태 CGL은 기질 인식 부위 또는 기질 특이성에 영향을 줄 수 있는 임의의 위치에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 7-10의 아미노산 위치 59 및/또는 339에 상응하는 아미노산 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 이들 예에서, 각각의 서열의 제1 메티오닌은 아미노산 위치 1에 상응하고, 및 각각의 아미노산은 그로부터 순차적으로 넘버링된다.

특정 구현예에서, 아미노산 위치 59 및/또는 339에서의 치환은 트레오닌(T) 또는 발린(V)이다. 특정 구현예에서, 변형은 59T 및 339V로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환이다. 추가의 구현예에서, 치환은 59T 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 치환은 339V의 추가 치환을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 원상태 CGL은 인간 CGL일 수 있다. 특정 구현예에서, 치환은 인간 CGL의 E59T 및 E339V의 조합(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열, 이의 단편 또는 동족체를 갖는 변형된 폴리펩타이드)을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 변형된 폴리펩타이드는 퐁고 아벨리이 CGL-TV 돌연변이체(SEQ ID NO: 3), 마카카 파스시컬라리스 CGL-TV 돌연변이체(SEQ ID NO: 4), 팬 트로글로다이테스 CGL-TV 돌연변이체(SEQ ID NO: 5), 또는 팬 패니스쿠스 CGL-TV 돌연변이체(SEQ ID NO: 6)일 수 있다.

상기 논의된 바와 같은 변형된 폴리펩타이드는 비변형된 폴리펩타이드(예를 들어, 원상태 폴리펩타이드) 또는 본 명세서에 개시된 임의의 폴리펩타이드 서열과 비교하여 특정 백분율의 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 비변형된 폴리펩타이드는 원상태 영장류 CGL(즉, 인간, 퐁고 아벨리이, 마카카 파스시컬라리스, 팬 트로글로다이테스 또는 팬 패니스쿠스 CGL)의 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 405 잔기 이하(또는 본 명세서에서 유도가능한 임의의 범위)를 포함할 수 있다. 동일성 백분율은 변형된 폴리펩타이드의 비변형된 부분(아미노산 59 및/또는 339에서의 임의의 치환을 제외한 변형된 폴리펩타이드의 서열)과 상응하는 원상태 폴리펩타이드 사이의 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(또는 본 명세서에서 유도가능한 임의의 범위)일 수 있다. 상기 논의된 동일성의 백분율은 폴리펩타이드의 비변형된 영역과 비교하여 폴리펩타이드의 특정 변형된 영역과 관련될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 동일한 종 또는 교차 종으로부터의 비변형된 종의 CGL 또는 돌연변이체 CGL의 것에 대한, 변형된 또는 돌연변이체 기질 인식 부위의 아미노산 서열의 동일성에 기초하여 특성규명될 수 있는 CGL의 변형된 또는 돌연변이체 기질 인식 부위를 함유할 수 있다. 예를 들어, 비변형된 CGL과 적어도 90%의 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 변형된 또는 돌연변이체 인간 폴리펩타이드는 변형된 또는 돌연변이체 인간 폴리펩타이드의 아미노산 중 적어도 90%가 비변형된 폴리펩타이드의 아미노산과 동일하다는 것을 의미한다.

일부 양태에서, 본 발명은 또한 이종성 아미노산 서열에 연결된 변형된 CGL을 포함하는 폴리펩타이드를 고려한다. 예를 들어, 변형된 CGL은 융합 단백질로서 이종성 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 CGL은 IgG Fc, 알부민, 알부민 결합 펩타이드 또는 XTEN 폴리펩타이드와 같은 아미노산 서열에 연결되어 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다.

혈청 안정성을 증가시키기 위해, 변형된 CGL은 하나 이상의 폴리에테르 분자에 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리에테르는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는 라이신 또는 시스테인과 같은 특정 아미노산 잔기를 통해 PEG에 연결될 수 있다. 치료적 투여를 위해, 변형된 CGL을 포함하는 이러한 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용가능한 담체에 분산될 수 있다.

일부 양태에서, 그와 같은 변형된 CGL을 코딩하는 핵산이 고려된다. 일 양태에서, 핵산은 박테리아에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 특정 구현예에서, 박테리아는 E. 콜리이다. 다른 양태에서, 핵산은 진균류(예를 들어, 효모), 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 본 발명은 또한 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터와 같은 벡터를 고려한다. 특정 구현예에서, 변형된 CGL을 코딩하는 핵산은 이종성 프로모터를 비제한적으로 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 변형된 CGL은 벡터(예를 들어, 유전자 요법 벡터)에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 상기 바이러스는 재조합 DNA 기술에 의해 변형되어 표적 세포에서 변형된 CGL-코딩 핵산의 발현을 가능하게 할 수 있다. 이들 벡터는 비-바이러스성(예를 들어, 플라스미드) 또는 바이러스성(예를 들어, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 백시니아 바이러스) 기원의 벡터로부터 유래될 수 있다. 비-바이러스 벡터는 바람직하게는 세포막을 가로질러 DNA의 진입을 용이하게 하기 위해 제제와 복합체화된다. 이러한 비-바이러스 벡터 복합체의 예는 DNA 및 지질-기반 전달 시스템의 축합을 용이하게 하는 폴리양이온성 제형을 갖는 제제를 포함한다. 지질-기반 전달 시스템의 예는 핵산의 리포좀 기반 전달을 포함할 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 추가로 고려한다. 숙주세포는 박테리아(예를 들어, E. 콜리), 진균 세포(예를 들어, 효모), 곤충 세포 또는 포유동물 세포일 수 있다.

일부 구현예에서, 벡터는 변형된 CGL을 발현하기 위해 숙주세포 내로 도입된다. 단백질은 임의의 적합한 방식으로 발현될 수 있다. 일 구현예에서, 단백질은 숙주세포에서 발현되어 단백질이 글라이코실화된다. 또 다른 구현예에서, 단백질은 숙주세포에서 발현되어 단백질이 아글라이코실화된다.

일부 구현예에서, 폴리펩타이드 또는 핵산은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형 내에 있다. 폴리펩타이드는 원상태 영장류 CGL 폴리펩타이드 또는 변형된 CGL 폴리펩타이드일 수 있다. 핵산은 원상태 영장류 CGL 폴리펩타이드 또는 변형된 CGL 폴리펩타이드를 코딩할 수 있다.

일 구현예에서, 시스틴뇨증을 갖거나 발병할 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 이 방법은 원상태 영장류 CGL 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1 및 7-10 참조)에 대해 적어도 2종의 치환을 갖는, 단리된, 변형된 영장류 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL) 효소를 포함하는 치료적 유효량의 제형을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 적어도 2종의 치환은 단리된, 변형된 영장류 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL) 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 또는 원상태 영장류 CGL 서열의 위치 59에서의 트레오닌 및 위치 339에서의 발린을 포함한다. 일부 양태에서, 효소는 XTEN 펩타이드, IgG Fc, 알부민 또는 알부민 결합 펩타이드와 같은 이종성 펩타이드 절편을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 효소는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 커플링된다. 일부 양태에서, 효소는 하나 이상의 라이신 또는 시스틴 잔기를 통해 PEG에 커플링된다.

대상체는 마우스와 같은 임의의 동물일 수 있다. 예를 들어, 상기 대상체는 포유동물, 특히 영장류, 및 더 상세하게는 인간 환자일 수 있다. 특정 양태에서, 상기 대상체 또는 환자는 메티오닌-제한된 식이 또는 정상 식이로 유지될 수 있다.

일부 양태에서, 상기 대상체는 시스틴뇨증에 대해 이전에 치료되었고, 시스틴뇨증의 재발을 방지하기 위해 효소가 투여된다. 일부 양태에서, 본 방법은 대상체에게 적어도 두번째 시스틴뇨증 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 두번째 시스틴뇨증 요법은 외과적 요법 또는 충격파 요법이다.

본 발명의 특정 양태는 또한 원상태 영장류 CGL 펩타이드, 유전자 요법 벡터에서 원상태 영장류 CGL 펩타이드를 코딩하는 핵산, 변형된 CGL 펩타이드, 유전자 요법 벡터에서 변형된 CGL을 코딩하는 핵산, 또는 암을 갖는 대상체 또는 종양세포를 치료하는 본 발명의 제형, 및 특히 방법을 고려한다. 상기 대상체는 마우스와 같은 임의의 동물일 수 있다. 예를 들어, 상기 대상체는 포유동물, 특히 영장류, 보다 상세하게는 인간 환자일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 암 환자를 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 대상체 또는 환자는 L-시스틴(시스테인)-제한 식이요법 또는 정상 식이요법으로 유지될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 암은 L-시스틴(시스테인) 고갈에 민감한 임의의 암이다. 일 구현예에서, 본 발명은 이러한 폴리펩타이드를 포함하는 제형을 투여하는 단계를 포함하는 종양 세포 또는 암 환자의 치료 방법을 고려한다. 일부 구현예에서, 투여는 암세포의 적어도 일부분이 사멸되도록 하는 조건 하에서 발생한다. 또 다른 구현예에서, 제형은 생리적 조건에서 L-시스틴(시스테인) 분해 활성을 갖는 이와 같은 변형된 CGL을 포함하고, 부착된 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 상기 논의된 CGL 변이체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 제형이다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 부형제는 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져있다. 상기 CGL 변이체는 모두 인간 요법에 유용하다고 고려될 수 있다.

추가의 구현예에서, L-시스틴(시스테인)을 분해활성을 갖는 비-박테리아(포유류, 예를 들어, 영장류 또는 마우스) 변형된 CGL 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 제형을 투여하는 단계를 포함하는 종양 세포의 치료 방법이 또한 제공될 수 있다.

종양 세포는 L-시스틴(시스테인)에 대한 영양 배지에 의존하기 때문에, 투여 또는 치료는 세포에 대한 영양 공급원을 지향할 수 있으며, 및 반드시 세포 자체의 영양 공급원을 지향하는 것은 아니다. 따라서, 생체내 용도에서, 종양 세포를 치료하는 것은 종양 세포의 모집단에 대한 영양배지를 조작된(즉, 변형된) CGL과 접촉시키는 것을 포함한다. 이 구현예에서, 배지는 L-시스틴(시스테인) 고갈이 요구되는 혈액, 림프액, 척수액 및 그와 유사한 체액일 수 있다.

본 발명의 특정 양태에 따르면, 변형된 CGL을 함유하는 이러한 제형은 정맥내로, 진피내로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 활막내로, 기관내로, 비강내로, 초자체내로, 질내로, 직장내로, 종양내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 안구내로, 경구로, 국소적으로, 흡입에 의해, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 국소화된 관류로, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물내 (예를 들어, 리포좀), 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 다른 방법 또는 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다.

추가의 구현예에서, 상기 방법은 또한 상기 대상체에게 적어도 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2 항암 요법은 외과적 요법, 화학 요법, 방사선 요법, 한랭 요법, 호르몬 요법, 면역 요법 또는 사이토카인 요법일 수 있다.

일 구현예에서, 변형된 CGL 또는 변형된 CGL을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 대상체의 종양 치료에 사용하기 위해 제공된다. 또 다른 구현예에서, 종양 치료를 위한 약제의 제조에서 변형된 CGL 또는 변형된 CGL을 코딩하는 핵산의 용도가 제공된다. 상기 변형된 CGL은 구현예의 임의의 변형된 CGL일 수 있다.

본 발명의 방법 및/또는 조성물의 맥락에서 논의된 구현예는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관한 구현예는 본 발명의 다른 방법 및 조성물에도 적용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련된 "인코딩하다" 또는 "인코딩"이라는 용어는 본 발명을 숙련가가 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해 사용되며; 그러나, 이들 용어들은 각각 "포함하다" 또는 "포함하는"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 명시된 성분의 관점에서 "본질적으로 없다"는 것은 명시된 성분 중 어느 것도 의도적으로 조성물로 제형화되지 않았고 및/또는 단지 오염물질로서 또는 미량으로 존재한다는 것을 의미하는 것으로 사용된다 . 따라서, 의도하지 않은 조성물 오염으로 인한 명시된 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 가장 바람직한 것은 명시된 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 하나 또는 그 이상의 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 청구범위에서, 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, "한" 또는 "하나의"라는 단어는 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.

청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은 대안이 단지 대안을 명확하게 지칭하지 않는 한, 또는 대안이 상호배타적인 경우를 제외하고는, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되지만, 본 개시내용은 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "또 다른"은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

본원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 디바이스에 대한 오차의 고유한 변화를 포함하는 값을 지칭하기 위해 사용되며, 상기 방법은 연구 대상체들 사이에 존재하는 변동 또는 값을 측정하기 위해 사용된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 상세한 설명 및 특정 예가 단지 설명의 방식으로 제공되며, 본 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변화 및 변경이 본 발명의 사상 및 범위내에서 본 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 분명할 것임을 이해해야 한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 양태를 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1. 투약 계획 과정에 따라 현장 수집 소변에서 시스틴 결정 수 분석.
도 2. 현장 수집 소변 사전- 및 사후-투여에서 시스틴 결정의 수 분석.
도 3. 투약 계획 과정에 따른 뇨 중 시스테인/크레아티닌 수준의 분석.

시스테인은 황전환 경로를 통해 필수 아미노산 L-메티오닌으로부터 유래된 호모시스테인으로부터 합성될 수 있으므로 비-필수 아미노산으로 간주되며, 효소 시스타티오닌-β-합성효소(CBS) 및 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL)를 포함한다. 따라서, 시스테인의 고갈은 온전한 황전환 경로를 갖는 정상 조직에 상대적으로 무독성이 될 것으로 예상된다.

시스틴뇨증은 신장 근위 세관의 시스틴 및 이염기성 아미노산 수송체를 코딩하는 SLC3A1 및 Slc7α9 유전자의 돌연변이에 의해 유발된 선천성 장애로서, 시스틴(아미노산 시스테인의 디설파이드 형태)의 비정상적인 배출 및 요로내 시스틴 결정/결석의 형성을 초래한다. Slc7α9 녹아웃 마우스, Slc3a1 녹아웃 마우스, D140G Slc3a1 돌연변이체 마우스 및 E383K Slc3a1 돌연변이체 마우스를 포함하는, 시스틴뇨증의 여러 마우스 모델이 사용가능하다(Feliubadalo 등, 2003; Ercolani 등, 2010; Peters 등, 2003; Livrozet 등, 2014, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함됨). 129S2/SvPasCrl로부터의 Slc3a1 게놈 DNA의 서열 분석은 129S2/SvPasCrl 마우스에서 엑손 7에서 동종접합성 돌연변이를 나타내었다. 점 A1232G 돌연변이는 고도로 보존된 서열에서의 미스센스 돌연변이(c.1232G> A)이다. 그 결과, 위치 383의 글루타민은 라이신으로 치환될 것이다(p. E383K). 이 치환은 rBAT의 세포외 부분에 나타나며, 129S2/SvPasCrl 마우스에서 rBAT 발현의 감소와 시스틴뇨증을 일으킨다(Livrozet 등, 2014). 위치 383의 글루타민은 다양한 종들 사이에서 고도로 보존되어있다.

시스틴뇨증을 가진 환자는 삶의 질이 낮고, 시스틴 결석이 위험이 평생동안 있으며, 신장 기능이 손상되고 종종 반복적 수술개입을 필요로 한다. 시스틴뇨증에 대한 기존 치료법은 없으며, 시스틴 용해도를 높이고 비뇨기 시스틴 농도를 낮추는 치료법이 지향된다. 과다이뇨(Hyperdiuresis)는 일반적인 치료이지만, > 4 리터의 물과 소변 용적> 3 리터의 매일 소비가 필요하여, 달성 및 유지하기 어렵다. 작은 티올 분자와 같은 다른 약물 치료는 시스틴과 반응함으로써 기능하여, 시스틴보다 더 가용성이지만 예컨대 백혈구감소증, 발진, 열병, 단백뇨 및 콩팥 증후군과 같은 심각한 독성을 가지며 이들의 용도를 제한하는 혼합된 디설파이드를 형성한다.

본 발명은 시스틴뇨증과 같은 질병을 치료하기 위해 L-시스틴(시스테인)을 분해하는 조작된, 치료적 효소를 사용하는 방법을 제공한다. 이 방법은 시스틴뇨증 환자에서 신장 및 비뇨기 시스틴 결석 형성의 발병률을 줄이기 위해 임상적으로 나타난 순환에서 시스틴을 제거한다. 본 명세서에 기재된 방법은 현재의 시스틴뇨증 약물과 관련된 부작용없이 검출 수준 이하로 순환 시스틴을 줄일 수 있다.

I. 정의

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어들 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭하며, 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 비-원상태 방식으로 작동가능하게 연결된 단백질 또는 단백질 단편을 함유하는 키메라성 단백질을 지칭한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "반감기"(1/2 수명)는 시험관내 또는 생체내에서, 예를 들어 포유동물에 주사 후, 절반으로 떨어지는 폴리펩타이드의 농도에 요구되는 시간을 지칭한다.

용어들 "작동가능한 조합에서", "작동가능한 순서로" 및 "작동가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분이 그의 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계에 있는 연결, 예를 들어, 핵산 분자가 주어진 유전자의 전사 및/또는 목적하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 방식의 핵산 서열의 연결, 또는 융합 단백질이 생산되도록 하는 방식의 아미노산 서열의 연결을 지칭한다.

용어 "링커"는 2개의 상이한 분자를 작동가능하게 연결시키는 분자 브릿지로서 작용하는 화합물 또는 모이어티를 지칭하도록 의미하는데, 여기서 링커의 한 부분은 제1 분자에 작동가능하게 연결되고, 링커의 다른 부분은 제2 분자에 작동가능하게 연결된다.

용어 "페길화된"은 고도의 생체적합성 및 변형의 용이성이 주어지면, 약물 담체로서 널리 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 콘쥬게이션을 지칭한다. PEG는 화학적 방법을 통해 PEG 사슬 말단의 하이드록시기를 통해 활성제에 커플링(예를 들어, 공유 결합)될 수 있지만; 그러나, PEG 자체는 분자 당 최대 2개의 활성제로 제한된다. 다른 접근법에서 PEG와 아미노산의 공중합체는 PEG의 생체적합성을 유지할 수 있는 신규한 생체적합물질로서 연구되었지만 분자 당 수많은 부착점의 이점이 추가되어(따라서 약물 부하가 더 큼), 다양한 용도에 맞게 합성으로 설계될 수 있다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드 또는 그의 전구체의 생산에 필요한 제어 및 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리펩타이드는 전장 코딩 서열에 의해, 또는 원하는 효소적 활성이 유지되도록 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 코딩될 수 있다.

용어 "원상태"는 자연 발생 공급원으로부터 단리될 때 유전자, 유전자 생성물의 전형적인 형태, 또는 그 유전자 또는 유전자 생성물의 특징을 지칭한다. 원상태 형태는 천연 모집단에서 가장 빈번하게 관측되는 것으로서 임의로 정상 또는 야생형으로 지정된다. 대조적으로, 용어 "변형된", "변이체" 또는 "돌연변이체"는 원상태 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때 순차적 및 기능적 성질(즉, 변형된 특징)에서 변형을 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 지칭한다.

용어 "벡터"는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포 내로 도입하기 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 지칭하는데 사용된다. 핵산 서열은 "외인성(exogenous)"일 수 있는데, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 외래적이거나, 서열이 세포내 서열과 상동하지만, 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주세포 핵산 내의 위치에 있음을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 표준 재조합 기술(예를 들어, Maniatis 등, 1988 및 Ausubel 등, 1994, 둘다 참조로서 본 명세서에 통합됨)을 통해 벡터를 작제할 수 있을 것이다.

용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 유형의 유전적 작제물을 지칭한다. 일부 경우에, RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 다른 사례에서, 이들 서열은 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 특정 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 제공하고 하기에 기재되는 핵산 서열을 함유할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 치료적 효과를 달성하는 방법에 사용되는 치료 조성물(예컨대, 치료적 폴리뉴클레오타이드 및/또는 치료적 폴리펩타이드)의 양을 지칭한다. 본원 전체에 걸쳐 사용된 용어 "치료적 이점" 또는 "치료적으로 효과적인"이라는 용어는 이 병태의 의료적 치료와 관련하여 상기 대상체의 웰빙을 촉진하거나 향상시키는 임의의 것을 지칭한다. 여기에는 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도 감소를 비제한적으로 포함한다. 예를 들어, 시스틴뇨증의 치료는 시스틴 결석의 크기 감소, 시스틴 결석의 제거, 또는 시스틴 결석의 형성 방지와 관련될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "K _M"은 효소에 대한 미하엘리스-멘텐 상수를 지칭하고, 주어진 효소가 효소 촉매 반응에서 그의 최대 속도의 1/2을 산출하는 특정 기질의 농도로서 정의된다. 본 명세서에 사용된 용어 "k _cat"은 각 효소 부위가 단위 시간당 생성물로 전환되고, 상기 효소가 최대 효율로 작용하는 기질 분자의 턴오버 수 또는 수를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "k _cat/K _M"은 효소가 기질을 생성물로 얼마나 효율적으로 전환시키는지를 측정하는 특이성 상수이다.

용어 "시스타티오닌-γ-분해효소"(CGL 또는 시스타티오나제)는 시스타티오닌의 시스테인으로의 가수분해를 촉매하는 임의의 효소를 지칭한다. 예를 들어, 그것은 시스타티오닌-γ-분해효소의 영장류 형태, 특히 시스타티오닌-γ-분해효소의 인간 형태를 포함한다.

"치료" 및 "치료하는"은 질환 또는 건강-관련 상태의 치료적 이점을 얻는 목적으로 대상체에게 치료제를 투여 또는 적용하거나 대상체에 대한 절차 또는 양식을 수행하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 치료는 약제학적 유효량의 시스티네아제(시스테이네아제)의 투여를 포함할 수 있다.

"대상체" 및 "환자"는 인간 또는 비-인간, 예컨대 영장류, 포유동물 및 척추동물을 지칭한다. 특정 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다.

II. 시스타티오닌-γ-분해효소

분해효소는 종종 신규한 이중 결합 또는 신규한 고리 구조를 형성하는 다양한 화학 결합의 절단을 촉매하는 효소이다. 예를 들어, 하기 반응을 촉매접촉하는 효소는 분해효소이다: ATP → cAMP + PP_i. 분해효소는 한 방향의 반응을 위해 하나의 기질만 필요로 하지만, 반대 반응을 위해 두 기질을 필요로 한다는 점에서 다른 효소와 다르다.

수많은 피리옥살-5'-포스페이트(PLP)-의존적 효소는 시스테인, 호모시스테인 및 메티오닌의 대사에 관여하며, 이들 효소는 Cys/Met 대사 PLP-의존적 효소로 지정된 진화론적 관련된 계열을 형성한다. 이들 효소는 약 400개의 아미노산의 단백질이고, PLP 기는 폴리펩타이드의 중심 위치에 위치한 라이신 잔기에 부착되어있다. 이 계열의 구성원은 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL), 시스타티오닌-γ-합성효소(CGS), 시스타티오닌-β-분해효소(CBL), 메티오닌-γ-분해효소(MGL), O-아세틸호모세린(OAH)/O-아세틸-세린(OAS) 설프하이드릴라제(OSHS)를 포함한다. 이들 모두에게 공통적인 것은 외부 기질 알디 민으로 이끄는 미하엘리스 복합체의 형성이다. 반응의 추가 과정은 특정 효소의 기질 특이성에 의해 결정된다.

예를 들어, 본 발명자들은 효소의 기질 특이성을 변화시키기 위해 특정 돌연변이를 PLP-의존성 분해효소 패밀리 구성원인 시스타티오닌-γ-분해효소에 도입시켰다. 이러한 방식으로, 변이체는 L-시스틴 및 L-시스테인 모두를 분해하는 새로운 능력으로 생산되었다. 다른 구현예에서, 신규한 L-시스틴(시스테인) 분해 활성을 생산하기 위한 다른 PLP-의존성 효소의 변형이 또한 고려될 수 있다.

시스타티오닌-γ-분해효소(CGL 또는 시스타티오나제)는 시스타티오닌을 시스테인 및 α-케토부티레이트로 분해하는 효소이다. 피리독살 포스페이트는 이 효소의 보철 그룹이다. 단백질 공학은 L-시스테인 및 L-시스틴의 분해에 대한 약한 활성을 단독으로 갖는 시스타티오나제를 고속으로 이들 아미노산을 분해할 수 있는 효소로 전환시키는데 사용되었다(미국 특허 출원 제14/472,779호, 이는 본 명세서에서 그 전체가 참고로 포함됨).

III. 시스티네아제(시스테이네아제) 조작

비-인간 단백질 치료제의 사용으로 임상적으로 관찰된 면역원성의 바람직하지 않은 효과로 인해, 발명자들은 (즉, 시스틴/시스테인의 높은 k _cat 및 낮은 K _M 값을 갖는 효소를 조작하고, 및 양호한 특이성을 나타내는) 인간 효소 내로 치료적으로 관련된 시스틴/시스테인 분해 활성을 조작하려고 하였다. 인간은 시스타티오닌-γ-분해효소(hCGL)라고 불리는 효소를 가지고 있으며, 그의 기능은 포유동물 황전환 경로의 마지막 단계, 즉 L-시스타티오닌을 L-시스테인, α-케토부티레이트, 및 암모니아로 전환하는 것을 촉매하는 것이다(Rao 등, 1990). 인간 CGL은 또한 L-시스테인 및 그의 디설파이드 형태인 L-시스틴을 약하게 분해할 수 있어, 조작을 위한 이상적인 후보 물질이 된다. 구조적으로- 및 계통발생적으로-유도된 돌연변이 유발을 이용하여, hCGL 변이체는 L-시스테인 및 L-시스틴 모두를 효율적으로 가수분해하도록 조작되었다.

일부 구현예는 변형된 단백질 및 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특정 구현예는 비변형된 버전, 바람직하게는 L-시스틴(시스테인) 분해 활성에 필적하는 적어도 하나의 기능적 활성을 나타내는 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 단백질 또는 폴리펩타이드는 혈청 안정성을 증가시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩타이드"의 기능 또는 활성을 언급할 때, 당해 분야의 숙련가는 예를 들어, 상기 기술이 비변형된 단백질 또는 폴리펩타이드보다 추가의 이점, 예컨대 L-시스틴(시스테인) 분해 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해된다. 특정 구현예에서, 비변형된 단백질 또는 폴리펩타이드는 원상태 CGL, 바람직하게는 인간 CGL이다. "변형된 단백질"에 관한 구현예는 "변형된 폴리펩타이드"에 대해 구현될 수 있으며, 그 반대의 경우도 구현될 수 있다고 구체적으로 고려된다.

활성의 측정은 당해 분야의 숙련가에게 익숙한 분석을 사용하여, 특히 단백질의 활성과 관련하여 달성될 수 있으며, 비교 목적을 위해, 예를 들어, 변형 또는 비변형된 단백질 또는 폴리펩타이드의 원상태 및/또는 재조합 버전을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 CGL은 L-시스테인을 피루베이트, 암모니아 및 H₂S로 서서히 분해하고, L-시스틴을 피루베이트, 암모니아 및 티오시스테인으로 전환시킨다(각각 k _cat/K _M 약 0.2 s^-1mM^-1 및 0.5 s^-1mM^-1). 티오시스테인은 L-시스테인 및 H₂S로 비효소적으로 추가로 분해된다. 따라서, L-시스틴(시스테인) 분해 활성은 L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 분해로 인한 임의의 기질의 생성을 검출하기 위한 임의의 검정, 예컨대 3-메틸-2-벤조티아졸리논 하이드라존(MBTH)을 사용하는 피루베이트의 검출에 의해 측정될 수 있다(Takakura 등, 2004).

특정 구현예에서, 변형된 CGL과 같은 변형된 폴리펩타이드는 L-시스틴(시스테인)의 분해 활성의 증가에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 비변형된 폴리펩타이드의 기질 인식 부위가 확인될 수 있다. 이 확인은 구조적 분석 또는 상동성 분석을 기반으로 할 수 있다. 상기 기질 인식 부위의 변경을 수반하는 돌연변이체의 모집단이 생성될 수 있다. 추가의 구현예에서, 증가된 L-시스틴(시스테인) 분해 활성을 갖는 돌연변이는 돌연변이체 모집단으로부터 선택될 수 있다. 원하는 돌연변이체의 선택은 L-시스틴(시스테인) 분해로부터 부산물 또는 생성물을 검출하는 방법을 포함할 수 있다.

변형된 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 가질 수 있으며; 따라서, 결실을 갖는 단백질, 치환을 갖는 단백질 및 결실 및 치환을 갖는 단백질은 변형된 단백질이다. 일부 구현예에서, 이들 변형된 단백질은 삽입 또는 첨가된 아미노산, 예컨대 융합 단백질, 또는 예를 들어 링커를 갖는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. "변형된 결실된 단백질"은 천연 단백질의 하나 이상의 잔기가 없지만, 천연 단백질의 특이성 및/또는 활성을 보유할 수 있다. "변형된 결실된 단백질"은 또한 면역원성 또는 항원성을 감소시킬 수 있다. 변형된 결실된 단백질의 예는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 특정 유기체에서 항원성인 것으로 결정된 단백질의 영역, 예컨대, 변형된 단백질이 투여될 수 있는 유기체의 유형으로부터 결실된 아미노산 잔기를 갖는 단백질이다.

치환 또는 대체 변이체는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 또 다른 하나의 아미노산의 교환을 포함하고, 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성, 특히 그의 효과기 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존 적이거나 아닐 수도 있으며, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 형상 및 전하 중 하나로 대체된다. 보존적 치환은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 알라닌에서 세린으로의 변화; 아르기닌에서 라이신으로의 변화; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로의 변화; 아스파르테이트에서 글루타메이트로의 변화; 시스테인에서 세린으로의 변화; 글루타민에서 아스파라긴으로의 변화; 글루타메이트에서 아스파르테이트로의 변화; 글리신에서 프롤린으로의 변화; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로의 변화; 이소류신에서 류신 또는 발린으로의 변화; 류신에서 발린 또는 이소류신으로의 변화; 라이신에서 아르기닌으로의 변화; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로의 변화; 페닐알라닌에서 티로신, 류신, 또는 메티오닌으로의 변화; 세린에서 트레오닌으로의 변화; 트레오닌에서 세린으로의 변화; 트립토판에서 티로신으로의 변화; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로의 변화; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다.

결실 또는 치환에 추가하여, 변형된 단백질은 잔기의 삽입을 보유할 수 있으며, 이는 전형적으로 폴리펩타이드내 적어도 하나의 잔기의 첨가를 포함한다. 이것은 표적 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질이라고 하는 말단 첨가는 아래에서 논의된다.

용어 "생물학적으로 기능적인 등가물"은 당해 기술 분야에서 잘 이해되며, 본 명세서에서 상세히 정의된다. 따라서, 단백질의 생물학적 활성이 유지된다면, 대조군 폴리펩타이드의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산의 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%를 갖는 서열이 포함된다. 변형된 단백질은 특정 양태에서 그것의 원상태 대응물과 생물학적으로 기능적으로 동등할 수 있다.

아미노산 및 핵산 서열은 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3'서열과 같은 추가의 잔기를 포함할 수 있지만, 여전히 본질적으로 단백질 발현이 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하여, 서열이 상기 제시된 기준을 충족시키는 한, 본 명세서에 개시된 서열 중 하나로 개시되는 것으로 이해될 것이다. 말단 서열의 첨가는 특히, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중 어느 한쪽에 측접한 다양한 비-코딩 서열을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용되거나, 다양한 내부 서열, 즉 유전자 내에서 발생하는 것으로 알려져있는 인트론을 포함할 수 있다.

L-시스틴 및 L-시스테인 모두를 분해하기 위해 가장 높은 촉매적 활성을 갖는 것으로 확인된 한 특정 변이체는 E59T, R119R의 동의어 코돈 변화 및 E339V와 같은 돌연변이를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 변이체는 hCGL-TV라고 불렸고, 위에서 기재된 것과 유사한 1 mL 척도 MBTH 검정을 사용하여 pH 7.3 및 37 ℃에서 100 mM PBS 완충액에서 L-시스틴(시스테인)을 분해하는 능력을 특징으로 한다. 이러한 조건 하에서, hCGL-TV 변이체는 1.0 ± 0.05 s^-1의 k _cat, 0.16 ± 0.02 mM의 K _M 및 6.3 ± 1.0 s^-1mM^-1의 k _cat/K _M으로 L-시스틴을 분해시키는 것으로 밝혀졌다. hCGL-TV 변이체는 L-시스테인의 분해를 위해 0.8 ± 0.03 s^-1의 k _cat, 0.25 ± 0.04 mM의 K _M 및 3.2 ± 0.6 s^-1mM^-1의 k _cat/K _M을 갖는 것으로 추가로 밝혀졌다. hCGL-TV 변이체는 228 ± 6 h의 분명한 T_0.5를 가진 인간 혈청에서 매우 높은 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, hCGL-TV는 DU145 및 PC3 전립선 종양 세포주 모두에서 약 60nM의 분명한 IC₅₀ 값을 갖는 것으로 밝혀졌다.

IV. 요법을 위한 효소적 L-시스틴(시스테인) 분해

특정 양태에서, 폴리펩타이드는 L-시스틴 및/또는 L-시스테인을 고갈시키는 신규한 효소에 의해 시스틴뇨증과 같은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 L-시스틴(시스테인) 분해 활성을 갖는 변형된 CGL을 사용하는 치료 방법을 구체적으로 개시한다. 본 발명의 특정 양태는 증가된 치료적 효능을 위한 L-시스틴(시스테인) 분해 활성을 갖는 신규한 효소를 제공한다.

본 발명의 특정 양태는 질환을 치료하기 위한 L-시스틴(시스테인) 분해 활성을 갖는 변형된 CGL을 제공한다. 일 예에서, 변형된 폴리펩타이드는 인간 폴리펩타이드 서열을 가질 수 있으며, 따라서 인간 환자에서 알레르기 반응을 방지하고, 반복 투여를 허용하고, 치료적 효능을 증가시킬 수 있다.

예로서, PEG-hCGL-TV는 96시간에 걸쳐 혈청 시스틴 수준(> 95%)을, 및 48시간에 걸쳐 시스테인 수준(80%)을 급격하게 감소시킬 수 있다. 이것을 측정하기 위해, 수컷 FVB 마우스에 50 mg/kg의 PEG-hCGL-TV를 i.p. 주사하고, 혈액 및 혈청 수집을 위해 0일, 1일, 2일, 4일 및 6일(그룹당 n = 5)에 희생시켰다. 혈청 샘플을 10 피코몰 중수소화된 시스틴 및 시스테인의 내부 표준 혼합물과 혼합하고, NANOSEP® OMEGA™ 원심분리 디바이스, 3 kDa 컷오프(Pall Life Biosciences)를 사용하여 한외여과시켰다(Tiziani 등, 2008; Tiziani 등, 2013). 여과된 극성 분획을 역상 BEH C18, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm 칼럼(THERMO SCIENTIFIC™ ACCELA® 1250 UPLC, Waters Corporation, USA)을 사용하여 크로마토그래프를 수행하고, 전기분무 이온화에 의해 커플링된 EXACTIVE™ Plus ORBITRAP™ 질량 분광분석기에 도입하였다(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). 데이터는 기기에 제공된 XCALIBUR™ 소프트웨어를 사용하여 50 내지 700 m/z 질량 범위에서 중심(centroid) MS 방식으로 획득했다. 시스틴과 시스테인의 상대 농도는 평균 값 ± SEM으로 보고된다.

또한, PEG-hCGL-TV는 약 23시간의 흡수 T_1/2 및 40 ± 7시간의 제거 T_1/2을 나타내었다. 이것을 측정하기 위해, 샘플을 항-hCGL 항체(토끼 항-CTH Sigma # C8248)로 탐색한 후, TYPHOON™ 스캐너(GE Healthcare)로 488 nm에서 여기하여 가시화하기 위해 항-토끼 IgG-FITC(Santa Cruz Biotechnology # sc-2012)를 첨가하여 닷 블랏 밀도측정 기술을 사용하였다. ImageJ 소프트웨어(Schneider 등, 2012)를 사용하여 샘플의 밀도측정 밴드를 동일한 블랏 내 PEG-hCGL-TV의 공지된 양의 적정량과 비교하여 표준 곡선을 구성하고, 상대적 혈청 PEG-hCGL-TV 수준을 계산하였다. 이 데이터는 혈관외 모델의 투여에 적합했다(Foye 등, 2007; Stone 등, 2012).

고갈은 포유동물의 순환에서 생체내에서, 조직 배양물 또는 다른 생물학적 배지에서 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 고갈이 요구되는 경우에 시험관내에서, 및 생체액, 세포 또는 조직이 체외에서 조작된 후 환자 포유동물의 몸으로 되돌아 가는 경우 생체외 절차에서 수행될 수 있다. 순환, 배양 배지, 생체액 또는 세포로부터의 L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 고갈은 처리되는 물질에 접근가능한 L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 양을 감소시키기 위해 수행되며, 따라서 접촉된 물질내 주위 L-시스틴 및/또는 L-시스테인을 분해하는 것에 관한 L-시스틴- 및/또는 L-시스테인-분해 조건하에, 조작된 영장류 시스티네아제(시스테이네아제)의 L-시스틴- 및/또는 L-시스테인-분해 양이 감소된 물질과 접촉하는 단계를 포함한다.

L-시스틴- 및/또는 L-시스테인-분해 효율은 용도에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 전형적으로 물질에 존재하는 L-시스틴 및/또는 L-시스테인의 양, 원하는 고갈 속도, 시스틴(테인) 노출에 대한 물질의 내성에 좌우된다. 물질 내의 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 수준, 및 따라서 상기 물질로부터의 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 고갈율은 당해 분야에 널리 공지된 다양한 화학적 및 생화학적 방법에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다. 예시적인 L-시스틴- 및/또는 L-시스테인-분해양은 본원에서 추가로 기술되며, 치료될 물질의 밀리리터(mL) 당 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)의 0.001 내지 100 유닛(U), 바람직하게는 약 0.01 내지 10 U, 및 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 5 U 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)일 수 있다.

L-시스틴 및/또는 L-시스테인 분해 조건은 CGL 효소의 생물학적 활성과 양립가능한 완충액 및 온도 조건이며, 효소와 양립할 수 있는 적당한 온도, 염 및 pH 조건, 예를 들어 생리적 병태를 포함한다. 예시적인 조건은 약 4 내지 40 ℃, 약 0.05 내지 0.2 M NaCl에 상응하는 이온 강도 및 약 5 내지 9의 pH를 포함하는 반면, 생리적 병태가 포함된다.

일 구현예에서, 생체내에서의 접촉은 정맥내 또는 복강내 주사에 의해 환자에게 본 발명의 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)를 포함하는 생리적으로 관용성인 조성물의 치료적 유효량을 투여함으로써 달성되며, 그렇게 함으로써 환자내에 존재하는 순환하는 L-시스틴 및/또는 L-시스테인을 고갈시킨다.

조작된 시스티네아제(시스테이네아제)의 치료적 유효량은 원하는 효과를 달성하기 위해, 즉 환자의 순환계에서 L-시스틴 및/또는 L-시스테인을 고갈시키기 위해 계산된 예정된 양이다. 따라서, 본 발명의 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)의 투여를 위한 투여 량 범위는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 것이다. 투약량은 유해한 부작용, 예컨대 과다점성 증후군, 폐부종, 울혈성 심장기능상실 등을 일으킬 정도로 크지 않아야 된다. 일반적으로, 투약량은 환자의 연령, 질환, 성별 및 질환 규모에 따라 달라질 것이며, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 투약량은 임의의 합병증의 경우 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.

예를 들어, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)의 치료적 유효량은 생리적으로 관용성인 조성물로 투여될 때 약 0.001 내지 약 100 단위(U)/mL, 바람직하게는 약 0.1U 이상, 및 보다 바람직하게는 1U 이상의 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)/mL의 혈관내(혈장) 또는 국소 농도를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 전형적인 투약량은 체중을 기준으로 투여될 수 있으며, 약 5-1000 U/킬로그램(kg)/일, 바람직하게는 약 5-100 U/kg/일, 보다 바람직하게는 약 10-50 U/kg/일, 및 보다 바람직하게는 약 20-40 U/kg/일의 범위내에 있다.

조작된 시스티네아제(시스테이네아제)는 주사에 의해, 또는 점진적 주입에 의해 경시적으로 비경구적으로 투여될 수 있다. 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)는 정맥내로, 복강내로, 경구로, 근육내로, 피하로, 공동내, 경피로, 피부로 투여될 수 있으며, 연동 수단에 의해 전달될 수 있고, 요로로 직접 주사되거나, 잠재적인 바이오센서 또는 L-시스틴(시스테인)을 함유할 수 있는 카테터에 연결된 펌프에 의해 투여될 수 있다.

조작된 시스티네아제(시스테이네아제)를 함유하는 치료적 조성물은 통상적으로 예를 들어, 단위 용량의 주사로서 정맥내로 투여된다. 용어 "단위 용량"은 치료 조성물과 관련하여 사용될 때, 대상체에게 일원화된 투약량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 상기 단위는 요구되는 희석제와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 예정된 양의 활성 물질, 즉 담체 또는 비히클을 함유한다.

상기 조성물은 투약 제형과 양립가능한 방식으로, 그리고 치료적 유효량으로 투여된다. 투여량은 치료될 대상체, 활성 성분을 사용하는 대상체 시스템의 용량, 및 원하는 치료 효과의 정도에 의존한다. 투여해야 하는 활성 성분의 정확한 양은 종사자의 판단에 달려 있으며, 개개인마다 다르다. 그러나, 전신 적용을 위한 적합한 투약 범위는 본 명세서에 개시되어 있으며, 투여 경로에 의존한다. 초기 투여 및 두번째 예방 주사를 위한 적절한 방법도 고려되고, 초기 투여, 및 후속적인 주사 또는 다른 투여에 의한 하나 이상의 시간 간격으로 반복 투여에 의해 대표된다. 예시적인 다중 투여가 본 명세서에 기재되어 있으며, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)의 계속 높은 혈청 및 조직 수준을 유지하고, 반대로 L-시스틴(시스테인)의 낮은 혈청 및 조직 수준을 유지하는 것이 특히 바람직하다. 대안적으로, 생체내 요법에 대해 명시된 범위의 혈액 농도를 유지하기에 충분한 연속적 정맥내 주입이 고려된다.

V. 콘주게이트

본 발명의 조성물 및 방법은 이종성 펩타이드 분절 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체와 콘주게이트를 형성시킴으로써 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)를 포함한다. 추가의 양태에서, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)는 PEG에 연결되어 효소의 유체역학적 반경을 증가시켜서 혈청 잔류를 증가시킬 수 있다. 특정 양태에서, 개시된 폴리펩타이드는 외부 수용체 또는 표적 세포상의 결합 부위에 구체적으로 및 안정적으로 결합하는 능력을 갖는 리간드와 같은 임의의 표적 치료제에 접합될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2009/0304666호).

A. 융합 단백질

본 발명의 특정 구현예는 융합 단백질에 관한 것이다. 이들 분자는 이종성 도메인에 N-말단 또는 C-말단에서 연결된 변형된 시스타티오나제를 가질 수 있다. 예를 들어, 융합은 또한 이종성 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위해 다른 종의 선도 서열을 이용할 수 있다. 또 다른 유용한 융합은 단백질 친화성 태그, 예컨대 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티딘 잔기, 또는 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 바람직하게는 절단가능한 항체 에피토프와 같은 면역학적으로 활성인 도메인의 첨가를 포함한다. 비제한적인 친화성 태그는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 글루타티온-S-전달효소(GST)를 포함한다.

특정 구현예에서, 시스티네아제(시스테이네아제)는 생체내 반감기를 증가시키는 펩타이드, 예컨대 XTEN 폴리펩타이드(Schellenberger 등, 2009), IgG Fc 도메인, 알부민, 또는 알부민 결합 펩타이드에 연결될 수 있다.

융합 단백질을 생성하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 완전한 융합 단백질의 새로운 합성 에 의해, 또는 이종성 도메인을 코딩하는 DNA 서열의 부착에 이어서, 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다.

모체 단백질의 기능적 활성을 회복시키는 융합 단백질의 생산은 탠덤 방식으로 연결된 폴리펩타이드 사이에서 스플라이싱된 펩타이드 링커를 코딩하는 브릿징 DNA 분절로 유전자를 연결함으로써 촉진될 수 있다. 링커는 수득된 융합 단백질의 적절한 폴딩을 허용하기에 충분한 길이를 갖는다.

B. 링커

특정 구현예에서, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)는 이중작용성 가교결합 시약을 사용하여 화학적으로 접합되거나, 단백질 수준에서 펩타이드 링커와 융합될 수 있다.

이중작용성 가교결합 시약은 친화성 매트릭스의 제조, 다양한 구조의 변경 및 안정화, 리간드 및 수용체 결합 부위의 확인, 및 구조적 연구를 포함하는 다양한 목적으로 광범위하게 사용되어왔다. 적합한 펩타이드 링커는 또한 Gly-Ser 링커와 같은 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)를 연결시키는데 사용될 수 있다.

2개의 동일한 작용기를 갖는 동종 이중작용성 시약은 동일한 및 상이한 거대분자 또는 거대 분자의 하위단위 사이의 가교결합을 유도하고, 폴리펩타이드 리간드를 그들의 특정 결합 부위에 연결시키는데 매우 효율적임이 입증되었다. 이종 이중작용성 시약은 2개의 상이한 작용기를 함유한다. 2개의 상이한 작용기의 차별적인 반응성을 이용함으로써, 가교결합은 선택적으로 및 순차적으로 제어될 수 있다. 이중작용성 가교결합 시약은 그의 작용기, 예를 들어, 아미노-, 설프하이드릴-, 구아니딘-, 인돌-, 카복실-특정 기의 특이성에 따라 분할될 수 있다. 이들 중에서, 유리 아미노 기에 대한 시약은 그것의 상업적 이용가능성, 합성 용이성 및 적용될 수 있는 온화한 반응 조건때문에 특히 대중적이다.

다수의 이종 이중작용성 가교결합 시약은 일차 아민-반응성 기 및 티올-반응성 기를 함유한다. 또 다른 예에서, 이종 이중작용성 가교결합 시약 및 가교결합 시약을 사용하는 방법이 기재되어있다(미국 특허 제5,889,155호, 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨). 가교결합 시약은 친핵성 하이드라자이드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 결합시켜, 일 예에서 알데하이드를 유리 티올과 커플링시킨다. 가교결합 시약은 다양한 작용기를 가교결합하도록 변형될 수 있다.

부가적으로, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 연결/커플링제 및/또는 기전은 영장류 조작된 시스티네아제(시스테이네아제), 예컨대 예를 들어, 항체-항원 상호작용, 아비딘 바이오틴 연결기, 아미드 연결기, 에스테르 연결기, 티오에스테르 연결기, 에테르 연결기, 티오에테르 연결기, 포스포에스테르 연결기, 포스포르아미드 연결기, 무수물 연결기, 디설파이드 연결기, 이온성 및 소수성 상호작용, 이중특이적 항체 및 항체 단편, 또는 이들의 조합을 조합하는데 사용될 수 있다.

바람직하게는, 혈액내에서 합리적인 안정성을 갖는 가교결합제가 사용될 수 있을 것이다. 표적화 및 치료제/예방적 제제를 콘주게이트하는데 성공적으로 이용될 수 있는 수많은 유형의 디설파이드-결합 함유 링커가 공지되어 있다. 입체 장애가 있는 디설파이드 결합을 함유하는 링커는 생체내에서 더 큰 안정성을 제공하는 것으로 입증될 수 있다. 따라서, 이러한 링커는 하나의 결합제 그룹이다.

힌더드 가교결합제 이외에, 비-힌더드 링커도 본원에 따라 사용될 수 있다. 보호된 디설파이드를 함유하거나 생성하지 않는 것으로 여겨지는 다른 유용한 가교결합제는 SATA, SPDP 및 2-이미노티올란을 포함한다(Wawrzynczak and Thorpe, 1987). 이러한 가교결합제의 사용은 당 기술 분야에 잘 알려져있다. 또 다른 구현예는 가요성 링커의 사용을 포함한다.

일단 화학적으로 콘주게이트되면, 펩타이드는 일반적으로 콘주게이트를 콘주게이트되지않은 제제 및 다른 오염물질로부터 분리하기 위해 정제될 것이다. 다수의 정제 기술은 임상적으로 유용하게 하기에 충분한 정도의 순도의 콘주게이트를 제공하는데 사용하기 위해 이용가능하다.

크기 분리에 기초한 정제 방법, 예컨대 겔 여과, 겔 투과 또는 고성능 액체 크로마토그래피가 일반적으로 가장 많이 사용될 것이다. 다른 크로마토그래피 기술, 예컨대 블루-세파로스 분리도 사용될 수 있다. 봉입체로부터 융합 단백질을 정제하는 통상적인 방법은 약한 시약, 예컨대 나트륨 N-라우로일-사르코신(SLS)을 사용하는 것과 같이 유용할 수 있다.

C. 페길화(PEGylation)

본 발명의 특정 양태에서, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)의 페길화에 관련된 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 예를 들어, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 페길화될 수 있다.

페길화는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체 사슬을 또 다른 분자, 정상적으로 약물 또는 치료 단백질에 공유결합시키는 방법이다. 페길화는 PEG의 반응 유도체를 상기 표적 거대분자와 함께 배양시킴으로써 일상적으로 달성된다. 약물 또는 치료적 단백질에 PEG를 공유결합시키면 제제를 숙주의 면역계에서 "마스킹"(면역원성 및 항원성 감소)시키거나, 제제의 유체역학적 크기(용액 크기)를 증가시켜, 신장 청소능을 감소시킴으로써 그의 순환 시간을 연장시킨다. 페길화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 대한 수용성을 제공할 수 있다.

페길화의 제1 단계는 하나 또는 양쪽 말단에서 PEG 중합체의 적합한 작용화이다. 동일한 반응성 모이어티를 갖는 각각의 말단에서 활성화되는 PEG는 "동종 이중작용성"으로 알려져 있고, 반면, 존재하는 작용기가 상이한 경우, PEG 유도체는 "이종 이중작용성" 또는 "이종 작용성"으로 지칭된다. PEG 중합체의 화학적으로 활성 또는 활성화된 유도체는 PEG를 원하는 분자에 부착시키도록 제조된다.

PEG 유도체에 대한 적합한 작용기의 선택은 PEG에 커플링될 분자 상의 이용가능한 반응성 기의 유형에 기초한다. 단백질의 경우, 전형적인 반응성 아미노산은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다. N-말단 아미노기 및 C-말단 카복실산도 또한 사용될 수 있다.

제1 세대 PEG 유도체를 형성하는데 사용되는 기술은 일반적으로 PEG 중합체를 하이드록실기, 전형적으로 무수물, 산 염화물, 클로로포르메이트 및 카보네이트와 반응성인 기와 반응시킨다. 제2 세대 페길화 화학에서, 보다 효율적인 작용기, 예컨대 알데하이드, 에스테르, 아미드 등이 콘주게이션에 이용가능하게 된다.

페길화의 적용이 점점 더 진전되고 정교해짐에 따라, 콘주게이션을 위한 이종 이중작용성 PEG의 필요성이 증가되어왔다. 이 이종 이중작용성 PEG는 친수성, 가요성 및 생체적합성 스페이서가 필요한 두 독립체를 연결하는데 매우 유용하다. 이종 이중작용성 PEG에 대한 바람직한 말단기는 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 디설파이드, 아민, 카복실 산 및 NHS 에스테르이다.

가장 일반적인 변경 제제 또는 링커는 메톡시 PEG(mPEG) 분자에 기초한다. 이들의 활성은 단백질-변형 기를 알코올 말단에 첨가하는 것에 좌우된다. 일부 경우, 폴리에틸렌 글리콜(PEG 디올)이 전구체 분자로서 사용된다. 이어서, 디올은 헤테로- 또는 호모-이량체성 PEG-연결된 분자를 제조하기 위해 양 말단에서 변형된다.

단백질은 일반적으로 친핵성 부위, 예컨대 비양성자화된 티올(시스테이닐 잔기) 또는 아미노기에서 페길화된다. 시스테이닐-특정 변경 시약의 예는 PEG 말레이미드, PEG 요오도아세테이트, PEG 티올 및 PEG 비닐설폰을 포함한다. 4종 모두 온화한 조건하에서, 및 중성 내지 약 알칼리성 pH에서 강하게 시스테이닐-특이성을 가지지만, 각각 일부 단점이 있다. 말레이미드로 형성된 티오에테르는 알칼리성 조건 하에서 다소 불안정할 수 있으므로, 이 링커를 갖는 제형 선택에 일부 제한이 있을 수 있다. 아이오도 PEG로 형성된 카바모티오에이트 연결은 보다 안정하지만, 유리 요오드는 일부 조건 하에서 티로신 잔기를 변형시킬 수 있다. PEG 티올은 단백질 티올과의 디설파이드 결합을 형성하지만, 이러한 연결은 또한 알칼리성 조건 하에서 불안정할 수 있다. PEG-비닐설폰 반응성은 말레이미드 및 요오도 PEG에 비해 상대적으로 느리지만; 형성된 티오에테르 연결은 상당히 안정하다. 그것의 더 느린 반응 속도는 또한 PEG-비닐설폰 반응을 제어하기 쉽게 할 수 있다.

원상태 시스테이닐 잔기에서의 부위-특이적인 페길화는 드물게 수행되는데, 그 이유는 이러한 잔기가 통상적으로 디설파이드 결합 형태이거나 생물학적 활성에 필요하기 때문이다. 다른 한편으로, 부위-지향적 돌연변이유발은 티올-특정 링커에 대한 시스테이닐 페길화 부위를 혼입시키는데 사용될 수 있다. 시스테인 돌연변이는 페길화 시약에 접근가능하고 페길화 후에 여전히 생물학적으로 활성이 있도록 설계되어야 한다.

아민-특정 변경 제제로는 PEG NHS 에스테르, PEG 트레실레이트, PEG 알데하이드, PEG 이소티오시아네이트 및 몇몇 다른 것들이 포함된다. 모두 온화한 조건에서 반응하며 아미노기에 매우 특이적이다. PEG NHS 에스테르는 아마 더 반응성이 강한 물질 중 하나이지만; 그의 높은 반응성은 페길화 반응을 대규모로 제어하기 어렵게 할 수 있다. PEG 알데하이드는 아미노 기와 이민을 형성한 다음, 나트륨 시아노보로하이드라이드에 의해 2차 아민으로 환원된다. 나트륨 보로하이드라이드와는 달리, 나트륨 시아노보로하이드라이드는 디설파이드 결합을 감소시키지 않을 것이다. 그러나, 이 화학 물질은 독성이 강하며, 특히 휘발성이 있는 낮은 pH에서는 조심스럽게 다루어야 한다.

대부분의 단백질 상의 다중 라이신 잔기로 인해, 부위-특이적 페길화는 도전일 수 있다. 다행히도, 이들 시약은 비양성자화된 아미노기와 반응하기 때문에, 낮은 pH에서 반응을 수행함으로써 페길화를 보다 낮은-pK 아미노기로 유도하는 것이 가능하다. 일반적으로 알파-아미노기의 pK는 라이신 잔기의 엡실론-아미노기보다 1 내지 2 pH 단위 낮다. pH 7 이하에서 분자를 페길화함으로써, N-말단에 대한 높은 선택성이 빈번하게 달성될 수 있다. 그러나, 이것은 단백질의 N-말단부가 생물학적 활성에 필요하지 않은 경우에만 실행가능하다. 여전히, 페길화의 약동학적 이점은 시험관내 생물활성을 현저히 손실시키므로 페길화 화학에 관계없이 생체내 생물활성이 훨씬 큰 생성물을 생성한다.

페길화 절차를 개발할 때 고려해야 할 몇 개의 파라미터가 있다. 다행히도, 일반적으로 4 또는 5개의 주요 파라미터가 없다. 페길화 조건의 최적화에 대한 "실험 설계" 접근법은 매우 유용할 수 있다. 티올-특정 페길화 반응을 위해, 고려할 파라미터는 하기를 포함한다: 단백질 농도, PEG-대-단백질 비율(몰 기준), 온도, pH, 반응 시간, 및 일부 사례에서 산소 배제. (산소는 단백질에 의한 분자간 디설파이드 형성에 기여하여, 페길화된 생성물의 수율을 감소시킬 수 있다.) pH가 더욱 중요할 수 있다는 점을 제외하고는 아민-특정 변경에 대해 동일한 인자가 고려되어야 하며(산소 제외), 특히 N-말단 아미노기를 표적으로 할 때 pH가 더욱 더 중요할 수 있다.

아민- 및 티올-특이적 변경 모두에 대해, 반응 조건은 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이것은 온도, 단백질 농도 및 pH를 제한할 수 있다. 또한, PEG 링커의 반응성은 페길화 반응을 개시하기 전에 공지되어야 한다. 예를 들어, 페길화 제제가 단지 70% 활성인 경우, 사용된 PEG의 양은 활성 PEG 분자만이 단백질-대-PEG 반응 화학양론에 카운트되도록 보장해야 한다.

VI. 단백질 및 펩타이드

특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 단백질 또는 펩타이드, 예컨대 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)를 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 이들 펩타이드는 융합 단백질에 포함되거나 전술한 바와 같은 제제에 접합될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단백질 또는 펩타이드는 일반적으로 유전자로부터 번역된 전장 서열까지 약 200개 초과의 아미노산의 단백질; 약 100개 초과의 아미노산의 폴리펩타이드; 및/또는 약 3 내지 약 100개 아미노산의 펩타이드를 비제한적으로 지칭한다. 편의상, 용어들 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 임의의 자연발생 아미노산, 임의의 아미노산 유도체, 또는 당 업계에 공지된 임의의 아미노산 모방체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기는 아미노산 잔기의 서열을 차단하는 임의의 비-아미노산 없이 순차적이다. 다른 구현예에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드의 잔기의 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 차단될 수 있다.

따라서, 용어 "단백질 또는 펩타이드"는 자연 발생 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 변형된 또는 비정상적인 아미노산을 포함한다.

단백질 또는 펩타이드는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현, 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 펩타이드의 단리, 또는 단백질 또는 펩타이드의 화학적 합성을 포함하여, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기술로 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오타이드 및 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드 서열은 이전에 개시되어 있으며, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 컴퓨터화된 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 하나의 상기 데이터베이스는 National Center for Biotechnology Information의 Genbank 및 GenPept 데이터베이스(World Wide Web에서 ncbi.nlm.nih.gov/에서 이용가능함)이다. 공지된 유전자에 대한 코딩 영역은 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 증폭 및/또는 발현될 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드의 다양한 상업적 제제가 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다.

VII. 핵산 및 벡터

본 발명의 특정 양태에서, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제) 또는 변형된 시스티네아제(시스테이네아제)를 함유하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 개시될 수 있다. 어떤 발현 시스템이 사용되는지에 따라, 핵산 서열은 통상적인 방법에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)가 영장류 CGL로부터 유래되고, E. 콜리에서 거의 사용되지 않는 다수의 코돈을 함유하는 경우, 이는 발현을 간섭할 수 있다. 따라서, 각각의 유전자 또는 그의 변이체는 E. 콜리 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 다양한 벡터는 또한, 관심의 단백질, 예컨대 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포손 또는 리포좀-기반 벡터를 비제한적으로 포함한다.

VIII. 숙주세포

숙주세포는 조작된 시스티네아제(시스테이네아제) 및 그의 콘주게이트의 발현 및 분비를 허용하도록 전환될 수 있는 임의의 것일 수 있다. 숙주세포는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 또는 사상균일 수 있다. 다양한 박테리아에는 에스케리치아 및 바실러스가 포함된다. 속 사카로마이세스, 클루이베르마이세스(Kiuyveromyces), 한세눌라, 또는 피치아에 속하는 효모는 적절한 숙주세포로 사용된다. 하기 속: 아스페르길루스, 트리코데르마, 뉴로스포라, 펜니실리움, 세팔로스포리움, 아클리아, 포도스포라, 엔도티아, 뮤코르, 코칠로볼러스, 및 피리큘라리아를 포함하는 다양한 종의 사상균이 발현 숙주로서 사용될 수 있다.

사용가능한 숙주 유기체의 예는 박테리아, 예를 들어 예를 들어, 에스케리치아 콜라이 MC1061, 바실러스 서브틸리스 BRB1의 유도체(Sibakov 등, 1984), 스타필로코쿠스 아우레스 SAI123(Lordanescu, 1975) 또는 연쇄상구균 리비단스(Hopwood 등, 1985); 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 AH 22(Mellor 등, 1983) 또는 쉬조사카로마이세스 폼베; 및 사상균, 예를 들어, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 아와모리(Ward, 1989), 또는 트리코데르마 리세이(Penttila 등, 1987; Harkki 등, 1989)를 포함한다.

포유동물 숙주세포의 예로는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL61), 랫트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 랫트 간종양 세포(H-4-II-E; ATCCCRL 1548), SV40-전환된 원숭이 신장 세포(COS-1; ATCC CRL 1650), 및 뮤린 배아 세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)가 포함된다. 전술한 것은 당 업계에 공지된 많은 가능한 숙주 유기체를 설명하기 위한 것이지 제한하는 것은 아니다. 원칙적으로, 분비할 수 있는 모든 숙주는 원핵 세포이든 진핵 세포이든 상관없이 사용될 수 있다.

조작된 시스티네아제(시스테이네아제) 및/또는 그의 융합 단백질을 발현하는 포유동물 숙주세포는 친계 세포주를 배양하기 위해 전형적으로 사용되는 조건 하에서 배양된다. 일반적으로, 세포는 5%-10% 혈청, 예컨대 우태 혈청이 전형적으로 보충된, 생리적 염 및 영양소를 함유하는 표준 배지, 예컨대 표준 RPMI, MEM, IMEM 또는 DMEM에서 배양된다. 배양 조건은 또한 표준적이며, 예를 들어 원하는 수준의 단백질이 얻어질 때까지 정치 배양 또는 롤러 배양에서 배양액을 37 ℃에서 배양한다.

IX. 단백질 정제

단백질 정제 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 이러한 기술은 한 수준에서 세포, 조직 또는 장기의 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획물로의 균질화 및 미정제 분별화를 포함한다. 관심 대상의 단백질 또는 폴리펩타이드는 달리 구체화되지 않는 한 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 부분적인 정제 또는 완전한 정제(또는 균질성으로 정제)를 달성하여 추가로 정제될 수 있다. 순수한 펩타이드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 면역 친화도 크로마토그래피 및 등전점 전기영동이다. 펩타이드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 고속 액체 크로마토그래피(FPLC) 또는 고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다.

정제된 단백질 또는 펩타이드는 다른 성분으로부터 단리가능한 조성물을 지칭하며, 단백질 또는 펩타이드는 자연적으로-수득가능한 상태와 관련하여 어느 정도까지 정제된다. 따라서, 단리된 또는 정제된 단백질 또는 펩타이드는 자연적으로 발생할 수 있는 환경이 없는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된"은 다양한 다른 성분을 제거하기 위해 분별화된 단백질 또는 펩타이드 조성물을 지칭하며, 그의 조성물은 그의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이 명칭은 단백질 또는 펩타이드가 조성물의 주요 구성요소를 형성하는 조성물, 예컨대 조성물내에 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 이상의 단백질을 구성하는 조성물을 지칭할 것이다.

단백질 정제에 사용하기에 적합한 다양한 기술이 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져있다. 이들은 예를 들어, 황산 암모늄, PEG, 항체 등을 사용한 침전, 또는 열 변성, 이어서 원심분리; 크로마토그래피 단계, 예컨대 이온교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시 아파타이트 및 친화도 크로마토그래피; 등전점 전기영동; 겔 전기영동; 및 이들 및 다른 기술의 조합을 포함한다. 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서가 변경되거나, 특정 단계가 생략될 수 있으며, 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩타이드의 적합한 제조 방법을 초래하는 것으로 여겨진다.

단백질 또는 펩타이드의 정제 정도를 정량화하기 위한 다양한 방법은 본 개시 내용에 비추어 당해 분야의 숙련가에게 공지되어있다. 이들은 예를 들어, 활성 분획의 특이 활성을 측정하거나, SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩타이드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하기 위한 바람직한 방법은 분획의 특이 활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 특이 활성과 비교하고, 및 그에 따른 순도를 계산하고, "-배 정제 수"로 평가된다. 물론, 활성 양을 나타내는데 사용되는 실제 단위는 정제를 따르기 위해 선택한 특정 검정기술 및 발현된 단백질 또는 펩타이드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부에 달려 있을 것이다.

단백질 또는 펩타이드가 항상 가장 정제된 상태로 제공될 것이라는 일반적인 요건은 없다. 사실상, 실질적으로 덜 정제된 생성물이 특정 구현예에서 유용할 수 있다는 것이 고려된다. 부분 정제는 보다 적은 정제 단계를 조합하여 또는 동일한 형태의 상이한 정제 방법을 이용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, HPLC 장치를 사용하여 수행되는 양이온-교환 칼럼 크로마토그래피는 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일한 기술보다 일반적으로 더 큰 "-배" 정제를 초래할 수 있음을 알 수 있다. 보다 낮은 정도의 상대 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 총 회수에서 또는 발현된 단백질의 활성을 유지하는데 이점을 가질 수 있다.

특정 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드는 예를 들어 조작된 시스티네아제(시스테이네아제), 조작된 AAD를 함유하는 융합 단백질 또는 페길화후 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)를 단리 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, His 태그 또는 친화성 에피토프는 정제 조작을 용이하게 하기 위해 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)에 포함될 수 있다. 친화도 크로마토그래피는 단리된 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특정 친화성에 의존하는 크로마토그래피 절차이다. 이것은 상호작용의 수용체-리간드 유형이다. 칼럼 물질은 결합 파트너 중 하나를 불용성 매트릭스에 공유 커플링시킴으로써 합성된다. 칼럼 물질은 용액으로부터 물질을 특이적으로 흡착할 수 있다. 용출은 결합이 일어나지 않을 조건(예를 들어, 변경된 pH, 이온 세기, 온도 등)으로 조건을 변경함으로써 일어난다. 매트릭스는 분자를 어느 정도 흡수하지 않고 광범위한 화학적, 물리적 및 열적 안정성을 갖는 물질이어야 한다. 리간드는 결합 특성에 영향을 미치지 않는 방식으로 커플링되어야 한다. 리간드는 또한 비교적 단단한 결합을 제공해야 한다. 샘플 또는 리간드를 파괴하지 않으면서 물질을 용출할 수 있어야 한다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 중의 분자가 그들의 크기 또는 보다 기술적인 관점에서 그의 유체역학 용적에 기초하여 분리되는 크로마토그래피 방법이다. 일반적으로 단백질 및 산업용 중합체와 같은 거대분자 또는 거대분자 복합체에 적용된다. 전형적으로 수용액을 사용하여 샘플을 칼럼을 통해 운반할 때, 이 기술은 유기 용매가 이동상으로 사용될 때 사용되는 겔 투과 크로마토그래피와 비교되는, 겔 여과 크로마토그래피로 공지되어 있다.

SEC의 기본 원리는 상이한 크기의 입자가 상이한 속도로 고정상을 통해 용리(여과)될 것이라는 점이다. 그 결과 크기에 따른 입자의 용액이 분리된다. 모든 입자가 동시에 또는 거의 동시에 장입된다면, 동일한 크기의 입자가 함께 용리되어야 한다. 각각의 크기 배제 칼럼은 분리할 수 있는 분자량의 범위를 갖는다. 배제 한계는 이 범위의 상단에서의 분자량을 정의하며, 분자가 너무 커서 고정상에 포획될 수 없는 곳이다. 투과 한계는 분리 범위의 하단에서의 분자량을 정의하며, 충분히 작은 크기의 분자가 고정상의 기공 안으로 완전히 침투할 수 있고, 이 분자량 이하의 모든 분자가 너무 작아서 단일 밴드로서 용리된다.

고-성능 액체 크로마토그래피(또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC)는 화합물을 분리, 동정 및 정량하기 위해 생화학 및 분석 화학에서 빈번하게 사용되는 칼럼 크로마토그래피의 한 형태이다. HPLC는 크로마토그래피 패킹 물질(고정상)을 보유하는 칼럼, 칼럼을 통해 이동상(들)을 이동시키는 펌프 및 분자의 체류 시간을 보여주는 검출기를 이용한다. 체류 시간은 고정상, 분석되는 분자 및 사용된 용매(들) 사이의 상호작용에 따라 달라진다.

예로서, 각 구조물은 클로닝을 단순화하기 위해 N-말단 NcoI 제한 부위, 인프레임 N-말단 His₆ 태그 및 C-말단 EcoRI 부위를 함유할 수 있다. pET28a 벡터(Novagen)에 클로닝한 후, 적절한 hCGL 발현 벡터를 함유하는 E. 콜리(BL21)을 약 0.5 내지 0.6의 OD₆₀₀에 이를 때까지 성장시킬 수 있다. 이 시점에서 배양물을 25 ℃에서 진탕기(shaker)로 스위칭하고, 0.5 mM IPTG로 유도하고, 추가로 12시간 동안 단백질을 발현시킬 수 있다. 이어서, 세포 펠렛을 원심분리에 의해 수집하고, IMAC 완충액(10 mM NaPO₄/10 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)에 재현탁시킬 수 있다. 프랑스의 압력 셀에 의한 용해 후, 용해물은 4 ℃에서 20,000 x g에서 20분 동안 원심분리될 수 있으며, 생성된 상청액은 니켈 IMAC 칼럼에 적용하고, 10-20 칼럼 용적의 IMAC 완충액으로 세정한 후, IMAC 용출 완충액(50 mM NaPO₄/250 mM 이미다졸/300 mM NaCl, pH 8)으로 용출하였다. 효소를 함유하는 분획물을 25 ℃에서 1시간 동안 10mM 피리독살 포스페이트(PLP)와 함께 인큐베이션할 수 있다. 10,000 MWCO 원심분리 필터 디바이스(AMICON™)를 사용하여 단백질을 100 mM PBS, 10% 글리세롤, pH 7.3 용액에 여러 번 완충액 교환할 수 있다. hCGL 효소 또는 hCGL-변이체 효소의 분취액을 액체 질소에서 플래시 냉동시키고, -80 ℃에서 저장할 수 있다. 이러한 방식으로 정제된 hCGL 또는 hCGL-변이체 효소는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의해 평가할 때 > 95% 균질할 수 있다.

X. 약제학적 조성물

신규한 시스티네아제(시스테이네아제)는 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 이들은 정맥내, 척추강내 및/또는 복강내로 투여될 수 있다.

본 발명은 치료적 제형의 특정한 성질에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리적으로 허용가능한 액체, 겔 또는 고형 담체, 희석제 및 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 치료적 제제는 가축과 같은 수의학 용도 및 다른 치료제와 유사한 방식으로 인간에서의 임상 용도로 포유동물에 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료적 효능에 요구되는 투약량은 개별 대상체의 특수화된 요건뿐만 아니라 사용 유형 및 투여 방식에 따라 다양할 것이다.

상기 조성물은 전형적으로 주사제로서 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조된다. 적합한 희석제 및 부형제는 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합이다. 또한, 필요하다면, 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.

임상 적용이 고려되는 경우, 목적하는 용도에 적합한 형태로 단백질, 항체 및 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 CGL 변이체 또는 추가 제제를 포함할 수 있다. "약제학적으로 또는 약리적으로 허용가능한"이라는 문구는 적절하게 예를 들어, 인간과 같은 동물에게 투여될 때 불리한, 알레르기성 또는 다른 유해한 반응을 일으키지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 단리된 적어도 하나의 CGL 변이체 또는 추가의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물의 제조는 본 개시내용에 비추어 당해 분야의 숙련가에게 공지될 것이며, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990에 예시되어 있으며, 본원에 참고로 포함된다. 또한, 동물(예를 들어, 인간) 투여의 경우, 생물학적 표준의 FDA 사무국(FDA Office of Biological Standards)이 요구하는 바와 같이, 제제가 무균, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 함을 이해할 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅물, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해 제제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 물질 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 본원에 참고로 포함됨). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없다면, 약제학적 조성물에서 그의 용도가 고려된다.

본 발명의 특정 구현예는 그것이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되어야하는지 여부 및 투여 경로, 예컨대 주사를 위해 멸균되어야하는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 정맥내로, 진피내로, 경피로, 척추강내로, 동맥내로, 복강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 점막으로, 경구로, 국부적으로, 국소적으로, 흡입(예를 들어, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 표적 세포를 직접 배씽(bathing)하는 국소화된 관류에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 지질 조성물(예를 들어, 리포좀)에서, 또는 다른 방법 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 상기의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 본원에서 참고로 포함됨).

변형된 폴리펩타이드는 유리 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 산 부가 염, 예를 들어 단백질성 조성물의 유리 아미노기로 형성되거나 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델 산과 같은 유기산으로 형성된 염을 포함한다. 유리 카복실 기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2 철; 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유래될 수 있다. 제형화시, 용액은 투약 제형과 양립가능한 방식으로, 및 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 주사가능한 용액과 같은 비경구 투여를 위해 제형화되거나 또는 폐로 전달하기 위한 에어로졸과 같은 다양한 투약 형태로 용이하게 투여되거나 약물 방출 캡슐 등과 같은 영양 투여용으로 제형화된다.

또한, 본 발명의 특정 양태에 따르면, 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제가 있거나 없는 약제학적으로 허용가능한 담체로 제공될 수 있다. 담체는 동화 가능해야 하며, 액체, 반-고체, 즉 페이스트 또는 고형 담체를 포함한다. 임의의 통상적인 배지, 제제, 희석제 또는 담체가 수령체 또는 그 안에 함유된 조성물의 치료적 유효성에 해로운 경우를 제외하고, 상기 방법을 실시하는데 사용하기 위한 투여가능한 조성물로의 사용이 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 식염수, 지질, 리포솜, 수지, 결합제, 충전제 등 또는 이들의 조합을 포함한다. 상기 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키는 다양한 산화방지제를 포함할 수 있다. 또한, 파라벤(예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로 부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 비제한적으로 포함하는, 다양한 항균 및 항진균제와 같은 보존제에 의해 미생물의 작용을 예방할 수 있다.

본 발명의 특정 양태에 따라, 본 조성물은 임의의 편리하고 실제적인 방식, 즉 용액, 현탁액, 에멀젼화, 혼합물, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 배합된다. 이러한 절차는 당해 분야의 숙련가에게는 일상적이다.

본 발명의 특정 구현예에서, 본 조성물은 반-고체 또는 고형 담체와 완전히 조합되거나 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 조성물을 치료적 활성의 손실, 즉 위장에서의 변성으로부터 보호하기 위해 안정화제가 또한 혼합 공정에 첨가될 수 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예로는 완충액, 아미노산, 예컨대 글리신 및 라이신, 탄수화물, 예컨대 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 소르비톨, 만니톨 등이 포함된다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 CGL 변이체, 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "지질"은 물에 특징적으로 불용성이고, 유기 용매로 추출가능한 임의의 광범위한 물질을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 넓은 부류의 화합물은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 용어 "지질"이 본원에서 사용되었기 때문에, 특정의 구조에 한정되지 않는다. 예는 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 자연 발생 또는 합성(즉, 인간에 의해 설계된 또는 생산된)일 수 있다. 그러나, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 리소 지질, 글리스 스핑고지질, 당지질, 설파티드, 에테르- 및 에스테르-연결된 지방산을 갖는 지질, 중합성 지질 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 지질로서 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는, 본원에 구체적으로 기술된 화합물 이외의 화합물도 조성물 및 방법에 포함된다.

당해 분야의 숙련가는 지질 비히클 중의 조성물을 분산시키기 위해 사용될 수 있는 기술의 범위에 익숙할 것이다. 예를 들어, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제) 또는 그의 융합 단백질은 지질을 함유하는 용액에 분산될 수 있고, 지질로 용해되거나, 지질로 에멀젼화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질과 공유 결합되거나, 지질 중 현탁액으로서 함유되거나, 교질임자 또는 리포좀과 함유되거나 복합체화되거나, 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 결합될 수 있다. 분산액은 리포솜을 형성하거나 생성하지 않을 수 있다.

동물 환자에게 투여된 조성물의 실제 투약량은 신체적 및 생리적 인자, 예컨대 체중, 상태의 중증도, 치료되는 질환의 유형, 이전 또는 동반 치료적 중재, 환자의 특발증, 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투약량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투약량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여에 책임이 있는 종사자는 어떤 경우에도 조성물 내 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 예를 들어 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은 약 2% 내지 약 75%, 또는 예를 들어, 약 25% 내지 약 60% 및 그 중에서 유도가능한 임의의 범위의 중량의 단위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물(들)의 양은 적합한 투약량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 얻어지는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 유효 기간 및 다른 약리적 고려사항들과 같은 인자는 상기 약제학적 제형을 제조하는 분야의 당해 분야의 숙련가에 의해 고려될 것이며, 따라서 다양한 투약량 및 치료 레지멘이 바람직할 수 있다.

다른 비-제한적인 구현예에서, 투여량은 또한 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 밀리그램/kg/체중 또는 그 이상의 투여량, 및 본 명세서에서 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도할 수 있는 범위의 비-제한적인 예에서, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 상기 기재된 수치에 기초하여 투여될 수 있다.

예로서, hCGL-TV 효소는 샘플에서 0.1% TRITON™ 114를 함유하는 IMAC 완충액으로 광범위하게(90-100 칼럼 용적) 결합된 IMAC 칼럼을 세척함으로써 정제될 수 있다. 샘플을 10-20 칼럼 용적의 IMAC 완충액으로 다시 세정한 다음, IMAC 용출 완충액(50mM NaPO₄/250mM 이미다졸/300mM NaCl, pH 8)으로 용출시킬 수 있다. TRITON™ 114로 세척하여 내독소를 제거할 수 있다. 정제된 단백질을 10,000 MWCO 여과 디바이스(AMICON®)를 사용하여 pH 8.3의 100mM NaPO₄ 완충액으로 완충액 교환할 수 있다. 이어서, PLP를 10 mM의 농도로 첨가하고, 단백질을 25 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 메톡시 PEG 석신이미딜 카복시메틸 에스테르 5000 MW(JenKem Technology)를 80:1의 몰비로 hCGL-TV에 첨가하고, 일정한 교반하에 25 ℃에서 1시간 동안 반응시킬 수 있다. 수득된 혼합물을 100,000 MWCO 여과 디바이스(AMICON®)를 사용하여 광범위하게 완충액 교환될 수 있고(10% 글리세롤을 함유한 PBS), 및 0.2 마이크론 주사기 필터(VWR)로 멸균시킬 수 있다. 모든 페길화 효소는 리뮬러스 아메보사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate, LAL) 키트(Cape Cod Incorporated)를 사용하여 리포폴리사카라이드(LPS) 함량을 분석할 수 있다.

XI. 병용 치료

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 제2 또는 추가의 요법과 조합하여 시스티네아제(시스테이네아제)를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 요법은 시스티네아제(시스테이네아제) 의존성과 관련된 임의의 질환의 치료에 적용될 수 있다. 예를 들어, 이 질환은 시스틴뇨증일 수 있다.

병용 요법을 포함하는 방법 및 조성물은 치료 또는 보호성 효과를 강화시키고, 및/또는 다른 요법의 치료 효과를 증가시킨다. 치료적 및 예방적 방법 및 조성물은 요로내 시스테인 결석의 제거와 같은 원하는 효과를 달성하는데 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이 과정은 시스티네아제(시스테이네아제) 및 제2 요법을 모두 투여하는 것을 포함할 수 있다. 조직, 장기 또는 세포는 하나 이상의 제제(즉, 시스티네아제(시스테이네아제) 또는 제2 제제)를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리적 제형(들)에 노출될 수 있거나, 조직, 장기 및/또는 세포를 둘 이상의 구별되는 조성물 또는 제형과 접촉시킬 수 있으며, 상기 하나의 조성물은 1)시스티네아제(시스테이네아제), 2)제2 제제, 또는 3)시스티네아제(시스테이네아제) 및 제2 제제 둘 모두를 제공한다. 또한, 이러한 병용 요법은 충격파 요법 또는 외과적 요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

용어들 "접촉된" 및 "노출된"은 세포에 적용될 때, 치료적 구조물이 표적 장기에 전달되거나 표적 세포와 직접 병치되도록 배치되는 과정을 기술하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 결석 용해를 달성하기 위해, 두 가지 약제는 결석을 용해시키거나 결석 형성 또는 개질을 방지하는 데 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.

시스티네아제(시스테이네아제)는 제2 시스틴뇨증 치료와 관련하여, 전, 중, 후에, 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시에 수분 내지 수일에서 수주까지의 간격으로 있을 수 있다. 시스티네아제(시스테이네아제)가 제2 시스틴뇨증 제제와 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 상당한 치료 기간이 각 전달 시간 사이에 만료되지 않도록 보장하여 2가지 치료법이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 한다. 이러한 경우, 약 12 내지 24시간, 또는 72시간 이내에, 보다 구체적으로는 서로 약 6 내지 12시간 이내에 환자에게 시스티네아제(시스테이네아제) 및 제2 시스틴뇨증 요법을 제공할 수 있다는 것이 고려된다. 어떤 상황에서는 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7)에서 몇 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)가 각각의 투여 사이에 경과하는 경우 치료 기간을 상당히 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.

특정 구현예에서, 치료 과정은 1 내지 90 일 또는 그 이상 지속될 것이다(이러한 범위는 개입일을 포함한다). 시스티네아제(시스테이네아제)는 하루 1일 내지 90일 중 임의의 날(이러한 범위에는 개입일이 포함되어 있음) 또는 이들의 임의의 조합으로 주어질 수 있고, 또 다른 치료는 1일 내지 90일 중 임의의 날(이러한 범위에는 개입일이 포함되어 있음) 또는 이들의 임의의 조합에 주어질 수 있음을 고려한다. 하루(24시간) 이내에, 환자에게 1회 또는 여러 번 투여할 수 있다. 또한, 치료 과정 후에, 어떠한 치료도 투여되지 않는 기간이 있는 것으로 고려된다. 이 기간은 환자의 상태(예를 들어, 예후, 강도, 건강 등)에 따라 1-7일 및/또는 1-5주 및/또는 1-12개월 이상 지속될 수 있다(이러한 범위에는 개입일이 포함되어 있음). 필요에 따라 치료주기가 반복될 것으로 기대된다.

다양한 조합이 사용될 수 있다. 아래의 예에서 시스티네아제(시스테이네아제)는 "A"이고, 제2 시스틴뇨증 요법은 "B"이다:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

본 구현예의 화합물의 임의의 화합물 또는 요법의 투여는 환자의 독성, 있는 경우, 제제를 고려하여 상기 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따른다. 따라서, 일부 구현예에서는 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.

A. 수술

시스틴 결석을 제거하기 위한 가장 일반적인 방법 중 하나는 경피 절제술로서, 키홀 절개가 등에서 이루어지며, 신장계가 결석을 분해하여 제거하는데 사용된다. 이 수술은 개방 수술보다 덜 침습적이지만, 일반적으로 2 내지 3일의 입원 기간과 몇 주간의 회복 기간과 함께 정기적 또는 척추 마취가 필요하다.

B. 충격파 요법

시스틴뇨증 환자는 종종 그들의 생애 동안 결석 형성 및 수술의 재발성 발작이 있다. 결석 조각화를 위한 고-에너지 충격파의 사용인 충격파 쇄석술은 1.5cm보다 작은 시스틴 결석 치료에 사용될 수 있다. 시스틴 결석은 모든 요로 결석 중 가장 튼튼하며, 쇄석술은 일반적으로 파단에 효과가 없다. 그러나 더 작은 시스틴 결석은 쇄석술로 파편화될 수 있는데, 왜냐하면 더 높은 에너지에서 더 빈번한 충격을 사용할 수 있기 때문이다.

C. 약물 요법

약물 요법은 시스틴 디설파이드 결합을 파괴하고, 보다 가용성인 혼합된 디설파이드를 형성하기 위해 D-페니실아민, α-메르캅토프로피오닐 글리신(Thiola) 및 카프토프릴과 같은 티올-함유 약물의 사용을 포함한다. 그러나, 이러한 약물은 위장 불내성, 발진 및 관절내 통증과 같은 여러 가지 불쾌한 부작용을 환자에게 빈번하게 제공한다(Sakhaee 및 Sutton, 1996).

D. 기타 방법

추가의 치료 과정은 일반적으로 결석 형성의 위험을 감소시키기 위해 요로 시스틴 수준의 관리를 포함한다. 이러한 관리 방법은 물의 섭취를 실질적으로 증가시켜(그렇게 함으로써 소변 용적과 가용화될 수 있는 시스틴의 양을 증가시킴), 시스틴의 대사성 전구체인 메티오닌의 식이 제한, 및 나트륨 및 구연산 칼륨의 경구 투여에 의해, 소변의 pH를 증가시켜 시스틴의 용해도를 증가시키는 것을 포함한다.

비-외과적 및 최소 침습 경로인 시스틴 결석을 치료하기 위한 추가의 방법은 결석의 화학적 용해를 위한 신장조루관 카테터(nephrostomy catheter)를 통한 화학 용액의 신장으로의 전달을 포함하며, 이는 화학적 용해(chemodissolution)로도 알려져있다. 중탄산 나트륨 및 pH 10에서의 유기 완충액 트리스-하이드록시 메틸렌-아미노 메탄(트로메타민-E)을 포함하는 다양한 화학분해성 약제가 이 기술에서 사용되었으며, 둘 모두 시스틴 결석을 용해시키기 위해 강하게 알칼리성인 환경을 제공하는 작용을 한다. 아세틸시스테인은 또한 화학 용해에 빈번하게 사용되며, 시스틴 디설파이드를 파괴하고, 보다 가용성인 디설파이드를 형성하여 D-페니실아민 및 티올 a와 유사한 방식으로 결석을 용해시킨다. 그러나 이러한 용해 방법은 시스틴 결석의 처리에 있어 제한적인 역할을 하는데, 왜냐하면 이들 화학 용해제는 극도로 느리게 수행되고, 결석을 용해시키기 위해 전형적으로 수주에서 수개월이 걸리기 때문이다(Ng and Streem, 2001).

XII. 키트

본 발명의 특정 양태는 치료적 키트와 같은 키트를 제공할 수 있다. 예를 들어, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 약제학적 조성물 및 선택적으로 이들의 용도를 위한 지침을 포함할 수 있다. 키트는 또한 이러한 조성물의 투여를 수행하기 위한 하나 이상의 디바이스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 키트는 조성물을 요로로 직접적으로 정맥내 주사하기 위한 약제학적 조성물 및 카테터를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 대상체 키트는 전달 장치와 함께 사용하기 위해, 약제로서 임의로 제형화된, 또는 동결건조된, 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)의 사전충전된 앰풀을 포함할 수 있다.

키트는 표지를 갖는 컨테이너를 포함할 수 있다. 적합한 컨테이너는 예를 들어, 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 컨테이너는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 컨테이너는 상기 기재된 바와 같이 치료적 또는 비-치료적 용도에 효과적인 조작된 시스티네아제(시스테이네아제)를 포함하는 조성물을 보유할 수 있다. 상기 컨테이너 상의 표지는 상기 조성물이 특정 치료 또는 비-치료적 용도에 사용됨을 나타낼 수 있으며, 상기한 바와 같이 생체내 또는 시험관내 사용에 대한 방향을 나타낼 수도 있다. 본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기재된 컨테이너 및 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용지침을 갖는 포장 삽입물을 포함하는 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 컨테이너를 포함할 것이다.

XIII. 실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내므로 그것의 실시를 위해 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에게 인정되어야 한다. 그러나, 당해 분야의 숙련가는 본 개시내용에 비추어 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 개시된 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인정해야 한다.

실시예 1 - 인간 시스티네아제(시스테이네아제) 효소를 갖는 시스틴뇨증의 마우스 모델의 치료

요로에서 결석 형성을 예방하거나 역전시키기 위한 hCGL-TV의 능력을 이전에 방광에서 시스틴 결석을 발달시키는 것으로 보고된 Slc3a1 넉아웃 마우스에서 평가하였고, 신장에서는 다소 적었다(Ercolani 등, 2010). 이 연구 프로젝트를 위해 사용된 Slc3a1 마우스 모델은 Regeneron Pharmaceuticals, Inc.에 의해 생성된 ES 세포 클론 16054A-G2에서 만들어졌으며, University of California Davis(U42RR024244)의 KOMP 저장소(www.komp.org)에 의해 마우스로 클로닝되었다. 이 라인은 DTCC 컨소시엄의 일환으로 Charles River Laboratory의 KOMP2 프로젝트의 일부로 KOMP 저장소(www.komp.org)에 추가로 브리딩되어 제공되었다.

각각 16주 및 9주의 C57BL/6N 배경의 2마리의 Scl3a1 수컷 마우스는 50 mg/kg 페길화된 hCGL-TV를 2주간 주 3회 복강내 투여하였다. 동물 연구는 Aeglea BioTherapeutics, Inc. IACUC에 따라 수행된다. hCGL-TV의 투여가 마우스의 시스틴 결석 형성을 예방 또는 완화시키는지 여부를 결정하기 위해 치료 시작전에(11일 및 0일) 및 치료(4, 7, 9일)동안 스팟 소변 샘플을 수집한다. 시스틴 결정은 40배 배율의 명시야 현미경검사에 의해 평가되며, 결정 수는 각각의 샘플에서 일관된 관심의 대표적인 영역에서 카운트된다. 도 2 및 도 3은 시각화된 육각형 결정의 수를 그래픽으로 나타낸다. 소변내 총 시스테인 농도는 총 산화된 티올 함량 및 단백질 침전을 감소시킨 후 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정한 후 7-플루오로벤조푸라잔-4-설폰산 암모늄 염으로 총 감소된 티올 함량을 유도한 것이다. 비뇨기 크레아티닌은 Sigma-Aldrich(MAK079)에서 얻은 크레아티닌 검정 키트를 사용하여, 및 제조자의 권장 절차에 따라 측정한다. 크레아티닌 수준은 비뇨기 총 시스테인 수준을 정상화하는 데 사용된다. 도 1 및 표 1은 투약 계획 동안 총 시스테인/크레아티닌 수준을 제공한다.

현장 수집 소변에서 총 시스테인 및 크레아티닌의 측정

일	총 시스테인(μM)		크레아티닌(mM)		총 시스테인/크레아티닌 비율의 평균(μM/mM)
	마우스 #1	마우스 #2	마우스 #1	마우스 #2
-11	2622.393	4567.356	0.361	0.728	6769.044
0	3068.229	4922.726	0.450	0.791	6520.854
4	1805.064	1986.336	0.631	0.900	2533.840
7	3482.205	3286.022	0.585	0.577	5823.750
9	3762.806	4735.066	0.619	0.750	6196.134

* * *

본 명세서에 개시되고 청구된 방법 모두는 본 개시내용에 비추어 과도한 실험과정없이 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예로 기재되었지만, 당해 분야의 숙련가는 변형이 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 방법 및 단계 또는 기재된 방법의 단계의 순서에 적용될 수 있다는 것을 알 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 동안 화학적으로 및 생리적으로 관련있는 특정 제제가 본 명세서에 기재된 제제로 치환될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 그러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

참고 문헌

하기 참조 문헌은 본 명세서에 제시된 예시적인 절차 또는 다른 세부사항을 제공하는 정도로, 본 명세서에 참고로 구체적으로 편입된다.

미국 특허 제4,870,287호

미국 특허 제5,739,169호

미국 특허 제5,760,395호

미국 특허 제5,801,005호

미국 특허 제5,824,311호

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Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe Gly Leu Lys Ile Ser Phe 130 135 140 Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu Ala Ala Ile Thr Pro Glu 145 150 155 160 Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr Asn Pro Thr Gln Lys Val 165 170 175 Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val His Lys His Gly Asp Ile 180 185 190 Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser Pro Tyr Phe Gln Arg Pro 195 200 205 Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr Ser Ala Thr Lys Tyr Met 210 215 220 Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu Val Ser Val Asn Cys Glu 225 230 235 240 Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln Asn Ser Leu Gly Ala Val 245 250 255 Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn Arg Gly Leu Lys Thr Leu 260 265 270 His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn Gly Met Ala Val Ala Gln 275 280 285 Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys Val Ile Tyr Pro Gly Leu 290 295 300 Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys Arg Gln Cys Thr Gly Cys 305 310 315 320 Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly Thr Leu Gln His Ala Glu 325 330 335 Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly 340 345 350 Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala Ile Met Thr His Ala Ser 355 360 365 Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly Ile Ser Asp Thr Leu Ile 370 375 380 Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu Asp Leu Leu Glu Asp Leu 385 390 395 400 Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro Ser Gly Ser His Ser 405 410 415

Claims (14)

1. 시스틴뇨증을 갖거나 발병할 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법으로서, 원상태 영장류 CGL 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1 및 7-10 참조)에 대해 적어도 2종의 치환을 갖는, 단리된, 변형된 영장류 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL) 효소를 포함하는 치료적 유효량의 제형을 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 적어도 2종의 치환은 단리된, 변형된 영장류 시스타티오닌-γ-분해효소(CGL) 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 또는 원상태 영장류 CGL 서열의 위치 59에서의 트레오닌 및 위치 339에서의 발린을 포함하는, 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 효소는 이종성 펩타이드 절편을 추가로 포함하는, 방법.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 이종성 펩타이드 절편은 XTEN 펩타이드, IgG Fc, 알부민 또는 알부민 결합 펩타이드인, 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 효소는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 커플링되는, 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 효소는 하나 이상의 라이신 또는 시스틴 잔기를 통해 PEG에 커플링되는, 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 L-시스틴 및/또는 L-시스테인 제한된 식이로 유지되는, 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 메티오닌-제한된 식이로 유지되는, 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 정상 식이로 유지되는, 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 인간 환자인, 방법.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 설치류인, 방법.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 제형은 정맥내로, 진피내로, 동맥내로, 복강내로, 병소내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 늑막내로, 기관내로, 안구내로, 비강내로, 초자체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 방광내로, 점막으로, 심막내로, 탯줄내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속적 주입에 의해, 표적 세포를 직접 배씽(bathing)하는 국소화된 관류에 의해, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해, 투여되는, 방법.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체는 시스틴뇨증에 대해 이전에 치료되었고, 시스테인뇨증의 재발을 방지하기 위해 효소가 투여되는, 방법.
13. 청구항 1에 있어서, 상기 대상체에게 적어도 두번째 시스틴뇨증 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 두번째 시스틴뇨증 요법은 외과적 요법 또는 충격파 요법인, 방법.
    

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