CN109562178A - 用于治疗胱氨酸尿症患者的人类酶介导的胱氨酸剔除 - Google Patents

用于治疗胱氨酸尿症患者的人类酶介导的胱氨酸剔除 Download PDF

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Abstract

本专利描述了涉及具有L‑半胱氨酸/L‑胱氨酸降解酶活性的蛋白质的工程化的方法和组合物。例如，在某些方面，可公开包含一个或多个氨基酸置换并且能够降解L‑半胱氨酸/L‑胱氨酸的经修饰的胱硫醚‑y‑裂合酶。此外，本发明的某些方面提供了使用所公开的蛋白质或核酸来治疗L‑半胱氨酸/L‑胱氨酸相关癌症的组合物和方法。

Description

用于治疗胱氨酸尿症患者的人类酶介导的胱氨酸剔除
本专利申请要求2016年7月6日提交的美国临时申请号62/359,018的优先权权益，该临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
合作研究协议的缔约方
本文公开和要求保护的发明是在Aeglea生物治疗公司(AegleaBioTherapeutics,Inc.)和德克萨斯大学系统董事会(The Board of Regents of TheUniversity of Texas System)之间的合作研究协议的范围内开发的。
发明背景
1.发明领域
本发明整体涉及医学和生物学领域。更具体地讲，它涉及具有高半胱氨酸/胱氨酸降解活性和适用于人类治疗的稳定性的灵长类动物酶的工程化。甚至更具体地讲，它涉及使用剔除L-胱氨酸和L-半胱氨酸的酶来治疗胱氨酸尿症的组合物和方法。
2.相关领域的描述
胱氨酸尿症是由编码肾近端小管的胱氨酸和二价氨基酸转运体的SLC3A1和SLC7A9基因突变导致的遗传病，所述突变导致胱氨酸(氨基酸半胱氨酸的二硫化物形式)的异常分泌并在泌尿道中形成胱氨酸结晶/结石。可用于治疗患有遗传病胱氨酸尿症(其中缺陷性肾转运体在肾滤过期间不能重新摄入胱氨酸)的患者的方法很少。胱氨酸(即氨基酸L-半胱氨酸的二硫化物形式)是高不溶性的，并且在胱氨酸尿症患者的泌尿道中达到高浓度，导致形成胱氨酸结晶和结石。减少循环胱氨酸水平的现有疗法部分防止了泌尿道结石形成，但具有限制其用途的显著副作用。
发明内容
本发明涉及利用工程化的人胱硫醚-γ-裂合酶的方法，所述胱硫醚-γ-裂合酶将胱氨酸有效地转化为半胱氨酸过硫化物，随后分解为游离的半胱氨酸和H2S，从而使该方法成为通过防止肾和泌尿道中的胱氨酸积聚和结石形成来治疗胱氨酸尿症患者的合适疗法。由于胱氨酸是通常由大多数细胞产生的非必需氨基酸，未发现动物模型中的长期胱氨酸剔除会产生毒性。同样，由于该酶由人类序列构成，不可能诱导不利免疫反应。胱氨酸降解治疗剂以非毒性方式消除循环胱氨酸的总水平的能力表明，它是优于现有治疗方案的防止胱氨酸结石形成的实施方案。
本发明涉及灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的工程化，以使得来自血清的L-胱氨酸和L-半胱氨酸(本文称为L-半胱氨酸/L-胱氨酸)均可有效地降解，并在适用于人类癌症治疗的制剂中提供经修饰的CGL酶。为了开发显示出与天然酶相比低KM和高催化活性kcat的酶，本发明人通过修饰所选的氨基酸来改造天然酶，所述修饰产生具有显著改善的酶学性质的酶。因此，本文所述的修饰的CGL酶通过提供新型酶来克服本领域的主要缺陷，与天然酶相比，所述新型酶包含具有L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解催化活性的人类或灵长类动物多肽序列。因此，这些经修饰的酶可适用于癌症治疗，并具有低免疫原性和改善的血清稳定性。
因此，在一个实施方案中，提供了经修饰的多肽，特别是具有L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的酶变体，所述L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性来源于涉及胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的灵长类动物酶。例如，酶变体可具有选自SEQ ID NO:2-6的氨基酸序列。例如，变体可以来源于人类酶，诸如人类CGL。在某些方面，可存在包含能够降解L-半胱氨酸/L-胱氨酸经修饰的灵长类动物CGL的多肽。在一些实施方案中，多肽能够在生理条件下降解L-半胱氨酸/L-胱氨酸。例如，多肽可具有至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、105、106s-1M-1或可在其中推导的任何范围的L-半胱氨酸/L-胱氨酸的催化效率(kcat/KM)。
未修饰的多肽可以是天然CGL，特别是人类同种型或其他灵长类动物同种型。例如，天然人类CGL可具有SEQ ID NO:1的序列。其他天然灵长类动物CGL的非限制性实例包括苏门达腊猩猩(Pongo abelii)CGL(Genbank ID:NP_001124635.1；SEQ ID NO:7)、食蟹猕猴(Macaca fascicularis)CGL(Genbank ID:AAW71993.1；SEQ ID NO:8)、黑猩猩(Pantroglodytes)CGL(Genbank ID:XP_513486.2；SEQ ID NO:9)和倭黑猩猩(Pan paniscus)CGL(Genbank ID:XP_003830652.1；SEQ ID NO:10)。示例性天然多肽包括与SEQ ID NO:1或7-10或其片段具有约、至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或可在其中推导的任何范围)的序列。例如，天然多肽可包含SEQID NO:1或7-10的序列的至少或多达约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、405个残基(或可在其中推导的任何范围)。
在一些实施方案中，天然CGL可通过一种或多种其他修饰(诸如化学修饰、置换、插入、缺失和/或截短)来进行修饰。在一个特定实施方案中，天然CGL可通过置换来修饰。例如，置换的数量可以为一个、两个、三个、四个或更多个。在其他实施方案中，天然CGL可在底物识别位点或可影响底物特异性的任何位置修饰。例如，经修饰的多肽可在SEQ ID NO:1或7-10的氨基酸位置59和/或339对应的氨基酸位置具有至少一个氨基酸置换。在这些实例中，每个序列的第一个甲硫氨酸对应于氨基酸位置1，并且每个氨基酸从其顺序编号。
在某些实施方案中，氨基酸位置59和/或339处的置换是苏氨酸(T)或缬氨酸(V)。在特定实施方案中，修饰是选自59T和339V的一个或多个置换。在另一个实施方案中，置换可包括59T置换。在又一个实施方案中，置换可包括另外的339V置换。
在一些实施方案中，天然CGL可以是人类CGL。在一个特定实施方案中，置换可包括人类CGL的E59T和E339V的组合(例如，具有SEQ ID NO:2、其片段或同源物的氨基酸序列的经修饰的多肽)。在另外的实施方案中，经修饰的多肽可以是苏门达腊猩猩CGL-TV突变体(SEQ ID NO:3)、食蟹猕猴CGL-TV突变体(SEQ ID NO:4)、黑猩猩CGL-TV突变体(SEQ ID NO:5)或倭黑猩猩CGL-TV突变体(SEQ ID NO:6)。
上文讨论的经修饰的多肽可表征为与未修饰的多肽(例如，天然多肽)或本文公开的任何多肽序列相比具有一定百分比的同一性。例如，未修饰的多肽可包含天然灵长类动物CGL(即，人类、苏门达腊猩猩、食蟹猕猴、黑猩猩或倭黑猩猩CGL)的至少或多达约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、405个残基(或可在其中推导的任何范围)。经修饰的多肽的未修饰的部分(即，经修饰的多肽的序列，不包括氨基酸59和/或339处的任何置换)和对应的天然多肽之间的同一性百分比可为约、至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或可在其中推导的任何范围)。还设想，与多肽的未修饰区相比，上文讨论的同一性百分比可与多肽的特定修饰区有关。例如，多肽可含有CGL的经修饰的或突变型底物识别位点，所述底物识别位点可基于CGL的经修饰的或突变型底物识别位点的氨基酸序列与来自相同物种或跨物种的未修饰的或突变型CGL的氨基酸序列的同一性来表征。例如，经修饰的或突变型人类多肽表征为与未修饰的CGL具有至少90％同一性意指在所述经修饰的或突变型人类多肽中至少90％的氨基酸与未修饰的多肽中的氨基酸相同。
在一些方面，本发明还设想了包含连接至异源氨基酸序列的经修饰的CGL的多肽。例如，经修饰的CGL可连接至异源氨基酸序列作为融合蛋白。在一个特定实施方案中，经修饰的CGL可连接至氨基酸序列(诸如IgG Fc、白蛋白、白蛋白结合肽或XTEN多肽)，用于增加体内半衰期。
为了提高血清稳定性，经修饰的CGL可连接至一个或多个聚醚分子。在一个特定实施方案中，聚醚可以是聚乙二醇(PEG)。经修饰的多肽可经由特定氨基酸残基(诸如赖氨酸或半胱氨酸)连接至PEG。关于治疗性施用，这种包含经修饰的CGL的多肽可分散于药学上可接受的载剂中。
在一些方面，设想了编码这种经修饰的CGL的核酸。在一个方面，核酸已经针对在细菌中表达进行密码子优化。在特定实施方案中，细菌是大肠杆菌(E.coli)。在其他方面，核酸已经针对在真菌(例如，酵母)中、在昆虫细胞中或在哺乳动物细胞中表达进行密码子优化。本发明还设想了含有此类核酸的载体，诸如表达载体。在特定实施方案中，编码经修饰的CGL的核酸可操作地连接至启动子，包括但不限于异源启动子。在一个实施方案中，经修饰的CGL可通过载体(例如，基因治疗载体)递送至靶细胞。此类病毒已经通过重组DNA技术进行修饰以使经修饰的编码CGL的核酸能够在靶细胞中表达。这些载体可来源于非病毒(例如，质粒)或病毒(例如，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)起源的载体。非病毒载体优选地与试剂复合以促进DNA的跨细胞膜进入。此类非病毒载体复合物的实例包括与聚阳离子试剂的制剂，所述聚阳离子试剂促进DNA和基于脂质的递送系统的缩合。基于脂质的递送系统的实例将包括核酸的基于脂质体的递送。
在其他方面，本发明还设想包含此类载体的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌(例如大肠杆菌)、真菌细胞(例如酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，将载体引入用于表达经修饰的CGL的宿主细胞中。蛋白质可以任何合适方式表达。在一个实施方案中，蛋白质在宿主细胞中表达，以使得所述蛋白质糖基化。在另一个实施方案中，蛋白质在宿主细胞中表达，以使得所述蛋白质非糖基化。
在一些实施方案中，多肽或核酸在包含药学上可接受的载剂的药物制剂中。多肽可以是天然灵长类动物CGL多肽或经修饰的CGL多肽。核酸可以编码天然灵长类动物CGL多肽或经修饰的CGL多肽。
在一个实施方案中，提供了治疗患有胱氨酸尿症或具有患上胱氨酸尿症的风险的受试者的方法，包括将治疗有效量的包含分离的、经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的制剂施用于受试者，所述经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶相对于天然灵长类动物CGL氨基酸序列具有至少两个置换(参见SEQ ID NO:1和7-10)，所述至少两个置换包括天然灵长类动物CGL序列或包含编码分离的、经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的核苷酸序列的核酸的位置59处的苏氨酸和位置339处的缬氨酸。在一些方面，酶还包含异源性肽段，诸如XTEN肽、IgG Fc、白蛋白或白蛋白结合肽。在一些方面，酶偶联至聚乙二醇(PEG)。在一些方面，酶经由一个或多个赖氨酸或胱氨酸残基偶联至PEG。
受试者可以是任何动物，诸如小鼠。例如，受试者可以是哺乳动物，具体地讲灵长类动物，以及更具体地讲人类患者。在某些方面，受试者或患者可以甲硫氨酸限制饮食或正常饮食维持。
在一些方面，受试者先前已经受胱氨酸尿症治疗，并且施用酶以预防胱氨酸尿症的复发。在一些方面，方法还包括将至少第二胱氨酸尿症疗法施用于受试者。在一些方面，第二胱氨酸尿症疗法是手术疗法或冲击波疗法。
本发明的某些方面还设想了通过施用天然灵长类动物CGL肽、基因治疗载体形式的编码天然灵长类动物CGL肽的核酸、经修饰的CGL肽、基因治疗载体形式的编码经修饰的CGL的核酸或本发明的制剂来治疗的方法，特别是治疗肿瘤细胞或患癌受试者的方法。受试者可以是任何动物，诸如小鼠。例如，受试者可以是哺乳动物，具体地讲灵长类动物，以及更具体地讲人类患者。在一些实施方案中，方法可包括选择具有癌症的患者。在某些方面，受试者或患者可以L-半胱氨酸/L-胱氨酸限制饮食或正常饮食维持。
在一些实施方案中，癌症是对L-半胱氨酸/L-胱氨酸剔除敏感的任何癌症。在一个实施方案中，本发明设想了一种治疗肿瘤细胞或癌症患者的方法，包括施用包含这种多肽的制剂。在一些实施方案中，施用在一定条件下发生，使得癌症的至少一部分细胞被杀死。在另一实施方案中，制剂包含在生理条件下具有L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性并且还包含所连接的聚乙二醇链的这种经修饰的CGL。在一些实施方案中，制剂是包含上文讨论的CGL变体中的任一者和药学上可接受的赋形剂的药物制剂。此类药学上可接受的赋形剂是本领域的技术人员熟知的。所有上述CGL变体均可设想为适用于人类治疗。
在另一个实施方案中，还可提供一种治疗肿瘤细胞的方法，包括施用包含具有L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的非细菌(哺乳动物，例如灵长类动物或小鼠)经修饰的CGL或编码其的核酸的制剂。
因为肿瘤细胞依赖于其对于L-半胱氨酸/L-胱氨酸的营养培养基，所以施用或治疗可针对用于细胞的营养源，并且不需要针对细胞本身。所以，在体内应用中，治疗肿瘤细胞包括使用于肿瘤细胞群的营养培养基接触工程化的(即，经修饰的)CGL。在这个实施方案中，培养基可以是其中需要L-半胱氨酸/L-胱氨酸剔除的血液、淋巴液、脊髓液以及类似的体液。
根据本发明的某些方面，含有经修饰的CGL的这种制剂可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、滑膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐带内、眼内、口服、经表面、通过吸入、输注、连续输注、局部灌注、经由导管、经由灌洗、在脂质组合物(例如，脂质体)中或通过本领域的普通技术人员已知的其他方法或前述的任何组合施用。
在另一个实施方案中，方法也可包括将至少第二抗癌疗法施用于受试者。第二抗癌疗法可以是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
在一个实施方案中，提供了包含经修饰的CGL或编码经修饰的CGL的核酸的组合物，用于治疗受试者中的肿瘤。在另一个实施方案中，提供了使用经修饰的CGL或编码经修饰的CGL的核酸制造用于肿瘤治疗的药物的用途。所述经修饰的CGL可以是该实施方案的任何经修饰的CGL。
在本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方案可关于本文所述的任何其他方法或组合物使用。因此，关于一种方法或组合物的实施方案也可应用于本发明的其他方法和组合物。
如本文所用，关于核酸的术语“编码(encode)”或“编码(encoding)”用于使本发明可容易地由熟练技术人员理解；然而，这些术语可分别与“包含”或“包括”互换使用。
如本文所用，就指定组分而言，“基本上不含”在本文中用于指任何指定组分都不有目的地配制为组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，任何不期望的组合物污染导致的指定组分的总量也小于0.05％，优选地小于0.01％。最优选的是其中不能用标准分析方法检测到指定组分的量的组合物。
如本文说明书中所用，“一个”或“一种”可意指一个(种)或多个(种)。如本文权利要求书中所用，当结合词语“包含”使用时，词语“一个”或“一种”可以指一个(种)或超过一个(种)。
除非明确指出仅指替代物或替代物是相互排斥的，否则在权利要求书中术语“或”的使用是用于指“和/或”，但是本公开支持仅指替代物的定义以及“和/或”。如本文所用，“另一个(种)”可以指至少第二个(种)或更多个(种)。
在本申请通篇中，术语“约”用于指数值包括装置的固有误差变化、用于确定该值的方法或研究受试者中存在的变化。
从以下具体实施方式中，本发明的其他目标、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，具体实施方式和具体实例，虽然指出了本发明的优选的实施方案，但仅以说明的方式给出，因为从该具体实施方式中，本发明的精神和范围内的许多变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合本文提出的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1.在给药方案的过程中，单次收集尿液中胱氨酸结晶的数量分析。
图2.在给药前和给药后，单次收集尿液中胱氨酸结晶的数量分析。
图3.在给药方案的过程中，泌尿半胱氨酸/肌酸酐的水平分析。
具体实施方式
半胱氨酸被认为是非必需氨基酸，因为它可以经由转硫化途径从来源于必需氨基酸L-甲硫氨酸的高半胱氨酸合成，所述转硫途径包括酶，即胱硫醚-β-合酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)。因此，预期半胱氨酸的剔除对具有完整转硫化途径的正常组织相对无毒。
胱氨酸尿症是由编码肾近端小管的胱氨酸和二价氨基酸转运体的SLC3A1和SLC7A9基因突变导致的遗传病，所述突变导致胱氨酸(氨基酸半胱氨酸的二硫化物形式)的异常分泌并在泌尿道中形成胱氨酸结晶/结石。可获得几种胱氨酸尿症的小鼠模型，包括Slc7a9敲除小鼠、Slc3a1敲除小鼠、D140G Slc3a1突变小鼠、和E383K Slc3a1突变小鼠(Feliubadalo等人,2003；Ercolani等人,2010；Peters等人,2003；Livrozet等人,2014，每篇文献以引用的方式整体并入本文)。来自129S2/SvPasCrl的Slc3a1基因组DNA的序列分析揭示了129S2/SvPasCrl小鼠中的外显子7中的纯合子突变。A1232G点突变是高度保守序列中的错义突变(c.1232G>A)。因此，位置383的谷氨酰胺将置换赖氨酸(p.E383K)。该置换位于rBAT的胞外部分中，并且在129S2/SvPasCrl小鼠中负责rBAT表达的丧失和胱氨酸尿症(Livrozet等人,2014)。位置383的谷氨酰胺在各种物种中是高度保守的。
胱氨酸尿症患者具有低生活质量、终身具有胱氨酸结石形成的风险、肾功能受损，并且通常需要反复手术干预。目前没有针对胱氨酸尿症的治疗方法，并且治疗针对增加胱氨酸溶解度和降低泌尿胱氨酸浓度。多尿是常见的疗法，然而它需要每天消耗>4升的水，并且尿体积>3升，这是难以实现和维持的。其他药物治疗(诸如小硫醇分子)通过与胱氨酸反应，以形成比胱氨酸更易溶的混合二硫化物来发挥功能，但具有显著毒性，诸如白细胞减少症、皮疹、发热、蛋白尿和肾炎综合征，这限制了它们的用途。
本发明提供了使用降解L-半胱氨酸/L-胱氨酸的工程化的治疗性酶来治疗疾病(诸如胱氨酸尿症)的方法。该方法从循环中除去胱氨酸，这在临床上显示出减少胱氨酸尿症患者中肾和泌尿胱氨酸结石形成的发生。本文所述的方法可使循环胱氨酸减少至检测水平以下，而不产生与目前胱氨酸尿症药物相关的副作用。
I.定义
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”是指包含经由肽键连接的氨基酸的化合物并且可互换使用。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指含有以非天然方式可操作地连接的蛋白质或蛋白质片段的嵌合蛋白。
如本文所用，术语“半衰期”(半生期)是指例如在注射于哺乳动物中之后，其多肽的浓度体外或体内下降一半所需的时间。
术语“以可操作的组合”、“以可操作的顺序”、和“可操作地连接”是指其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式发挥作用的关系的键合，例如以使得核酸分子能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的方式实现的核酸序列的键合，或以使得产生融合蛋白的方式实现的氨基酸序列的键合。
术语“接头”意指充当可操作地连接两种不同分子的分子桥的化合物或部分，其中接头的一个部分可操作地连接至第一分子，并且其中接头的另一个部分可操作地连接至第二分子。
术语“聚乙二醇化”是指与聚乙二醇(PEG)缀合，鉴于聚乙二醇的高度生物相容性和修饰简易性，已广泛用作药物载剂。PEG可经由化学方法通过PEG链的末端的羟基连接(例如共价连接)至活性剂；然而，PEG本身仅限于每分子连接至多两分子活性剂。在另一种方法中，PEG和氨基酸的共聚物已经作为新型生物材料加以研究，所述生物材料将保留PEG的生物相容性，但将具有每个分子多个连接点的附加优势(因此提供较大的药物负载)，并且可以以合成方式设计以适合多种应用。
术语“基因”是指包含多肽或其前体的产生所需的控制和编码序列的DNA序列。多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码，以保留所需的酶活性。
术语“天然”是指基因、基因产物的典型形式，或当从自然存在来源分离时基因或基因产物的特征。天然形式是自然群体中最常见的形式，并且因此被任意地称为正常或野生型形式。相比之下，术语“经修饰的”、“变体”或“突变体”是指当与天然基因或基因产物相比时显示出序列和功能性质的修改(即，改变的特征)的基因或基因产物。
术语“载体”用于指核酸序列可插入其中，以引入细胞，并在其中复制的载剂核酸分子。核酸序列可以是“外源的”，这意指它是载体所引入的细胞外源的，或该序列与细胞中的序列同源，但通常未发现该序列处于宿主细胞核酸内的位置中。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒、和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域的技术人员将准备好通过标准重组技术构建载体(参见例如Maniatis等人,1988和Ausubel等人,1994，这两篇文献均以引用的方式并入本文)。
术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些情况下，RNA分子接着翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况下，这些序列例如在反义分子或核酶的产生中未翻译。表达载体可含有多种“控制序列”，所述控制序列是指在特定宿主细胞中可操作地连接的编码序列的转录和可能发生的翻译必需的核酸序列。除管理转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可以含有另外发挥其他功能并且如下所述的核酸序列。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在实现治疗效果的方法中所采用的治疗性组合物(诸如治疗性多核苷酸和/或治疗性多肽)的量。如整个本申请中所用，术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指关于这种病症的医学治疗，促进或增强受试者的良好状态的任何事物。这包括但不限于疾病的病征或症状的频率或严重性的降低。例如，胱氨酸尿症的治疗可涉及例如减小胱氨酸结石的大小、消除胱氨酸结石，或预防胱氨酸结石的形成。
如本文所用，术语“KM”是指关于酶的米-曼二氏(Michaelis-Menten)常数，并且定义为使给定酶在酶催化反应中产生其最大速度的一半的特异性底物的浓度。如本文所用，术语“kcat”是指转换数或每单位时间每个酶位点转化为产物的底物分子的数目，并且其中酶以最大效率工作。如本文所用，术语“kcat/KM”是特异性常数，它度量酶如何有效地将底物转化为产物。
术语“胱硫醚-γ-裂合酶”(CGL或胱硫醚酶)是指催化胱硫醚水解为半胱氨酸的任何酶。例如，其包括胱硫醚-γ-裂合酶的灵长类动物形式，或具体地讲，胱硫醚-γ-裂合酶的人形式。
“治疗”和“治愈”是指将治疗剂施用或应用于受试者或者对受试者实施程序或模式，用于获得疾病或健康相关病症的治疗益处。例如，治疗可包括施用药学上有效量的半胱氨酸酶/胱氨酸酶。
“受试者”和“患者”是指人类或非人类，诸如灵长类动物、哺乳动物、和脊椎动物。在特定实施方案中，受试者是人类。
II.胱硫醚-γ-裂合酶
裂合酶是催化各种化学键的断裂，通常形成新的双键或新的环结构的酶。例如，催化此反应的酶将是裂合酶：ATP→cAMP+PPi。裂合酶与其他酶的不同之处在于它们只需要一个底物来进行一个方向的反应，但需要两个底物来进行逆反应。
许多吡哆醛-5′-磷酸(PLP)依赖性酶涉及半胱氨酸、高半胱氨酸、和甲硫氨酸的代谢，并且这些酶形成进化相关家族，称为Cys/Met代谢PLP依赖性酶。这些酶是约400个氨基酸的蛋白质，并且PLP基团连接至位于多肽的中心位置的赖氨酸残基。此家族的成员包括胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)、胱硫醚-γ-合酶(CGS)、胱硫醚-β-裂合酶(CBL)、甲硫氨酸-γ-裂合酶(MGL)、O-乙酰基高丝氨酸(OAH)/O-乙酰基-丝氨酸(OAS)硫化氢解酶(OSHS)。所有酶的共通之处在于形成米氏(Michaelis)复合物，产生外部底物醛亚胺。反应的进一步过程通过特定酶的底物特异性确定。
例如，本发明人将特异性突变引入PLP依赖性裂合酶家族成员胱硫醚-γ-裂合酶中，以改变其底物特异性。以这种方式，产生具有从头降解L-胱氨酸和L-半胱氨酸的能力的变体。在其他实施方案中，还可设想用于产生新型L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的其他PLP依赖性酶的修饰。
胱硫醚-γ-裂合酶(CGL或胱硫醚酶)是将胱硫醚分解为半胱氨酸和α-酮基丁酸的酶。吡哆醛磷酸是这种酶的辅基。蛋白质工程用于将胱硫醚酶(其仅具有降解L-半胱氨酸和L-胱氨酸的弱活性)转化为可以高速率降解这些氨基酸酶(美国专利申请No.14/472,779，该专利以引用的方式整体并入本文)。
III.半胱氨酸酶/胱氨酸酶工程化
由于使用非人类蛋白质疗法在临床上出现的不期望的免疫原性效果，本发明人试图将治疗相关的胱氨酸/半胱氨酸降解活性改造为人类酶(即，改造具有针对胱氨酸/半胱氨酸的高kcat和低KM值并且还显示出有利的特异性的酶)。人类具有称为胱硫醚-γ-裂合酶(hCGL)的酶，其功能是催化哺乳动物转硫化途径在最后一步(Rao等人,1990)，即将L-胱硫醚转化为L-半胱氨酸、α-酮丁酸和氨。人类CGL也可以弱降解L-半胱氨酸及其二硫化物形式L-胱氨酸，使其成为工程化的理想候选物。使用结构和系统发生引导的诱变，将hCGL变体工程化为有效地水解L-半胱氨酸和L-胱氨酸。
一些实施方案涉及经修饰的蛋白质和多肽。特定实施方案涉及表现出至少一种可与未修饰型式相当的功能活性的经修饰的蛋白质或多肽，所述功能活性优选地为L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性。在其他方面，蛋白质或多肽可进一步修饰以增加血清稳定性。因此，当本申请涉及“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”的功能或活性时，本领域的普通技术人员将理解这包括例如相对于未修饰的蛋白质或多肽具有另外优势的蛋白质或多肽，所述另外优势诸如L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性。在某些实施方案中，未修饰的蛋白质或多肽是天然CGL，优选地人类CGL。特别设想了，涉及“经修饰的蛋白质”的实施方案可关于“经修饰的多肽”实施，反之亦然。
活性的确定可使用本领域的技术人员所熟悉的分析，具体地讲关于蛋白质的活性来实现，并且可包括为了比较目的，例如使用经修饰的或未修饰的蛋白质或多肽的天然和/或重组型式。例如，人类CGL将L-半胱氨酸缓慢降解为丙酮酸、氨和H2S，并且将L-胱氨酸转化为丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸(kcat/KM分别为～0.2s-1mM-1和0.5s-1mM-1)。硫代半胱氨酸还被非酶促降解为L-半胱氨酸和H2S。因此，L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性可以通过检测从L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的降解获得的任何底物的产生的任何分析，诸如使用3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)来检测丙酮酸来确定(Takakura等人,2004)。
在某些实施方案中，经修饰的多肽(诸如经修饰的CGL)可以基于其L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的增加来鉴定。例如，可鉴定未修饰的多肽的底物识别位点。此鉴定可基于结构分析或同源性分析。可产生涉及此类底物识别位点的修饰的突变体的群体。在另一个实施方案中，可以从突变体群体选择具有增加的L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的突变体。所需的突变体的选择可包括用于检测来自L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解的副产物或产物的方法。
经修饰的蛋白质可具有氨基酸的缺失和/或置换；因此，具有缺失的蛋白、具有置换的蛋白、以及具有缺失和置换的蛋白均为经修饰的蛋白质。在一些实施方案中，这些经修饰的蛋白质还可包括插入或添加的氨基酸，例如融合蛋白或具有接头的蛋白。“经修饰的缺失蛋白质”缺乏天然蛋白质的一个或多个残基，但可具有天然蛋白质的特异性和/或活性。“经修饰的缺失蛋白质”也可具有降低的免疫原性或抗原性。经修饰的缺失蛋白质的实例为具有从至少一个抗原区域(即，被确定为在特定生物体(诸如可施用经修饰的蛋白质的生物体类型)中具有抗原性的蛋白质的区域)缺失氨基酸残基的蛋白质。
置换或替换变体通常含有蛋白质内的一个或多个位点处的一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可设计为调节多肽的一种或多种特性，特别是其效应子功能和/或生物可用性。置换可以是或不可以是保守的，即一种氨基酸被具有类似形状和电荷的氨基酸替换。保守置换是本领域熟知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。
除缺失或置换之外，经修饰的蛋白质还可具有残基的插入，其通常涉及多肽中至少一个残基的添加。这可包括靶向肽或多肽或仅单一残基的插入。下文讨论了末端添加(称为融合蛋白)。
术语“生物学功能等同物”是本领域熟知的，并且在本文中进一步详细定义。因此，包括与对照多肽的氨基酸具有约70％和约80％之间或约81％和约90％之间或甚至约91％和约99％之间的同一性或功能等同性的氨基酸的序列，只要维持蛋白质的生物学活性即可。经修饰的蛋白质在某些方面可以具有与其天然对应物等同的生物学功能。
还应理解，氨基酸和核酸序列可包括另外的残基，诸如另外的N-或C-末端氨基酸或5′或3′序列，并且还基本上如本文所公开的序列之一所陈述，只要序列满足以上陈述的准则即可，包括维持蛋白表达所涉及的生物蛋白活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，所述核酸序列可以例如包括侧接编码区的5′或3′部分中的任一者的各种非编码序列，或可以包括已知出现于基因内的各种内部序列(即，内含子)。
据发现，被鉴定为具有降解L-胱氨酸和L-半胱氨酸二者的最高催化活性的一种特定变体具有以下突变：E59T(即R119R的同义密码子变化)和E339V。该变体称为hCGL-TV，并且与上文所述类似，使用1mL标度MBTH分析在100mM PBS缓冲剂中pH7.3和37℃下表征其降解L-半胱氨酸/L-胱氨酸的能力。在这些条件下，发现hCGL-TV变体以kcat＝1.0±0.05s-1、KM＝0.16±0.02mM以及kcat/KM＝6.3±1.0s-1mM-1降解L-胱氨酸。还发现hCGL-TV变体以kcat＝0.8±0.03s-1、KM＝0.25±0.04mM以及kcat/KM＝3.2±0.6s-1mM-1降解L-半胱氨酸。发现hCGL-TV变体人血清中具有非常高的稳定性，并且表观T0.5为228±6h。此外，发现对于DU145和PC3前列腺肿瘤细胞系，hCGL-TV具有的表观IC50值为～60nM。
IV.用于治疗的酶促L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解
在某些方面，多肽可用于通过剔除L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的新型酶来治疗疾病(诸如胱氨酸尿症)。本发明特别公开了使用具有L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的经修饰的CGL的治疗方法。本发明的某些实施方案提供了具有增加的治疗功效的L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的新型酶。
本发明的某些方面提供了用于治疗疾病的L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的经修饰的CGL。在一个实例中，经修饰的多肽可具有人类多肽序列并且因此可预防人类患者中的过敏性反应，允许重复给药，并且增加治疗功效。
例如，PEG-hCGL-TV可在96h内显著降低血清胱氨酸水平(>95％)，在48h内显著降低半胱氨酸水平(80％)。为了确定这一点，给雄性FVB小鼠腹膜内注射50mg/kg PEG-hCGL-TV，并在第0、1、2、4和6天处死(n＝5只/组)以收集血液和血清。将血清样品与10皮摩尔氘化胱氨酸和半胱氨酸的内标混合物混合，并使用OMEGATM离心装置3kDa截留超滤(Pall Life Biosciences)(Tiziani等人,2008；Tiziani等人,2013)。使用反相BEH C18、1.7μm、2.1×150mm柱(THERMO SCIENTIFICTM 1250UPLC,Waters Corporation,USA)对滤过的极性级分进行色谱分析，并引入与电喷雾电离偶联的EXACTIVETM PlusORBITRAPTM质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)。使用仪器提供的XCALIBURTM软件从50至700m/z质量范围以矩心MS模式获取数据。胱氨酸和半胱氨酸的相对浓度以平均值±SEM报告。
此外，PEG-hCGL-TV显示出吸收T1/2为大约23h，并且消除T1/2为40±7h。为了确定这一点，使用斑点印迹光密度测定技术，其中使用抗hCGL抗体(兔抗CTH Sigma#C8248)探测样品，然后加入抗兔IgG-FITC(Santa Cruz Biotechnology#sc-2012)，以在TYPHOONTM扫描仪(GE Healthcare)上通过488nm下的激发显象。使用ImageJ软件(Schneider等人,2012)，将样品的光密度测定带与相同印迹内已知量的PEG-hCGL-TV的滴定进行比较，以构建标准曲线并计算相对血清PEG-hCGL-TV水平。将数据与血管外施用模型拟合(Foye等人,2007；Stone等人,2012)。
剔除可以在哺乳动物的循环中体内进行，在期望剔除组织培养物或其他生物学培养基中的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的情况下体外进行，以及在体外操纵其中生物流体、细胞或组织的离体程序中进行，随后返回患者哺乳动物体内。从循环、培养基、生物流体或细胞中剔除L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸，以减少被处理材料可接触的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的量，因此包括在L-胱氨酸-和/或L-半胱氨酸降解条件下，使待剔除的材料接触L-胱氨酸-和/或L-半胱氨酸降解量的工程化的灵长类动物半胱氨酸酶/胱氨酸酶，以降解被接触材料中的环境L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸。
L-胱氨酸-和/或L-半胱氨酸降解效率可根据应用而广泛地变化，通常取决于材料中存在的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的量、所期望的剔除速率、以及材料对于暴露于半胱氨酸酶/胱氨酸酶的耐受性。材料中的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸水平，从而从材料剔除L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的速率，可容易地通过本领域熟知的多种化学和生物化学方法监测。示例性L-胱氨酸-和/或L-半胱氨酸降解量在本文中进一步描述，并且可在每毫升(mL)待处理的材料0.001至100个单位(U)工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶、优选地约0.01至10U、更优选地约0.1至5U工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的范围内。
L-胱氨酸-和/或L-半胱氨酸降解条件是与CGL酶的生物学活性相容的缓冲剂和温度条件，并且包括与酶相容的中等温度、盐和pH条件，例如生理条件。示例性条件包括约4-40℃、与约0.05至0.2M NaCl相当的离子强度以及约5至9的pH，而生理条件包括在内。
在一个实施方案中，体内接触通过给患者施用、通过静脉内或腹膜内注射治疗有效量的包含本发明的工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的生理可耐受组合物来实现，从而剔除患者中存在的循环L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸。
治疗有效量的工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶是计算为实现所期望的效果(即，剔除患者循环中的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸)的预定量。因此，本发明的工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的施用剂量范围是足以产生所期望的效果的那些。剂量不应大到引起不利的副作用，诸如高粘血症综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等等。一般来说，剂量将随着患者的年龄、健康状态、性别、和疾病程度而变化，并且可由本领域的技术人员确定。如果出现任何并发症，那么剂量可由个别医生调整。
例如，工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的治疗有效量可以是使得当在生理可耐受组合物中施用时足以实现每mL约0.001至约100个单位(U)、优选地大于约0.1U、以及更优选地每mL大于1U的工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的血管内(血浆)或局部浓度的量。典型剂量可基于体重施用，并且在约5-1000U/千克(kg)/天、优选地约5-100U/kg/天、更优选地约10-50U/kg/天、以及更优选地约20-40U/kg/天的范围内。
工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶可以通过注射或通过随时间逐渐输注来肠胃外施用。工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶可以静脉内、腹膜内、口服、肌肉内、皮下、腔内、透皮、经皮施用，可以通过蠕动装置递送，可以直接注射至泌尿道，或可以通过连接至可含有潜在生物传感器或L-半胱氨酸/L-胱氨酸的导管的泵施用。
含有工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的治疗性组合物通常静脉内施用，例如通过注射单位剂量。术语“单位剂量”当关于治疗性组合物使用时是指适合作为用于受试者的单位剂量的物理离散单位，各单位含有经计算以联合所需稀释剂(即，载剂或媒介物)产生所需治疗效应的预定量的活性材料。
组合物以可与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效量施用。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者的全身利用活性成分的能力、以及所需治疗效应的程度。需要施用的活性成分的精确量取决于专业人员的判断，并且对各个体来说是独特的。然而，用于全身性施用的合适剂量范围在本文中有所公开并且取决于施用路线。还设想了用于初始施用和加强注射的合适方案，并且所述方案的代表为初始施用、随后以一个或多个小时的时间间隔通过后续注射或其他施用进行重复给药。示例性多次施用在本文中有所描述，并且特别优选地维持工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的连续高血清和组织水平以及相反地L-半胱氨酸/L-胱氨酸的低血清和组织水平。或者，设想了足以维持血液中在体内疗法所规定的范围内的浓度的连续静脉内输注。
V.缀合物
本发明的组合物和方法涉及工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶，诸如通过与异源肽段或聚合物(诸如聚乙二醇)形成缀合物。在其他方面，工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶可连接至PEG，以增加酶的流体动力学半径，因此增加血清持续性。在某些方面，所公开的多肽可缀合至任何靶向试剂，诸如具有特异性和稳定结合至靶细胞上的外部受体或结合位点的能力的配体(例如，美国专利公布2009/0304666)。
A.融合蛋白
本发明的某些实施方案涉及融合蛋白。这些分子可具有在N-或C-末端连接至异源域的修饰的胱硫醚酶。例如，融合物也可采用来自其他物种的前导序列，以允许异源宿主中蛋白质的重组表达。另一种适用的融合物包括蛋白质亲和标签(诸如血清白蛋白亲和标签或六组氨酸残基)或免疫活性域(诸如抗体表位，优选地可切割)的添加，以促进融合蛋白的纯化。非限制性亲和标签包括聚组氨酸、甲壳素结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
在一个特定实施方案中，半胱氨酸酶/胱氨酸酶可以连接至增加体内半衰期的肽，诸如XTEN多肽(Schellenberger等人,2009)、IgG Fc域、白蛋白或白蛋白结合肽。
本领域的技术人员熟知产生融合蛋白的方法。此类蛋白质可以例如通过完全融合蛋白的从头合成或通过连接编码异源域的DNA序列、随后表达完整融合蛋白来产生。
恢复亲本蛋白的功能活性的融合蛋白的产生可通过将基因连接至编码肽接头的桥接DNA区段来促进，所述肽接头在串联连接的多肽之间剪接。接头将具有足以允许所得融合蛋白适当折叠的长度。
B.接头
在某些实施方案中，工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶可以使用双官能交联试剂化学缀合或在蛋白质水平上与肽接头融合。
双官能交联试剂已广泛用于多种目的，包括亲和基质的制备、不同结构的修饰和稳定化、配体和受体结合位点的鉴定和结构研究。合适的肽接头也可用于连接工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶，诸如Gly-Ser接头。
据证实，携带两个相同官能团的同源双官能试剂在诱导相同和不同的大分子或大分子的亚单位之间的交联，以及多肽配体与其特异性结合位点的连接方面高度有效。异源双官能试剂含有两个不同的官能团。通过利用两个不同官能团的差异反应性，可选择性和按顺序控制交联。双官能交联试剂可根据其官能团的特异性分类，例如氨基、巯基、胍、吲哚、羧基特异性基团。其中，涉及游离氨基基团的试剂由于其商业可用性、合成简易性、以及可应用该试剂的温和反应条件而特别受欢迎。
大多数的异源双官能交联试剂含有伯胺反应性基团和硫醇反应性基团。在另一个实例中，描述了异源双官能交联试剂和使用所述交联试剂的方法(美国专利No.5,889,155，该专利具体地以引用的方式整体并入本文)。交联试剂将亲核的酰肼残基与亲电的顺丁烯二酰亚胺残基组合，从而在一个实例中允许醛与游离的硫醇偶联。可以修饰交联试剂以交联各种官能团。
另外，本领域的技术人员已知的任何其他连接/偶联剂和/或机制均可用于组合灵长类动物工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶，例如抗体-抗原相互作用、抗生物素蛋白-生物素键、酰胺键、酯键、硫酯键、醚键、硫醚键、磷酸酯键、磷酰胺键、酸酐键、二硫化物键、离子和疏水性相互作用、双特异性抗体和抗体片段或它们的组合。
优选采用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知许多类型的含二硫键的接头可以成功地用于缀合靶向剂和治疗/预防剂。据证实，含有位阻型双硫键的接头在体内可产生较大的稳定性。因此，这些接头是一组连接剂。
除位阻交联剂之外，还可以采用与其一致的非位阻接头。不考虑含有或产生保护二硫化物，其他适用的交联剂包括SATA、SPDP、和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak和Thorpe,1987)。本领域中充分理解此类交联剂的使用。另一个实施方案涉及柔性接头的使用。
一旦肽发生化学缀合，通常即可将其纯化，以使缀合物与未缀合试剂和其他污染物分离。许多纯化技术可用于提供具有充分纯度的缀合物，以使其在临床上适用。
基于大小分离的纯化方法通常最有用，诸如凝胶过滤、凝胶渗透或高效液相色谱。也可使用其他色谱技术，诸如Blue-Sepharose分离。从包涵体纯化融合蛋白的常规方法可以是适用的，诸如使用弱清洁剂，诸如N-月桂酰基-肌氨酸钠(SLS)。
C.聚乙二醇化
在本发明的某些方面，公开了与工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的聚乙二醇化有关的方法和组合物。例如，工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶可以根据本文公开的方法聚乙二醇化。
聚乙二醇化是聚(乙二醇)聚合物链共价连接至另一个分子(通常为药物或治疗性蛋白)的过程。聚乙二醇化例行地通过将PEG的反应性衍生物与靶标大分子一起孵育来实现。PEG共价连接至药物或治疗性蛋白可对宿主的免疫系统“遮蔽”该试剂(降低的免疫原性和抗原性)或增加该试剂的流体动力学大小(溶液中的大小)，由此通过降低肾清除率来延长其循环时间。聚乙二醇化也可为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。
聚乙二醇化的第一步是PEG聚合物在一个或两个末端处的合适官能化。每个末端均用相同反应性部分活化的PEG称为“同源双官能的”，而如果存在的官能团不同，则PEG衍生物称为“异源双官能的”或“异源官能的”。制备PEG聚合物的化学活性或活化衍生物，以将PEG连接至所需分子。
用于PEG衍生物的合适官能团的选择基于将偶联至PEG的分子上的可用反应性基团的类型。对于蛋白质，典型反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和酪氨酸。也可以使用N-末端氨基基团和C-末端羧酸。
用于形成第一代PEG衍生物的技术通常使PEG聚合物与可与羟基反应的基团(通常为酸酐、酰氯、氯甲酸酯和碳酸酯)反应。在第二代聚乙二醇化化学中，更有效的官能团(诸如醛、酯、酰胺等等)可用于缀合。
由于聚乙二醇化的应用已经变得越来越先进和复杂，对于用于缀合的异源双官能PEG的需求已经增加。这些异源双官能PEG非常适用于连接其中需要亲水性、柔性、和生物相容性间隔基的两个实体。用于异源双官能PEG的优选端基是顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、胺、羧酸和NHS酯。
最常见的修饰剂或接头基于甲氧基PEG(mPEG)分子。其活性取决于将蛋白质修饰基团添加至醇末端。在一些情况下，聚乙二醇(PEG二醇)用作前体分子。随后在两个末端处修饰二醇，以产生异源二聚或同源二聚PEG连接分子。
蛋白质通常在亲核位点(诸如未质子化的硫醇(半胱氨酰残基)或氨基基团处)聚乙二醇化。半胱氨酰特异性修饰试剂的实例包括PEG顺丁烯二酰亚胺、PEG碘乙酸酯、PEG硫醇和PEG乙烯基砜。所有四者均在温和条件和中性至微碱性pH下具有强半胱氨酰特异性，但各自具有一些缺陷。通过顺丁烯二酰亚胺形成的硫醚可在碱性条件下稍微不稳定，因此使用这种接头的配制选择可能存在一些限制。通过碘PEG形成的硫代氨基甲酸酯键更稳定，但游离的碘可在一些条件下修饰酪氨酸残基。PEG硫醇与蛋白硫醇形成二硫键，但这种键也可在碱性条件下不稳定。PEG-乙烯基砜反应性与顺丁烯二酰亚胺和碘PEG相比相对缓慢；然而，所形成的硫醚键极稳定。其较慢反应速率也可使PEG-乙烯基砜反应更容易控制。
在天然半胱氨酰残基处的位点特异性聚乙二醇化很少进行，因为这些残基通常为二硫键的形式或为生物学活性所需。在另一个方面，定点诱变可用于掺入用于硫醇特异性接头的半胱氨酰聚乙二醇化位点。必须设计半胱氨酸突变，以使其可接近聚乙二醇化试剂并且在聚乙二醇化后仍具有生物学活性。
胺特异性修饰剂包括PEG NHS酯、PEG三氟乙基磺酸酯、PEG醛、PEG异硫氰酸酯等等。其均在温和条件下反应并且对氨基极具特异性。PEG NHS酯可能是一种更具反应性的试剂；然而，其高反应性可使聚乙二醇化反应在大规模下难以控制。PEG醛与氨基基团形成亚胺，随后用氰基硼氢化钠将亚胺还原为仲胺。不同于硼氢化钠，氰基硼氢化钠将不会还原二硫键。然而，这种化学品具有高度毒性并且必须谨慎地处置，特别是在其具有挥发性的较低pH下。
由于大多数蛋白质上的多个赖氨酸残基，位点特异性聚乙二醇化可具有挑战性。幸运的是，因为这些试剂与未质子化的氨基基团发生反应，所以有可能通过在较低pH下进行反应而将聚乙二醇化引向较低pK氨基基团。一般来说，α-氨基基团的pK比赖氨酸残基的ε-氨基基团小1-2个pH单位。通过在pH7或更低下使分子聚乙二醇化，通常可获得对N-末端的高选择性。然而，这仅在蛋白质的N-末端部分不为生物学活性所需的情况下可行。另外，聚乙二醇化的药代动力学有益效果通常强于体外生物学活性的显著损失，得到具有更大体内生物学活性的产物，而与聚乙二醇化化学无关。
当开发聚乙二醇化程序时，考虑多个参数。幸运的是，通常存在不超过四种或五种关键参数。优化聚乙二醇化条件的“实验设计”方法可为非常适用的。对于硫醇特异性聚乙二醇化反应，考虑的参数包括：蛋白质浓度、PEG与蛋白质之比(以摩尔计)、温度、pH、反应时间以及在一些情况下排氧量。(氧气可有助于通过蛋白质实现分子间二硫化物形成，这将降低聚乙二醇化产物的产率。)关于胺特异性修饰应考虑相同的因素(氧气除外)，不同的是，pH甚至可能更关键，特别是当靶向N-末端氨基基团时。
关于胺和硫醇特异性修饰，反应条件可影响蛋白质的稳定性。这可限制温度、蛋白质浓度、和pH。另外，在开始聚乙二醇化反应之前应已知PEG接头的反应性。例如，如果聚乙二醇化试剂仅为70％活性，那么所用的PEG的量应确保仅活性PEG分子计算在蛋白质与PEG反应化学计量中。
VI.蛋白质和肽
在某些实施方案中，本发明涉及包含至少一种蛋白质或肽(诸如工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶)的新型组合物。这些肽可包含于融合蛋白中或缀合至上文所述的试剂。
如本文所用，蛋白质或肽通常指但不限于大于约200个氨基酸直至从基因翻译的全长序列的蛋白质；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3至约100个氨基酸的肽。为了方便起见，术语“蛋白质”、“多肽”、和“肽”在本文中可互换使用。
如本文所用，“氨基酸残基”是指任何自然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或本领域已知的任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或肽的残基是连续的，而无任何中断氨基酸残基的序列的非氨基酸。在其他实施方案中，序列可包含一个或多个非氨基酸部分。在特定实施方案中，蛋白质或肽的残基的序列可被一个或多个非氨基酸部分中断。
因此，术语“蛋白质或肽”涵盖包含自然存在的蛋白质中存在的20种常见氨基酸中的至少一种，或至少一种经修饰的或不常见的氨基酸的氨基酸序列。
蛋白质或肽可通过本领域的技术人员已知的任何技术制备，所述技术包括通过标准分子生物技术来表达蛋白质、多肽或肽，从自然来源分离蛋白质或肽，或者化学合成蛋白质或肽。对应于各种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列此前已有所公开，并且可以在本领域的普通技术人员已知的计算机化数据库中找到。一种该数据库是美国国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库(可在万维网ncbi.nlm.nih.gov/访问)。用于已知基因的编码区可使用本文公开的或本领域的普通技术人员已知的技术扩增和/或表达。或者，蛋白质、多肽、和肽的各种商业化制剂是本领域技术人员已知的。
VII.核酸和载体
在本发明的某些方面，可以公开编码工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶或含有经修饰的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的融合蛋白的核酸序列。根据所用的表达系统，可基于常规方法选择核酸序列。例如，如果工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶来源于灵长类动物CGL，并且含有大肠杆菌中很少使用的多个密码子，那么其可干扰表达。因此，个别基因或其变体可针对大肠杆菌表达进行密码子优化。多种载体也可用于表达所关注的蛋白质，诸如工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶。示例性载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子或基于脂质体的载体。
VIII.宿主细胞
宿主细胞可以是可转化以允许工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶及其缀合物的表达和分泌的任何细胞。宿主细胞可以是细菌、哺乳动物细胞、酵母或丝状真菌。各种细菌包括埃希氏菌属(Escherichia)和芽孢杆菌属(Bacillus)。属于酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kiuyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)的酵母将可用作适当的宿主细胞。丝状真菌的各物种均可用作表达宿主，包括以下属：曲霉属(Aspergillus)、木霉菌属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、头孢霉属(Cephalosporium)、裸花草属(Achlya)、柄孢壳菌属(Podospora)、内座壳属(Endothia)、毛霉属(Mucor)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、和梨孢霉属(Pyricularia)。
可用的宿主生物的实例包括细菌，例如大肠杆菌MC1061、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BRB1的衍生物(Sibakov等人,1984)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)SAI123(Lordanescu,1975)或浅青紫链球菌(Streptococcus lividans)(Hopwood等人,1985)；酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH 22(Mellor等人,1983)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；以及丝状真菌，例如构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(Ward,1989)或里氏木霉(Trichodermareesei)(Penttila等人,1987；Harkki等人,1989)。
哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61)、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、海拉S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCCCRL1548)、SV40转化猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)、和鼠类胚细胞(NIH-3T3；ATCC CRL1658)。前述内容是说明性的，而非限制本领域已知的多种可能的宿主生物体。原则上，所有能够分泌的宿主均可使用，无论是原核生物还是真核生物。
表达工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶和/或其融合蛋白的哺乳动物宿主细胞在通常用于培养亲本细胞系的条件下培养。一般来说，细胞在含有生理盐和营养物的标准培养基(诸如标准RPMI、MEM、IMEM或DMEM)中培养，通常补充有5％-10％血清(诸如胎牛血清)。培养条件也是标准的，例如培养物在37℃下在固定或滚筒培养物中孵育，直至实现所需的蛋白质水平。
IX.蛋白质纯化
蛋白质纯化技术是本领域技术人员熟知的。这些技术在一个层面上涉及细胞、组织或器官至多肽和非多肽部分的均质化和粗分离。除非另外规定，否则所关注的蛋白质或多肽可使用色谱和电泳技术进一步纯化，以实现部分或完全纯化(或纯化至同质性)。特别适用于制备纯肽的分析方法是离子交换色谱、凝胶排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱、免疫亲和色谱、和等电点聚焦。纯化肽的特别有效方法是快速高效液相色谱(FPLC)或甚至高效液相色谱(HPLC)。
纯化的蛋白质或肽意指可与其他组分分离的组合物，其中蛋白质或肽相对于其自然获得状态纯化至任何程度。所以，分离的或纯化的蛋白质或肽还指从其可自然存在的环境中分离的蛋白质或肽。一般来说，“纯化的”将指已进行分级以除去各种其他组分的蛋白质或肽组合物，并且该组合物实质上保持其表达的生物学活性。在使用术语“实质上纯化的”的情况下，这个名称将指组合物，其中蛋白质或肽形成组合物的主要组分，诸如构成组合物中的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白质。
适用于蛋白质纯化的各种技术是本领域的技术人员熟知的。这些技术包括例如用硫酸铵、PEG、抗体等等沉淀，或通过热变性，然后离心；色谱步骤，诸如离子交换、凝胶过滤、逆相、羟磷灰石和亲和色谱；等电点聚焦；凝胶电泳；以及这些和其他技术的组合。如本领域中通常所知，据信进行各种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并且仍然产生制备实质上纯化的蛋白质或肽的合适方法。
根据本公开，用于定量蛋白质或肽的纯化程度的各种方法是本领域的技术人员已知的。这些方法包括例如确定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析来评估级分内的多肽的量。用于分析级分的纯度的优选方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性相比较，从而计算其中的纯度程度，所述纯度程度通过“纯化倍数”来评估。当然，用于表示活性的量的实际单位取决于被选为进行纯化的特定测定技术，以及所表达的蛋白质或肽是否表现出可检测的活性。
一般不要求蛋白质或肽将始终以其最纯状态提供。实际上，设想了实质上不太纯的产物可用于某些实施方案。部分纯化可通过组合使用较少的纯化步骤或通过利用相同的一般纯化方案的不同形式来实现。例如，预期利用HPLC装置进行的阳离子交换柱色谱通常得到大于利用低压色谱系统的相同技术的纯化“倍数”。表现出较低程度的相对纯化的方法可在蛋白质产物的总回收方面，或在维持所表达的蛋白质的活性方面具有优势。
在某些实施方案中，蛋白质或肽可以是分离的或纯化的，例如工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶、含有工程化的AAD的融合蛋白或聚乙二醇化后的工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶。例如，His标签或亲和表位可包含于这种工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶中，以促进纯化。亲和色谱是依赖于待分离的物质与其可特异性结合的分子之间的特异性亲和力的色谱程序。这是受体-配体的相互作用类型。柱材料通过使一种结合伴侣共价偶联至不溶性基质来合成。然后柱材料能够从溶液特异性吸附物质。洗脱通过将条件改为其中不发生结合的那些条件(例如，改变的pH、离子强度、温度等等)来发生。基质应为不吸附分子达到任何显著程度并且具有广泛范围的化学、物理、和热稳定性的物质。配体应以诸如不会影响其结合性质的方式偶联。配体还应提供相对紧密的结合。应有可能洗脱物质而不破坏样品或配体。
尺寸排阻色谱(SEC)是其中溶液中的分子基于其尺寸或以更具技术性的术语来说其流体动力学体积来分离的色谱方法。其通常适用于大分子或大分子复合物，诸如蛋白质和工业聚合物。通常，当水溶液用于通过柱输送样品时，该技术称为凝胶过滤色谱，与名称凝胶渗透色谱相对，该名称在有机溶剂用作流动相时使用。
SEC的潜在原理是不同尺寸的粒子以不同速率通过固定相洗脱(过滤)。这使粒子的溶液基于尺寸分离。只要所有粒子同时或几乎同时加载，相同尺寸的粒子应一起洗脱。各尺寸排阻柱具有可分离的分子量范围。排阻限将分子量限定在该范围的上端，并且是分子太大而不能捕获在固定相中的限制。渗透限将分子量限定在分离范围的下端，并且是尺寸足够小的分子可以完全穿透固定相的孔中，并且小于该分子质量的所有分子均过小以致于不能作为单一条带洗脱的限制。
高效液相色谱(或高压液相色谱，HPLC)是通常用于生物化学和分析化学以分离、鉴定、和定量化合物的柱色谱形式。HPLC利用容纳色谱填充材料(固定相)的柱、移动流动相通过柱的泵、以及显示分子的保留时间的检测器。保留时间根据固定相、所分析的分子、以及所用溶剂之间的相互作用而变化。
例如，每个构建可含有N-末端NcoI限制性位点、框内N-末端His6标签和C-末端EcoRI位点，以简化克隆。在克隆至pET28a载体(Novagen)之后，含有适当的hCGL表达载体的大肠杆菌(BL21)可生长直到达到OD600＝～0.5-0.6。此时，培养物可以转到25℃的振荡器中，并且用0.5mM IPTG诱导，并允许再表达蛋白质12h。然后可通过离心收集细胞沉淀并重悬于IMAC缓冲剂(10mM NaPO4/10mM咪唑/300mM NaCl，pH8)中。在通过弗氏(French)细胞压碎器裂解之后，裂解物可以在4℃20,000xg下离心20min，并将所得的上清液施用于镍IMAC柱，用10-20个柱体积的IMAC缓冲剂洗涤，然后用IMAC洗脱缓冲剂(50mM NaPO4/250mM咪唑/300mM NaCl，pH8)洗脱。然后在25℃下用10mM吡哆醛磷酸(PLP)孵育含有酶的级分一小时。然后使用10,000MWCO离心过滤装置(AMICONTM)，对蛋白质进行缓冲剂交换至100mM PBS、10％甘油、pH7.3溶液数次。可在液氮中闪冻hCGL酶或hCGL变体酶的等分试样，并储存在-80℃下。以这种方式纯化的hCGL或hCGL变体酶的均质性可以>95％，如通过SDS-PAGE和考马斯染色所评估。
X.药物组合物
设想了可以全身或局部施用新型半胱氨酸酶/胱氨酸酶。它们可以静脉内、鞘内和/或腹膜内施用。
不旨在通过治疗性制剂的特定性质来限制本发明。例如，此类组合物可与生理可耐受液体、凝胶或固体载剂、稀释剂、和赋形剂一起在制剂中提供。这些治疗性制剂可施用于哺乳动物，用于兽医用途，诸如家畜，以及以类似于其他治疗剂的方式施用于人类，用于临床用途。一般来说，治疗功效所需的剂量将根据使用类型和施用模式以及个别受试者的特殊需求而变化。
此类组合物通常制备为液体溶液或悬浮液，制备为注射剂。合适的稀释剂和赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油等等以及它们的组合。另外，如有需要，组合物可含有少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。
在设想临床应用的情况下，可能需要以适用于预期应用的形式制备包含蛋白质、抗体和药物的药物组合物。一般来说，药物组合物可包含有效量的溶解或分散于药学上可接受的载剂中的一种或多种CGL变体或另外的试剂。短语“药学或药理学上可接受的”是指当根据情况施用于动物(例如人类)时不会产生不利的、过敏或其他不适当反应的分子实体和组合物。根据本发明，含有通过本文公开的方法分离的至少一种CGL变体或另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域的技术人员已知的，如Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,1990所示例，该文献以引用的方式并入本文。此外，对于动物(例如，人类)施用，应当理解制剂应满足美国食品药品管理局生物标准办公室(FDA Office ofBiological Standards)所要求的无菌性、致热性、一般安全性、和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、此类类似材料及其组合，如本领域的普通技术人员所已知(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,1990，该文献以引用的方式并入本文)。除非任何常规载剂与活性成分不相容，否则设想其在药物组合物中的用途。
本发明的某些实施方案可包含不同类型的载剂，取决于其是否以固体、液体或气雾剂形式施用，以及其对施用路线(诸如注射)而言是否必需为无菌的。组合物可以静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、经粘膜、口服、经表面、局部、通过吸入(例如，气雾剂吸入)、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接浸泡靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、在脂质组合物(例如，脂质体)中或通过如所属领域的技术人员应已知的其他方法或前述的任何组合(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,1990，该文献以引用的方式并入本文)施用。
经修饰的多肽可以配制成游离、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如通过蛋白质组合物的游离氨基基团形成的那些，或通过无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的那些。通过游离羧基基团形成的盐也可以从无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)；或有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因)衍生。在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以诸如治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，诸如配制用于肠胃外施用，诸如注射溶液，或用于递送至肺的气雾剂，或配制用于饮食施用，诸如药物释放胶囊等等。
另外根据本发明的某些方面，适用于施用的组合物可以提供于具有或不具有惰性稀释剂的药学上可接受的载剂中。载剂应为可同化的，并且包括液体、半固体(即，糊剂)或固体载剂。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载剂对接受者或对其中所含的组合物的治疗有效性有害，否则其在用于实践方法的可施用组合物中的用途是适当的。载剂或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等等，或它们的组合。组合物也可包含各种抗氧化剂，以延迟一种或多种组分的氧化。另外，微生物作用的预防可通过防腐剂，诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它们的组合来实现。
根据本发明的某些方面，组合物与载剂以任何便利和实用的方式，即通过溶液、悬浮液、乳化、掺合物、封装、吸收等等组合。此类程序对于本领域的技术人员而言是常见的。
在本发明的一个特定实施方案中，组合物与半固体或固体载剂充分组合或混合。混合可以任何便利方式(诸如研磨)来实现。稳定剂也可添加于混合过程中，以保护组合物免于治疗活性丧失，即在胃中变性。用于组合物的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸(诸如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇等)。
在其他实施方案中，本发明可涉及包括CGL变体、一种或多种脂质、和水性溶剂的药物脂质媒介物组合物的使用。如本文所用，术语“脂质”将定义为包括特征在于不溶于水并且可使用有机溶剂萃取的广泛范围的物质中的任一者。这种广泛种类的化合物是本领域的技术人员熟知的，并且当本文使用术语“脂质”时，其不限于任何特定结构。实例包括含有长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是自然存在的或合成的(即，人工设计或产生的)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域熟知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫酯、具有醚和酯连接脂肪酸的脂质、可聚合脂质以及它们的组合。当然，组合物和方法还涵盖本领域的技术人员理解为脂质的不同于本文特别描述的那些的化合物。
本领域的普通技术人员应熟悉可用于将组合物分散于脂质媒介物中的技术的范围。例如，工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶或其融合蛋白可以分散于含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、共价连接至脂质、以悬浮液包含于脂质中、包含于胶束或脂质体中或与胶束或脂质体复合或者通过本领域的普通技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构缔合。分散可以或不可以引起脂质体的形成。
施用于动物患者的组合物的实际剂量可由的物理和生理因素(诸如体重、病症的严重性、所治疗的疾病的类型、先前或并行治疗介入、患者的自发病和施用路线)决定。根据剂量和施用路线，优选的剂量和/或有效量的施用次数可以根据受试者的反应而变化。负责施用的专业人员将在任何情况下确定组合物中活性成分的浓度和针对个别受试者的适当剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可以例如占单位重量的约2％至约75％之间，或约25％至约60％之间，以及可从其中推导的任何范围。当然，各治疗可用组合物中的活性化合物的量可以以例如在化合物的任何给定单位剂量中获得的合适剂量的方式准备。制备此类药物制剂的领域的技术人员将设想诸如溶解度、生物可用性、生物半衰期、施用路线、产品保存期的因素以及其他药物考虑，因此多种剂量和治疗方案可以是所期望的。
在其他非限制性实例中，剂量也可包含每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重至约1000毫克/kg/体重或更多，以及可从其中推导的任何范围。在可从本文所列的数目推导的范围的非限制性实例中，可根据上文所述的数目施用约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
例如，hCGL-TV酶可以通过使用在样品中含有0.1％TRITONTM 114的IMAC缓冲剂彻底洗涤结合的IMAC柱(90-100倍柱体积)来纯化。样品可以用10-20倍柱体积的IMAC缓冲剂再次洗涤，然后用IMAC洗脱缓冲剂(50mM NaPO4/250mM咪唑/300mM NaCl，pH8)洗脱。可以采用TRITONTM 114洗涤来除去内毒素。可以使用10,000MWCO过滤装置对纯化的蛋白质进行缓冲剂交换至100mM NaPO4缓冲剂pH8.3。其后，PLP可以以10mM的浓度添加，并在25℃下孵育蛋白质1h。然后可以以80:1的摩尔比将甲氧基PEG琥珀酰亚胺基羧甲基酯5000MW(JenKem Technology)加入hCGL-TV，并允许在25℃下恒定搅拌中反应1h。使用100,000MWCO过滤装置对所得的混合物进行广泛地缓冲剂交换(含10％甘油的PBS)，并且用0.2微米针筒过滤器(VWR)灭菌。使用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)试剂盒(Cape Cod Incorporated)分析所有聚乙二醇化酶的脂多糖(LPS)含量。
XI.组合治疗
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及施用半胱氨酸酶/胱氨酸酶与第二或另外疗法的组合。这种疗法可应用于治疗半胱氨酸酶/胱氨酸酶依赖性相关的任何疾病。例如，疾病可以是胱氨酸尿症。
方法和组合物(包括组合疗法)增强了治疗或保护作用，和/或增加了其他疗法的治疗效果。治疗性和预防性方法和组合物可以有效地实现所期望的效果(诸如消除泌尿道中的半胱氨酸结石)的组合量提供。该过程可涉及施用半胱氨酸酶/胱氨酸酶和第二疗法。组织、器官或细胞可暴露于包含一种或多种药剂(即，半胱氨酸酶/胱氨酸酶或第二药剂)的一种或多种组合物或药理学制剂，或通过使组织、器官、和/或细胞接触两种或更多种不同的组合物或制剂，其中一种组合物提供1)半胱氨酸酶/胱氨酸酶、2)第二药剂或3)半胱氨酸酶/胱氨酸酶和第二药剂二者。另外，设想了这种组合疗法可与冲击波疗法或手术疗法组合使用。
当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗构建体递送至靶器官或与靶细胞直接并列放置的过程。为了实现结石溶解，例如将两种药剂以有效溶解结石或预防其形成或再形成的组合量递送至细胞。
半胱氨酸酶/胱氨酸酶可以在相对于第二胱氨酸尿症治疗之前、期间、之后或以各种组合施用。施用可在同时至几分钟至几天至几周范围内的时间间隔中。在其中半胱氨酸酶/胱氨酸酶与第二胱氨酸尿症药剂分开提供给患者的实施方案中，一般将确保在每次递送的时间之间持续很长的一段时间，使得两种治疗仍能够对患者发挥有利组合效应。在这些情况下，设想可在彼此约12至24或72h内，更具体地讲在彼此约6-12h内向患者提供半胱氨酸酶/胱氨酸酶和第二胱氨酸尿症药剂。在一些情况下，可需要显著延长治疗的时间期，其中个别施用之间相隔几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
在某些实施方案中，治疗过程将持续1-90天或更长(此范围包括介入日)。设想半胱氨酸酶/胱氨酸酶可在第1天至第90天(此范围包括介入日)中的任一天或其任何组合给予，并且另一种治疗在第1天至第90天(此范围包括介入日)中的任一天或其任何组合给予。在一天(24小时时期)内，可给予患者一次或多次治疗施用。此外，在治疗过程之后，设想存在一段不施用治疗的时间期。此时间段可持续1-7天、和/或1-5周、和/或1-12个月或更长(此范围包括介入日)，取决于患者的健康状态，诸如其预后、体力、健康状态等。预期治疗循环根据需要重复。
可采用多种组合。对于以下实例，半胱氨酸酶/胱氨酸酶为“A”，第二胱氨酸尿症疗法为“B”：
考虑到试剂的毒性(如果有的话)，本发明实施方案的任何化合物或疗法向患者的施用将遵循关于此类化合物的施用的一般方案。所以，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。
A.手术
除去胱氨酸结石的最常用的方法之一是经皮肾镜取石术，其中在背部进行锁孔切开，并使用肾镜来分解和除去结石。虽然该手术侵入性低于开放手术，但通常需要定期或脊髓麻醉，并且住院时间为2至3天，恢复时间为几周。
B.冲击波疗法
胱氨酸尿症患者通常在其一生中经历结石形成的反复发作和手术。冲击波碎石术，即使用高能冲击波进行结石破碎，可用于治疗小于1.5cm的胱氨酸结石。胱氨酸结石在所有泌尿结石中是最坚固的，碎石术通常不能破坏。然而，较小的胱氨酸结石可以使用碎石术破碎，因为可使用能量更高、频率更高的冲击波。
C.药物疗法
药物疗法涉及使用含硫醇药物(诸如D-青霉胺、α-巯基丙酰基甘氨酸(Thiola)、和卡托普利)来破坏胱氨酸二硫键，形成溶解性更高的混合二硫化物。然而，这些药物通常给予患者各种令人不快的副作用，诸如胃肠不耐受、皮疹和关节疼痛(Sakhaee和Sutton,1996)。
D.其他方法
另外的治疗过程通常涉及泌尿胱氨酸水平的管理，以减少结石形成的风险。这些管理方法包括显著增加水的摄入量(从而增加尿量和可增溶的胱氨酸量)、甲硫氨酸(甲硫氨酸是胱氨酸的代谢前体)和钠的饮食限制，以及口服施用柠檬酸钾(以增加尿的pH，从而增加胱氨酸的溶解度)。
治疗胱氨酸结石的另外方法(非手术和微创路线)涉及经由肾造口术导管将化学溶液递送至肾，以进行结石的化学溶解，也称为化学溶解。该技术已使用多种化学溶解药剂，包括碳酸氢钠和有机缓冲剂三-羟基亚甲基-氨基甲烷(三羟基氨基甲烷-E)pH10，它们二者均用于提供强碱性环境，来溶解胱氨酸结石。乙酰半胱氨酸通常也用于化学溶解，以类似于D-青霉胺和Thiola的方式，通过破坏胱氨酸二硫化物，形成可溶性更高的二硫化物来溶解结石。然而，该溶解方法在治疗胱氨酸结石中的作用有限，因为这些化学溶解药剂作用速度极慢，通常需要几周至几个月来溶解结石(Ng和Streem,2001)。
XII.试剂盒
本发明的某些方面可提供试剂盒，诸如治疗试剂盒。例如，试剂盒可包含一种或多种本文所述的药物组合物以及任选地关于其使用的说明书。试剂盒还可包含一种或多种用于实现此类组合物的施用的装置。例如，主题试剂盒可包含药物组合物和用于实现向泌尿道直接静脉内注射组合物的导管。在其他实施方案中，主题试剂盒可包含任选地配制为药物或冻干的工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的预填充安瓿瓶，与递送装置一起使用。
试剂盒可包含具有标签的容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶、和试管。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器可容纳包括有效用于治疗性或非治疗性应用的工程化的半胱氨酸酶/胱氨酸酶的组合物，诸如上文所述。容器上的标签可指示组合物用于特定疗法或非治疗性应用，并且还可指示关于体内或体外使用的指导，诸如上文所述的那些。本发明的试剂盒将通常包含上文所述的容器和一个或多个包含从商业和使用者观点来说所需的材料的其他容器，所述材料包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
XIII.实施例
包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应当理解，下面的实施例中公开的技术表示发明人发现在本发明的实践中作用良好的技术，因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域的技术人员应认识到，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可以在公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。
实施例1–使用人类半胱氨酸酶/胱氨酸酶来治疗胱氨酸尿症的小鼠模型
在Slc3a1敲除小鼠中评估hCGL-TV预防或逆转泌尿道中结石形成的能力，先前已报道Slc3a1敲除小鼠在膀胱中并且在较小程度上在肾中患有胱氨酸结石(Ercolani等人,2010)。本研究项目所用的Slc3a1小鼠模型由Regeneron Pharmaceuticals,Inc.从ES细胞克隆16054A-G2创建，并由加利福尼亚大学戴维斯分校(University of CaliforniaDavis)的KOMP资源库(www.komp.org)克隆至小鼠(U42RR024244)。由Charles RiverLaboratory作为DTCC合作的一部分进一步繁育品系，并作为KOMP2项目的一部分提供给KOMP资源库(www.komp.org)。
两只分别具有16周和9周C57BL/6N背景的Scl3a1雄性小鼠接受腹膜内施用50mg/kg聚乙二醇化hCGL-TV每周三次达2周。动物研究根据Aeglea BioTherapeutics,Inc.IACUC进行。在治疗开始前(第-11天和第0天)和治疗期间(第4天、第7天、第9天)收集单次尿样，以确定hCGL-TV的施用是否防止或改善小鼠中的胱氨酸结石形成。通过亮视野显微镜在40x放大率下评估胱氨酸结晶，并从每个样品中一致的所关注的代表性区域对结晶的数量计数。图2和3以图形方式表示了可见的六方晶体的数量。在总氧化硫醇含量和蛋白质沉淀减少后，通过高效液相色谱(HPLC)测定尿中总半胱氨酸的浓度，然后使用7-氟苯并呋喃-4-磺酸铵盐推导减少的总硫醇含量。使用得自Sigma-Aldrich(MAK079)的肌酸酐测定试剂盒根据制造商的建议程序来测定泌尿肌酸酐。肌酸酐水平用于归一化泌尿总半胱氨酸水平。图1和表1提供了给药方案过程中的总半胱氨酸/肌酸酐水平。
表1.单次收集尿液中总半胱氨酸和肌酸酐的测定
***
根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法可以在没有过度实验的情况下进行和执行。虽然已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的前提下，可以对所述方法和在本文所述方法的步骤或步骤顺序上施加变化。更具体地讲，将显而易见的是，化学和生理相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类相似替代和修改被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围以及概念之内。
参考文献
以下参考文献在其提供对本文所阐述的那些方面补充的示例性程序或其他细节的程度上具体地以引用的方式并入本文。
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序列表
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(Board of Regents, The University of Texas System)
<120> 用于治疗胱氨酸尿症患者的人类酶介导的胱氨酸剔除
<130> UTFB.P1122WO
<140> 未分配
<141> 2017-07-06
<150> 62/359,018
<151> 2016-07-06
<160> 11
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 405
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln
1 5 10 15
His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp
20 25 30
Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys
35 40 45
Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly
50 55 60
Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly
65 70 75 80
Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr
85 90 95
Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp
100 105 110
Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe
115 120 125
Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu
130 135 140
Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val
165 170 175
His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser
180 185 190
Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr
195 200 205
Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu
210 215 220
Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln
225 230 235 240
Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn
245 250 255
Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn
260 265 270
Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys
275 280 285
Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys
290 295 300
Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly
305 310 315 320
Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr
325 330 335
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala
340 345 350
Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly
355 360 365
Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu
370 375 380
Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro
385 390 395 400
Ser Gly Ser His Ser
405
<210> 7
<211> 405
<212> PRT
<213> 苏门达腊猩猩
<400> 7
Met Gln Glu Lys Glu Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln
1 5 10 15
His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp
20 25 30
Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Pro Ile Ser Pro Ser Val Thr Phe Lys
35 40 45
Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Val Tyr Ser Arg Ser Gly
50 55 60
Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly
65 70 75 80
Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr
85 90 95
Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp
100 105 110
Val Tyr Ala Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe
115 120 125
Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu
130 135 140
Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Pro Thr Gln Lys Met Thr Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val
165 170 175
His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser
180 185 190
Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys
195 200 205
Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu
210 215 220
Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu Tyr Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln
225 230 235 240
Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn
245 250 255
Arg Gly Leu Lys Thr Leu Gln Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn
260 265 270
Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys
275 280 285
Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys
290 295 300
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305 310 315 320
Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr
325 330 335
Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala
340 345 350
Val Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Lys Asp Arg Asp Val Leu Gly
355 360 365
Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu
370 375 380
Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro
385 390 395 400
Ser Gly Ser His Ser
405
<210> 8
<211> 405
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴
<400> 8
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1 5 10 15
His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Glu Pro Glu Gln Trp
20 25 30
Thr Ser Arg Ala Val Val Pro Leu Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys
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50 55 60
Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly
65 70 75 80
Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr
85 90 95
Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp
100 105 110
Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe
115 120 125
Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Cys
195 200 205
Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu
210 215 220
Val Ser Val Asn Cys Glu Arg Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln
225 230 235 240
Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Leu Asp Cys Tyr Leu Cys Asn
245 250 255
Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn
260 265 270
Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Gly Val Glu Lys
275 280 285
Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Ala Lys
290 295 300
Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Ile Thr Phe Tyr Ile Lys Gly
305 310 315 320
Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr
325 330 335
Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Val Glu Leu Pro Ala
340 345 350
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355 360 365
Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Lys
370 375 380
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385 390 395 400
Ser Gly Ser His Asn
405
<210> 9
<211> 405
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<400> 9
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1 5 10 15
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Thr Ser Arg Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys
35 40 45
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50 55 60
Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly
65 70 75 80
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85 90 95
Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp
100 105 110
Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe
115 120 125
Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu
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Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val
165 170 175
His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser
180 185 190
Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr
195 200 205
Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu
210 215 220
Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln
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Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn
245 250 255
Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn
260 265 270
Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys
275 280 285
Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys
290 295 300
Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly
305 310 315 320
Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr
325 330 335
Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala
340 345 350
Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly
355 360 365
Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu
370 375 380
Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro
385 390 395 400
Ser Gly Ser His Ser
405
<210> 10
<211> 405
<212> PRT
<213> 倭黑猩猩
<400> 10
Met Gln Glu Lys Asp Ala Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln
1 5 10 15
His Phe Ala Thr Gln Ala Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp
20 25 30
Thr Ser Lys Ala Leu Val Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys
35 40 45
Gln Gly Ala Pro Gly Gln His Ser Gly Phe Glu Tyr Ser Arg Ser Gly
50 55 60
Asn Pro Thr Arg Asn Cys Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly
65 70 75 80
Ala Lys Tyr Cys Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr
85 90 95
Ile Thr His Leu Leu Lys Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp
100 105 110
Val Tyr Gly Gly Thr Asn Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe
115 120 125
Gly Leu Lys Ile Ser Phe Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu
130 135 140
Ala Ala Ile Thr Pro Glu Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Pro Thr Gln Lys Val Ile Asp Ile Glu Ala Cys Ala His Ile Val
165 170 175
His Lys His Gly Asp Ile Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser
180 185 190
Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Cys Met Tyr
195 200 205
Ser Ala Thr Lys Tyr Met Asn Gly His Ser Asp Val Val Ile Gly Leu
210 215 220
Val Ser Val Asn Cys Glu Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln
225 230 235 240
Asn Ser Leu Gly Ala Val Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn
245 250 255
Arg Gly Leu Lys Thr Leu His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn
260 265 270
Gly Met Ala Val Ala Gln Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys
275 280 285
Val Ile Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys
290 295 300
Arg Gln Cys Thr Gly Cys Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly
305 310 315 320
Thr Leu Gln His Ala Glu Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr
325 330 335
Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala
340 345 350
Ile Met Thr His Ala Ser Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly
355 360 365
Ile Ser Asp Thr Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu
370 375 380
Asp Leu Leu Glu Asp Leu Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro
385 390 395 400
Ser Gly Ser His Ser
405
<210> 11
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Met Gly Gly His His His His His His Gly Gly Gln Glu Lys Asp Ala
1 5 10 15
Ser Ser Gln Gly Phe Leu Pro His Phe Gln His Phe Ala Thr Gln Ala
20 25 30
Ile His Val Gly Gln Asp Pro Glu Gln Trp Thr Ser Arg Ala Val Val
35 40 45
Pro Pro Ile Ser Leu Ser Thr Thr Phe Lys Gln Gly Ala Pro Gly Gln
50 55 60
His Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Arg Ser Gly Asn Pro Thr Arg Asn Cys
65 70 75 80
Leu Glu Lys Ala Val Ala Ala Leu Asp Gly Ala Lys Tyr Cys Leu Ala
85 90 95
Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Val Thr Ile Thr His Leu Leu Lys
100 105 110
Ala Gly Asp Gln Ile Ile Cys Met Asp Asp Val Tyr Gly Gly Thr Asn
115 120 125
Arg Tyr Phe Arg Gln Val Ala Ser Glu Phe Gly Leu Lys Ile Ser Phe
130 135 140
Val Asp Cys Ser Lys Ile Lys Leu Leu Glu Ala Ala Ile Thr Pro Glu
145 150 155 160
Thr Lys Leu Val Trp Ile Glu Thr Pro Thr Asn Pro Thr Gln Lys Val
165 170 175
Ile Asp Ile Glu Gly Cys Ala His Ile Val His Lys His Gly Asp Ile
180 185 190
Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Met Ser Pro Tyr Phe Gln Arg Pro
195 200 205
Leu Ala Leu Gly Ala Asp Ile Ser Met Tyr Ser Ala Thr Lys Tyr Met
210 215 220
Asn Gly His Ser Asp Val Val Met Gly Leu Val Ser Val Asn Cys Glu
225 230 235 240
Ser Leu His Asn Arg Leu Arg Phe Leu Gln Asn Ser Leu Gly Ala Val
245 250 255
Pro Ser Pro Ile Asp Cys Tyr Leu Cys Asn Arg Gly Leu Lys Thr Leu
260 265 270
His Val Arg Met Glu Lys His Phe Lys Asn Gly Met Ala Val Ala Gln
275 280 285
Phe Leu Glu Ser Asn Pro Trp Val Glu Lys Val Ile Tyr Pro Gly Leu
290 295 300
Pro Ser His Pro Gln His Glu Leu Val Lys Arg Gln Cys Thr Gly Cys
305 310 315 320
Thr Gly Met Val Thr Phe Tyr Ile Lys Gly Thr Leu Gln His Ala Glu
325 330 335
Ile Phe Leu Lys Asn Leu Lys Leu Phe Thr Leu Ala Val Ser Leu Gly
340 345 350
Gly Phe Glu Ser Leu Ala Glu Leu Pro Ala Ile Met Thr His Ala Ser
355 360 365
Val Leu Lys Asn Asp Arg Asp Val Leu Gly Ile Ser Asp Thr Leu Ile
370 375 380
Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Glu Glu Asp Leu Leu Glu Asp Leu
385 390 395 400
Asp Gln Ala Leu Lys Ala Ala His Pro Pro Ser Gly Ser His Ser
405 410 415

Claims (14)

1.一种治疗患有胱氨酸尿症或具有患上胱氨酸尿症的风险的受试者的方法，包括将治疗有效量的包含分离的、经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的制剂施用于所述受试者，所述经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶相对于天然灵长类动物CGL氨基酸序列具有至少两个置换(参见SEQ ID NO:1和7-10)，所述至少两个置换包括所述天然灵长类动物CGL序列或包含编码所述分离的、经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的核苷酸序列的核酸的位置59处的苏氨酸和位置339处的缬氨酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述酶还包含异源肽段。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述异源肽段是XTEN肽、IgG Fc、白蛋白或白蛋白结合肽。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述酶偶联至聚乙二醇(PEG)。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述酶经由一个或多个赖氨酸或胱氨酸残基偶联至PEG。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者以L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸限制饮食维持。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者以甲硫氨酸限制饮食维持。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者以正常饮食维持。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人类患者。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是啮齿动物。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述制剂静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐带内、口服、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接浸泡靶细胞的局部灌注、经由导管或经由灌洗施用。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前已经受胱氨酸尿症治疗，并且施用所述酶以预防胱氨酸尿症的复发。
13.如权利要求1所述的方法，还包括向所述受试者施用至少第二胱氨酸尿症疗法。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述第二胱氨酸尿症疗法是手术疗法或冲击波疗法。
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