KR20200018770A - 아르기닌 고갈 및 면역 종양학 작용제를 이용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

종양 또는 암을 치료하는 방법은 아르기닌 고갈 효소 및 면역-종양학 작용제를 투여하는 것을 포함한다.

Description

아르기닌 고갈 및 면역 종양학 작용제를 이용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
특정 종양 세포는 예컨대, L-아르기닌과 같은 아미노산에 대한 수요가 높으며, L-아르기닌 고갈 조건 하에서 사멸된다고 50년 넘게 알려져 왔다 (Wheatley and Campbell, 2002). 인간 세포에서, L-아르기닌은, 먼저 효소 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC)에 의해 L-오르니틴 및 카르바모일 포스페이트로부터 L-시트룰린이 합성되고, 아르기니노숙시네이트 신테타제 (ASS)가 L-시트룰린 및 아스파르테이트를 아르기니노숙시네이트로 전환시킨 후, 이어서, 아르기니노숙시네이트 리아제 (ASL)에 의해 아르기니노숙시네이트가 L-아르기닌으로 전환되는, 3 단계로 합성된다. 다수의 간세포성 암종 (HCC), 흑색종 및 신세포 암종 (Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Yoon et al., 2007)은 ASS를 발현하지 않고, 따라서 L-아르기닌 고갈에 민감하다. ASS 발현의 결여에 대한 분자적 기반은 다양한 것으로 보이며, 이는 비정상적인 유전자 조절을 포함한다. 비-악성 세포는 L-아르기닌 고갈시에는 휴면 상태 (G0)로 진입하고, 이로써, 수주 동안 생존가능한 상태 그대로 유지되는 반면, 종양 세포는 세포 주기 결함을 보이며, 이는 비록 단백질 합성이 억제될지라도, DNA 합성의 재개시로 이어지고, 결국에는 큰 불균형 및 신속한 세포 사멸이 유발한다 (Shen et al., 2006; Scott et al., 2000). HCC, 흑색종 및 다른 ASS 결핍 암 세포에 대한 L-아르기닌 고갈의 선택적 독성이 시험관내에서, 이종이식 동물 모델에서 및 임상 시험에서 광범위하게 입증되었다 (Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Shen et al., 2006; Izzo et al., 2004). 최근, 쳉(Cheng) 등 (2007)은 다수의 HCC 세포 또한 오르니틴 트랜스카르바밀라제 발현의 결핍을 보이며, 따라서 이 또한 효소적 L-아르기닌 고갈에 대해 감수성을 띤다는 것을 입증하였다.
암 요법, 특히, 암, 예컨대, 예를 들어, 높은 이환율과 연관이 있는 암의 흔한 형태인 간암종, 흑색종 및 신세포 암종 치료를 위해 L-아르기닌 가수분해 효소를 사용하는 것이 관심의 대상이 되고 있다. 암 요법을 위해 2가지 L-아르기닌 분해 효소: 박테리아 아르기닌 데이미나제 및 인간 아르기나제가 사용되어 왔다. 불행하게도, 상기 효소 둘 다는 임상적 사용에 큰 지장을 주는 유의한 단점을 나타낸다 (각각 면역원성, 및 혈청에서 매우 불량한 안정성을 동반한 낮은 촉매 활성). 따라서, L-아르기닌 고갈 요법의 치료적 성공은 이러한 단점을 다루는 것에 의존할 것이다.
다수의 암 치료에서 또 다른 도전 과제는 면역계를 회피할 수 있는 일부 암의 능력이다. 예를 들어, 일부 종양은, 면역계에서 면역 반응을 조정함으로써 자기 관용을 유지하는 억제 경로인, 면역 체크포인트 경로를 통해 면역계를 회피한다. 상기 경로는 종양에 의해 탈조절될 수 있고, 이로써 면역 저항을 유발한다. 둘 다 항원-특이적 T 세포 반응의 증폭을 유발하는 것인, 자극 전 수용체의 효능제 또는 억제 신호의 길항제 둘 다인 상기 경로 중 일부가 암 면역요법을 위한 표적이 되어 왔다. 일부 예시적인 수용체 및 리간드로는 그 중에서도 세포독성 T-림프구-연관 항원 4 (CTLA4), 프로그램화된 세포 사멸 1 (PD1), 프로그램화된 세포 사멸 리간드 1 (PDL1), 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3), B7-H3, B-7-H4, 및 T 세포막 단백질 3 (TIM3)을 포함한다 (Pardoll, 2012).
본 개시내용의 한 측면은 혈청 중 L-아르기닌을 고갈시키는 효소를 이용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 아르기니노숙시네이트 신테타제 (ASS), 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC), 또는 아르기니노숙시네이트 리아제 (ASL)를 발현하지 않거나, 또는 다르게는 그가 결핍된 것이다.
일부 측면에서, 본 발명은 또한 천연 금속 보조인자 (Mn2 +)가 또 다른 금속로 대체된 것인, 아르기나제 단백질의 용도를 고려한다. 특정 실시양태에서, 아르기나제 단백질은 인간 아르기나제 I의 아미노산 서열 또는 인간 아르기나제 II의 아미노산 서열, 및 비-천연 금속 보조인자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 금속은 코발트 (Co2+)이다. 본 발명의 인간 아르기나제 I 및 II 단백질은 2개의 Mn (II) 부위를 가지며; 한쪽 또는 양쪽 부위는 변형된 아르기나제 I 또는 II 단백질을 생성하기 위해 비-천연 금속 보조인자로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 pH 7.4에서 400 mM- 1 s-1 초과의 kcat/KM을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 단백질은 pH 7.4에서 400 mM- 1 s-1 내지 4,000 mM- 1 s-1의 kcat/KM을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 단백질은 pH 7.4 및 37℃에서 400 mM- 1 s-1 내지 2,500 mM- 1 s-1의 kcat/KM을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 아르기나제 I 또는 II의 아미노산 서열 및 비-천연 금속 보조인자를 포함하는 단백질로서, 여기서 상기 단백질은 pH 7.4 및 37℃에서 400 mM- 1 s-1 초과의 kcat/KM을 나타내는 것인 단백질을 고려한다.
본 개시내용의 추가의 또 다른 측면은, 예를 들어, 면역 체크포인트 경로를 표적화하는 면역요법 치료와 함께 공동으로 아르기닌 고갈에 의해 암 또는 종양을 치료하는 방법이다. 아르기닌 고갈은 조작된 또는 유도체화된 아르기나제 효소를 포함한, 인간 아르기나제 I 또는 아르기나제 II 효소 뿐만 아니라, 면역 체크포인트 표적화된 요법과 함께 투여되었을 때, 적어도 상가적 또는 상승작용적 효과를 나타내는, 다른 종으로부터의 아르기나제 또는 다른 아르기닌 고갈 효소의 투여로 달성될 수 있다.
그러므로, 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 치료량의, 코발트 보조인자를 포함하는 인간 아르기나제 I 효소 및 면역-종양학 작용제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법으로서 기술될 수 있다. 종양은 아르기닌 고갈 요법에 반응하는 다양한 유형의 것일 수 있고, 특정 실시양태에서, 아르기닌 영양요구성 종양이거나, 또는 아르기닌 의존성 또는 영양요구성 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 영양요구성 세포는 ASS, OTC, ASL 또는 그의 조합 중 하나 이상의 것의 감소된 또는 억제된 발현을 나타내며, 따라서 종양 세포는 혈청으로부터 아르기닌을 이용하여야 한다.
특정 실시양태에서, 인간 아르기나제 I 또는 다른 효소는 환자 혈청에서의 효소의 반감기를 증가시키기 위해 안정화제와의 회합에 의해 안정화된 것이다. 본원에서 사용되는 바, "회합"은 공유 또는 비-공유 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 수많은 회합 유형들 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 이는 또한 조작된 핵산 구축물로부터, 수소 결합 또는 소수성 상호작용 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 것으로부터 발현된 단백질 융합도 포함할 수 있다. 본 개시된 방법에서 사용하기 위한 안정화제로는, 예를 들어, 대개는 PEG화로 지칭되는 폴리에틸렌 글리콜, 엑스테닐화로도 지칭되고, 상표명 엑스텐(Xten)® 하에 상업적으로 이용가능한, 하나 이상의 동질성 합성 단백질 중합체에의 중합, 하나 이상의 Fc 단편에의 또는 혈청 단백질, 예컨대, 알부민에의 접합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 상기와 같은 안정화된 효소 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 고려되는 다른 효소들 모두 본 개시내용에 의해 고려된다.
본 개시된 방법은 수의학용 동물, 농경 동물, 가축, 또는 연구용 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 및 비-인간 동물 대상체 둘 다에게 적용가능하다. 면역-종양학 작용제가 대상체의 면역 반응을 증진시킨다는 것이 본 개시내용의 한 측면이다. 특정 실시양태에서, 면역계를 증진시키는 것은 종양 존재에 대한 환자의 T 세포 반응의 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 그러므로, 특정 실시양태에서, 면역-종양학 작용제는, 때때로, 체크포인트 억제제로서 지칭되는 세포 표면 수용체, 또는 상기 수용체에 대한 리간드인 면역 억제제를 억제한다. 그 예로는, 예를 들어, PD-1 경로 억제제, 예컨대, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체, OX40 (CD134) 경로 억제제, 예컨대, 항-OX40 또는 항-OX40L (CD252), 항-4-1BB 또는 다른 항-B7 패밀리 리간드, 예컨대, 항-B7-H1 및 항-B7.1을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 항체로는 펨브롤리주맙, 이필리무맙, 아테졸리주맙 또는 니볼루맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 방법은 간세포성 암종, 신세포 암종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 췌장암, 방광암, 결장 암종, 결장직장암, 삼중 음성 유방암, 호지킨 림프종, 위암, 교모세포종, 메르켈 세포 암종, 폐 암종, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 반응성 암 또는 종양의 치료를 위해 고려된다. 인간 아르기나제 I 효소, 및 항-PD-1 항체 또는 항-PDL-1 항체 또는 다른 면역 체크포인트 또는 TNF 수용체 억제제의 조합의 투여는 치료 용량의 항-PD-1 항체 단독 또는 항-PD-Li 항체 단독, 또는 인간 아르기나제 I 효소 단독의 투여에 의해 나타나는 종양 성장 억제와 비교하여 종양 성장 억제에 대해 상가적 효과를 나타낼 수 있거나, 또는 특정 실시양태에서, 종양 성장 또는 암에 대해 상가적이기보다는 더 큰 효과, 또는 상승작용적 효과를 나타낸다. 2종의 치료 레지멘은 공동으로 수행될 수 있거나, 또는 이는 필요에 따라 순차적으로 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 암 환자에게 치료량의, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소를 포함하는 제약 조성물, 및 면역-종양학 작용제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역계 조정 요법을 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 암을 치료하는 방법으로서도 기술될 수 있다.
특정 실시양태에서, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소의 치료량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 7.5 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 또는 상기 범위로부터 추론가능하거나, 또는 상기 범위 내에 포함되어 있는 임의의 양이다.
코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소를 포함하는 제약 조성물은 비경구로 투여될 수 있거나, 또는 국소로, 피하로, 정맥내로, 피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 안구내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 소포내로, 점막으로, 심막내로, 제대내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접적으로 표적 세포를 국부 관류욕시킴으로써, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 이루어지는 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 다양한 경로에 의해 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내로 또는 피하로 투여된다.
본 개시내용은 또한 암 환자에게 아르기닌 고갈 작용제 및 체크포인트 경로 억제제 또는 암 성장 또는 증식을 억제하거나 또는 감소시키는 다른 면역계 조정제를 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 암을 치료하는 방법으로서 기술될 수 있다. 본 방법은 아르기닌 고갈 작용제 및 체크포인트 경로 억제제를 이용하는 치료의 치료적 효과가 아르기닌 고갈 작용제 단독 또는 상기 체크포인트 경로 억제제 단독을 이용하는 치료와 비교하여 상가적이거나, 또는 상기 아르기닌 고갈 작용제 및 체크포인트 경로 억제제를 이용하는 치료의 치료적 효과가 아르기닌 고갈 작용제 단독 또는 상기 체크포인트 경로 억제제 단독을 이용하는 치료와 비교하여 상승작용적인 것인 암 치료를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료는 환자 내 혈청 아르기닌에서의 50% 내지 99%, 또는 90% 내지 99% 감소를 유발할 수 있거나, 또는 환자 내 혈청 아르기닌의 검출불가능한 수준으로의 감소를 유발할 수 있다.
본 방법의 실행에서 유용한 효소로는 아르기나제 효소, 아르기닌 데이미나제 효소 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 효소는 인간 효소, 재조합 인간 효소, 조작된 인간 효소 또는 다른 종, 포유동물, 또는 예를 들어, 미코플라스마를 포함하나 이에 제한되지는 않는 박테리아로부터의 효소일 수 있다.
일부 실시양태에서, 천연 아르기나제는 오직 금속 보조인자의 치환에 의해서만 변형된다. 다른 실시양태에서, 아르기나제는 다른 변형, 예컨대, 치환, 결실, 말단절단, 또는 안정화 단백질 또는 중합체에의 접합에 의해, 예컨대, PEG화에 의한 안정화 이외에도, 금속 보조인자의 치환에 의해서 변형된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 아르기나제 I 또는 II의 천연 아미노산 서열 및 비-천연 금속 보조인자를 포함하는 단백질로서, 여기서 아미노산 서열에는 천연 서열의 일부가 결여된 것인 단백질을 제공한다. 특정 실시양태에서, 비-천연 금속 보조인자는 코발트이다. 일부 실시양태에서, 아르기나제에는 야생형 서열의 일부가 결여된다. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 말단절단된 아르기나제 I 또는 아르기나제 II 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아르기나제는 아르기나제 II이고, 아르기나제에는 야생형 서열의 처음 21개의 아미노산이 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 천연 아르기나제에는 N-말단 메티오닌이 결여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 아르기나제 단백질로서, 여기서 단백질은 천연 인간 아르기나제 I 또는 II 단백질과 비교하였을 때, 생리적 조건 하에서 및 특별히, 인간 혈청의 pH (pH 7.4)에서 증가된 촉매 활성을 나타내는 것인 아르기나제 단백질을 고려한다. 일부 실시양태에서, 아르기나제 단백질은 인간 아르기나제 I 단백질 또는 인간 아르기나제 II 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질은 비-천연 금속 보조인자를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-천연 금속 보조인자는 Co+ 2이다. Mn+2 보조인자의 Co+2로의 치환은 촉매 활성에서의 현저한 증가 및 생리적 pH에서 KM에서의 대폭 감소를 유발한다. 일부 측면에서, 본 발명은 또한 비-아르기나제 아미노산 서열에 연결된 아르기나제를 포함하는 융합 단백질을 고려한다. 한 실시양태에서, 비-아르기나제 서열은 예컨대, 환자에게 투여되었을 때, 혈청 중 아르기나제의 반감기를 증가시키기 위해 면역글로불린의 Fc 영역의 적어도 일부를 포함한다. Fc 영역 또는 그의 일부는 임의의 적합한 Fc 영역일 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 영역 또는 그의 일부는 IgG Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, 아르기나제 활성을 가지는 아미노산 서열은 인간 아르기나제 I의 천연 또는 돌연변이화된 아미노산 서열 및 인간 아르기나제 II의 천연 또는 돌연변이화된 아미노산 서열 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 아르기닌 고갈 효소의 천연 또는 돌연변이화된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 이량체 Fc-아르기나제 융합 단백질, 알부민, 또는 합성 단백질 접합이 고려된다.
융합 단백질 중의 아르기나제는 천연, 돌연변이화된, 및/또는 다르게는, 변형된, 예컨대, 금속 보조인자 변형된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아르기나제는 결실, 치환, 말단절단 또는 그의 조합을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 아르기나제가 아르기나제 I인, Fc-아르기나제 함유 융합 단백질을 고려한다. 한 실시양태에서, 아르기나제에는 야생형 서열의 일부가 결여된다. 또 다른 실시양태에서, 아르기나제는 N-말단 메티오닌이 결여된 아르기나제 I이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 아르기나제는 아르기나제 II에 야생형 아르기나제 II 서열의 처음 21개의 아미노산이 결여된 아르기나제 II이다. 일부 실시양태에서, 아르기나제는 비-천연 금속 보조인자를 추가로 포함한다. 상기 실시양태에서, 한쪽 또는 양쪽 부위는 인간 아르기나제 I 또는 II 및 비-천연 금속 보조인자의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 생성하기 위해 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-천연 금속 보조인자는 코발트이다. 일부 실시양태에서, 아르기나제는 치환을 함유한다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 예시적인 아르기나제 효소는 미국 특허 번호 8,440,184 (상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함됨)에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 아르기나제 단백질 투여에 의한 치료 방법, 및 특히, 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 암은 ASS, OTC, 또는 ASL을 발현하지 않거나, 또는 그가 결핍된 암이다. 특정 실시양태에서, 인간 암은 아르기닌 영양요구성 암이다. 상기 논의된 바와 같이, 아르기나제 단백질은 천연, 돌연변이화된, 및/또는 다르게는 변형된, 예컨대, 금속 보조인자 변형된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 암 환자에게 아르기나제 활성을 가지는 아미노산 서열 및 인간 면역글로불린의 Fc 영역의 적어도 일부를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 제제를 투여하는 것을 포함하는, 인간 암 환자를 치료하는 방법을 고려한다. 일부 실시양태에서, 투여는 암의 암 세포 중 적어도 일부가 사멸되도록 하는 조건 하에서 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 생리적 조건에서 진성 인간 아르기나제에 의해 나타난 활성보다 더 높은 인간 아르기나제 활성을 가지고, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 쇄(들)가 추가로 부착된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 상기 논의된 아르기나제 단백질 중 임의의 것, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 제제이다. 상기 제약상 허용되는 부형제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 상기 아르기나제 변이체 중 임의의 것이 인간 요법에 유용한 것으로서 고려된다.
암은 임의의 유형의 암 또는 종양 유형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 간세포성 암종, 신세포 암종, 흑색종, 전립선암, 또는 췌장암이다. 일부 실시양태에서, 제제는 국소로, 정맥내로, 피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 안구내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 소포내로, 점막으로, 심막내로, 제대내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접적으로 표적 세포를 국부 관류욕시킴으로써, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여된다.
상기 언급된 아르기나제, 변이체 등은 모두 바람직한 실시양태에서는 정제된 또는 단리된 단백질로서, 및 바람직하게는 단량체 단백질로서 고려된다.
실시예 섹션의 실시양태는 본 발명의 모든 측면에 적용가능한 본 발명의 실시양태인 것으로 이해된다.
청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은 명확하게 명시되지 않는다면, 비록 본 개시내용이 오직 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하는 경우라도, 대안만을 단독으로 지칭하거나, 또는 대안이 상호 배타적인 것을 지칭하는 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
본 출원 전역에 걸쳐, "약"이라는 용어는 값이 그 값을 결정하는데 사용되는 조성물, 장치 또는 방법의 오차의 표준 편차를 포함한다는 것을 명시하기 위해 사용된다.
오랜 특허법에 따르면, 단수형 단어는 청구범위 또는 명세서에서 "포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 구체적으로 언급되지 않는다면, 하나 이상을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효"라는 단어는, 치료적 효과를 달성하는, 예컨대, 치료되는 병태의 적어도 하나의 증상이 적어도 호전되는 효과를 달성하는, 본 발명의 방법에서 사용되는 활성제 및/또는 치료 조성물 (예컨대, 치료 폴리뉴클레오티드 및/또는 치료 폴리펩티드)의 양, 및/또는 상기 세포와 함께 사용되는 프로세스 또는 물질의 분석을 지칭한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 예는 본 발명의 구체적인 실시양태를 나타내지만, 본 발명의 취지 및 범주 내에서의 다양한 변화 및 변형이 상기 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명한 바, 상기 상세한 설명 및 구체적인 예는 단지 예로서 제공되는 것임을 이해하여야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 측면을 추가로 나타내기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 구체적인 실시양태에 관한 상세한 설명과 함께 조합하여 상기 도면 중 하나 이상의 것을 참조함으로써 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1은 마우스 모델에서의 혈청 L-아르기닌 고갈을 제시하는 그래프이다. Co-hArgI의 단일 IP 용량으로 치료된 Balb/c 마우스의 혈청 L-Arg 농도는 3일 넘게 ≤ 3-4 μM로 유지된다.
도 2는 대조군과의 비교로서 제시된, Co-hArgI로 치료되었을 때의 HCC 종양 이종이식편 감소를 제시하는 그래프이다. Hep3b 종양 이종이식편을 보유하는 누드 마우스를 제9일 및 제12일에 PBS (○) 또는 Co-hArgI (●)로 IP 주사에 의해 2회에 걸쳐 치료하였다. Co-hArgI로 치료된 마우스에서 종양 위축이 관찰된 반면, PBS로 치료된 종양은 억제되지 않았다.
도 3은 코발트 로딩이 인간 아르기나제 I의 촉매 활성에 미치는 효과를 제시하는 그래프이다.
도 4는 Co-hArgI, 항 PD-L1, 및 Co-hArgI 및 항 PD-L1의 조합을 이용한, CT26 마우스 모델에서의 결장 암종 종양 성장 억제를 제시하는 그래프이다. 본 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 2종의 작용제의 조합이 종양 성장을 억제함에 있어서 상가적 효과보다 더 큰 효과를 가진다.
도 5는 Co-hArgI, 항 OX40 항체, 및 Co-hArgI 및 항 OX40 항체의 조합을 이용한, MC38 마우스 모델에서의 결장 암종 종양 성장 억제를 제시하는 그래프이다. 본 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 2종의 작용제의 조합이 종양 성장을 억제함에 있어서 상가적 효과보다 더 큰 효과를 가진다.
도 6은 Co-hArgI, 항 PD-L1, 및 Co-hArgI 및 항 PD-L1의 조합을 이용하였을 때의, CT26 마우스 모델에 존재하는 CD45+ T세포를 제시하는 그래프이다.
도 7은 도 6에 제시된 바와 같은 CD45+ T세포에 존재하는 CD8+ 세포의 퍼센트를 제시하는 그래프이다.
본 발명은 일반적으로 혈청 중 L-아르기닌을 고갈시키는 효소를 이용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 암은 아르기니노숙시네이트 신테타제 (ASS), 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC), 또는 아르기니노숙시네이트 리아제 (ASL), 또는 아르기닌 생합성에 요구되는 다른 효소를 발현하지 않거나, 또는 다르게는 그가 결핍된 것이다. 천연 및 돌연변이화된 효소 둘 다 뿐만 아니라, 변형된 금속 보조인자를 포함하는 효소, 다른 폴리펩티드와 융합된 효소 뿐만 아니라, 혈청 지속성을 증가시키는 중합체, 예컨대, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜에 접합된 효소도 고려된다.
I. 아르기나제
아르기나제는 망가니즈 함유 효소이다. 이는 요소 회로의 최종 효소이다. 아르기나제는, 진행 기간 동안에 신체가 유해한 암모니아를 처리하는 것인, 포유동물에서의 연속된 생물물리학적 반응인 요소 회로에서 5번째 및 마지막 단계이다. 구체적으로, 아르기나제는 L-아르기닌을 L-오르니틴 및 요소로 전환시킨다.
L-아르기닌은 L-시트룰린 및 NO를 생산하는 산화질소 신타제 (NOS)에 대한 산화질소에 대한 질소 공여 기질이다. 비록 아르기나제의 KM (2-5 mM)이 L-아르기닌에 대한 NOS의 것 (2-20 μM)보다 훨씬 더 높은 것으로 보고되어 있지만, 아르기나제 또한 NOS 활성을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 특정 조건 하에서 아르기나제 I은 Cys-S-니트로실화되고, 이로써 L-아르기닌에 대한 보다 높은 친화도 및 NOS에 대한 기질의 감소된 이용가능성을 유발한다.
아르기나제는 수개의 나선에 의해 둘러싸여 있는 평행 8 가닥 β-시트로 이루어진 α/β 폴드를 가지는 동종-삼량체 효소이다. 효소는 L-아르기닌의 구아니디늄 탄소 상에서의 친핵성 공격을 위해 수산화물을 생성하는데 필수적인 이핵 금속 클러스터를 함유한다. 아르기나제에 대한 천연 금속은 Mn2 +이다. 이들 Mn2 + 이온은 물과 배위결합하여 분자를 배향시키고, 안정화시키고, 물이 친핵체로서 작용하고, L-아르기닌을 공격할 수 있도록 허용하고, 그를 오르니틴 및 요소로 가수분해시킨다.
포유동물은, L-아르기닌의 요소 및 L-오르니틴으로의 가수분해를 촉매하는 2개의 아르기나제 동종효소 (EC 3.5.3.1)를 가진다. 아르기나제 I 유전자는 염색체 6 (6q.23) 상에 위치하고, 간세포의 시토졸에서 고도로 발현되고, 요소 회로의 마지막 단계로서 질소 제거에서 작용한다. 아르기나제 II 유전자는 염색체 14 (14q.24.1) 상에서 발견된다. 아르기나제 II는 조직, 예컨대, 신장, 뇌, 및 골격근에 미토콘드리아적으로 위치하며, 여기서 프롤린 및 폴리아민 생합성을 위해 L-오르니틴을 공급하는 것으로 간주된다 (Lopez et al., 2005).
아르기나제는 세포외 L-아르기닌을 분해시키는 방법으로서 근 50년 동안 연구되어 왔다 (Dillon et al., 2002). 간경유 동맥 색전술에 의해 아르기나제를 도입하였고; 그 이후, 여러 명의 환자는 HCC의 부분적 관해를 경험하게 됨으로써 일부 유망한 임상 결과를 달성하게 되었다 (Cheng et al., 2005). 그러나, 아르기나제는 KM이 높고 (~2-5 mM), 생리적 pH 값에서는 극도로 낮은 활성을 나타내기 때문에, 화학요법 목적을 위해서는 고용량의 투약이 요구된다 (Dillon et al., 2002). 천연 아르기나제는 수분 이내에 순환으로부터 제거되지만 (Savoca et al., 1984), 래트에서의 PEG-아르기나제 MW5000의 단일 주사는 ~3일 동안 거의 완전한 아르기닌 고갈을 달성하는데 충분하였다 (Cheng et al., 2007).
쳉 등은 다수의 인간 HCC 세포주는 (ASS 이외의) OTC를 발현하지 않으며, 이에 PEG-아르기나제에 대해 감수성을 띤다는 놀라운 관찰결과를 얻었다 (Cheng et al., 2007). Hep3b 간암종 세포를 이식받은 마우스에서 PEG-아르기나제를 매주 투여하였을 때, 종양 성장 지연을 유발하였으며, 이는 5-플루오로우라실 (5-FU)의 공동 투여에 의해 두드러지게 나타났다. 그러나, PEG-아르기나제는 인간 요법을 위해서 실행이 불가능한 극도로 높은 고용량으로 사용되었고, 이는 그의 생리적 활성은 더 낮다는 것을 반영한다.
이러한 문제를 다루기 위해, 우수한 동역학적 성질 및 안정성을 나타내는 박테리아 아르기닌 가수분해 효소인 아르기닌 데이미나제 또는 ADI가 시험관내에서 및 임상적으로 시험되어 왔다. 불행하게도, ADI는 박테리아 효소이고, 그러므로, 대부분의 환자에서 강한 면역 반응 및 역효과를 유도한다. 그러나, 유의한 유해 반응이 발생하지 않은 환자의 경우, 인상적인 백분율의 환자가 안전 병변 또는 관해를 나타낸다.
임상적 사용을 위해, 아르기나제가 순환 중에 장기간 (예컨대, 수일) 동안 지속될 수 있도록 하기 위해서는 아르기나제 조작이 필수적이다. 어떤 변형도 이루어지지 않을 경우, 인간 아르기나제의 순환 중 반감기는 단지 몇 분에 지나지 않는데, 그 이유는 상기 인간 아르기나제의 크기가 신장을 통해 이루어지는 여과를 피할 수 있을 정도로 충분히 크지 않기 때문이다. 비변형된 인간 아르기나제는 혈청 중에서의 비활성화에 매우 감수성이며, 단 4시간의 반감기로 분해된다. 그러므로, 본 발명은 순환 지속성이 개선된, 임상 연구 및 잠재적인 치료적 사용을 위한 신규하고, 개선된 형태의 아르기나제를 개발하게 되었다.
II. 아르기나제 변이체
포유동물은, L-아르기닌의 요소 및 L-오르니틴으로의 가수분해를 촉매하는 2개의 아르기나제 동종효소 (EC 3.5.3.1)를 가진다. 아르기나제 I 유전자는 염색체 6 (6q.23) 상에 위치하고, 간세포의 시토졸에서 고도로 발현되고, 요소 회로의 마지막 단계로서 질소 제거에서 작용한다. 아르기나제 II 유전자는 염색체 14 (14q.24.1) 상에서 발견된다. 아르기나제 II는 조직, 예컨대, 신장, 뇌, 및 골격근에 미토콘드리아적으로 위치하며, 여기서 프롤린 및 폴리아민 생합성을 위해 L-오르니틴을 공급하는 것으로 간주된다 (Lopez et al., 2005). L-아르기닌은 L-시트룰린 및 NO를 생산하는 산화질소 신타제 (NOS)에 대한 산화질소에 대한 유일의 기질이다. 비록 아르기나제의 KM (2-5 mM)이 L-아르기닌에 대한 NOS의 것 (2-20 μM)보다 훨씬 더 높은 것으로 보고되어 있지만, 아르기나제 또한 NOS 활성을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다 (Durante et al., 2007). 특정 조건 하에서 아르기나제 I은 Cys-S-니트로실화되고, 이로써 L-아르기닌에 대한 보다 높은 친화도 및 NOS에 대한 기질의 감소된 이용가능성을 유발한다 (Santhanam et al., 2007). 아르기나제는 수개의 나선에 의해 둘러싸여 있는 평행 8 가닥 β 시트로 이루어진 α/β 폴드를 가지는 동종-삼량체 효소이다. 효소는 L-아르기닌의 구아니디늄 탄소 상에서의 친핵성 공격을 위해 수산화물을 생성하는데 필수적인 이핵 금속 클러스터를 함유한다 (Cama et al., 2003; Dowling et al., 2008). 아르기나제에 대한 천연 금속은 Mn2 +이다. 천연 금속 (즉, Mn2+)을 포함하는 아르기나제는 9의 최적 pH 값을 나타낸다. 생리적 pH에서 효소는 L-아르기닌의 가수분해에서 10배 초과로 더 낮은 kcat / KM을 나타낸다. 천연 Mn2 + 효소를 포함하는 진성 인간 아르기나제가 보이는 낮은 촉매 활성은, 그가 L-아르기닌 혈장 수준을 치료학상 관련된 수준으로 감소시키기 위해서는 실행불가능한 용량의 효소가 사용되어야 할 수도 있다는 것을 의미하는 바, 이에 인간 요법에 문제를 일으킨다.
일부 측면에서, 본 발명은 천연 금속 보조인자 (Mn2 +)가 또 다른 금속으로 대체된 돌연변이체 아르기나제를 고려한다. 천연 금속 보조인자를 포함하는 천연 인간 아르기나제와 비교하였을 때, 인간 아르기나제 중 금속 보조인자의 치환이 생리적 조건 하에서 L-아르기닌의 가수분해 및 안정성에 대해 유익한 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 천연 금속 (Mn2 +)을 다른 2가 양이온으로 치환하는 것은 효소의 최적의 pH 값을 더 낮은 값으로 이동시켜, 생리적 조건 하에서 L-아르기닌 가수분해가 높은 비율로 이루어질 수 있도록 하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 인간 아르기나제 I 및 II 단백질은 2개의 Mn (II) 부위를 가지고; 그러므로, 한쪽 또는 양쪽 부위는 비-천연 금속 보조인자와 함께 돌연변이화된 I 또는 II 단백질을 생성하기 위해 치환될 수 있다.
일부 실시양태에서, 금속은 코발트 (Co2+)이다. 인간 아르기나제 I 또는 인간 아르기나제 II 중 Mn2 + 대신 Co2+의 도입은 생리적 pH에서의 극적으로 보다 높은 활성을 유발한다. Mn2 +를 함유하는 인간 아르기나제 I ("Mn-hArgI")와 비교하였을 때, Co2 + 함유 인간 아르기나제 I 효소 ("Co-hArgI")는 시험관내에서 pH 7.4에서 10배 증가된 kcat / KM을 나타내었고, 결국 이는 HCC 세포독성의 15배 증가 및 흑색종 세포독성의 13배 증가로 번역된 것으로 나타났다. 또한, Co-hArgI의 약리학적 제제는 단일 주사로 마우스에서 3일 넘게 혈청 L-Arg를 제거할 수 있는 것으로 나타났다. 추가로, Co-hArgI의 약리학적 제제는 누드 마우스에서 HCC 종양 이종이식편을 위축시킬 수 있는 반면, Mn-hArgI는 오직 종양 성장을 저속화시키는 것만 수행하는 것으로 나타났다 (Ensor et al., 2002).
본 발명의 특정 측면에서, PEG화된 아르기나제와 관련된 방법 및 조성물을 개시한다. 구체적으로, 조작된 시스테인 잔기에서의 아르기나제의 PEG화 (예컨대, N-말단의 3번째 잔기의 치환)가 균질 PEG화된 아르기나제 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 중합화의 일시적인 붕괴를 기반으로 한 PEG화된 아르기나제의 단리 방법 또한 개시한다.
PEG화는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체 쇄의 또 다른 분자, 보통 약물 또는 치료 단백질에의 공유 부착 프로세스이다. PEG화는 통상 PEG의 반응성 유도체와 표적 거대분자의 인큐베이션에 의해 달성된다. PEG의 약물 또는 치료 단백질에의 공유 부착이 상기 작용제를 숙주의 면역계로부터 "차폐"시킬 수 있고 (면역원성 및 항원성 감소), 상기 작용제의 수력학적 크기 (용액 중 크기)를 증가시켜 신장 제거를 감소시킴으로써 그의 순환 시간을 연장시킨다. PEG화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 수용성을 제공할 수 있다.
PEG화에서 제1 단계는 한쪽 또는 양쪽 말단에서의 PEG 중합체의 적합한 작용화이다. 각 말단에서 동일한 반응성 모이어티로 활성화되는 PEG는 "동종이작용성"인 것으로 공지되어 있는 반면, 존재하는 작용기가 상이할 경우, 이때, PEG 유도체는 "이종이작용성" 또는 "이종작용성"인 것으로 지칭된다. PEG 중합체의 화학적으로 활성 또는 활성화된 유도체는 PEG를 원하는 분자에 부착시키기 위해 제조된다.
PEG 유도체를 위해 적합한 작용기의 선택은 PEG에 커플링되는 분자 상의 이용가능한 반응성 기의 유형에 기초한다. 단백질인 경우, 전형적인 반응성 아미노산으로는 리신, 시스테인, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 티로신을 포함한다. N-말단 아미노 기 및 C-말단 카르복실산 또한 사용될 수 있다.
제1 세대 PEG 유도체를 형성하는데 사용되는 기술은 일반적으로 PEG 중합체를 히드록실 기와 반응성인 기, 전형적으로, 무수물, 산 클로라이드, 클로로포르메이트 및 카르보네이트와 반응시키는 것이다. 제2 세대 PEG화 화학법에서, 더욱 효율적인 작용기, 예컨대, 알데히드, 에스테르, 아미드 등이 접합에 이용가능하다.
PEG화 적용이 점점 더 진화되고, 정교해짐에 따라, 접합을 위해 이종이작용성 PEG에 대한 요구는 증가하고 있다. 이러한 이종이작용성 PEG는 2종의 엔티티를 연결시키는데 매우 유용하며, 여기서 친수성이고, 가용성이며, 생체적합성인 스페이서가 요구된다. 이종이작용성 PEG에 대해 바람직한 단부 기는 말레이미드, 비닐 술폰, 피리딜 디술피드, 아민, 카르복실산 및 NHS 에스테르이다.
가장 일반적인 변형 작용제, 또는 링커는 메톡시 PEG (mPEG) 분자에 기초한다. 그의 활성은 단백질 변형 기의 알콜 단부에의 첨가에 의존한다. 일부 경우에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 디올)은 전구체 분자로서 사용된다. 이어서, 디올은 (실시예에서 PEG 비스-비닐술폰으로 제시되는 바와 같은) 이종- 또는 동종-이량체 PEG 연결 분자 제조를 위해 양쪽 단부에서 변형된다.
단백질은 일반적으로 친핵성 부위, 예컨대, 비양성자화된 티올 (시스테이닐 잔기) 또는 아미노 기에서 PEG화된다. 시스테이닐-특이적 변형 시약의 예로는 PEG 말레이미드, PEG 아이오도아세테이트, PEG 티올, 및 PEG 비닐술폰을 포함한다. 상기 4가지 모두 온화한 조건 및 중성 내지 약한 알칼리성 pH에서 강하게 시스테이닐-특이적이지만, 이들은 각각 몇 가지 단점을 가지고 있다. 말레이미드와 형성되는 아미드는 알칼리성 조건 하에서 다소 불안정적일 수 있고, 이에 상기 링커를 이용하는 제제화 옵션에 일부 제한이 있을 수 있다. 아이오도 PEG와 형성되는 아미드 연결은 더욱 안정적이지만, 유리 아이오딘이 일부 조건 하에서는 티로신 잔기를 변형시킬 수 있다. PEG 티올은 단백질 티올과 디술피드 결합을 형성하지만, 이 연결 또한 알칼리성 조건 하에서 불안정적일 수 있다. 말레이미드 및 아이오도 PEG와 비교하였을 때, PEG-비닐술폰 반응성은 상대적으로 느리지만; 그러나, 형성된 티오에테르 연결은 매우 안정적이다. 또한 그의 느린 반응 속도를 통해 PEG-비닐술폰 반응을 더욱 쉽게 제어할 수 있다.
천연 시스테이닐 잔기에서의 부위-특이적 PEG화는 거의 수행되지 않는데, 그 이유는 상기 잔기가 일반적으로 디술피드 결합 형태이거나, 또는 생물학적 활성에 요구되기 때문이다. 한편, 티올-특이적 링커를 위한 시스테이닐 PEG화 부위 도입을 위해 부위-지정 돌연변이유발이 사용될 수 있다. 시스테인 돌연변이는 PEG화 시약에의 접근이 가능하고, PEG화 이후에도 여전히 생물학적으로 활성이도록 디자인되어야 한다.
아민-특이적 변형 작용제로는 PEG NHS 에스테르, PEG 트레실레이트, PEG 알데히드, PEG 이소티오시아네이트, 및 여러 다른 것들을 포함한다. 이들은 모두 온화한 조건 하에서 반응하고, 아미노 기에 대해 매우 특이적이다. 아마도 PEG NHS 에스테르가 보다 반응성인 작용제들 중 하나가 되겠지만; 그러나, 그의 높은 반응성으로 인해 대규모의 PEG화 반응은 제어가 어려워질 수 있다. PEG 알데히드는 아미노 기와 이민을 형성하고, 이어서, 소듐 시아노보로히드라이드에 의해 2급 아민으로 환원된다. 소듐 보로히드라이드와 달리, 소듐 시아노보로히드라이드는 디술피드 결합을 환원시키지 않을 것이다. 그러나, 상기 화학물질은 독성이 매우 높고, 특히, 휘발성이게 되는 더 낮은 pH에서는 조심스럽게 취급되어야 한다.
대부분의 단백질 상의 다중의 리신 잔기에 기인하여, 부위-특이적 PEG화는 도전 과제가 될 수 있다. 다행스럽게도, 이들 시약은 비양성자화된 아미노 기와 반응하기 때문에, 더 낮은 pH에서 반응을 수행함으로써 PEG화를 더 낮은 pK 아미노 기로 지정할 수 있다. 일반적으로, α-아미노 기의 pK는 리신 잔기의 엡실론-아미노 기보다 1-2 pH 단위만큼 더 낮다. 빈번하게는, 상기 분자를 pH 7 이하에서 PEG화시킴으로써 N-말단에 대한 고도의 선택성을 획득할 수 있다. 그러나, 이는 단지 단백질의 N-말단부가 생물학적 활성을 위해 요구되지 않는 경우에만 실행가능하다. 그래도 여전히, PEG화로부터 얻게 되는 약동학적 이익은 빈번하게는 시험관내 생물활성의 유의한 손실을 능가하며, 이로써 PEG화 화학법과 상관없이 생체내 생물활성이 훨씬 더 큰 생성물을 유발할 수 있다.
PEG화 방법 개발시 고려해야 할 파라미터가 몇 가지 존재한다. 다행스럽게도, 중요한 파라미터는 일반적으로 4 또는 5가지 이하로 존재한다. PEG화 조건의 최적화를 위한 "실험 디자인" 접근법이 매우 유용할 수 있다. 티올-특이적 PEG화 반응의 경우, 고려해야 할 파라미터로는 단백질 농도, PEG-대-단백질 비 (몰 기준), 온도, pH, 반응 시간, 및 일부 경우에서, 산소 차단을 포함한다. 산소는 단백질에 의한 분자간 디술피드 형성에 기여할 수 있고, 이는 PEG화된 생성물의 수율을 감소시킬 것이다. 아민-특이적 변형에 대해서도 동일한 인자가 고려되어야 하며 (산소 제외), 단, 예외적으로, 특히 N-말단 아미노 기를 표적화할 때에는 pH가 훨씬 더 중요할 수 있다.
아민- 및 티올-특이적 변형 둘 다의 경우, 반응 조건이 단백질의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 이는 온도, 단백질 농도, 및 pH를 제한할 수 있다. 추가로, PEG화 반응 시작 전, PEG 링커의 반응성은 공지되어야 한다. 예를 들어, PEG화 작용제가 단지 70%만 활성이면, PEG 사용량은 확실하게 오직 활성 PEG 분자만이 단백질-대-PEG 반응 화학량론으로 계수되도록 하여야 한다. PEG 반응성 및 질을 결정하는 방법은 추후 기술될 것이다.
IV. 단백질 및 펩티드
특정 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드, 예컨대, 안정화된 아르기나제 다량체를 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다. 이들 펩티드는 융합 단백질에 포함될 수 있거나, 또는 상기 기술된 바와 같은 작용제에 접합될 수 있다.
A. 단백질 및 펩티드
본원에서 사용되는 바, 단백질 또는 펩티드란, 일반적으로 한 유전자로부터 번역되는 약 200개 초과의 아미노산 내지 최대 전장의 서열로 이루어진 단백질; 약 100개 초과의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드; 및/또는 약 3개의 내지 약 100개의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 지칭하나 이에 제한되지는 않는다. 편의상, "단백질," "폴리펩티드" 및 "펩티드"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
특정 실시양태에, 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드의 크기는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 약 250, 약 275, 약 300, 약 325, 약 350, 약 375, 약 400, 약 425, 약 450, 약 475, 약 500, 약 525, 약 550, 약 575, 약 600, 약 625, 약 650, 약 675, 약 700, 약 725, 약 750, 약 775, 약 800, 약 825, 약 850, 약 875, 약 900, 약 925, 약 950, 약 975, 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400, 약 1500, 약 1750, 약 2000, 약 2250, 약 2500개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바, "아미노산 잔기"란, 관련 기술분야에 공지된 임의의 자연적으로 발생된 아미노산, 임의의 아미노산 유도체 또는 임의의 아미노산 모방체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기는 아미노산 잔기의 서열을 중단시키는 어떤 비-아미노산도 없이 연속적이다. 다른 실시양태에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기의 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다. 따라서, "단백질 또는 펩티드"라는 용어는, 하기 표 1에 제시된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 자연적으로 발생된 단백질 중에서 발견되는 20종의 일반 아미노산, 또는 적어도 하나의 변형된 아미노산 또는 비통상적 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
표 1
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단백질 또는 펩티드는 표준 분자 생물학적 기술을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, 천연 공급원으로부터의 단백질 또는 펩티드의 단리, 또는 단백질 또는 펩티드의 화학적 합성을 포함한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 다양한 유전자에 상응하는 뉴클레오티드 및 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 서열이 앞서 개시되었고, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 전산화된 데이터베이스에서 살펴볼 수 있다. 상기와 같은 한 데이터베이스는 (월드 와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov/에서 이용가능한) 미국 국립 생물공학 정보 센터의 진뱅크 및 진펩트(National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept) 데이터베이스이다. 공지된 유전자에 대한 코딩 영역은 본원에 개시된 기술을 이용하여, 및/또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 증폭 및/또는 발현할 수 있다. 대안적으로, 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드에 대한 다양한 상업적 제제가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
B. 핵산 및 벡터
본 발명의 특정 측면에서, 안정화된 다량체 아르기나제로서의 융합 단백질을 코딩하는 핵선 서열이 개시될 수 있다. 사용되는 발현 시스템에 따라, 핵산 서열은 종래 방법에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 인간 아르기나제 I 및 II는 발현을 방해할 수 있는, 이. 콜라이(E. coli)에서는 거의 사용되지 않는 다중 코돈을 함유하고, 그러므로, 각 유전자 또는 그의 변이체는 이. 콜라이 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 관심 단백질, 예컨대, 융합 다량체 아르기나제 또는 시스테인-치환된 아르기나제의 발현을 위해 다양한 벡터 또한 사용될 수 있다. 예시적인 벡터로는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존 또는 리포솜 기반 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
C. 숙주 세포
본 발명에서 유용한 숙주 세포, 바람직하게, 진핵 세포는 형질전환되어 아르기나제 및 그의 융합 다량체를 발현 및 분비할 수 있는 임의의 세포이다. 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 효모, 또는 사상성 진균일 수 있다. 다양한 박테리아로는 에스케리키아(Escherichia) 및 바실루스(Bacillus)를 포함한다. 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속, 한세눌라(Hansenula) 속 또는 피키아(Pichia) 속에 속하는 효모가 적절한 숙주 세포로서 사용될 수 있을 것이다. 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 트리코더마(Trichoderma) 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 세팔로스포리움(Cephalosporium) 속, 아클리아(Achlya) 속, 포도스포라(Podospora) 속, 엔도티아(Endothia) 속, 뮤코르(Mucor) 속, 코클리오볼루스(Cochliobolus) 속, 및 피리쿨라리아(Pyricularia) 속을 포함한, 다양한 사상성 진균 종이 발현 숙주로서 사용될 수 있다.
사용가능한 숙주 유기체의 예로는 박테리아, 예컨대, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) MC1061, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) BRB1의 유도체 (Sibakov et al., 1984), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) SAI123 (Lordanescu, 1975) 또는 스트렙토코쿠스 리비단스(Streptococcus lividans) (Hopwood et al., 1985); 효모, 예컨대, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisi ae) AH 22 (Mellor et al., 1983) 및 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 사상성 진균, 예컨대, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) (Ward, 1989), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) (Penttila et al., 1987; Harkki et al., 1989)를 포함한다.
포유동물 숙주 세포의 예로는 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-K1; ATCC CCL61), 래트 뇌하수체 세포 (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포 (ATCC CCL2.2), 래트 간종양 세포 (H-4-II-E; ATCCCRL 1548) SV40 형질전환된 원숭이 신장 세포 (COS-1; ATCC CRL 1650) 및 뮤린 배아 세포 (NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다. 상기 예는 예시적인 것이지만, 관련 기술분야에 공지된 다수의 가능한 숙주 유기체를 제한하는 것은 아니다. 원칙적으로, 원핵 세포이든 또는 진핵 세포이든 상관없이, 분비가능한 모든 숙주가 사용될 수 있다.
아르기나제 및/또는 그의 융합 다량체를 발현하는 포유동물 숙주 세포는 전형적으로 모체 세포주를 배양하는데 사용되는 조건 하에서 배양된다. 일반적으로, 세포는 전형적으로 5-10% 혈청, 예컨대, 우태아 혈청으로 보충된, 생리적 염 및 영양소를 함유하는 표준 배지, 예컨대, 표준 RPMI, MEM, IMEM 또는 DMEM 중에서 배양된다. 배양 조건 또한 표준 조건이며, 예컨대, 원하는 수준의 단백질을 획득할 때까지, 배양물을 정치 또는 회전 배양으로 37℃에서 인큐베이션한다.
D. 단백질 정제
단백질 정제 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이들 기술은 세포, 조직 또는 기관의 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로 의 한 수준으로의 균질화 및 미가공 분별을 포함한다. 달리 언급되지 않는다면, 관심 단백질 또는 폴리펩티드는 부분 또는 완전한 정제 (또는 균질성이 될 때까지 정제)를 위해 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 순수한 펩티드 제조를 위해 특별히 적합화된 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피 및 등전 포커싱이다. 특히 효율적인 펩티드 정제 방법은 고속 성능 액체 크로마토그래피 (FPLC) 또는 심지어 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)이다.
정제된 단백질 또는 펩티드는 단백질 또는 펩티드가 그의 자연적으로 수득될 수 있는 상태 대비 임의의 정도로까지 정제되는, 다른 성분으로부터 단리가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 그러므로, 단리된 또는 정제된 단백질 또는 펩티드는 또한 그가 자연적으로 발생될 수 있는 환경으로부터 유리된 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된"이라는 용어는 단백질 또는 펩티드 조성물이 분별을 거쳐 다양한 다른 성분이 제거되었고, 상기 조성물은 실질적으로 그의 발현된 생물학적 활성은 유지한다는 것을 지칭할 것이다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 그가 의미하는 것은 조성물 중 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성한다는, 예컨대, 조성물 중 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 또는 그 초과의 단백질을 구성한다는 것을 지칭한다.
단백질 정제의 사용에 적합한 다양한 기술이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 기술은 예를 들어, 황산암모늄, PEG, 항체 등을 이용하는 침전, 또는 열 변성에 의한 기술, 이어서, 원심분리; 크로마토그래피 단계, 예컨대, 이온 교환, 겔 여과, 역상, 히드록실아파타이트 및 친화성 크로마토그래피; 등전 포커싱; 겔 전기영동; 및 상기 기술 및 다른 기술의 조합을 포함한다. 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경될 수 있거나, 또는 특정 단계가 생략될 수 있고, 이를 통해서도 여전히 실질적으로 정제된 단백질 또는 펩티드를 제조하는데 적합한 방법을 유발할 수 있는 것으로 간주된다.
본 개시내용에 비추어, 단백질 또는 펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 활성 분획의 비활성을 결정하거나, 또는 SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내 폴리펩티드의 양을 사정하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 사정하는데 바람직한 방법은 분획의 비활성을 계산하고, 그 값을, 초기 추출물의 비활성과 비교하고, "정제 배수"로 사정되는, 그 안의 순수도를 계산하는 것이다. 물론, 활성량을 나타내는데 사용되는 실제 단위는 정제 후에 수행되도록 선택된 특정 검정 기술, 및 발현된 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부에 의존하게 될 것이다.
일반적으로 단백질 또는 펩티드가 항상 그의 가장 정제된 상태로 제공되어야 할 필요는 없다. 사실상, 덜 실질적으로 정제된 생성물이 특정 실시양태에서 유용성을 가질 수 있다는 것이 고려된다. 부분 정제는 더 적은 개수의 정제 단계를 조합하여 사용함으로써, 또는 동일한 일반 정제 방식의 다른 형태를 사용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, HPLC 장치를 사용하여 수행되는 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 통해 일반적으로는 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일한 기술보다 더 큰 "배수" 정제를 유발할 것으로 인지된다. 더 낮은 정도의 상대 정제를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 총 회수에서, 또는 발현된 단백질의 활성을 유지시키는데 이점을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 예를 들어, 안정화된 아르기나제 다량체 융합 단백질, 또는 PEG화 이전 또는 이후의 아르기나제와 같은 단백질 또는 펩티드는 단리 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, His 태그 또는 친화성 에피토프는 정제 촉진을 위해 상기 아르기나제 변이체에 포함될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 단리시키고자 하는 물질과, 그가 특이적으로 결합할 수 있는 분자 사이의 특이적 친화성에 의존하는 크로마토그래피 방법이다. 이는 수용체-리간드 유형의 상호작용이다. 칼럼 물질은 결합 파트너 중 하나를 불용성 매트릭스에 공유적으로 커플링시킴으로써 합성된다. 이어서, 칼럼 물질은 용액으로부터 물질을 특이적으로 흡착할 수 있다. 용출은 조건을 결합이 이루어지지 않는 조건으로 변경시킴으로써 (예컨대, pH, 이온 강도, 온도 등 변경) 이루어진다. 매트릭스는 그 자체가 유의한 정도로 분자를 흡착하지 않고, 광범위한 화학적, 물리적, 및 열적 안정성을 가지는 물질이어야 한다. 리간드는 그의 결합 특성에 영향을 주지 않도록 하는 방식으로 커플링되어야 한다. 리간드는 또한 상대적으로 밀착 결합하여야 한다. 또한, 샘플 또는 리간드를 파괴하지 않으면서 물질을 용출시킬 수 있어야 한다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 용액 중 분자가 그의 크기에 기초하여, 또는 더욱 기술적인 면에서, 그의 수력학적 부피에 기초하여 분리되는 크로마토그래피 방법이다. 이는 일반적으로, 큰 분자, 또는 거대분자 복합체, 예컨대, 단백질 및 산업용 중합체에 적용된다. 전형적으로, 수용액이 칼럼을 통해 샘플을 수송하는데 사용될 때, 이 기술은 겔 여과 크로마토그래피로 공지되어 있으며, 유기 용매가 이동상으로서 사용될 때 사용되는 겔 투과 크로마토그래피라는 명칭의 것과는 대조를 이룬다.
SEC의 기본 원리는 상이한 크기의 입자는 정지상을 통해 다른 속도로 용출 (여과)될 것이라는 것이다. 이를 통해 크기에 기초하여 입자의 용액의 분리를 유발한다. 모든 입자가 동시에 또는 거의 적재되었다고 가정할 때, 크기가 동일한 입자는 함께 용출되어야 한다. 각각의 크기 배제 칼럼은 분리될 수 있는 분자량 범위를 가진다. 배제 한계는 상기 범위의 상한부에서의 분자량을 정의하고, 분자가 너무 커서 정지상에서 포획되지 못하는 경우이다. 투과 한계는 분리 범위의 하한부에서의 분자량을 정의하고, 충분히 작은 크기의 분자가 정지상의 공극 내로 충분히 투과할 수 있고, 이러한 분자 질량 미만의 모든 분자는 너무 작아서 그가 단일 밴드로 용출되는 경우이다.
고성능 액체 크로마토그래피 (또는 고압 액체 크로마토그래피, HPLC)는 화합물의 분리, 확인 및 정량화를 위해 생화학 및 분석 화학에서 빈번하게 사용되는 칼럼 크로마토그래피 형태이다. HPLC는 크로마토그래피 패킹 물질 (정지상)을 수용하는 칼럼, 칼럼을 통해 이동상(들)을 이동시키는 펌프, 및 분자의 머무름 시간을 제시하는 검출기를 이용한다. 머무름 시간은 정지상 사이의 상호작용, 분석되는 분자, 및 사용되는 용매(들)에 의존하여 달라진다.
V. 제약 조성물
본 발명의 신규한 아르기나제는 종양 세포 성장을 억제하고, 가장 바람직하게는, 국부 진행성 또는 전이성 암을 앓는 암 환자에서 암 세포를 사멸시키기 위해 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다는 것이 고려된다. 이는 정맥내로, 경막내로, 및/또는 복강내로 투여될 수 있다. 이는 단독으로, 또는 항증식성 약물과 함께 조합하여 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 이는 수술 또는 다른 절차 이전에 환자에서 암 부하량을 감소시키기 위해 투여된다. 대안적으로, 이는 수술 후 임의의 남아있는 암 (예컨대, 수술을 통해 제거되지 못한 암)이 확실하게 생존하지 못하도록 하기 위해 투여될 수 있다.
본 발명을 치료 제제의 특정 성질에 의해 제한하고자 하지 않는다. 예를 들어, 상기 조성물은 생리적으로 허용가능한 액체, 겔, 또는 고체 담체, 희석제, 및 부형제를 함께 포함하는 제제로서 제공될 수 있다. 이러한 치료 제제는 다른 치료제와 유사한 방식으로 예컨대, 가축의 경우, 수의학적 용도로, 및 인간에서는 임상적 용도로 포유동물에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능을 위해 필요한 투여량은 사용 유형 및 투여 모드 뿐만 아니라, 개별 대상체의 특화된 요건에 따라 달라질 것이다.
상기 조성물은 전형적으로 액체 액제 또는 현탁제로서, 주사제로서 제조된다. 적합한 희석제 및 부형제는, 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 등, 및 그의 조합이다. 추가로, 원하는 경우, 조성물은 소량의 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충화제를 함유할 수 있다.
임상적 적용이 고려되는 경우, 제약 조성물--발현 벡터, 바이러스 스톡, 단백질, 항체 및 약물--을 의도하는 적용에 적합한 형태로 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 중에 용해 또는 분산되어 있는, 유효량의 하나 이상의 아르기나제 변이체 또는 추가 작용제를 포함한다. "제약 또는 약리학적으로 허용되는"이라는 어구는 분자 엔티티 및 조성물이 적절하게 동물, 예컨대, 예를 들어, 인간에게 투여되었을 때, 유해 반응, 알레르기 반응 또는 다른 원치않는 반응을 일으키지 않는다는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 방법에 의해 단리된, 적어도 하나의 아르기나제 변이체, 예컨대, 안정화된 다량체 아르기나제 또는 PEG화된 아르기나제, 또는 추가의 활성 성분을 함유하는 제약 조성물의 제조는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] (본원에서 참조로 포함됨)에 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다. 추가로, 동물 (예컨대, 인간) 투여를 위해서는 제제는 FDA 사무국의 생물학적 표준에서 요구하는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는 담체"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예컨대, 항박테리아제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 그의 유사 물질 및 그의 조합을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함됨) 참조). 단, 임의의 종래 담체가 활성 성분과 양립되지 않는 한, 제약 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
본 발명은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되는지, 및 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균성이어야 하는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이, 정맥내로, 피내로, 경피적으로, 경막내로, 동맥내로, 복강내로, 비강내로, 질내로, 직장내로, 국소로, 근육내로, 피하로, 점막으로, 경구로, 국소로, 국부적으로, 흡입 (예컨대, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 직접적으로 표적 세포를 국부 관류욕시킴으로써, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해, 액체 조성물로 (예컨대, 리포솜으로), 또는 다른 방법 또는 상기 방법들의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] (상기 문헌은 본원에서 참조로 포함됨) 참조).
아르기나제 변이체는 유리 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 산 부가염, 예컨대, 단백질성 조성물의 유리 아미노 기와 형성된 것, 또는 무기산, 예컨대, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 또는 만델산과 같은 유기산과 형성된 것을 포함한다. 유리 카르복실 기와 형성된 염 또한 무기 염기, 예컨대, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제제화시, 액제는 투여 제제와 화합성인 방식으로 및 치료학상 유효량으로 투여될 것이다. 제제는 예컨대, 주사용 액제, 또는 폐로의 전달을 위한 에어로졸과 같이, 비경구적 투여용으로 제제화된, 또는 예컨대, 약물 방출 캡슐제 등과 같이, 소화관 투여용으로 제제화된 다양한 투여 형태로 용이하게 투여된다.
추가로, 본 발명에 따라, 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 불활성 희석제를 포함 또는 포함하지 않는 제약상 허용되는 담체에 제공된다. 담체는 동화가능하여야 하고, 액체, 반고체, 즉, 페이스트, 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 종래 배지, 작용제, 희석제 또는 담체가 수용자에게, 또는 그에 함유되어 있는 조성물의 치료적 효과에 유해하지 않는 한, 본 발명의 방법을 실시하는데 사용하기 위해 투여가능한 조성물에서 그를 사용하는 것은 적절하다. 담체 또는 희석제의 예로는 지방, 오일, 물, 염수 용액, 액체, 리포솜, 수지, 결합제, 충전제 등, 또는 그의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가로, 보존제, 예컨대, 파라벤 (예컨대, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항박테리아제 및 항진균제에 의해 미생물의 작용을 방지할 수 있다.
본 발명에 따라, 조성물은 임의의 편리하고, 실용적인 방식으로, 즉, 용해, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 상기 절차는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게는 통상적인 것이다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 함께 완전하게 조합 또는 혼합된다. 혼합은 예컨대, 분쇄와 같은 임의의 종래 방식으로 수행될 수 있다. 치료 활성의 손실, 즉, 위에서의 변성으로부터 조성물을 보호하기 위해 혼합 프로세스에서 안정화제 또한 첨가될 수 있다. 조성물에서 사용하기 위한 안정제의 예로는 완충제, 아미노산 예컨대, 글리신 및 리신, 탄수화물, 예컨대, 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 소르비톨, 만니톨 등을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 아르기나제 변이체, 하나 이상의 지질, 및 수성 용매를 포함하는 제약 지질 비히클 조성물의 용도에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바, "지질"이라는 용어는 특징적으로 물 중에서 불용성이고, 유기 용매로 추출가능한, 광범위한 물질들 중 임의의 것을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 광범위한 부류의 화합물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 본원에서 "지질"이라는 용어로 사용되는 바와 같이, 임의의 특정 구조체로 제한되지 않는다. 예로는 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체를 함유하는 화합물을 포함한다. 지질은 자연적으로 발생된 지질 또는 합성 지질 (즉, 인공으로 디자인되거나, 또는 제조된 것)일 수 있다. 그러나, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세리드, 스테로이드, 테르펜, 리소리피드, 글리코스핑고리피드, 글리코리피드, 술파티드, 에테르 및 에스테르 연결 지방산을 포함하는 지질, 및 중합화가능한 지질, 및 그의 조합을 포함한다. 물론, 본원에 구체적으로 기술된 것 이외의, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 지질인 것으로 이해되는 화합물도 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 포함된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 지질 비히클 중에 조성물을 분산시키는데 사용될 수 있는 다양한 기술에 대해 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, 안정화된 다량체 또는 PEG화된 아르기나제를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 함유 용액 중에 분산시키거나, 지질과 함께 용해시키거나, 지질과 함께 유화시키거나, 지질과 함께 혼합하거나, 지질과 함께 조합하거나, 지질에 공유 결합시키거나, 지질 중 현탁액으로서 함유시키거나, 또는 미셀 또는 리포솜과 함유 또는 복합체를 형성하거나, 또는 다르게는 지질 또는 지질 구조체와 회합시킬 수 있다. 분산은 리포솜의 형성을 유발하거나 또는 유발하지 않을 수 있다.
동물 환자에게 투여되는 본 발명의 조성물의 실제 투여량은 물리적 및 생리적 인자, 예컨대, 체중, 병태 중증도, 치료되는 질환 유형, 선행 또는 공동 치료 개입, 환자의 특발증에 의해 및 투여 경로에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여를 담당하는 의사는 어떤 경우에서든 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상체에 적절한 용량(들)을 결정하게 될 것이다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은, 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%, 예를 들어, 및 상기 값 내에서 추론가능한 임의의 범위로 포함할 수 있다. 물론, 적합한 투여량이 임의의 주어진 단위 용량의 화합물로 수득되도록 하는 방식으로 각각의 치료학상 유용한 조성물 중 상기 양의 활성 화합물(들)이 제조될 수 있다. 인자, 예컨대, 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 수명 뿐만 아니라, 다른 약리학적 고려 사항도 상기 제약 제제를 제조하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 고려될 것이며, 따라서 다양한 투여량 및 치료 레지멘이 바람직할 수 있다.
다른 비-제한적인 예에서, 용량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 추론가능한 범위의 비-제한적인 예에서, 상기 기술된 수치에 기초하여 약 5 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다.
VII. 정의
"aa"라는 용어는 아미노산(들)을 지칭한다. 아미노산 치환은 문자 코드를 사용하여 분자 중의 아미노산 위치, 예컨대, 303으로 표시된다 (숫자 앞의 문자는 대체되는 아미노산을 나타내는 반면, 숫자 뒤의 문자는 도입되는 아미노산을 나타냄).
본원에서 사용되는 바, "일부"라는 용어는 ("주어진 단백질의 일부"인 것과 같이) 단백질과 관련되는 경우, 상기 단백질의 단편을 지칭한다. 단편의 크기는 그 범위가 4개의 아미노산 잔기 내지 전체 아미노산 서열에서 1개의 아미노산을 뺀 크기일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "단백질" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산을 포함하는 화합물을 지칭하며, 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "융합 단백질"이라는 용어는 외인성 단백질 단편 (비-아르기나제 단백질로 이루어진 융합 파트너)에 연결된 (또는 작동가능하게 연결된) 관심 단백질 (즉, 인간 아르기나제 또는 그의 변이체)을 함유하는 키메라 단백질을 지칭한다. 융합 파트너는 혈청 반감기, 가용성, 또는 이들 둘 다를 증진시킬 수 있다. 또한, 숙주 세포 또는 배양 상청액 또는 둘 다로부터 재조합 융합 단백질이 정제될 수 있도록 허용하는 친화성 태그 (예컨대, his-태그)를 제공할 수 있다.
"작동가능한 조합으로," "작동가능한 순서로" 및 "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 주어진 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 제조되도록 하는 방식으로 이루어지는 핵산 서열의 연결을 지칭한다. 상기 용어는 또한 기능성 단백질이 제조되도록 하는 방식으로 이루어지는 아미노산 서열의 연결도 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "Km"이라는 용어는 효소에 대한 미카엘리스-멘텐 상수(Michaelis-Menten)를 지칭하고, 주어진 효소가 효소 촉매 반응에서 그의 최대 속도의 절반치를 얻게 되는 특이적 기질의 농도로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바, kcat라는 용어는 단위 시간당, 대사 회전수 또는 생산을 위해 각 효소 부위가 전환시키는 기질 분자의 개수를 지칭하고, 여기서 효소는 최대 효율로 작용한다.
본원에서 사용되는 바, Kcat/Km이라는 용어는 효소가 얼마나 효율적으로 기질을 생성물로 전환시키는지를 나타내는 척도인 특이성 상수이다.
"Mn-hArgI"라는 용어는 Mn (II) 보조인자를 포함하는 인간 아르기나제 I를 지칭한다. "Co-hArgI"라는 용어는 Co (II) 보조인자를 포함하는 인간 아르기나제 I (돌연변이체 또는 천연)를 지칭한다.
"IC50"이라는 용어는 반수 최대 (50%) 억제 농도 (IC)이고, 따라서 유효성의 척도가 된다.
"PEG화된"라는 용어는, 그의 생체적합성이 높고, 변형이 용이하다면, 약물 운반체로서 널리 사용되고 있는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과의 접합을 지칭한다 (Harris et al., 2001). 다양한 약물, 단백질, 및 리포솜에의 부착이 잔류 시간을 개선시키고, 독성을 감소시키는 것으로 제시된 바 있다 (Greenwald et al., 2000; Zalipsky et al., 1997). PEG는 쇄의 단부에서 히드록실 기를 통해 및 다른 화학 방법을 통해 활성 작용제에 커플링 (예컨대, 공유적으로 연결)될 수 있지만; 그러나, PEG 그 자체는 분자당 최대 2개의 활성 작용제로 제한된다. 다른 접근법에서, PEG 및 아미노산의 공중합체는 PEG의 생체적합성 특성은 유지하지만, (더 많은 약물을 로딩시키면서) 분자 1개당 다수의 부착점을 가지는 추가된 이점을 보이며, 다양한 적용에 적합하도록 합성적으로 디자인될 수 있는 신규한 생체 적합 물질로서 탐구되어 왔다 (Nathan et al., 1992; Nathan et al., 1993).
"유전자"라는 용어는 폴리펩티드 또는 그의 전구체 제조에 필요한 제어 서열 및 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열을 지칭한다. 폴리펩티드는 전장의 코딩 서열에 의해, 또는 원하는 효소 활성이 유지되는 한, 코딩 서열의 임의의 일부분에 의해 코딩될 수 있다.
"대상체"라는 용어는 인간을 포함한 동물을 지칭한다.
"야생형"이라는 용어는 자연적으로 발생된 공급원으로부터 단리되었을 때, 유전자 또는 유전자 생성물의 특징을 가지는 유전자 또는 유전자 생성물을 지칭한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 빈번하게 관찰되고, 따라서 임의로 "정상" 또는 "야생형" 형태의 유전자로 지명되는 것이다. 그에 반해, "변형된" 또는 "변이체" 또는 "돌연변이체"라는 용어는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교하여 서열 변형, 및/또는 기능적 특성 변형 (즉, 변경된 특징)을 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 지칭한다. 자연적으로 발생된 돌연변이체가 단리될 수 있고; 이는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교하였을 때, 변경된 특징을 가진다는 사실에 의해 확인된다는 점에 주의한다.
VIII. 키트
본 발명은 키트, 예컨대, 치료적 키트를 제공한다. 예를 들어, 키트는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 제약 조성물, 및 임의적으로 그의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 상기 조성물을 투여하기 위한 하나 이상의 장치도 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상 키트는 제약 조성물, 및 조성물을 암성 종양 내로 직접 정맥내 주사하기 위한 카테터를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상 키트는 전달 장치와 함께 사용하기 위한, 임의적으로, 제약으로서 제제화되거나, 또는 동결건조된, 안정화된 다량체 아르기나제 또는 단리된 PEG화된 아르기나제로 이루어진 미리 충전된 앰플을 포함할 수 있다.
키트는 라벨이 있는 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 및 시험관을 포함한다. 용기는 예컨대, 유리, 또는 플라스틱과 같은, 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 예컨대, 상기 기술된 바와 같은 치료적 또는 비-치료적 적용에 효과적인 항체를 포함하는 조성물을 수용할 수 있다. 용기 상의 라벨은 조성물이 특적 요법 또는 비-치료적 적용에 사용된다고 명시할 수 있고, 이는 또한 예컨대, 상기 기술된 것과 같은, 생체내 또는 시험관내 사용 설명서를 명시할 수 있다. 본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기술된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 니들, 시린지, 및 사용 설명서를 포함하는 패키지 인서트를 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다.
IX. 실시예
하기 예는 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태 및 측면을 예시하는 역할을 하며, 그의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 하기의 실험 개시내용에서, 하기 약어가 적용된다: eq (당량); M (몰랄); μM (마이크로몰랄); mM (밀리몰랄); N (노르말); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); mg (밀리그램); μg (마이크로그램); L (리터); ml (밀리리터); μl (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); μm (마이크로미터); nm (나노미터); EC (섭씨 도); MW (분자량); PBS (포스페이트 완충처리된 염수); min (분).
실시예 1
아르기나제 I 중 금속 도입 및 금속 함량 결정
아르기나제를 정제한 후, 50℃에서 10분 동안 진행되는 10 mM 금속과의 인큐베이션 단계에 의해 Mn2 + 및 Co2 +를 도입할 수 있다. 아르기나제 제제의 최종 금속 함량 및 아이덴티티를 결정하기 위해, 단백질 샘플인 Mn-hArgI (145 μM), Co-hArgI (182 μM) 및 연관된 투석 완충제 (100 mM Hepes, pH 7.4)를 2% 질산 중에서 희석시키고, 유도 결합 플라스마 질량 분석법 (ICP-MS, 오스틴 소재의 텍사스 대학교 지질 과학과(Department of Geological Sciences, University of Texas at Austin))에 의해 분석하여 투석 완충제 중에서 관측된 금속 농도를 최종 단백질 샘플의 금속 농도로부터 감산하고, 단백질 농도로 나눔으로써 단백질의 코발트, 철, 망가니즈 및 아연 함량을 정량화하였다. 단백질 농도 결정을 위해, 아미노산 서열에 기반하여 hArgI에 대한 흡광 계수를 계산하였다 (Gill and von Hippel, 1989). 최종 완충제 농도 6 M의 구아니디늄 히드로클로라이드, 20 mM 포스페이트 완충제, pH 6.5에서 계산된 ε280=24,180 M- 1 cm-1에 기초하여 아르기나제 I에 대한 모든 단백질 농도를 계산하였다. 비교를 위해, 표준으로서 BSA 희석액을 사용하여 BCA 검정법에 의해서도 또한 아르기나제 농도를 계산하였다. 상기 방법 사용 결과, Co2 +와 함께 인큐베이션된 아르기나제 샘플은 2.1±0.5 당량의 Co 및 0.4±0.1 당량의 Fe를 함유하고, Zn 또는 Mn의 양은 검출불가능한 것으로 나타났다. Mn2 +와 함께 인큐베이션된 샘플은 1.5±0.2 당량의 Mn 및 0.4±0.1 당량의 Fe를 함유하고, Zn 또는 Co의 양은 검출불가능하였다. 따라서, 코발트 도입을 위해서는 가열식 인큐베이션이 효율적인 방법이다.
코발트 로딩에 관한 추가 연구는 보다 높은 비율의 코발트 로딩이 달성가능하고, 보다 높은 비활성도를 유발하는 것으로 입증하였다. 본 연구의 결과는 하기 표 및 도 3에 제시되어 있다.
표 2
Co-아르기나제 I 코발트 로딩
Figure pct00003
*그래프화됨
별표 표시된 데이터는 도 3에 제시되어 있다.
실시예 2
간세포성 암종 세포 및 전이성 흑색종에 대한 Co- Arg 및 그의 변이체의 세포독성
조작된 아르기나제의 시험관내 세포독성을 시험하기 위해, 다양한 농도 (0-100 nM)의 Mn-ArgI, Co-ArgI 또는 Co-hArgI 변이체를, 우태아 혈청으로 보충된 DMEM 배지 중에서 500개의 세포/웰의 시딩 밀도의 HCC (Hep 3b) 세포 또는 흑색종 (A375) 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection))와 함께 96-웰 플레이트에서 인큐베이션하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 다양한 농도의 아르기나제 함유 배지를 이용하여 삼중으로 처리하였다. 대조군 용액은 배지 중의 평형 염 용액이었다. 처리된 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 세포를 제1일, 제3일, 제5일, & 제7일에 100 μL/웰의 MTT (5 mg/mL)를 첨가하여 표준 MTT 검정법 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))에 의해 시험하고, 시간당 1 내지 2회에 걸쳐 온화하게 교반하면서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 용액을 흡인시킨 후, 이어서, 200 μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하였다. 자동 플레이트 판독기를 사용하여 각 웰에 대해 570 nm에서의 흡광도를 해석하여 대조군 대비 살아있는 세포의 상대적인 개수를 결정하였다. 생성된 데이터를 지수 방정식으로 피팅하여 아르기나제 세포독성에 대한 겉보기 IC50 값을 결정하였다. 제5일부터의 IC50 값을 계산하여 Mn-hArgI의 경우, IC50 값은 5±0.3 nM (~0.18 μg/ml)이고, Co-hArgI의 경우, 0.33±0.02 nM (~0.012 μg/ml)인 값을 얻었다. 따라서, HCC에 대해 Co-ArgI 효소가 Mn 치환된 효소보다 15배 더 큰 세포독성인 것으로 보인다. 전이성 흑색종 세포주 (A375)에 대해서 Mn-hArgI는 4.1±0.1 nM (~0.15 μg/ml)인 겉보기 IC50을 유발하였다. Co-hArgI와 함께 인큐베이션하였을 때, 겉보기 IC50 0.32±0.06 nM (~0.012 μg/ml)으로, 세포독성은 13배 증가되었다.
실시예 3
생체내 반감기 증진을 위한 Fc - 아르기나제 융합 단백질 조작
치료 폴리펩티드, 예컨대, TNF-α 억제제 에타네르셉트 (엔브릴(Enbril)™)의 생체내 반감기를 연장시키기 위해, IgG Fc 도메인에의 융합을 광범위하게 사용하였다. Fc 도메인은, 혈관 내피 및 다수의 다른 조직 상에서 발현되는 FcγRn 수용체에 결합한다 (Roopenian and Akilesh, 2007). IgG Fc 도메인에 대한 FcγRn의 친화도는 pH에 고도로 의존적이다. 결합은 엔도솜 구획의 산성 pH에서 일어나며, 이로써, 단백질은 세포 표면 상에서 재순환될 수 있고, 이로써 단백질 분해에 의해 분해를 피할 수 있다. 세포 표면에서, 결합 친화도가 생리적 pH에서는 매우 낮기 때문에, Fc 도메인은 FcγRn으로부터 유리된다. FcγRn을 통한 엔도솜 재순환이 인간에서 면역글로불린의 혈청 반감기를 약 7-14일까지 적어도 4-7배 연장시키는 것으로 추정된다. Fc 융합물은 수명이 짧은 분자에 긴 반감기를 부여하는 상기와 같은 성향을 이용한다. 그러나, 인간 아르기나제는 동종삼량체이고, 그러므로, 그 자체가 이량체인 IgG Fc에 융합되었다면, 생성된 Fc-아르기나제 폴리펩티드는 가능하게는 고분자량의 응집체를 형성하게 될 것이다.
이러한 문제는 삼량체화를 붕괴하고, 단량체 형태에서 안정적인 돌연변이체 형태의 아르기나제를 사용함으로써 피할 수 있었다. 아르기나제 I의 삼량체화 및 서브유니트 계면에 대해 좀 더 상세히 연구되었다 (Lavulo et al., 2001). Glu256Gln에서의 단일 아미노산 치환이 삼량체화를 붕괴함으로써, 이를 통해 단량체 아르기나제 I 효소의 형성을 유발하는 것으로 제시된 바 있다 (Sabio et al., 2001). 상기 변이체의 발현 및 정제 후, 정상 상태 동역학적 성질 분석 결과, kcat/KM은 1,320 s-1 mM-1로, Co-hArgI과 비교하였을 때, 활성은 거의 동일한 것으로 나타났다.
이어서, 상기 구축물을 Fc 발현 벡터로 클로닝하였다. Fc 발현 벡터는 DsbA 리더 서열, 이어서, IgG Fc 코딩 영역, EcoRI 제한 부위 및 정지 코돈을 함유하는 pTRC99a 플라스미드 (아머샴(Amersham))에 기반한 구축물이다. 단량체 아르기나제 유전자를, EcoRI로 벡터 및 유전자 둘 다를 분해함으로써 프레임내 Fc 코딩 영역 뒤에 배치시킨 후, 이어서, 라이게이션시키고, 서열분석 및 발현을 위해 이. 콜라이 (BL21)로 형질전환시켰다. IgG Fc는 보통 글리코실화 단백질이기 때문에, 재조합 IgG 또는 Fc 융합물의 발현은 지금까지, 박테리아와 달리 N-연결 글리코실화가 가능한 재조합 포유동물 세포에서 수행되어 왔다. 그러나, Asn297에서의 글리코실화가 활성화 및 억세성 Fcγ 수용체 (인간에서는 FcγRI-III)에의 결합에는 중요하지만, FcγRn에의 친화도 또는 pH 의존적 결합에 대해서는 어떤 뚜렷한 효과도 없다 (Tao and Morrison, 1989; Simmons et al., 2002). 따라서, 박테리아에서 발현된 비-글리코실화 IgG 항체는 포유동물 세포에서 발현된 완전한 글리코실화 항체의 것과 거의 구별이 어려운 혈청 지속성을 영장류에서 나타낸다 (Simmons et al., 2002). 종전의 지배적인 개념과 딜리, IgG 항체 및 Fc 단백질은 발효기에서 최대 g/L 수준으로까지 이. 콜라이 중에서 효율적으로 발현될 수 있다. 이. 콜라이 발효는 기술상 훨씬 더 간단하고, 빠르다. 추가로, 생성된 단백질은 비-글리코실화 단백질이기 때문에, 치료 당단백질 발현에서 중요한 문제인 글리칸 이질성을 나타내지 않는다 (Jefferis, 2007). 융합 단백질을 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, 이량체화되지 못한 폴리펩티드 대비 올바르게 폴딩된 이량체 Fc-아르기나제 융합물의 수율을 FPLC 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정량화한다. 상기 제제화를 통해 생체내 시험에 적합한, 고도로 활성이며 매우 안정적인 형태의 인간 아르기나제에 이르게 되었다.
실시예 4
아르기나제의 PEG화
아르기나제를 정제한 후, CoCl2를 이용하여 10 mM로 만들고, 50℃에서 10분 동안 가열하였다. 원심분리하여 임의의 침전물을 제거한 후, PEG-5000 아르기나제에 대해 100,000 MWCO 여과 장치 (아미콘(Amicon))를 이용하여 광범하게 완충제 교환 (10% 글리세롤을 포함하는 PBS)을 수행하고, 0.2 μm 시린지 필터 (VWR)로 멸균화하였다. PEG화된 효소를 모두 리물루스 아메보사이트 라이세이트(Limulus Amebocyte Lysate: LAL) 키트 (케이프 코드 인코포레이티드(Cape Cod Incorporated))를 이용하여 리포폴리사카라이드 (LPS) 함량에 대해 분석하였다.
PEG화된 Co-hArgI는 야생형 효소와 거의 동일한 혈청 안정성을 가지는 것으로 밝혀졌고, 1690±290 s-1 mM-1인 kcat/KM 값을 나타내었다.
실시예 5
마우스 모델에서의 L- Arg의 혈청 고갈
Balb/c 마우스를 단일 IP 주사에 의해 500 μg의 약리학적으로 제조된, PEG화된 Co-hArgI 또는 동일한 부피의 PBS로 치료하였다. 0, 48, 72, 및 96 hr 시점에 채혈을 위해 심장 정맥 천자에 의해 마우스를 희생시켰다. 혈액 샘플을 400 mM 시트르산 나트륨 완충제 pH 4와 50:50 (v/v)으로 즉시 혼합하고, 30분 동안 응고될 수 있도록 하고, 혈청 분리를 위해 원심분리시켰다. 이어서, 큰 단백질 및 침전물 제거를 위해, 생성된 혈청을 10,000 MWCO 장치 (아미콘) 상에서 여과하고, 분석을 위해 통과액을 수집하였다. L-아르기닌 표준, 대조군 마우스 혈청 및 실험 샘플을 OPA (애질런트(Agilent))로 유도체화시키고, 본질적으로 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) (발간 번호: 5980-3088)에 의해 기술된 바와 같이 수행하되, 단 예외적으로, 더욱 우수한 피크 분리를 얻기 위해 유속을 1/2만큼 감속시키고, 획득 시간을 배가시킴으로써 약간 변형시킨 분리 프로토콜에 의해 C18 역상 HPLC 칼럼 (애질런트) (5 μm, 4.6x150 mm) 상에서 분리시켰다. 혈청 L-Arg 수준을 정량화하기 위해 농도 대비 L-Arg 피크 면적을 플롯팅하여 L-아르기닌 표준 곡선을 작성하였다. 약리학적으로 제조된 Co-hArgI의 단일 용량이 3일 넘게 L-Arg를 검출 한계 이하로 유지시키는데 충분하였다 (도 1).
실시예 6
Co- hArgI를 이용한 HCC 종양 이종이식편 치료
75% 전면생장률의 조직 배양물로부터 수집된 ~106개의 HCC 세포를 누드 마우스의 옆구리에 피하로 주사하였다. HCC 이종이식된 종양 직경이 ~0.5 ㎤까지 성장한 후 (제9일), 마우스를 2개 군으로 분류하였다. 실험군은 제9일 및 제12일에 약리학적으로 최적화된 Co-hArgI 500 μg을 IP 주사에 의해 받았다. 대조군은 제9일 및 제12일에 PBS를 IP 주사에 의해 받았다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, PBS로 치료된 종양은 제15일까지 그 크기가 3배 증가하였다. 아주 대조적으로, Co-hArgI로 치료된 종양은 제15일까지 그 크기가 감소되었다. Mn-hArgI로 치료된 종양은 단지 성장률에서 지연된 것으로 제시된 바 있다 (Cheng et al., 2007). Co-hArgI가 시험관내 및 생체내 둘 다에서 HCC에 대해 고도로 효과적인 화학요법제인 것으로 보인다.
실시예 7
Co- hArgI 및 항-PD-L1 Ab를 이용한 종양 미세환경에서의 L-아르기닌 균형 붕괴
인간 아르기나제 I (hArgI)는 혈청 중에서 낮은 활성 및 낮은 안정성을 나타내는 Mn2 +-의존성 효소이다. 골수 유래 억제 세포 (MDSC)는 hArgI 및 산화질소 신타제 (NOS)를 발현하는데, 이는 종양 미세환경에서의 L-아르기닌의 이용가능성을 제어하며, 이는 결국 T 세포의 기능을 조절한다. MDSC에 의한 L-아르기닌의 고갈은 T 세포 항-종양 기능 손상 및 숙주 면역의 종양 회피와 상관관계를 가지는 것으로 나타났다. 말초 혈액 단핵 세포, 골수 단핵 세포 및 CD34+ 세포에서의 L-아르기닌 생합성 경로의 효소의 발현 분석 결과, 이들 세포는 OTC 및 ASS를 낮은 수준을 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이들 세포는 생리적 기능을 위해 외인성/세포외 L-아르기닌에 의존하는 것을 시사한다. 이러한 관찰결과에 기초하여, 장기간의 L-아르기닌 고갈이 MDSC 집단에 부정적인 영향을 미칠 수 있고, 그러므로, 종양 성장의 면역 조절을 증진시킬 수 있다고 고려된다. Mn2 + 천연 보조인자를 Co2 +로 대체함으로써 개발된 것으로서, 내인성 hArgI와 비교하여 유의하게 개선된 촉매 활성 및 혈청 안정성을 유발하는 조작된 hArgI (AEB1102)를 사용하여 상기 가설에 대해 시험하였다. 조작된 효소는 또한 상기 기술된 바와 같이 PEG화된 것이다. 단독으로 및 항-PD-L1 및 항-PD-1 모노클로날 항체 (mAb)와 함께 조합하여 투약받은 뮤린 CT26 결장-암 모델에서 생체내에서의 만성의 광범위한 PEG화된 Co-hArgI-매개의 L-아르기닌 고갈이 미치는 효과를 시험하였다.
본 연구에서는 암컷 엔비고(Envigo) Balb/c 마우스 (BALB/cAnNHsd)를 사용하였다. 상기 마우스는 시험 제1일에 6-7주령된 것이었다. 제0일에, 시험 동물에 5.0E+05 CT26.WT 세포를 피하로 이식하였다. 모든 마우스를 연구군으로 분류하고, 하기와 같이 치료를 시작하였다:
AEB-001-1037
- 군 1: 비히클 (PBS) IP, Q7Dx4; + 이소타입 대조군, 10 mg/kg IP, (Q3Dx2; 3일 휴약)x4
- 군 2: AEB1102, (3 mg/kg IP, Q7Dx4)
- 군 3: 항-PD-L1 Ab, 10 mg/kg IP, (Q3Dx2; 3일 휴약)x4
- 군 4: AEB1102, 3 mg/kg IP, Q7Dx4; + 항-PD-L1 Ab, 10 mg/kg IP, (Q3Dx2; 3일 휴약)x4;
AEB1102는 매주 1회로 4회에 걸쳐 (제3일, 제10일, 제17일, 제24일) 투약하였다.
항-PD-L1은 매주 1일 투약 2일 휴약, 1일 투약 3일 휴약으로 8회에 거쳐 (제3일, 제6일, 제10일, 제13일, 제17일, 제20일, 제24일, 제27일) 투약하였다.
모든 동물을 적어도 1일 1회에 걸쳐 임상 증후에 대해 관찰하였다. 매주 3회에 걸쳐 개별 체중 및 종양 부피를 기록하였다. 종양 크기가 2000 ㎣에 도달하였을 때, 개별 마우스를 종료시켰다.
생체내에서 CT26 마우스를 AEB1102 (PEG화된 Co-hArgI)로 치료하였을 때, PD-1 및 PD-L1을 표적화하는 표준 면역조정 항체와 유사한 치료적 효과를 유발하였다. 유의하게는, AEB1102와 항-PD-1 및 PD-L1 mAb와의 조합 요법을 통해 AEB1102 단독 및 면역요법 단독 수행과 비교하여 겉보기상 상승작용적 또는 적어도 상가적 항-종양 효과를 유발하였다.
본 연구로부터의 데이터는 도 4에 그래프로 제시되어 있다. 본 데이터는 항-면역 체크포인트 단백질 수용체 (항-PD-1) 및 리간드 (항-PD-L1)와 함께 조합하여 PEG화된 Co-hArgI로 치료하였을 때의 효과를 반영하는 것이다. 도면에서, 상단의 곡선은 이소타입 대조군 항체에 대한 것이고, 두 번째 곡선은 항-PD-L1 항체에 대한 것이고, 세 번째 곡선은 PEG화된 Co-hArgI에 대한 것이고, 최하단의 곡선의 PEG화된 Co-hArgI 및 항-PD-L1 항체의 조합 치료에 대한 것이다. 본 데이터에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 2종의 작용제의 조합이 종양 성장을 억제함에 있어서 상가적 효과보다 더 큰 효과를 가진다.
제3일에 채취된 샘플에서 림프구 T세포 활성화에 미치는 효과 또한 측정하였다. 4개 군에서 CD45+를 발현하는 총 살아있는 세포의 백분율 뿐만 아니라, 또한 CD8+인 CD45+ 세포의 백분율이 하기 표 3에 제시되어 있다. 이들 데이터 또한 도 6 및 7에 그래프 형태로 제시되어 있다.
Figure pct00004
표에는 평균 ± SEM으로 기록되어 있다.
종합해 보면, 상기 결과들은 종양 미세환경에서의 L-아르기닌의 생리적 균형을 붕괴하는 것이 종양 성장을 억제하고, 추가로는 종양을 면역요법에 대해 감작시킨다는 것을 입증한다.
실시예 8
ArgI 및 OX40를 이용한 치료의 결장 암종 치료적 효과
MC38 결장 암종 세포의 현탁액을 암컷 C57BL/6 마우스의 옆구리에 주사하였다. 제0일에 종양 부피가 75-100 ㎣에 도달하였을 때, 마우스를 군들로 무작위화하였다. 캘리퍼스를 이용하여 1주 2회에 걸쳐 종양 부피를 측정하였다. 제0일에 치료를 시작하였다.
제1 군에는 6주 동안 격주로 10 mg/kg 이소타입 대조군을 주사하였고, 제2 군에는 6주 동안 매주 3 mg/kg co-아르기나제 I를 주사하였고, 제3 군에는 6주 동안 매주 10 mg/kg 항-OX40ab를 주사하였고, 제4 군에는 6주 동안 매주 3 mg/kg co-ArgI 및 10 mg/kg 항 OX40ab를 주사하였다. 본 연구로부터의 데이터는 도 5에 제시되어 있다. 비록 co-ArgI가 차선의 용량으로 제공되기는 하였지만, ArgI 및 aOX40의 조합이 종양 부피를 감소 또는 억제함에 있어서 상가적 효과보다 더 큰 효과를 가지는 성향을 나타낸다.
본원에 개시되고, 청구되는 조성물 및 방법은 모두 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이도 제조 및 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시양태에 의해 기술되었지만, 조성물 및 방법에 대해, 및 본원에 기술된 방법의 단계에 또는 그 단계의 순서에 대해 본 발명의 개념, 취지 및 범주로부터 벗어남없이 변형이 적용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게는 자명할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적으로 및 생리적으로 둘 다의 방식으로 관련된 특정 작용제는 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서, 본원에 기술된 작용제 대신으로 치환될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명하는 상기와 같은 모든 유사 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범주 및 개념 내에 포함되는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기 참고문헌은 그가 본원에 기술된 것을 보충하는 예시적인 절차적 또는 다른 상세한 설명을 제공하는 정도로까지 본원에서 참조로 구체적으로 포함된다.
Figure pct00005

Claims (48)

  1. 치료량의, 코발트 보조인자를 포함하는 인간 아르기나제 I 효소 및 치료량의 면역-종양학 작용제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 종양이 아르기닌 영양요구성 종양 세포를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소가 안정화제와의 회합에 의해 안정화된 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 안정화제가 폴리에틸렌 글리콜, 합성 단백질 중합체, Fc 융합, 또는 알부민을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소가 PEG화된 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 종양이 아르기니노숙시네이트 신테타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기니노숙시네이트 리아제 또는 그의 조합의 감소된 또는 억제된 발현을 나타내는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 대상체가 동물 대상체인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 대상체가 인간 암 환자인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 면역-종양학 작용제가 대상체의 면역 반응을 증진시키는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 면역-종양학 작용제가 면역 억제제를 억제하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 면역-종양학 작용제가 체크포인트 억제제 경로를 차단하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 면역-종양학 작용제가 PD-1, OX40 또는 다른 B7 경로 억제제를 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 작용제가 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인 방법.
  14. 제 항에 있어서, 면역-종양학 작용제가 항-OX40 또는 항-OX40L 항체인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 작용제가 펨브롤리주맙, 이필리무맙, 아테졸리주맙 또는 니볼루맙을 포함하는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 작용제가 이필리무맙을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 종양이 간세포성 암종, 신세포 암종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 췌장암, 방광암, 결장 암종, 결장직장암, 삼중 음성 유방암, 호지킨 림프종, 위암, 교모세포종, 메르켈 세포 암종, 폐 암종, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암을 포함하는 것인 방법.
  18. 제13항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소, 및 항-PD-1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-OX40 항체 또는 항-OX40L 항체의 조합의 투여가 치료 용량의 항-PD-1 항체 단독 또는 항-PDL-1 항체 단독, 또는 인간 아르기나제 I 효소 단독의 투여에 의해 나타나는 종양 성장 억제와 비교하여 종양 성장 억제에 대해 상가적 효과를 나타내는 것인 방법.
  19. 제13항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소, 및 항-PD-1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-OX40 항체 또는 항-OX40L 항체의 조합의 투여가 치료 용량의 항-PD-1 항체 단독, 항-PD-Li 항체, 항-OX40 항체 또는 항-OX40L 항체 단독 또는 인간 아르기나제 I 효소 단독의 투여에 의해 나타나는 종양 성장 억제와 비교하여 종양 성장 억제에 대해 상승작용적 효과를 나타내는 것인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소, 및 항-PD-1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-OX40 항체 또는 항-OX40L 항체가 공동으로 투여되는 것인 방법.
  21. 제13항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소, 및 항-PD-1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-OX40 항체 또는 항-OX40L 항체가 순차적으로 투여되는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소가 pH 7.4 및 37℃에서 아르기닌의 가수분해에 대해 400 mM- 1 s-1 내지 4,000 mM- 1 s-1의 kcat/KM을 나타내는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소가 2 내지 3 μg Co/mg 아르기나제의 아르기나제 대비 코발트의 비를 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 인간 아르기나제 I 효소가 30℃ 내지 55℃의 온도에서 15분 내지 60분의 기간 동안 아르기나제 아포효소를 코발트 또는 코발트 이온과 접촉시킴으로써 제조되는 것인 방법.
  25. 암 환자에게 치료량의, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소를 포함하는 제약 조성물, 및 면역-종양학 작용제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역계 조정 요법을 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 암을 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소를 포함하는 제약 조성물, 및 면역-종양학 작용제를 포함하는 제약 조성물이 공동으로 투여되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 코발트 보조인자를 포함하는 인간 아르기나제 I 효소를 포함하는 제약 조성물, 및 면역-종양학 작용제를 포함하는 제약 조성물이 순차적으로 투여되는 것인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소의 치료량이 약 0.01 mg/kg 내지 약 7.5 mg/kg인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소의 치료량이 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소의 치료량이 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg인 방법.
  31. 제25항에 있어서, 면역-종양학 작용제가 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-OX40 항체 또는 항-OX40L 항체인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 면역-종양학 작용제가 펨브롤리주맙, 이필리무맙, 아테졸리주맙 및 니볼루맙으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 암 환자가 간세포성 암종, 신세포 암종, 유방암, 흑색종, 전립선암, 췌장암, 방광암, 결장 암종, 결장직장암, 삼중 음성 유방암, 호지킨 림프종, 위암, 교모세포종, 메르켈 세포 암종, 폐 암종, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암에 대해 치료되는 것인 방법.
  34. 제25항에 있어서, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소를 포함하는 제약 조성물이 비경구로 투여되는 것인 방법.
  35. (누락)
  36. 제25항에 있어서, 코발트 보조인자를 포함하는 PEG화된 인간 아르기나제 I 효소를 포함하는 제약 조성물이 국소로, 정맥내로, 피내로, 동맥내로, 복강내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 전립선내로, 흉막내로, 기관내로, 안구내로, 비강내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 결막하로, 소포내로, 점막으로, 심막내로, 제대내로, 경구로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접적으로 표적 세포를 국부 관류욕시킴으로써, 카테터를 통해, 또는 세척을 통해 투여되는 것인 방법.
  37. 제25항에 있어서, 제약 조성물이 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  38. 암 환자에게 아르기닌 고갈 작용제 및 체크포인트 경로 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 암을 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 아르기닌 고갈 작용제 및 체크포인트 경로 억제제를 이용하는 치료의 치료적 효과가 아르기닌 고갈 작용제 단독 또는 상기 체크포인트 경로 억제제 단독을 이용하는 치료와 비교하여 상가적인 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 아르기닌 고갈 작용제 및 체크포인트 경로 억제제를 이용하는 치료의 치료적 효과가 아르기닌 고갈 작용제 단독 또는 상기 체크포인트 경로 억제제 단독을 이용하는 치료와 비교하여 상승작용적인 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 치료가 환자 내 혈청 아르기닌에서의 50% 내지 99% 감소를 유발하는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 치료가 환자 내 혈청 아르기닌에서의 90% 내지 99% 감소를 유발하는 것인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 치료가 환자 내 혈청 아르기닌의 검출불가능한 수준으로의 감소를 유발하는 것인 방법.
  44. 제38항에 있어서, 아르기닌 고갈 작용제가 아르기나제 효소, 아르기닌 데이미나제 효소 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  45. 제38항에 있어서, 효소가 인간 효소인 방법.
  46. 제38항에 있어서, 상기 효소가 조작된 인간 아르기나제인 방법.
  47. 제38항에 있어서, 상기 효소가 Fc 단편, PEG화, 알부민 또는 합성 단백질 중합체와의 접합 또는 회합에 의해 안정화된 것인 방법.
  48. 치료량의 인간 아르기나제 I 효소 또는 미코플라스마 아르기닌 데이미나제 효소 및 치료량의 면역-종양학 작용제를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
KR1020197006482A 2017-06-23 2017-09-08 아르기닌 고갈 및 면역 종양학 작용제를 이용하여 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법 KR102577761B1 (ko)

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Class et al. Patent application title: COMPOSITIONS OF ENGINEERED HUMAN ARGINASES AND METHODS FOR TREATING CANCER Inventors: George Georgiou (Austin, TX, US) Everett Stone (Austin, TX, US) Everett Stone (Austin, TX, US)

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