CN105612252A - 作为抗新生剂的工程改造的灵长类动物胱氨酸/半胱氨酸降解酶 - Google Patents

作为抗新生剂的工程改造的灵长类动物胱氨酸/半胱氨酸降解酶 Download PDF

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Abstract

本发明描述涉及具有L-(半)胱氨酸降解酶活性的蛋白的工程改造的方法和组合物。例如，在某些方面，可公开一种包含一种或多种氨基酸取代并且能够降解L-(半)胱氨酸的经修饰胱硫醚-y-裂解酶。此外，本发明的某些方面提供使用所公开的蛋白或核酸来治疗具有L-(半)胱氨酸的癌症的组合物和方法。

Description

作为抗新生剂的工程改造的灵长类动物胱氨酸/半胱氨酸降解酶
发明背景
本申请要求2013年8月29日提交的美国临时申请号61/871,727和2014年3月5日提交的美国临时申请号61/948,106的优先权权益，所述临时申请的完整内容以引用的方式并入本文。
本发明在政府支持下根据由美国国立卫生研究院授权的授权号R01CA154754进行。政府对本发明享有某些权利。
1.发明领域
本发明大体来说涉及医学和生物学的领域。更具体说来，其涉及用使L-胱氨酸和L-半胱氨酸缺乏的酶治疗癌症的组合物和方法。甚至更具体说来，其涉及具有适用于人类疗法的高半胱氨酸/半胱氨酸降解活性和稳定性的灵长类动物酶的工程改造。
2.相关技术的描述
多种氨基酸的全身性缺乏已经显示有效杀死各种肿瘤类型，而对非癌组织具有最小毒性。这种治疗效应可通过使用被引入循环中的药理学优化酶来实现，所述酶使肿瘤所依赖的氨基酸降解。某些癌症如前列腺、小细胞肺癌、胶质母细胞瘤和肝细胞癌已经显示高度依赖于细胞外半胱氨酸/胱氨酸以便增生和存活。这些肿瘤中的多种异常地过度表达xCT(-)胱氨酸/谷氨酸反向转运体以便维持蛋白和谷胱甘肽产生所需的充足半胱氨酸水平，表明其已经丧失或下调其原生半胱氨酸生物合成能力。支持这一想法，xCT(-)胱氨酸/谷氨酸反向转运体的小分子抑制剂(如柳氮磺胺吡啶)的使用已经显示延迟前列腺和小细胞肺癌肿瘤异种移植物的生长(Doxsee等人,2007；Guan等人,2009)。尽管L-胱氨酸的xCT(-)依赖性转运的阻断是有前景的，但其无法消除Na+依赖性ASC转运体和/或Na+独立转运体对自由L-半胱氨酸的转运，并且在一些实施例中，通过骨髓源性基质细胞向肿瘤细胞提供自由L-半胱氨酸(Zhang等人,2012)。使胱氨酸和半胱氨酸缺乏的治疗剂因此可完全地剥夺这种基本代谢物的肿瘤。然而，并无已知的具有适合作为人类治疗剂应用的特性或活性的不可逆半胱氨酸/胱氨酸降解酶，并且一般来说，可完成特异性氨基酸降解的酶经常不存在，迫使对现有酶进行所需活性的工程改造。
发明概述
本发明涉及灵长类动物胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)的工程改造，使得L-胱氨酸和L-半胱氨酸(本文中称为L-(半)胱氨酸)可有效地从血清降解，并且涉及在适用于人类癌症疗法的配制物中提供经修饰CGL酶。为了开发如与原生酶相比呈现低KM和高催化活性kcat的酶，本发明人通过修饰所选择的氨基酸工程改造原生酶，所述修饰产生具有显著改进的酶特性的酶。因而，如本文所述经修饰的CGL酶通过提供新颖酶克服了所属领域中的显著缺乏，所述新颖酶如与原生酶相比包含具有L-(半)胱氨酸降解催化活性的人类或灵长类动物多肽序列。因而，这些经修饰酶可适用于癌症疗法并且具有低免疫原性和改进的血清稳定性。
因此，在第一实施方案中，提供一种经修饰多肽，尤其是具有源于与胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)相关的灵长类动物酶的L-(半)胱氨酸降解活性的酶变体。例如，新颖的酶变体可具有选自由SEQIDNO:2-6组成的群组的氨基酸序列。例如，所述变体可源于人类酶，如人类CGL。在某些方面，可存在包含能够降解L-(半)胱氨酸的经修饰灵长类动物CGL的多肽。在一些实施方案中，所述多肽可能够在生理条件下降解L-(半)胱氨酸。例如，所述多肽可具有至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、105、106s-1M-1或可在所述范围中派生的任何范围的关于L-(半)胱氨酸的催化效率(kcat/KM)。
未修饰多肽可为原生CGL，尤其人类亚型或其他灵长类动物亚型。例如，所述原生人类CGL可具有SEQIDNO:1的序列。其他原生灵长类动物CGL的非限制性实例包括苏门答腊猩猩CGL(GenbankID:NP_001124635.1；SEQIDNO:7)、食蟹猴CGL(GenbankID:AAW71993.1；SEQIDNO:8)、黑猩猩CGL(GenbankID:XP_513486.2；SEQIDNO:9)和倭黑猩猩CGL(GenbankID:XP_003830652.1；SEQIDNO:10)。示例性原生多肽包括具有SEQIDNO:1或7-10或其片段的约、至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或可在所述范围中派生的任何范围)的序列。例如，所述原生多肽可包含SEQIDNO:1或7-10的序列的至少或多达约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、405个残基(或可在所述范围中派生的任何范围)。
在一些实施方案中，所述原生CGL可通过一种或多种其他修饰，如化学修饰、取代、插入、缺失和/或截短来修饰。在一个特定实施方案中，所述原生CGL可通过取代修饰。例如，取代的数目可为1、2、3、4或更大。在其他实施方案中，所述原生CGL可在底物识别位点或可影响底物特异性的任何位置中经修饰。例如，经修饰多肽可在对应于SEQIDNO:1或7-10的氨基酸位置59和/或339的氨基酸位置处具有至少一种氨基酸取代。在这些实施例中，各序列的第一甲硫氨酸对应于氨基酸位置1，并且各氨基酸依序从其编号。
在某些实施方案中，在氨基酸位置59和/或339处的取代为苏氨酸(T)或缬氨酸(V)。在特定实施方案中，所述修饰为选自由59T和339V组成的群组的一种或多种修饰。在另一实施方案中，所述取代可包含59T取代。在另一实施方案中，所述取代可包含339V的额外取代。
在一些实施方案中，所述原生CGL可为人类CGL。在一个特定实施方案中，所述取代为人类CGL的E59T和E339V的组合(例如，所述经修饰多肽具有SEQIDNO:2的氨基酸序列、其片段或同系物)。在其他实施方案中，所述经修饰多肽可为苏门答腊猩猩CGL-TV突变体(SEQIDNO:3)、食蟹猴CGL-TV突变体(SEQIDNO:4)、黑猩猩CGL-TV突变体(SEQIDNO:5)或倭黑猩猩CGL-TV突变体(SEQIDNO:6)。
如上文所讨论的经修饰多肽可表征为如与未修饰多肽(例如，原生多肽)或本文所公开的任何多肽序列相比具有特定百分比的同一性。例如，所述未修饰多肽可包含原生灵长类动物CGL(即，人类、苏门答腊猩猩、食蟹猴、黑猩猩或倭黑猩猩CGL)的至少或多达约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、405个残基(或可在所述范围中派生的任何范围)。所述同一性百分比可在经修饰多肽的未修饰部分(即，经修饰多肽中排除在氨基酸位置59和/或339处的任何取代的序列)与相应原生多肽之间为约、至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或可在所述范围中派生的任何范围)。还涵盖如与多肽的未修饰区相比，上文所讨论的同一性百分比可与多肽的特定修饰区有关。例如，多肽可含有CGL的经修饰或突变型底物识别位点，所述位点可基于CGL的经修饰或突变型底物识别位点的氨基酸序列与来自相同物种或跨物种的未修饰或突变型CGL的所述氨基酸序列的同一性来表征。表征为例如与未修饰CGL具有至少90％同一性的经修饰或突变型人类多肽意指在所述经修饰或突变型人类多肽中的至少90％的氨基酸与未修饰多肽中的氨基酸同一。
在一些方面，本发明还预期包含连接于异源氨基酸序列的经修饰CGL的多肽。例如，所述经修饰CGL可连接于所述异源氨基酸序列作为融合蛋白。在一个特定实施方案中，所述经修饰CGL可连接于氨基酸序列，如IgGFc、白蛋白、白蛋白结合肽或XTEN多肽用于增加体内半衰期。
为了增加血清稳定性，所述经修饰CGL可连接于一个或多个聚醚分子。在一个特定实施方案中，所述聚醚可为聚乙二醇(PEG)。所述经修饰多肽可经由特异性氨基酸残基，如赖氨酸或半胱氨酸连接于PEG。关于治疗性施用，所述包含所述经修饰CGL的多肽可分散于药学上可接受的载体中。
在一些方面，涵盖编码所述经修饰CGL的核酸。一方面，所述核酸已经针对细菌中的表达进行密码子优化。在特定实施方案中，所述细菌为大肠杆菌。在其他方面，所述核酸已经针对真菌(例如酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞中的表达进行密码子优化。本发明进一步涵盖含有所述核酸的载体，如表达载体。在特定实施方案中，所述编码所述经修饰CGL的核酸可操作地连接于启动子，包括但不限于异源启动子。在一个实施方案中，经修饰CGL可通过载体(例如基因疗法载体)递送至靶细胞。所述病毒可已经通过重组DNA技术修饰以使经修饰CGL编码核酸能够在靶细胞中表达。这些载体可来源于非病毒(例如质粒)或病毒(例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)起源的载体。非病毒载体优选地与试剂复合以促进DNA跨细胞膜的进入。所述非病毒载体复合物的实例包括与聚阳离子试剂的配制物，所述聚阳离子试剂促进DNA和基于脂质的递送系统的缩合。基于脂质的递送系统的实例将包括核酸的基于脂质体的递送。
在其他方面，本发明进一步涵盖包含所述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可为细菌(例如大肠杆菌)、真菌细胞(例如酵母)、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，将所述载体引入至用于表达经修饰CGL的宿主细胞中。所述蛋白可以任何适合方式表达。在一个实施方案中，所述蛋白在宿主细胞中表达，使得所述蛋白糖基化。在另一实施方案中，所述蛋白在宿主细胞中表达，使得所述蛋白非糖基化。
在一些实施方案中，所述多肽或核酸在包含药学上可接受的载体的药物配制物中。所述多肽可为原生灵长类动物CGL多肽或经修饰CGL多肽。所述核酸可编码原生灵长类动物CGL多肽或经修饰CGL多肽。
本发明的某些方面还涵盖通过施用原生灵长类动物CGL肽、基因疗法载体中编码所述原生灵长类动物CGL肽的核酸、经修饰CGL肽、基因疗法载体中编码经修饰CGL的核酸或本发明的配制物进行治疗的方法，并且具体说来治疗肿瘤细胞或具有癌症的受试者的方法。所述受试者可为任何动物，如小鼠。例如，所述受试者可为哺乳动物，具体说来灵长类动物，并且更具体说来人类患者。在一些实施方案中，所述方法可包括选择具有癌症的患者。在某些方面，所述受试者或患者可维持L-(半)胱氨酸限制性饮食或正常饮食。
在一些实施方案中，所述癌症为对L-(半)胱氨酸缺乏敏感的任何癌症。在一个实施方案中，本发明涵盖一种治疗肿瘤细胞或癌症患者的方法，所述方法包括施用包含所述多肽的配制物。在一些实施方案中，所述施用在一定条件下发生，使得所述癌症的至少一部分细胞被杀死。在另一实施方案中，所述配制物包含在生理条件下具有L-(半)胱氨酸降解活性并且进一步包含所连接的聚乙二醇链的所述经修饰CGL。在一些实施方案中，所述配制物为包含上文所讨论的CGL变体中的任一者和药学上可接受的赋形剂的药物配制物。所述药学上可接受的赋形剂是所属领域的技术人员众所周知的。所有以上CGL变体均可预期适用于人类疗法。
在另一实施方案中，也可提供一种治疗肿瘤细胞的方法，所述方法包括施用包含具有L-(半)胱氨酸降解活性的非细菌(哺乳动物，例如灵长类动物或小鼠)经修饰CGL或编码其的核酸的配制物。
因为肿瘤细胞依赖于其关于L-(半)胱氨酸的营养培养基，所以所述施用或治疗可针对用于所述细胞的营养源，并且不必要针对所述细胞本身。因此，在体内应用中，治疗肿瘤细胞包括使用于肿瘤细胞的群体的营养培养基与工程改造(即，经修饰)的CGL接触。在这个实施方案中，所述培养基可为血液、淋巴液、脊髓液和其中需要L-(半)胱氨酸缺乏的类似体液。
根据本发明的某些方面，含有经修饰的CGL的所述配制物可静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、滑膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肿瘤内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐带内、眼内、经口、经表面、通过吸入、输注、持续输注、局部灌注、经由导管、经由灌洗在脂质组合物(例如脂质体)中或通过如所属领域的技术人员将知道的其他方法或前述的任何组合施用。
在另一实施方案中，所述方法也可包括向所述受试者施用至少一种第二抗癌疗法。所述第二抗癌疗法可为手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
在一个实施方案中，提供一种包含经修饰的CGL或编码经修饰的CGL的核酸的组合物，用于治疗受试者中的肿瘤。在另一实施方案中，提供经修饰的CGL或编码经修饰的CGL的核酸的用途，其用于制造用于治疗肿瘤的药剂。所述经修饰的CGL可为所述实施方案的任何经修饰的CGL。
在本发明的方法和/或组合物的上下文中讨论的实施方案可关于本文所述的任何其他方法或组合物使用。因此，关于一种方法或组合物的实施方案也可应用于本发明的其他方法和组合物。
如本文所用，关于核酸的术语“编码(encode)”或“编码(encoding)”用于使本发明可容易地由熟练技术人员了解；然而，这些术语可分别与“包含(comprise)”或“包含(comprising)”互换使用。
如本文说明书中所用，“一(a)”或“一(an)”可意指一种或多种。如本文权利要求书中所用，当联合措辞“包含(comprising)”使用时，措辞“一(a)”或“一(an)”可意指一种或超过一种。
除非明确指示为仅指代替代物或所述替代物互相排除，否则在权利要求书中术语“或”的使用是用于意指“和/或”，不过本公开支持仅指代替代物和“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可意指至少第二种或更多种。
在本申请中，术语“约”用于指示一个值包括针对用于确定所述值的器件、方法的固有误差变化，或在研究受试者之间存在的变化。
本发明的其他目标、特征以及优点将根据以下详细描述变得显而易知。然而，应了解所述详细描述和具体实施例虽然指示本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改根据这个详细描述对于所属领域技术人员将变得显而易知。
附图简述
以下图式形成本说明书的一部分并且包括在内以进一步证明本发明的某些方面。本发明可通过与本文提供的具体实施方案的详细描述组合参考这些图式中的一个或多个来更好地理解。
图1-(半)胱氨酸酶催化的示意图：hCGL和工程改造的hCGL变体将L-胱氨酸转化为丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸。硫代半胱氨酸非酶促降解为硫化氢和L-半胱氨酸。L-半胱氨酸进一步由hCGL和工程改造的hCGL变体降解为丙酮酸、氨和硫化氢。
图2A-B-(A)L-胱氨酸(空心圆)和(B)L-半胱氨酸(实心圆)的hCGL-TV催化的降解的米-曼二氏动力学。
图3-在37℃下在汇集的人类血清中的hCGL-TV(空心圆)随时间而变的活性，其中表观T0.5为228±6h。
图4A-B-用变化浓度的hCGL-TV治疗的前列腺肿瘤系(A)DU145和(B)PC3，其中针对每一细胞系的表观IC50值为约60nM。
图5-hCGL-TV的氨基酸序列(SEQIDNO:11)。含有N端His6标签并且来自具有突变E59T-E339V的残基2-405的hCGL氨基酸序列以粗体加下划线。
图6A-B–(A)消除胱氨酸水平超过96h和(B)降低胱氨酸水平超过48h的FVB小鼠(n＝5/组)中PEG-hCGL-TV的单一50mg/kg腹膜内剂量。(***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，并且NS＝不显著。
图7-随时间追踪FVB小鼠(n＝5/组)中PEG-hCGL-TV的单一50mg/kg腹膜内剂量的药物动力学，产生约23h的吸收T1/2和40±7h的消除T1/2。
图8-具有HMVP2前列腺癌同种异体移植物的FVB小鼠(每一组n＝8)用PEG-hCGL-TV以50mg/kg体重(空心正方形)、用PEG-hCGL-TV以100mg/kg体重(实心三角形)、用PBS(空心圆)或热灭活PEG-hCGL-TV以100mg/kg体重(实心菱形)每4天一次腹膜内处理。
图9-具有人类(PC3)前列腺癌异种移植物的雄性裸小鼠(每一组n＝7)用PEG-hCGL-TV以50mg/kg体重(实心三角形)、用PEG-hCGL-TV以100mg/kg体重(实心圆)、用PBS(实心菱形)或热灭活PEG-hCGL-TV以100mg/kg体重(实心正方形)每4天一次腹膜内处理。
说明性实施方案的描述
半胱氨酸被视为非必需氨基酸，因为其可由源于必需氨基酸L-甲硫氨酸的高半胱氨酸经由转硫途径合成，所述转硫途径包含酶胱硫醚-β-合酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)。因此，预期半胱氨酸的缺乏对于具有完整转硫途径的正常组织相对无毒。某些癌症可具有转硫途径酶CBS和/或CGL的异常低或不存在的表达，因此需要所述酶以从细胞外区室输入L-半胱氨酸/L-胱氨酸。在肝细胞癌中，CBS的下调进一步导致不良预后(Kim等人,2009)，并且也已经观察到胃肠癌具有CBS的频繁表观遗传沉默(Zhao等人,2012)。在其他实施例中，CGL表达的不存在已经频繁地在淋巴母细胞性白血病细胞系中观察到(Glode等人,1981；Link等人,1983)。CBS和CGL以及xCT(-)半胱氨酸转运体的表达水平构成针对用半胱氨酸/半胱氨酸缺乏方案治疗的患者选择的重要肿瘤生物标记物。
本发明提供使L-(半)胱氨酸降解的工程改造的治疗性酶。还提供使用所述酶来治疗如癌症、溶酶体贮积病(即，胱氨酸贮积症)的疾病并且消除多种自身免疫病况中的不利免疫效应的方法。因此，可使这些氨基酸缺乏的治疗性酶可用作免疫调节剂。
I.定义
如本文所用，术语“蛋白”和“多肽”是指包含经由肽键接合的氨基酸的化合物并且可互换使用。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指含有以非原生方式可操作地连接的蛋白或蛋白片段的嵌合蛋白。
如本文所用，术语“半衰期”(1/2生命)是指例如在注射于哺乳动物中后，其多肽的浓度体外或体内下降一半将所需的时间。
术语“呈可操作组合”、“呈可操作顺序”和“可操作地连接”是指键联，其中如此描述的组分呈允许其以其预期方式起作用的关系，例如以使得核酸分子能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白分子的合成的方式实现的核酸序列的键联，或以使得产生融合蛋白的方式实现的氨基酸序列的键联。
术语“接头”意图指用作分子桥以可操作地连接两种不同分子的化合物或部分，其中所述接头的一个部分可操作地连接于第一分子，并且其中所述接头的另一部分可操作地连接于第二分子。
术语“PEG化”是指与聚乙二醇(PEG)缀合，聚乙二醇已经广泛地用作药物载体，给定其高程度的生物相容性和修饰简易性。PEG可经由化学方法通过在PEG链的末端的羟基偶联(例如共价连接)于活性剂；然而，PEG本身局限于每个分子至多两个活性剂。在一种不同方法中，PEG和氨基酸的共聚物已经作为新颖的生物材料加以研究，所述生物材料将保留PEG的生物相容性，但将具有每个分子多个连接点的附加优势(因此提供较大的药物负载)，并且可以合成方式设计以适合多种应用。
术语“基因”是指包含多肽或其前体的产生所必需的控制和编码序列的DNA序列。所述多肽可由全长编码序列或由所述编码序列的任何部分编码，以便保留所需的酶活性。
术语“原生”是指基因、基因产物的典型形式，或当从自然存在来源分离时所述基因或基因产物的特征。原生形式是最常在自然群体中观察到的形式并且因此任意地指定为正常或野生型形式。相比之下，术语“经修饰”、“变体”或“突变体”是指当与原生基因或基因产物相比时展示序列和功能特性的修饰(即，改变的特征)的基因或基因产物。
术语“载体”用于指载体核酸分子，核酸序列可插入其中以引入至细胞中，所述核酸序列可在所述细胞中复制。核酸序列可为“外源的”，这意指其与其中正引入所述载体的细胞无关，或所述序列与所述细胞中的序列同源，但在宿主细胞核酸中通常未发现所述序列的位置中。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。所属领域的技术人员将准备好通过标准重组技术构建载体(参见例如Maniatis等人,1988和Ausubel等人,1994，均以引用的方式并入本文)。
术语“表达载体”是指包含编码能够转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些情况下，RNA分子接着翻译成蛋白、多肽或肽。在其他情况下，这些序列例如在反义分子或核糖酶的产生中未翻译。表达载体可含有多种“控制序列”，所述控制序列是指特定宿主细胞中可操作地连接的编码序列的转录和可能发生的翻译所必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列，载体和表达载体还可含有也发挥其他功能并且描述如下的核酸序列。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指用于方法中以实现治疗效应的治疗组合物(如治疗性聚核苷酸和/或治疗性多肽)的量。如本申请中所用的术语“治疗益处”或“治疗有效”是指关于这种病况的医学治疗，促进或增强受试者的良好状态的任何事物。这包括但不限于疾病的病征或症状的频率或严重程度的降低。例如，癌症的治疗可涉及例如肿瘤尺寸的降低、肿瘤侵袭性的降低、癌症的生长速率的降低或转移的预防。癌症的治疗还可指延长具有癌症的受试者的生存。
如本文所用的术语“KM”是指关于酶的米-曼二氏常数并且定义为使给定的酶在酶催化反应中产生一半的其最大速度的特异性底物浓度。如本文所用的术语“kcat”是指转换数或每单位时间每一个酶位点转化为产物的底物分子的数目，并且其中所述酶以最大效率起作用。如本文所用的术语“kcat/KM”为特异性常数，其为酶将底物转化为产物如何有效的量度。
术语“胱硫醚-γ-裂解酶”(CGL或胱硫醚酶)是指催化胱硫醚水解为半胱氨酸的任何酶。例如，其包括胱硫醚-γ-裂解酶的灵长类动物形式，或具体说来，胱硫醚-γ-裂解酶的人类形式。
“治疗(Treatment)”和“治疗(treating)”是指治疗剂施用或应用于受试者或程序或用药程式对受试者的性能，用于获得疾病或健康相关病况的治疗益处。例如，治疗可包括施用药学上有效量的(半)胱氨酸酶。
“受试者”和“患者”是指人类或非人类，如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，所述受试者为人类。
II.胱硫醚-γ-裂解酶
裂解酶为催化各种化学键的断裂的酶，通常形成新的双键或新的环结构。例如，催化这个反应的酶将为裂解酶：ATP→cAMP+PPi。裂解酶与其他酶的不同之处在于其仅需要一种底物用于沿一个方向的反应，但需要两种底物用于逆反应。
多种吡哆醛-5′-磷酸(PLP)依赖酶牵涉于半胱氨酸、高半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢中，并且这些酶形成进化相关家族，被指定为Cys/Met代谢PLP依赖酶。这些酶为约400个氨基酸的蛋白并且PLP基团连接于位于所述多肽的中心位置中的赖氨酸残基。这个家族的成员包括胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)、胱硫醚-γ-合酶(CGS)、胱硫醚-β-裂解酶(CBL)、甲硫氨酸-γ-裂解酶(MGL)、O-乙酰基高丝氨酸(OAH)/O-乙酰基-丝氨酸(OAS)硫化氢解酶(OSHS)。其中所有酶的共通之处在于形成米氏复合物，导致外部底物醛亚胺。所述反应的进一步过程通过所述特定酶的底物特异性确定。
例如，本发明人将特异性突变引入至PLP依赖裂解酶家族成员胱硫醚-γ-裂解酶中，以改变其底物特异性。以这种方式，本发明人制造了具有重新使L-胱氨酸和L-半胱氨酸降解的能力的新颖变体。在其他实施方案中，也可涵盖用于产生新颖L-(半)胱氨酸降解活性的其他PLP依赖酶的修饰。
胱硫醚-γ-裂解酶(CGL或胱硫醚酶)为将胱硫醚分解为半胱氨酸和α-酮基丁酸酯的酶。吡哆醛磷酸为这种酶的辅基。如实施例中所示，使用蛋白工程改造将仅具有关于L-半胱氨酸和L-胱氨酸降解的微弱活性的胱硫醚酶转化为可以高速率降解这些氨基酸的酶。
III.(半)胱氨酸酶工程改造
一些实施方案涉及经修饰蛋白和多肽。特定实施方案涉及展现至少一种可与未修饰型式相当的功能活性的经修饰蛋白或多肽，所述功能活性优选地为L-(半)胱氨酸降解活性。在其他方面，所述蛋白或多肽可进一步经修饰以增加血清稳定性。因此，当本申请涉及“经修饰蛋白”或“经修饰多肽”的功能或活性时，所属领域的技术人员应了解这包括例如相对于未修饰蛋白或多肽具有额外优势的蛋白或多肽，所述额外优势如L-(半)胱氨酸降解活性。在某些实施方案中，所述未修饰蛋白或多肽为原生CGL，优选地为人类CGL。具体说来，预期涉及“经修饰蛋白”的实施方案可关于“经修饰多肽”实施，并且反之亦然。
活性的确定可使用所属领域的技术人员所熟悉的测定，具体说来关于所述蛋白的活性来实现，并且可包括为了比较目的，例如使用经修饰或未修饰蛋白或多肽的原生和/或重组型式。例如，L-(半)胱氨酸降解活性可通过检测由于L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的降解而引起的任何底物的产生的任何测定来确定，所述测定如使用3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)来检测丙酮酸(Takakura等人,2004)。
在某些实施方案中，如经修饰CGL的经修饰多肽可基于其L-(半)胱氨酸降解活性的增加来鉴定。举例来说，可鉴定未修饰多肽的底物识别位点。这种鉴定可基于结构分析或同源性分析。可产生涉及所述底物识别位点的修饰的突变体的群体。在另一实施方案中，可从所述突变体群体选择具有增加的L-(半)胱氨酸降解活性的突变体。所需突变体的选择可包括用于检测L-(半)胱氨酸降解的副产物或产物的方法。
经修饰蛋白可具有氨基酸的缺失和/或取代；因此，具有缺失的蛋白、具有取代的蛋白和具有缺失和取代的蛋白为经修饰蛋白。在一些实施方案中，这些经修饰蛋白可进一步包括插入或添加的氨基酸，例如融合蛋白或具有接头的蛋白。“经修饰缺失蛋白”缺乏原生蛋白的一个或多个残基，但可具有原生蛋白的特异性和/或活性。“经修饰缺失蛋白”也可具有降低的免疫原性或抗原性。经修饰缺失蛋白的实例为从至少一个抗原区域(即，所述蛋白中经确定在特定生物体中具抗原性的区域)缺失氨基酸残基的蛋白，所述生物体如可施用所述经修饰蛋白的生物体类型。
取代或置换变体典型地含有在所述蛋白内的一个或多个位点处的一种氨基酸与另一氨基酸的交换并且可设计为调节所述多肽的一种或多种特性，尤其是其效应功能和/或生物可用性。取代可为或可不为保守的，即一种氨基酸用具有类似形状和电荷的氨基酸置换。保守取代为所属领域中众所周知的并且包括例如以下改变：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异白氨酸至白氨酸或缬氨酸；白氨酸至缬氨酸或异白氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至白氨酸或异白氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、白氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸至异白氨酸或白氨酸。
除了缺失或取代，经修饰蛋白还可具有残基的插入，其典型地涉及所述多肽中至少一个残基的添加。这可包括靶向肽或多肽或简单地单一残基的插入。下文讨论末端添加(称为融合蛋白)。
术语“生物功能相等物”在所属领域中得到充分了解并且在本文中进一步详细定义。相应地，包括具有约70％与约80％之间，或约81％与约90％之间，或甚至约91％与约99％之间的与控制多肽的氨基酸同一或功能上相等的氨基酸的序列，只要维持所述蛋白的生物活性。经修饰蛋白在某些方面可与其原生对应物生物功能相等。
还应了解，氨基酸和核酸序列可包括额外残基，如额外N或C端氨基酸或5′或3′序列，并且还基本上如本文所公开的序列之一所陈述，只要所述序列满足以上陈述的准则，包括维持蛋白表达所涉及的生物蛋白活性。末端序列的添加尤其适用于可例如包括侧接编码区的5′或3′部分中的任一者的各种非编码序列或可包括已知出现于基因内的各种内部序列(即，内含子)的核酸序列。
IV.用于疗法的酶促L-(半)胱氨酸降解
在某些方面，所述多肽可用于用使L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸缺失的新颖酶治疗疾病，包括对L-(半)胱氨酸缺失敏感的癌症，如肝细胞癌、黑素瘤和肾细胞癌。本发明具体说来公开使用具有L-(半)胱氨酸降解活性的经修饰CGL的治疗方法。本发明的某些实施方案提供具有L-(半)胱氨酸降解活性的新颖酶用于增加的治疗功效。
本发明的某些方面提供用于治疗如肿瘤的疾病的具有L-(半)胱氨酸降解活性的经修饰CGL。在一个实施例中，所述经修饰多肽可具有人类多肽序列并且因此可预防人类患者中的过敏性反应，允许重复给药，并且增加治疗功效。
本发明治疗方法可适用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，如在实体肿瘤或血液学肿瘤中发现的那些。示例性实体肿瘤可包括但不限于选自由胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳房组成的群组的器官的肿瘤。示例性血液学肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可使用本文提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、各种类型的头颈部癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、小痣恶性黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、结节性黑素瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小无裂细胞NHL；贮积病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)和慢性成髓细胞性白血病。
所述癌症可具体说来具有以下组织学类型，不过其不限于这些：赘生物，恶性；癌瘤；癌瘤，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；联合肝细胞癌与胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜形成的硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；盯聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞状上皮癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；睾丸母细胞瘤，恶性；塞尔托利细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；泡状横纹肌肉瘤；间质性肉瘤；混合肿瘤，恶性；米勒管混合肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波济氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙原性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室鼓膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸粒性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。
源于CGL的工程改造的灵长类动物(半)胱氨酸酶可在本文中在多种用于使肿瘤细胞、肿瘤组织或具有癌症的哺乳动物的循环中缺乏L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸或用于在认为可需要L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸缺乏的情况下使L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸缺乏的用药程式中用作抗肿瘤剂。
缺乏可体内在哺乳动物的循环中、体外在需要组织培养物或其他生物培养基中的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸缺乏的情况下和在其中生物流体、细胞或组织在身体外操作并且随后返回患者哺乳动物的身体的离体程序中实施。实施循环、培养基、生物流体或细胞的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸缺乏以减少可接近正在处理的材料的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的量，并且因此其包括使欲缺乏的材料与L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸降解量的工程改造的灵长类动物(半)胱氨酸酶在L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸降解条件下接触以便降解正在进行接触的材料的周围L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸。
因为肿瘤细胞可依赖于其关于L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的营养培养基，所以所述缺乏可针对用于所述细胞的营养源，并且不必要针对所述细胞本身。因此，在体内应用中，治疗肿瘤细胞包括使用于肿瘤细胞的群体的营养培养基与工程改造的(半)胱氨酸酶接触。在这个实施方案中，所述培养基可为血液、淋巴液、脊髓液和其中需要L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸缺乏的类似体液。
L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸降解效率可视所述应用广泛地变化，并且典型地取决于存在于所述材料中的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸的量、所需缺乏速率和所述材料对于暴露于(半)胱氨酸酶的耐受性。材料中的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸水平和因此所述材料的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸缺乏速率可容易地通过所属领域中众所周知的多种化学和生物化学方法来监测。示例性L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸降解量进一步描述于本文中，并且可介于每毫升(mL)欲处理的材料0.001至100单位(U)的工程改造的(半)胱氨酸酶、优选地约0.01至10U并且更优选地约0.1至5U的工程改造的(半)胱氨酸酶范围内。
L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸降解条件为可与CGL酶的生物活性相容的缓冲液和温度条件，并且包括可与所述酶相容的适度温度、盐和pH条件，例如生理条件。示例性条件包括约4-40℃、与约0.05至0.2MNaCl相当的离子强度和约5至9的pH，而生理条件包括在内。
在一个特定实施方案中，本发明涵盖使用工程改造的(半)胱氨酸酶作为抗肿瘤剂的方法，并且因此包括使肿瘤细胞的群体与治疗有效量的工程改造的(半)胱氨酸酶接触一段足以抑制肿瘤细胞生长的时间。
在一个实施方案中，所述体内接触通过施用、通过静脉内或腹膜内注射治疗有效量的包含本发明的工程改造的(半)胱氨酸酶的生理可耐受组合物至患者而实现，由此使存在于所述患者中的肿瘤细胞的循环L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸来源缺乏。工程改造的(半)胱氨酸酶的所述接触也可通过施用所述工程改造的(半)胱氨酸酶至含有肿瘤细胞的组织中来实现。
工程改造的(半)胱氨酸酶的治疗有效量为经计算以实现所需效应，即使肿瘤组织中或患者的循环中的L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸缺乏并且由此使肿瘤细胞停止分裂的预定量。因此，用于本发明的工程改造的(半)胱氨酸酶的施用的剂量范围为足够大以产生其中肿瘤细胞分裂和细胞循环的症状减少的所需效应的那些。所述剂量不应大到引起不利的副作用，如高粘血症症状、肺水肿、充血性心力衰竭等。一般来说，所述剂量将随着患者的年龄、健康状态、性别和疾病程度而变化并且可由所属领域的技术人员确定。如果发生任何并发症，那么所述剂量可由个别医师调节。
例如，工程改造的(半)胱氨酸酶的治疗有效量可为使得当在生理可耐受组合物中施用时足以实现每mL约0.001至约100单位(U)、优选地超过约0.1U并且更优选地每mL超过1U的工程改造的(半)胱氨酸酶的血管内(血浆)或局部浓度的量。典型剂量可基于体重施用，并且在约5-1000U/公斤(kg)/天、优选地约5-100U/kg/天、更优选地约10-50U/kg/天并且更优选地约20-40U/kg/天的范围内。
所述工程改造的(半)胱氨酸酶可肠胃外通过注射或通过随时间逐渐输注来施用。所述工程改造的(半)胱氨酸酶可静脉内、腹膜内、经口、肌肉内、皮下、腔内、透皮、经皮施用，可通过蠕动构件递送，可直接注射至含有肿瘤细胞的组织中，或可通过连接至可含有潜在生物传感器或L-(半)胱氨酸的导管的泵施用。
含有工程改造的(半)胱氨酸酶的治疗组合物常规地静脉内施用，例如通过注射单位剂量。术语“单位剂量”当关于治疗组合物使用时是指适合作为用于受试者的单位剂量的物理个别单位，各单位含有经计算以联合所需稀释剂(即载体或媒介物)产生所需治疗效应的预定量的活性材料。
所述组合物以可与剂量配制物相容的方式并且以治疗有效量施用。欲施用的量取决于欲治疗的受试者、所述受试者的全身利用活性成分的能力和所需治疗效应的程度。需要施用的活性成分的精确量取决于从业人员的判断并且对各个体来说是独特的。然而，用于全身性应用的适合剂量范围公开于本文中并且取决于施用途径。还涵盖用于初始施用和加强注射的适合方案并且所述方案由初始施用、随后在一个或多个小时的时间间隔下通过后续注射或其他施用进行重复给药来代表。示例性多次施用描述于本文中并且尤其优选维持工程改造的(半)胱氨酸酶的持续高血清和组织水平和相反地L-(半)胱氨酸的低血清和组织水平。或者，涵盖足以维持血液中在体内疗法所规定的范围内的浓度的持续静脉内输注。
V.缀合物
本发明的组合物和方法涉及工程改造的(半)胱氨酸酶，如通过与异源肽区段或如聚乙二醇的聚合物形成缀合物。在其他方面，所述工程改造的(半)胱氨酸酶可连接于PEG以增加所述酶的流体动力学半径并且因此增加血清持续性。在某些方面，所公开的多肽可缀合于任何靶向试剂，如具有特异性且稳定地结合于肿瘤细胞上的外部受体或结合位点的能力的配体(美国专利公布2009/0304666)。
A.融合蛋白
本发明的某些实施方案涉及融合蛋白。这些分子可具有在N或C端连接于异源结构域的经修饰的胱硫醚酶。例如，融合物也可采用来自其他物种的前导序列以允许异源宿主中蛋白的重组表达。另一种适用的融合物包括如血清白蛋白亲和标签或六组氨酸残基的蛋白亲和标签或如抗体表位的免疫活性结构域(优选地可裂解)的添加以促进融合蛋白的纯化。非限制性亲和标签包括聚组氨酸、甲壳素结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。
在一个特定实施方案中，所述(半)胱氨酸酶可连接于增加体内半衰期的肽，如XTEN多肽(Schellenberger等人,2009)、IgGFc结构域、白蛋白或白蛋白结合肽。
所属领域的技术人员众所周知产生融合蛋白的方法。所述蛋白可例如通过重新合成完全融合蛋白或通过连接编码异源结构域的DNA序列、随后表达完整融合蛋白来产生。
重新获得亲本蛋白的功能活性的融合蛋白的产生可通过连接基因与编码肽接头的桥接DNA区段来促进，所述肽接头在串联连接的多肽之间剪接。所述接头将具有足以允许所得融合蛋白的适当折叠的长度。
B.接头
在某些实施方案中，所述工程改造的(半)胱氨酸酶可使用双官能交联试剂化学缀合或在蛋白层面上与肽接头融合。
双官能交联试剂已经广泛地用于多种目的，包括亲和基质的制备、不同结构的修饰和稳定化、配体和受体结合位点的鉴定和结构研究。适合的肽接头也可用于连接所述工程改造的(半)胱氨酸酶，如Gly-Ser接头。
携带两个同一官能团的同源双官能试剂证实在诱导同一与不同的巨分子或巨分子的亚单位之间的交联和多肽配体与其特异性结合位点的连接方面高度有效。异源双官能试剂含有两个不同官能团。通过利用所述两个不同官能团的差异反应性，可选择性地并且依序地控制交联。所述双官能交联试剂可根据其官能团的特异性分类，所述官能团例如氨基、硫氢基、胍、吲哚、羧基特异性基团。其中，针对自由氨基的试剂已经由于其商业可得性、合成简易性和可应用所述试剂的适度反应条件而变得尤其受欢迎。
大多数的异源双官能交联试剂含有伯胺反应性基团和硫醇反应性基团。在另一实施例中，描述异源双官能交联试剂和使用所述交联试剂的方法(美国专利号5,889,155，以全文引用的方式特定地并入本文中)。所述交联试剂组合亲核酰肼残基与亲电子顺丁烯二酰亚胺残基，从而在一个实施例中允许醛偶联到自由硫醇。所述交联试剂可经修饰以交联各种官能团。
另外，所属领域的技术人员已知的任何其他连接/偶联剂和/或机制均可用于组合灵长类动物工程改造的(半)胱氨酸酶，例如抗体-抗原相互作用、抗生物素蛋白生物素键联、酰胺键联、酯键联、硫酯键联、醚键联、硫醚键联、磷酸酯键联、磷酰胺键联、酐键联、二硫化物键联、离子和疏水性相互作用、双特异性抗体和抗体片段或其组合。
优选将采用在血液中具有适度稳定性的交联剂。已知多种类型的含双硫键接头可成功地用于缀合靶向和治疗/预防剂。含有位阻型双硫键的接头可证实产生较大的体内稳定性。这些接头因此为一组连接剂。
除了受阻交联剂以外，也可据此采用非受阻接头。不考虑含有或产生受保护二硫化物，其他适用的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak和Thorpe,1987)。所属领域中充分了解所述交联剂的使用。另一实施方案涉及柔性接头的使用。
一旦进行化学缀合，所述肽一般将经纯化以分离所述缀合物与未缀合试剂和其他污染物。大量纯化技术可用于提供具有充足纯度程度的缀合物以使其在临床上适用。
基于尺寸分离的纯化方法一般将最有用，如凝胶过滤、凝胶渗透或高效液相色谱。也可使用其他色谱技术，如Blue-Sepharose分离。从包涵体纯化融合蛋白的常规方法可为适用的，如使用弱清洁剂，如N-月桂酰基-肌氨酸钠(SLS)。
C.PEG化
在本发明的某些方面，公开与工程改造的(半)胱氨酸酶的PEG化有关的方法和组合物。例如，所述工程改造的(半)胱氨酸酶可根据本文公开的方法PEG化。
PEG化为聚(乙二醇)聚合物链共价连接于另一分子(通常为药物或治疗蛋白)的过程。PEG化惯常地通过用靶巨分子孵育PEG的反应性衍生物来实现。PEG共价连接于药物或治疗蛋白可对宿主的免疫系统“遮蔽”所述试剂(降低的免疫原性和抗原性)或增加所述试剂的流体动力学尺寸(溶液中的尺寸)，由此通过降低肾清除率而延长其循环时间。PEG化也可向疏水性药物和蛋白提供水溶性。
PEG化的第一个步骤是PEG聚合物的一个或两个末端处的适合官能化。每一个末端处均用相同反应性部分活化的PEG称作“同源双官能”，而如果存在的官能团不同，那么所述PEG衍生物称作“异源双官能”或“杂官能”。制备所述PEG聚合物的化学活性或活化衍生物以连接PEG至所需分子。
用于所述PEG衍生物的适合官能团的选择是基于将偶联到所述PEG的分子上可得的反应性基团的类型。关于蛋白，典型反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。也可使用N端氨基酸和C端羧酸。
用于形成第一代PEG衍生物的技术一般为使所述PEG聚合物与可与羟基反应的基团(典型地为酐、酰氯、氯甲酸酯和碳酸酯)反应。在第二代PEG化化学中，如醛、酯、酰胺等的更有效官能团可用于缀合。
由于PEG化的应用已经变得越来越先进和复杂，对于用于缀合的异源双官能PEG的需要已经增加。这些异源双官能PEG极适用于连接其中需要亲水性、柔性和生物相容性间隔基的两个实体。用于异源双官能PEG的优选端基为顺丁烯二酰亚胺、乙烯基砜、二硫吡啶、胺、羧酸和NHS酯。
最常见修饰剂或接头是基于甲氧基PEG(mPEG)分子。其活性取决于添加蛋白修饰基团至醇末端。在一些情况下，聚乙二醇(PEG二醇)用作前体分子。所述二醇随后在两个末端处经修饰以便制造异质二聚或同型二聚PEG连接分子。
蛋白一般在亲核位点，如未质子化硫醇(半胱氨酰基残基)或氨基处PEG化。半胱氨酰基特异性修饰试剂的实例包括PEG顺丁烯二酰亚胺、PEG碘乙酸酯、PEG硫醇和PEG乙烯基砜。所有四者均在适度条件和中性至略微碱性pH下强烈地具有半胱氨酰基特异性，但各具有一些缺陷。用顺丁烯二酰亚胺形成的硫醚可在碱性条件下略微不稳定，因此关于使用这种接头的配制选项可存在一些限制。用碘PEG形成的硫代氨基甲酸酯键联更稳定，但自由碘可在一些条件下修饰酪氨酸残基。PEG硫醇与蛋白硫醇形成二硫键，但这种键联也可在碱性条件下不稳定。PEG-乙烯基砜反应性与顺丁烯二酰亚胺和碘PEG相比相对缓慢；然而，所形成的硫醚键联极稳定。其较慢反应速率也可使PEG-乙烯基砜反应更容易控制。
在原生半胱氨酰基残基处的位点特异性PEG化很少进行，因为这些残基通常呈二硫键的形式或为生物活性所需。另一方面，定点诱变可用于并入用于硫醇特异性接头的半胱氨酰基PEG化位点。必须设计半胱氨酸突变，使得其可接近所述PEG化试剂并且在PEG化后仍为生物活性的。
胺特异性修饰剂包括PEGNHS酯、PEG三氟乙基磺酸酯、PEG醛、PEG异硫氰酸酯等。其均在适度条件下反应并且对氨基极具特异性。所述PEGNHS酯可能为一种更具反应性的试剂；然而，其高反应性可使PEG化反应在大规模下难以控制。PEG醛与氨基形成亚胺，其接着用氰基硼氢化钠还原成仲胺。不同于硼氢化钠，氰基硼氢化钠将不会还原二硫键。然而，这种化学品具有高度毒性并且必须谨慎地处置，尤其在其变得具挥发性的较低pH下。
归因于大多数蛋白上的多个赖氨酸残基，位点特异性PEG化可具有挑战。幸运的是，因为这些试剂与未质子化氨基反应，所以有可能通过在较低pH下进行所述反应而将PEG化导向较低pK氨基。一般来说，α-氨基的pK比赖氨酸残基的ε-氨基低1-2pH单位。通过在pH7或更低下PEG化所述分子，经常可获得对N端的高选择性。然而，这仅在所述蛋白的N端部分不为生物活性所需的情况下可行。另外，PEG化的药物动力学益处经常强于体外生物活性的显著损失，从而与PEG化化学无关，产生具有大得多的体内生物活性的产物。
当开发PEG化程序时，考虑数种参数。幸运的是，通常存在不超过四种或五种关键参数。优化PEG化条件的“实验设计”方法可极其适用。关于硫醇特异性PEG化反应，欲考虑的参数包括：蛋白浓度、PEG与蛋白比率(以摩尔计)、温度、pH、反应时间和在一些情况下氧气的排除。(氧气可有助于通过所述蛋白实现分子间二硫化物形成，其将降低PEG化产物的产率。)关于胺特异性修饰应考虑相同因素(氧气除外)，除了pH可甚至更关键，尤其当靶向N端氨基时。
关于胺和硫醇特异性修饰，反应条件可影响所述蛋白的稳定性。这可限制温度、蛋白浓度和pH。另外，在开始PEG化反应之前应已知所述PEG接头的反应性。例如，如果PEG化试剂仅为70％活性，那么所用PEG的量应确保仅活性PEG分子计算在蛋白与PEG反应化学计量中。
VI.蛋白和肽
在某些实施方案中，本发明涉及包含至少一种蛋白或肽的新颖组合物，所述蛋白或肽如工程改造的(半)胱氨酸酶。这些肽可包含于融合蛋白中或缀合于如上文所述的试剂。
如本文所用，蛋白或肽一般指但不限于大于约200个氨基酸直至从基因翻译的全长序列的蛋白；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3至约100个氨基酸的肽。为了方便起见，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。
如本文所用，“氨基酸残基”是指任何自然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或所属领域中已知的任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，所述蛋白或肽的残基为连续的，而无任何非氨基酸中断氨基酸残基的序列。在其他实施方案中，所述序列可包含一个或多个非氨基酸部分。在特定实施方案中，所述蛋白或肽的残基的序列可由一个或多个非氨基酸部分中断。
因此，术语“蛋白或肽”涵盖包含自然存在的蛋白中发现的20种常见氨基酸中的至少一者或至少一种经修饰或特殊氨基酸的氨基酸序列。
蛋白或肽可通过所属领域的技术人员已知的任何技术制备，所述技术包括蛋白、多肽或肽通过标准分子生物技术的表达、蛋白或肽与自然来源的分离或蛋白或肽的化学合成。对应于各种基因的核苷酸和蛋白、多肽和肽序列先前已经加以公开，并且可在所属领域的技术人员已知的计算机化数据库中发现。一种所述数据库为美国国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库(在万维网ncbi.nlm.nih.gov/上可得)。用于已知基因的编码区可使用本文所公开或所属领域的技术人员将知晓的技术扩增和/或表达。或者，所属领域的技术人员已知蛋白、多肽和肽的各种商业制剂。
VII.核酸和载体
在本发明的某些方面，可公开编码工程改造的(半)胱氨酸酶或含有经修饰的(半)胱氨酸酶的融合蛋白的核酸序列。视所用的表达系统而定，可基于常规方法选择核酸序列。例如，如果所述工程改造的(半)胱氨酸酶来源于灵长类动物CGL并且含有大肠杆菌中很少使用的多种密码子，那么其可干扰表达。因此，各别基因或其变体可针对大肠杆菌表达进行密码子优化。多种载体也可用于表达相关蛋白，如工程改造的(半)胱氨酸酶。示例性载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子或基于脂质体的载体。
VIII.宿主细胞
宿主细胞可为可转化以允许工程改造的(半)胱氨酸酶和其缀合物的表达和分泌的任何细胞。宿主细胞可为细菌、哺乳动物细胞、酵母或丝状真菌。各种细菌包括埃希氏菌属和杆菌属。属于酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属的酵母将可用作适当宿主细胞。丝状真菌的多个种可用作表达宿主，包括以下属：曲霉属、木霉属、脉孢菌属、青霉属、头孢属、绵霉属、柄孢壳菌属、内座壳属、毛霉菌属、旋孢腔菌属和梨孢属。
适用的宿主生物体的实例包括细菌，例如大肠杆菌MC1061、枯草杆菌BRB1的衍生物(Sibakov等人,1984)、金黄色葡萄球菌SAI123(Lordanescu,1975)或变铅青链霉菌(Hopwood等人,1985)；酵母，例如酿酒酵母AH22(Mellor等人,1983)或粟酒裂殖酵母；和丝状真菌，例如构巢曲霉、泡盛曲霉(Ward,1989)或里氏木霉(Penttila等人,1987；Harkki等人,1989)。
哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCCCCL61)、大鼠垂体细胞(GH1；ATCCCCL82)、海拉S3细胞(ATCCCCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H-4-II-E；ATCCCRL1548)、SV40转化猴肾细胞(COS-1；ATCCCRL1650)和鼠类胚细胞(NIH-3T3；ATCCCRL1658)。前述为说明性的，而非限制所属领域中已知的多种可能的宿主生物体。原则上，所有能够分泌的宿主均可使用，无论原核生物或真核生物。
表达所述工程改造的(半)胱氨酸酶和/或其融合蛋白的哺乳动物宿主细胞在典型地用于培养亲本细胞系的条件下培养。一般来说，细胞在含有生理盐和营养物的标准培养基，如标准RPMI、MEM、IMEM或DMEM中培养，典型地补充有5％-10％血清，如胎牛血清。培养条件也为标准的，例如培养物在37℃下在固定或滚筒培养物中孵育直至实现所述蛋白的所需水平。
IX.蛋白纯化
蛋白纯化技术是所属领域的技术人员众所周知的。这些技术在一个层面上涉及细胞、组织或器官至多肽和非多肽部分的均质化和粗分离。除非另外规定，否则相关蛋白或多肽可使用色谱和电泳技术进一步纯化以实现部分或完全纯化(或纯化至同质性)。尤其适合制备纯肽的分析方法为离子交换色谱、凝胶排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱、免疫亲和色谱和等电子聚焦。纯化肽的尤其有效方法为快速高效液相色谱(FPLC)或甚至高效液相色谱(HPLC)。
纯化蛋白或肽意图指可与其他组分分离的组合物，其中所述蛋白或肽相对于其自然可获得状态纯化至任何程度。因此，分离或纯化蛋白或肽还指从其可自然存在的环境中分离的蛋白或肽。一般来说，“纯化”将指已经受分离以去除各种其他组分的蛋白或肽组合物，并且所述组合物实质上保留其表达的生物活性。在使用术语“实质上纯化”的情况下，这个名称将指组合物，其中所述蛋白或肽形成所述组合物的主要组分，如构成所述组合物中的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白。
适合用于蛋白纯化的各种技术是所属领域的技术人员众所周知的。这些技术包括例如用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀，或通过热变性，随后离心；色谱步骤，如离子交换、凝胶过滤、逆相、羟磷灰石和亲和色谱；等电子聚焦；凝胶电泳；和这些和其他技术的组合。如所属领域中一般已知，相信进行各种纯化步骤的顺序可改变，或特定步骤可省略，并且仍引起用于制备实质上纯化蛋白或肽的适合方法。
所属领域的技术人员鉴于本发明已知用于定量所述蛋白或肽的纯化程度的各种方法。这些方法包括例如确定活性部分的比活性，或通过SDS/PAGE分析来分析部分内多肽的量。用于分析部分的纯度的优选方法是计算所述部分的比活性，将其与初始提取物的比活性相比较，并且因此计算其中纯度程度，所述纯度程度通过“纯化倍数”来分析。用于表示活性的量的实际单位当然将取决于选择用于进行纯化的特定测定技术和所表达的蛋白或肽是否展现可检测活性。
一般不要求所述蛋白或肽将始终以其最纯状态提供。事实上，预期实质上不太纯的产物可在某些实施方案中有用。部分纯化可通过组合使用较少纯化步骤或通过利用相同的一般纯化方案的不同形式来实现。例如，预期利用HPLC装置进行的阳离子交换柱色谱一般将引起大于利用低压色谱系统的相同技术的纯化“倍数”。展现较低程度的相对纯化的方法可在蛋白产物的总回收方面，或在维持所表达的蛋白的活性方面具有优势。
在某些实施方案中，蛋白或肽可分离或纯化，例如工程改造的(半)胱氨酸酶、含有所述工程改造的AAD的融合蛋白或工程改造的(半)胱氨酸酶后PEG化。例如，His标签或亲和表位可包含于所述工程改造的(半)胱氨酸酶中以促进纯化。亲和色谱为依赖于欲分离的物质与其可特异性结合的分子之间的特异性亲和力的色谱程序。这是受体-配体类型的相互作用。柱材料通过使一种结合搭配物共价偶联到不溶性基质来合成。所述柱材料接着能够特异性地从溶液吸附所述物质。洗脱通过将所述条件改变为其中将不发生结合的那些条件(例如，改变的pH、离子强度、温度等)而发生。所述基质应为不会吸附分子至任何显著程度并且具有广泛范围的化学、物理和热稳定性的物质。所述配体应以不会影响其结合特性的方式偶联。所述配体还应提供相对紧密结合。应有可能洗脱所述物质而不会破坏样品或所述配体。
尺寸排阻色谱(SEC)为其中溶液中的分子基于其尺寸或以更具技术性术语来说其流体动力学体积来分离的色谱方法。其通常适用于大分子或巨分子复合物，如蛋白和工业聚合物。典型地，当水溶液用于通过柱输送样品时，所述技术称作凝胶过滤色谱，与名称凝胶渗透色谱相对，所述凝胶渗透色谱是在有机溶剂用作流动相时使用。
SEC的潜在原理是不同尺寸的粒子将以不同速率通过固定相洗脱(过滤)。这导致粒子的溶液基于尺寸的分离。只要所有粒子同时或接近同时负载，相同尺寸的粒子应一起洗脱。各尺寸排阻柱具有可分离的分子量范围。排阻限制规定在这个范围的上端的分子量并且是分子过大而无法在固定相中捕捉的情况。渗透限制规定在分离范围的下端的分子量并且是具有足够小尺寸的分支可完全穿透至固定相的孔隙中并且低于这种分子质量的所有分子均过小而使得其作为单一色带洗脱的情况。
高效液相色谱(或高压液相色谱，HPLC)是频繁用于生物化学和分析化学中以分离、鉴定和定量化合物的柱色谱形式。HPLC利用容纳色谱填充材料(固定相)的柱、移动流动性通过所述柱的泵和显示所述分子的保留时间的检测器。保留时间视固定相、所分析的分子和所用溶剂之间的相互作用而变化。
X.药物组合物
预期所述新颖(半)胱氨酸酶可全身性或局部地施用以抑制肿瘤细胞生长并且最优选地杀死具有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中的癌细胞。其可静脉内、鞘内和/或腹膜内施用。其可单独或与抗增生药物组合施用。在一个实施方案中，在手术或其他程序之前施用所述甲硫氨酸酶以降低患者中的癌症负荷。或者，其可在手术后施用以确保任何剩余癌症(例如，手术无法消除的癌症)不存活。
本发明不意图受治疗制剂的特定性质限制。例如，所述组合物可与生理可耐受液体、凝胶或固体载体、稀释剂和赋形剂一起在配制物中提供。这些治疗制剂可施用于用于兽医用途的哺乳动物(如使用家畜)，和以类似于其他治疗剂的方式施用于人类中用于临床用途。一般来说，治疗功效所需的剂量将根据使用类型和施用模式以及个别受试者的特殊需求而变化。
所述组合物典型地制备为液体溶液或悬浮液，用作可注射剂。适合的稀释剂和赋形剂为例如水、生理盐水、右旋糖、甘油等，和其组合。另外，必要时，所述组合物可含有少量辅助物质，如湿润剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。
在预期临床应用的情况下，可能有必要制备呈适合于预期应用的形式的包含蛋白、抗体和药物的药物组合物。一般来说，药物组合物可包含有效量的一种或多种溶解或分散于药学上可接受的载体中的CGL变体或额外试剂。措辞“药物或药学上可接受”是指当视情况而定施用于例如人类的动物时不会产生不利、过敏或其他不适当反应的分子实体和组合物。含有至少一种通过本文所公开的方法分离的CGL变体或额外活性成分的药物组合物的制备将由所属领域的技术人员鉴于本发明已知，如以引用的方式并入本文中的Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,1990所示例。此外，关于动物(例如人类)施用，应了解制剂应满足如美国食品药品管理局生物标准办公室(FDAOfficeofBiologicalStandards)所要求的无菌性、致热性、一般安全性和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、所述类似材料和其组合，如所属领域的技术人员应已知(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,1990，以引用的方式并入本文中)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则预期其在药物组合物中之使用。
本发明的某些实施方案可包含不同类型的载体，取决于其是否欲以固体、液体或气雾剂形式施用，和其针对如注射的施用途径是否需要为无菌的。所述组合物可静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、经粘膜、经口、表面、局部、通过吸入(例如气雾剂吸入)、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接洗刷靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、在脂质组合物(例如脂质体)中或通过如所属领域的技术人员应已知的其他方法或前述的任何组合(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第18版,1990，以引用的方式并入本文中)施用。
所述经修饰多肽可配制成呈自由、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如用蛋白组合物的自由氨基形成的那些，或用例如盐酸或磷酸的无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。用自由羧基形成的盐也可衍生于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。在配制时，溶液将以可与剂量配制物相容的方式并且以如治疗有效的量施用。所述配制物容易以各种剂型施用，如配制用于肠胃外施用，如可注射溶液或用于递送至肺的气雾剂，或配制用于饮食施用，如药物释放胶囊等。
进一步根据本发明的某些方面，适合施用的组合物可在具有或不具有惰性稀释剂的药学上可接受的载体中提供。所述载体应为可同化的并且包括液体、半固体(即糊剂)或固体载体。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对接受者或对其中所含组合物的治疗有效性有害，否则其在用于实践所述方法的可施用组合物中的使用是适当的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、生理盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等，或其组合。所述组合物也可包含各种抗氧化剂以延迟一种或多种组分的氧化。另外，微生物的作用的预防可通过防腐剂，如各种抗细菌剂和抗真菌剂，包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合来实现。
根据本发明的某些方面，所述组合物与所述载体以任何便利且实用方式，即通过溶液、悬浮液、乳化、掺合物、封装、吸收等组合。所述程序对于所属领域的技术人员是惯常的。
在本发明的一个特定实施方案中，所述组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。所述混合可以任何便利方式，如研磨来实现。稳定剂也可添加于混合过程中以便保护所述组合物免于治疗活性的损失，即胃中的变性。用于组合物中的稳定剂的实例包括缓冲液、氨基酸(如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物(如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等)。
在其他实施方案中，本发明可涉及包括CGL变体、一种或多种脂质和水性溶剂的药物脂质媒介物组合物的使用。如本文所用，术语“脂质”将定义为包括广泛范围的特征在于不溶于水中并且可用有机溶剂萃取的物质中的任一者。这一广泛种类的化合物是所属领域的技术人员众所周知的并且当术语“脂质”用于本文中时，其不限于任何特定结构。实例包括含有长链脂族烃和其衍生物的化合物。脂质可为自然存在的或合成的(即，人工设计或制造)。然而，脂质通常为生物物质。生物脂质是所属领域中众所周知的并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫酯、具有醚和酯连接脂肪酸的脂质、可聚合脂质和其组合。当然，所述组合物和方法还涵盖由所属领域的技术人员理解为脂质的不同于本文特定描述的那些的化合物。
所属领域的技术人员应熟悉可用于将组合物分散于脂质媒介物中的技术的范围。例如，所述工程改造的(半)胱氨酸酶或其融合蛋白可分散于含有脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，共价键结于脂质，呈悬浮液形式含于脂质中，含于胶束或脂质体中或与胶束或脂质体复合，或通过所属领域的技术人员已知的任何方式另外与脂质或脂质结构缔合。所述分散可或可不导致脂质体的形成。
施用于动物患者的组合物的实际剂量可由如体重、病况的严重程度、所治疗的疾病的类型、先前或并行治疗介入、患者的自发病和施用途径的物理和生理因素决定。视施用的剂量和途径而定，优选的剂量和/或有效量的施用数目可根据受试者的反应变化。负责施用的从业人员将在任何情况下决定组合物中活性成分的浓度和针对个别受试者的适当剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可例如构成单位重量的约2％至约75％之间，或约25％至约60％之间，和可从其中导出的任何范围。当然，各治疗适用组合物中的活性化合物的量可以使得将在所述化合物的任何给定单位剂量中获得适合剂量的方式准备。制备所述药物配制物的领域的技术人员将考虑如溶解度、生物可用性、生物半衰期、施用途径、产品保存期的因素以及其他药物考虑，并且因而，多种剂量和治疗方法可为需要的。
在其他非限制性实施例中，剂量也可包含每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重至约1000毫克/kg/体重或更高，和可从其中推导的任何范围。在可从本文所列的数目推导的范围的非限制性实施例中，可基于上文所述的数目施用约5毫克/kg/体重至约100毫克/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
XI.组合治疗
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及施用与第二或额外疗法组合的(半)胱氨酸酶。所述疗法可应用于治疗与(半)胱氨酸缺乏有关的任何疾病。例如，所述疾病可为癌症。
所述方法和组合物(包括组合疗法)增强治疗或保护效应，和/或增加另一抗癌或抗过度增生疗法的治疗效应。治疗和预防方法和组合物可以有效实现所需效应的组合量提供，所述效应如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增生。这一过程可涉及向所述细胞施用(半)胱氨酸酶和第二疗法。组织、肿瘤或细胞可暴露于一种或多种包含一种或多种所述试剂(即，(半)胱氨酸酶或抗癌剂)的组合物或药物配制物，或通过使所述组织、肿瘤和/或细胞与两种或更多种不同组合物或配制物接触，其中一种组合物提供1)(半)胱氨酸酶，2)抗癌剂，或3)(半)胱氨酸酶和抗癌剂。另外，预期所述组合疗法可联合化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法使用。
术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时在本文中用于描述将治疗构建体和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并列放置的过程。举例来说，为了实现细胞杀死，两种试剂以有效杀死细胞或预防其分裂的组合量递送至细胞。
(半)胱氨酸酶可在抗癌治疗之前、期间、之后或在相对于抗癌治疗的各种组合中施用。所述施用可呈介于并行至数分钟至数天至数周范围内的时间间隔。在其中所述(半)胱氨酸酶与抗癌剂分开提供至患者的实施方案中，一般将确保在每次递送的时间之间持续很长的一段时间，使得所述两种化合物将仍能够对所述患者发挥有利组合效应。在所述情况下，预期可向患者提供所述(半)胱氨酸酶和所述抗癌疗法，彼此在约12至24或72h内并且更具体说来彼此在约6-12h内。在一些情形下，可需要显著延长治疗的时间段，其中在各别施用之间相隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在某些实施方案中，治疗过程将持续1-90天或更久(这一所述范围包括介入日)。预期一种试剂可在第1天至第90天(这一所述范围包括介入日)中的任一天或其任何组合给予，并且另一种试剂在第1天至第90天(这一所述范围包括介入日)中的任一天或其任何组合给予。在一天(24小时时期)内，可给予所述患者所述试剂的一次或多次施用。此外，在治疗过程之后，预期存在一段不施用抗癌治疗的时间。这个时间段可持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更久(这个所述范围包括介入日)，取决于所述患者的健康状态，如其预后、体力、健康等。预期所述治疗循环必要时将重复。
可采用多种组合。关于以下实施例，(半)胱氨酸酶为“A”并且抗癌疗法为“B”：
本发明实施方案的任何化合物或疗法向患者的施用将遵循关于所述化合物的施用的一般方案，虑及所述试剂的毒性(如果有的话)。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。
A.化学疗法
多种化学治疗剂可根据本发明实施方案使用。术语“化学疗法”是指使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症的治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂或药物通过其在细胞内的活性模式来分类，例如其是否和在哪个阶段影响细胞周期。或者，试剂可基于其直接交联DNA、插入DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征。
化学治疗剂的实例包括烷基化剂，如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；乙撑亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；草苔虫素；海绵多烯酮类化合物(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀；多达霉素(包括合成性类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仓、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、罗莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其卡奇霉素λ1I和卡奇霉素ΩI1)；达内霉素，包括达内霉素A；双膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、多柔比星、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸、亚德利亚霉素(包括吗啉基-亚德利亚霉素、氰基吗啉基-亚德利亚霉素、2-吡咯啉基-亚德利亚霉素和脱氧亚德利亚霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀和佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、蝶罗呤和曲美沙特；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺药，如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；嗯尿嘧啶；安吖啶；百垂布昔；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类化合物，如美登素和安斯菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；丙亚胺；利索新；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；糖胞嘧啶(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类化合物，例如紫杉醇和多烯紫杉醇；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，如顺铂、奥克赛铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，如视黄酸；卡培他滨；卡波铂、丙卡巴肼、寡霉素、吉西他滨、新霉酰胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反式铂和以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
B.放射疗法
引起DNA破坏并且已经广泛使用的其他因素包括通常称作γ射线、X射线者，和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还涵盖其他形式的DNA破坏因素，如微波、质子束照射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV照射。最有可能所有这些因素均影响对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复和染色体的组装和维持的广泛范围的破坏。针对X射线的剂量范围介于在延长时间段(3至4周)内50至200伦琴的每日剂量至2000-6000伦琴的单一剂量范围内。针对放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于所述同位素的半衰期、所发射的放射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
C.免疫疗法
熟练技术人员应了解，免疫疗法可与所述实施方案的方法组合或联合使用。在癌症治疗的上下文中，免疫治疗剂一般依赖于免疫效应细胞和分子的使用以靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗为所述实例。所述免疫效应子可为例如对肿瘤细胞的表面上的一些标志物具特异性的抗体。所述抗体单独可用作疗法的效应子或其可募集其他细胞来实际影响细胞杀死。所述抗体还可缀合于药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、篦麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)并且仅用作靶向剂。或者，所述效应子可为携带直接或间接地与肿瘤细胞靶相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫疗法的一方面，肿瘤细胞必须具有一些服从靶向(即不存在于大多数的其他细胞上)的标志物。存在多种肿瘤标志物并且这些标志物中的任一者均可适用于本发明实施方案的上下文中的靶向。常见肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erbB和p155。免疫疗法的一个替代方面是组合抗癌效应与免疫刺激效应。免疫刺激分子也存在，包括：细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN；趋化因子，如MIP-1、MCP-1、IL-8；和生长因子，如FLT3配体。
目前在研究中或在使用中的免疫疗法的实例为免疫佐剂，例如牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人,1998；美国专利5,824,311)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。
D.手术
约60％的患有癌症的人将经历一些类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括其中所有或一部分癌性组织以物理方式去除、切除和/或破坏的切除术，并且可与其他疗法，如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法联合使用。肿瘤切除术是指肿瘤的至少一部分的物理去除。除肿瘤切除术以外，通过手术进行的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和用显微镜控制的手术(莫氏手术)。
在切除癌性细胞、组织或肿瘤的一部分或全部后，可在身体中形成空腔。治疗可通过灌注、直接注射或具有额外抗癌疗法的区域的局部应用来实现。所述治疗可重复，例如每隔1、2、3、4、5、6或7天，或每隔1、2、3、4和5周或每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可具有变化的剂量。
E.其他试剂
预期其他试剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以改进治疗的治疗功效。这些额外试剂包括影响细胞表面受体和GAP结的上调的试剂、细胞抑制和分化试剂、细胞粘着抑制剂、增加过度增生细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的试剂或其他生物试剂。通过提高GAP结的数目实现的细胞间信号传导的增加将增加对相邻过度增生细胞群体的抗过度增生效应。在其他实施方案中，细胞抑制或分化试剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以改进治疗的抗过度增生功效。预期细胞粘着抑制剂改进本发明实施方案的功效。细胞粘着抑制剂的实例为粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步预期增加过度增生细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂(如抗体c225)可能与本发明实施方案的某些方面组合使用以改进治疗功效。
XII.试剂盒
本发明的某些方面可提供试剂盒，如治疗试剂盒。例如，试剂盒可包含一种或多种如本文所述的药物组合物和任选地关于其使用的说明书。试剂盒还可包含一种或多种用于实现所述组合物的施用的器件。例如，本发明试剂盒可包含药物组合物和用于实现所述组合物向癌性肿瘤中的直接静脉内注射的导管。在其他实施方案中，本发明试剂盒可包含任选地配制为医药品或冻干的工程改造的(半)胱氨酸酶的预填充安瓿，与递送器件一起使用。
试剂盒可包含具有标签的容器。适合的容器包括例如瓶、小瓶和试管。所述容器可由多种材料，如玻璃或塑料形成。所述容器可容纳包括有效用于治疗或非治疗应用的工程改造的(半)胱氨酸酶的组合物，如上文所述。所述容器上的标签可指示所述组合物用于特定疗法或非治疗应用，并且还可指示关于体内或体外使用的指导，如上文所述的那些。本发明的试剂盒将典型地包含上文所述的容器和一个或多个包含由商业和使用者观点来说可需要的材料的其他容器，所述材料包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
XIII.实施例
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应了解，以下实施例中所公开的技术表示由本发明人发现在本发明的实践中运作良好的技术，并且因此可被视为构成优选的其实践模式。然而，本领域技术人员根据本发明应了解，在所公开的特定实施方案中可进行多种改变并且所述改变仍获得类似或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1-作为人类(半)胱氨酸酶的骨架的胱硫醚-γ-裂解酶
归因于临床上使用非人类蛋白治疗剂所见的免疫原性的非所需效应，本发明人设法将治疗上相关的胱氨酸/半胱氨酸降解活性工程改造至人类酶中(即，对酶进行工程改造使其针对胱氨酸/半胱氨酸具有高kcat和低KM值并且还呈现有利的特异性)。人类具有被称为胱硫醚-γ-裂解酶(hCGL)的酶，所述酶的功能是催化哺乳动物转硫途径中的最后步骤(Rao等人,1990)，即将L-胱硫醚转化为L-半胱氨酸、α-酮基丁酸酯和氨。人类CGL还可微弱地降解L-半胱氨酸和其二硫化物形式L-胱氨酸，使其成为工程改造的理想候选物。使用结构上和系统发育上指导的诱变，工程改造hCGL变体以有效地水解L-半胱氨酸和L-胱氨酸。
实施例2-人类胱硫醚-γ-裂解酶和人类(半)胱氨酸酶的基因合成和表达
hCGL基因含有大肠杆菌中很少使用并且可干扰表达的多种密码子。因此，为了优化大肠杆菌中的蛋白表达，各别基因用使用DNA-Works软件(Hoover等人,2002)设计的密码子优化的寡核苷酸组装。各构建体含有N端NcoI限制位点、框内N端His6标签和用于简化克隆的C端EcoRI位点。在克隆至pET28a载体(Novagen)中之后，含有适当hCGL表达载体的大肠杆菌(BL21)在37℃下在250rpm下的振荡烧瓶中使用含50μg/ml卡那霉素的极品肉汤(TerrificBroth，TB)培养基生长，直至实现约0.5-0.6的OD600。此时，所述培养物转到在25℃下的振荡器中，并且用0.5mMIPTG诱导，并且允许表达蛋白再持续12h。细胞集结粒接着通过离心收集并且再悬浮于IMAC缓冲液(10mMNaPO4/10mM咪唑/300mMNaCl,pH8)中。在通过弗氏细胞压碎器溶解之后，溶解产物在4℃下在20,000×g下离心20min，并且所得上清液应用于镍IMAC柱，用10-20个柱体积的IMAC缓冲液洗涤，并且接着用IMAC洗脱缓冲液(50mMNaPO4/250mM咪唑/300mMNaCl,pH8)洗脱。含有酶的部分接着在25℃下用10mM吡哆醛磷酸(PLP)孵育1小时。使用10,000MWCO离心过滤器件(AMICONTM)，蛋白接着数次缓冲液交换至100mMPBS、10％甘油、pH7.3溶液中。hCGL酶或hCGL-变体酶的等分试样接着在液氮中急骤冷冻并且存储于-80℃下。以这种方式纯化的hCGL或hCGL-变体酶为>95％均质，如通过SDS-PAGE和考马斯染色所分析。产率基于6M盐酸胍、20mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)的最终缓冲液浓度中的计算消光系数ε280＝29,870M-1cm-1计算为约200-300mg/L培养物(Gill和vonHippel,1989)。
实施例3-针对(半)胱氨酸酶活性和排序克隆的96孔板筛选
人类CGL缓慢地将L-半胱胺酸降解为丙酮酸、氨和H2S，并且将L-胱氨酸转化为丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸(kcat/KM分别为约0.2s-1mM-1和0.5s-1mM-1)(图1)。硫代半胱氨酸进一步非酶促降解为L-半胱氨酸和H2S。使用3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)来检测丙酮酸的比色测定(Takakura等人,2004)针对96孔板格式定比例以用于筛选小的文库并且用于对具有最大胱氨酸和/或半胱氨酸裂解酶活性的克隆排序。这种板筛选提供一种用于从诱变文库拣选最具活性克隆的容易方法。选择展示大于亲本对照的活性的克隆用于进一步表征。
将含有诱变的hCGL或hCGL对照物的单一群落拣选至每孔含有75μL含有50μg/ml卡那霉素的TB培养基的96孔培养板中。这些培养物接着在37℃下在板振荡器上生长，直至实现约0.8–1的OD600。在冷却至25℃之后，添加每孔额外75μL含有50μg/ml卡那霉素和2mMIPTG的培养基。在25℃下在振荡下进行表达持续至少2h，之后将每孔100μL培养物转移至96孔分析板中。所述分析板接着离心以使细胞集结成粒，去除培养基并且通过添加每孔50μLB-PER蛋白萃取试剂(Pierce)使细胞溶解。在通过离心清除后，溶解产物在两个板之间分流，一个板中用0.8mML-胱氨酸孵育并且另一板中用1.2mML-半胱氨酸孵育，并且在37℃下孵育10-12h。接着通过添加3份1M乙酸钠中的0.03％MBTH溶液(pH5)使所述反应衍生。所述板在50℃下加热40min并且在冷却后在λ＝320nm下在微量滴定板读取器中读数。
实施例4-诱变对hCGL的残基E59、R119和E339的效应
结构分析指示残基E59、R119和E339有可能牵涉于hCGL对其底物L-胱硫醚的识别中。在这些位点处构建NNS密码子(N可为A、T、G或C；S可为G或C)饱和文库并且使用以下诱变引物筛选所述文库：(E59)正向5'-GGCCAGCATAGCGGTTTTNNSTATAGCCGTAGCGGC(SEQIDNO:12)、反向5'-GCCGCTACGGCTATASNNAAAACCGCTATGCTGGCC(SEQIDNO:13)、(R119)正向5'-GTATGGTGGGACCAATNNSTATTTCCGTCAGGTGGCG(SEQIDNO:14)、反向5'-CGCCACCTGACGGAAATASNNATTGGTCCCACCATAC(SEQIDNO:15)、(E339)正向5'-CTGAAACTGTTTACCCTGGCANNSAGCTTGGGCGGCTTTG(SEQIDNO:16)和反向5'-CAAAGCCGCCCAAGCTSNNTGCCAGGGTAAACAGTTTCAG(SEQIDNO:17)，使用作为模板DNA的hCGL基因和特异性末端引物；正向5'-GATATACCATGGGAGGCCATCACCACCATCATCATGGCGGGCAGGAAAAGGATGCG(SeqIDNO:18)和反向5'-CTCGAATTCTCAACTGTGGCTTCCCGATGGGGGATGGGCCGCTTTCAGCGCCTGATCC(SEQIDNO:19)。PCR产物用NcoI和EcoRI消化并且用T4DNA连接酶接合至pET28a载体中。所得接合直接转化至大肠杆菌(BL21)中并且接种于LB-卡那霉素板上用于如实施例3中所述进行后续筛选。所有文库均以其理论尺寸的两倍过量进行筛选。分离呈现活性的克隆并且确定hCGL基因变体的序列以鉴定突变。
所述酶变体纯化至如通过SDS-PAGE所分析大于95％均质性。用PLP孵育显示可能增强比活性，因为用于表达的大肠杆菌细胞并未针对所产生的酶的量产生充足PLP。一旦所述酶已经负载PLP，其为稳定的并且在数天的存储后可能检测到无辅因子的损失并且因此无活性降低。
实施例5-人类(半)胱氨酸酶变体hCGL-TV的表征
发现由所述筛选鉴定为具有针对使L-胱氨酸和L-半胱氨酸降解的最高催化活性的一种特定变体具有以下突变：E59T、R119R的同义密码子改变和E339V。这种变体被称为hCGL-TV(图5)并且使用类似于实施例3中所述的测定的1mL规模MBTH测定表征其在100mMPBS缓冲液中在pH7.3和37℃下降解L-(半)胱氨酸的能力。在这些条件下，发现所述hCGL-TV变体以1.0±0.05s-1的kcat、0.16±0.02mM的KM和6.3±1.0s-1mM-1的kcat/KM使L-胱氨酸降解(图2A)。进一步发现所述hCGL-TV变体针对L-半胱氨酸的降解具有0.8±0.03s-1的kcat、0.25±0.04mM的KM和3.2±0.6s-1mM-1的kcat/KM(图2B)。
通过在37℃下在汇集的人类血清中孵育来测试hCGL-TV的血清稳定性。在各时间点，抽取等分试样并且使用L-胱氨酸作为底物测试剩余活性。在对数据绘制曲线后，发现所述hCGL-TV变体极稳定，其中表观T0.5为228±6h(图3)。
实施例6-hCGL-TV针对前列腺肿瘤细胞系的体外细胞毒性
使用DU145和PC3前列腺肿瘤细胞系分析hCGL-TV的体外细胞毒性。细胞以约3000个细胞/孔接种于RPMI-1640培养基中并且允许生长24h，接着向各孔中添加介于0-10μM范围内的hCGL-TV的滴定液。在孵育3天后，使用(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑(MTS)测定以比色法分析存活细胞的相对数目。所得的数据的分析针对DU145细胞系和PC3细胞系均产生约60nM的表观IC50值(分别为图4A和4B)。
实施例7-人类(半)胱氨酸酶的药理学制剂
所述hCGL-TV酶如实施例2中所述进行纯化，具有一个例外：在结合于所述IMAC柱之后，所述蛋白在所述样品中用含有0.1％TRITONTM114的IMAC缓冲液广泛地洗涤(90-100个柱体积)。所述样品用10-20个柱体积的IMAC缓冲液再次洗涤并且接着用IMAC洗脱缓冲液(50mMNaPO4/250mM咪唑/300mMNaCl,pH8)洗脱。用TRITONTM114洗涤用于内毒素去除。所述纯化蛋白使用10,000MWCO过滤器件缓冲液交换至100mMNaPO4缓冲液(pH8.3)中。随后，添加10mM的浓度的PLP并且所述蛋白在25℃下孵育1h。甲氧基PEG琥珀酰亚胺羧基甲酯5000MW(JenKemTechnology)接着以80:1摩尔比添加至hCGL-TV中并且允许在25℃下在恒定搅拌下反应1h。所得混合物使用100,000MWCO过滤器件广泛地进行缓冲液交换(具有10％甘油的PBS)，并且用0.2微米针筒过滤器(VWR)灭菌。使用LimulusAmebocyteLysate(LAL)试剂盒(CapeCodIncorporated)分析所有PEG化酶的脂多糖(LPS)含量。
实施例8-灵长类动物(半)胱氨酸酶的工程改造
来自如黑猩猩(黑猩猩；SEQIDNO:9)、倭黑猩猩(倭黑猩猩；SEQIDNO:10)、猩猩(苏门答腊猩猩；SEQIDNO:7)和弥猴(食蟹猴；SEQIDNO:8)的灵长类动物物种的CGL的序列的氨基酸组成分别与人类CGL(SEQIDNO:1)为约99.3％、98.8％、96％和95.3％同一性。归因于序列相似性，来自这些生物体的工程改造的CGL如果作为治疗剂引入至人类中将不可能引起显著免疫反应。具有赋予增强的(半)胱氨酸酶活性的突变的灵长类动物CGL酶将使用如实施例4中所述的标准诱变技术构建。所得的基因将被克隆至pET28a中并且验证序列以确保未并入非所需的突变。用于表达并且纯化所得的酶的构建体描述于上文。预期在对应于59T和339V(SEQIDNO:3-6)的氨基酸位置工程改造的灵长类动物CGL针对L-胱氨酸和L-半胱氨酸具有增强的活性，其中kcat/KM值为至少1×103s-1M-1或更高。在37℃下具有增强的(半)胱氨酸酶活性的工程改造的灵长类动物CGL的血清稳定性将如上文所述加以确定。
实施例9-小鼠中PEG-hCGL-TV的药效学(PD)分析
雄性FVB小鼠腹膜内注射50mg/kgPEG-hCGL-TV并且在第0、1、2、4和6天处死(每组n＝5)用于血液和血清收集。血清样品与10皮摩尔氘化胱氨酸和半胱氨酸的内标混合物混合并且使用OMEGATM离心器件3kDa截止值(PallLifeBiosciences)超滤(Tiziani等人,2008；Tiziani等人,2013)。经过过滤的极性部分使用逆相BEHC18,1.7μm,2.1×150mm柱(THERMOSCIENTIFICTM 1250UPLC,WatersCorporation,USA)进行色谱分析并且引入联合电喷雾电离的EXACTIVETMPlusORBITRAPTM质谱仪(ThermoFisherScientific,SanJose,CA)中。用仪器提供的XCALIBURTM软件以质心MS模式从50至700m/z质量范围获得数据。将胱氨酸和半胱氨酸的相对浓度报告为平均值±SEM。如图6A中可见，PEG-hCGL-TV显著降低血清胱氨酸水平(>95％)持续超过96h，并且具有半胱氨酸水平的80％降低持续超过48h(图6B)。
实施例10-小鼠中PEG-hCGL-TV的药物动力学(PK)分析
使用如实施例9中所述的相同血清样品分析PEG-hCGL-TV的循环持续性。使用斑点印迹密度测定技术，用抗hCGL抗体(兔抗CTHSigma#C8248)探测样品，随后添加抗兔IgG-FITC(SantaCruzBiotechnology#sc-2012)以通过在TYPHOONTM扫描仪(GEHealthcare)上在488nm下激发来目测。使用ImageJ软件(Schneider等人,2012)，将所述样品的密度测定带与相同印迹内的已知量的PEG-hCGL-TV的滴定液相比较以构建标准曲线并且计算相对血清PEG-hCGL-TV水平。将这一数据与血管外施用模型(Foye等人,2007；Stone等人,2012)拟合证明了对于PEG-hCGL-TV来说约23h的吸收T1/2和40±7h的消除T1/2(图7)。
实施例11-PEG-hCGL-TV对同种异体移植物模型中HMVP2肿瘤细胞的生长的效应
PEG-hCGL-TV抑制肿瘤发展的能力在小鼠前列腺癌(HMVP2)同种异体移植物模型中加以评估。对于这一实验，HMVP2细胞呈椭圆体生长并且用于在四组(八只小鼠/组)FVB/N雄性小鼠的胁腹中在皮下注射后引发肿瘤。细胞生长大约2周，此时在注射位点处的小肿瘤变得可触知。所述四组中的每一组接着每4天通过腹膜内注射施用50或100mg/kg的PEG-hCGL-TV、PBS(对照物)或100mg/kg的热灭活PEG-hCGL-TV(额外对照物)。如图8中所示，与两个对照组(即，单独PBS注射和灭活酶注射对照组)相比，用PEG-hCGL-TV处理产生了肿瘤生长的显著抑制，其在两种剂量(50和100mg/kg)下均为高度统计学显著的。重要的是，重复给药在处理期中为极良好耐受的。在这点上，在实验过程中在经处理小鼠和对照组小鼠中并无体重或食物消耗的差异。最后，在这一实验结束时，对小鼠进行尸体剖检并且在宏观评估时在任何主要器官中均未见异常。
实施例12-PEG-hCGL-TV对异种移植物模型中PC3前列腺肿瘤细胞的生长的效应
PEG-hCGL-TV抑制肿瘤发展的能力在人类前列腺癌(PC3)异种移植物模型中加以评估。对于这一实验，PC3细胞用于在四组(七只小鼠/组)FVB/N雄性小鼠的胁腹中在皮下注射后引发肿瘤。细胞生长10天，此时在注射位点处的肿瘤变得可触知。所述四组中的每一组接着每4天通过腹膜内注射施用50或100mg/kg的PEG-hCGL-TV、PBS(对照物)或100mg/kg的热灭活PEG-hCGL-TV(额外对照物)。如图9中可见，与两个对照组(即，单独PBS注射和灭活酶注射对照组)相比，用PEG-hCGL-TV处理在两种剂量(50和100mg/kg)下均引起了肿瘤生长的显著延迟。重复给药在处理期中在这一小鼠品系中也为极良好耐受的，其中在实验过程中在经处理小鼠和对照组小鼠中并无体重或食物消耗的差异。在这一实验结束时，对小鼠进行尸体剖检并且在宏观评估时在任何主要器官中均未见异常。
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本文所公开并且要求的所有方法均可根据本发明进行并且实施而无需不当实验。虽然本发明的组合物和方法已经就优选的实施方案加以描述，但本领域技术人员应显而易知，变化可应用于所述方法和本文所述方法的步骤中或步骤序列中而不偏离本发明的概念、精神以及范围。更具体说来，应显而易知在化学上并且在生理学上相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时将实现相同或相似结果。本领域技术人员显而易知的所有所述相似的取代物和修饰均被视为在随附权利要求书所界定的本发明的精神、范围以及概念内。
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Claims (33)

1.一种分离的经修饰灵长类动物胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)，其相对于原生灵长类动物CGL氨基酸序列(参见SEQIDNO:1和7-10)具有至少一种取代，所述至少一种取代包括在所述原生灵长类动物CGL序列的位置59处的苏氨酸。
2.如权利要求1所述的酶，其进一步包含位置339处的缬氨酸取代。
3.如权利要求1所述的酶，其进一步包含异源肽区段。
4.如权利要求3所述的酶，其中所述异源肽区段为XTEN肽、IgGFc、白蛋白或白蛋白结合肽。
5.如权利要求1所述的酶，其中所述酶偶联到聚乙二醇(PEG)。
6.如权利要求5所述的酶，其中所述酶经由一个或多个赖氨酸或胱氨酸残基偶联到PEG。
7.一种分离的经修饰灵长类动物胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)，其相对于原生灵长类动物CGL氨基酸序列(参见SEQIDNO:1和7-10)具有至少两种取代，所述至少两种取代包括在所述原生灵长类动物CGL序列的位置59处的苏氨酸和位置339处的缬氨酸。
8.一种核酸，其包含编码如权利要求1所述的酶的核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的核酸，其中所述核酸针对细菌、真菌、昆虫或哺乳动物中的表达进行密码子优化。
10.一种包含如权利要求8或9所述的核酸的表达载体。
11.一种包含如权利要求8或9所述的核酸的宿主细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
13.一种药物配制物，其包含在药学上可接受的载体中的原生或经修饰灵长类动物胱硫醚-γ-裂解酶(CGL)、包含编码原生灵长类动物CGL酶的核苷酸序列的核酸、如权利要求1所述的酶或如权利要求8或9所述的核酸。
14.一种治疗肿瘤细胞或具有肿瘤细胞的受试者的方法，其包括向所述肿瘤细胞或所述受试者施用治疗有效量的如权利要求13所述的配制物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述受试者维持L-胱氨酸和/或L-半胱氨酸限制性饮食。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述受试者维持正常饮食。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述肿瘤细胞已经被鉴定为相对于非肿瘤细胞具有降低的胱硫醚-β-合酶或胱硫醚-γ-裂解酶基因的表达水平。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述肿瘤细胞已经被鉴定为相对于非肿瘤细胞具有增加的xCT(-)半胱氨酸转运体的表达水平。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述受试者为人类患者。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述配制物静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐带内、经口、通过吸入、通过注射、通过输注、通过持续输注、通过直接洗刷靶细胞的局部灌注、经由导管或经由灌洗施用。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述配制物施用于所述肿瘤细胞的营养培养基中。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述营养培养基为血液、淋巴液或脊髓液。
23.如权利要求14所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用至少一种第二抗癌疗法。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述第二抗癌疗法为手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
25.一种包含根据权利要求1所述的酶或根据权利要求8所述的核酸的组合物，其用于受试者中肿瘤细胞的治疗。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述酶偶联到聚乙二醇(PEG)。
27.如权利要求25所述的组合物，其中所述核酸针对细菌、真菌、昆虫或哺乳动物中的表达进行密码子优化。
28.如权利要求25所述的组合物，其中所述组合物经配制用于肿瘤内、静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、眼内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐带内、经口施用。
29.如权利要求25所述的组合物，其中所述组合物经配制用于施用于所述肿瘤细胞的营养培养基中。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述营养培养基为血液、淋巴液或脊髓液。
31.如权利要求25所述的组合物，其进一步包含至少一种第二抗癌疗法。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述第二抗癌疗法为化学疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。
33.根据权利要求1所述的酶或根据权利要求8所述的核酸的用途，其用于制造用于治疗肿瘤细胞的药剂。
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