CN110346555A - 一种肝脏脂质代谢调控fxr蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用 - Google Patents

一种肝脏脂质代谢调控fxr蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及应用。在高脂饮食小鼠制备的脂肪肝模型上，通过形态学和Western blotting方法证实硫化氢通过代谢性核受体FXR缓解脂肪肝。在293A细胞转染人His‑FXR质粒及FXR锌指结构半胱氨酸突变质粒，并给予硫化氢供体处理，通过改良生物素转换实验和锌离子荧光强度实验检测并验证FXR硫氢化修饰，并确定修饰位点，发现硫化氢可使肝脏FXR Cys138/141位点发生硫氢化修饰，增强FXR对肝脏脂质合成关键酶转录调控能力，最终减轻肝脏脂质蓄积。本发明准确得到FXR蛋白硫氢化修饰位点，为缓解非酒精性脂肪肝疾病提供了新途径。

Description

一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法及 应用
技术领域
本发明属于生物科学技术领域，具体涉及一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，本发明还涉及一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的应用。
背景技术
随着人们饮食结构和生活方式的改变，非酒精性脂肪肝已成为不可忽视的慢性肝病，除了过多的脂质摄入、糖脂代谢紊乱及HCV感染外，氨基酸特别是蛋氨酸代谢异常也是非酒精性脂肪肝发病的重要原因。
蛋氨酸是人体必需氨基酸也是体内重要的甲基供体，在体内蛋氨酸脱甲基后生成S-腺苷蛋氨酸，进而代谢生成同型半胱氨酸；其中50％的同型半胱氨酸再甲基化成蛋氨酸(称为蛋氨酸循环)，其余的同型半胱氨酸在胱硫醚β合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)催化下产生胱硫醚，再经胱硫醚γ裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE)催化产生半胱氨酸，并释放硫化氢气体，半胱氨酸最终代谢成丙酮酸进入三羧酸循环，而硫化氢则代谢成硫酸盐及硫代硫酸盐。
内源性H2S是蛋氨酸代谢的中间产物，依赖于胱硫醚β合酶及胱硫醚γ裂解酶催化产生，被认为是一种新型气体信号分子。肝脏是H2S产生最多的器官之一，其内源性生成关键酶胱硫醚β合酶和胱硫醚γ裂解酶，在肝细胞中表现出高表达。在啮齿类动物肝脏中胱硫醚γ裂解酶蛋白量超过胱硫醚β合酶蛋白量的近60倍，肝脏90％中的H2S由CSE催化产生。
FXR(farnesoid X receptor)属于类固醇激素核受体家族，当配体与FXR配体结合区结合后，FXR空间结构发生变化，与视黄酸X受体以异二聚体形式结合于靶基因启动子区的FXRE(FXR response element，FXRE)来调控基因的表达。FXR蛋白结构DNA结合区中通常包含两个高度保守的富含半胱氨酸残基的锌指结构。晶体结构分析显示，锌指结构有利于DBD特异性序列与DNA双螺旋大沟结合，增强核受体转录活性。FXR对靶基因的调控通路复杂，不仅调控胆汁酸代谢，还可通过调节糖、脂代谢，缓解非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
蛋白质是细胞功能的最重要执行者，其决定着生命活动能否有序、高效的进行，而其中翻译后修饰(Post-translational modification，缩写为PTM)起着重要的调节作用。翻译后修饰改变了蛋白质中不同氨基酸残基上的生物化学官能团，进而改变其化学性质或结构，使得蛋白质具有更为复杂的结构和更为完善的功能，实现更为精细的调节。蛋白质的翻译后修饰过程极其复杂，已知的翻译后修饰种类有20多种，其中较为常见的主要是磷酸化、泛素化、SUMO化、酰(含乙酰)化、甲基化以及糖基化。H2S可使蛋白质发生另一种转录后硫氢化修饰，硫氢化修饰是指蛋白质特定位点的半胱氨酸-SH基团转变为-SSH基团，经修饰后的蛋白活性可发生改变。
H2S可使蛋白质发生另一种转录后硫氢化修饰，H2S在体内半衰期只有几十秒，在体内除少量以气体形式经肺排出体外，大多数在线粒体内被氧化生成硫酸盐或硫代硫酸盐经肾脏排出，其余则参与体内蛋白修饰或其他生物化学过程。硫氢化修饰的基本条件是蛋白质含有半胱氨酸，体内有多少种蛋白质可以发生硫氢化修饰目前尚不明确。有报道称用改良生物素实验检测出约10％～25％的肝脏蛋白存在硫氢化修饰，而使用Tag-switch方法能检测出的肝脏蛋白硫氢化修饰的量更低，但硫氢化修饰确实影响很多蛋白功能。2009年，Solomon H.Snyder实验室首次报道H2S可使蛋白发生硫氢化修饰，蛋白质半胱氨酸残基的游离巯基发生改变-SH→-SSH，硫氢化修饰可以由H2S直接介导发生。GAPDH在发生硫氢化修饰后，活性可以增加6倍。
之后，很多蛋白的硫氢化修饰及功能改变被陆续报道，大部分蛋白质在发生硫氢化修饰后，活性增强，如parkin，PTEN，Keap1等。蛋白硫氢化修饰的降低与疾病发生有着密切的相关关系，parkin蛋白在发生硫氢化修饰后，其活性增强，发挥的神经保护作用增强，在帕金森病人的脑组织中，parkin蛋白的硫氢化修饰水平明显降低。
目前，能较全面检测蛋白质转录后修饰的方法是蛋白质质谱分析法，如磷酸化修饰，乙酰化修饰等均可用这种方法检测，但由于技术限制，目前尚缺乏高效的硫氢化修饰位点的蛋白质质谱检测方法。本研究用改良生物素转换实验准确的找到FXR蛋白的关键硫氢化修饰位点，并证明修饰后确实在细胞和动物水平影响到肝细胞的脂质蓄积。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，能准确找到FXR蛋白硫氢化修饰的检测位点。
本发明的另一个目的是提供一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的应用，为缓解非酒精性脂肪肝疾病提供了新途径。
本发明所采用的技术方案是，一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，构建人His-FXR质粒；
步骤2，突变分组：将步骤1中的人His-FXR质粒分为五组，前四组分别依次突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192位点，记为M1、M2、M3、M4，第五组突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192的全部位点，记为M1-4；
步骤3，将步骤2突变后的五组人His-FXR质粒M1、M2、M3、M4、M1-4，分别加入293A细胞处理24h，随后再加入100μM NaHS处理2h，得到细胞处理液；
步骤4，将经步骤3处理后的细胞处理液进行胞浆胞核蛋白分离，随后采用Westernblotting方法观察FXR表达情况；在步骤3收细胞前2h加入100μM NaHS，HEN Buffer收细胞并超声裂解，随后通过改良生物素转换实验检测FXR硫氢化修饰，得到初步FXR蛋白硫氢化修饰位点；
步骤5，对步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点，通过锌离子荧光强度实验进行验证，确定FXR蛋白硫氢化修饰位点。
本发明的特征在于，
步骤4中Western blotting方法具体为：
步骤4.1，电泳：将步骤3的细胞处理液接通电源，电压强度浓缩胶为4-5V/cm，分离胶为6-7V/cm；
步骤4.2，转膜：在电转槽中加入电转液，同时将硝酸纤维素膜和滤纸放入电转液中完全浸湿；将胶卸下，只保留目的片段胶，按顺序铺好滤纸、胶和膜；将用滤纸和膜夹好的胶平铺于海绵上，封紧后放入电转槽，膜朝向正极，在250mA电转2h；
步骤4.3，封闭：将步骤4.2的膜从电转槽中取出，使用TBST洗掉膜上残留的电转液，先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后再浸没于封闭液中，室温缓慢摇动1小时；
步骤4.4，孵育一抗：将经步骤4.3处理的膜从封闭液中取出，用滤纸吸干液体，放入孵育袋内，加入用封闭液稀释的一抗工作液FXR，室温下轻摇孵育1小时或在4℃孵育8-16h，一抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟；
步骤4.5，孵育二抗：选择二抗兔抗，用封闭液按1:30000稀释，室温孵育1h；二抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟，准备发光；
步骤4.6，发光：将经步骤4.5处理后的膜使用去离子水漂洗，用滤纸吸干水分，正面朝下覆于发光液上，孵育1～5分钟后置于保鲜膜内固定于片盒中，曝光、显影、定影，清水冲净晾干，标定marker，进行分析或扫描。
步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点是：Cys138/141。
步骤5中锌离子荧光强度实验的具体步骤为：
步骤5.1，将293A细胞接种至10cm细胞培养皿，当密度为80％左右时加10μgFXR质粒过表达FXR，用试剂盒提取细胞核蛋白；
步骤5.2，分组：将细胞核蛋白分为四组，分别为control组、NaHS组、DTT组和NaHS+DTT组，其中每组为100μl细胞核蛋白，NaHS组通过NaHS 100μM在37℃处理30min，DTT组通过DTT在37℃处理30min，NaHS+DTT组为依次使用NaHS 100μM、DTT 1mM在37℃处理30min；
分组：将细胞核蛋白分为六组，分别为FXR质粒组、M1组、M2组和、M3组、M4组和M1-4组，其中每组为100μl细胞核蛋白，依次加入FXR质粒、FXR锌指结构M1、M2、M3、M4和M1-4继续培养36小时；
每组100μl核蛋白分别用NaHS 100μM，DTT 1mM 37℃处理30min，或加FXR及FXR锌指结构不同位点突变质粒继续培养36小时；
步骤5.3，用15μM锌离子和25μM锌离子荧光探针继续孵育30min；
步骤5.4，脱盐柱洗脱多余的锌离子；
步骤5.5，酶标仪检测锌离子荧光强度。
步骤5中确定FXR蛋白硫氢化修饰位点为：Cys138/141。
本发明所采用的第二个技术方案，FXR蛋白硫氢化修饰在缓解非酒精性脂肪肝生物制药中的应用。
本发明的特征在于，
H2S通过激活FXR抑制下游糖代谢及脂代谢靶基因表达在缓解非酒精性脂肪肝生物制药中的应用。
H2S通过激活FXR抑制下游糖代谢及脂代谢靶基因表达中的应用。
本发明的有益效果是：通过本发明的检测方法确认FXR的DNA结合区两对C4锌指结构是潜在的硫氢化修饰位点，在His-FXR质粒基础上成对突变Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys190/193位点并构建质粒，最后做以上位点全部突变的质粒；发现FXRCys138/141位点突变和全突变后可出现以下影响，硫氢化修饰明显减少，FXR与锌离子结合能力减弱，FXR下游靶基因表达趋势反转，说明H2S修饰FXR结构关键位点后，增加FXR与靶基因DNA结合调控转录。由上可知，FXR缓解脂肪肝的机制是由于FXR的Cys138/141位点发生硫氢化修饰，为缓解非酒精性脂肪肝疾病提供了新途径和新的研究方向。
附图说明
图1是本发明检测方法中H2S供体缓解高脂饮食引起的脂肪肝的肝脏切片HE染色显微形态变化图，其中第一行和第二行分别为放大100倍和放大400倍时的显微形态变化图，其中第一列为normal chow组显微形态变化图，其中第二列为NS组即对照组的显微形态变化图，其中第三列为实验组中的NaHS组的显微形态变化图，其中第四列为实验组中的GYY4137组的显微形态变化图；
图2是本发明小鼠肝脏FXR硫氢化修饰的蛋白免疫印迹图；
图3是本发明FXR发生了硫氢化修饰的蛋白免疫印迹图；
图4是本发明敲低FXR后给H2S供体处理是否缓解脂肪肝实验的肝脏切片HE染色显微形态变化图；其中第一行和第二行分别为在放大100倍和放大400倍时的显微形态变化图，其中第一列为Lenti-control组显微形态变化图，其中第二列为Lenti-control+NaHS组的显微形态变化图，其中第三列为实验组中的Lenti-siFAX组的显微形态变化图，其中第四列为Lenti-siFAX+NaHS组的显微形态变化图；
图5是本发明敲低FXR后给H2S供体处理是否缓解脂肪肝实验的对比图，其中图A-1表示实验2中小鼠肝脏FXR硫氢化修饰的蛋白免疫印迹图，图A-2表示小鼠肝脏FXR硫氢化修饰的荧光强度图，图B-1表示敲低FXR后分组的蛋白免疫印迹图，图B-2表示敲低FXR后分组的荧光强度图；
图6是本发明人His-FXR质粒突变转染位点的蛋白免疫印迹图；
图7是本发明H2S供体处理细胞后FXR与Zn2+结合能力增强的锌离子荧光强度照片；
图8是本发明FXR突变质粒与Zn2+结合能力增强的锌离子荧光强度照片；
图9是本发明H2S供体处理细胞后FXR与Zn2+结合能力增强的锌离子荧光强度图；
图10是本发明FXR突变与Zn2+结合能力增强的锌离子荧光强度图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
H2S作为新型气体信号分子，可通过多种途径调节血脂，缓解非酒精性脂肪肝。核受体FXR可通过增加脂肪酸水解，抑制脂肪酸合成，增加脂肪酸β氧化等多种途径改善胰岛素抵抗和减轻肝脏脂肪蓄积。
研究发现：高脂饲喂小鼠给予H2S供体NaHS和GYY4137后，小鼠肝脏脂质蓄积情况缓解，机制可能是H2S通过激活FXR影响下游糖代谢和脂代谢相关靶基因表达。实验结果显示，高脂饲喂小鼠并给予H2S供体处理后，SREBP1-C、FAS等与脂质合成相关的转录因子和基因表达下降；高脂饲喂小鼠尾静脉注射慢病毒敲低FXR后，再给予H2S供体，肝脏脂质蓄积不能缓解，证实H2S通过FXR缓解脂肪肝。细胞实验和动物实验均证实H2S可使FXR发生硫氢化修饰，增强其转录活性；成对突变FXR蛋白的锌指结构半胱氨酸，发现Cys138/141为关键位点。故得出结论，H2S可使FXR发生硫氢化修饰，尤其是Cys138/141位点硫氢化修饰后与锌离子结合能力增强，进而与靶基因DNA结合和调控能力增强，缓解脂肪肝。
一、实验动物模型
8周龄雄性C57BL/6小鼠(购于北京维通利华实验动物有限技术公司)，由北京大学医学部实验动物中心饲养，均为清洁级健康动物，常规条件饲养，自由饮食饮水，本实验完全依照北京大学医学部实验动物管理条例和伦理委员会的相关规定进行。
二、实验方案
实验1：H2S供体对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝的缓解作用
(1)将C57BL/6小鼠(21g-23g)从8周龄开始连续高脂饮食(high fat diet，HFD)饲喂12周，将小鼠分为两组，分别为实验组和NS组(对照组)，另外设有正常饮食Normal chow组。
实验组小鼠分为两组，从8周龄后连续12周，在HFD饲喂的同时，每天分别腹腔注射H2S供体NaHS和GYY4137，注射量分别为：NaHS[2mg/kg(body weight)/day]，GYY4137[5mg/kg(body weight)/day]。NS组(对照组)，从8周龄后，连续12周在HFD饲喂的同时，每天腹腔注射生理盐水。Normal chow组为正常饮食组。
对上述分组的小鼠HE染色观察肝脏形态及脂质含量。
实验2：FXR体外硫氢化修饰
(1)HepG2细胞进行FXR硫氢化修饰：HepG2细胞转染正常(wild-type，WT)FXR质粒或FXR突变质粒，转染24-48h收集细胞。用HEN溶液(加入100μM去铁头胺)裂解上述细胞后，采用BCA法蛋白定量，将细胞裂解液蛋白浓度调整为1mg/ml，取上述4份300μl细胞裂解液，分为四组，分别为：对照组、NaHS组、DTT组、NaHS+DTT组。其中分组中所采用的NaHS浓度为100μM；DTT浓度为1mM；DTT、NaHS与细胞裂解液充分混匀，在37℃孵育30min。
小鼠肝脏FXR硫氢化修饰：取小鼠(实验1中的四个小组的小鼠，即：实验NaHS组、实验GYY4137组、NS组(对照组)和Normal chow组)肝脏50mg，按照质量比例1:20，加HEN溶液(加入100μM去铁头胺)，使用组织匀浆器裂解。将组织裂解液在4℃，12000g条件下离心10min，取上清。然后用BCA法蛋白定量1mg/ml，分别取300μl的组织裂解液。
(2)向上述HepG2细胞进行FXR硫氢化修饰细胞裂解液和小鼠肝脏FXR硫氢化修饰组织裂解液中加入4倍体积的Blocking溶液，在50℃水浴锅中孵育20min，每5min震荡一次；
(3)加入10倍体积预冷的丙酮，将上样置于-20℃静置20min，沉淀蛋白并去除Blocking溶液中的MMTS；
(4)随后在4℃，5000g条件下离心10min，弃上清；
(5)加入5ml冷丙酮洗涤蛋白沉淀，在4℃，5000g条件下离心10min，弃上清，然后室温晾干丙酮；
(6)用HENS溶液重悬蛋白：取适量蛋白裂解液与等体积2×上样缓冲液混匀，95℃煮3次，每次5min，此部分蛋白裂解液作为input。将剩余蛋白与1/3体积4mM Biotin-HPDP室温孵育3h；
(7)洗涤生物素标记的Dynabeads磁珠：取适量磁珠放入1.5ml EP管中，将EP管放置在磁珠分离器上面，磁珠将吸附在管壁，弃缓冲液，加入HENS溶液洗涤3次；
(8)最后加入适量HENS溶液制成磁珠悬液：然后在蛋白裂解液中加入20μl洗好的磁珠悬液室温孵育4h；
(9)孵育结束后，用1mlHENS溶液洗涤磁珠2次、PBS洗涤磁珠2次。加入上样缓冲液制成样品，用SDS-PAGE胶电泳。Western blotting检测硫氢化修饰的目的蛋白。
使用Western blotting方法检测FXR表达变化及其下游靶基因的变化。
实验3：敲低FXR后给H2S供体处理是否缓解脂肪肝
HepG2细胞接种于6孔板，待细胞密度约到80％时，提前2h换无血清培养基，筛选出的三条FXR的siRNA(50pM)各取2μl，Neofect转染试剂2μl加至100μl无血清高糖DMEM混匀，室温静置30min后加入6孔板处理24h。收细胞后用蛋白质免疫印迹法选取敲减效果最好的一条FXR siRNA并用Quantitative Real-time PCR方法确认。
选取敲减效果最好的FXR siRNA包装慢病毒Lenti-siFXR，经小鼠尾静脉注射敲低FXR表达：用HepG2细胞做病毒滴度试验后，病毒浓度确定为1×108TU/ml；用生理盐水将病毒稀释至所需浓度，尾静脉注射至8周龄雄性C57BL/6小鼠，每只100μl；12周后处死小鼠，肝脏切片，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白判断转染效率。
C57BL/6小鼠尾静脉注射慢病毒敲低FXR，对照组注射Lenti-control，高脂饮食并给予H2S供体12周。实验组分为小鼠Lenti-control+NaHS、Lenti-siFAX、Lenti-siFAX+NaHS。
实验4：确定FXR修饰位点
步骤1，构建人His-FXR质粒；
步骤2，突变分组：将步骤1中的人His-FXR质粒分为五组，前四组分别依次突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192位点，记为M1、M2、M3、M4，第五组突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192的全部位点，记为M1-4；
步骤3，将步骤2突变后的五组人His-FXR质粒M1、M2、M3、M4、M1-4，分别加入293A细胞处理24h，随后再加入100μM NaHS处理2h，得到细胞处理液；
步骤4，将经步骤3处理后的细胞处理液进行胞浆胞核蛋白分离，随后采用Westernblotting方法观察FXR表达情况；在步骤3收细胞前2h加入100μM NaHS，HEN Buffer收细胞并超声裂解，随后通过改良生物素转换实验检测FXR硫氢化修饰，得到初步FXR蛋白硫氢化修饰位点；
步骤4中Western blotting方法具体为：
步骤4.1，电泳：将步骤3的细胞处理液接通电源，电压强度浓缩胶为4-5V/cm，分离胶为6-7V/cm；
步骤4.2，转膜：在电转槽中加入电转液，同时将硝酸纤维素膜和滤纸放入电转液中完全浸湿；将胶卸下，只保留目的片段胶，将胶在电转液中浸泡，按顺序铺好滤纸、胶和膜；将用滤纸和膜夹好的胶平铺于海绵上，封紧后放入电转槽，膜朝向正极，在250mA电转2h；
步骤4.3，封闭：将步骤4.2的膜从电转槽中取出，使用TBST洗掉膜上残留的电转液，先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后再浸没于封闭液中，室温缓慢摇动1小时；
步骤4.4，孵育一抗：将经步骤4.3处理的膜从封闭液中取出，用滤纸吸干液体，放入孵育袋内，加入用封闭液稀释的一抗工作液FXR，室温下轻摇孵育1小时或在4℃孵育8-16h，一抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟；
步骤4.5，孵育二抗：选择二抗兔抗，用封闭液按1:30000稀释，室温孵育1h；二抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟，准备发光；
步骤4.6，发光：将经步骤4.5处理后的膜使用去离子水漂洗，用滤纸吸干水分，正面朝下覆于发光液上，孵育1～5分钟后置于保鲜膜内固定于片盒中，曝光、显影、定影，清水冲净晾干，标定marker，进行分析或扫描。
步骤5，对步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点，通过锌离子荧光强度实验进行验证，确定FXR蛋白硫氢化修饰位点。
步骤5.1，将293A细胞接种至10cm细胞培养皿，当密度为80％左右时加10μgFXR质粒过表达FXR，用试剂盒提取细胞核蛋白；
步骤5.2，分组：将细胞核蛋白分为四组，分别为control组、NaHS组、DTT组和NaHS+DTT组，其中每组为100μl细胞核蛋白，NaHS组通过NaHS 100μM在37℃处理30min，DTT组通过DTT在37℃处理30min，NaHS+DTT组为依次使用NaHS 100μM、DTT 1mM在37℃处理30min；
分组：将细胞核蛋白分为六组，分别为FXR质粒组、M1组、M2组和、M3组、M4组和M1-4组，其中每组为100μl细胞核蛋白，依次加入FXR质粒、FXR锌指结构M1、M2、M3、M4和M1-4继续培养36小时；
步骤5.3，用15μM锌离子和25μM锌离子荧光探针继续孵育30min；
步骤5.4，脱盐柱洗脱多余的锌离子；
步骤5.5，酶标仪检测锌离子荧光强度。
三、实验结果分析
针对实验1的实验结果分析：
对小鼠进行肝脏形态学观察，选取小鼠肝左叶，切片厚度为6-8μm，如图1所示，石蜡切片HE染色显示：在100×和400×显微镜下，Normal chow组小鼠肝脏切片中肝细胞以中央静脉为中心，向周围呈放射状排列，肝细胞结构清晰；而NS组(对照组)小鼠肝细胞中有密集的空泡，将细胞核挤向一侧，提示出现脂肪肝；实验组中，NaHS组和GYY4137组小鼠肝脏切空泡减少，肝索结构清晰完整，肝脏脂质蓄积少于其余两组，脂肪肝症状减轻。
综上所述，H2S供体治疗均可显著抑制高脂饮食小鼠肝脏脂质蓄积。
针对实验2的实验结果分析：
为了寻找H2S供体治疗均可显著抑制高脂饮食小鼠肝脏脂质蓄积的原因，检测FXR下游靶基因SREBP1-c、FAS、SREBP2、Actin的mRNA和蛋白变化，如图2所示，小鼠肝脏FXR硫氢化修饰发现：实验NaHS组(HFD+NaHS)、实验GYY4137组(HFD+GYY4137)、NS组(HFD+NS)和Normal chow组FXR下游影响脂质合成的转录因子和酶，在给予H2S后蛋白表达水平降低。
H2S溶于水后，可产生-HS，硫氢根结合到蛋白质半胱氨酸上，就称为硫氢化修饰，通过上述机理影响FXR功能的变化。如图3所示，HepG2细胞进行FXR硫氢化修饰，认为FXR发生了硫氢化修饰，DTT可以打断二硫键，即可去除硫氢化修饰，该实验证实H2S确实可以修饰FXR。
由上可知：H2S能抑制FXR下游脂质合成关键基因的表达。
针对实验3的实验结果分析：
如图4所示：如果是H2S影响到FXR，减少肝细胞脂质蓄积，那么针对建立的四组模型(Lenti-control、Lenti-control+NaHS、Lenti-siFAX、Lenti-siFAX+NaHS)进行石蜡切片HE染色观察：采用FXR的siRNA包装的慢病毒鼠尾静脉注射敲低FXR的表达，再进行高脂饮食，并给H2S腹腔注射，发现脂肪肝不能缓解。
由上可知：FXR是H2S缓解脂肪肝过程中的关键调控转录因子。
如图5所示：如果FXR可发生硫氢化修饰，在动物模型上是否也有FXR的硫氢化修饰。实验2和实验3中两批动物模型肝脏FXR都有硫氢化修饰。图5中图A-1和图A-2表示给H2S的两组FXR硫氢化修饰增多，和图4呼应，图B-1和图B-2解释敲低FXR后，FXR硫氢化修饰随之减少。
FXR介导了H2S对HFD诱导的脂肪肝的保护效应，进一步检测小鼠肝脏FXR硫氢化修饰情况发现，H2S供体处理增加了肝脏FXR硫氢化修饰；敲低FXR后，肝脏FXR硫氢化修饰减弱。
由上可证实，H2S确实影响到FXR，减少肝细胞脂质蓄积。
针对实验4的实验结果分析：
如图6所示，确定FXR发生硫氢化修饰，还需确定修饰位点，继续找到锌指结构的半胱氨酸，并成对突变，把突变质粒转染到肝细胞，测试硫氢化修饰情况，发现Cys138/141位点和全突变位点后FXR硫氢化修饰减少，说明Cys138/141位点为关键位点。
FXR作为锌指蛋白，其活性依赖于锌离子结合能力。采用锌离子荧光探针观察细胞FXR蛋白与锌离子荧光强度，探讨FXR硫氢化修饰是否影响FXR与锌离子结合能力。如图7所示：免疫荧光实验结果显示NaHS处理后FXR与锌离子荧光强度增强，提示FXR锌指结构发生硫氢化修饰后与锌离子荧光探针结合能力增强。
HepG2细胞分别给予FXR质粒及突变质粒再用NaHS处理后，锌离子荧光探针强度发生明显变化，FXR质粒组FXR表达不再均匀分布在胞质中，而是向核膜聚集，胞质胞核中锌离子荧光强度都较强，提示FXR过表达后与锌离子结合能力增强，给予NaHS处理后FXR硫氢化修饰增强，FXR活性改变入核也相应增多，进而与锌离子结合能力增强。如图8所示：Cys155/158，Cys174/180，Cys190/193位点突变后锌离子荧光强度与FXR质粒组相近，Cys138/141位点突变质粒组和锌指结构全突变组胞质胞核中锌离子荧光强度均明显减弱，提示该位点突变后FXR与锌离子结合能力减弱。
如图9所示：由于锌离子和FXR均在细胞中广泛分布，尤其是胞浆中表达量较高，而FXR锌指结构与DNA结合是在细胞核中，为了排除免疫荧光实验假阳性的可能，提高实验准确度，进一步观察核蛋白FXR与锌离子荧光探针结合情况。结果显示给NaHS处理后的锌离子荧光强度较强，而DTT去除硫氢化修饰后荧光强度减少。为充分证实H2S对FXR锌离子结合能力的影响，又检测了加入突变质粒后FXR蛋白与锌离子结合情况，如图10所示，结果显示过表达FXR组与未处理的Wild Type组相比锌离子荧光强度增强；加入FXR突变质粒组与未处理的Wild Type组相比锌离子荧光强度减弱，提示突变FXR锌指结构能减弱该蛋白与锌离子结合，尤其是Cys138/141位点和锌指结构全位点突变后FXR与锌离子结合能力明显下降。

Claims (7)

1.一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，构建人His-FXR质粒；
步骤2，突变分组：将步骤1中的人His-FXR质粒分为五组，前四组分别依次突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192位点，记为M1、M2、M3、M4，第五组突变人His-FXR质粒的锌指结构Cys138/141、Cys155/158、Cys174/180、Cys189/192的全部位点，记为M1-4；
步骤3，将步骤2突变后的五组人His-FXR质粒M1、M2、M3、M4、M1-4，分别加入293A细胞处理24h，随后再加入100μM NaHS处理2h，得到细胞处理液；
步骤4，将经步骤3处理后的细胞处理液进行胞浆胞核蛋白分离，随后采用Westernblotting方法观察FXR表达情况；在步骤3收细胞前2h加入100μM NaHS，HEN Buffer收细胞并超声裂解，随后通过改良生物素转换实验检测FXR硫氢化修饰，得到初步FXR蛋白硫氢化修饰位点；
步骤5，对步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点，通过锌离子荧光强度实验进行验证，确定FXR蛋白硫氢化修饰位点。
2.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤4中Western blotting方法具体为：
步骤4.1，电泳：将步骤3的细胞处理液接通电源，电压强度浓缩胶为4-5V/cm，分离胶为6-7V/cm；
步骤4.2，转膜：在电转槽中加入电转液，同时将硝酸纤维素膜和滤纸放入电转液中完全浸湿；将胶卸下，只保留目的片段胶，按顺序铺好滤纸、胶和膜；将用滤纸和膜夹好的胶平铺于海绵上，封紧后放入电转槽，在250mA电转2h；
步骤4.3，封闭：将步骤4.2的膜从电转槽中取出，使用TBST洗掉膜上残留的电转液，先用丽春红染色观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后再浸没于封闭液中，室温缓慢摇动1小时；
步骤4.4，孵育一抗：将经步骤4.3处理的膜从封闭液中取出，用滤纸吸干液体，放入孵育袋内，加入用封闭液稀释的一抗工作液FXR，室温下轻摇孵育1小时或在4℃孵育8-16h，一抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟；
步骤4.5，孵育二抗：选择二抗兔抗，用封闭液按1:30000稀释，室温孵育1h；二抗孵育结束后，在摇床上用TBST洗膜3次，每次10分钟，准备发光；
步骤4.6，发光：将经步骤4.5处理后的膜使用去离子水漂洗，用滤纸吸干水分，正面朝下覆于发光液上，孵育1～5分钟后置于保鲜膜内固定于片盒中，曝光、显影、定影，清水冲净晾干，标定marker，进行分析或扫描。
3.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤4得到的初步FXR蛋白硫氢化修饰位点是：Cys138/141。
4.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤5中锌离子荧光强度实验的具体步骤为：
步骤5.1，将293A细胞接种至10cm细胞培养皿，当密度为80％左右时加10μgFXR质粒过表达FXR，用试剂盒提取细胞核蛋白；
步骤5.2，分组：将细胞核蛋白分为四组，分别为control组、NaHS组、DTT组和NaHS+DTT组，其中每组为100μl细胞核蛋白，NaHS组通过NaHS 100μM在37℃处理30min，DTT组通过DTT在37℃处理30min，NaHS+DTT组为依次使用NaHS 100μM、DTT 1mM在37℃处理30min；
分组：将细胞核蛋白分为六组，分别为FXR质粒组、M1组、M2组和、M3组、M4组和M1-4组，其中每组为100μl细胞核蛋白，依次加入FXR质粒、FXR锌指结构M1、M2、M3、M4和M1-4继续培养36小时；
每组100μl核蛋白分别用NaHS 100μM，DTT 1mM 37℃处理30min，或加FXR及FXR锌指结构不同位点突变质粒继续培养36小时；
步骤5.3，用15μM锌离子和25μM锌离子荧光探针继续孵育30min；
步骤5.4，脱盐柱洗脱多余的锌离子；
步骤5.5，酶标仪检测锌离子荧光强度。
5.根据权利要求1所述的一种肝脏脂质代谢调控FXR蛋白硫氢化修饰的检测方法，其特征在于，所述步骤5中确定FXR蛋白硫氢化修饰位点为：Cys138/141。
6.FXR蛋白硫氢化修饰在缓解非酒精性脂肪肝生物制药中的应用。
7.H2S通过激活FXR抑制下游糖代谢及脂代谢靶基因表达在缓解非酒精性脂肪肝生物制药中的应用。
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