CN1174493A

CN1174493A - 用iNOS和相关NOS药剂治疗人体勃起功能障碍

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Publication number: CN1174493A
Application number: CN95197487A
Authority: CN
Inventors: N·F·冈萨雷斯·卡德维德; J·拉吉弗
Original assignee: NIREC Inc
Current assignee: NIREC Inc
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-11-09
Publication date: 1998-02-25
Also published as: AU693621B2; JPH11501206A; EP0808104A1; US5594032A; WO1996014748A1; AU4233696A; CA2204886A1

Abstract

本发明提供了一种治疗勃起机能障碍的方法,该方法包括对患者施用诱导型氧化氮合酶(iNOS)药剂,该药剂包括阴茎iNOS、阴茎iNOS的诱导物、iNOS cDNA或具有iNOS cDNA的阴茎平滑肌细胞或阴茎海绵体。典型的体内治疗包括通过持续或间断植入的或外输注泵输注、小丸输尿管内给药,注射或其它相关的方法将这些药剂运送到患者的阴茎组织中。把来自超量表达iNOS的患者的遗传工程细胞或阴茎组织植入微胶囊中或小丸中、或者通过其它方法,或者经手术直接接种到阴茎海绵体中。在某些情况下,口服给药或全身注射给药途径是可行的。本发明也提供了另一种治疗方法,该方法包括在培养的平滑肌细胞中体外诱导iNOS,然后运送纯化的或重组的iNOS酶,产生iNOS cDNA并用iNOS cDNA遗传转化,之后将其运送到患者的阴茎。本发明的方法包括其它内源和外源NOS同工型在阴茎中的超量表达和/或生物学调节,以治疗勃起机能障碍。

Description

用iNOS和相关NOS药剂治疗人体勃起功能障碍

发明所属技术领域

本发明涉及一种治疗勃起功能障碍的方法，特别是涉及经采用诱导型氧化氮合酶(iNOS)药剂治疗勃起功能障碍的方法，所说药剂包括iNOS、NOS同工型(isoform)、iNOS诱导物、iNOS cDNA和重组iNOS cDNA转化的阴茎平滑肌细胞(iNOS工程细胞)，该方法的目的是改善阴茎勃起血管原性(vasculogenic)功能障碍，特别是血管原性功能障碍。在体内例如阴茎海绵体中诱导iNOS以产生改善病人症状的高水平的iNOS的阴茎组织特异性表达。iNOS也可以在切除的和培养的海绵体细胞中体外诱导、提取和纯化，其后以多种运送系统提供给病人。或者，可以在体外合成重组iNOS，并运送至病人进行治疗。也可以将cDNA iNOS植入病人的阴茎组织以体内产生重组iNOS。另一种替换性方法是用阴茎iNOS和/或NOS同工型cDNA转化来自体内的培养细胞，将所形成的工程细胞引入到体内的海绵体。可以用与有关iNOS所描述的相同的方法使用其它NOS同工型或它们的相应的cDNA和重组蛋白质，以及由NOS cDNA转染的阴茎细胞。

背景技术

在美国有超过12,000,000的男性患有阳痿，不能达到或维持足以性交的阴茎勃起。它与年龄增大有关，65岁的男性有25％患有此病，75岁的男性有55％患有此病，尽管这些患者中大多数人的性欲相对而言并未受到影响。在美国每年有超过400,000的门诊病人因此就诊，有30,000的病人因此住院。假阴茎的外科移植从1980年的19,000增加到1989年的32,000。1989年用于治疗阳痿的经费保守估计为250,000,000美元。在病人方面，尽管阳痿通常不威胁到生命，但是对病人及其配偶来说，在心理方面的后果却是非常严重的。

与文献中的早期设想不同，多达90％的阳痿是由于器官而非心理原因引起的。尽管年龄增大的确是一个具有倾向性的因素，但是在某些病人中器官性阳痿可以早在青春期就出现。导致阴茎勃起功能障碍的血管原性和神经化改变药剂大多数器官性阳痿综合征的根源，因为男性激素紊乱和其它可能导致性欲丧失的身体原因在这些问题上处于一个次要地位。

许多起因性血管疾病将最终导致阴茎勃起障碍。因而，动脉粥样硬化、某些类型的高血压、糖尿病、严重的吸烟和酒精中毒均被认为是有可能引起勃起功能障碍的危险因素。糖尿病患者作为一个群体最容易患有血管原性阳痿，在美国约2,500,000人口中发病率超过50％。

本发明基于下列发现：通过诱导氧化氮合酶(NOS)的阴茎组织的特异性表达或者在体内表达重组NOS，可以进行有效的改善性治疗。氧化氮合酶合成化合物氧化氮(NOS)，其是充当阴茎勃起的一种主要介质。

正常勃起的生理过程分为三个相互协调的不同阶段：(a)动脉流入增加；(b)静脉流出减少；(c)海绵体平滑肌松弛。后者似乎是关键，但是阴茎血管的血液动力学通过动脉干的平滑肌也进行了参与。因而，阴茎动脉和窦中的平滑肌松弛被认为是引起正常勃起的关键性步骤。阴茎平滑肌功能异常可能是勃起功能异常的关键。

在一个正常的勃起过程中，刺激通过勃起神经(骨盆自律神经纤维)传递给阴茎。神经递质从三个系统释放：(a)去甲肾上腺素从交感去甲肾上腺素能纤维中释放；(b)乙酰胆碱从副交感胆碱能纤维中释放；(c)一种物质从非肾上腺素能-非胆碱能(NANC)纤维中释放。已经表明NANC神经递质是氧化氮(NO)，它作用于平滑肌引起平滑肌松弛。

环绕海绵体腔隙空间的小梁平滑肌的松弛具有三大作用：(a)通过降低通常情况的对动脉流的持续(柔和)阻力增加从螺烯动脉进入与内皮相连的腔隙空间的流量；(b)调节阴茎内的血储使阴茎充血；(c)将接近80％的收缩血压传递给海绵体空间。后者压缩与扩张的平滑肌和硬的无弹性的巩膜并行的排出静脉，使静脉流出受到限制。消肿的发生是与此主要受交感控制的过程正相反，即增加两个腔隙中平滑肌的紧张性，导致动脉流入的减少和腔隙空间的减小，从而使静脉变瘪。

NO被证实是源于内皮松弛因子(EDRF)中的作用于血管的化合物，它似乎在不同的生物反应中发挥多种作用。从于内皮相连的血管中释放出的EDRF，在缺氧、血管性疾病、败血病性休克和炎症情况下发挥不同作用。

NO在通过局部诱导平滑肌细胞松弛维持血管紧张性方面具有非常重要的生理作用。研究表明：在阴茎海绵体中，NO是引起勃起的主要化合物，并且它似乎是阴茎中的NANC神经递质。

以阴茎为例，我们已经通过电场刺激(EFS)，药物治疗和特异性NOS抑制剂应用证实：NO是人、狗、鼠和家兔阴茎勃起的主要介质。此发现通过应用了(a)松弛器官浴中的海绵体条(b)动物模型的勃起反应两种必需方法的其它大量实验，得到进一步证实和扩大。近来，我们已经清楚地揭示出男性阳痿危险因素相关鼠模型勃起功能障碍与阴茎NOS含量减少之间的相互关系。

阴茎释放NOD的位点之一，似乎在海绵体非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经的末端，NO从那里弥散，之后与相邻细胞中的鸟苷酸环化酶结合，并主要在平滑肌靶组织中刺激cGMP生成。cGMP的合成导致细胞内Ca²⁺的减少，以及细胞内Ca²⁺减少后的平滑肌松弛和阴茎血管舒张。

本领域普通技术人员已知：氧化氮合酶是在内皮细胞、巨噬细胞、大脑、肝脏和另外几个细胞类型和组织中催化NO生成的酶。NOS有两型：组成型NOS(cNOS)，其含量似乎不随不同的实验条件而改变；诱导型NOS(iNOS)，细菌毒素和某些生长因子可刺激其合成。一般来讲，cNOS分为几组：第一组存在于大脑中(其中的一种同工型称作神经元NOS，nNOS或I型NOS)，第二组cNOS存在于内皮细胞(内皮NOS，eNOS或III型NOS)。已知iNOS(II型NOS)在巨噬细胞、肺、肝、大动脉平滑肌细胞中诱导表达，也可以在内皮细胞中诱导表达。

从不同组织中分离的cNOS和iNOS表明几种同工型的存在，其中每组具有特异性辅助因子要求、mRNA大小和免疫特性。在相同的细胞类型中可以同时表达不只一种同工型(不同型名称显示于下列的圆括号中)。cNOS组(特征在于它们对Ca²⁺的依赖性)中有三种不同的胞质同工酶：A，存在于大脑、小脑和成神经细胞瘤细胞；B，存在于内皮细胞中；C，存在于噬中性白细胞中。前两种是钙调蛋白质依赖性的，第三种是非钙调蛋白质依赖性的。Ib无BH⁴和FDA作辅助因子，唯有一种Ia另外用FMN作辅助因子。还有一种特殊的Ca²⁺/钙调蛋白质依赖性同工型，它在内皮细胞cNOS中的比例超过90％。

在iNOS组中，一种溶解型iNOS可以通过巨噬细胞、肝细胞、枯氏细胞、成纤维细胞、内皮细胞、多种动物的肺和肝诱导产生。一种不同的特殊型iNOS存在于巨噬细胞中并且仅仅依赖NADPH。

从它们各自不同的运动学和和对底物/辅助因子的要求中，可以进一步明显看出cNOS、nNOS和iNOS之间的显著区别。L-精氨酸和NADPH分别是常用的底物和辅助因子。如上所述，cNOS和iNOS的区别在于：cNOS对Ca²⁺/钙调蛋白质依赖，而iNOS对Ca²⁺/钙调蛋白质不依赖或仅仅部分依赖。NOS催化的反应是将L-精氨酸转化为瓜氨酸，其中的产物为NO。通过一系列的竞争性抑制剂如N^G-氮-L-精氨酸和N^G-甲基-L-精氨酸，或NO螯合剂如血红蛋白质可抑制NO的活性。通过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和谷氨酸可增加(3-H)瓜氨酸在某些细胞中的合成。不同的同工型NOS来说，并无真正的特异性化学抑制剂。羟基-精氨酸和精氨酸二肽也可作为NOS的底物。氨基胍似乎是iNOS的优先抑制剂，但是其特异性随细胞型变化。

另外，NOSmRNA(以及形成的cDNA)是特异性同工型，可以在一种特异性构造的组织中表达。例如，已经克隆出鼠和人脑cNOS(nNOS)基因DNA序列(包括内含子和外显子)。其mRNA表达为一种10.5kb的多核苷酸。但是在鼠肾、肝或心组织中未发现相同种类的mRNA。不只可以从鼠小脑中提纯nNOS，从鼠多形核白细胞和其它来源中也已经纯化出nNOS。已经从牛和人的内皮细胞中克隆出iNOScRNA。在后一种情况中，其相应的cNOS mRNA的长度为4kb，由一个基因编码，此基因与在脑中表达的基因不同。而且，iNOS已经从经LPS刺激的鼠和小鼠的巨噬细胞、鼠血管平滑肌、人肝细胞和condrocytes中克隆出。虽然从所有的研究物种(人、鼠、小鼠)中只鉴定出一种iNOS基因，但目前可以明确认为：人基因组所鉴定的某些重复序列可以与两种或多种不同基因相对应。

非阴茎NOS的诱导作用在大鼠和小鼠模型中由注射大肠杆菌的脂多糖(LPS)体内引发，并且由与LPS、白细胞介素β、肿瘤坏死因子(TNE-α)和/或γ干扰素一起培养细胞或组织片体外引发。此诱导作用依赖蛋白质合成，并且用地塞米松或其它糖皮质激素以及TGF-β可将其阻断。

通过下列胞质溶胶(3-H)L-精氨酸至(3-H)L瓜氨酸的转化，我们发现在人、大鼠和家兔的阴茎组织均浆中存在有NOS。我们和其它人已经通过蛋白质印迹发现了nNOS的同工型，并且通过组织化学和免疫细胞化学将其定位于阴茎的神经末端。但是还没有发现对性刺激中NO合成起作用的主要阴茎NOS同工酶的区别特征。另外，目前的基因剔除实验还不能在nNOS、eNOS或iNOS沉默时对转基因小鼠的生殖行为产生影响。此异常结果似乎来源于非NO选择性勃起途径的表达或激活。此处所述的我们目前的研究显示：有独特的阴茎NOS同工酶存在，它不同于那些在其它组织中的NOS同工酶。在阴茎中可能有其它的非NOS依赖性途径存在，我们推断：它们在阴茎勃起过程中与NO级联共同协作，或者是在阴茎NOS长期减少或沉默后显露出优势。这些假定的阴茎平滑肌生理辅助松弛剂包括血管活性肠多肽(VIP)、降钙素基因相关多肽(CGRP)和前列腺素等。

目前我们对老龄健全大鼠、糖尿病BB大鼠和雄性激素缺失大鼠的研究表明：NOS减少或灭活与某些类型的勃起功能障碍有关。在健全老龄大鼠和切除睾丸大鼠中，通过给雄性激素可以将阴茎NOS恢复至正常值，将对EFS反应的勃起恢复至正常水平。EFS本身调节(激活或抑制)阴茎NOS活性，并且以一种不同于健全和切除睾丸大鼠的方式调节。

但是在本领域中还没有发现和提出基于利用内源性NO合成、或内源性NOS活性或表达的治疗方法，目前对勃起功能障碍的药物治疗仅仅是外用、或周期性自我注射、或在性交前尿道内给予血管活性化合物的混合物(包括硝基供体)进入阴茎海绵体，外科治疗基于假阴茎移植或动脉/静脉手术。例如，美国专利第4,931,445(Goldstein等)，5,336,678(Cavallini)，和5,278,192(Fung等)中分别描述了用药物etoparidone、长压定或异丁基亚硝酸盐或亚硝酸盐异戊酯治疗阳痿的方法。Bredt等在美国专利5,268,465中描述了一个大鼠大脑cDNA编码的一个特异性序列钙调蛋白质依赖性NOS分子的特征，但未提及或讲述将其用于勃起功能障碍的治疗，这是一种cNOS或nNOS。Stuehr等在美国专利5,132,407中描述了一种从小鼠巨噬细胞中纯化的含有三种成分的非钙调蛋白质依赖性NOS，但未提及用于治疗勃起功能障碍。

Voss等在美国专利4,801,587中描述了将DMSO用作一种介导罂粟壳的吸收剂，罂粟壳是一种用于治疗人阳痿的已知化合物。EI-Rashidy在美国专利5,256,625中描述了将羟基-丙基-β-环糊精用作罂粟壳的一种吸收增强剂。

本发明的主要主题，阴茎iNOS同工型，通过免疫细胞化学方法先前从未在酶或蛋白质水平、在mRNA水平或者在阴茎组织片中检测到。除了我们自己专有的在此所述的关于大鼠阴茎平滑肌细胞(RPSMC)、人阴茎平滑肌细胞(HPSMC)、关于人和大鼠海绵体的组织切片、以及在大鼠海绵体中体内进行的工作外，还没有任何关于在阴茎细胞中iNOS检测研究的报道。iNOS在勃起功能中是否具有生理作用尚未清楚，而且没有任何发表物提出或暗示阴茎iNOS的存在或者它可用于勃起功能障碍的治疗。

确实，血管iNOS在被诱导时会对血压产生不利影响。人们估计其参与了败血病性休克，没有明显地维持正常血管紧张性。另外，人们没有想到用诱导iNOS、iNOS cDNA或基因治疗来促进阴茎勃起，可能是因为人们认为要冒出现系统性高血压或不可控制性阴茎勃起的危险，并且不认为它参与正常勃起反应。在本领域中还没有出版物记载将化合物不间断地送至阴茎，这一点不同于周期性治疗调节剂。没有出版物描述其它NOS同工型(神经元和内皮的)在治疗勃起功能障碍方面的应用或调控。

因而在本领域中需要提供一种治疗勃起功能障碍的改进的方法，此方法通过诱导阴茎组织的iNOS的内源性生成，或阴茎组织的iNOS的外源性引入来治疗勃起功能障碍，并且也可以通过采用本发明的方法，在阴茎中应用其它NOS同工型或它们的调节作用。

发明描述

本发明的目的和优点在于：提供改善勃起功能障碍的方法和组合物，此方法是用阴茎NOS和/或其它NOS同工型、NO蛋白质、iNOS诱导物和iNOScDNA对阴茎进行局部治疗，以减少它们对全身的影响。

其它目的和优点包括：

提供通过将阴茎iNOS直接或间接引入组织以增加阴茎组织中iNOS含量的方法和组合物；

为了改善血管原性阳痿(包括血管原性阳痿)，为引入患者阴茎组织的iNOS诱导物提供运送系统；

提供阴茎iNOS的克隆、测序和表达的方法，及其区别特性的证据。

通过多种系统，为表现勃起功能障碍综合征的病人提供治疗方法，包括：包含iNOS诱导物或海绵体中阴茎iNOS重组蛋白质(天然的或修饰的)的微胶囊的阴茎植入；或通过基因工程，体内在受影响的阴茎组织中或者活体外在待植入阴茎的阴茎细胞和组织中的iNOS产生，或在某种情况下的全身给药；以及，

提供阴茎和非阴茎NOS同工型及其生物调节物的组合物，以及用于勃起功能障碍治疗的方法。

从详细描述、附图和权利要求中可以明显看出本发明的其它目的。

本发明提供一种勃起功能障碍的新的治疗方法，该方法通过应用多种药剂提高阴茎中诱导氧化氮合酶(iNOS)水平，其在体内依次实现氧化氮(NO)的生理调节产生，通过NO松弛阴茎海绵体中平滑肌的作用介导勃起反应的机理。

本发明涉及通过提高阴茎中iNOS的水平以改善患者勃起功能障碍的方法和组合物，此通过将iNOS直接引入阴茎组织，或者在所提供的优选的实施方案中，通过用适宜的iNOS诱导物治疗，引入iNOScDNA，或通过用重组iNOScDNA转化切除的和培养的阴茎海绵体细胞或组织片，将这些细胞再引入至它们体内增殖的阴茎中，来诱导内源性iNOS的产生，并且提高海绵体NO的产生能力。在阴茎的治疗性调节勃起功能障碍中，这些方法也适用于其它NOS同工型，以及它们相应的cDNA、工程细胞或体内基因疗法。

附图1概要性地说明了本发明的几个实施方案。在一个实施方案中，在适宜的培养基3中培养或孵育得自阴茎2的切除组织标本1(优选的海绵体细胞)的细胞或组织片。然后用适于iNOS体外诱导的诱导物5处理所培养的阴茎平滑肌细胞(PSMC)或海绵体切片4。从所诱导的细胞或组织4提取iNOS7，将其纯化8并运送9给阴茎2以用于治疗。或者，从体外诱导的PSMC中分离10mRNA并且克隆(例如通过RT/PCR(逆转-聚合酶链反应)、文库技术或其它克隆技术)11其相应的cDNA。制备13所得iNOScDNA12，并传送9给患者的阴茎以用于治疗。或者，在优选的实施方案中，用所克隆的iNOScDNA12产生重组iNOS蛋白质14，将其回收15并传送9给阴茎2以用于治疗。在另一个实施方案中，用重组阴茎iNOScDNA12转化所培养的PSMC细胞或组织片20以产生iNOS工程细胞或海绵体组织22，然后将它们引入24适当的阴茎组织26(比如海绵体28).细胞或组织移植物在此增殖，以复壮和增强阴茎细胞及组织结构的内源性iNOS的产生能力。可将适于iNOS体外诱导的诱导物16传送9给患者的阴茎2，由此可升高阴茎组织中内源性产生的iNOS的水平。可在某些条件下通过全身给药实现NOS生物药剂递给阴茎，例如，在下面实施例10中详细描述的。

通过用不同的药剂(诸如淋巴因子和细菌脂多糖(LPS))单独或联合处理完成所培养的大鼠阴茎平滑肌细胞(RPSMC)、人阴茎平滑肌细胞(HPSMC)和大鼠或人的海绵体组织片中的iNOS的体外诱导。应用多种诱导物混合液处理将引起所处理的细胞和组织NOS活性的明显升高，此可通过培养基中亚硝酸盐的蓄积测得。RPSMC的时间进程显示为一种达至少60小时的线性反应(此可被L-NAME抑制)，由此表明这种亚硝酸盐的释放是由iNOS诱导引起。所观察到的RPSMC培养基中亚硝酸盐积累的刺激作用是由iNOS诱导引起的事实，可通过用Northern和Western印迹法分别证明所诱导阴茎细胞中iNOSmRNA和iNOS蛋白质的存在而证实。用于Northern印迹分析的探针是RPSMC中一段350bp的iNOScDNA片断；Western印迹分析是通过所裂解的诱导RPSMC与商用iNOS抗体的反应而进行的，

基于在所培养细胞体外诱导条件下的这些结果，体内治疗通过将一种诱导物混合液运送给大鼠模型的阴茎海绵体组织而实现，此混合液如下面实施例2中详述的，它含有大肠杆菌脂多糖(LPS)、重组大鼠干扰素-γ(IFN-γ)、重组人肿瘤坏死因子(TNF-α)和重组人白细胞介素-1β(IL-1β)。对人类患者需要应用人IFN-γ。可以使用其它混合液并将它们加入到单个药剂的传送中。尽管可以采用各种适宜的给药方法，例如包埋或注射微胶囊、混合液的注射、尿道内引入、表面或硬膜下应用等等，但是目前优选的给药方法包括用一个连接有伸进海绵体组织的导管的渗透泵连续输注诱导物混合液。

可采用此处说明的泵系统将诱导物混合液运送给大鼠一段短的时间(例如：在3天内1ul/hr)或一段较长的时间(例如：在14天内0.5ul/hr)。已经观察到：短期(即3天)治疗比长期(即14天)治疗更有效，但是这可能是一种人为现象，是由于混合液在泵中停留时间延长，诱导物混合液中某些生物成分失效所造成。基于不同情况的患者可以调节配方、运送系统和给药方案。

在对三个不同年龄组大鼠的体内试验中，所述的采用iNOS诱导物的治疗明显地增强勃起反应，此三个组为成年组(5个月大)、老龄组(20个月大)和更老龄组(28-32个月大)。通过检测对此动物海绵体神经的电场刺激(EFS)反应的最大海绵体内压，以测定诱导物治疗完成后试验动物的勃起反应。没有发现阴茎异常勃起，此表明所诱导的阴茎iNOS是保持在生理调节下。没有观察到高血压或其它严重副作用。

在用此诱导物治疗后，用最适度剂量下的氧化氮合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)处理可明显地减弱所观察的勃起反应。此信息证明诱导物治疗机理是通过NOS的级联系统。诱导物治疗是通过氧化氮合酶的诱导进行可由下面的资料进一步证明：用iNOS诱导物处理的大鼠阴茎组织匀浆与未处理的对照组相比显示出NOS活性升高；阴茎组织切片中NOS活性和蛋白质的组织化学检查；以及阴茎胞液中iNOS的Western印迹法检查。

大鼠海绵体中iNOS诱导的可行性也可通过阴茎切片的体外培养和经硝酸盐与Western印迹分析的iNOS检测而证明。此过程也可通过本发明提供的人海绵体体外培养而实现(如类似分析所示)，以及在提取的RNA的RT/PCR在人阴茎平滑肌细胞(HPSMC)中实现。

从所诱导的RPSMC中制备cDNA文库，用足量的探针筛选，并且对几个iNOS+克隆检测并测序。与公开的大鼠血管iNOS序列相比，完整RPSMCiNOS编码区序列的比较显示两个明显的氨基酸差异，这提示此为一个截然不同的iNOS种类。用RPSMC iNOS构成物稳定转染RPSMC，并使此细胞基本表达iNOS。这也可获得相同的HPSMC iNOS序列，从而证明人阴茎细胞中的iNOS诱导和此阴茎iNOS截然不同的性能。

将大鼠RPSMC iNOS构建体用于老龄大鼠减弱的海绵体的体内基因治疗，表明：通过单一注射以脂质体为基质的RPSMC iNOS构建体制剂，在5天后这几个大鼠比典型观察的成年大鼠显示出较高的勃起反应。通过Western印迹法检测体内产生的iNOS蛋白质。在注射治疗11天后，勃起反应的增强更加一致(所有试验大鼠)并且强度相等。在杆状病毒表达载体中制备另一RPSMC iNOS cDNA的构建体，并且在昆虫细胞中表达iNOS蛋白质。转染的细胞和组织片两者以及iNOS重组蛋白质都可在海绵体中通过直接分子作用或植入用于增强阴茎NO的合成。

本发明的方法可扩展到其它阴茎和非阴茎NOS同工型，用于它们及其生物调节基因对勃起功能障碍的治疗。

附图简要说明

通过参考附图可更加详细地说明本发明，其中：

图1概要说明了本发明的方法，包括应用iNOS和iNOS诱导物直接或间接治疗人勃起功能障碍；

图2是一组条线图，说明通过培养基中亚硝酸盐的积累测定的在用iNOS诱导物混合液(含有用和没用细菌脂多糖(LPS)补充的一种淋巴因子)处理的大鼠阴茎平滑肌细胞(RPSMC)培养物中氧化氮合成的体外刺激作用；

图3是一组条线图，说明通过培养基中亚硝酸盐的积累测定的在用iNOS诱导物混合液(含有加有LPS的二或三种淋巴因子)处理的RPSMC培养物中氧化氮合成的体外刺激作用；

图4是一个曲线图，说明通过培养基中亚硝酸盐的积累测定的在NOS抑制物存在或不存在的情况下用标准二元iNOS诱导物混合液处理的RPSMC培养物的iNOS诱导的时间进程和稳定性；

图5是一个条线图，显示当除去此诱导物且不替换时，所述酶的转化慢，由此表明在诱导后高水平的iNOS将持续相当一段时间。

图6是当与RPSMC iNOS探针杂交时RPSMC的多腺苷酸+mRNA的Northern印迹，所述RPSMC接受一段时间的诱导。

图7是通过诱导的RPSMC裂解并且与商用iNOS抗体反应获得的提取液的Western印迹。

图8是一个曲线图，显示在5、20和3O个月大的大鼠中勃起反应对于海绵体神经的电场刺激的一致的增强，这些大鼠经过用本发明的几个阴茎诱导型氧化氮合酶诱导物连续输注三天。

图9是一个条线图，显示如图8所处理的大鼠的勃起反应对最适剂量下的氧化氮合酶抑制剂的增强的敏感性。

图10是一个曲线图，显示在经电场刺激触发的阴茎勃起的增强作用中，用氧化氮合酶诱导物进行中期治疗(14天)的三个年龄组与短期例相比没用获得更好的应答。

图11是一个条线图，显示在不同年龄大鼠的EFS勃起试验中，最适剂量下的氧化氮合酶抑制剂区别应答者与非应答者。

图12是一个条线图，显示用氧化氮合酶诱导物处理三天的大鼠阴茎胞液中氧化氮合酶活性的升高。

图13是一个条线图，显示诱导物处理的大鼠胞液中NOS活性的升高可通过用L-NAME处理抑制，但用氨基胍处理则不改变。

图14A、B和C为阴茎组织的显微照片，显示经组织化学检查的诱导物处理的大鼠的阴茎组织中NOS活性的升高。

图15A、B和C为阴茎组织的显微照片，显示经免疫细胞化学检查的诱导物处理的大鼠的阴茎组织中iNOS的升高。

图16是Western印迹自体放射照片，显示接受iNOS诱导物泵输注的老龄大鼠海绵体中所检测到的iNOS蛋白质的表达。

图17是Western印迹自体放射照片，显示可在体外阴茎，在大鼠和人海绵体切片的培养中获得iNOS诱导作用，在此可通过亚硝酸盐释放和Western印迹检测证明iNOS的升高。

图18是一个重叠序列图，显示根据第一个诱导的RPSMC文库测序的iNOScDNA克隆。

图19是序列比较，显示从第二诱导的RPSMC文库测序的iNOS cDNA克隆和选择来构建代表整个编码区的iNOS cDNA重组体的两个克隆。

图20是一个可比较的测序图，显示用于测序HPSMC iNOS cDNA的策略，以及60％的HPSMC iNOS编码区与相应的人肝细胞iNOS cDNA编码区的比较。

图21是一个显示用于从HPSMC iNOS产生RT/PCR片断的引物的图表。

图22是一个显示RPSMC iNOS cDNA序列区与其人肝细胞iNOS相应部位之间同源性的图表。

图23是显示接受基因治疗的老龄大鼠的勃起反应对EFS增加的压力的图，所述基于治疗是通过在海绵体中直接注射RPSMC iNOS cDNA构建体进行的。

图24是Western印迹分析结果，显示在接受基因治疗的老龄大鼠的阴茎胞液中通过Western印迹法检测的iNOS蛋白质的表达，所述基因治疗是通过在海绵体中直接注射RPSMC iNOS cDNA构建体进行的。

实施本发明的最佳方式

下面的详细论述是通过实施例的方式说明本发明，而不是限制本发明的原理。这一描述显然可使本领域技术人员运用本发明，而且它还论述了本发明的几个实施方案、适宜方案、变化、选择性方案和应用，包括我们目前所确信的实施本发明的最佳方案。

NO产量的测定是基于NO共产品(co-pruducts)的产生，诸如来源于(3-H)L-精氨酸或来源于相对稳定的NO代谢产物(例如亚硝酸盐和硝酸盐)的(3-H)瓜氨酸。后面的方法对在细胞外培养基中测定NO-产物的释放和积累特别适宜。

可以通过在组织切片(免疫细胞化学)和胞液(Western印迹法)中的免疫检测、其mRNA的Northern印迹分析或者NOS相关活性的组织化学检测(NADPH心肌黄酶测定)来检查和评价iNOS蛋白质。实施例 1 体外平滑肌细胞的iNOS诱导

此实施例论述在大鼠阴茎平滑肌细胞的体外培养物中获得氧化氮合酶的高水平稳定诱导的方法，以此为体内诱导实验选择条件。

在37℃，5％CO₂存在下，用带有20％胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)，自切除于3个月大Sprague Dawley大鼠的小片阴茎组织引发RPSMC的原始培养物。将生长于外植体的细胞转移至含10％血清的培养基，并且在第4至第10次传代(1∶3分离)时将它们应用于此实验，除非另作说明。或者，用保存于液氮下来自第4-8次传代的细胞再起始此培养，并且用于下面2-4节的培养中。基于形态学和细胞免疫化学的标准，认为这些培养物主要由阴茎的平滑肌细胞组成。

在90-100％细胞铺满“Primaria培养皿下进行所有实验，通常培养皿为24孔平皿，加或不加在每个实验中指明的诱导物。没有特殊说明时，标准二元诱导物混合液由细菌脂多糖(LPS)(10ug/ml)和重组大鼠干扰素-γ(INF-γ)(250U/ml)组成。按照提示将其它需进行实验的物质加入此含血清的培养基，并按所提示的时间进行培养。一直收集并保存此培养基，此为了间接测量NO产量，这基于其转变为亚硝酸盐的测定。此过程基于Greiss药剂的应用，即应用250ul培养基与同等量的药剂混合。将每个实验条件都准备一式三份。

图2描述了用一个添加细胞因子而非LPS培养48小时后所得的结果。在缺乏诱导物情况下(第1组，左带)，只有很微弱的NO产生(每孔少于5μM，或2.5nmol)。只有LPS(1和10μg/ml)的情况下，只能勉强刺激不足50％的基本合成(第1组，分别为中带和右带)。

在缺乏LPS情况下，添加INT-γ(50-500U/ml)(2至5组，左带)，导致亚硝酸盐的量成比例适量增长，最大量达45μM。添加1或10μg/mlLPS(分别为中带和右带)，刺激诱导达120μM或接近基本水平的20倍。相反，TNF-α浓度达500U/ml，无论有无LPS(第6，7组)，均不能对刺激产生任何影响。在10μg/mlLPS存在下(第8组，右带)，最小试验浓度(5ng/ml)的白细胞介素-1β(1L-1β)比500U/ml的INF-γ(第8组，右带)略微有效，但1L-1β的浓度高达100ng/ml(第9，10组)，增加的刺激较少。

图3描述了将另外的细胞因子加人INF-γ/LPS二元混合物(三元或四元混合物)，实验中无细胞因子情况下的基本合成(第11组)略微高于以前组(与第1组相比)，这种情况同样出现在10μg/mlLPS和250U/mlINF-γ的二元混合物中(第12组，与第5组相比)，因为此混合物成本低，所以被选作体外连续实验的标准混合物，此混合物作为参照，在LPS存在下添加TNF-α至500U/ml并添加1L-1β(第13组)，使NO合成翻倍(中带和右带)。而且，重要的是，iNOS诱导变得对LPS添加物有依赖性(左带)。增加TNF-α至3,000U/ml时不再产生进一步的刺激(第14组)。

TNF-α不是必需的组分,这通过(a)和(b)得到证实。(a)混合物中去掉它，IL-1β提高至100U/ml，只轻微减少刺激(第15组)。(b)后一混合物中加入(只能阻止刺激减少不能增加刺激)TNF-α500U/ml(第16组)，IL-1β和IFN-γ分别降至5ng/ml、100U/ml(第17组)，对诱导几乎不产生影响(与第14，16组相比)。从第18组与相应的第13组的比较中可非常明显地看出：将IL-1β降至5ng/ml，对刺激可能不产生影响(第13组中所用的IL-1β是18组的4倍多)。

图4显示了iNOS诱导的时间过程。其中诱导物RP-SMC用或不用标准混合物处理，有或无NOS抑制剂(L-NAME)，时间范围为0-96小时，在培养基中估计亚硝酸盐。缺乏抑制剂，甚至在96小时也只有很少量的亚硝酸盐积累(实心方形)。但用标准诱导混合物处理，6-10小时滞后期之后直至48小时，有一个接近线性的合成，这一时间后合成率逐渐减慢(实心圆形)。从用2mML-NAME所获得的最大达85％的抑制中可以看出：亚硝酸盐的释放是由于iNOS的诱导作用。

正如图5(+1)所示：在诱导物存在下，48小时后亚硝酸盐合成逐渐减慢，并非是由于iNOS降解显著增加，而是由于产物过度积累所致的酶活性反馈抑制。在有或无诱导物存在下，铺满24孔平皿培养RP SMC，在48小时去掉培养基，取而代之的是含有或不含有诱导物的新鲜培养基。当亚硝酸盐的合成按小时比例进行时，3-5天中所获得的值(孵化带)甚至高于2天前所获得的值(空白带)。当在48小时时去掉诱导物而又不使用新鲜培养基时，此酶的转化似乎是缓慢的，这似乎保证iNOS能够在停止诱导后相当长的一段时间内保持高水平。

在RPSMC培养基中观察到的亚硝酸盐积累的刺激作用是由于iNOS的诱导作用产生，论证诱导的阴茎细胞含有iNOS mRNA(Northern印迹)和iNOS蛋白质(Western印迹)可以证实这一点。iNOS mRNA表达的Northern印迹分析，用标准硫氰酸胍/CaCl法将mRNA从两个10cm盘上的RPSMC中分离出。此法补充了乙醇沉淀分离的两组苯酚/氯仿提取物，并用寡脱氧胸苷酸分离出聚腺苷酸化RNA。在变性甲醛1％琼脂糖凝胶上，用每道3-4μg聚腺苷酸化RNA制作Northern印迹，然后用Posiblot压力印迹装置将其转移至10X SSC的尼龙膜上。

如前所述，用一个〔32-P〕标记的特异性探针杂交过滤器，从RPSMC中获得由一个350bp片段组成的iNOS cDNA，它被称作RPSMC-iNOS350。分别用反义和有义引物NO4和NO3，通过1μg从LPS/γINF诱导的RP-SMC中逆转录，合成此片段。这些引物是从小鼠巨噬细胞iNOS的核苷酸序列中选定的20体。并且在此cDNA的FMN区域中含有一个350hp的片段。将此探针克隆入InvitrogenPCRII载体，亚克隆入Promega pGem3z。自动化双脱氧测序表明：此探针分别含有与小鼠iNOS cDNA90％的同源性。用NOS探针处理后，用甘油醛磷酸酯脱氧酶(GPDH)探针再次杂交Northern印迹。

对于Western印迹，冲洗经诱导的其它RPSMC，在一种常规缓冲液中将其裂解，煮5分钟，用一种微量离心机澄清此提取物，将等份试样在一个具有适宜分子量水平的电泳微量凝胶上进行电泳，将一western印迹移至硝化纤维膜上。将过滤器与市售抗小鼠巨噬细胞iNOS羧基端的家兔抗血清(亲和性生物药剂)反应。通过一个辣根过氧化物酶山羊抗家兔第二代抗体和一个市售ELC(鲁米诺)检测药剂盒，使此信号可见。

图6显示的是：用大鼠RPSMC iNOS探针杂交，经一段时间诱导的聚腺苷酸化RNA的northern印迹。在顶部区域可见4.5kb典型信号，底部为甘油醛磷酸酯脱氧酶参比带。图7显示的是：通过诱导RPSMC的裂解获得并与一种市售NOS抗体反应的western印迹，它显示出所期望的125-130KD iNOS带(道2)。用一种大鼠小脑提取物不能获得信号，道3为空白。实施例2 将iNOS诱导物直接注入阴茎海绵体

此实施例说明将氧化氮合酶直接注入大鼠阴茎的方法。

用每公斤体重腹膜内注射50mg5-乙基-5-(1-甲基丁基)-2-巴比土酸钠的方式，将来自“成年”，“老龄”，“更老龄”三组的雄性Fischer344大鼠麻醉。这些年龄组在相对老龄方面的定义与大鼠Fisher344株(最大生存期约34-36个月，最佳繁殖期2.5-8个月)的常规指定有关。一旦大鼠繁殖疲劳，在控制光源下饲养动物，并按NIH规定处理。每个实验的每组动物数目显示于相应图中。

在横向耻骨弓上切一个皮肤切口(5mmm)，以暴露阴茎角和它的近端部分。然后用一个与一乙烯管(Bolab/bb317-85Arizona)相连的27号针对右侧阴茎海绵体进行插管，此乙烯管与一个ALZET^R渗透泵(AlzaCorporation，Palo Alto，CA)相连。每个泵(所示储存容积100或200ul)含有1ug/mlE.coli脂多糖(LPS)，2,500U/ml重组大鼠干扰素-γ(IFN-γ)，2,500U/ml重组人肿瘤坏死因子(TNF-α)和50ng/ml重组人白细胞介素-1β(1L-1β)的混合物。在大鼠海绵体中试验此混合物，发现其有效。可以用类似方法，将其用于人阴茎组织(见实施例5)，最好用人INFγ代替大鼠INF-γ。

通过Mersilene 6-0缝合将针和线固定于阴茎的外周组织，将渗透泵皮下放置于大鼠腹部。将针刺入海绵体，在与泵最后连接之前，通过注射肝素化盐溶液检查进入腔隙空间的通畅性，并观察机械诱导的勃起。通过Dexon^R Plus4-0缝合，封闭此切口，在整个实验中，通过观察一般状况的恢复和尿的活性，检查手术的成功性。去掉泵时，证实没有外周血肿和炎症。通过渗透压将泵运送的诱导混合物从导管直接压入海绵体，或者以1ul/hr在3天内压入(泵1003D)，或者以0.5ul/hr在14天内压入(泵2002)。

在某些情况下，在第三天将泵1003D从麻醉的大鼠中取出，并将一装有新鲜溶液的新泵放入腹部，并按上述方法与导管相连。在另外的三天中，继续进行治疗直至放出储存罐中的所有内含物。实施例3勃起反应的改善测定

此实施例说明测定勃起反应改善的方法，此改善是由氧化氮合酶诱导物治疗引起的。

在每组治疗完成时，按实施例1中所述的方法将大鼠麻醉。通过一个改进的公开方法测定勃起反应，简单地讲，用外科手术的方法暴露出海绵体神经，用一个方形脉冲刺激器刺激。此刺激器与一个放置于此神经上的白金双性电极相连。通过一个插入海绵体内的针，用一个与一记录器相连的压力转换器记录海绵体内的压力，为在毫米汞柱上将反应表达出来，用一个压力计对此记录器进行校准。在整个实验中(约2-3小时)，每隔45分钟，给动物重复注射35mg/kg的氯氨酮。

在重复实验中，每组大鼠依次接受下列治疗：(a)30秒脉冲电刺激(EFS)，频率为15Hz，每次间隔5分钟，对于电压响应曲线，电压依次为15，10，2.5，5和10伏特；(b)以每只动物2mg/kg的单位剂量注射氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)后，以10伏特的电压进行EFS，记录30分钟。在某些动物中，通过如上所述的股骨内插管和记录，在实验开始时其测定系统血压。确定海绵体内压力值的平均数和标准偏差，通过配对t-检验获得统计学显著性。

图8显示：成年和老龄大鼠对EFS的勃起反应显著增强，勃起反应的测定是通过在10伏特下测定最大海绵体内。在经100ul泵处理三天的更老龄大鼠中并没有产生与相同年龄未接受此处理的大鼠相比的显著性刺激(空心标记)。在2伏特的最低极限，所有组的勃起反应刺激均是显著的。充当勃起功能障碍的老龄大鼠经iNOS诱导物混合物治疗，反应变得好于年龄小的动物(成年组)。

甚至在非老龄(成年)大鼠中均存在阴茎勃起大幅度增强，而这种增强并不伴随不良副作用。这些大鼠看起来健康而灵活，系统血压保持正常，没有出现阴茎异常勃起。它提示：无论什么机理的阴茎勃起增强，均可在EFS刺激物所释放的生理调节下维持。不希望被理论所限，所以我们认为：EFS刺激物在阴茎中引导了一种神经传递过程，此过程与在性刺激中所出现的一种或多种过程相类似或能对性刺激物产生应答。

图9显示：治疗大鼠阴茎勃起的刺激作用依赖于NOS级联，因为不是最佳剂量的L-NAME可将其抑制。确定经L-NAME处理后的海绵体内压的最大分数，并与以前一个单独实验中所获得的未经处理的大鼠的对应值进行比较。在经处理和未经处理大鼠中的比较值为：经处理大鼠的值比未经处理大鼠的值为39％比62％(成年)，18％比30％(老龄)以及28％比23％(更老龄)。这表明：成年和老龄动物对治疗性NOS级联的依赖甚至高于缺乏NOS诱导物时对它的依赖。在开始衰老的动物中的情况也如此。

描述于图10的实验显示：短期(3天)治疗的功效大于较长时间治疗的功效，在较长时间治疗中诱导物混合物在泵中保持14天。这可能是由于某些生物成分的失效而造成。此阐明了应用图8中相同的诱导物治疗14天后对接受EFS的勃起反应造成的影响。两组大鼠在每个年龄组中都很明显：1)高应答者(实心标记)，在10和20伏时，分别达到海绵体内压刺激的50％和300％，高于各自对应的未治疗大鼠(见图8)。2)未应答者(空心标记)，其值相似或低于未治疗大鼠。

通过对最适剂量下的L-NAME的敏感度可判断应用iNOS诱导物治疗的成功与否，如图11所示。L-NAME抑制三个年龄组中反应大鼠的勃起反应超过95％，此比图9中所述实验情况更加明显，而在非应答大鼠中抑制作用仅为一般(与非治疗大鼠相似)。

这些结果表明：在此应用于大鼠阴茎(或引入组织)的iNOS诱导物在很大程度上有效地刺激全部三个年龄组中接受EFS的勃起反应，且在老龄大鼠中更加明显。实施例4诱导治疗后所增加的NOS活性的测定

此实施例证明勃起反应的增强伴随氧化氮合酶的刺激。

将100ul泵植入六只成年大鼠三天，然后用带有如实施例2所述的新鲜溶液的相似的泵取代它。三只大鼠带有含诱导物混合液的泵，而三只大鼠带有盐水并作为对照。在实验末，按上述方法将大鼠麻醉，手术摘取阴茎(包括睾丸)、肝以及某些大鼠中的小脑。切除阴茎头和皮肤，并将此组织贮存于液氮下。

从两个治疗和两个对照大鼠的组织匀浆中测定NOS活性，为了避免体内实验中残余L-NAME的干扰和EFS诱导的NOS活性的改变，它不接受EFS。在含0.32M蔗糖/20mM Hepes pH7.2/0.5mM EDTA/1mM DTT和蛋白质酶抑制剂(3uM亮肽素、1uM胃酶抑素A、1mM苯基甲基磺酰氟)的四体积冷培养基中从每单个器官(约300-400mg)中制备匀浆。通过以12,500g离心60分钟而分离胞液和特殊成分，并且将特殊成分再悬浮于相同容积的培养基中。将胞液成分通过Dowex AG50WX-8(Na⁺)树脂以除去内源性精氨酸，并在2uCi/ml树脂纯化的(3-H)L-精氨酸100uML-精氨酸存在下，将50ul的三个等份与或不与L-NAME(2mM)、0.3mM氨基胍或EGTA(5mM)一起按照前面所述在37℃培养45分钟。通过此树脂除去残余(3-H)L-精氨酸，在三氯乙酸乙酯提取的上清液中计算(3-H)瓜氨酸。通过在零时培养放出的放射性校对所有的值。

在图12中比较柱标记为“C”的未治疗(对照)大鼠与柱标记为“T”的iNOS诱导物治疗大鼠的阴茎胞液中NOS的活性。很明显，NOS的活性提高58％。如图13所示，L-NAME可将此活性抑制60-70％，但氨基胍，AG，不影响此活性。因为与nNOS相比，AG是巨噬细胞iNOS的优先抑制剂，此证据可使我们相信在体内诱导的iNOS与巨噬细胞iNOS不同。

通过NADPH心肌黄酶活性的组织化学检测以证实在提高阴茎NOS中iNOS诱导物的作用。将一治疗成年大鼠的阴茎和一对照成年大鼠的阴茎包埋在冷冻于-70℃的OCT化合物中，用恒冷切片机将其切为15um的切片，并且用四唑蓝进行NAPDH心肌黄酶的染色。此活动被称为应用NOS的联合定位，在此NOS为目前研究的所有组织中的NOS，包括大鼠阴茎。

图14(全部放大100倍)显示20个月的未治疗大鼠阴茎海绵体(A组)、相同年龄组大鼠的诱导海绵体(B组)和大鼠小脑(C组)的冷冻切片的比较。很明显，在未治疗大鼠的海绵体中蓝色染料局限于小面积中，而在用iNOS诱导物治疗的大鼠海绵体中蓝色染料浓度更高且扩散在大片面积中。小脑组显示在大部分组织切片中有大片面积。

通过用商用抗大鼠巨噬细胞iNOS的兔多克隆抗体和生物素酰化山羊抗兔IgG的免疫细胞化学，应用辣根过氧化物酶和DAB染色，可以获得NADPH心肌黄酶染色的证据(图15，全部放大100倍)。A组显示加入对照兔血清(1/1000)的未治疗大鼠海绵体的很少的染色，相反抗血清(1/1000)将某些面积染色为较浓密的褐色(B组)。治疗海绵体的切片(C组)具有更深且更弥漫的染色，如NAPDH心肌黄酶的情况。免疫细胞化学方法比NAPDH心肌黄酶技术(一般的NOS)具有更特异的对iNOS同工酶的识别，并提示甚至在外部诱导不存在的情况下iNOS可表达于老龄大鼠的阴茎中。诱导仍按所预期的刺激iNOS的表达。

通过用Western印迹测定法分析两个治疗大鼠和两个对照大鼠的阴茎胞液而获得在用iNOS诱导物治疗的20个月大鼠的阴茎中iNOS诱导的证据。通过Lowry方法估计蛋白质，并将80ug胞液蛋白质至于7.5％聚丙烯酰胺微型凝胶上1小时，然后通过电印迹转移至尼龙膜上。应用1小时曝光的自体放射照相术按照前面实施例检测此iNOS的130KD带。

图16(底部)显示在未治疗大鼠的阴茎胞液(CC)中一个微弱但明显不同的iNOS信号(UT，头两道)，此证实免疫细胞化学的结果，它表明大鼠阴茎中iNOS生理表达的程度，至少在此年龄的大鼠中。如通过免疫细胞化学所观察到的，泵治疗大鼠(Tr)的阴茎胞液中iNOS信号明显地增强，此证明体内诱导是成功的。与两个阴性对照组(小脑(Ce)和未治疗RPSMC)对应的道中没有看到iNOS带，相反在诱导RPSMC胞液中产生一个明显的信号。

然后从iNOS信号中剥离此膜，并再次与抗人脑神经元NOS(nNOS)(Transduction Laboratories)的羧基末端的兔抗体反应。当顶带为双峰时，如上所述检测相应的l60kD带。图16(顶带)显示nNOS存在于这四个阴茎样本中，特别是存在于小脑胞液(阳性对照)中，以及它不存在于非治疗的和诱导的RPSMC中。这从而证明应用iNOS抗体检测的特异性。

实施例3和4中提供的数据阐明本发明通过将诱导物混合物直接给予阴茎而在大鼠阴茎中诱导iNOS的过程以及在三个年龄组中所得到的没有不良副作用的勃起反应的刺激。实施例5 在大鼠和人阴茎海绵体中iNOS诱导的体外测定

为了证实iNOS诱导物混合物直接作用于大鼠阴茎诱发iNOS合成的能力，重要的是证实iNOS的诱导能够在从动物切除的阴茎组织中发生。相似的，由于最终目标是用于治疗人，所以必需表明这种操作也能在人阴茎中发生。本实施例表明诱导物混合物也能在阴茎海面组织中诱导iNOS。

从三只大鼠中切除剥光皮肤的球状和柄状区，切成小片，清洗几次，并在24孔平皿(50-80mg/孔)0.5m1MEM/10％胎牛血清中孵育。把每片阴茎分成四个孔，并将其中两个孔经过标准双孵育混合物(10ug/ml LPS和250U/ml大鼠γ-干扰素)。孵育进行48小时并在孵育培养基中测定硝酸盐。把所说的组织片清洗、匀化并且如前面实施例在RPSMC时得到胞质溶胶。如上进行iNOS蛋白质的蛋白质印迹分析，不同的是使用其它商品抗体(Upstate)，所说的抗体抗所有大鼠的巨噬细胞iNOS蛋白质。把所说的实验重复三次。

为了分析人阴茎的诱导，从经过作过阴茎修复术植入块的三名患者正式同意的弃去物得到阴茎海绵体的切片。把各个患者组织分别经过如上孵4育和分析，不同的是：a)在MEMO/0.1％人血清中把阴茎切片经过一夜的血清除尽振荡(shock)，并在相同培养基中继续孵育5天；b)诱导混合物是10ug/ml LPS，500U/ml人γ-INF，200U/ml人TNFα和4ng/ml人IL1β。

图17上部显示了在大鼠1-3的大鼠阴茎海绵体(RCC)中获得的有(+)或没有(-)诱导作用的结果。一条明显的130kD iNOS带是从用诱导混合物孵育的三个切片的胞质溶胶中经蛋白质印迹法可测的。用诱导大鼠巨噬细胞的胞质溶胶(1MM，最后一个道)证实了iNOS带的位置。在两种情况下(大鼠1和3)，没有诱导物时观察不到iNOS带，但在一只大鼠(大鼠2)中，有一种基本上是内源性iNOS合成，尽管它低于诱导的样品。在各种情况都存在硝酸盐产物，但含量较低(在诱导的样品中为44-65uM)。在+和-道之间没有观察到NO合成的明显不同，并且在iNOS带的密度和硝酸盐产物之间没有相互关系。这就比较了诱导和没诱导的RPSMC的发生情况(见上述)。在重复实验中得到相似结果(没有显示)。

图17下部显示了使用人阴茎海绵体(HPCC)的结果。在相应于HPCC组织的诱导切片的蛋白质印迹的第三道测得非常明显的iNOS带。阳性对照是诱导的RPSMC的胞质溶胶(第4道)和大鼠巨噬细胞(IMM，第5道)。在没有诱导物存在下孵育前(第1道)或孵育后(第2道)相同组织的切片中没有看到iNOS。在其它两个重复实验中得到相似的结果(没有显示)。就象在大鼠阴茎海绵体时，由人阴茎海绵体切片中合成的硝酸盐的量越低(这里是58uM，在其它患者中只有20-30uM)，与所观察到的明显的iNOS带的相互关系越差。

这些实验确实证明了：a)在大鼠阴茎海绵体中能够体外诱导iNOS，也证实了体内所得到的结果；b)如前体内所观察到的，在加入的诱导物不存在下在一些大鼠中也能测得到低含量的iNOS；c)由于硝酸盐的合成非常低并且最有可能引起nNOS活性，所以诱导的iNOS似乎受酶活性(抑制)的严格控制；d)在人阴茎海绵体基本上发生相同的过程。

从这些实施例中的总的结论是通过药理方式(用诱导物混合物诱导的mRNA，体内和体外的基因疗法，蛋白质给药，等)在阴茎海绵体中诱导的iNOS蛋白质和cDNA将受生理控制的抑制而保留并直到如一次或多次的自然性刺激消除了控制将不产生NO。这证实了本发明方法作为治疗阳痿而不使被治疗的阴茎海绵体出现不希望的持久性血管舒张(胀阳症)的疗法的适用性。此外，它解释了在用泵中诱导体(实施例3)和用cDNA基因疗法(实施例7)二者治疗大鼠中不出现胀阳症的原因。在我们的实验中是通过电刺激大鼠的神经(EFS)来使控制释放出现的，我们认为它类似造成性刺激的神经传导，并认为它包括了Ca2+流动性或NOS激活的其它机理。我们至少已使这种EFS激活在阉割大鼠中出现。实施例6 克隆阴茎特异性iNOScDNA和证实后续把转染的细胞或组织植入块接种到大鼠和人的阴茎海绵体中的其体外表达

为了进行iNOS基因疗法，必需有iNOS的全部编码区的结构，测定这些结构中阴茎iNOS核苷酸和氨基酸序列是否与文献中所报道的那些其它的iNOS不同是很重要的。一种明确的阴茎iNOScDNA可以从一种iNOS基因或优选在经过不同表达调节的阴茎中表达的基因衍生出来。在所说的阴茎组织中也可以特殊控制所说的产物(iNOS蛋白质)的酶活性。这一实施例显示了在RPSMC中组成型表达大鼠iNOScDNA构建体的构建和使用。

制备iNOS结构有两种方法。第一种方法集中在来自诱导的RPSMC的大鼠阴茎iNOS，因为它可以在这些动物中首先尝试基因疗法实验。另一种方法是集中在人阴茎iNOS，因为它是以大鼠实验为基础用于人阳痿疗法的产物。

从150cm²烧瓶中用LPS/INF诱导物混合物孵育48小时的融合性RPSMC中分离全部RNA，并用常规步骤制备polyA+RNA。把15ugRNA用于把一种诱导的RPSMC cDNA文库构建到σZap载体中(UniZapXR，Stratagene)。把所说的文库放置在150cm²Petri平皿上，培养并把裂解的斑双份(重复平板接种)转入尼龙膜上。用32-P标记的RPSMC-iNOS350进行杂交。在初级、二级和三级筛选后，在自动测序仪上用双脱氧法选择四个克隆进行测序。在每个以前序列为基础合成的连续排序引物帮助下把每种测序延伸到3方向。反义引物使互补序列排序。

由于是文库制备物，只能把1.1kb的适当测序，并把四种克隆重叠成较大的延伸。用RT/PCR从用于构建文库的RNA中得到5和3的排序，如图18中所描述的。上面描述了四种克隆的iNOS cDNA的结构代表如TSC*，TSC5，TSC2和C5y，也显示了三种PCR的产物1/2，5/6和7/8。iNOS图下的箭头表示各单独序列的长度和方向。

为了得到更多的代表性克隆和完整的测序，从诱导的RPSMC制得的新polyA+RNA中得到一种二级cDNA文库。用图18上描述的探针混合物筛选所说的文库。如上筛选四种克隆并排序，如图19所表示的。只描述了用于最终结构的克隆1和5。把克隆2和3与5叠加并稍微延伸到5区。iNOS草图下的箭头表示各单独序列的长度和方向。

来自两种cDNA文库的重叠片段能够编辑序列的错误和双关性，并最后从RPSMC iNOS得到一种共有序列(见附录A列出RPSMC iNOS cDNA的核苷酸序列)。下列表1表示了从两种不同组的大鼠脉管iNOS序列中发现的核苷酸和氨基酸的差异，并当分别比较参考序列中的每一个时显示出6个氨基酸的不同。在酶活性基团上游区域中不同于两种参考序列的氨基酸残基数同时是两个(氨基酸270和591)。这两种明显不同的变异表明iNOS RPSMC序列来自与大鼠血管序列不同的基因中。这一结论得到了近期在人和灵长目基因组甚至分离的染色体(14和17)中发现多种iNOS基因序列的支持。但是，不能完全排除多态性。

表 1

在RPSMC iNOS中发现的与大鼠血管SMC iNOS比较不同的氨基酸

RPSMC 大鼠血管SMC变化 AA位置我们的工作参照#1 参照#2编号编号 __________ __________

密码子 AA 密码子 AA 密码子 AA1 72 CAU HIS CAU HIS UAU TYR2 201 AUU ILE AUU ILE AUC ILE3** 270 ACC THR CCC PRO CCC PRO4 348 CCC XLA GCC ALA CCC PRO5* 349 CUG VAL GCG ALA GUG VAL6 423 UUU PHE UUU PHE UUC PHE7** 591 CGC GLY GTC VAL GTC VAL8 679 GAC GLU GAG GLU GUG VAL9 680 ACG THR ACG THR CCG PRO10 683 GUU VAL GUU VAL GUC VAL11* 721 CUC LEU CCC PRO CUC LEU12* 741 CUG LEU CCG PRO CUG LEU13* 1084 AUC MET AUC ILE AUG MET参照#1：从大鼠血管平滑肌细胞cDNA克隆和表达的iNOS。生物化学生物物理学报，Geng，Y.J.等，1994。参照#2：大鼠血管平滑肌细胞iNOS克隆。生物化学生物物理研究通讯，Nunokawa，Y.等，1993。*者：与参照#2相配，但不与参照#1相配。**者：既不与#1相配，也不与#2相配。无*者：与参照#1相配，但不与参照#2相配。下划线者：类似于我们的工作的数据。

用二级文库中的两种克隆(1和5)在pBlueScriptSK(+/-)(Stratagene)载体构建RPSMC iNOS编码区的构建体。用限制酶Kpnl和Nhel在克隆1并用Nhel和Xhol在克隆5中产生粘端。连接这两种片段并用琼脂糖电泳分离的二聚体插入用Kpnl和Xpnl限制性消化的载体。用连接混合物转化大肠杆菌并把所说的质粒分离、纯化、分析和设计pBS RPiNOS。然后用Kpn1和Not1从pBS RPiNOS取下iNOS的全部编码区并克隆到真核细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen)中的那些克隆位点。所说的载体含有指导克隆基因和SV40驱动的抗生素G418抗性新霉素基因转录的CMV启动子。这种新构建体被定义为pcDNA3 RPiNOS和被在5端测序150bp，它们可证实iNOS的存在(见附录BRPSMC iNOS氨基酸序列)。

然后使用所说的构建体稳定地在体内转化RPSMC以在不存在iNOS诱导物时使细胞组成型表达iNOS蛋白质。以1∶8(ug/ul)把pBS RPiNOS与脂质转染药剂(GIBCO)混合并把1ml血清缺乏DMEM培养基加入(2ug/孔)到生长在35mm平皿上30％融合的RPSMC。加入含有10％胎牛血清的DMEM5小时后，使培养进行24小时。同时用新鲜的培养基替换所说的培养基并继续培养48小时。再替换培养基并在含有300ug/mlG418的培养基上继续培养来选择含有质粒的转染细胞。在生长和增殖3-4周后分离多种细胞的克隆。选择16种克隆并测试无诱导物时硝酸盐的产物。在孵育第4天好几种克隆以高于非转染细胞的基础浓度10um到45-50uM水平的量释放硝酸盐。这明显地表示在转染细胞中有意想不到的活性iNOS的高度表达。实施例7 治疗人阳痿的人阴茎iNOS cDNA的部分测序

为了把在大鼠模型中开发的iNOS的基因疗法转移到人，必需给人阴茎iNOS测序来确定它是否与人肝细胞cDNA是相同物种或不同物种，并将其克隆到充足的表达载体中。在人的临床实验之前，后者必须在HPSMC和制备的人阴茎海绵体切片中实验。这样实验表明人阴茎平滑肌iNOS cDNA的部分相关序列(60％的编码区)。

从经过阴茎修复移植术的阳痿患者得到手术切除阴茎海绵体的样本(每个患者至少5g)，并放置在冰中的(DMEM)直到运送到实验室。所有的步骤都要经过人类受治疗者公共团体委员会(institutional human subjectscommittee)的批准并在正式同意协定书下实现。把所说的组织切成非常小的碎片并在切除2-6小时在Primaria烧瓶采用常规移植方法开始在DMEM中用20％胎牛血清培养阴茎平滑肌细胞(HPSMC)。其它组织切片用于没有提前分离平滑肌细胞的直接治疗(如上)。一旦细胞融合，把它们用胰蛋白质酶消化，转移到10％胎牛血清的DMEM中，并繁殖到第25次传代。用肉眼检查这些培养物的形态学特征并对肌肉肌动蛋白免疫细胞化学染色，表明它们只含有平滑肌细胞。把所说的培养物命名为HPSMC(“人阴茎平滑肌细胞”)，对来源于单个患者的每个样本给一个识别号。

为了测定诱导iNOS合成的最适合的条件，把HPSMC转移到24孔的平皿上并使其融合。用来自4-14次传代的RPSMC同源培养物作对照。以各种浓度加入一系列诱导物，并在24和40小时用标准的Griess反应法通过测定硝酸盐向培养基的释放来测定NO产生。

在方法1中，在DMEM/10％胎牛血清存在下直接处理4-14次传代的三种患者的HPSMC，而在方法2中，把来自这些患者中的两个HPSMC(12次传代)转入含有0.1％牛或人血清的DMEM，保持24小时，最后再在含有不同诱导物的相应的新鲜培养基中培养24小时。对孵育人阴茎海绵体来说后一种方法效果比较满意。

用RPSMC中硝酸盐合成有显著增加的疗法HPSMC表现出非常少的硝酸盐产生，除了HPSMC中iNOS活性偶尔提高的一些情况。在后一种情况之一，用常规方法从HPSMC中分离出poly A+RNA，其中HPSMC在10cm2平皿中生长并用方法2用一种混合物培养48小时，其中所述的混合物含有1ug/ml的大肠杆菌脂质多糖、500U/ml的重组人干扰素-γ(IFN-γ)、200U/ml重组人肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和4ng/ml的重组人白细胞介素-1β(IL-1β)。由于在HPSMC中iNOS的诱导相对较低，这种cDNA文库不是优选的方法。

从用于诱导的RPSMC的cDNA文库途径改变这种优选的方法得到一种以通过所得到的cDNA的聚合酶链反应(PCR)扩增结合的iNOS mRNA的逆转录(RT)为主的方法。用公开的用于RT/PCR和DNA序列反应的人干细胞iNOScDNA的序列通过常规方法合成一系列18twentymer引物。选择它们是为了有义引物中的每一种(除了No.1)就在反义引物的上游100-150bp，在每个不同片段(0.35-0.95kb)中含有独特的限制位点。这促进了扩增片段的后续克隆。

在反义寡核苷酸引物中的每个存在下(0.5uM)，用MMLV逆转录酶(100U)通过常规的方法逆转录实施例1中方法1的0.5ug份的poly A+RNA。采用常规的“热启动”法，在有义和反义引物(0.25uM)存在下把1/5份RT混合物在94℃(45秒)、60℃(30秒)和72℃(90秒)经过一组35个循环的PCR。用凝胶电泳分析1/7份的PCR混合物和通过与足够的标准比较测定带的大小。把PCR混合物的剩余物经过相同的步骤并用常规方法(Millipore柱)洗脱并纯化所说的片段。

分别用有义和反义引物两者在自动测序仪上给每种片段测序。图20上的阴影表示已测序的HPSMC iNOS的位置并延伸2.13kb外3.63kb。这包含了蛋白质激酶，钙结合调节剂蛋白、FMN和FAD结合位点。在兔抗合成小肽(各15个氨基酸)的这些区域制备命名为Ab1和Ab2的两种抗人肝细胞iNOS抗体。

图21表示用于从已测序的HPSMC中生产RT/PCR片段的引物。图22表示按照所说的区域HPSMC iNOS核苷酸序列和各人肝细胞iNOS的同源性在88％到99％之间变化。HPSMC iNOS相对于大鼠主动脉iNOS只有81-82％的同源性。即使考虑到多义性和序列错误，这也暗示这样得到的HPSMC序列属于与人肝细胞iNOS不同的cDNA，与用RPSMC iNOS所得到的情况一致。然而，不论RPSMC和HPSMC iNOS cDNA是否由不同于迄今发现的大鼠和人iNOS基因编码不影响本发明iNOS基因疗法或iNOS蛋白质疗法步骤的应用。

所说的实施例显示了用于克隆阴茎海绵体平滑肌的阴茎iNOS和阴茎特异性新iNOS同工型序列的步骤。在能够组成型合成NO的大鼠阴茎细胞中表达了相应的构建体。所以，本发明的一种方法包括把稳定转染阴茎细胞或阴茎海绵体切片的iNOS植入患有勃起机能障碍的人的阴茎中。此外，已部分测序来自人阴茎海绵体平滑肌的阴茎iNOS，并认为是明确的阴茎同工型(见附录C，和相应的cDNA序列附录D)。实施例8用大鼠阴茎iNOS cDNA通过阴茎海绵体的基因疗法对老龄大鼠勃起机能障碍的校正

为了证明iNOS能够治疗老龄大鼠的勃起机能障碍，必需将所说的构建体体内给药，测定治疗大鼠的勃起反应，并显示在阴茎海绵体中表达的iNOS。此外，重要的是评价在阴茎和全身水平时可能的副作用。所说的实施例显示了在大鼠模型中用RPSMC iNOS cDNA构建体显著性地和出乎意料地改善勃起反应的勃起机能障碍的基因疗法。

所说的实验选择了禁食一周的7只20月龄的大鼠和1只5月龄的大鼠。在无菌操作下，在麻醉大鼠上用一个小的凡能斯提耳氏切口使阴茎暴露出来。得到阴茎长度的迟缓的解剖。用一根2-0的丝和夹子，把把阴茎固定在它的根部。用一只25的计量针头把100μl的刚配制好的10μg pcDNA3RPiNOS和80μl脂质转染试剂(lipofectin)(1∶8)注射到三只未受损大鼠和一只阉割大鼠的阴茎体上。把这种位置保持2分钟。然后除去针头并用间断的2-0丝缝线关闭所说的切口。剩余的四只未受损的老龄大鼠(对照组)只用脂质转染试剂采用上述步骤处理。五天后，用EFS测定法测量勃起反应，同时用计算机数据获得和分析系统记录平均的动脉压。

两种未受损大鼠(#1和#2)在10伏EFS的最大海绵体内压力(MIP)有一个出乎意料的戏剧性和显著性改良，2-3次刺激达到105h100mmHg(图23)。对照大鼠之一(#4)显示了45mmHg的MIP，其它两只(未显示)是50和58mmHg。所有对照大鼠为或低于平均前面20月龄大鼠(见实施例3)所获得的58mmHg。甚至勃起反应的刺激高于前面成年大鼠所平均得到的(77mmHg)。全身注射NOS抑制剂L-NAME2.5mg/kg完全消除了勃起，这明显地说明所说的勃起反应依赖于NO。通过处理第三只处理的老大鼠(#3)和阉割的成年大鼠(没显示)的勃起反应没有得到改善。我们知道阉割会影响大鼠的球状海绵体/坐骨海绵体肌肉，这些肌肉都参与了大鼠和人的勃起反应。所以，与阉割有关的勃起机能障碍目前认为是‘priori’，对iNOS疗法很可能是难治疗的。

在治疗大鼠中没有出现副作用。平均动脉压维持在与对照组的一样并对L-NAME的反应方面相同(微微增加)。如果不发生全身作用，它应当导致高血压。肉眼评价，没有出现阴茎异常勃起。阴茎损伤或大鼠警觉的损害。

通过阴茎细胞溶质的蛋白质印迹分析能够测定治疗大鼠阴茎中组成型iNOS表达。图24显示了在大鼠#1的阴茎海绵体中有一个非常明显的iNOS带，在大鼠#2有一个较弱的带而在大鼠3#和4#中没有，这可以认为是勃起反应的结果。对照组中的三个(#2，#3，#4)有很少或没有iNOS的表达，也与勃起反应一致。尽管如此，有一个对照(#1)有一个与勃起反应不一致的明显假象的高iNOS。

给四组20月龄大鼠的其它组注射1/4上述给出的构建体/脂质体混合物的1/4剂量并且11天后测定对EFS勃起反应。有一个戏剧性的增长MIP平均值+/-标准误差107+/-10mmHg，这个数值高于未处理的20月龄大鼠(57+/-10mmHg)，并且甚至高于成年大鼠中之一(79+/-8mmHg)。经过基因疗法的大鼠的平均动脉压是133+/-9mmHg，和MIP/MAP比是0.80+/-0.03。

实施例8显示了直接给阴茎海绵体单独注射我们给出的构建体在两只成年大鼠除三次实验外能够戏剧性地改善EFS阴茎勃起反应5天后注射，并且能诱生阴茎iNOS的表达，不引起副作用。在使iNOS高度表达，很长时间后和使用把副作用降到最小的低剂量，反应甚至会更好并且更能再重复，这些就是患者可以自己直接注射进阴茎海绵件中实施阳萎基因疗法的确凿的证据。但是，患者只需要周期性地自己使用这些注射液(以稳定NOS表达的经常性平衡)，这可以私下进行达到长期效果，不在性行为之前马上进行，就象用血管作用药一样。实施例9接种到阴茎海绵体中的重组大鼠阴茎iNOS酶的制备

为了获得一种中间体和对阴茎中NO合成的中等持续作用和用于不太严重的机能障碍症的随后勃起，本发明包括把所说的重组iNOS蛋白质直接接种到阴茎海绵体中的步骤。这种“外来”iNOS酶只有当性刺激激发原始的勃起反应时才有活性。我们认为它与诱导iNOS mRNA或从转染的重组iNOS合成的内源iNOS会发生相同的结果，所说的实施例表示了用于勃起机能障碍疗法的大量阴茎iNOS蛋白质的生产方法。

为了体外大量生产RPSMC iNOS蛋白质，用多步方法将我们克隆进pBluescriptSK-质粒(pBSRPiNOS)的全长大鼠iNOS基因移入杆状病毒转化质粒pVL1393。

首先，用PCR除去RPINOS基因的5区。pVL1393上多角体启动子的基因有效表达需要ATG翻译启动序列在80个碱基对之内的多角体启动子。所克隆的RPINOS基因有一个142bp5未翻译区。我们选择在RPiNOS基团上用引物须竞争多角体启动子-BamHI限制位点和弥补BassAI限制位点的内部区RPINOS进行PCR来除去这些区。接着用TA克隆技术把这一245bpPCR片段克隆进PCROII克隆载体中。

第二步是分离RPSMC的3区和杆状病毒转化载体pVL1393。用BassAI和NotI把质粒pBSRPINOS切割成游离的3.8KB片段，接着为克隆目的纯化这种片段。用BamHI和NotI限制酶切割pVL1393并纯化。然后通过首先连接254bp BamHI-BsaAI片段与3.8KB RPINOS3区片段使所述片段连接起来。用凝胶电泳分离所说的产物并随后连接到pVL1393上(BamHI和Not1切口)。把所说的复合质粒pVLRPiNOS转入大肠杆菌并用克隆杂交法分别用254bp BasmHI-BsaAI片段和内部RPINOS基因片段识别正确的连接产物。用限制消化法和RPINOS ATG区的DNA测序进一步证实所说的克隆。

为了在昆虫细胞中表达RPiNOS，必须经同源重组把所说的基因移入杆状病毒基因组，这一步骤经采用转化质粒pVLRPiNOS和杆状病毒AcNPV的缺失变种(Bculogold，由Pharmigen出售的)共感染fq昆虫细胞来进行。用修饰的病毒对重组体进行阳性选择。共同转染后，用噬斑测定法纯化8个单独的变种。把这些纯种分离物中的四个扩增两倍得到高效价的原种。

用不同方法分析病毒原种对iNOS的表达。首先，对病毒悬浮物PCR并感染细胞溶质来鉴定正确的重组体。其次，对iNOS产生水平进行蛋白质印迹分析。高产iNOS杆状病毒产生者感染生长在旋转烧瓶中的sf9细胞的大量培养物。用25ADP-核糖亲和层析纯化所说的iNOS，得到大约95％的纯化蛋白质，它可用于大鼠体内基因疗法。相应的用相同方法产生的人阴茎iNOS可用于人患者的体内基因疗法中。实施例10测试NOS生物药剂效果和推荐人给药途径的动物模型

为了证实iNOS对不同类型的勃起机能障碍的可用性，重要的是测定各种情况下内源阴茎iNOS是否实际上减少和症状发生时NOS表达的量为多少。所说的勃起机能障碍的大鼠模型能够用于勃起机能障碍和阴茎NOS的全身测定。这个实施例显示了大鼠模型中勃起机能障碍伴随着阴茎NOS的降低。

为了研究诱发血浆雄激素的下降或干扰它们的组织靶的短期作用，阉割成年(5月龄)Fischer344大鼠，并用下表II中所示的化合物治疗一周，或进行肾上腺切除术。阉割阻断了血浆睾酮(T)的性腺产生，而肾上腺切除抑制了由肾上腺产生的雄激素以及其它皮质类固醇。氟硝丁酰胺是在组织含量中消除雄激素的作用的一钟抗雄激素物质。Finasteride是一种把T转化为DHT的抑制剂。剩余的其它组没受损伤并使其经过垂体切除术，肾上腺切除术或用下丘脑/垂体的轴线抑制剂(GnRH拮抗剂)处理。后者用睾丸调节T的产生，用来处理未受损的和阉割大鼠作为对照。

表 II

与大鼠中阴茎氧化氮合酶降低相关的阳痿危险因素

NOS病症或治疗参考文献 EFS应答阴茎反应活性含量A)短期性腺机能减退#只阉割 1 - - NC阉割+氟硝丁酰胺 2 -- - NC/-阉割+T+finasteride 1 - -阉割+雌二醇 2 -- -垂体切除术 2 -- -- NC/-GnRNA 2 - - NC肾上腺切除术 3 - - NC阉割+肾上腺切除术 3 - -B)长期病症衰老的，很老的 # 4 -- --糖尿病I型 # 5，6 NC -- -- -糖尿病II型 # 5，6 NC -- -- -被动吸烟 7 NC -- -被动吸烟+衰老的，老的 7 NC -- -与对照大鼠比较的变化。NC：没有变化；NC/-：非显著性20-30％减少；-：40-50％减少；--：高于60％减少。平均动脉压正常，除了*者。#中血浆较低。1.Lugg等(1995)，内分泌学136：1495-15012.Penson等(1995)，美国生理学杂志，已提交3.Penson等(1995)，内分泌学，已提交4.Garban等(1995)，美国生理学杂志，268：H467-H4755.Vernet等(1995)，内分泌学136：在出版中6.Garban等(1995)，在撰写中7.Xie等(1995)美国男科学会议，已提交

为了研究与阳萎危险因素有关的长期病症，使用患糖尿病5个月以上的很老的Fischer344大鼠(30月龄)或自发糖尿病BB大鼠(I型和II型)。其它组包括经受被动吸烟2个月的成年和老龄(20月龄)大鼠。对照组是未治疗的Fischer344成年和老龄大鼠，并且年龄与糖尿病抗性BB大鼠相配。

在所有情况下，用如上的EFS测定勃起功能，并且只在BB大鼠中经对限制的非麻醉动物的阴茎进行操作确定勃起反应(杯状和弹跳数(number ofcups and flips)来测定勃起功能。首先测定海绵体神经的协调性，其次是外周神经病(背部神经)。除了被动吸烟，所有的其它处理和条件都减少了一个或其它勃起参数，这表明明显的勃起机能障碍能够用作相应情况下人的模型(图25)。

用L-精氨酸/瓜氨酸转化测定法测定胞质溶胶中的阴茎NOS的活性，如前面实施例中所描述的。在所有情况下不排除(图25)，都有50％或更高的阴茎NOS的产生。用蛋白质印迹法可以使阴茎NOS的含量具体化(NOS蛋白质的存在量，不考虑它的活性)。并用一个适当的常规计算机程序用半定量的测密度方法评价。由于以前已知nNOS是唯一阴茎中天然产生的同工型，所以完全可以使用抗人nNOS同工型的抗体。

在短期治疗的情况下，阴茎nNOS含量(表II)不受影响，这暗示依赖雄激素抑制NOS活性是勃起机能障碍的主要原因，在勃起机理上双倍于其它作用。在长期情况下，包括神经病和阴茎组织的纤维化，阴茎nNOS有一个明显下降。这包括一种情况(吸烟)不影响勃起，可能为在长期过程中依赖于非NO辅助通道的补偿机制被激活。

所得到的结果清楚地表明阴茎NOS的下降与大鼠勃起机能障碍有关，并且由iNOS诱导或iNOS基因疗法引起的NO合成的治疗性增长将改善大鼠的勃起机能障碍。这些结果也支持我们的iNOS疗法步骤能够治疗人的阳痿这一观点。工业(医疗/治疗)实用性

很明显本发明的产物和方法将在治疗人的血管原性勃起机能障碍方面不仅对老龄患者而且对具有这种机能障碍的所有年龄的患者具有广泛的实用性。按照本发明的iNOS生物剂的给药途径依赖于所考虑的产物类型并在下列表III中列出。主要标准如下：

A)因为除阴茎外对其它器官的iNOS的共同诱导和在各器官中激活时iNOS所产生的全身作用的危险性，所以不能全身使用实施例3和4出现的类型-诱导混合物。由于细胞因子的潜在不稳定性，短期(几天)内用连续方式把诱导混合物直接施用到阴茎海绵体中。这种作用不是迅速的，而是持续几天到几周的期限，并需要重复给药。

B)实施例7和8中出现的类型-阴茎特异性iNOS cDNA制剂主要是：a)在脂质体或其它适当的药学上可接受的制剂中的非靶性、非器官或组织特异性表达构建体(在表III中用—表示)；或b)在腺病毒或逆转录病毒制剂中的器官或组织特异性表达构建体(在表III中用TS表示)。这两种类型的构建体为的是提供一种非迅速基质期间(non-immediate medium-duration)作用，这种作用主要依赖于主要经间断使用的附加或整合的外源iNOS cDNA几天、几周或几月的稳定表达。

所说的脂质体制剂包括实施例7或8中出现的载体类型或具有有效特征的等效制剂以及不同的脂质混合物，这种载体可以在有机体中任何地方低水平地表达。所以，意欲使它们在阴茎处直接使用以避免普遍作用。腺病毒构建体提供了对非复制细胞(如阴茎平滑肌中的那些)更有效的转移。如果特殊的启动子确保在阴茎中优先表达，这些构建体也可以全身给药。例如，所说的构建体可以与我们推荐使用的平滑肌β-肌动蛋白质、胶原等启动子一起使用来在平滑肌中靶位表达。外源iNOS蛋白质将限制纤维肌束(与年龄相关)并在这一隔段内，它将仅对阴茎起作用，这是因为或者它需要由性刺激过程中阴茎释放的神经传导的激活或者因为它代表特殊阴茎iNOS。在含有平滑肌的其它器官中的表达也可以发生。

在逆转录病毒载体中的iNOS构建体也可以转化培养基中复制的HPSMC，由于逆转录病毒将诱导HPSMC基因组的永久性修饰，所以它可提供更有效和稳定的整合。

C)用实施例6和7中出现的类型-iNOS构建体稳定地转染的阴茎平滑肌细胞(HPSMC)。它们可以用或者脂质体、腺病毒、转录病毒或相似构建体体内转化，然后局部移植到阴茎海绵体中，优选多部位来帮助确保均匀的分布和通过HPCC的更有效的产生。我们认为全身给药是不可取的。这类产物提供了一种非常有目标的、高度器官特异性表达，以及B类(表IIIBa和Bb)所描述的类型的非迅速的持久作用。优选或甚至必要的是从相同患者中得到的细胞培养物(HPSMC)，但按照移植方法认为从单一来源的稳定培养物是有作用的。

D)转化的阴茎海绵体组织作为C类(表III)。它们特别适合于直接植入，单一细胞不足的方法(见下文)。同时，可以施用iNOS转化的阴茎海绵体片段，作为C类起作用。

E)实施例9制备和纯化的重组iNOS蛋白质，或内源性阴茎iNOS主要是局部使用。预期的用途时是为了达到用局部使用的血管扩张剂所得到的短期和迅速的作用类型，这与其它四类相反。所说的蛋白质相对不稳定(有限的半衰期)，并需要重复给药(不稳定的转化)。全身途径需要只对阴茎有活性的蛋白质。

表 III

治疗勃起机能障碍的iNOS生物药剂的给药途径

cDNA

诱导物 - TS 细胞组织蛋白质

(A) (Ba) (Bb) (C) (D) (E)I.全身的1.口服(丸/片) × ×2.注射(皮下) × ×II.局部的(P)1.注射(直接) × × ×* ×2.注射(器件) × ×3.输注(泵) × × ×4.输尿管内(丸) × × × ×5.小丸和相关的 × ×(非输尿管)6.补片 × ×7.涂抹(膏、霜等) × ×8.直接植入 ×9.有限植入 × ×(微胶囊等)*任意的。

如上表所示，给药的特殊途径可以划分为如下几类：

I)全身的：限制在靶向iNOS cDNA(腺病毒/组织或器官的特异性启动子)，和可能的iNOS蛋白质。可以是患者自己给药，可以是或者：1)口服(优选)或者2)皮下或静脉注射。当cDNA时，认为它需要间断重复，但与性交时刻无关。当是蛋白质时，在性交之前马上给药。

II)局部的：取决于直接对阴茎给药，所有类型的iNOS生物药剂剂和如上所述与性交相关的治疗的两种时间类型都可使用。一些延长作用的治疗需要医生和实验室介入。

1)如实施例6 使用血管扩张化合物的使用方法自己直接注射到暂时收缩的阴茎海绵体的根部。对iNOS构建体保留所说的方法，所说的方法可以转染HPSMC，尽管后者可以克隆到阴茎外的部位。它也适合于iNOS蛋白质。除了iNOS蛋白质外，注射可以间断地和独立于性交时间进行。

2)如1)自己直接注射，但通过由医生植入的特殊器件，汤匙装置可以使重复注射不需要每次只用针头穿刺。如1)一样使用。

3)用医生植入阴茎或公共区的输注泵来缓慢连续直接运送到阴茎海绵体。适用于诱导物和cDNA，需要供给iNOS药剂的方法。

4)自我道入输尿管内下丸，用于中等(iNOS蛋白质)或缓慢(诱导物、iNOS构建体)运送。但是，与步骤1-3相比，化合物保持较少的对阴茎海绵体的限制。

5)由医生植入海绵体来缓慢释放丸剂或相关的药剂，它适合于诱导物或靶向iNOS构建体，有较低的全身扩散。

6)对iNOS靶向构建体和蛋白质来说，可以在阴茎或附近皮肤上自己使用缓慢的或快速释放的补片。但对诱导物并不建议使用这种方法，这种方法的使用或者在性交前(蛋白质)或者不依赖于性交(构建体)。

7)对靶向iNOS构建体或蛋白质可以油膏、乳液、霜剂等形式自己在阴茎腺状体上自己使用缓慢或快速的涂擦制剂。或者在性交前(蛋白质)或者不依赖于性交(构建体)使用这种方法。

8)由医生进行的直接植入来自同一患者的iNOS转化的阴茎海绵体平滑肌组织片。所说的组织是在实验室体外转化的并再植入患者体内。这限制在腺病毒转化组织(非复制的)，认为它能提供长期作用。它的优点是不依赖于性交。

9)由医生和实验室进行的来自相同患者或来自其它患者的建立的培养物体外转化的HPSMC有限植入。对基因组的整合优选转录病毒载体，并且所说的方法不依赖于性交。单一细胞与置入阴茎海绵体中的人工间隔保留在一起，避免由循环引起的细胞分散。载体物质可以促进组织克隆化(降解丸剂)，或在移植细胞和宿主免疫系统之间创建一种生理半透屏障(藻酸盐或等同物的微胶囊；透析膜组分；等等)。我们认为这种方法提供了最长时期的作用。

上述对治疗勃起机能障碍的iNOS相关生物剂的设计的方法对nNOS和eNOS相关的生物剂是容易使用的。主要的不同是因为它们是组成型同工酶，所以将不使用诱导物治疗，并且外源物质将经受相同生理调节以影响内源nNOS和可能影响阴茎中的eNOS。这样，为了避免全身作用，只有局部释放体系是可行的。此外，在实施例8出现的那些情况，即病理条件不受nNOS(和可能是eNOS)影响的情况下，保证了nNOS和eNOS的生物活性剂的使用。这些调节剂包括NOS的辅因子(四氢生物蝶呤、辅酶等)、底物(

L-精氨酸)、二聚诱导物和阴茎上局部使用的相关物质。

总之，本发明优选的实施方案主要是用iNOS诱导物混合物的体内局部连续的阴茎治疗，具体方法是单一或重复局部施用iNOS、cDNA的构建体或iNOS重组蛋白质；或者高度表达iNOS的基因工程阴茎细胞或组织的植入物来通过阴茎NOS的增加实现产生显著的勃起反应的刺激，我们的证据表明阴茎NOS是一种同工酶。局部的体内治疗出人意料的是没有引起不期望的认为的全身施用iNOS诱导物可能产生的副作用，并因为在没有神经刺激存在时不出现勃起(阴茎异常勃起)所以保持了生理控制下的阴茎NOS的活性。得自人和大鼠阴茎海绵体平滑肌的细胞和组织的mRNA和蛋白质水平上的iNOS的证实和确定特征表明这种独特的同工酶在阴茎中起着生理作用，并使得可以克隆其cDNA。本文的证据表明阴茎cDOS是一种不同于其它大鼠iNOS(包括血管平滑肌中的)的同工酶或物种。所以，我们的发明包括使用相应的重组iNOS cDNA和从其它物种和阴茎细胞类型获得的在生理控制下有效增加阴茎中NOS合成的那些。本发明提供了一种提高阴茎NOS水平以治疗勃起机能障碍疾病的改进的方法。

此外，本发明的范围可以延伸到对阴茎局部施用下列物质的勃起机能障碍治：(a)nNOS和eNOS构建体；(b)它们各自的cDNAs；(b)它们各自的蛋白质；(c)经基因工程产生的表达nNOS或eNOS的阴茎或组织；或(d)NOS活性的生物调节剂(使所述活性保持在生理控制下和不产生不期望的副作用)。对某些情况下(优选的是与组织特异性调节剂相关的情况下)建议也可以全身给药。

应当清楚本领域普通技术人员在不背离本发明的精神的情况下可以作出在本发明范围内的各种修改。因此，我们希望用现有技术(需要的话参照说明书)所容许的尽可能宽的所附权利要求的范围限定我们的发明。

附录A得自鼠阴茎平滑肌细胞的诱导型-氧化氮合酶的完整的核苷酸序列1 .......... .......... .......... .......... ...GAAACTT51 CTCAGCCACC TTGGTGAGGG GACTGGACTT TTAGAGACGC TTCTGAGGTT101 CCTCAGGCTT GGGTCTTGTT AGCCTAGTCA ACTACAAGCC CCACGGAGAA151 CAGCAGAGTT GGTGCAGAAG CACAAAGTCA CAGACATGGC TTGCCCCTGG201 AAGTTTCTCT TCAGAGTCAA ATCCTACCAA GGTGACCTGA AAGAGGAAAA251 GGACATTAAC AACAACGTGG AGAAAACCCC AGGTGCTATT CCCAGCCCAA301 CAACACAGGA TGACCCTAAG AGTCACAAGC ATCAAAATGG TTTCCCCCAG351 TTCCTCACTG GGACTGCACA GAATGTTCCA GAATCCCTGG ACAAGCTGCA401 TGTGACTCCA TCGACCCGCC CACAGCACGT GAGGATCAAA AACTGGGGCA451 ATGGAGAGAT TTTTCACGAC ACCCTTCACC ACAAGGCCAC CTCGGATATC501 TCTTGCAAGT CCAAATTATG CATGGGGTCC ATCATGAACT CCAAGAGTTT551 GACCAGAGGA CCCAGAGACA AGCCCACCCC AGTGGAGGAG CTTCTGCCTC601 AAGCCATTGA ATTCATTAAC CAGTATTATG GCTCCTTCAA AGAGGCAAAA651 ATAGAGGAAC ATCTGGCCAG GCTGGAAGCC GTAACAAAGG AAATAGAAAC701 AACAGGAACC TACCAGCTCA CTCTGGATGA GCTCATCTTT GCCACCAAGA751 TGGCCTGGAG GAACGCCCCT CGCTGCATCG GCAGGATTCA GTGGTCCAAC801 CTGCAGGTCT TCGATGCCCG GAGCTGTAGC ACTGCATCAG AAATGTTCCA851 GCATATCTGC AGACACATAC TTTACGCCAC TAACAGTGGC AACATCAGGT901 CGGCCATTAC TGTGTTCCCC CAGCGGAGCG ATGGGAAGCA TGACTTCCGG附录A(续)951 ATCTGGAATT CCCAGCTCAT CCGGTACGCT GGCTACCAGA TGACCGATGG1001 CACCATCAGA GGGGATCCTG CCACCTTGGA GTTCACCCAG TTGTGCATCG1051 ACCTGGGCTG GAAGCCCCGC TATGGCCGCT TCGATGTGCT GCCTCTGGTC1101 CTGCAGGCTC ACGGTCAAGA TCCAGAGGTC TTTGAAATCC CTCCTGATCT1151 TGTGCTGGAG GTGACCATGG AGCATCCCAA GTACGAGTGG TTCCAGGAGC1201 TCGGGCTGAA GTGGTATGCG CTGCCTGCCG TGGCCAACAT GCTCCTGGAG1251 GTGGGTGGCC TCGAGTTCCC AGCCTGCCCC TTCAATGGTT GGTACATGGG1301 CACCGAGATT GGAGTCCGAG ACTTCTGTGA CACACAGCGC TACAACATCC1351 TGGAGGAAGT GGGCAGGAGG ATGGGCCTGG AGACCCACAC ACTGGCCTCC1401 CTCTGGAAAG ACCGGGCTGT CACCGAGATC AATGCAGCTG TGCTCCATAG1451 TTTTCAGAAG CAGAATGTGA CCATCATGGA CCACCACACA GCCTCAGAGT1501 CCTTCATGAA GCACATGCAG AATGAGTACC GGGCCCGAGG AGGCTGCCCT1551 GCAGACTGGA TTTGGCTGGT CCCTCCGGTG TCCGGGAGCA TCACCCCTGT1601 GTTCCACCAG GAGATGTTGA ACTACGTCCT ATCTCCATTC TACTACTACC1651 AGATCGAGCC CTGGAAGACC 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EKDINNNVEK TPGAIPSPTT QDDPKSHKHQ51 NGFPQFLTGT AQNVPESLDK LHVTPSTRPQ HVRIKNWGNG EIFHDTLHHK101 ATSDISCKSK LCMGSIMNSK SLTRGPRDKP TPVEELLPQA IEFINQYYGS151 FKEAKIEEHL ARLEAVTKEI ETTGTYQLTL DELIFATKMA WRNAPRCIGR201 IQWSNLQVFD ARSCSTASEM FQHICRHILY ATNSGNIRSA ITVFPQRSDG251 KHDFRIWNSQ LIRYAGYQMS DGTIRGDPAT LEFTQLCIDL GWKPRYGRFD

P301 VLPLVLQAHG QDPEVFEIPP DLVLEVTMEH PKYEWFQELG LKWYALPAVA

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P P751 LVQLTFEGSR GPSYLPGEHL GIFPGNQTAL VQGILERVVD CSSPDQTVCL801 EVLDESGSYW VKDKRLPPCS LRQALTYFLD ITTPPTQLQL HKLARFATEE851 THRQRLEALC QPSEYNDWKF SNNPTFLEVL EEFPSLRVPA AFLLSQLPIL901 KPRYYSISSS QDHTPSEVHL TVAVVTYRTR DGQGPLHHGV CSTWINNLKP951 EDPVPCFVRS VSGFQLPEDP SQPCILIGPG TGIAPFRSFW QQRLHDSQHR1001 GLKGGRMTLV FGCRHPEEDH LYQEEMQEMV RKGVLFQVHT GYSRLPGKPK1051 VYVQDILQKE LADEVFSVLH GEQGHLYVCG DVRIARDVAT TLKKLVAAKL

M1101 NLSEEQVEDY FFQLKSQKRY HEDIFGAVFS YGAKKGNTLE EPKGTRL·附录C人iNOS序列表附录D人iNOS cDNA序列表

Claims

1.一种在患者中治疗勃起机能障碍的方法，该方法包括下列步骤：

a)提供一种能使体内组织中iNOS水平增加的药剂；

b)向阴茎组织引入有效量的所说的iNOS药剂。

2.如权利要求1的治疗勃起机能障碍的方法，其中a)所说的药剂选自实质上由iNOS诱导物、iNOS蛋白质、iNOS cDNA以及iNOS cDNA转化的阴茎细胞或iNOS cDNA转化的组织组成的组。

3.如权利要求2的治疗勃起机能障碍的方法，其中所说的iNOS诱导物是一种阴茎iNOS诱导物，所说的iNOS蛋白质是一种阴茎iNOS蛋白质，所说的iNOS cDNA是一种阴茎iNOS cDNA，并且所说的iNOS cDNA转化的细胞或组织是阴茎细胞或组织。

4.如权利要求1的治疗勃起机能障碍的方法，其中：a)所说的引入步骤包括以间断的、连续的或随时间释放的方式直接把iNOS诱导物引入阴茎组织中。

5.如权利要求2的治疗勃起机能障碍的方法，其中a)所说的诱导物选自实质上由细菌脂多糖、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和它们的混和物组成的组。

6.如权利要求2的治疗勃起机能障碍的方法，其中：a)所说的药剂是体外产生的iNOS蛋白质。

7.如权利要求6的治疗勃起机能障碍的方法，其中所说的iNOS蛋白质是阴茎iNOS蛋白质。

8.如权利要求6的治疗勃起机能障碍的方法，其中所说的iNOS蛋白质经连续输注或反复注射、局部表面涂敷、输尿管内给药、微胶囊给药或相关的方法局部施用。

9.如权利要术3的治疗勃起机能障碍的方法，其中a)所说的药剂是阴茎或其它iNOS cDNA，其经连续输注或反复注射、表面涂敷、输尿管内给药、微胶囊给药或相关的方法局部施用以及经全身途径施用。

10.如权利要求3的治疗勃起机能障碍的方法，其中a)所说的药剂是iNOScDNA转化的阴茎海绵体细胞或组织，其被直接植入到阴茎海绵体或组织中，后者被直接植入到阴茎海绵体或组织中，或者保留在微胶囊、小丸或意在限制细胞释放到全身循环中的其它材料(procedures)中。

11.如权利要求2的治疗勃起机能障碍的方法，其中a)所说的药剂是阴茎的或其它的iNOS或e NOS cDNAs，其经连续输注或反复注射、表面涂敷、输尿管内给药、微胶囊给药或相关方法局部施用。

12.如权利要求2的治疗勃起机能障碍的方法，其中a)所说的药剂是iNOScDNA转化的阴茎海绵体细胞或组织，其被直接植入到阴茎海绵体或组织中，后者被直接植入到阴茎海绵体或组织中，或者保留在微胶囊、小丸或意在限制细胞释放到全身循环中的其它材料中。

13.如权利要求2的治疗勃起机能障碍的方法，其中：a)所说的药剂是内源或外源阴茎NOS的生物调节剂。

14.一种cDNA表达载体，该载体包含质粒pBS RPiNOS。

15.一种DNA片段，该DNA片段实质上包含编码选自下组的蛋白质的结构基因：cNOS、nNOS、eNOS和iNOS。

16.如权利要求15的DNA片段，其中DNA片段是cDNA。

17.如权利要求16的DNA片段，其中DNA片段是重组DNA。

18.如权利要求17的DNA片段，其可操作地连接到启动子上以表达所说的基因。

19.一种重组宿主，其表达如权利要求18的编码氧化氮合酶的基因。

20.一种DNA序列，该序列编码诱导的氧化氮合酶。

21.权利要求20的序列，其中所说的DNA是cDNA。

22.权利要求20的序列，其是天然来源的。

23.权利要求22的序列，其源于大鼠PSMC和人PSMC，所说的源于大鼠PSMC的cDNA从5到3方向具有如附录A所示的DNA序列，所说的源于人PSMC的cDNA从5到3方向具有如附录D所示的的DNA序列。

24.一种cDNA表达载体，该载体包含：

a)一种在宿主有机体中起作用的启动子片段；

b)一种cDNA区段，所说的cDNA编码氧化氮合酶。

c)所说的cDNA区段由启动子片段定向，以便其在宿主中表达，产生非天然诱导的氧化氮合酶。

25.如权利要求24的表达载体，其中所说的宿主有机体是胎细胞、大肠杆菌(e.coliform)、酵母或PSMC。

26.由权利要求24的表达载体转化的转染宿主有机体。

27.一种转染的宿主有机体，其包含：a)其中已具有编码氧化氮合酶的DNA表达载体的细胞；

b)所说的细胞是微生物或哺乳动物细胞。

28.一种改良的组织，所说的组织的正常功能依赖于氧化氮的产生，所说的改良包括把转染细胞引入宿主组织中，所说的细胞已具有编码氧化氮合酶的DNA表达载体。

9.源于PSMCcDNA的氧化氮合酶，所说的氧化氮合酶选自大鼠iNOS和人iNOS，所说的大鼠iNOS具有附录B所示的氨基酸序列，所说的人iNOS具有附录C所示的氨基酸序列。

30.一种真核生物表达载体：

a)pcDNAs RPiNOS，其实质上包含pcDNAs，pcDNAs含有阴茎编码区，一种质粒和一种启动子部分。