CN1703257A

CN1703257A - 心脏刺激系统和方法

Info

Publication number: CN1703257A
Application number: CN 200380101166
Authority: CN
Inventors: 兰德尔·J·李
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2002-11-16
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2005-11-30

Abstract

一种心脏刺激装置，包括相偶联的能量源(46)和能量发射器(50)，所述的能量发射器(50)从递送元件(30)延伸到心脏中的组织区。例如，通过使用可延伸的预成型的针，使一系列发射器(50)从递送装置延伸并进入沿组织区的特定位置。用能量发射器(50)将一定体积的传导试剂(18)递送到该区域中，增强对该区域的刺激。所述试剂可以是活细胞的可注射制剂，所述的活细胞表达生成连接蛋白，如连接蛋白43，且可以进行遗传修饰以超表达生成。所述的试剂可以包括无生命的材料，如金属的传导聚合物或其组合。能量发射器(50)和传导试剂(18)的组合增强对该区域的刺激。将刺激装置和传导试剂递送到室间隔膜，改善双心室隔膜起搏。

Description

心脏刺激系统和方法

相关申请的交叉参考

本申请是2003年2月24日提交的、要求对2002年11月16日提交的美国临时申请系列号60/426,840的优先权的美国申请系列号10/374,899的连案，其整体内容通过引用并入本文。

发明背景

1.发明领域

本发明是刺激患者心脏的系统和方法。更具体地说，其是使用与可植入的发射器相偶联的刺激器和方法，所述的可植入发射器又与注射到待刺激心脏区域的传导试剂相偶联。

2.背景技术

对于将能量与心脏组织相偶联以影响心脏功能已经公开了多种医疗器件系统和方法。已经公开了许多这样的系统和方法用于治疗各种类型心律失常的特定目的，例如，所述的心律失常包括纤维性颤动、心动过速、心搏徐缓或其他失常。

在之前公开的用于将能量偶联到心脏组织的许多类型不同装置和方法中，已经使用了各种不同类型的能量偶联。

近几年来在治疗心律失常方面有显著影响的一种类型能量偶联使用心脏中或周围的能量发射器将能量递送到目标心脏组织区。之前公开的这种类型能量递送系统和方法包括使用下列发射器的装置：电能量发射器，如递送直流电或交流电如射频(RF)电流的电极；诸如递送声能(如超声)的晶体或变换器的发射器；诸如递送光(如激光)的光学纤维、透镜或其他光学元件(如激光器二极管)的发射器；或使用微波偶联(如诱导)的能量发射器。

已经研究用于治疗特定心律失常的另一类型能量偶联包括将组织稳定降低到一定水平的低体温或低温装置。一般来说，这些装置包括冷却到低温(相对于周围体温)，从而从周围组织吸取热量、降低周围组织温度的区域。通过实现这一点，热量以足够的水平传递，暂时或永久地发生受影响组织结构或功能方面的目标性变化。某种程度上，这种低体温偶联涉及从周围组织吸取热量从而将其冷却，这种装置称作能量偶联装置。

用于心脏治疗的各种不同能量偶联装置的设计和特征也不同，以使这种装置适于获得不同的所需结果。

例如，本文中某些装置和方法一般指“消融装置”，具体适于将足够的能量与心脏组织偶联，以将组织消融。例如，可以进行这种消融以中断失常的病灶起源，或形成传导阻滞以中断导致失常的心脏组织网络中的有害传导通路。

还已经公开了其他消融装置，以形成穿过组织或患者体内其他材料的通道(passageway)，如重通阻塞的腔或血管。

之前公开的使用能量偶联的心脏治疗装置的其他例子已经具体适应于刺激心脏组织，而不是消融心脏组织。各种类型的这种心脏刺激系统包括：适应于将能量与心脏组织以一定方式偶联以引发失常、从而诊断通过心脏的心脏传导的装置；适应于提供心脏周期的人工起搏以治疗失常的起搏器装置和方法；和除纤颤器装置和方法，其中心脏受冲击而失常(shocked out of an arrhythmia)，并回到窦性心律。

因为心脏传导循环与通过心脏组织的电传导直接并密切相关，之前公开的用于引发、起搏或除纤颤的心脏刺激器通常是电偶联装置，其将电能量从电极引线或导管递送或置于待刺激的组织。起搏器和除纤颤器装置已经改变了各种(某种程度上相互排除)设计，以适于一种或其他暂时或永久性用途，各取决于对急性或慢性心律护理的特定需要。

通常，永久性的起搏器系统包括起搏器装置，其中起搏器与通常称作“起搏器引线”的电引线相连。可植入的或永久性的起搏器典型包括电源，如电流能量源(如电池)。该电源与电引线的一端电偶联。电引线的另一端与待刺激的心脏组织连接，通常使用锚定物如针、螺丝、花键(spline)、抓紧器(grasper)等来连接，锚定物可以是电极电流发射器本身。

近年来，更多的兴趣、研究和开发已集中在修饰心脏组织结构的细胞修复，以增加这种修饰结构中的心脏传导或功能。

某些尝试集中在将传导性收缩肌细胞递送到收缩变弱的心脏区域，如坏死区。这些尝试的目的是增加这些区域中的心脏功能。例如，递送的这种细胞可以从患者自身的细胞培养物制备，例如其可以是心脏细胞，也可以是骨骼肌细胞、成纤维细胞或干细胞。还可以以一定的方式修饰递送的细胞，以增强其收缩功能或传导性，包括增强其对某些因子的表达，例如增强连接蛋白43的表达，连接蛋白43已知增强心脏信号传导。

连接蛋白发现在间隙连接的连接子中。间隙连接调节细胞间的分子通路，所述分子包括无机离子和第二信使，从而实现通过间隙连接的细胞电偶联。例如，连接蛋白43是心室心肌中负责间隙连接细胞间通讯的主要间隙连接蛋白。连接蛋白43，缩写为“Cx43”，是具有与间隙连接和电机械偶联相关的结构、调控或生化功能。连接蛋白是一个完整的蛋白家族。对于心脏的各部分存在有特异性的连接蛋白。本发明方面中有用的、将试剂递送到与心脏活化相关的心脏组织区的Cx43例子是人多肽序列，如人Cx43(Genbank注册No.XP_027460、XP_027459、XP_004121、P17302、AAD37802、A35853、NP_000156和AAA52131)、小鼠Cx43(Genbank注册No.P23242、P18246、A39802、A36623、NP_034418、CAA44640)和大鼠Cx43的示例性序列，Genbank注册No.为P08050、S00532、NP_036699、AAA75194和1404339A。心血管系统中的连接蛋白家族包括Cx37、Cx40、Cx43、Cx45。

这里所提到的各种术语：心脏传导、信号传导或通过心脏组织的“传导”通常指这种传播涉及通过细胞组织包括间隙连接的所得收缩波。

还已经公开了将试剂局部递送到目标心脏组织结构中的细胞中的其他例子，修饰体内细胞功能，如通过改变细胞内的遗传物质来增强传导/收缩，例如通过增强细胞对导致所需效应的某些化合物或试剂的表达(如DNA物质，以导致Cx43或其他这类化合物的表达或超表达)。

还建立了将心脏刺激系统和传导实际的递送组合的系统或治疗方法，所述的心脏刺激系统如起搏器或除纤颤器，所述的传导试剂如细胞治疗、基因治疗、其他组织工程模式或其他传导试剂，如传导聚合物、金属或其组合(如可注射溶液或悬液，如金，导电性粉尘)，组合方式应能基本增强对心脏组织结构的人工刺激，如起搏或除纤颤。

近年来，双心室隔膜起搏是近年来新产品开发和研究方面日益受到注意和关注的领域，尤其是它是束状阻滞(如希氏束)和充血性心衰中复杂且危险条件的治疗指标。心室的正常电活化通常进行如下。电脉冲开始于窦房结，导致房活性通过AV结，然后是心室活化。心室活化期包括下列事件(通常以所述顺序)：

A)左隔膜活化，因为希氏束的分支进入隔膜中，在隔膜左侧的位置比右侧高；

B)RV早期去极化(由于RV的厚度，迅速发生RV的去极化)后尖端(apical)去极化；

C)左心室的侧壁去极化；

D)基底的晚期LV去极化。

各种不同的疾病状态或异常情况可以影响心脏周期的这种心室活化期。特别令人关注的一个例子称作左束支阻滞(“LBBB”)。LBBB改变整个心室去极化通路。去极化开始于隔膜的右侧，向LV的左前侧进行。然后发生尖端去极化。

已经公开了通常目的在于通过用起搏引线，典型地通过左侧(如左心室)起搏引线使LV收缩性再次同步的双心室起搏装置和方法。

提供与本发明相关的其他背景的另外一些系统、装置和方法的例子以不同的方式公开于Lindemans等的美国专利申请公开：US 2002/0035388，和Ben-Haim的US2002/0087089。其他这种例子以不同的方式公开于下列美国专利：Money的4,399,818；King的5,103,821；Bush等的5,683,447；Salo等的5,728,140；Lee等的6,059,726；Panescu等的6,101,410；Maarse的6,128,535；Soykan等的6,151,525；Markowitz等的6,238,429；还有其他的例子公开于下列PCT专利申请公开：King的WO 90/10471；Stokes等的WO 98/02150；Panescu等的WO 98/28039；Sen的WO 00/59375；Field的WO 01/68814；Lee的WO 02/22206；和Ideker的WO 02/051495。列在本段中的所有这些参考文献的内容的整体都通过引用并入本文。

仍然需要改进的心脏刺激系统和方法。

仍然需要改善心脏刺激过程中心脏组织结构内的传导。

仍具体需要双心室隔膜刺激系统和方法，如用于起搏，提供人工心脏刺激和传导试剂的组合，以提高刺激效果。

仍具体需要能捕获隔膜组织实质区的隔膜刺激系统和方法，以在多种左束支阻滞的发生中提供双心室起搏。

发明内容

本发明的一个目的是影响心脏组织对来自心脏刺激器的刺激的应答，所述的心脏刺激器如起搏器或除纤颤器。

本发明的另一个目的是影响患者心脏内心脏组织区中的收缩性或传导。

本发明的另一个目的是影响患者心脏中的心室隔膜功能。

本发明的另一个目的是提供心脏刺激引线和/或影响心脏收缩或传导的试剂向心室隔膜的改进递送。

本发明的另一个目的是提供对患者心脏的心脏刺激。

本发明的另一个目的是提供对患者心室隔膜的心脏刺激。

本发明的另一个目的是对患者的心脏进行起搏。

本发明的另一个目的是对患者心脏进行除纤颤。

本发明的另一个目的是实现对患者心脏的双心室起搏或除纤颤。

本发明的另一个目的是提供能量递送，和对心脏刺激过程中递送的能量的改进组织应答。

本发明的另一个目的是将细胞递送到患者心脏的心脏组织区。

因此本发明的一个方面是具有心脏刺激器装置和试剂递送装置的心脏刺激系统。心脏刺激器装置包括心脏刺激器和能量发射器。心脏刺激器包括包括能量源，其适应地位于患者体内，以将能量发射到待刺激的心脏组织区。能量递送装置适于向心脏组织区递送影响区域中对发射能量所刺激的应答的试剂。

该方面的一种方式中，试剂递送装置包括递送导管。在一个实施方案中，递送导管是心脏递送导管。在另一个实施方案中，递送导管是血管递送导管，其适于将试剂通过在隔膜中延伸的血管递送到所述区域中。

在另一种方式中，试剂递送装置包括针。在该方式的一个实施例中，针是手术针。在另一个实施方案中，试剂递送装置还包括递送导管，并且针沿递送导管的远端部分定位。在该实施方案的一个变换方式中，递送导管是心脏递送导管。在另一种变换方式中，递送导管适于定位在隔膜中延伸的血管中，从而使针适于穿透血管壁进入隔膜的心脏组织。

本发明的另一个方面是具有心脏刺激器装置和试剂组合的心脏刺激系统。心脏刺激器装置包括心脏刺激器和能量发射器。心脏刺激器包括能量源，其适于将能量源的能量偶联到能量发射器上，以激活能量发射器。能量发射器适于定位在患者体内，以对心脏刺激器的激活应答，将能量发射到心脏组织区中。试剂适于定位于心脏组织区，以影响该区域中对发射能量的刺激应答。

根据一种方式，心脏刺激器是起搏器装置。根据另一种方式，心脏刺激器是除纤颤器装置。

本发明的另一个方面是具有心脏起搏器的系统，其与细胞治疗系统协同作用，以提供心脏刺激。

根据一种方式，细胞治疗系统包括一定体积的连接蛋白43和细胞递送导管，所述的细胞递送导管适于将连接蛋白43递送到要为心脏起搏器所刺激的心脏组织区中。

本发明的另一个方面是具有心脏刺激器和一定体积传导试剂的心脏刺激系统，所述的心脏刺激器适于将能量递送到患者心脏组织区中以刺激该区域，所述的传导试剂适于递送到所述的区域中，以用心脏刺激器递送的能量增强对该区域的刺激。

根据本发明的一种方式，心脏刺激器还包括具有近端部分和远端部分的递送元件，其适于定位在患者心脏的一定位置上；还包括一系列可延伸的电极装置，其与递送元件协同作用，每一个包括刺激电极，所述的刺激电极可调整，以从一定位置上的递送元件延伸，并进入到相对于组织区中其他可延伸电极元件的特定位置上。

在该方式的一个实施方案中，一系列可延伸电极装置中的每一个包括可延伸的针，其可调整，以从递送装置的远端部分延伸并进入心脏组织，从而将各刺激电极定位在特定的位置上。

根据该实施方案的一种变换方式，每个可延伸电极装置的刺激电极集成有针。在另一种变换方式中，每个可延伸电极装置的刺激电极可调整，以从各个针延伸到特定的各位置。

根据其他变换方式，针具有弯曲的形状，或由超弹性或形状记忆金属合金如镍-钛合金制成。

在另一个实施方案中，一系列可延伸电极装置中的每一个具有带内腔的较柔韧的管体，每一个刺激电极沿各延伸电极装置的管体定位。根据该实施方案，每个较柔韧的管体适于偏转并前行通过组织区，以将各刺激电极放置在各特定的位置上。

在该实施方案的另一种变换方式中，可移动的探针适于可移动地接合在至少一个管体内腔中，以调整管体从递送元件延伸，并前移通过组织区，从而使各刺激电极定位在各特定位置上。在另一个特征中，可移动的探针可以提供有近端部分和定形的远端部分，通过在管体近端和外部扭转远端部分，该远端部分可以在内腔中扭转，从而偏转并在前行管体，以放置电极。

根据另一个实施方案，提供锚定物，该锚定物可以从递送元件延伸，适于将远端部分锚定在一定的位置上，从而使一系列可延伸电极装置适于沿组织区的各特定位置定位。在该实施方案的一个有利的变换方式中，锚定物还作为刺激电极提供。

根据另一个实施方案，另一个刺激电极位于递送元件的末梢尖端。

在另一个方式中，心脏刺激器是心脏起搏器。在另一个实施方案中，心脏起搏器是双心室起搏器。

根据本方面的另一方式，传导试剂包括活细胞，在另一个实施方案中，细胞包括至少一种成肌细胞、成纤维细胞或干细胞。从另一点上说，活细胞是适于在与组织区心脏细胞的间隙连接处表达连接蛋白的类型，在更具体的有利变换方式中，是适于在间隙连接处表达连接蛋白43的类型，更进一步说，是有利地经过遗传修饰以超表达生成连接蛋白43的类型。

在另一种方式中，传导试剂包括传导性无生命材料的可注射制剂，其适于增强区域中的电传导，如导电金属。

根据另一种方式，隔膜穿孔器包括在系统中，其适于将心脏刺激器和组织区通过至少一个隔膜穿孔脉管连接，还将一定体积的传导试剂通过至少一个隔膜穿孔脉管递送到所述区域中。

在另一种方式中，提供了跨心脏递送元件，以通过心脏房室，如通过右心房递送刺激器和传导试剂。

本发明的另一个方面是具有心脏刺激器的心脏刺激系统，所述的心脏刺激器配置有能量源和能量发射器，所述的能量发射器适于和能量源偶联，定位于待刺激患者的心脏区域内，其还包括增强能量源的能量对区域刺激的装置。

本发明的另一个方面是具有传导试剂递送系统的心脏刺激系统，所述的传导试剂递送系统包括传导试剂源和递送装置，所述的递送装置适于将一定体积的传导试剂从源递送到患者的心脏区域内，还具有将能量递送到至少一部分区域的装置。传导试剂的体积适于增强来自能量递送装置的能量对区域的刺激。

本发明的另一个方面是具有细长体的心脏刺激器，其具有近端部分、适于至少部分定位在患者心脏中一定位置上的远端部分和至少部分沿远端部分延伸的递送腔。该装置还包括将能量递送到患者心脏内组织区中的装置，和增强来自能量递送装置的能量对组织区的刺激的装置。另外，递送能量的装置和增强刺激的装置适于和细长体协同作用。

本发明的另一个方面是具有细长体的心脏刺激器，其具有近端部分、适于至少部分定位在患者心脏中一定位置上的远端部分和至少部分沿远端部分延伸的腔，还具有能量递送装置和一定体积的传导试剂。能量递送装置具有能量发射器，其偶联于细长体，可调节以从远端部分延伸，在远端部分位于一定位置时进入组织区域，还具有能量引线，其适于和能量发射器偶联，当能量发射器位于第二位置时，还沿近端部分和能量源偶联。传导试剂的体积与腔偶联，适于在远端部分定位、能量发射器位于第二位置时通过腔递送到组织区只能感。

本发明的另一个方面是具有心脏刺激器和一定体积细胞的心脏刺激系统，所述的细胞适于超表达连接蛋白43。心脏刺激器具有细长体，其具有近端部分、远端部分和沿远端部分的心脏刺激电极。心脏刺激器和一定体积的细胞适于协同作用，以刺激患者心脏中的组织区。

本发明的另一个方面是具有细长体、能量递送装置和一定体积传导试剂的心脏刺激器。所述的细长体具有近端部分、适于至少部分定位在患者心脏中一定位置上的远端部分和至少部分沿远端部分延伸的腔。能量递送装置具有与细长体偶联的能量发射器，其可调节以从远端部分延伸，并在远端部分位于一定位置时进入组织区。该装置还具有能量引线，其适于和能量发射器偶联，当能量发射器延伸进入组织区时其还适于沿近端部分和能量源偶联。传导试剂的体积与腔偶联，当远端部分定位、能量发射器延伸进入组织区时，适于至少部分通过腔递送到组织区。

本发明的另一个方面是具有细长体、能量递送装置和锚定物的心脏刺激器。细长体具有近端部分和适于至少部分定位在患者心脏中一定位置上的远端部分。能量递送装置具有多个能量发射器。每个能量发射器与细长体偶联，并可调节，以从近端部分延伸，并在远端部分位于一定位置时进入相对于心脏组织区中其他能量发射器特定的各位置。在各能量发射器位于组织区中的第二个位置时，每个能量发射器还与能量源偶联。锚定物适于将远端部分锚定在心脏中的一定位置上。

本发明的另一个方面是具有细长体、能量递送装置和心脏刺激能量源的心脏刺激器。细长体具有近端部分和适于至少部分定位在患者心脏中一定位置上的远端部分，和至少部分沿远端部分延伸的递送腔。能量递送装置具有多个能量发射器。每个能量发射器与细长体偶联，并可调节，以从近端部分延伸，并在远端部分位于一定位置时进入相对于心脏组织区中其他能量发射器特定的各位置。在各能量发射器延伸进入组织区时，每个能量发射器还通过近端部分与能量源偶联。心脏刺激能量源适于偶联于每个能量发射器，为能量源提供能量，从而将能量发射到组织区。因此，组织区中每个各自特定的位点上的能量发射器适于刺激组织区。

本发明的另一个方面是具有细长体、针和能量发射器的心脏刺激器。细长体具有近端部分、远端部分和至少部分沿远端部分通道。针的柄具有末梢尖端和内腔。能量发射器适于和能量源偶联。还是这一方面，细长体的远端部分适于至少部分定位在患者心脏中的一定位置上，针适于和通道偶联，可以在至少部分位于通道中的第一位置和至少部分从通道延伸的第二位置之间调节，在远端部分定位时进入心脏组织区。另外，能量发射器与针的内腔偶联，并可调节，以从针延伸并进入组织区。

本发明的另一个方面是包括一系列刺激电极的双心室心脏刺激系统。一系列中的每个电极适于定位在相对于患者心室内隔膜中其他刺激电极的特定位置上，从而使一系列定位的电极适于形成限定隔膜内组织区的图案。另外，如此限定的区域和图案包括足够的区域以刺激至少四分之一的隔膜，在进一步的实施方案中，足以提供对至少三分之一或甚至多达一般或更多隔膜的人工刺激。

本发明的另一个方面是具有双心室心脏刺激能量源和隔膜刺激器的心脏刺激系统，所述的隔膜刺激器具有细长体，其带有近端部分和具有一系列可延伸的心脏刺激电极的远端部分。远端部分适于定位在患者心脏中与心室隔膜相关的一定位置上。每个可延伸心脏刺激电极可调整，以从远端部分延伸，以定位在相对于隔膜组织区中其他可延伸心脏刺激电极的各特定位置上。每个可延伸刺激电极还适于和双心室心脏刺激能量源偶联。因此，通过将细长体的远端部分定位在一定位置上，将每个可延伸心脏刺激电极定位了组织区中的各特定位置上，将每个可延伸心脏刺激电极与双心室心脏刺激能量源偶联，一系列的电极适于用能量源为一系列中的每个电极提供能量、从组织中的各特定位置发射电流以大大刺激组织区。

本发明还包括提供下述治疗方法的其他方面。

本发明的另一个方面是一种方法，包括：将一定体积的细胞递送到心脏组织区；用心脏刺激器装置刺激心脏组织区。

本发明中又一方式包括：从含一定体积细胞的心脏组织区对患者心脏进行起搏。

本发明的另一方式包括：将细胞提供在表达连接蛋白43的环境中。

本方式的又一实施方案包括：提供细胞在一定的环境中，使连接蛋白43超表达，比区域中固有的心脏细胞更多。

本发明的另一个方面是一种方法，包括：将一定体积的细胞递送到患者的心室隔膜中，使其足以增强隔膜对来自起搏器或除纤颤器的刺激的应答。

另一个发明是一种方法，包括：使用患者心室隔膜的脉管系统将一定体积的试剂递送到隔膜中，增强隔膜组织对来自心脏刺激器的刺激的应答。

本发明的另一个方面是一种方法，包括：使用患者心室隔膜的脉管系统将一定体积的试剂递送到隔膜中，增强沿隔膜的心脏收缩或传导。

本发明的另一个方面是一种方法，包括：使用患者心脏隔膜的脉管系统将心脏刺激器引线递送到隔膜中，以用来通过隔膜对心脏进行起搏或除纤颤。

本发明的另一个方面是一种方法，包括：从能量发射器发射刺激能量到心室隔膜的实质部分。

本发明的另一个方面是一种方法，包括：将一系列能量发射器植入到患者心室隔膜的特定位置上，从而使这种能量发射器所结合的区域包括隔膜的实质部分。

该方法的一种方式进一步包括：同时从每个植入的能量发射器发射能量。

该方法的另一种方式进一步包括：将锚定物植入到隔膜中；并从锚定物延伸到至少一个能量发射器。

该方法的另一种方式进一步包括：将锚定物植入到隔膜中；并从锚定物延伸到每个能量发射器。

该方法的另一种方式进一步包括：将植入的能量发射器与起搏器偶联。

该方法的另一种方式进一步包括：将植入的能量发射器与除纤颤器偶联。

该方法的另一种方式进一步包括：从每个能量发射器发射电流。

该方法的另一种方式进一步包括：将每个能量发射器通过针递送到特定的位置上。

该方法的另一种方式进一步包括：前移一系列针到隔膜中；将每个能量发射器通过特定的一枚针递送到各特定位置上。

该方法的另一种方式进一步包括：将一系列能量发射器中的多个定位于递送元件上；前移递送元件到隔膜中，使位于递送元件上的每个能量发射器定位于其各自特定的位置上。

本发明的另一个方面是刺激患者心脏区的方法，该方法包括提供心脏刺激器、提供传导试剂递送系统、用心脏刺激系统将能量递送到待刺激的心脏区域，和将一定体积的传导试剂从传导试剂递送系统递送到心脏区域。进一步根据该方法方面，一定体积的传导试剂增强递送到该位置的能量对心脏区域的刺激。

本发明的另一个方面是对患者心脏提供双心室刺激的方法，该方法包括：提供一系列的心脏刺激电极、将递送元件的远端部分定位在心脏心室内隔膜的一部分上，和将一系列心脏刺激电极从递送元件的远端部分延伸，并进入心室内隔膜中，从而使每个心脏刺激电极定位在相对于心室内隔膜组织中其他心脏刺激电极的特定位置上。

本发明的另一个方面是制备用于对患者心脏提供双心室刺激的双心室心脏刺激系统的方法。该方法进行如下：提供具有细长体的双心室刺激器，所述的细长体具有近端部分、适于定位在心室内位置上的远端部分、刺激电极和至少沿远端部分延伸的通道，所述的刺激电极沿远端部分定位，从而在远端部分定位时与心脏隔膜组织区电偶联。该方法还包括：将一定体积的细胞加载到双心室刺激器的通道中，其中细胞适于超表达连接蛋白-43或其类似物、衍生物或生物学等价物。

本发明的另一个方面也是制备用于对患者心脏提供心脏刺激的心脏刺激系统的方法。该方法包括提供具有细长体的心脏刺激器，所述的细长体具有近端部分、适于定位在心脏内位置上的远端部分、一系列可延伸的心脏刺激电极和至少沿远端部分延伸的通道，所述的心脏刺激电极适于从一定位置上的远端部分延伸，从而定位在相对于心脏组织区中其他可延伸心脏刺激电极的特定位置上。该方法还包括：将一定体积的细胞加载到通道中，其中细胞适于增强一系列可延伸电极对组织区的电刺激。

本发明的另一个方面是刺激患者心脏中隔膜区域的方法，包括：将至少一个心脏刺激电极递送到心脏心室内隔膜中的至少一个隔膜穿孔脉管中、将一定体积的传导试剂递送到与隔膜穿孔脉管相关的隔膜组织区，并在将一定体积的传导试剂递送到该区域之后，用至少一个心脏刺激电极刺激组织区。

本发明的另一个方面是对患者心脏提供双心室刺激的方法，该方法包括刺激包括至少四分之一心室内隔膜的组织区，另一个方式中，刺激至少三分之一、或甚至二分之一、最高至所有隔膜的组织区。

本发明的另一个方面是刺激患者心脏区域的方法，该方法包括将一定体积的细胞递送到适于超表达连接蛋白-43或其类似物、衍生物或生物学等价物的区域中，并向该区域提供电刺激。

所描述的各个方面、方式、实施方案、变换方式和特征是独立有利的，不需要与其他组合，虽然本发明也认为普通技术人员根据该公开内容的总体可以从各种组合受益。

下面的说明书部分中会显示出本发明的其他目的和优点，其中详述是为了全面公开本发明的优选实施方案，而非对其进行限制。

附图说明

将参照附图更全面地描述本发明，所述附图只是说明性的。

图1说明根据本发明的系统和方法治疗之前，具有箭头表示的多个左束阻滞区的心脏剖面。

图2说明与图1所示类似的、具有的多个左束阻滞区的心脏剖面，说明本发明中具有位于右心室隔膜上的递送导管的一种方式。

图3说明与图1和2所示类似的心脏剖面，说明使用本发明的后续方式，其中影响心脏传导的试剂递送到与多个左束阻滞相关的心脏组织区中。

图4说明与图1-3中所示类似的心脏剖面，只是说明将一系列能量发射器植入到与多个左束阻滞相关的心脏组织区的另一种方式。

图5说明具有与图1所示类似的左束阻滞的剖面，只是说明具有箭头所示左束阻滞之局部单一区域的心脏。

图6说明具有与图5所示类似的左束阻滞的心脏剖面，只是说明本发明中具有定位于右心室隔膜中的递送导管的一种方式。

图7说明与图5和6中所示类似的心脏剖面，说明使用本发明的后续方式，其中影响心脏传导的试剂递送到与左束阻滞相关的心脏组织区。

图8A说明根据本发明的可延伸电极系列装置的远端部分的侧视图，包括一些内部结构。

图8B说明沿图8A中线B-B所截的横截面。

图8C说明用于递送如根据图8A-B中所示的系列装置的特定实施方案的、示意性的部分剖视图。

图9说明根据本发明的另一种可延伸电极装置的部分断面视图。

图10说明具有本发明另一种可延伸电极装置的心脏剖视图，使用配置在心室隔膜中、与用于双心室隔膜起搏的起搏器(示意性示出)偶联的螺丝锚定物和多个电极引线。

图11A-B说明各自沿图10中线A和B所截的横截面视图。

图12A说明具有另一种可延伸电极装置的心脏的剖面视图，使用配置在心室隔膜中、与用于双心室隔膜起搏的起搏器(示意性示出)偶联的螺丝锚定物和带有多个电极的单一引线。

图12B说明适于根据图12A中所示实施方案使用的可延伸电极装置的部分剖面视图。

图13A说明具有另一种电极装置的心脏的剖面视图，使用配置在心室隔膜中第一位置上的单一心脏内引线。

图13B说明与图13A类似的试图，但是在心室中的第一位置和第二位置上植入有多个电极引线。

图13C说明使电引线沿心室内隔膜区域缝合的另一种方式。

图14A说明起搏电极系统的透视图，使用冠状窦递送系统将起搏电极通过隔膜穿孔血管的管壁递送到心室的心肌隔膜中。

图14B说明试剂递送系统的透视图，使用冠状窦途径将增强心脏传导的试剂通过隔膜穿孔血管的管壁递送到心室隔膜壁的心肌组织中。

图15说明根据本发明的一个实施方案的组合心脏刺激系统的示意性视图。

发明详述

更具体地参照附图，以说明本发明体现在图1-15通常所示的实施方案中。可以理解的是：在不背离本文所公开的基本概念的条件下，装置可以改变配置和零件细节，方法可以改变特定的步骤和顺序。

在通过束分支(尤其是左束分支阻滞或“LBBB”)的传导受阻的患者中，用与可注射导体偶联的多个引线捕获多个隔膜，将使多个隔膜激活，从而使LV去极化，提高同步化。

本发明考虑了多种方法来达到本发明的目的，具体地，它们涉及将试剂递送到心脏组织区，以影响传导，增强对那里电刺激的应答。

一方面，适于增强心脏信号传导的试剂(即生物导体、传导金属、传导聚合物等)递送到心肌隔膜中，例如通过由图3和图7中跨心脏递送导管所示出的经皮、跨心脏方法。多种传统或其他递送系统可以适于这种递送，例如下列递送导管和系统：Johnson & Johnson开发的“Noga”系统、BioHeart，Inc开发的“Myocath”装置和系统；Boston Scientific Corporation开发的“Stilleto”导管和系统和“BioCardia”商业化开发的至少一种其他导管装置和系统。

另一方面，起搏器引线系统可以包括递送特征，如腔，通过该腔来递送这种试剂。从这一点上说，这种起搏器引线需要更高的性能以容纳试剂递送腔，有利之处包括下列实在益处：知道导体试剂递送到能量发射源的近端，以去极化。

除了本文所示或所描述的特定实施方案，本文认为其他的试剂递送装置或方法也适于达到本发明的目的，在至少部分该公开内容的基础上，对于普通技术人员来说是显而易见的。

不管本文其他处所示和所描述的其他实施方案，改变和改动对普通技术人员来说是显而易见的，下列实施方案在具体方面上认为是高度有利的，虽然不局限于双心室起搏器：将影响心脏传导的物质或试剂递送通过递送系统；将印象心脏传导的物质或试剂递送通过起搏器引线；和提供具有多个引线、适于跨心室隔膜实质区的可延伸电极结构，以更有效地在那里起搏。

在本发明的可延伸电极方面，根据本发明的一个有利实施方案，通常使用微丝来延伸和增加电刺激心肌的电极表面积/体积。可延伸电极的使用能够使大量心肌受到刺激，从而使心脏的电-机械收缩同步。新的电极排列和相关的心脏刺激系统认为对具有如图所示束分支阻滞的患者是特别有用的，对充血性心衰的患者也是特别有用的。

因此，可以看出本发明可以用来特别有利地刺激心室隔膜，如参照附图中特定具体的说明性实施方案得以说明。

参照附图，心脏1在各剖面视图中示出，其包括右心室2、两尖瓣3、左心室4、心室内隔膜6和尖端9，所述的心室内隔膜6包括右束8和左束10。

如图1-4所示，心脏具有多个左束阻滞区的患者可以通过使用本发明特别好地治疗。

如图1箭头所示，示出了多个阻滞区12、14、16，对从传统单一电极方法的起搏提出了特别的挑战。在多左束阻滞发生中使用本发明该实施方案的具体方式示于图2-4。

如图2所示，示出的试剂递送导管具有近端部分32和包括末梢尖端38的远端部分36。通过经皮、跨腔方法在体外操作近端部分32通过静脉系统，然后通过两尖瓣3跨右心房进入心室，将远端部分36递送到右心室2。递送导管30上远端部分36的末梢尖端38则定位在靠隔膜6的右心室中。试剂源40与递送导管的近端部分偶联，如图3中示意性所示。然后将来自源的一定体积的传导试剂通过递送导管30中的递送腔(未示出)、通过位于递送导管30的末尖端38的远端部分递送到与多个左束阻滞相关的心脏组织区，如图3所示。只使用压力就可实现这一点，虽然在某些有利的实施方案(如下文所述)中使用与递送导管集成的或可滑动置于其中的针头，将试剂注射到组织中。其中使用这种单独运作的针，针的内膛可以与试剂源近侧(proximally)偶联，如下文将进行的。

对于本发明的隔膜电极，也可以使用经皮、跨腔的递送导管30将这种心脏刺激器递送到待刺激的隔膜区域，示于图4中。如图4所示，多个电极元件50通过递送导管30递送，所述的电极元件50可以是与电极相连的花键、细丝或其他类型的引线，其还与电能量源46近侧偶联，以进行从元件50向隔膜组织的电流发射。通过提供这些引线50和电极的排列，所述电极的定位跨越足够宽的隔膜区域，其协同性的电流发射能够提高跨大面积的组织区的刺激，适于从这种多个阻滞区，如从图4中说明性实施方案中所示的阻滞12、14、16提供合适的心脏传导。

电极引线50可以包括细丝、花键或其他类型的合适结构，以提供对递送的必要机械支撑，还将信号传导到电极。根据各种技术和工具，引线50可以前移通过心脏区，对普通技术人员而言是显而易见的。在一个例子中，引线的末梢尖端是尖锐的，使引线象针一样前移，机械地穿过组织。在另一个例子中，分离的可延伸递送装置如可展开的针从锚定点延伸到一定位置上，以递送引线，引线通过针递送到该位置上，在其他替代或组合的例子(未示出)中，消融性能量源可以偶联在引线和组织之间，以使引线或花键消融其通过心脏组织的通路，以进行展开。

通过将电极引线元件50和刺激能量源46偶联提供了这种刺激，如图4所示。例如，这可以是起搏器或除纤颤器，其可以是特定类型或样式，以满足对选定心脏部位进行刺激的特殊要求，用于根据本发明治疗。在用于刺激隔膜的该实施方案的特定有利环境下，能量源46可以是双心室起搏器装置，其具有引入到其中的适当软件和硬件，以在那里提供合适的刺激剂。本发明考虑使用的这种能量源的更具体的例子包括但不局限于：产品名为“kapp 900”(型号#KDR901)的双室调搏器、产品名为“Marquez DR”(型号#7274)的心脏内除纤颤器(ICD)和产品名为“Insync ICD”(型号#7272)的双心室ICD，所有都商业上来源于Medtronic Device Corporation；和产品名为“Insignia”(型号#1298)的Guidant DDD、产品名为“Prism II”(型号#1861)的ICD；和Guidant BiV(Renewal，型号#H135)，所有都商业上来源于GuidantCorporation。

如本文其他处所述，一系列电极元件50的递送可以在试剂18的递送之后、之前或同时，以增强刺激的隔膜区的传导。例如，图3和图4的实施方案可以合并。在这种高度有利的设置中，来自一系列电极元件50的大面积刺激还该区域中由试剂18所致的传导增强合并，以给出最佳的结果。

在另一方面中，本文其他处所述的实施方案对于隔膜或其他地方的其他失常情况也是有用的，例如在根据图5-7中试剂18递送实施方案的多个局部左束阻滞病灶区的情况下，所述的左束阻滞通过参照阻滞12进行说明。

图8A-C中示出了根据本发明使用的心脏刺激器的另一高度有利的实施方案。更具体地，递送导管30包括一系列的腔或通道34，包括围绕中央腔或通道呈圆周状(cercumferential)间隔的腔或通道。圆周状间隔的腔34每一个容纳有各电极元件50的引线，而中央腔34容纳有另一个电极导线60，其形成可以在中央腔内外调节的螺丝状锚定物，用于递送到并锚定到隔膜中。另外，圆周状间隔的电极元件50根据图8C中更具体的实施方案示出，包括预成型的针元件52，其可以由镍-钛合金制成，或由其他超弹性的形状记忆材料或其他合适的材料制成，在递送尖端38接近隔膜壁时，所述的材料可以容纳在各自的腔34中，然后从腔34延伸并前移进入隔膜壁。还示出了可延伸的电极元件56，其可以在针元件52的内外调节。在递送导管30的尖端38还示出了环电极，其可以用于辅助定位((mapping)，以寻找放置刺激电极的最佳位置，和/或用于作为刺激电极刺激的其他表面区域。

虽然图8A-C中所示的特定构造认为是有利的，诸如元件的数目、位置或特定类型的各种特征都是说明性的，可以进行其他合适的替换。例如，可以使用圆周状间隔的电极元件50的其他数目和相应位置，根据本实施方案通常需要2个或更多个电极元件50，对于许多情况来说通常2-4个电极元件50是最佳的。在图9中所示的另一实施例中，可以移动的探针58可以在电极元件50的通道中移动，所述的电极元件50包括柔韧的柄52，在其尖端具有电极54。可移动的探针适于在通过隔膜壁前移到达所需位置的过程中辅助柄52定位电极54，以进行刺激。可以提供这些特征，而不使用图8C所示和所描述的针装置，或者可以作多种改动，以合并两种方法之间的各方面，例如包括特定的电极装置50，或提供具有一种设计和根据其他设计的一种或多种的这种装置。

无论如何，图10中示出了使用过程中一系列电极隔膜刺激器的广义方面的其他示意性视图。为了便于说明，在横截的心脏中以一定角度排列示出了电极元件50的排列，但是它们可以具有同样的平面取向，如在与心脏1中所示横切平面横向的平面中。因此，锚定元件60定位于隔膜壁组织区中，所述的隔膜壁组织区为已经定位在各特定位置上的电极元件50所结合，所述的各特定位置环绕穿越该区域的重要锚定物60。通过提供元件50、60和与刺激能量源(未示出)的作为刺激电极的尖端38，可以大大刺激电极元件50所结合的组织，例如进行双心室起搏。

为了进一步说明图11A-B中不同平面中所示的这种电极元件的取向，图11B进一步提供了与刺激区域相对应的虚线标出的区域18。但是，可以用圆以外的其他形状、用不同长度的元件50，例如，或用结合的区域18中锚定物60偏移处的中央区域来改变图11B中所示的对应于区域18的圆周排列。在一方面中，图11B的视图为两维上元件50平面排列的具体视图。但是，它们可以是改变的取向，以位于不同的平面中，从而使隔膜组织的三维体积限定为区域。另外，还可以改变元件50的排列，使所得的刺激区18是两个或多个离散的区域，如下文的进一步描述。

可以理解：虽然在隔膜壁表面用元件50、60和环电极38刺激所述的区域是有利的，但没有必要提供所有的这些元件作为刺激电极，移除它们中的一个或多个这种所得的组合排列也认为是这里的实施方案。例如，中央螺丝(screw)电极60可以可以仅作为锚定物提供，而不具有电刺激性。或者，它可以替代为简要的电引线，不必是螺丝锚定物构造。在考虑修改的其他例子中，离散的电极可以沿元件50在区域18中定位于各位置上，如图12A-B中的电极55所示。或者，电极元件50可以是具有刺激能力的连续片断，沿其长度到区域18的边界外。

在图13A-B所示的一个具体的其他具体方案中，电极元件50进入隔膜壁6的组织区中，如分别是图8C或图9的针和探针实施方案。如图13B中所示，多个这种元件可以以这种方式放置，其排列能够使多个电极元件50和57的组合对应于要由此而刺激的总体组织区18。这些元件50、57可以分散地放置到隔膜壁中，引线分别从中延伸，如图13B所示，用相同的心脏内递送导管30或分离的递送装置也一样。如图13B所示防止后，元件50、57的引线与能量源如起搏器或除纤颤器偶联。还考虑在放置引线50、57之后和与能量源偶联之前或之后除去递送导管30，或者仍然存在，如果提供有足够低的轮廓并适于这种长期使用(或如果用于一过性起搏)。

另一种改动示于图13C中，其中远距离机械缝合机制(未示出)提供在递送导管30的远端36，并适于跨隔膜壁6组织区的长度缝合单一引线元件50。提供这类跨延伸长度的缝合引线起搏器的这种机制的例子提供在下列参考文献中：“FlexibleMicroelectrode Arrays With Integrated Insertion Devices”，by O’Brien，David P.，Nichols，T.Richard，and Allen，Mark G.，variously of the School of Electrical and ComputerEngineering at Georgia Institute of Technology and the School of Medicine at EmoryUniversity，both in Atlanta，Georgia。该参考文献的内容整体通过引用并入本文。

在不背离本发明范围的条件下可以进行前述实施方案的各种改动，具体是在为了实现与本发明目的一致的特定所需结果的范围内进行的改动。

例如，试剂递送和可延伸递送实施方案的一个所需结果是在跨隔膜6的大区域内对心脏1进行起搏，如跨越隔膜6中足够面积的电极或试剂，以避免那里束阻滞的影响。因此，隔膜6的“实质”区通常指隔膜壁的至少五分之一，甚至可以更有利的是四分之一，更有利的是多于三分之一，或甚至是隔膜的二分之一(捕获真个隔膜是理想的)。从这一点上说，本文的这种“刺激”是指经历人工刺激的区域，例如通过直接来自激发电极的放电，或通过人工递送的传导试剂的其传播增加。另外，配置这种试剂或可伸展电极可以到达顶点9或超过。在任意时间事件中，虽然刺激这种实质区在本发明的许多应用中都是非常有利的，但其并不是获得本发明所公开的、根据本文所述各实施方案的其他许多益处所必需的。

在本文中具体描述了本发明和作为能量源46的起搏器一起使用，所述的能量源与电极排列50偶联，所述的电极排列50可以是植入的或一过性的，可以是商业上可获得的类型。或者，这种起搏器可以改动，和电极排列装置50和/或本文所述试剂或“生物电极”18一起使用。例如，对于通常使用传统的电极引线通过隔膜6起搏心脏1的给定焦耳数，这种能量剂量可以在本发明排列的许多电极之间分配，从而减小电极自身部位的电流密度。在另一方面中，在达到使用传统系统递送任意一个电极处的相同水平之前，需要跨排列的电极从起搏器递送更多焦耳。

心脏1的其他区域也可以使用本文所述的实施方案刺激，普通技术人员可以进行适当改动来使用。

另外，可以使用其他的刺激能量形式，如超声或微波，虽然电刺激是非常有利的，根据工业中的以前经验是有效的。此外，“刺激”一定程度上是针对实施方安庆内进行描述的，通常是进行这种刺激以激发传导活性，并割据通常为非消融性的能量递送方式进行。

细胞培养物，具体表达或超表达Cx43或其他连接蛋白的细胞培养物在本文特指根据本发明的非常有利的试剂，使用这种试剂以增强心脏中的细胞传导。具体和刺激器相关，这种试剂试剂认为是“生物电极”，通过局部增强的传导有效的延伸能量发射器(如电极)的所及范围，从而刺激心脏的更大区域。电极和生物电极刺激较大的区域，减轻心室间同步收缩方面的不足。

还考虑在类似应用中也具有有益效果的“生物电极”之外的其他试剂。例如，其他物质可以注射或以其他方式应用到目标组织。这种其他物质的例子包括：聚合物，其可以是传导性的(如聚石蜡)，或非传导性的(如PLGA)，该情况下它们可以包覆如传导性金属；水凝胶，如带有离子电荷的类型；或其他溶液或悬液，如带有金或其他传导性金属颗粒或离子的溶液或悬液。

另外，本发明还考虑使用前述的组合物或共混物，如根据一个非常有利的例子，将超表达Cx43的细胞和聚合物递送基质(其也可以是传导性的或非传导性的)组合。

上文中还参照说明性的实施方案描述了电极装置和传导试剂递送之间的各种组合，但是有可以有其他组合和亚组合，并对其进行改动。例如，螺丝电极可以改变为具有中空的腔，用于试剂递送。在另一个例子中，图14A-B说明了将电极和传导试剂分别非常有利地经血管递送到心室隔膜中，它们可以组合在一起递送。作为可替代方案，和其他的经心脏方法组合而完成每种的递送。另外，一些试剂和/或电极可以通过经心脏递送方式递送，而其他试剂和/或电极也可以通过经血管隔膜穿孔方法递送——可以提供每种方法来增强对隔膜不同区域的刺激，而这些组合可以提供完全且更有利的双心室起搏结果。为此，本文一般性示出并描述了经心脏方法，经常为优选的右(right)心脏系统。但是，也考虑了试剂或刺激器的左心室经心脏递送，取代右心室方法(或经血管方法)或与由心室方法(或经血管方法)组合。考虑了这些的组合和亚组合，在本公开内容的基础上，对于普通技术人员来说是显而易见的。

可以使用不同体积的试剂，不同数目、尺寸、模式和/或长度的刺激引线以适应具体需要。一方面，可以使用之前的诊断分析来确定病症程度、病症部位或患者的各种解剖注意事项，这些参数设定要使用试剂或电极排列的体积。或者，可以使用实时诊断方法，使能够监测刺激物效应，从而可以改变试剂的量或电极配置的距离、方向或数目，直至获得正确的结果。因此，例如，这类实施方案的电极可以可通过组织缩进或前移，从而可以尝试不同的配置，直至获得同步化。

还考虑了试剂递送和电极实施方案，虽然彼此组合是非常有利的，但相独立也是有利的，可以用于提供有益结果，而不需要使用其他的。

不管上述如何，图15示出了特别有利的总体装置。更具体地，所示心脏刺激系统100包括如下的递送导管110和锚定物140，所述的递送导管协同作用以提供生物电极150和刺激电极130的递送。递送导管110具有带近端连接器114的近端部分112、远端部分116和末梢尖端118，是心脏内递送导管，适于将其内容物从右心室向室间隔膜递送。从递送导管110延伸的是具有可延伸螺丝锚定物140的内导管120，多年个间隔的可延伸电极元件130位于螺丝锚定物140周围。所有的或只有一些中央锚定物140、可延伸电极元件130和元件尖端120可以作为刺激电极提供，以与能量源160偶联，如通过轴120偶联。另外，所有或只有一些中央螺丝140、可延伸电极元件130和元件尖端220还适于通过刺激电极部分(section)偶联，如区域150所示，如通过端口与通道(未示出)偶联，并进一步与这种试剂源170偶联(示意性示出)。

这种组合的扎对于刺激心室内隔膜的实质部分，如对于双心室起搏尤其是治疗LBBB是非常有利的。如图15所示，说明了将可延伸元件提供到组织如隔膜壁中达到其他实施方案，另一个装置180可以与作为促动器(actuator)的这种装置偶联，使得能够自动或手动延伸各可延伸的元件。可以提供在图15中100处所示总体系统中或本文其他实施方案中的其他元件包括监控传感器和相关的硬件和/或软件，如引入或通过其他方式与能量源如起搏器/除纤颤器协同作用，包括例如：定位电心脏信号，用于确定刺激方式中的诊断用途；和/或与刺激信号自身如设定点等相关的反馈控制。

增强连接蛋白的传导试剂

一定程度上使用表达连接蛋白的细胞试剂作为生物电极的本发明与同一发明人于2002年11月7日提交的共同未决的美国专利申请系列号No.10/291,202相关，其公开内容的整体通过引用并入本文。本发明的这一方面基于实验发现，基于人造材料和方法：使心肌细胞和重组细胞如经修饰表达重组连接蛋白43的成年骨骼肌细胞相接触，能够使修饰的骨骼肌细胞与心肌细胞电偶联。因此，根据本发明实施方案的本发明提供了一种方法，该方法包括使用遗传修饰的重组细胞生成连接蛋白，以在重组细胞和心肌细胞之间产生持续的功能性间隙连接，从而获得这些细胞之间的电通讯。表达重组Cx43(或其他连接蛋白)的重组细胞的使用增加并维持重组细胞和心肌细胞之间的通讯，从而提供改进且协调性的电偶联，该电偶联的心肌收缩效率增加。本发明提供了治疗心脏病的方法，该方法包括：将经修饰表达连接蛋白的重组细胞移植或植入心脏组织中，以实现人工刺激心肌功能异常区域的能力，尤其是在心室内隔膜刺激的情况下，如使用起搏器或除纤颤器，例如进行双心室起搏作为心脏阻滞的治愈性指标。

与连接蛋白实施方案相关的定义

下列定义应用于使用生物或细胞材料作为生物电极试剂的本发明实施方案中，具体是针对与连接蛋白-43和/或与其生成或表达相关的试剂的实施方案。一定程度上，这些术语还针对本文提供的其他实施方案使用，应该给出对于本领域的普通技术人员来说与这种实施方案相关的常见、惯用的意思，除非这种术语特别指明针对特定的实施方案。

本文所用的“多聚核苷酸”指寡核苷酸、核苷酸和其片段或部分，以及肽核酸(PNA)、片段、部分或其其反义分子，还指基因组或合成来源的、单链或双链的、表示正义或反义链的DNA或RNA。其中“多聚核苷酸”用来指特定多聚核苷酸序列(如编码连接蛋白43多肽的多聚核苷酸)，“多聚核苷酸”包括编码功能上与所述多肽登台的多肽的多聚核苷酸，如是简并突变体的多聚核苷酸(即编码相同的氨基酸序列，但由于遗传密码子的简并性导致多聚核苷酸序列不同)，或编码所述多肽的有生物活性的突变体或片段的多聚核苷酸，包括与本文提供的序列相比具有基本序列相似性或序列相同性的多聚核苷酸。同样，本文所用的“多肽”指寡聚肽、肽或蛋白质。这里所述的“多肽”指天然存在蛋白质分子的氨基酸序列，“多肽”和类似术语并不将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列，而是还包括具有生物活性的突变体或片段，包括与本文提供的氨基酸序列相比具有基本序列相似性或序列相同性的多肽。

本文所用的“多肽”指具有下列氨基酸序列的重组或非重组多肽的氨基酸序列：i)天然多肽；ii)具有生物活性的多肽片段；iii)具有生物活性的多肽的多肽类似物；或iv)具有生物活性的多肽突变体；本发明中有用的多肽可以从任意物种获得，如哺乳动物或非哺乳动物(如爬行动物、两栖动物、鸟类(如鸡))，尤其是哺乳动物，包括人类、啮齿类(如小鼠或大鼠)、牛、绵羊、猪、鼠或马，优选大鼠和人类，来自任意来源，不论其是天然的、合成的、半合成的或重组的。例如，“人连接蛋白43多肽“指从人类获得的分离的人Cx43多肽的氨基酸序列，包括所有天然发生的等位突变体，并不将氨基酸序列限定于与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列。

多肽“突变体”定义为一个或多个氨基酸改变(如通过缺失、增添、插入和/或替换)的氨基酸序列。通常，“增添”指在分子的一端加入核苷酸或氨基酸残基，而“插入”指在天然存在的分子的残基之间加入核苷酸或氨基酸残基。突变体可以具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有类似的结构或化学性质，如将亮氨酸替换为异亮氨酸。较少见的是，突变体可以具有“非保守性”改变，如将甘氨酸替换为色氨酸。类似的微小变化还包括氨基酸缺失或插入等。确定哪个或多少个氨基酸残基可以替换、增添、插入或缺失而不取消生物活性或免疫活性的指导可以使用本领域中公知的计算机程序查询，例如使用DNAStar软件。

“目的核酸”指编码诱导或维持细胞之间电偶联所必需的蛋白质或其他分子的任意核酸(如DNA)。一般来说，核酸可操作性地连接到其调控和表达所需的其他序列上，如启动子和调控元件。

本文所用的术语“生物活性”具体针对连接蛋白，或影响其生成的生物或细胞材料，例如指具有天然发生的连接蛋白多肽的结构、调节功能或生化功能的化合物，具体是促进建立经修饰表达连接蛋白多肽的细胞和心肌细胞之间电化学连接，具体包括人连接蛋白多肽。同样，“免疫活性”限定天然、重组或合成的人连接蛋白多肽或其任意寡聚肽在合适的动物或细胞中诱导特异性免疫应答的能力和与连接蛋白特异性抗体结合的能力。

本文所用的术语“衍生物”指对编码多肽的核酸或所编码的多肽的化学修饰物。说明性的这种修饰是将氢用烷基、酰基或氨基取代。核酸衍生物编码保留有天然多肽的基本生物特征的多肽。

本文所用的“分离的”是描述目的化合物(如多聚核苷酸或多肽)处在不同于化合物天然发生环境的环境中。“分离的”包括样品中基本富含谜底化合物的化合物，和/或其中目的化合物部分或基本纯化的化合物。

本文所用的术语“基本纯化”指从其天然环境中取出，至少60％不含、优选75％不含、最优选90％不含天然与之结合的其他组分的化合物(如多聚核苷酸或多肽)。

“转化”、“转导”或“转染”指导入新的核酸(如对细胞外源的DNA或RNA)后细胞中诱导的永久性或瞬时的遗传变化，优选永久性的遗传变化。可以通过将新的核酸导入到宿主细胞的基因组中实现遗传变化，或通过瞬时或稳定地将新的DNA保持为附加体元件来实现遗传变化。

“转化的细胞”、“转染的细胞”或“转导的细胞”指已经通过重组DNA技术导入(或向其祖细胞)了编码目的蛋白的DNA分子的细胞。

“构建体“指为了表达特定的核苷酸序列产生的或用于构建其他重组核苷酸序列的重组核酸，通常是重组DNA。本发明中有用的构建体包括可操作性连接到启动子上的编码连接蛋白的基因序列，所述的启动子能够使连接蛋白在转化的细胞中表达。根据本发明有用的、用于表达人Cx43和大鼠Cx43的示例性构建体各自描述在Shinoura，N，et al.，J Neurosurg.1996 May；84(5)：839-845和Suzuki et al.，Ann.Thorac.Surg.，2001，71：1724-33中。

“启动子”指足以能在重组细胞中指导转录的基本序列。“启动子”还包括足以对细胞类型特异性、组织特异性或可被外界信号或试剂诱导的启动子依赖型基因表达进行控制的元件。这些元件可以位于天然基因的5’或3’区域(如增强子元件)。

“可操作性连接的”或“可操作连接的”指DNA序列和调控序列以能够在适当的分子(如转录活化蛋白)与调控序列结合时进行表达的方式结合。

“连接蛋白基因”指编码连接蛋白多肽的开放阅读框或内含子或具有生物活性的其片段。“连接蛋白基因”包括参与调控表达的临近5’和3’非编码核苷酸序列，超过编码区最长约10kb，可以是任意方向。编码连接蛋白的DNA序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。基因可以导入合适的载体中，用于染色体外维持或整合到宿主中。

本文所用的术语“cDNA”包括具有天然mRNA分子中发现的序列元件排列的所有核酸，其中序列元件是外显子(如编码所编码多肽的开放阅读框的序列)和3’和5’非编码区。正常的mRNA物质具有相毗邻的外显子，通过核RNA剪接除去了介入的内含子，以产生编码目的多肽的连续开放阅读框。

“心肌细胞”指心脏收缩细胞，其是心脏肌肉细胞。心肌细胞可以分离并在体外培养，或是宿主心肌的一部分。

“骨骼肌细胞”指骨骼肌中发现的细胞，其包括但不局限于成肌细胞、肌管和成熟骨骼肌肉细胞。

“重组细胞”指包括正常情况下不与细胞相关的核酸的细胞(如转化、转导或转染了编码特定蛋白如连接蛋白构建体的细胞)。

“移植细胞”指导入宿主中以与宿主中的细胞相接触的细胞。例如，重组细胞可以移植和/或植入到宿主的心脏组织中。

用于治疗心脏传导障碍的本实施方案的上下文中的“治疗有效量“指能够有效减少心脏传导障碍和/或改善心脏传导率(传导指标)的量。

基因产物的“超表达(overexpress或overexpressing)”指表达水平相对于处在如特定发育阶段或分化阶段的特定细胞或细胞类型中蛋白质表达的正常水平来说增加。在某些情况下，超表达可以是来自内源性和重组基因的蛋白质表达的积累效应，或来自重组基因的大量蛋白质表达。连接蛋白(如Cx43)的超表达指特定细胞中连接蛋白的表达超过与特定分化阶段的正常或野生型细胞正常相关的连接蛋白表达水平。对于正常不明显表达或表达不可检测量的连接蛋白的细胞(如Cx43在成年骨骼肌细胞中或肌管中)，连接蛋白的超表达指可检测地表达连接蛋白，具有是表达水平足以促进建立连接蛋白表达水平提高了的重组细胞和心肌细胞之间的电化学连接。在某些实施方案中，连接蛋白的超表达指增加至少约2倍，在其他的实施方案中，增加至少约5倍，在另外的一些实施方案中，增加至少约10倍。

术语“受试者”、“患者”、“宿主”和“个体”在本文中互换使用，指需要诊断或治疗的任意哺乳动物受试者，尤其是人类。其他受试者可以包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别感兴趣的是具有心肌相关疾病的受试者，其易于通过将表达重组连接蛋白(如Cx43)的细胞移植到受试者中(如通过将表达重组连接蛋白的细胞体内导入到受试者中，或通过将表达连接蛋白的细胞(如成年骨骼肌细胞、干细胞(如间叶细胞、造血细胞)、成纤维细胞、心脏细胞等)移植入患者中。在许多实施方案中，宿主是人类。

针对细胞间连接的术语“电偶联”指细胞之间的相互作用，其能够进行细胞之间的细胞内通讯，从而提供细胞之间的电传导。体内电偶联提供电机械偶联的基础，并通常伴随有电机械偶联，其中肌肉中通过间隙敛迹饿对细胞的电刺激导致肌肉收缩。

“心脏传导障碍”指正常产生并传递启动心肌收缩的电活性的障碍。缘于电传导障碍的心律失常可以导致危及生命的室性心动过速、危及血液动力学的心搏徐缓和心脏休克。

“与心脏传导障碍相关的病症”指与心脏传导障碍相关的病症、症状或疾病。心脏传导障碍相关的病症的例子是无规则的心脏搏动、疲劳、呼吸短促，和缺少同步化心肌收缩。

“治疗”指至少获得对折磨宿主的病症相关症状的改善，其中改善广义上指至少减小参数的量，如与进行治疗的病症相关的症状(如无规则的心脏搏动、疲劳、呼吸短促、昏厥可以是与传导障碍如心脏阻滞、室性心动过速相关的症状，或与充血性心衰(及缺少同步化的收缩)相关的症状)。同样，治疗还包括病理情况或至少与其相关的症状完全受到抑制、而使宿主不再受病症或至少具有病症特征的症状的折磨的情况，如，抑制不发生或停止，如终止。在另一方面中，该术语包括增强对至少一个心脏区域的刺激能力。

在超表达连接蛋白的细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法

本发明的该实施方案提供在表达连接蛋白的重组细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法，在额外的方式中还包括与人工心脏刺激能量源的偶联。该方法通常涉及使连接蛋白重组细胞(如骨骼肌细胞、干细胞(如间叶细胞、造血细胞)、成纤维细胞、心脏细胞等)和心肌细胞以一定方式相接触，从而提供心肌细胞和重组细胞之间的电连接。细胞是重组的，如其经过遗传修饰，以产生具有生物活性的连接蛋白，如连接蛋白43(Cx43)蛋白。重组细胞中连接蛋白的生成提供重组细胞和心肌细胞之间的电连接，然后是电机械连接。

编码连接蛋白的核酸

如上文所概括，本发明中该实施方案的方法使用核酸组合物，其包括适于在重组细胞中表达的、编码具有生物活性的连接蛋白43蛋白或具有生物活性的其片段、同源物或类似物的基因组和cDNA核酸组合物，细胞可以随后与心脏细胞形成电化学连接。

“连接蛋白”是来自同源蛋白质家族的蛋白质，所述的同源蛋白质家族是在作为同源或异源七聚物的间隙连接的连接蛋白中发现的。连接蛋白是参与细胞的电偶联的主要间隙连接蛋白。间隙连接调节细胞间的分子通道，从而获得细胞的电偶联，所述分子包括无机离子和第二信使。已知有超过15种的连接蛋白亚基亚型，大小在约25kDa和60kDa之间变动，通常具有4个假定的跨膜α螺旋扳头(spanner)。不同的连接蛋白对心脏的各部分是特异的。心血管系统中发现的连接蛋白家族蛋白包括Cx37、Cx40、Cx43和Cx45(van Veen，AA；van Rijen，HV；Opthof，T.，CardiovascularResearch 2001 Aug 1，51(2)：217-29.；Severs，NJ；Rothery，S；Dupont，E；Coppen，SR；Yeh，HI；Ko，YS；Matsushita，T；Kaba，R；Halliday，D.，Microscopy Research and Technique2001 Feb 1，52(3)：301-22；Kwong，KF；Schuessler，RB；Green，KG；Laing，JG；Beyer，EC；Boineau，JP；Saffitz，JE.，Circulation Research 1998 Mar 23，82(5)：604-12)。

本文中互换使用的“连接蛋白43”和“Cx43”指分离的Cx43多肽的氨基酸序列，其具有与间隙连接和电机械偶联相关的结构、调节或生化功能，可以从任意物种获得，尤其是哺乳动物，包括人类、啮齿类(如小鼠或大鼠)、牛、绵羊、猪、鼠或马，优选人类，可以是天然的、合成的、半合成的或重组的，包括所有天然存在的等位突变体，并不将氨基酸序列局限在与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列上。Cx43包括具有生物活性的Cx43片段。Cx43的例子包括人Cx43(Genbank注册No.XP_027460、XP_027459、XP_004121、P17302、AAD37802、A35853、NP_000156、AF151980、M65188和AAA52131)、小鼠Cx43(Genbank注册No.P23242、P18246、A39802、A36623、NP_034418、NM_010288、CAA44640)和大鼠Cx43，Genbank注册No.为P08050、S00532、NP 036699、AAA75194和1404339A。

感兴趣的连接蛋白基因组序列包括位于起始密码子和终止密码子之间的核酸，其中连接蛋白43尤其令人关注，其包括正常存在于天然染色体中的所有内含子。其还可以包括成熟mRNA中发现的3’和5’非翻译区。其还包括特异性转录和翻译调控序列，如启动子、增强子等，包括位于转录区5’或3’端的约10kbp且可能更大的旁侧基因组DNA。基因组DNA可以分离为100kbp或更大的大片段，或基本不含旁侧染色体序列的较小片段。在另一个实施方案中，连接蛋白DNA是cDNA，其缺少可以发现在基因组DNA中的内含子序列。cDNA可以操作性地与启动子相连，所述的启动子正常情况下和连接蛋白序列相关(如对连接蛋白基因来说内源性的启动子)，或对于连接蛋白序列是外源的(即来源和连接蛋白序列不同的启动子)。

可以将该5’区的序列，和5’上游序列和3’下游序列用作启动子元件，包括增强子结合位点，其在连接蛋白多肽正常表达的组织中提供表达。所用的连接蛋白序列可以基于任意物种(如哺乳动物或非哺乳动物(如爬行动物、两栖动物、鸟类(如鸡))，尤其是哺乳动物，包括人类、啮齿类(如小鼠或大鼠)、牛、绵羊、猪、鼠或马，优选大鼠和人类)，可以从任意来源分离或生成，不论其是天然的、合成的、半合成的或重组的。当重组细胞是人类细胞时，或细胞要植入的心脏组织是人心脏组织时，连接蛋白优选是人连接蛋白或来源于人连接蛋白。

在本发明的该实施方案中使用的核酸组合物可以合适地编码全部或部分的连接蛋白多肽，通常至少基本全部的连接蛋白多肽。可以根据传统方法通过化学合成寡核苷酸、限制酶消化、PCR扩增等来获得DNA序列的片段。一般地，DNA片段至少约100个相毗邻的核苷酸，通常至少约200个核苷酸，更通常为至少250个核苷酸至约500个核苷酸。

可以分离并获得基本纯的连接蛋白基因，通常并非是完整的哺乳动物染色体。通常，获得的DNA基本不含其他核酸序列，即不包括编码Cx43或其片段的序列，一般为至少约50％纯，通常为至少90％纯，典型为“重组的”，即旁侧有一个或多个天然存在的染色体中通常不与之结合的核苷酸。

包括旁侧启动子区和编码区的连接蛋白的序列可以以本领域中公知的多种途径进行突变，以产生启动子强度、所编码蛋白质的序列等方面的目标性改变。这种突变的DNA序列或产物将与这里所提供的序列基本类似，即不同之处分别在于至少一个核苷酸和氨基酸，不同之处也可以在于至少两个，或至少约10个或更多个核苷酸或氨基酸。一般来说，序列改变可以是增添、替换、插入或缺失。缺失可以包括较大的改变，如结构域或外显子的缺失。例如，可以使用这种修饰的连接蛋白序列来产生构建体，以导入到细胞中来促进电化学连接蛋白的生成。

应该注意的是，优选根据宿主的属和种来选择连接蛋白基因(如人接受Cx43修饰的细胞时，Cx43基因序列是人Cx43)。

所编码的连接蛋白是具有生物活性的，当在骨骼肌细胞中生成时，有生物活性的Cx43多肽促进骨骼肌细胞和心肌细胞之间联系的建立。不拘泥于理论，连接蛋白(如Cx43)表达在细胞表面，作为间隙连接部分插入到质膜中。为了建立细胞间的电偶联，连接蛋白必须起到间隙连接的作用，以形成间隙连接性的细胞间通讯(GJIC)。本领域的技术人员可以容易地鉴别两个细胞(如骨骼肌细胞和心肌细胞)之间的电连接。可以通过对细胞微注射间隙连接可通过的染料如荧光黄(Molecular Probes，Or.)来评价间隙连接，当存在间隙连接时，荧光黄可以从一个细胞转移到另一个细胞中。下面的实施例中给出了用于检测功能性间隙连接的微注射方案(即Cx43的功能性表达)。

重组细胞能够可选地进行遗传修饰，以表达其他蛋白质，如N-钙粘着蛋白。但是，细胞优选不进行这样的修饰，以避免对要移植的细胞进行更多遗传操作。另外，重组细胞不必进行修饰以表达或超表达N-钙粘着蛋白，因为本发明人已经表明外源性(如导入的或重组的)连接蛋白(任意内源性连接蛋白存在或不存在)的表达是足够的。

连接蛋白核酸的构建体

包括连接蛋白核酸的构建体是本领域中公知的。例如，EI Oakley，et al.，Ann.Thorac.Surg.，2001，71：1724-33中描述了含连接蛋白43基因的构建体。使用包含编码连接蛋白的核酸的构建体转化、转染或转导特定的感兴趣细胞，以使导入的编码连接蛋白的核酸分子在修饰的细胞中表达。

在要表达的核酸是DNA是，可以在本发明中使用启动子(如在真核细胞中起作用的启动子)与目的DNA可操作性连接的任意构建体。可以根据本发明使用的含DNA序列(或相应RNA序列)的构建体可以适于在哺乳动物细胞中使用的任意表达构建体，含有目的DNA或RNA序列。这种构建体可以包括质粒或病毒构建体(如腺相关病毒、腺病毒等)的核酸，可以是环状的或线形的。优选的是，构建体能够在真核和/或原核细胞中复制。合适的构建体是本领域中公知的，可以通过商业途径获得。同样，获得外源性DNA或RNA序列在遗传改变的宿主细胞中表达的技术也是本领域公知的。

在一个实施方案中，DNA构建体含有促进目的DNA在哺乳动物细胞中表达的启动子。启动子可以是在哺乳动物细胞中起作用的强启动子，如来自巨细胞病毒(CMV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、慢病毒或腺病毒的启动子。更具体的说，示例性的启动子包括来自人CMV的即早基因的(Boshart ea al.，Cell 41：521-530，1985)和来自RSV的长末端重复(LTR)的启动子(Gorman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777-6781，1982)。作为可替代方案，所用启动子可以是强的常见真核启动子，如肌动蛋白基因启动子。在一个实施方案中，所用的启动子可以是组织特异性启动子。例如，用在构建体中的启动子可以是心脏细胞特异性的启动子、成肌细胞特异性启动子或成年骨骼肌细胞特异性启动子(Luo et al.，Development 2001Feb，128(4)：459-69；Lee，et al.，J.Thor.Card.Sur.1999 Jul，118(1)：26-4，discussion34-5)。来自新生大鼠的原代心肌细胞曾经转染过由大鼠酰基辅酶合成酶基因的C启动子(Kanda，et al.，Heart Vessels 2000，15(4)：191-6)和α-与β-心脏肌球蛋白重链基因启动子(James，et al.，Circulation 2000 Apr 11，101(14)：1715-21)驱动的报道构建体。

本发明中该实施方案的构建体还包括增强和调控连接蛋白在修饰细胞中表达的启动子。例如，血清应答因子(SRF)基因已经表明能调控多种肌肉(mascue)和生长因子诱导性基因的转录。因为SRF不是肌肉特异性的，推定其通过募集肌源辅助因子(myogenic accessory factor)来活化肌基因。Myocardin是肌肉转录因子类的一个成员，提供ARF赋予肌基因肌源活性的机制(Wang，et al.，Cell.2001 Jun 29；105(7)：851-61)。

在另一个实施方案中，启动子是受调控的(启动子如诱导性启动子)，如四环素调控的启动子，从该启动子的表达可以受与外源物质(如四环素)接触的调节。用于本发明的受调控启动子系统的另一个例子是lac操纵子-阻遏蛋白基因调控系统来调控哺乳动物启动子(Cronin，et al.，Genes Dev.2001 Jun 15，15(12)：1506-17)。

对于真核表达来说，构建体应该含有与目的基因操作性连接的最低限度的真核启动子，其可操作性地连接于多聚腺苷酸信号序列。多聚腺苷酸信号序列可以选自本领域中公知的各种多聚腺苷酸信号序列中的任意序列。示例性的多聚腺苷酸信号序列是SV40早期多聚腺苷酸信号序列。构建体还可以包括一个或多个内含子，适当时，它可以增加目的DNA的表达水平，尤其是目的DNA是cDNA时(如不含天然存在序列的内含子)。可以使用本领域公知的各内含子中的任意一个(如人珠蛋白内含子，其插入到构建体中目的DNA的5’位置).

在替代的实施方案中，递送到细胞的核酸是编码连接蛋白的RNA.在该实施方案中，RNA适于在靶细胞中表达(即RNA的翻译)。生成编码目的蛋白的RNA(如mRNA)的方法是本领域公知的，易于用来生成编码本发明中有用的连接蛋白的RNA。

产生重组连接蛋白细胞

修饰表达重组连接蛋白的细胞包括能够通过连接蛋白介导的间隙连接与心肌细胞偶联的任意细胞，包括骨骼肌细胞、干细胞(如间叶细胞、造血细胞)、成纤维细胞、心脏细胞等，遗传修饰后提供重组连接蛋白(如Cx43)在细胞中的表达。在特别感兴趣的一个实施方案中，细胞是骨骼肌细胞。

细胞可以从宿主(如内源细胞)获得，或从适当的培养细胞系获得。细胞对于宿主来说可以是自体同源的、同种异源的或异种的(如灵长类、猪等)。在某些实施方案中，细胞通过活组织检查(如肌肉活组织检查)从受试者或患者收集。后一实施方案能够进行表达重组连接蛋白的细胞向宿主心肌的自体同源移植。

适合用来产生表达重组连接蛋白的细胞的细胞包括骨骼肌细胞，尤其是成年骨骼肌细胞、干细胞(如间叶细胞、造血细胞)、成纤维细胞、心脏细胞等。然后将能够生成连接蛋白(如Cx43)的表达构建体导入转化之前和/或之后可以在体外增殖和培养的细胞中，以增加用来移植到心肌组织中的、表达重组连接蛋白的细胞数目。

在一个更特定的实施方案中，细胞是骨骼肌细胞肌肉细胞或细胞系，增殖并转化适当的载体，以表达连接蛋白(如Cx43)。将表达重组连接蛋白的这些细胞在体外培养，用于移植到心肌中。在另一个实施方案中，细胞是新鲜原代培养物或冷冻培养物中的细胞。

将连接蛋白构建体导入哺乳动物细胞的方法包括本领域技术人员公知的常规方案。

可以使用操作性插入到构建体中的调控性启动子来实现连接蛋白表达的调控，所述的构建体包含用于转导修饰细胞的连接蛋白基因。调控连接蛋白表达的其他方法可以包括重组细胞内源性的基因组调控元件，或加入调节连接蛋白表达的化合物(在植于入重组细胞时或之后)。

可以通过诸如western印迹的技术、使用对重组连接蛋白特异的抗体来检测修饰细胞中的连接蛋白表达。确认重组细胞中重组连接蛋白表达的其他方法涉及对培养物中的转化细胞使用连接蛋白mRNA特异性的引物进行的RT-PCR，或使用免疫荧光技术。可以在体内模型中测试连接蛋白多肽促进重组细胞和心肌细胞之间电连接产生的能力。

在重组连接蛋白细胞和心肌细胞之间产生功能性间隙连接

表达重组连接蛋白的细胞可以进行培养，以在体外增加细胞的数目。获得所需数目的重组细胞之后，将细胞导入心肌组织中。可替代地或另外地，将重组连接蛋白细胞和心肌细胞在体外共培养，然后移植。

连接蛋白的生成使得修饰的细胞诱导和心肌细胞通过间隙连接的电连接。由于心肌细胞和非心脏细胞之间细胞特征和电生理特征方面的差异，需要心肌细胞和非心肌细胞的紧密偶联，以使电通讯同步化。本发明表明了两种不同细胞类型之间的特定的、新的相互作用，这种特定的、新的相互作用能够进行心肌疾病和病症的处理和治疗。

治疗心脏病症的方法

本发明的该实施方案提供了矫正心脏传导障碍的方法，和治疗与心脏传导障碍相关的心脏病症的方法。本发明的这些方面相对于常规的细胞移植更先进：通过增加细胞与细胞的通讯从而获得更同步化的收缩。所述的方法通常涉及使宿主的心脏细胞与表达连接蛋白(如Cx43)的重组细胞接触，使连接蛋白促进重组细胞和心肌细胞之间电连接的产生。这种连接通过改善心脏中的传导促进对心脏传导障碍的矫正。在特别感兴趣的实施方案中，重组细胞是骨骼肌细胞。

连接蛋白和具有生物活性的相关化合物或细胞的应用包括：治疗需要增加心肌细胞之间协调收缩的各种不同病症中的用途。易于通过这种方法治疗的示例性疾病包括但不局限于完全的心脏阻滞、折返性心律失常(如室性心动过速)、充血性心衰等。可以从改善同步化收缩受益的任意心脏疾病或病症都易于用局部增强或递送连接蛋白或其生物学等同物的这些方法来治疗，以影响细胞间隙连接。

植入重组连接蛋白细胞

下列描述用于表达连接蛋白的细胞的示例性植入技术，该描述并不具有限制性，尤其在根据本文其他实施方案提供的其他递送方法中，这些其他的递送技术可以和该实施方案的描述组合，也可以独立进行，这对于普通技术人员来说是显而易见的。

重组连接蛋白细胞向受试者心肌中的移植可以使用将组织和/或分离的细胞移植到心脏中的公知外科技术。通常，有两种方法将重组细胞导入到受试者的心脏组织中：1)手术、直接注射；或2)如美国专利No.6,059,726(Lee and Lesh，“Method forlocating the AV junction of the heart and injecting active substances therein”)中所述的经皮技术。

重组连接蛋白细胞可以植入到发生传导障碍的任意心脏区域。通过戴治疗的心脏病的类型、心肌组织的总体损伤和要移植的细胞中连接蛋白的表达水平来确定要移植的重组细胞量。本发明的心脏刺激方面中特别有意思的是，西吧递送到待刺激或要增强这种刺激传播的心脏组织区中，尤其是心室内隔膜中，以用于隔膜起搏。因此，当用“损伤的”心脏组织时，这种表述在本文中指还应用于待刺激的组织区，虽然那些特定的区域本身并没有损伤(但是其刺激将有效地治疗与那些损伤相关的病症)。

在某些实施方案中，表达重组连接蛋白的细胞通过经皮方法来移植。如果可以通过非侵入性的诊断技术准确确定损伤的心脏组织部位，可以使用本领域公知的向心肌经皮注射的常用方法，将重组连接蛋白细胞直接注射到受损伤的心肌组织中，也可以使用本文提供的新的、有利的递送方案。治疗有效所必须的重组细胞量随要治疗的疾病类型和发生的心脏损伤的程度而改变。

免疫抑制剂可以超表达Cx43的细胞移植联合使用，所述的超表达Cx43的细胞不来源于宿主以最低限度降低移植物排斥的可能性，例如是同种异源的或异种的细胞。

与其他治疗联合

在适当时，本发明的方法还可以和其他心脏治疗联合使用，在某些实施方案中，用于治疗某些类型传导缺陷的药物可以和重组连接蛋白细胞向受损心肌的植入联合使用(如在植入过程中和/或之后)。适合用来与连接蛋白或其他间隙连接增强方法联合治疗的心脏用药物包括但不局限于生长因子、编码生长因子的多聚核苷酸、血管生成药、钙通道阻断剂、降压药、抗有丝分裂药、影响肌肉收缩的药物、抗动脉粥样硬化药、抗凝剂、β-阻断剂、抗心律失常药、抗炎药、血管扩张药、溶血药、强心苷、抗生素、抗病毒药、抗真菌药、抑制原生动物的药物、抗心律失常药物(用于治疗室性心动过速)、硝酸盐、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；脑钠尿肽(brain natriureticpeptide，BNP)；抗肿瘤药、类固醇等。

连接蛋白或其他间隙连接增强可以是冠状动脉旁路移植(CABG)的补充程序。将无功能的心肌疤痕替换有功能性的肌肉并进行血管再生成相对于单纯的血管再生成(旁路手术)来说提高心肌性能。移植重组连接蛋白细胞和CABG联合，通过减小壁应力和缺血压力来防止持续性的心肌重建，提供手术过程中的更好治疗。通过在GABG手术时植入重组细胞可以避免将重组细胞递送到心肌中的额外手术过程。

对治疗的评价

可以通过多种方式来监测根据连接蛋白或其他间隙连接增强方法的治疗效果。通常，对于和本发明各实施方案相关的心脏阻滞疾病来说，使用心电图(ECG)或霍尔特监护仪来确定疗效。心脏收缩的发生是由于心脏内产生的电脉冲；ECG是心律和电脉冲的量度。因此，ECG是确定治疗是否改进或维持、抑制或减慢受试者心脏中电传导的劣化。使用霍尔特监护仪也是评价治疗效果的可靠方法，所述的霍尔特监护仪是一种可以长期佩带的手提ECG，用来监测心脏异常、心律基因等。

还可以使用电生理测试来评价治疗情况，所述的电生理测试涉及将导管经皮放置到心脏中，以评价心脏的传导性能。

用连接蛋白或具有生物活性的相关试剂递送治疗的病症是充血性心衰时，可以使用心电图和核研究来确定心室功能的改善。对重组连接蛋白细胞移植入心肌组织之前和之后的心电图比较，可以对治疗进行可靠的评价。

上述评价疗效的方法只是示例性的，而不具有限制性。检测同步偶联的许多合适的方法(如通过监测心脏功能)是本领域公知的，也适合使用。

实施例

列出下列实施例，以为本领域的普通技术人员提供如何制作和使用本发明实施方案的全面公开和描述，并不是要限定本发明的范围，也不是为了说明下面的实验是进行的所有实验或仅有的实验，也不是为了说明只有那些方法或治疗可以根据该公开内容进行，不具有根据本领域中普通技术的不合理实验。已经尝试确保所用数字(如量、温度等)的准确性，但是一些实验误差和偏差也是应该说明的。除非指明，份是制重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压力处于或接近大气压。

虽然参照其特定的实施方案描述了本发明，但本领域的技术人员应该理解：在不背离本发明真正实质和范围的条件下，可以进行各种改变，并用等同物替换。另外，可以进行许多改动，以适应于特定的情况、材料、物质组合物、方法、方法步骤，适应于本发明的目的、实质和范围。所有这些改动也都在所附权利要求的范围内。

实施例1：鉴定骨骼肌成肌细胞/肌管电刺激心脏组织的能力

组织工程技术是替代用来治疗末期心脏病和收缩异常的传统疗法的吸引人的技术。细胞移植提供了修复患者功能的前景。

生物活检的骨骼肌具有能够分裂和增殖的卫星细胞、骨骼肌成肌细胞。骨骼肌成肌细胞最初表达Cx43。但是，随着细胞成熟并分化成肌管(导致收缩性肌肉纤维的基本单位)，Cx43的表达在骨骼肌管中是最少的。

骨骼肌成肌细胞和肌管具有不同的细胞电生理特征。确定了成肌细胞向肌管分化的不同阶段的动作电位参数特征。从2-5日龄的新生大鼠的后肢通过酶分散分离骨骼肌成肌细胞。通过将生长培养基换为分化培养基(DM)(98％DMEM，2％马血清(HyClone)、青霉素G 100U/ml和链霉素100μg/ml)，使培养的成肌细胞分化成多核肌管。对在DM中孵育2-14天的成肌细胞和肌管进行研究。使用研究完整细胞构型的膜片钳(patch clamp)技术来记录动作电位。获得了下列参数：所得的膜电位(RMP)、动作电位幅度(APA)、50％(APD₅₀)去极化时的动作电位持续时间(表1)。

在第4天，成肌细胞开始分化成肌管，到10-14天形成自发收缩纤维的网络。

表1.在DM中不同天数内动作电位参数的变化

组别	RMP(mV)	APA(mV)	Vmax(V/s)	阈值(nA)	APD₅₀(ms)
组别	RMP(mV)	APA(mV)	Vmax(V/s)	阈值(nA)	APD₅₀(ms)	DM 2(n＝10)	-27.4±2.9	60.1±5.8	27.4±4.2	31.1±6.5	15.1±1.7
DM 4(n＝4)	-38.3±3.6	94.4±6.5	72.2±6.7	23.8±2.39	8.1±0.1	DM 2(n＝10)	-27.4±2.9	60.1±5.8	27.4±4.2	31.1±6.5	15.1±1.7
DM 4(n＝4)	-38.3±3.6	94.4±6.5	72.2±6.7	23.8±2.39	8.1±0.1	DM 6(n＝8)	-50.6±3.0	113.9±3.4	102.9±9.0	18.1±0.9	7.4±0.5
DM 8(n＝11)	-52.8±1.8	123.7±4.3	123.5±6.4	17.2±1.9	7.4±0.4	DM 6(n＝8)	-50.6±3.0	113.9±3.4	102.9±9.0	18.1±0.9	7.4±0.5
DM 8(n＝11)	-52.8±1.8	123.7±4.3	123.5±6.4	17.2±1.9	7.4±0.4	DM 10(n＝7)	-53.1±2.5	133.1±2.7	153.4±8.9	29.2±5.3	7.4±0.5
DM 11(n＝10)	-53±1.7	133.5±3.1	146.4±2.9	33±2.8	5.1±0.5	DM 10(n＝7)	-53.1±2.5	133.1±2.7	153.4±8.9	29.2±5.3	7.4±0.5
DM 11(n＝10)	-53±1.7	133.5±3.1	146.4±2.9	33±2.8	5.1±0.5	DM 12(n＝9)	-52.4±3.2	127.4±2.9	142.7±6.4	30.7±6.8	5.4±0.7
DM 13(n＝9)	-48.8±3.1	120.6±3.0	129.3±6.8	30±4.9	7.5±0.6	DM 12(n＝9)	-52.4±3.2	127.4±2.9	142.7±6.4	30.7±6.8	5.4±0.7
DM 13(n＝9)	-48.8±3.1	120.6±3.0	129.3±6.8	30±4.9	7.5±0.6	DM 14(n＝9)	-46.8±0.9	120.2±5.4	114.6±3.9	43.3±4.3	6.4±0.6

新鲜分离的骨骼肌成肌细胞不具有可测量的动作电位，不能得以电刺激。

RMP：在第8天和第10-14天之间没有显著差异。

APA：所者发育过程中肌管的RMP变得更负，动作电位的幅度也增加，并在10-11天达到峰值。接着，APA平行下降，直至13-14天。在第10天和第8天、11-14天之间没有发现显著差异。

Vmax：观察到了和APA的类似变化。

APD₅₀：APD₅₀的最小值发生在第111-12天，然后增加。除了第2天，组间没有显著差异。

因此，成肌细胞向肌管分化的不同时期发生动作电位变化。

膜片钳数据突出了7天内DM中成肌细胞相对的电不可刺激性。根据这些结果，移植的骨骼肌成肌细胞/肌管通常不传播足够的电脉冲以增强细胞间传导，除非通过间隙连接增强了细胞偶联。

使用计算机模拟来评价骨骼肌成肌细胞与肌原纤维和心脏心肌细胞之间的细胞与细胞的电刺激(Lee R et al.，Annals of Biomedical Engineering 28-1：S54，2000)。通过引入每种细胞类型的测定的细胞参数来进行模拟。计算机模拟结果确定骨骼肌细胞的动作电位持续时间(APD)短(成肌细胞和肌原纤维分别为1.6ms和2.8ms)，与心脏细胞相比，是骨骼-骨骼与骨骼-心脏刺激的主要限制点。对于骨骼肌细胞来说需要高度的细胞间偶联，以在在2.5ms内，在其自身去极化之前，足够快地激发其下游的相邻细胞。细胞间偶联的降低增加使邻近细胞带电所需要的时间。细胞间偶联降低的比例仍能使同源链中细胞-细胞刺激：心室∶骨骼肌成肌细胞∶骨骼肌原纤维细胞类型为45∶5∶1。在混合链中，刺激的限制因素仍是：骨骼肌细胞是源细胞。

这些结果说明：1)短骨骼肌动作电位通过限制想心脏细胞提供足够刺激电荷的能力来限制骨骼肌向心脏的传导；2)骨骼肌细胞分化成肌原纤维进一步限制了刺激能力；3)连续的骨骼肌向心脏的传导需要非常高水平的间隙连接偶联。

因此，细胞间偶联下降的情况将大大降低移植的骨骼肌细胞和相邻心肌细胞之间的电传递。电传导缓慢或阻滞能导致潜在致命的心律失常。

实施例2：骨骼肌细胞移植的电生理结果

为了评价骨骼肌细胞移植到心肌中的电生理结果，使用评价心脏传导的体内模型。之前已说明了想心脏传导系统的特定区域进行基因转移的可能性(Lee et al.1198PACE 21-II：606；Gallinghouse et al.，November 1996 Am Heart Assoc.；美国专利No.6,059,726)。例如，已经描述了重组β半乳糖苷酶在大鼠和猪AV结中的高效且特异的局部表达。通过在大鼠中产生AV阻滞已经证实了AV结注射的准确性和可再现性(Lee et al.1998 J Appl Physiol.85(2)：758-763)。作为心房和心室之间电传递的电绝缘导管，AV传导轴在心脏电生理的研究中处于战略性的位置。

为了确定骨骼肌移植是否改变AV结电生理特征上的传导，使用了AV结注射的大鼠模型(Lee et al.1998 J Appl Physiol.85(2)：758-763)。将动物通过化学方法去神经(使用阿托品和普奈洛尔来抑制自主神经系统的影响)，通过右心房超速起搏和心房程序性额外刺激加以研究，都在预注射和处死时进行。测定表面ECG PR间隔和AV结阻滞周期(AVBCL)(AV传导依次变长、然后不能传导时的速率)和有效不应期(ERP)(心房额外刺激不能通过AV结传导时的偶联间隔)。将骨骼肌成肌细胞(1×10⁵，15μl)或赋形剂单注射剂注射到大鼠的AVN中(n＝8)。

在移植骨骼肌成肌细胞的动物中，AV结的电生理特征显著改变。与对照动物相比较，记录骨骼肌成肌细胞注射的大鼠中文克巴赫循环周期(70.0±4.4和57.0±5.0msec；p＜0.01)和AV结不应期(113.8±5.6和87.0±6.2msec；p＜0.005)的显著变化。AVN的组织学检查表明大约10％的AVN参与，具有最低限度至没有的炎症。AV传导轴的组织学在对照赋形剂注射中显示正常。有意思的是，PR间隔不明显改变，说明了心脏传导特性的表面EKG标志物的不敏感性。

这些结果进一步提供证据说明移植的骨骼肌成肌细胞(甚至在涉及小部分AVN时)改变心脏传导，并可以产生传导慢或传导阻滞的区域。因此，当骨骼肌成肌细胞分化成肌管并丧失形成间隙连接的能力时，其传播电脉冲的能力下降。

实施例3-7：方法和材料

实施例3-7中使用下列材料和方法。

骨骼肌成肌细胞分离物和培养物

该方案得到旧金山加利福尼亚大学动物研究委员会的许可，并根据联邦准则进行。如前所述，通过酶分散法从2-5日龄的C3H新生小鼠分离新生骨骼肌成肌细胞，并如前所述进行培养(Rando，T.，and Blau，H.M.(1994)，J.Cell Biol.125，1275-1287)。分离后，细胞用生长培养基(GM)(80％-培养基(GIBCO BRL)、20％FBS(HyCloneLaboratories，Inc.)、青霉素G 100U/ml和链霉素100μg/ml、bFGF2.5ng/ml(人，Promega Corp))培养。骨骼肌成肌细胞在GM培养基中于湿润的95％空气和5％CO₂中培养。一旦培养物达到75％融合(第0天)，将成肌细胞培养在GM培养基中，或换到分化培养基(DM)(98％DMEM，2％马血清(HyClone)，青霉素G 100U/ml和链霉素100μg/ml)中。将培养在DM中的成肌细胞在湿润的95％空气和5％CO₂中孵育。在第0天、第2天、第4天、第7天收集成肌细胞，分别提取RNA和蛋白质。

生成连接蛋白43

将大鼠连接蛋白43(Cx43)克隆到MFG逆转录载体中；然后如前所述导入鼠成肌细胞中(Springer ML，Chen AS，Kraft PE，Bednarski M，Blau HM.，Molecular Cell.1998，2：549-558)。该载体已经表明能够在肌肉中稳定表达(Dhawan J，Pan LC，PavlathGK，Travis MA，Lanctot AM，Blau HM，Science 1991：254，1509-1512)。使用表达E.coliβ-半乳糖苷酶(β-gal)基因(TR/Z))的原代成肌细胞作为对照成肌细胞(Springer，M.L.and Blau，H.M.，Som.Cell Mol.Genet.1997：23，203-209)。

使用加利福尼亚Qiagen公司的Qiagen试剂盒从培养的细胞中提取RNA，并通过光谱分析(A260和A280测量值)对其进行定量。每个样品的RNA(1μg)使用Olig-dT于37℃逆转录1小时，分别对相同量的cDNA扩增连接蛋白43、myogenin、myoD、结合素和GAPDH。表2中描述了用在该研究中的不同引物。于94℃变性5分钟后，进行一定循环的扩增(94℃ 30″；55℃ 30″；和72℃ 30″)，然后再于72℃延伸5分钟。对GAPDH和连接蛋白43进行半定量的最佳循环数为25；myogenin、myoD和结合素为22。通过2％琼脂糖凝胶电泳分辨PCR产物，用NIH软件通过密度计量进行分析。连接蛋白43、myogenin、myoD和结合素的表达水平相对于GAPDH的水平进行校正；第0天的水平设定为1。

表2：实验研究中所用引物的概括

基因	引物(正向)	引物(反向)
基因	引物(正向)	引物(反向)	连接蛋白43	5’-TACCACGCCACCACCGGCCCA-3’	5’-GGCATTTTGGCTGTCGTCAGGGAA-3’
Myogenin	5’-CCTTAAAGCAGAGAGCATCC-3’	5’-GGAATTCGAGGCATAATATGA-3’	连接蛋白43	5’-TACCACGCCACCACCGGCCCA-3’	5’-GGCATTTTGGCTGTCGTCAGGGAA-3’
Myogenin	5’-CCTTAAAGCAGAGAGCATCC-3’	5’-GGAATTCGAGGCATAATATGA-3’	MyoD	5’-TTCTTCACCACACCTCTGACA-3’	5’-GCCGTGAGAGTCGTCTTAACTT-3’
结合素	5’-CCGGAGGCTTGGGGTCGCT-3’	5’-CTGTTCCTGAAGCTGGGCCTGG-3’	MyoD	5’-TTCTTCACCACACCTCTGACA-3’	5’-GCCGTGAGAGTCGTCTTAACTT-3’
结合素	5’-CCGGAGGCTTGGGGTCGCT-3’	5’-CTGTTCCTGAAGCTGGGCCTGG-3’	GAPDH	5’-AAAGTGGAGATTGTTGCCAT-3’	5’-TTGACTGTGCCGTTGAATT-3’

通过Western印迹法检测蛋白质表达

从培养的细胞中提取总的可溶性蛋白，通过Bradford法进行定量。可溶性蛋白(40μg)使用10-20％分辨率的凝胶通过SDS-PAGE进行分离，用于连接蛋白43、MHC和P21的检测。将蛋白质电转印到HYBOND^TM-ECL硝酸纤维素膜上，使用ECL检测试剂盒进行免疫反应。所以用抗连接蛋白43兔多克隆抗体(Zymed Laboratories，Inc.Ca.)(1∶1000)检测连接蛋白43。肌球蛋白重链蛋白用Mf-20抗体(Developmentalstudies hybridoma bank，University of lowa)(1∶2000稀释)检测。P21蛋白用P21抗体(Chemicon international，Inc.Cz)(1∶500稀释)检测。

免疫荧光分析

如Tomakidi P，Cheng H，Kohl A，Komposch G，Alonso A，Cell Tissue Res，2000；301(2)：323-327中所述对连接蛋白43、MHC、结合素进行免疫荧光方法。简要地说，将成肌细胞铺到具有GM培养基的载玻培养皿(chamber slide)上。在70-80％融合时，培养基仍然为GM或换为DM。在第0天、第2天、第4天和第7天收集细胞。用PBS中的4％多聚甲醛固定和固定后用0.2％triton X-100/PBS通透后，细胞用3％BSA封闭1小时，然后与一抗在室温下孵育1小时，用PBS洗3次后，用FITC偶联的二抗孵育1小时。Desmin抗体(Sigma，St.Louis，Mo)、连接蛋白43(Zymed Laboratories，Inc.Ca)和MF-20(Developmental studies hybridoma bank，University of lowa)的稀释度分别为1∶100、1∶100和1∶50。

微注射技术

通过用可通过间隙连接的染料荧光黄(Molecular Probes，Or)对细胞进行微注射来评价间隙连接。在1)70-80％融合的对照(TR/Z)和CX43成肌细胞；2)TR/Z与Cx43肌管和3)共培养的成年大鼠心肌细胞(ARC)和成年骨骼肌成肌细胞或肌管中进行微注射。染料溶液由存在于无菌蒸馏水中的2％荧光黄(可通过间隙连接)和1％四甲基若丹明-葡聚糖(不可通过间隙连接；Molecular Probes)组成。用Micromanipulator 5171，FemtoJet，Eppendorf，通过0.5±0.2μm尖头微量移液器(Femtotips，Eppendorf)施加脉冲压力0.3秒的时间进行微注射。洗涤培养的细胞，将培养基换为含10％FBS的磷酸盐缓冲液(PBS)。用Nikon TE300显微镜进行注射，所述的显微镜具有相差(phase)和荧光光学器件。

实施例3：表达Gap连接蛋白

如上所述将编码连接蛋白43的核酸导入骨骼肌细胞。评价表达重组Cx43的成肌细胞或表达Cx43的、已经分化为肌管的成肌细胞与其他类型成肌细胞或肌管之间的功能性间隙连接。使用对照性(TR/Z)成肌细胞作为功能性间隙连接的对照，所述的对照性成肌细胞最初表达Cx43，然后在分化为肌管的过程中下调Cx43的表达，染料在对照成肌细胞中转移，但不在对照肌管中转移。

观察到了对照细胞和Cx43细胞中Cx43 mRNA变化(图2A和2B)和蛋白质变化(图2C和2D)。RT-PCR实验的琼脂糖凝胶电泳示出了第0、2、4和7天的对照细胞(TR/Z)和表达重组Cx43的细胞中的mRNA Cx43水平。在第0、2、4和7天通过对三个对照样品和三个表达重组Cx43的细胞样品进行RT-PCR来确定Cx43mRNA的平均水平。在第7天，TR/Z对照(为转化的)骨骼肌管中连接蛋白43的mRNA水平明显下调，而相比之下，在第0天和第7天之间Cx43修饰的细胞未表现出Cx43 mRNA表达上的显著差异，说明实现了连接蛋白43基因的逆转录病毒转道，和对照肌管不同，Cx43在成熟的肌管中表达(第7天)。

还观察了与分析Cx43 mRNA的相同细胞相关的Cx43蛋白质水平。对Cx43的Western印迹分析表明第0、2、4和7天对照细胞和表达重组Cx43的细胞中存在相当量的Cx43蛋白。使用Cx43印迹实验来确定第0、2、4和7天三个对照细胞样品和三个表达Cx43的细胞样品中Cx43蛋白的相对量。蛋白质表达结果和RT-PCR结果相一致，证实了重组Cx43的表达可以营救第7天对照细胞中连接蛋白的丧失。RT-PCR结果显示了预期的Cx43 mRNA水平，在对照细胞中逐渐下降，在第7天几乎不存在；而表达重组Cx43的细胞中Cx43 mRNA的水平从第0至第7天没有改变。在这些RT-PCR研究中使用GAPDH作为内部对照。用Cx43的抗体进行Western印迹分析，对照细胞中表明Cx43表达在第2天下调，4天后几乎不存在(形成肌管的过程中)；而表达重组Cx43的细胞不表现出任何下调，甚至可以在第7天检测到上调。在分化前后的骨骼肌成肌细胞中没有发现N-钙粘着蛋白mRNA和蛋白质水平上的差异。

在对照细胞(成肌细胞和肌管)和表达重组Cx43的细胞上进行微注射研究，以分析功能性间隙连接的形成。注射的细胞标记有若丹明葡聚糖和荧光黄，荧光黄能够通过功能性间隙连接从一个细胞转移到另一个细胞。相差照片(phase contrastpanels)示出了每组实验中的注射细胞。骨骼肌成肌细胞或肌管之间的微注射研究示出了若丹明或荧光黄染料的相对转移。在相差显微镜下观察目的细胞，并对若丹明或荧光黄染料进行适当的荧光照射。对表达Cx43的、与其他对照成肌细胞接触的对照成肌细胞进行观察；Cx43成肌细胞与Cx43成肌细胞偶联；对照肌管(如Cx43表达)与对照肌管偶联；Cx43肌管与Cx43肌管偶联。

这些微注射研究表明：在骨骼肌成肌细胞中，染料转移(荧光黄)可以在对照(TR/Z)和Cx43成肌细胞中观察到。在DM培养基中培养7天后，在从对照成肌细胞形成的肌管中不能观察到染料转移。分化培养基中培养7天的Cx43转导的骨骼肌细胞中仍存在染料转移。总之，这些微注射实验表明：分化培养基中生长的Cx43转导的骨骼肌成肌细胞中发生染料转移，而对照肌管中不发生。

实施例4：间隙连接功能和共培养实验

为了研究成肌细胞和培养的成年大鼠心肌细胞(ARC)之间的间隙连接形成，通过常规方法，从体重200-250g的雌性Sprague-Dawley大鼠中酶解分离单一的成年大鼠心脏心室的肌细胞。简要地说，在腹腔内麻醉(戊巴比妥100mg/kg)后，快速切除心脏，使用Langendorff技术通过主动脉向后灌注。37℃下使用溶液A(norminal无钙的溶液，NaCl 134mM，KCl 5.4mM，Hepes 10mM，葡萄糖10mM，MgCl₂ 1mM，NaH₂PO₄ 0.33mM，用NaOH滴定到pH7.4)灌注5min，然后用含1mg/ml胶原酶(B型，Boehringer Mannheim，德国)的溶液A、0.1mM CaCl₂灌注15min，再用溶液A和CaCl₂ 0.2mM洗5min。然后，取出左心室，然后切成小块，在玻璃锥形瓶中用20ml的溶液A和0.1mM CaCl₂于37℃下摇培10分钟。将细胞悬液过滤(200微米筛目)，使滤液沉降5min。用含1mM Ca²⁺的溶液增加上清液中的Ca²⁺浓度，直到0.5mM终浓度。ARC以10⁴杆状细胞cm^-2的密度生长在位于昆布氨酸(laminin)包被的皿中的、补充10％FBS、青霉素G 100U/ml和链霉素100μg/ml的HAM-F-12/M199(1∶1)中。

在含血清的培养基中，ARC经历称作分化/再分化的形态变化，标志是丧失杆形状，肌原纤维瓦解和随后的散开，以及收缩器(apparatus)的重构。在第3天，加入胞嘧啶arabinouranoside(5μM)，以抑制成纤维细胞过度生长。多数APC在第7天重新分化，观察到了收缩活性。在完成分化/再分化后，将骨骼肌成肌细胞(10⁴/cm^-2)加入到ARC培养物中。使它们在HAM-F-12/M199培养基中过夜，第二天进行微注射，以评价成肌细胞和ARC之间的染料转移。为了诱导肌管形成，将培养基换为DM，并在形成肌管(7天)之后进行微注射。

完成了评价心肌细胞和对照细胞(骨骼肌成肌细胞或肌管)或和表达重组Cx43的细胞(骨骼肌成肌细胞或肌管)之间功能性间隙连接形成的微注射研究。注射的细胞标记有若丹明葡聚糖和荧光黄，荧光黄能够通过功能性间隙连接从一个细胞转移到另一个细胞。观察了每组实验中注射的细胞。在共培养实验中，可以在成年大鼠和心肌细胞(ARC)和表达Cx43的对照成肌细胞或和Cx43成肌细胞之间的染料转移。即使在分化培养7天后，Cx43细胞也能够和ARC进行染料转移，指示为功能性间隙连接。相比之下，在对照骨骼肌肌管和ARC之间没有染料转移。总之，这些实验通过说明有可能通过在其中一种细胞中表达重组连接蛋白来形成两种不同细胞类型之间的功能性间隙连接，显示了本发明的特定的、新的特征。尤其是，功能性间隙连接可以形成在经修饰表达Cx43的成年骨骼肌细胞和心肌细胞之间。

实施例5：连接蛋白43对骨骼肌成肌细胞分化的影响

为了确定Cx43表达对骨骼肌成肌细胞分化的影响，分析了其他蛋白质的表达水平。进行了免疫荧光研究，分析对照细胞和Cx细胞中MHC和结合素的表达水平，所述的MHC和结合素是成肌细胞分化成肌管的两个强的标志物。对照骨骼肌成肌细胞在DM中孵育7天后分化成多核的肌管。在连接蛋白43组中，即使在DM中14天后也不形成肌管。显然，重组Cx43的表达抑制成肌细胞形成肌管。免疫荧光研究表明：成肌细胞分化成肌管的两个强标志物MF-20(MHC)和结合素在第7天时存在于对照样品中，而不存在于表达Cx43的样品中。来自western印迹研究显示的MF-20表达与免疫荧光分析相一致。细胞有丝分裂标志物P21的表达在这些组间具有一致的变化，从第0天到第7天逐渐上调，说明当培养基换为DM时，TR/Z和Cx43细胞都退出分裂。

为了确定重组连接蛋白43的表达对成肌细胞有害，还是只在成肌细胞分化成肌管的过程中有害，用带有Cx43基因的复制缺陷型腺病毒(Ad Cx43)转染了骨骼肌成肌细胞和肌管。转染Ad Cx43并转移到分化培养基中的成肌细胞向肌管的形成受阻。相比之下，转染Ad Cx43的完全分化的肌管仍具有正常外观，它们以类似于对照肌管的有序排列方式排列。转染不具有Cx43的对照腺病毒发育正常。

实施例6：骨骼肌中Cx43的表达改善AV结中的电传导

为了确定连接蛋白的集中表达是否改善心脏传导，将骨骼肌细胞转导Cx43(与体外实验所用细胞相同)，并注射到免疫缺陷型大鼠的AV结中(Lee et al.1998 J ApplPhysiol.85(2)：758-763)。将注射有Cx43转导的骨骼肌成肌细胞(2.5×10⁶细胞/25μl；n＝8)的动物和注射对照骨骼肌成肌细胞(2.5×10⁶细胞/25μl；n＝5)的动物相比较。测定表面ECG PR间隔和AV结阻滞周期(AVBCL)(AV传导依次变长、然后不能传导时的速率)和AVN有效不应期(AVN ERP)(心房额外刺激不能通过AV结传导时的偶联间隔)。与注射对照骨骼肌细胞的动物相比，注射Cx43转导的骨骼肌成肌细胞的动物中观察到了PR间隔的明显缩短(40.6±1.9ms和47.6±2.5ms；p＜0.0001，成对T检验)。与注射对照骨骼肌成肌细胞的动物相比，注射Cx43转导的骨骼肌成肌细胞的动物中AVBCL(96.7±10ms和112.0±11.0ms；p＜0.03，成对T检验)和AVNERP(80.0±9.2ms和100.0±16.0ms；p＜0.001，成对T检验)明显改善。

这些结果表明：与注射对照骨骼肌成肌细胞的动物相比，注射Cx43转导的骨骼肌成肌细胞的动物中通过AV结的传导明显得到改善。因此，重组细胞中生成的连接蛋白提供重组细胞和相邻心肌细胞之间的电连接，该电连接进一步提供心房和心室之间的电机械连接。

实施例7：表达Cx43的细胞在之前患有心肌梗塞的患者中的自体同源移植

人心肌病的治疗进行如下。肌肉活检样品从经历过前、侧、后壁心肌梗塞的患者获得，该可以是或不是需要冠状动脉旁路移植(CABG)术的患者。通过上述方法从活检样品收集的骨骼肌细胞进行离体培养，进行遗传修饰以表达人连接蛋白(如Cx43)。通过对连接蛋白的免疫荧光分析法，分析修饰的骨骼肌中重组连接蛋白的表达。在某些情况下，通过上述的体外荧光染料分析法，分析细胞与心肌细胞形成功能性间隙连接的能力。

对修饰的肌细胞进行分析后，将治疗有效量的修饰肌细胞植入患者心脏组织中。在某些情况下，当患者自身的骨骼肌细胞不能用于心脏治疗市，可以将表达重组人Cx43的重组肌细胞系和本领域技术人员公知的适当免疫抑制药物联用。然后用注射导管或用进行CABG程序的皮下注射器将表达Cx43的肌细胞血管内植入，所述的导管可以从各种来源获得(可注射导管，如Johnson & Johnson’s NOGA system、Bioheart’sMyocath、Biocardia、Boston Scientific’s stilleto、Transvascular catheter等)。手术后对患者进行监测以评价治疗效果。

患者

患者为男性和女性，年龄通常在18-75岁之间，曾经诊断有心肌梗塞或非缺血性心肌病。

活检样品

骨骼肌活检样品从(如3-4周)预期数周内作冠状动脉旁路的患者获得，该程序是经过批准的。从骨骼肌活检样品分离自体同源的骨骼肌细胞(成肌细胞和肌管)。在无菌手术条件下，利用开放的活检技术从肌腹切下骨骼肌。从患者的股(四头肌-股外侧肌)或中部腓肠(腓肠肌)获得活检样品。试图从活检样品中排除污染性的筋膜。

四头肌-股外侧肌-在股靠下三分之一处沿股前外侧纵向切开。透过软组织和筋膜进行解剖，鉴别并暴露四头肌-股外侧肌。将肌肉段再沿肌肉纤维的纵轴纵向剖开，并置于转运培养基的容器中。

腓肠肌-在中部腓肠的后外侧腓肠肌区域进行纵切。透过深度筋膜进行解剖，及暴露腓肠肌。将肌肉段再沿肌肉纤维的纵轴纵向剖开，并置于转运培养基的容器中。

自体同源细胞的离体增殖和遗传修饰

使用离体的人连接蛋白构建体来分离、扩增和转导自体同源骨骼肌细胞的方法和方案如上所述。例如，以与Springer ML et al.，Molecular Cell.1998，2：549-558中所述相似的方式，将人连接蛋白(如Cx43)cDNA克隆到MFG逆转录病毒构建体中，并导入自体同源的骨骼肌细胞中。该构建体通常在自体同源的肌细胞中稳定表达。

培养遗传修饰的细胞，以提供浓度约10⁶-10⁹细胞/ml。在移植到患者之前，修饰的细胞可以保存在冰箱中(通常约0℃)。通过台盼蓝染料排出测定细胞存活力的方法可以用作细胞存活力分析法。通过上述的免疫荧光和/或功能性间隙连接分析检测Cx43的表达，证实其效力。

通过经皮方法植入表达重组连接蛋白的细胞

表达重组连接蛋白的细胞向心肌的植入涉及使用导管递送系统来施用重组细胞。重组细胞注射到之前梗塞部位的运动不能的(akinetic)心肌疤痕中。根据目标梗塞区域的尺寸，400百万-100百万的细胞作为悬液注射。可以使用多次注射来递送重组细胞。

可以使针前移通过导管的端孔到预定的深度来进行注射。针腔的近端与含有重组细胞悬液的标准注射器相连。通过荧光镜、心腔内超声心动图或磁共振成像引导靠心脏内表面足够定位后，针前移进入心肌，注射细胞悬液。在完成注射时，针退回到导管中。在目标区域重复该方法，直到完成细胞转移。试图覆盖整个疤痕区，包括其边界。如果细胞治疗在CABG过程中递送，则使用针和注射器经心外膜递送细胞到上述运动不能区。

监测和评价治疗

通过本领域技术人员公知的方法和技术，进行临床状态、不良反应、12引线心电图、24小时走动心电图和常规临床实验室测试，以评价区域性左心室壁功能。可以进行跟踪，在植入后选定时期(如1、2、3、4、6和12个月)与基线(即治疗之前)比较。在某些情况下，治疗的评价可以包括：对植入区域(梗塞区)中区域性壁动作和壁厚度的Dobutamine应激心动图评价，比较心室造影或磁共振成像。可以通过治疗后的监测和评价来确定梗塞区中功能性肌肉的再生水平和同步化电机械传导。

实施例8：表达重组Cx43的细胞在心脏传导疾病患者中的自体同源移植患者

患者为男性和女性，年龄为1-90岁，诊断患有心脏传导疾病(即心脏休克)。心脏休克可以是先天的、获得性的、医原性的(如瓣膜手术(valve surgery)或导管消融的并发症)或正常衰老过程的一部分。使用实施例7中所述的方法，体积为0.2-0.5ml的1-100百万修饰的细胞注射到AV结区中。重组连接蛋白细胞可以通过25号注射器由AV结动脉或即皮递送系统进行外科递送(例如参见美国专利No.6,059,726。

治疗的监测和评价

可以通过表面ECG容易地进行心脏休克的检测(和其治疗)。锻炼应激测试(exercise stress testing)、霍尔特监测或电生理研究是评价治疗的替代补充方案。

虽然上述说明具有专指性，这些不应理解为限制本发明的范围，而只是针对本发明的现有优选实施方案进行说明。因此，本发明的范围应该由所附的权利要求书和其法律效力上等同的文件来决定。所以，应该理解：本发明的范围完全包括对于本领域技术人员来说显而易见的其他实施方案，因此本发明的范围不受所附权利要求之外的其他内容的限制，在权利要求中，除非明确声明，单数形式的元件并不是指“一个且只有一个”，而是“一个或多个”。对本领域技术人员公知的上述优选实施方案中元件的所有结构、化学成分和功能等同物都通过引用并入本文，也包括在这些权利要求中。此外，装置和方法没有必要说明本发明要解决的每一个问题，因为它也包括在这些权利要求中。另外，本发明公开内容中没有元件、组件或方法步骤是开放于公众的，不管这些元件、组件或方法步骤是否在权利要求中明确说明。本文没有权利要求要素受35U.S.C.112第6款规定的限制，除非这些要素使用术语“意指”来表述。

Claims

1.一种心脏刺激系统，包括

心脏刺激装置，其适于将能量递送到患者心脏的组织区，从而刺激该区域；和

一定体积的传导试剂，其适于递送到所述区域中，并且用通过心脏刺激装置递送的能量增强对该区域的刺激。

2.权利要求1的系统，其中所述的心脏刺激装置包括：

递送元件，其具有近端部分和适于定位在患者心脏中某位置的远端部分；和

一系列可延伸的电极装置，其和递送元件协同作用，并且每个电极装置包括刺激电极，所述的刺激电极是可调节的，以从所述位置上的递送元件延伸，并且进入相对于组织区中其他可延伸电极装置的特定位置。

3.权利要求2的系统，其中一系列可延伸电极装置中的每一个包括可延伸的针，所述的针是可调节的，以从递送元件的远端部分延伸并进入心脏组织中，从而将各刺激电极定位在特定的位置上。

4.权利要求3的系统，其中所述的每个可延伸电极装置的刺激电极集成为针。

5.权利要求3的系统，其中所述的每个可延伸电极装置的刺激电极是可调节的，以从各个针延伸到特定的各位置上。

6.权利要求3的系统，其中所述的针为弯曲形状。

7.权利要求3的系统，其中所述的针包括超弹性的金属合金。

8.权利要求3的系统，其中所述的针包括形状记忆金属合金。

9.权利要求3的系统，其中所述的针包括镍-钛合金。

10.权利要求2的系统，其中：

一系列可延伸电极装置中的每一个包括具有内腔的较柔韧管体；

每个刺激电极沿各个可延伸电极装置的管体定位；和

其中每个较柔韧的管体适于偏转，并前行通过组织区，从而将各个刺激电极放置在各个特定的位置上。

11.权利要求10的系统，其还包括：

可移动的探针，其适于可移动地结合在至少一个管体的内腔中，从而调节管体从递送元件延伸，并前移通过组织区，从而使各个刺激电极定位在各特定位置上。

12.权利要求11的系统，其中：

可移动的探针具有近端部分和成形的远端部分，所述的远端部分可以通过在管体的近端和外部扭转近端部分而在内腔中扭转，从而使管体偏转并前行，以放置电极。

13.权利要求2的系统，其还包括：

锚定物，其可以从递送元件延伸，并适于将远端部分锚定在一定位置上，从而使一系列可延伸电极装置适于沿组织区定位在各个特定的位置上。

14.权利要求13的系统，其中所述的锚定物包括刺激电极。

15.权利要求14的系统，其中：

递送元件的远端部分包括末梢尖端；并且刺激电极位于末梢尖端。

16.权利要求1的系统，其中所述的心脏刺激装置包括：

心脏起搏器。

17.权利要求3的系统，其中所述的心脏起搏器包括：

双心室心脏起搏器。

18.权利要求1的系统，其中所述的心脏刺激装置包括：

除纤颤器。

19.权利要求1的系统，其中所述的传导试剂包括活细胞。

20.权利要求19的系统，其中所述的活细胞包括成肌细胞、成纤维细胞或干细胞中的至少一种。

21.权利要求19的系统，其中所述的活细胞适于在和组织区中心脏细胞的间隙连接处表达连接蛋白。

22.权利要求21的系统，其中所述的活细胞适于在间隙连接处表达连接蛋白43。

23.权利要求22的系统，其中所述的活细胞经遗传修饰以超表达生成连接蛋白43。

24.权利要求1的系统，其中所述的传导试剂包括适于增强区域中电传导的传导性无生命材料的可注射制剂。

25.权利要求24的系统，其中所述的传导性无生命材料包括传导性金属的可注射制剂。

26.权利要求1的系统，其中：

所述的心脏刺激装置包括至少一个电引线，其定位适于将电流发射到所述的区域中；和

该系统还包括递送装置，其适于递送至少一个电引线和一定体积的传导试剂到组织区中。

27.权利要求26的系统，其中所述的递送元件包括：

隔膜穿孔递送装置，其适于将心脏刺激装置通过至少一个隔膜穿孔脉管与组织区相偶联，还通过至少一个隔膜穿孔脉管将一定体积的传导试剂递送到所述区域中。

28.权利要求26的系统，其中所述的递送装置包括：

经心脏递送元件。

29.一种心脏刺激系统，包括：

心脏刺激装置，其具有能量源和能量发射器，所述的能量发射器适于和能量源偶联并定位在待刺激的患者心脏区域中；和

用来自能量发射器的能量增强对所述区域刺激的装置。

30.权利要求29的系统，其中增强对所述区域刺激的装置包括：

将传导试剂递送到所述区域的装置。

31.权利要求30的系统，其中将传导试剂递送到所述区域的装置包括：

在所述区域中生成连接蛋白或其类似物、衍生物或生物活性上的等价物的装置。

32.权利要求31的系统，其中在所述区域中生成连接蛋白的装置包括：

在所述区域中生成连接蛋白43或其类似物、衍生物或生物活性上的等价物的装置。

33.权利要求32的系统，其中生成连接蛋白43的装置包括：

遗传修饰细胞的装置，所述的细胞超表达连接蛋白43或其类似物、衍生物或生物活性上的等价物；和

用所述的遗传修饰细胞在所述区域中生成连接蛋白43的装置。

34.权利要求29的系统，其还包括：

用心脏刺激装置刺激心脏隔膜的装置和增强刺激的装置。

35.权利要求34的系统，其中刺激隔膜的装置包括：

从隔膜对心脏起搏的装置。

36.权利要求35的系统，其中从隔膜对心脏起搏的装置包括：

提供从隔膜的双心室起搏的装置。

37.权利要求34的系统，其中刺激隔膜的装置包括：

通过隔膜对心脏除纤颤的装置。

38.权利要求34的系统，其中刺激隔膜的装置包括：

通过至少一个隔膜穿孔脉管刺激隔膜的装置。

39.一种心脏刺激系统，包括：

传导试剂递送系统，其具有传导试剂源和递送装置，所述的递送装置适于将一定体积的传导试剂从所述源递送并进入患者心脏的区域中；

将能量递送到所述区域至少一部分的装置；并且

其中一定体积的传导试剂适于用来自能量递送装置的能量增强对所述区域的刺激。

40.权利要求39的系统，其中将能量递送到所述区域的装置包括：

将刺激电极递送到所述区域的装置。

41.权利要求40的系统，其中将刺激电极递送到所述区域的装置包括：

使刺激电极从与所述区域相邻的心脏房室中一定位置上的递送导管延伸并进入所述区域的装置。

42.权利要求41的系统，其中延伸刺激电极的装置包括：

将刺激电极定位在一定位置上的装置，所述的位置偏离与所述区域相邻的导管远端部分的纵轴。

43.权利要求39的系统，其中将刺激电极递送到所述区域的装置包括：

将一系列刺激电极递送到所述区域的装置。

44.权利要求43的系统，其中将一系列刺激电极递送到所述区域的装置包括：

将每个刺激电极定位在相对于所述区域中其他刺激电极的各特定位置上的装置。

45.权利要求44的系统，其中定位每个刺激电极的装置包括：

将多个电极元件从递送元件延伸的装置。

46.权利要求39的系统，其中将刺激电极递送到所述区域的装置包括：

将刺激电极递送到隔膜穿孔脉管中的装置。

47.权利要求39的系统，其中将能量递送到所述区域的装置包括：

从所述区域对心脏起搏的装置。

48.权利要求47的系统，其中从所述区域对心脏起搏的装置包括：

提供从隔膜的心脏双心室起搏的装置。

49.一种心脏刺激装置，包括：

细长体，其具有近端部分、适于至少部分定位在患者心脏中一定位置上的远端部分，和至少部分沿远端部分延伸的递送腔；

将能量递送到患者心脏组织区中的装置；

用能量递送装置递送的能量增强对所述组织区刺激的装置；并且

其中能量递送装置和增强刺激装置适于和细长体协同作用。

50.权利要求49的装置，其中将能量递送到所述区域的装置包括：

将刺激电极递送到所述区域的装置。

51.权利要求50的装置，其中将刺激电极递送到所述区域的装置包括：

52.权利要求51的装置，其中延伸刺激电极的装置包括：

53.权利要求49的装置，其中将刺激电极递送到所述区域的装置包括：

将一系列刺激电极递送到所述区域的装置。

54.权利要求53的装置，其中将一系列刺激电极递送到所述区域的装置包括：

55.权利要求54的装置，其中定位每个刺激电极的装置包括：

将多个电极元件从递送元件延伸的装置。

56.权利要求49的装置，其中将刺激电极递送到所述区域的装置包括：

将刺激电极递送到隔膜穿孔脉管中的装置。

57.权利要求49的装置，其中将能量递送到所述区域的装置包括：

从所述区域对心脏起搏的装置。

58.权利要求57的装置，其中从所述区域对心脏起搏的装置包括：

提供从隔膜的心脏双心室起搏的装置。

59.权利要求49的装置，其中增强对所述区域刺激的装置包括：

将传导试剂递送到所述区域的装置。

60.权利要求59的装置，其中将传导试剂递送到所述区域的装置包括：

在所述区域中生成连接蛋白或其类似物、衍生物或生物活性上的等同物的装置。

61.权利要求60的装置，其中在所述区域中生成连接蛋白的装置包括：

在所述区域中生成连接蛋白43或其类似物、衍生物或生物活性上的等同物的装置。

62.权利要求62的装置，其中生成连接蛋白43的装置包括：

遗传修饰超表达连接蛋白43或其类似物、衍生物或生物活性上的等价物的细胞的装置；和

63.权利要求49的装置，其还包括：]

用心脏刺激装置刺激心脏隔膜的装置和增强刺激的装置。

64.一种心脏刺激装置，包括：

细长体，其具有近端部分、适于至少部分在患者心脏中一定位置上定位的远端部分，和至少部分沿远端部分延伸的递送腔；

能量递送装置，其具有能量发射器，所述的能量发射器与细长体偶联，并可调节，以从远端部分延伸并在远端部分位于一定位置时进入组织区，还具有能量引线，其适于和能量发射器偶联，并在能量发射器进入第二位置时沿近端部分与能量源偶联；和

一定体积的传导试剂，其与腔偶联，并适于在远端部分位于一定位置、能量发射器位于第二位置时通过腔递送到组织区中。

65.权利要求64的装置，其中能量发射器包括刺激电极。

66.权利要求64的装置，其中所属的能量递送装置包括：

一系列的可延伸电极装置，其与细长体偶联，其中可延伸电极中的每一个包括刺激电极，其可调节，以从一定位置上的细长体延伸，并进入相对于组织区中其他可延伸电极装置的特定位置上。

67.权利要求66的装置，其中一系列可延伸电极装置中的每一个包括可延伸的针，该针可调节，以从细长体的远端部分延伸并进入心脏组织，从而将各刺激电极定位在特定位置上。

68.权利要求67的装置，其中每个可延伸电极装置的刺激电极集成有针。

69.权利要求67的装置，其中每个可延伸电极装置的刺激电极可调节，以从各针延伸到各特定位置上。

70.权利要求67的装置，其中至少一个可延伸电极装置的针为弯曲形状。

71.权利要求67的装置，其中至少一个可延伸电极装置的针包括超弹性的金属合金。

72.权利要求3的系统，其中至少一个可延伸电极装置的针包括形状记忆金属合金。

73.权利要求3的系统，，其中至少一个可延伸电极装置的针包括镍-钛合金。

74.权利要求66的装置，其中：

一系列可延伸电极装置中的每一个包括带有内腔的较柔韧管体；

每个刺激电极沿过可延伸电极装置的管体定位；并且

其中每个较柔韧的管体适于偏转并前行通过组织区，从而将各刺激电极放置在个特定位置上。

75.权利要求74的装置，其还包括：

可移动的探针，其适于结合在至少一个管体的内腔中移动，从而调节管体从递送元件延伸，并前移通过组织区，从而使各个刺激电极定位在各特定位置上。

76.权利要求75的装置，其中：

可移动的探针具有近端部分和定形的远端部分，所述的定形远端部分可以通过在管体的近端和外部扭转近端部分在内腔中扭转，从而偏转并前行管体，以放置电极。

77.权利要求66的装置，其还包括：

锚定物，其从递送元件延伸，并适于将远端部分锚定在一定位置上，从而使一系列可延伸电极装置适于沿组织区定位在各个特定的位置上。

78.权利要求77的装置，其中所述的锚定物包括刺激电极。

79.权利要求78的装置，其中：

细长体的远端部分包括末梢尖端；且

刺激电极位于末梢尖端。

80.权利要求64的装置，其中心脏刺激装置包括：

心脏起搏器。

81.权利要求80的装置，其中心脏起搏器包括：

双心室心脏起搏器。

82.权利要求64的装置，其中心脏刺激装置包括：

心脏除纤颤器。

83.权利要求64的装置，其中所述的传导试剂包括活细胞。

84.权利要求83的装置，其中所述的活细胞包括成肌细胞、成纤维细胞或干细胞中的至少一种。

85.权利要求83的装置，其中所述的活细胞适于在和组织区中心脏细胞的间隙连接处表达连接蛋白。

86.权利要求85的装置，其中所述的活细胞适于在间隙连接处表达连接蛋白Cx43。

87.权利要求86的装置，其中所述的活细胞经遗传修饰以超表达生成连接蛋白Cx43。

88.权利要求64的装置，其中所述的传导试剂包括适于增强区域中电传导的传导性无生命材料的可注射制剂。

89.权利要求88的系统，其中所述的传导性无生命材料包括传导性金属的可注射制剂。

90.一种心脏刺激系统，包括：

心脏刺激装置，其具有细长体，所述的细长体具有近端部分、远端部分和沿远端部分的心脏刺激电极；

一定体积的细胞，其适于表达连接蛋白43；

其中心脏刺激装置和一定体积的细胞适于协同作用，从而刺激患者心脏中的心脏区域。

91.权利要求90的系统，其中心脏刺激电极可以调节，以从远端部分延伸，并在远端部分位于一定位置时进入组织区。

92.权利要求91的系统，其中所述的心脏刺激装置还包括：

一系列的所属心脏刺激电极，每一个都可调节，以从细长体延伸，并在远端部分在与所述区域相关的心脏中一定位置上定位时，进入相对于组织区中其他心脏刺激电极的特定位置上。

93.权利要求90的系统，其中一定体积的细胞经遗传修饰以超表达产生连接蛋白43。

94.心脏刺激装置，包括：

一定体积的传导试剂，其与腔偶联，并适于在远端部分位于一定位置、能量发射器位于第二位置时至少部分通过腔递送到组织区中。

95.权利要求94的系统，其中能量发射器包括心脏刺激电极。

96.权利要求95的系统，其中能量递送装置还包括：

一系列的所述心脏刺激电极，每一个都可调整，以从细长体延伸，并在远端部分定位于一定位置时进入相对于组织区内其他心脏刺激电极的特定位置上。

97.权利要求94的系统，一定体积的传导试剂包括活细胞。

98.权利要求97的系统，其中所述的活细胞适于在和组织区中心脏细胞的间隙连接处表达连接蛋白。

99.权利要求98的系统，其中所述的活细胞适于在间隙连接处表达连接蛋白Cx43。

100.权利要求99的系统，其中所述的活细胞经遗传修饰以超表达生成连接蛋白Cx43。

101.一种心脏刺激装置，包括：

细长体，其具有近端部分、适于至少部分在患者心脏中一定位置上定位的远端部分；

能量递送装置，其具有多个能量发射器，每个能量发射器与细长体偶联，并可调节，以从远端部分延伸，并在远端部分位于一定位置时进入相对于心脏组织区中其他能量发射器的各特定位置上，每个发射器适于在各能量发射器位于组织区的第二位置时与能量源偶联；和

锚定物，其适于将远端部分偶联到心脏中的一定位置上。

102.一种心脏刺激装置，包括：

心脏刺激能量源，其适于与每个能量发射器偶联，为每个能量发射器提供能量，从而将能量发射到组织区中；

其中组织区中每个特定位置上的能量发射器适于刺激所述的组织区。

103.一种心脏刺激装置，包括：

细长体，其具有近端部分、远端部分和至少部分沿远端部分定位的通道；

针，其具有带末梢尖端和内腔的柄；

能量发射器，其适于与能量源偶联；

其中细长体的远端部分适于在患者心脏的一定位置上定位；

其中针适于与通道偶联，并可在至少部分位于通道中的第一位置和至少部分从通道延伸并在远端部分位于一定位置时进入组织区的第二位置之间调节；并且

其中能量发射器与针的内腔偶联，并可调节以从针延伸进入组织区中。

104.一种双心室刺激系统，包括：

一系列的刺激电极，每个适于定位在相对于患者心脏心室内隔膜中其他刺激电极的特定位置上，从而使一系列定位的电极适于形成限定隔膜内组织区的图案；并且

其中图案和区域适于刺激至少三分之一的隔膜。

105.一种心脏刺激系统，包括：

双心室心脏刺激能量源；

隔膜刺激装置，其具有细长体，所述的细长体具有近端部分和带有可延伸心脏刺激电极的远端部分；

其中远端部分适于定位在与心室隔膜相关的患者心脏的一定位置上；

其中每个可延伸心脏刺激电极可以调节，以从远端部分延伸，从而定位在心室隔膜组织区中其他可伸展心脏刺激电极的各特定位置上；

其中每个可延伸刺激电极适于与双心室心脏刺激能量源偶联；并且

由此将细长体的远端部分定位在一定位置上，见个每个可延伸的心脏刺激电极定位在组织区中的各特定位置上，将每个可延伸心脏刺激电极与双心室心脏刺激能量源偶联，电极的排列适于基本刺激组织区，用能量源为每个电极提供能量，以从所述区域中的各特定位置发射电流。

106.刺激患者心脏中区域的方法，包括：

提供心脏刺激装置；

提供传导试剂递送系统；

将能量递送到与要用心脏刺激系统刺激的心脏区域相关的位置上；

将一定体积的传导试剂从传导试剂递送系统递送到心脏区域中；并且

其中一定体积的传导试剂增强递送到该位置的能量对心脏区域的刺激。

107.提供对患者心脏进行双心室刺激的方法，包括：

提供一系列的心脏刺激电极；

使递送元件的远端部分靠心脏心室内隔膜的部分定位；

将一系列心脏刺激电极从递送元件的远端部分延伸并进入心室内隔膜中，从而使每个心脏刺激电极在相对于心室内隔膜组织区中其他心脏刺激电极的特定位置上定位。

108.制备双心室心脏刺激系统以对患者心脏提供双心室刺激的方法，包括：

提供双心室刺激器，其具有细长体，所述细长体具有近端部分、适于在心室中一定位置上定位的远端部分，沿远端部分定位于一定位置上从而在远端部分位于一定位置上时与心脏隔膜组织区电偶联的刺激电极，以及至少沿远端部分延伸的通道；和

将一定体积的细胞加载到双心室刺激器的通道中，其中细胞适于超表达连接蛋白43或其类似物、衍生物或生物活性上的等价物。

109.制备心脏刺激系统以对患者心脏提供心脏刺激的方法，包括：

提供心脏刺激期，其具有细长体，所述细长体具有近端部分、适于在心室中一定位置上定位的远端部分，一系列可延伸心脏刺激电极，其每一个适于从一定位置上的远端部分延伸，从而定位在相对与心脏组织区中其他可延伸心脏刺激电极的特定位置上，以及至少沿远端部分延伸的通道；和

将一定体积的细胞加载到通道中，其中所述的细胞适于增强一系列可延伸电极对组织区的电刺激。

110.刺激患者心脏隔膜组织区的方法，包括：

将至少一个心脏刺激电极递送到心脏心室内隔膜中至少一个隔膜穿孔脉管中；

将一定体积的传导试剂递送到与隔膜穿孔脉管相关的隔膜组织区中；和

将一定体积的传导试剂递送到所述区域后，用至少一个心脏刺激电极刺激组织区。

111.提供对患者心脏的双心室刺激的方法，包括：

人工刺激包括至少四分之一隔膜的组织区。

112.刺激患者心脏区域的方法，包括：

将一定体积的细胞递送到区域中，所述细胞适于超表达连接蛋白43或其类似物、衍生物或生物活性上的等同物；和

提供对该区域的电刺激。